សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើលគេហទំព័រ Nature.com។ កំណែកម្មវិធីរុករកដែលអ្នកកំពុងប្រើមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។ ដើម្បីទទួលបានបទពិសោធន៍ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកដែលបានធ្វើបច្ចុប្បន្នភាព (ឬបិទរបៀបឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ ទន្ទឹមនឹងនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
morphogenesis ពោះវៀនរបស់មនុស្សបង្កើតលក្ខណៈពិសេស crypt-villus នៃមីក្រូស្ថាបត្យកម្ម epithelial 3D និងការរៀបចំលំហ។ រចនាសម្ព័ន្ធពិសេសនេះត្រូវបានទាមទារដើម្បីរក្សា homeostasis ពោះវៀនដោយការពារ niche កោសិកាដើមនៅក្នុង crypt basal ពីអង់ទីហ្សែន microbial exogenous និងសារធាតុរំលាយអាហាររបស់វា។ លើសពីនេះ villi ពោះវៀន និងទឹករំអិលបញ្ចេញបង្ហាញកោសិកា epithelial ដែលមានមុខងារខុសគ្នាជាមួយនឹងរបាំងការពារនៅលើផ្ទៃ mucosal ពោះវៀន។ ដូច្នេះ ការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ epithelial 3D ឡើងវិញគឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការសាងសង់គំរូពោះវៀននៅក្នុង vitro។ ជាពិសេស ពោះវៀនដែលធ្វើត្រាប់តាមសរីរាង្គនៅលើបន្ទះឈីបអាចបង្កឱ្យមាន morphogenesis 3D ដោយឯកឯងនៃ epithelium ពោះវៀនជាមួយនឹងមុខងារសរីរវិទ្យា និងជីវមេកានិចប្រសើរឡើង។ នៅទីនេះ យើងផ្តល់នូវពិធីការដែលអាចបង្កើតឡើងវិញបានដើម្បីបង្កឱ្យមាន morphogenesis ពោះវៀនយ៉ាងរឹងមាំនៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប microfluidic ក៏ដូចជានៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់ដែលបានបង្កប់ Transwell។ យើងពិពណ៌នាអំពីវិធីសាស្រ្តលម្អិតសម្រាប់ការផលិតឧបករណ៍ ការដាំដុះ Caco-2 ឬកោសិកា epithelial សរីរាង្គពោះវៀននៅក្នុងការកំណត់ធម្មតា ក៏ដូចជានៅលើវេទិកា microfluidic ការបង្កើត morphogenesis 3D និង ការកំណត់លក្ខណៈនៃភ្នាសកោសិកា 3D ដែលបានបង្កើតឡើងដោយប្រើមធ្យោបាយថតរូបភាពច្រើន។ ពិធីការនេះសម្រេចបាននូវការបង្កើតឡើងវិញនៃមីក្រូស្ថាបត្យកម្មពោះវៀនដែលមានមុខងារដោយគ្រប់គ្រងលំហូរសារធាតុរាវនៅផ្នែកខាងក្រោមរយៈពេល 5 ថ្ងៃ។ វិធីសាស្ត្រ morphogenesis ក្នុងវីត្រូរបស់យើងប្រើប្រាស់ភាពតានតឹងកាត់ និងចលនាមេកានិចដែលពាក់ព័ន្ធនឹងសរីរវិទ្យា ហើយមិនតម្រូវឱ្យមានវិស្វកម្មកោសិកាស្មុគស្មាញ ឬការរៀបចំទេ ដែលអាចមានប្រសិទ្ធភាពជាងបច្ចេកទេសដែលមានស្រាប់ផ្សេងទៀត។ យើងស្រមៃថាពិធីការដែលបានស្នើឡើងរបស់យើងអាចមានផលវិបាកយ៉ាងទូលំទូលាយសម្រាប់សហគមន៍ស្រាវជ្រាវជីវវេជ្ជសាស្ត្រ ដោយផ្តល់នូវវិធីសាស្រ្តមួយដើម្បីបង្កើតឡើងវិញនូវស្រទាប់ភ្នាសកោសិកា 3D នៅក្នុងវីត្រូសម្រាប់កម្មវិធីជីវវេជ្ជសាស្ត្រ គ្លីនិក និងឱសថ។
ការពិសោធន៍បង្ហាញថាកោសិកា Caco-2 នៃអេពីថេលីលពោះវៀនដែលត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប 1, 2, 3, 4, 5 ឬឧបករណ៍មីក្រូហ្វ្លុយអ៊ីឌីកពីរស្រទាប់ 6,7 អាចឆ្លងកាត់ការបង្កើតរូបរាង 3D ដោយឯកឯងនៅក្នុងវីត្រូដោយគ្មានការយល់ដឹងច្បាស់លាស់អំពីយន្តការមូលដ្ឋាន។ នៅក្នុងការសិក្សាថ្មីៗរបស់យើង យើងបានរកឃើញថាការដកយកសារធាតុប្រឆាំងម៉ូហ្វហ្សែនដែលបញ្ចេញចេញពីឧបករណ៍ដាំដុះគឺចាំបាច់ និងគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីបង្កើតការបង្កើតរូបរាងអេពីថេលីល 3D នៅក្នុងវីត្រូ ដែលត្រូវបានបង្ហាញដោយ Caco-2 និងសរីរាង្គពោះវៀនដែលមកពីអ្នកជំងឺ។ កោសិកាអេពីធីលីលត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងផ្តោតជាពិសេសលើការផលិតកោសិកា និងការចែកចាយកំហាប់នៃសារធាតុប្រឆាំង Wnt ដ៏មានឥទ្ធិពលគឺ Dickkopf-1 (DKK-1) នៅក្នុងឧបករណ៍ពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប និងឧបករណ៍មីក្រូហ្វ្លុយអ៊ីឌីកដែលបានកែប្រែដែលមានការបញ្ចូល Transwell ដែលមានឈ្មោះថា "បន្ទះឈីបចម្រុះ"។ យើងបង្ហាញថាការបន្ថែមសារធាតុប្រឆាំង Wnt ពីខាងក្រៅ (ដូចជា DKK-1, Wnt repressor 1, ប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងការរលាយ 1 ឬ Soggy-1) ទៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបរារាំង morphogenesis ឬរំខានដល់ស្រទាប់អេពីធីលីល 3D ដែលបានកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធជាមុន ដែលបង្ហាញថាភាពតានតឹងប្រឆាំងក្នុងអំឡុងពេលវប្បធម៌គឺជាការទទួលខុសត្រូវចំពោះ morphogenesis ពោះវៀននៅក្នុង vitro។ ដូច្នេះវិធីសាស្រ្តជាក់ស្តែងមួយដើម្បីសម្រេចបាននូវ morphogenesis រឹងមាំនៅចំណុចប្រទាក់អេពីធីលីលគឺការដកចេញ ឬរក្សាកម្រិតនៃសារធាតុប្រឆាំង Wnt នៅក្នុងផ្នែក basolateral ដោយការលាងសម្អាតសកម្ម (ឧទាហរណ៍ នៅក្នុងវេទិកាពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ឬវេទិកាចម្រុះនៅលើបន្ទះឈីប) ឬការសាយភាយ។ មេឌៀ basolateral (ឧទាហរណ៍ ពីការបញ្ចូល Transwell ទៅក្នុងអាងស្តុកទឹក basolateral ធំៗនៅក្នុង អណ្តូង)។
នៅក្នុងពិធីការនេះ យើងផ្តល់នូវវិធីសាស្រ្តលម្អិតសម្រាប់ការផលិតមីក្រូឧបករណ៍ពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប និងបន្ទះឈីបកូនកាត់ដែលអាចបញ្ចូលបានដោយ Transwell (ជំហានទី 1-5) ដើម្បីដាំដុះកោសិកាអេពីធីលីលពោះវៀននៅលើភ្នាសដែលមានរន្ធញើសដែលមានមូលដ្ឋានលើ polydimethylsiloxane (PDMS) (ជំហានទី 6A, 7A, 8, 9) ឬភ្នាស polyester នៃការបញ្ចូល Transwell (ជំហានទី 6B, 7B, 8, 9) និងបង្កឱ្យមាន morphogenesis 3D នៅក្នុង vitro (ជំហានទី 10)។ យើងក៏បានកំណត់អត្តសញ្ញាណលក្ខណៈពិសេសកោសិកា និងម៉ូលេគុលដែលបង្ហាញពី histogenesis ជាក់លាក់ជាលិកា និងភាពខុសគ្នានៃកោសិកាដែលពឹងផ្អែកលើពូជពង្សដោយអនុវត្តមធ្យោបាយថតរូបភាពច្រើន (ជំហានទី 11-24)។ យើងបង្កឱ្យមាន morphogenesis ដោយប្រើកោសិកាអេពីធីលីលពោះវៀនរបស់មនុស្ស ដូចជា Caco-2 ឬ organoids ពោះវៀន ក្នុងទម្រង់វប្បធម៌ពីរជាមួយនឹងព័ត៌មានលម្អិតបច្ចេកទេស រួមទាំងការកែប្រែផ្ទៃនៃភ្នាសដែលមានរន្ធញើស ការបង្កើត monolayers 2D និងជីវគីមីពោះវៀន និងការបន្តពូជនៃមីក្រូបរិស្ថានជីវមេកានិច។ នៅក្នុង vitro។ ដើម្បីបង្កឱ្យមាន morphogenesis 3D ពី 2D។ ស្រទាប់អេពីធីលីលតែមួយស្រទាប់ យើងបានដកសារធាតុប្រឆាំង morphogen ក្នុងទម្រង់ដាំដុះទាំងពីរដោយហូរឧបករណ៍ផ្ទុកចូលទៅក្នុងផ្នែក basolateral នៃការដាំដុះ។ ជាចុងក្រោយ យើងផ្តល់នូវការតំណាងនៃប្រយោជន៍នៃស្រទាប់អេពីធីលីល 3D ដែលអាចបង្កើតឡើងវិញបាន ដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីធ្វើគំរូនៃការលូតលាស់អេពីធីលីលដែលពឹងផ្អែកលើ morphogen ការដាំដុះរួមគ្នារវាងអតិសុខុមប្រាណម៉ាស៊ីន និងមីក្រូជីវសាស្ត្រ ការឆ្លងមេរោគភ្នាក់ងារបង្ករោគ របួសរលាក មុខងាររបាំងអេពីធីលីល និងការព្យាបាលដោយប្រូបាយអូទិក ឧទាហរណ៍។ ឥទ្ធិពល។
ពិធីសាររបស់យើងអាចមានប្រយោជន៍សម្រាប់អ្នកវិទ្យាសាស្ត្រជាច្រើនប្រភេទ ទាំងផ្នែកមូលដ្ឋាន (ឧទាហរណ៍ ជីវវិទ្យាភ្នាសរំអិលពោះវៀន ជីវវិទ្យាកោសិកាដើម និងជីវវិទ្យាអភិវឌ្ឍន៍) និងការស្រាវជ្រាវអនុវត្ត (ឧទាហរណ៍ ការធ្វើតេស្តថ្នាំមុនព្យាបាល ការធ្វើគំរូជំងឺ វិស្វកម្មជាលិកា និងជំងឺក្រពះពោះវៀន)។ ដោយសារតែភាពអាចបង្កើតឡើងវិញបាន និងភាពរឹងមាំនៃពិធីសាររបស់យើងដើម្បីបង្កើត morphogenesis 3D នៃ epithelium ពោះវៀននៅក្នុង vitro យើងស្រមៃថាយុទ្ធសាស្ត្របច្ចេកទេសរបស់យើងអាចត្រូវបានផ្សព្វផ្សាយដល់ទស្សនិកជនដែលសិក្សាពីឌីណាមិកនៃការផ្តល់សញ្ញាកោសិកាក្នុងអំឡុងពេលនៃការអភិវឌ្ឍពោះវៀន ការបង្កើតឡើងវិញ ឬ homeostasis។ លើសពីនេះ ពិធីសាររបស់យើងមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការសួរចម្លើយការឆ្លងមេរោគក្រោមភ្នាក់ងារបង្ករោគផ្សេងៗដូចជា Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ឬ Vibrio cholerae។ ទស្សនិកជននៃរោគវិទ្យាជំងឺ និងរោគវិទ្យាក៏មានប្រយោជន៍ផងដែរ។ ការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធអតិសុខុមជីវសាស្ត្រពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបអាចអនុញ្ញាតឱ្យមានការរួមវប្បធម៌រយៈពេលវែង 10 និងការវាយតម្លៃជាបន្តបន្ទាប់នៃការការពាររបស់ម្ចាស់ផ្ទះ ការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំ និងការជួសជុលរបួសដែលទាក់ទងនឹងភ្នាក់ងារបង្ករោគនៅក្នុងបំពង់រំលាយអាហារ (GI) 11។ ជំងឺក្រពះពោះវៀនផ្សេងទៀតដែលទាក់ទងនឹងរោគសញ្ញាពោះវៀនលេចធ្លាយ ជំងឺ celiac ជំងឺ Crohn ជំងឺរលាកពោះវៀនធំ ជំងឺរលាកថង់ទឹកប្រមាត់ ឬរោគសញ្ញាពោះវៀនឆាប់ខឹងអាចត្រូវបានក្លែងធ្វើនៅពេលដែលស្រទាប់អេពីថេលីលពោះវៀន 3D ត្រូវបានរៀបចំដោយប្រើស្រទាប់អេពីថេលីលពោះវៀន 3D របស់អ្នកជំងឺ ជំងឺទាំងនេះរួមមានការស្វិតរបស់វីឡា ការខ្លីនៃគ្រីប ការខូចខាតភ្នាសរំអិល ឬរបាំងអេពីថេលីលចុះខ្សោយ។ ការធ្វើកោសល្យវិច័យ ឬសរីរាង្គពោះវៀនដែលទទួលបានពីកោសិកាដើម 12,13។ ដើម្បីធ្វើគំរូកាន់តែប្រសើរឡើងនូវភាពស្មុគស្មាញខ្ពស់នៃបរិស្ថានជំងឺ អ្នកអានអាចពិចារណាបន្ថែមប្រភេទកោសិកាដែលពាក់ព័ន្ធនឹងជំងឺ ដូចជាកោសិកាម៉ូណូនុយក្លេអ៊ែរឈាមគ្រឿងកុំពែររបស់អ្នកជំងឺ (PBMCs) ទៅនឹងគំរូដែលមានមីក្រូស្ថាបត្យកម្មវីឡា-គ្រីបពោះវៀន 3D។ កោសិកាភាពស៊ាំជាក់លាក់ជាលិកា 5។
ដោយសារតែមីក្រូរចនាសម្ព័ន្ធអេពីធីលីល 3D អាចត្រូវបានជួសជុល និងមើលឃើញដោយមិនចាំបាច់ដំណើរការកាត់ អ្នកទស្សនាដែលធ្វើការលើប្រតិចារិកលំហ និងការថតរូបភាពដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ ឬគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់អាចចាប់អារម្មណ៍លើការគូសផែនទីរបស់យើងអំពីឌីណាមិកលំហ និងពេលវេលានៃហ្សែន និងប្រូតេអ៊ីននៅលើទីជ្រៅនៃអេពីធីលីល។ ចាប់អារម្មណ៍លើបច្ចេកវិទ្យា។ ការឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចអតិសុខុមប្រាណ ឬភាពស៊ាំ។ លើសពីនេះ ការនិយាយឆ្លងគ្នារវាងម៉ាស៊ីន និងអតិសុខុមប្រាណបណ្តោយ 10, 14 ដែលសម្របសម្រួល homeostasis ពោះវៀនអាចត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងស្រទាប់ភ្នាសរំអិលពោះវៀន 3D ដោយការដាំដុះរួមគ្នានូវប្រភេទអតិសុខុមប្រាណផ្សេងៗ សហគមន៍អតិសុខុមប្រាណ ឬអតិសុខុមប្រាណលាមក ជាពិសេសនៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប។ នៅក្នុងវេទិកា។ វិធីសាស្រ្តនេះគឺមានភាពទាក់ទាញជាពិសេសចំពោះទស្សនិកជនដែលសិក្សាអំពីភាពស៊ាំនៃភ្នាសរំអិល ក្រពះពោះវៀន អតិសុខុមជីវសាស្ត្ររបស់មនុស្ស វប្បធម៌ និងអតិសុខុមជីវសាស្ត្រគ្លីនិក ដែលកំពុងស្វែងរកការដាំដុះអតិសុខុមជីវសាស្ត្រពោះវៀនដែលមិនទាន់មានវប្បធម៌ពីមុននៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍។ ប្រសិនបើពិធីការ morphogenesis ក្នុងវីត្រូរបស់យើងអាចត្រូវបានសម្របខ្លួនទៅនឹងទម្រង់វប្បធម៌ដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបាន ដូចជាការបញ្ចូលពហុរន្ធនៅក្នុងចាន 24, 96 ឬ 384 រន្ធ ដែលបំពេញបន្ថែមជាបន្តបន្ទាប់នូវបន្ទប់ basolateral ពិធីការនេះក៏អាចត្រូវបានផ្សព្វផ្សាយដល់អ្នកដែលកំពុងបង្កើតវេទិកាត្រួតពិនិត្យ ឬផ្ទៀងផ្ទាត់ឱសថ ជីវវេជ្ជសាស្ត្រ ឬវេទិកាដែលមានទិន្នផលខ្ពស់សម្រាប់ឧស្សាហកម្មម្ហូបអាហារ។ ក្នុងនាមជាភស្តុតាងនៃគោលការណ៍ ថ្មីៗនេះយើងបានបង្ហាញពីលទ្ធភាពនៃប្រព័ន្ធ morphogenesis ដែលមានទិន្នផលខ្ពស់ពហុរន្ធដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបានទៅជាទម្រង់ចាន 24 រន្ធ។ លើសពីនេះ ផលិតផលសរីរាង្គច្រើននៅលើបន្ទះឈីបត្រូវបានធ្វើពាណិជ្ជកម្ម16,17,18។ ដូច្នេះ ការផ្ទៀងផ្ទាត់វិធីសាស្ត្រ morphogenesis ក្នុងវីត្រូរបស់យើងអាចត្រូវបានពន្លឿន និងអាចទទួលយកបានដោយមន្ទីរពិសោធន៍ស្រាវជ្រាវជាច្រើន ឧស្សាហកម្ម ឬរដ្ឋាភិបាល និងភ្នាក់ងារនិយតកម្ម ដើម្បីយល់ពីការសរសេរកម្មវិធីឡើងវិញនៃកោសិកានៃ morphogenesis ពោះវៀនក្នុងវីត្រូនៅកម្រិត transcriptomic ដើម្បីសាកល្បងថ្នាំ ឬ ជីវព្យាបាល ការស្រូបយក និងការដឹកជញ្ជូនថ្នាំដែលត្រូវបានជ្រើសរើសត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើសារធាតុជំនួសពោះវៀន 3D ឬប្រើគំរូសរីរាង្គនៅលើបន្ទះឈីបផ្ទាល់ខ្លួន ឬពាណិជ្ជកម្ម ដើម្បីវាយតម្លៃពីភាពអាចបង្កើតឡើងវិញបាននៃដំណើរការ morphogenesis ពោះវៀន។
គំរូពិសោធន៍ពាក់ព័ន្ធនឹងមនុស្សមួយចំនួនមានកំណត់ត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សាពី morphogenesis នៃ epithelial ពោះវៀន ដែលភាគច្រើនដោយសារតែខ្វះពិធីការដែលអាចអនុវត្តបានដើម្បីបង្កឱ្យមាន morphogenesis 3D នៅក្នុង vitro។ តាមពិតទៅ ចំណេះដឹងបច្ចុប្បន្នភាគច្រើនអំពី morphogenesis ពោះវៀនគឺផ្អែកលើការសិក្សាលើសត្វ (ឧទាហរណ៍ zebrafish20 កណ្ដុរ21 ឬមាន់22)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ពួកវាមានកម្លាំងពលកម្មច្រើន និងចំណាយច្រើន អាចមានការសង្ស័យខាងសីលធម៌ ហើយសំខាន់បំផុត មិនកំណត់ដំណើរការអភិវឌ្ឍន៍របស់មនុស្សយ៉ាងច្បាស់លាស់នោះទេ។ គំរូទាំងនេះក៏មានកម្រិតខ្លាំងផងដែរនៅក្នុងសមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការត្រូវបានសាកល្បងតាមរបៀបដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបានច្រើនផ្លូវ។ ដូច្នេះ ពិធីការរបស់យើងសម្រាប់ការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធជាលិកា 3D ឡើងវិញនៅក្នុង vitro មានដំណើរការល្អជាងគំរូសត្វនៅក្នុង vivo ក៏ដូចជាគំរូវប្បធម៌កោសិកា 2D ឋិតិវន្តប្រពៃណីផ្សេងទៀត។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន ការប្រើប្រាស់រចនាសម្ព័ន្ធ epithelial 3D បានអនុញ្ញាតឱ្យយើងពិនិត្យមើលទីតាំងលំហនៃកោសិកាដែលមានភាពខុសគ្នានៅក្នុងអ័ក្ស crypt-villus ដើម្បីឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចផ្សេងៗនៃភ្នាសរំអិល ឬភាពស៊ាំ។ ស្រទាប់ epithelial 3D អាចផ្តល់កន្លែងសម្រាប់សិក្សាពីរបៀបដែលកោសិកាអតិសុខុមប្រាណប្រកួតប្រជែងដើម្បីបង្កើតជា niches លំហ និងការវិវត្តន៍អេកូឡូស៊ីដើម្បីឆ្លើយតបទៅនឹងកត្តាម្ចាស់ផ្ទះ (ឧទាហរណ៍ ស្រទាប់ទឹករំអិលខាងក្នុងទល់នឹងស្រទាប់ខាងក្រៅ ការបញ្ចេញ IgA និងប៉ិបទីតប្រឆាំងមេរោគ)។ លើសពីនេះ រូបរាងអេពីធីលីល 3D អាចអនុញ្ញាតឱ្យយើងយល់ពីរបៀបដែលមីក្រូជីវសាស្រ្តពោះវៀនរៀបចំរចនាសម្ព័ន្ធសហគមន៍របស់វា និងផលិតសារធាតុរំលាយអាហារអតិសុខុមប្រាណ (ឧទាហរណ៍ អាស៊ីតខ្លាញ់ខ្សែសង្វាក់ខ្លី) ដែលបង្កើតជាអង្គការកោសិកា និងទីជម្រកកោសិកាដើមនៅក្នុងគ្រីបតូសមូលដ្ឋាន។ លក្ខណៈពិសេសទាំងនេះអាចត្រូវបានបង្ហាញតែនៅពេលដែលស្រទាប់អេពីធីលីល 3D ត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងវីត្រូ។
បន្ថែមពីលើវិធីសាស្រ្តរបស់យើងក្នុងការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធអេពីធីលីលពោះវៀន 3D មានវិធីសាស្រ្តជាច្រើននៅក្នុងវីត្រូ។ ការដាំដុះសរីរាង្គពោះវៀនគឺជាបច្ចេកទេសវិស្វកម្មជាលិកាទំនើបដែលផ្អែកលើការដាំដុះកោសិកាដើមពោះវៀនក្រោមលក្ខខណ្ឌ morphogen ជាក់លាក់23,24,25។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការប្រើប្រាស់គំរូសរីរាង្គ 3D សម្រាប់ការវិភាគដឹកជញ្ជូន ឬការដាំដុះរួមគ្នារវាងម៉ាស៊ីន និងមីក្រូជីវសាស្រ្តច្រើនតែជាបញ្ហាប្រឈម ពីព្រោះ lumen ពោះវៀនត្រូវបានរុំព័ទ្ធនៅក្នុង organoid ហើយដូច្នេះការណែនាំសមាសធាតុ luminal ដូចជាកោសិកា microbial ឬអង់ទីហ្សែន exogenous គឺមានកម្រិត។ ការចូលប្រើ lumen សរីរាង្គអាចត្រូវបានកែលម្អដោយប្រើ microinjector26,27 ប៉ុន្តែវិធីសាស្រ្តនេះគឺជាការឈ្លានពាន និងប្រើប្រាស់កម្លាំងពលកម្មច្រើន ហើយតម្រូវឱ្យមានចំណេះដឹងឯកទេសដើម្បីអនុវត្ត។ លើសពីនេះ វប្បធម៌សរីរាង្គប្រពៃណីដែលរក្សានៅក្នុង scaffolds hydrogel ក្រោមលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្តមិនឆ្លុះបញ្ចាំងយ៉ាងត្រឹមត្រូវនូវជីវមេកានិចសកម្មនៅក្នុង vivo ទេ។
វិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀតដែលប្រើដោយក្រុមស្រាវជ្រាវជាច្រើនប្រើប្រាស់រចនាសម្ព័ន្ធអ៊ីដ្រូជែល 3D ដែលបានកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធជាមុន ដើម្បីធ្វើត្រាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធអេពីថេលីលពោះវៀន ដោយការដាំដុះកោសិកាពោះវៀនរបស់មនុស្សដែលនៅដាច់ដោយឡែកនៅលើផ្ទៃជែល។ ផលិតរចនាសម្ព័ន្ធអ៊ីដ្រូជែលដោយប្រើផ្សិតដែលបានបោះពុម្ព 3D មីក្រូកិន ឬផ្សិតដែលផលិតដោយលីចូក្រាហ្វី។ វិធីសាស្រ្តនេះបង្ហាញពីការរៀបចំដោយខ្លួនឯងនៃកោសិកាអេពីថេលីលដែលនៅដាច់ដោយឡែកនៅក្នុងវីត្រូ ជាមួយនឹងជម្រាល morphogen ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងសរីរវិទ្យា ដោយបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធអេពីថេលីលសមាមាត្រទិដ្ឋភាពខ្ពស់ និង crosstalk stroma-epithelial ដោយរួមបញ្ចូលកោសិកា stromal នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ លក្ខណៈនៃរចនាសម្ព័ន្ធដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធជាមុនអាចការពារការបង្ហាញនៃដំណើរការ morphogenetic ដោយឯកឯង។ គំរូទាំងនេះក៏មិនផ្តល់នូវលំហូរ luminal ឬ interstitial ថាមវន្តដែរ ដោយខ្វះភាពតានតឹងកាត់សារធាតុរាវដែលកោសិកាពោះវៀនត្រូវឆ្លងកាត់ morphogenesis និងទទួលបានមុខងារសរីរវិទ្យា។ ការសិក្សាថ្មីៗមួយទៀតបានប្រើរចនាសម្ព័ន្ធអ៊ីដ្រូជែលនៅក្នុងវេទិកា microfluidic និងរចនាសម្ព័ន្ធអេពីថេលីលពោះវៀនដែលមានលំនាំដោយប្រើបច្ចេកទេសឆ្លាក់ឡាស៊ែរ។ សរីរាង្គពោះវៀនកណ្តុរធ្វើតាមលំនាំឆ្លាក់ដើម្បីបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធបំពង់ពោះវៀន ហើយលំហូរសារធាតុរាវ intraluminal អាចត្រូវបានសង្ខេបឡើងវិញដោយប្រើ... ម៉ូឌុលមីក្រូហ្វ្លុយអ៊ីឌីក។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ គំរូនេះមិនបង្ហាញពីដំណើរការ morphogenetic ដោយឯកឯង ហើយក៏មិនរាប់បញ្ចូលចលនាមេកានិចពោះវៀនដែរ។ បច្ចេកទេសបោះពុម្ព 3D ពីក្រុមដូចគ្នាអាចបង្កើតបំពង់ពោះវៀនខ្នាតតូចជាមួយនឹងដំណើរការ morphogenetic ដោយឯកឯង។ ទោះបីជាមានការផលិតស្មុគស្មាញនៃផ្នែកពោះវៀនផ្សេងៗគ្នានៅក្នុងបំពង់ក៏ដោយ គំរូនេះក៏ខ្វះលំហូរសារធាតុរាវ luminal និងការខូចទ្រង់ទ្រាយមេកានិចផងដែរ។ លើសពីនេះ ប្រតិបត្តិការគំរូអាចមានកម្រិត ជាពិសេសបន្ទាប់ពីដំណើរការ bioprinting ត្រូវបានបញ្ចប់ ដែលរំខានដល់លក្ខខណ្ឌពិសោធន៍ ឬអន្តរកម្មកោសិកាទៅកោសិកា។ ផ្ទុយទៅវិញ ពិធីការដែលបានស្នើឡើងរបស់យើងផ្តល់នូវ morphogenesis ពោះវៀនដោយឯកឯង ភាពតានតឹងកាត់ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងសរីរវិទ្យា ជីវមេកានិចដែលធ្វើត្រាប់តាមចលនាពោះវៀន ភាពងាយស្រួលក្នុងការចូលប្រើផ្នែក apical និង basolateral ឯករាជ្យ និងការបង្កើតឡើងវិញនូវមីក្រូបរិស្ថានជីវសាស្រ្តស្មុគស្មាញនៃម៉ូឌុល។ ដូច្នេះ ពិធីការ morphogenesis 3D ក្នុង vitro របស់យើងអាចផ្តល់នូវវិធីសាស្រ្តបំពេញបន្ថែមដើម្បីយកឈ្នះលើបញ្ហាប្រឈមនៃវិធីសាស្រ្តដែលមានស្រាប់។
ពិធីការរបស់យើងផ្តោតទាំងស្រុងលើការបង្កើតរូបរាងអេពីធីលីល 3D ដោយមានតែកោសិកាអេពីធីលីលនៅក្នុងការដាំដុះ ហើយគ្មានកោសិកាជុំវិញប្រភេទផ្សេងទៀតដូចជាកោសិកាមេសេនឈីម៉ាល កោសិកាអង់ដូថេលីល និងកោសិកាភាពស៊ាំទេ។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន ស្នូលនៃពិធីការរបស់យើងគឺការបង្កើតរូបរាងអេពីធីលីលដោយការដកសារធាតុទប់ស្កាត់រូបរាងដែលបញ្ចេញនៅផ្នែកខាងក្រោមនៃឧបករណ៍ផ្ទុកដែលបានណែនាំ។ ខណៈពេលដែលម៉ូឌុលដ៏រឹងមាំនៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប និងកូនកាត់នៅលើបន្ទះឈីបរបស់យើងអនុញ្ញាតឱ្យយើងបង្កើតស្រទាប់អេពីធីលីល 3D រាងរលកឡើងវិញ ភាពស្មុគស្មាញជីវសាស្រ្តបន្ថែមដូចជាអន្តរកម្មអេពីធីលីល-មេសេនឈីម៉ាល33,34 ការដាក់ប្រាក់ម៉ាទ្រីសក្រៅកោសិកា (ECM)35 និងនៅក្នុងគំរូរបស់យើង លក្ខណៈពិសេសគ្រីប-វីលុសដែលបង្ហាញពីទីជម្រកកោសិកាដើមនៅក្នុងគ្រីបមូលដ្ឋាននៅតែត្រូវពិចារណាបន្ថែមទៀត។ កោសិកាស្ត្រូម៉ាល (ឧទាហរណ៍ ហ្វីបូប្លាស) នៅក្នុងមេសេនឈីម៉ាដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការផលិតប្រូតេអ៊ីន ECM និងបទប្បញ្ញត្តិនៃរូបរាងពោះវៀននៅក្នុងវីវ៉ូ35,37,38។ ការបន្ថែមមេសេនឈីម៉ាល កោសិកាទៅនឹងគំរូរបស់យើងបានបង្កើនដំណើរការ morphogenetic និងប្រសិទ្ធភាពនៃការភ្ជាប់កោសិកា។ ស្រទាប់ endothelial (ឧ. សរសៃឈាមតូចៗ ឬឡាំហ្វាទិច) ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការគ្រប់គ្រងការដឹកជញ្ជូនម៉ូលេគុល 39 និងការជ្រើសរើសកោសិកាភាពស៊ាំ 40 នៅក្នុងមីក្រូបរិស្ថានពោះវៀន។ លើសពីនេះ សមាសធាតុសរសៃឈាមដែលអាចភ្ជាប់រវាងគំរូជាលិកាគឺជាតម្រូវការជាមុននៅពេលដែលគំរូជាលិកាត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីបង្ហាញពីអន្តរកម្មពហុសរីរាង្គ។ ដូច្នេះ កោសិកា endothelial អាចត្រូវការរួមបញ្ចូលដើម្បីធ្វើគំរូលក្ខណៈពិសេសសរីរវិទ្យាកាន់តែត្រឹមត្រូវជាមួយនឹងគុណភាពបង្ហាញកម្រិតសរីរាង្គ។ កោសិកាភាពស៊ាំដែលទទួលបានពីអ្នកជំងឺក៏ចាំបាច់សម្រាប់ការបង្ហាញការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំពីកំណើត ការបង្ហាញអង់ទីហ្សែន ការឆ្លងប្រព័ន្ធភាពស៊ាំសម្របខ្លួនពីកំណើត និងភាពស៊ាំជាក់លាក់ជាលិកានៅក្នុងបរិបទនៃការធ្វើត្រាប់តាមជំងឺពោះវៀន។
ការប្រើប្រាស់បន្ទះឈីបកូនកាត់គឺសាមញ្ញជាងការប្រើប្រាស់ពោះវៀនលើបន្ទះឈីប ពីព្រោះការរៀបចំឧបករណ៍គឺសាមញ្ញជាង ហើយការប្រើប្រាស់ការបញ្ចូល Transwell អនុញ្ញាតឱ្យមានការដាំដុះដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបាននៃអេពីថេលីញ៉ូមពោះវៀន។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការបញ្ចូល Transwell ដែលមានលក់នៅលើទីផ្សារជាមួយនឹងភ្នាស polyester មិនមែនជាការបត់បែនទេ ហើយមិនអាចធ្វើត្រាប់តាមចលនាដូច peristaltic បានទេ។ លើសពីនេះ ផ្នែក apical នៃការបញ្ចូល Transwell ដែលដាក់ក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់នៅតែស្ថិតស្ថេរដោយគ្មានភាពតានតឹងកាត់នៅផ្នែក apical។ ជាក់ស្តែង លក្ខណៈសម្បត្តិឋិតិវន្តនៅក្នុងផ្នែក apical កម្រនឹងអនុញ្ញាតឱ្យមានការដាំដុះបាក់តេរីរយៈពេលវែងនៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់។ ខណៈពេលដែលយើងអាចបង្កើត morphogenesis 3D យ៉ាងរឹងមាំនៅក្នុងការបញ្ចូល Transwell នៅពេលប្រើបន្ទះឈីបកូនកាត់ ការខ្វះខាតជីវមេកានិចដែលពាក់ព័ន្ធនឹងសរីរវិទ្យា និងលំហូរសារធាតុរាវ apical អាចកំណត់លទ្ធភាពនៃវេទិកាបន្ទះឈីបកូនកាត់សម្រាប់កម្មវិធីដែលមានសក្តានុពល។
ការកសាងឡើងវិញពេញលេញនៃអ័ក្សគ្រីប-វីឡារបស់មនុស្សនៅក្នុងវប្បធម៌ពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប និងវប្បធម៌កូនកាត់នៅលើបន្ទះឈីបមិនទាន់ត្រូវបានបង្កើតឡើងយ៉ាងពេញលេញនៅឡើយទេ។ ដោយសារ morphogenesis ចាប់ផ្តើមពីស្រទាប់អេពីធីលីលតែមួយ មីក្រូស្ថាបត្យកម្ម 3D មិនចាំបាច់ផ្តល់នូវភាពស្រដៀងគ្នាខាងសរីរវិទ្យាទៅនឹងគ្រីបនៅក្នុងវីវ៉ូនោះទេ។ ទោះបីជាយើងបានកំណត់លក្ខណៈចំនួនប្រជាជនកោសិកាដែលកំពុងរីកសាយនៅជិតដែនគ្រីបមូលដ្ឋាននៅក្នុងអេពីធីលីញ៉ូម 3D ដែលត្រូវបានរចនាឡើងដោយមីក្រូក៏ដោយ តំបន់គ្រីប និងវីឡាមិនត្រូវបានកំណត់ព្រំដែនច្បាស់លាស់ទេ។ ទោះបីជាបណ្តាញខាងលើខ្ពស់នៅលើបន្ទះឈីបនាំឱ្យមានការកើនឡើងនៃកម្ពស់នៃអេពីធីលីញ៉ូមដែលត្រូវបានរចនាឡើងដោយមីក្រូក៏ដោយ កម្ពស់អតិបរមានៅតែត្រូវបានកំណត់ត្រឹម ~300–400 µm។ ជម្រៅពិតប្រាកដនៃគ្រីបពោះវៀនរបស់មនុស្សនៅក្នុងពោះវៀនតូច និងពោះវៀនធំគឺ ~135 µm និង ~400 µm រៀងគ្នា ហើយកម្ពស់នៃវីឡាពោះវៀនតូចគឺ ~600 µm41។
ពីទស្សនៈនៃការថតរូបភាព ការថតរូបភាពដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៅនឹងកន្លែងនៃមីក្រូស្ថាបត្យកម្ម 3D អាចត្រូវបានកំណត់ចំពោះពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ដោយសារចម្ងាយការងារដែលត្រូវការពីកែវថតគោលដៅទៅស្រទាប់អេពីធីលីលគឺស្ថិតនៅលំដាប់ពីរបីមីលីម៉ែត្រ។ ដើម្បីជំនះបញ្ហានេះ គោលដៅឆ្ងាយអាចត្រូវបានទាមទារ។ លើសពីនេះ ការធ្វើផ្នែកស្តើងៗសម្រាប់ការរៀបចំគំរូថតរូបភាពគឺជាបញ្ហាប្រឈមដោយសារតែភាពបត់បែនខ្ពស់នៃ PDMS។ លើសពីនេះ ដោយសារការផលិតមីក្រូស្រទាប់នីមួយៗនៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបពាក់ព័ន្ធនឹងការស្អិតជាប់ជាអចិន្ត្រៃយ៍រវាងស្រទាប់នីមួយៗ វាពិបាកខ្លាំងណាស់ក្នុងការបើក ឬដកស្រទាប់ខាងលើចេញដើម្បីពិនិត្យមើលរចនាសម្ព័ន្ធផ្ទៃនៃស្រទាប់អេពីធីលីល។ ឧទាហរណ៍ ដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងស្កេន (SEM)។
ភាពមិនជ្រាបទឹកនៃ PDMS គឺជាកត្តាកំណត់មួយនៅក្នុងការសិក្សាដែលមានមូលដ្ឋានលើមីក្រូហ្វ្លុយអ៊ីឌីកដែលដោះស្រាយជាមួយម៉ូលេគុលតូចៗដែលមិនជ្រាបទឹក ដោយសារ PDMS អាចស្រូបយកម៉ូលេគុលដែលមិនជ្រាបទឹកបែបនេះដោយមិនជាក់លាក់។ ជម្រើសជំនួស PDMS អាចត្រូវបានពិចារណាជាមួយនឹងវត្ថុធាតុ polymeric ផ្សេងទៀត។ ម៉្យាងវិញទៀត ការកែប្រែផ្ទៃនៃ PDMS (ឧទាហរណ៍ ការស្រោបដោយវត្ថុធាតុ lipophilic 42 ឬ poly(ethylene glycol) 43) អាចត្រូវបានពិចារណាដើម្បីកាត់បន្ថយការស្រូបយកម៉ូលេគុលដែលមិនជ្រាបទឹក។
ជាចុងក្រោយ វិធីសាស្រ្តរបស់យើងមិនទាន់ត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈល្អទាក់ទងនឹងការផ្តល់នូវការត្រួតពិនិត្យដែលមានអត្រាខ្ពស់ ឬវេទិកាពិសោធន៍ដែលងាយស្រួលប្រើ "ទំហំតែមួយសមនឹងទាំងអស់" នោះទេ។ ពិធីការបច្ចុប្បន្នតម្រូវឱ្យមានស្នប់សឺរាំងក្នុងមួយឧបករណ៍ខ្នាតតូច ដែលត្រូវការកន្លែងទំនេរនៅក្នុងម៉ាស៊ីនភ្ញាស់ CO2 និងការពារការពិសោធន៍ទ្រង់ទ្រាយធំ។ ការកំណត់នេះអាចត្រូវបានកែលម្អយ៉ាងខ្លាំងដោយការធ្វើមាត្រដ្ឋាននៃទម្រង់វប្បធម៌ប្រកបដោយភាពច្នៃប្រឌិត (ឧទាហរណ៍ ការបញ្ចូលរន្ធចំនួន 24 រន្ធ, 96 រន្ធ ឬ 384 រន្ធ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការបំពេញបន្ថែមជាបន្តបន្ទាប់ និងការដកចេញនូវឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយនៅផ្នែកខាងក្រោម)។
ដើម្បីបង្កើត morphogenesis 3D នៃ epithelium ពោះវៀនរបស់មនុស្សនៅក្នុង vitro យើងបានប្រើឧបករណ៍ពោះវៀនបន្ទះឈីប microfluidic ដែលមានមីក្រូឆានែលពីរស្របគ្នា និងភ្នាស porous យឺតនៅចន្លោះដើម្បីបង្កើតចំណុចប្រទាក់ lumen-capillary ។ យើងក៏បង្ហាញពីការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍មីក្រូឆានែលតែមួយ (បន្ទះឈីបកូនកាត់) ដែលផ្តល់លំហូរ basolateral ជាបន្តបន្ទាប់នៅក្រោមស្រទាប់ epithelial ប៉ូលដែលដាំដុះនៅលើការបញ្ចូល Transwell ។ នៅក្នុងវេទិកាទាំងពីរ morphogenesis នៃកោសិកា epithelial ពោះវៀនរបស់មនុស្សជាច្រើនអាចត្រូវបានបង្ហាញដោយការអនុវត្តការរៀបចំទិសដៅនៃលំហូរដើម្បីយក morphogen antagonists ចេញពីបន្ទប់ basolateral ។ នីតិវិធីពិសោធន៍ទាំងមូល (រូបភាពទី 1) មានប្រាំផ្នែក៖ (i) ការផលិតមីក្រូបន្ទះឈីបពោះវៀន ឬបន្ទះឈីបកូនកាត់បញ្ចូល Transwell (ជំហានទី 1-5; ប្រអប់ទី 1), (ii) ការរៀបចំកោសិកា epithelial ពោះវៀន (កោសិកា Caco-2) ឬ organoids ពោះវៀនរបស់មនុស្ស; ប្រអប់ 2-5), (iii) ការដាំដុះកោសិកាអេពីធីលីលពោះវៀននៅលើបន្ទះសៀគ្វីពោះវៀន ឬបន្ទះសៀគ្វីកូនកាត់ (ជំហានទី 6-9), (iv) ការបង្កើត morphogenesis 3D ក្នុងវីត្រូ (ជំហានទី 10) និង (v)) ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈមីក្រូស្ត្រុកទ័រអេពីធីលីល 3D (ជំហានទី 11-24)។ ជាចុងក្រោយ ក្រុមត្រួតពិនិត្យសមស្របមួយ (ដែលបានពិភាក្សាបន្ថែមទៀតខាងក្រោម) ត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ប្រសិទ្ធភាពនៃ morphogenesis ក្នុងវីត្រូ ដោយប្រៀបធៀប morphogenesis អេពីធីលីលទៅនឹងការគ្រប់គ្រងលំហ ពេលវេលា លក្ខខណ្ឌ ឬនីតិវិធី។
យើងបានប្រើវេទិកាវប្បធម៌ពីរផ្សេងគ្នា៖ ពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបដែលមានឆានែលត្រង់ ឬឆានែលមិនលីនេអ៊ែរ ឬបន្ទះឈីបកូនកាត់ដែលមានការបញ្ចូល Transwell (TW) នៅក្នុងឧបករណ៍មីក្រូហ្វ្លុយអ៊ីឌីក ដែលផលិតដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងប្រអប់ទី 1 និងជំហានទី 1 -5។ “ការផលិតឧបករណ៍” បង្ហាញជំហានសំខាន់ៗក្នុងការផលិតបន្ទះឈីបតែមួយ ឬបន្ទះឈីបកូនកាត់។ “ការដាំដុះកោសិកាអេពីថេលីលពោះវៀនរបស់មនុស្ស” ពន្យល់ពីប្រភពកោសិកា (Caco-2 ឬសរីរាង្គពោះវៀនរបស់មនុស្ស) និងនីតិវិធីវប្បធម៌ដែលប្រើក្នុងពិធីការនេះ។ “ការបង្កើតរូបរាងក្នុងវីត្រូ” បង្ហាញជំហានទូទៅដែលកោសិកាអេពីថេលីល Caco-2 ឬកោសិកាអេពីថេលីលដែលមានប្រភពមកពីសរីរាង្គត្រូវបានដាំដុះនៅលើបន្ទះឈីបពោះវៀន ឬនៅលើការបញ្ចូល Transwell នៃបន្ទះឈីបកូនកាត់ បន្ទាប់មកដោយការបង្កើតរូបរាង 3D និងការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធអេពីថេលីលដែលមានលក្ខណៈ។ លេខជំហានកម្មវិធី ឬលេខប្រអប់ត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងក្រោមព្រួញនីមួយៗ។ កម្មវិធីនេះផ្តល់នូវឧទាហរណ៍អំពីរបៀបដែលស្រទាប់អេពីថេលីលពោះវៀនដែលបានបង្កើតឡើងអាចត្រូវបានប្រើ ឧទាហរណ៍ ក្នុងការកំណត់លក្ខណៈខុសគ្នានៃកោសិកា ការសិក្សាសរីរវិទ្យាពោះវៀន ការបង្កើតប្រព័ន្ធអេកូឡូស៊ីរបស់ម៉ាស៊ីន-មីក្រូប៊ីយ៉ូម និងជំងឺ។ ការធ្វើគំរូ។ រូបភាពអ៊ីមមូណូហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍ក្នុង “ការបែងចែកកោសិកា” បង្ហាញស្នូល F-actin និង MUC2 ដែលបង្ហាញក្នុងស្រទាប់អេពីថេលីល Caco-2 3D ដែលបង្កើតឡើងលើបន្ទះពោះវៀន។ សញ្ញា MUC2 មាននៅក្នុងកោសិកាហ្គូបឡេត និងទឹករំអិលដែលបញ្ចេញចេញពីផ្ទៃភ្នាសរំអិល។ រូបភាពហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍ក្នុងសរីរវិទ្យាពោះវៀនបង្ហាញទឹករំអិលដែលផលិតដោយការជ្រលក់ពណ៌សម្រាប់អាស៊ីតស៊ីយ៉ាលីក និងសំណល់ N-acetylglucosamine ដោយប្រើសារធាតុ agglutinin នៃគ្រាប់ស្រូវសាលីហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍។ រូបភាពពីរដែលត្រួតគ្នាក្នុង “ការរួមវប្បធម៌របស់ម៉ាស៊ីន-មីក្រូប៊ីយ៉ូម” បង្ហាញការរួមវប្បធម៌របស់ម៉ាស៊ីន-មីក្រូប៊ីយ៉ូមក្នុងពោះវៀនលើបន្ទះឈីប។ បន្ទះខាងឆ្វេងបង្ហាញការរួមវប្បធម៌នៃប្រូតេអ៊ីនហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍ពណ៌បៃតង (GFP) ដែលបង្ហាញអ៊ីមមូណូហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍ជាមួយកោសិកាអេពីថេលីល Caco-2 3D ដែលបានរចនាឡើងដោយមីក្រូ។ បន្ទះខាងស្តាំបង្ហាញពីទីតាំងនៃ GFP E. coli ដែលបានរួមវប្បធម៌ជាមួយកោសិកាអេពីថេលីល Caco-2 3D បន្ទាប់មកដោយការជ្រលក់ពណ៌អ៊ីមមូណូហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍ជាមួយ F-actin (ក្រហម) និងស្នូល (ខៀវ)។ ការធ្វើគំរូជំងឺបង្ហាញពីពោះវៀនដែលមានសុខភាពល្អធៀបនឹងពោះវៀនដែលលេចធ្លាយក្នុង... បន្ទះរលាកពោះវៀនក្រោមបញ្ហាប្រឈមខាងសរីរវិទ្យាជាមួយនឹងអង់ទីហ្សែនបាក់តេរី (ឧទាហរណ៍ lipopolysaccharide, LPS) និងកោសិកាភាពស៊ាំ (ឧទាហរណ៍ PBMC; បៃតង)។ កោសិកា Caco-2 ត្រូវបានដាំដុះដើម្បីបង្កើតស្រទាប់អេពីធីលីល 3D។ របារមាត្រដ្ឋាន 50 µm។ រូបភាពនៅជួរខាងក្រោម៖ “ភាពខុសគ្នានៃកោសិកា” សម្របដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។2. សារព័ត៌មានសាកលវិទ្យាល័យ Oxford; ផលិតឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង 5. NAS; “ការដាំដុះរួមរវាងម៉ាស៊ីននិងមីក្រូប” សម្របដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង 3. NAS; “ការធ្វើគំរូជំងឺ” សម្របដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង 5. NAS។
ទាំងបន្ទះឈីបពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប និងបន្ទះឈីបកូនកាត់ត្រូវបានផលិតឡើងដោយប្រើច្បាប់ចម្លង PDMS ដែលត្រូវបានរុះរើចេញពីផ្សិតស៊ីលីកុនដោយលីចូក្រាហ្វីទន់ 1,44 និងមានលំនាំជាមួយ SU-8។ ការរចនានៃមីក្រូឆានែលនៅក្នុងបន្ទះឈីបនីមួយៗត្រូវបានកំណត់ដោយការពិចារណាលើអ៊ីដ្រូឌីណាមិកដូចជាភាពតានតឹងកាត់ និងសម្ពាធអ៊ីដ្រូឌីណាមិក 1,4,12។ ការរចនាពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបដើម (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 1a) ដែលមានមីក្រូឆានែលត្រង់ស្របគ្នាពីរដែលដាក់ជាប់គ្នា បានវិវត្តទៅជាពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបស្មុគស្មាញ (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 1b) ដែលរួមបញ្ចូលមីក្រូឆានែលកោងមួយគូដើម្បីបង្កើតពេលវេលាស្នាក់នៅសារធាតុរាវកើនឡើង លំនាំលំហូរមិនលីនេអ៊ែរ និងការខូចទ្រង់ទ្រាយពហុអ័ក្សនៃកោសិកាដាំដុះ (រូបភាពទី 2a-f) 12។ នៅពេលដែលជីវមេកានិចពោះវៀនស្មុគស្មាញជាងនេះត្រូវការបង្កើតឡើងវិញ ពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបស្មុគស្មាញអាចត្រូវបានជ្រើសរើស។ យើងបានបង្ហាញថា បន្ទះឈីបពោះវៀនដែលបង្រួមក៏បង្កើតឱ្យមាន morphogenesis 3D យ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងពេលវេលាស្រដៀងគ្នាជាមួយនឹងកម្រិតស្រដៀងគ្នានៃការលូតលាស់អេពីធីលីលបើប្រៀបធៀបទៅនឹង បន្ទះឈីបពោះវៀនដើម ដោយមិនគិតពីប្រភេទកោសិកាដែលបានដាំដុះ។ ដូច្នេះ ដើម្បីបង្កឱ្យមាន morphogenesis 3D ការរចនាពោះវៀនលីនេអ៊ែរ និងស្មុគស្មាញនៅលើបន្ទះឈីបអាចផ្លាស់ប្តូរបាន។ ច្បាប់ចម្លង PDMS ដែលបានព្យាបាលលើផ្សិតស៊ីលីកុនដែលមានលំនាំ SU-8 ផ្តល់នូវលក្ខណៈពិសេសអវិជ្ជមានបន្ទាប់ពីការរុះរើ (រូបភាពទី 2a)។ ដើម្បីបង្កើតពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ស្រទាប់ PDMS ខាងលើដែលបានរៀបចំត្រូវបានភ្ជាប់ជាបន្តបន្ទាប់ទៅនឹងខ្សែភាពយន្ត PDMS ដែលមានរន្ធញើស ហើយបន្ទាប់មកតម្រឹមជាមួយស្រទាប់ PDMS ខាងក្រោមដោយការភ្ជាប់ដែលមិនអាចត្រឡប់វិញបានដោយប្រើឧបករណ៍ព្យាបាល corona (រូបភាពទី 2b-f)។ ដើម្បីផលិតបន្ទះឈីបកូនកាត់ ច្បាប់ចម្លង PDMS ដែលបានព្យាបាលត្រូវបានភ្ជាប់ទៅស្លាយកញ្ចក់ ដើម្បីបង្កើតឧបករណ៍ microfluidic ឆានែលតែមួយដែលអាចផ្ទុកការបញ្ចូល Transwell (រូបភាពទី 2h និងទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 2)។ ដំណើរការភ្ជាប់ត្រូវបានអនុវត្តដោយការព្យាបាលផ្ទៃនៃច្បាប់ចម្លង PDMS និងកញ្ចក់ជាមួយនឹងប្លាស្មាអុកស៊ីសែន ឬការព្យាបាល corona។ បន្ទាប់ពីការក្រៀវនៃឧបករណ៍ microfabricated ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងបំពង់ស៊ីលីកុន ការដំឡើងឧបករណ៍បានត្រៀមរួចរាល់ដើម្បីអនុវត្ត morphogenesis 3D នៃ epithelium ពោះវៀន (រូបភាពទី 2g)។
ក, រូបភាពគ្រោងការណ៍នៃការរៀបចំផ្នែក PDMS ពីផ្សិតស៊ីលីកុនដែលមានលំនាំ SU-8។ ដំណោះស្រាយ PDMS ដែលមិនទាន់ព្យាបាលត្រូវបានចាក់ទៅលើផ្សិតស៊ីលីកុន (ខាងឆ្វេង) ព្យាបាលនៅសីតុណ្ហភាព 60 °C (កណ្តាល) ហើយរុះរើ (ខាងស្តាំ)។ PDMS ដែលបានរុះរើត្រូវបានកាត់ជាបំណែកៗ និងសម្អាតសម្រាប់ប្រើប្រាស់បន្ថែម។ខ, រូបថតផ្សិតស៊ីលីកុនដែលប្រើដើម្បីរៀបចំស្រទាប់ខាងលើ PDMS។គ, រូបថតផ្សិតស៊ីលីកុនដែលប្រើដើម្បីផលិតភ្នាស PDMS ដែលមានរន្ធញើស។ឃ, រូបថតស៊េរីនៃសមាសធាតុ PDMS ខាងលើ និងខាងក្រោម និងឧបករណ៍ពោះវៀនដែលបានផ្គុំនៅលើបន្ទះឈីប។ង, គ្រោងការណ៍នៃការតម្រឹមនៃសមាសធាតុ PDMS ខាងលើ ភ្នាស និងខាងក្រោម។ស្រទាប់នីមួយៗត្រូវបានភ្ជាប់ដោយមិនអាចត្រឡប់វិញបានដោយការព្យាបាលប្លាស្មា ឬកូរ៉ូណា។ច, គ្រោងការណ៍នៃឧបករណ៍ពោះវៀនដែលផលិតនៅលើបន្ទះឈីបជាមួយនឹងមីក្រូឆានែលដែលបង្រួម និងបន្ទប់បូមធូលីដែលដាក់ជាន់គ្នា។ជ, ការដំឡើងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបសម្រាប់ការដាំដុះកោសិកាមីក្រូហ្វ្លុយអ៊ីឌីក។ពោះវៀនដែលផលិតនៅលើបន្ទះឈីបដែលផ្គុំជាមួយបំពង់ស៊ីលីកុន និងសឺរាុំងត្រូវបានដាក់នៅលើគម្រប។ឧបករណ៍បន្ទះឈីបត្រូវបានដាក់នៅលើ គម្របចាន Petri ទំហំ 150 មីលីម៉ែត្រ សម្រាប់ដំណើរការ។ សារធាតុចងត្រូវបានប្រើដើម្បីបិទបំពង់ស៊ីលីកូន។ រូបថតដែលមើលឃើញនៃការផលិតបន្ទះឈីបកូនកាត់ និង morphogenesis 3D ដោយប្រើបន្ទះឈីបកូនកាត់។ សារធាតុបញ្ចូល Transwell ដែលរៀបចំដោយឯករាជ្យដើម្បីដាំដុះ ស្រទាប់កោសិកាអេពីថេលីលពោះវៀន 2D ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់ដើម្បីបង្កើត morphogenesis 3D ពោះវៀន។ ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានចាក់តាមរយៈមីក្រូឆានែលនៅក្រោមស្រទាប់កោសិកាដែលបានបង្កើតឡើងនៅលើការបញ្ចូល Transwell។ របារមាត្រដ្ឋាន 1 សង់ទីម៉ែត្រ។ ម៉ោង បោះពុម្ពឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។4. Elsevier។
នៅក្នុងពិធីការនេះ ខ្សែកោសិកា Caco-2 និងសរីរាង្គពោះវៀនត្រូវបានប្រើជាប្រភពអេពីធីលីល (រូបភាពទី 3a)។ កោសិកាទាំងពីរប្រភេទត្រូវបានដាំដុះដោយឯករាជ្យ (ប្រអប់ទី 2 និងប្រអប់ទី 5) ហើយត្រូវបានប្រើដើម្បីសាបព្រួសមីក្រូឆានែលដែលស្រោបដោយ ECM នៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ឬ Transwell ។ នៅពេលដែលកោសិកាមានចរន្តបញ្ចូលគ្នា (គ្របដណ្តប់ >95% នៅក្នុងដប) កោសិកា Caco-2 ដែលដាំដុះជាប្រចាំ (រវាងផ្លូវ 10 និង 50) នៅក្នុងដប T ត្រូវបានប្រមូលផលដើម្បីរៀបចំការព្យួរកោសិកាដែលបំបែកដោយសារធាតុរាវ trypsinization (ប្រអប់ទី 2) ។ សរីរាង្គពោះវៀនរបស់មនុស្សពីការធ្វើកោសល្យវិច័យពោះវៀន ឬការវះកាត់ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងដំបូល Matrigel scaffold ក្នុងចាន 24 រន្ធដើម្បីគាំទ្រដល់មីក្រូបរិស្ថានរចនាសម្ព័ន្ធ។ មធ្យមដែលមាន morphogens សំខាន់ៗ (ដូចជា Wnt, R-spondin និង Noggin) និងកត្តាលូតលាស់ដែលបានរៀបចំដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងប្រអប់ទី 3 ត្រូវបានបំពេញបន្ថែមរាល់ថ្ងៃរហូតដល់សរីរាង្គលូតលាស់ដល់ ~500 µm ក្នុងអង្កត់ផ្ចិត។ សរីរាង្គដែលលូតលាស់ពេញលេញត្រូវបានប្រមូលផល និងបំបែកទៅជាតែមួយ កោសិកាសម្រាប់ដាំលើពោះវៀន ឬបន្ទះបញ្ចូល Transwell នៅលើបន្ទះឈីប (ប្រអប់ទី 5)។ ដូចដែលយើងបានរាយការណ៍ពីមុនមក វាអាចត្រូវបានបែងចែកទៅតាមប្រភេទជំងឺ 12,13 (ឧទាហរណ៍ ជំងឺរលាកពោះវៀនធំ ជំងឺរលាកពោះវៀនធំ ជំងឺ Crohn ជំងឺមហារីកពោះវៀនធំ និងរន្ធគូថ ឬអ្នកបរិច្ចាគធម្មតា) ទីតាំងដំបៅ (ឧទាហរណ៍ ដំបៅទល់នឹងតំបន់ដែលមិនមានដំបៅ) និងទីតាំងក្រពះពោះវៀននៅក្នុងបំពង់អាហារ (ឧទាហរណ៍ duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon ឬ rectum)។ យើងផ្តល់នូវពិធីការដែលបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនៅក្នុងប្រអប់ទី 5 សម្រាប់ការដាំដុះ organoids ពោះវៀនធំ (coloids) ដែលជាធម្មតាត្រូវការកំហាប់ខ្ពស់ជាង morphogens ជាង organoids ពោះវៀនតូច។
ក, លំហូរការងារសម្រាប់ការបញ្ចូល morphogenesis ពោះវៀននៅក្នុងបន្ទះឈីបពោះវៀន។ កោសិកា epithelium ពោះវៀនរបស់មនុស្ស Caco-2 និងសរីរាង្គពោះវៀនត្រូវបានប្រើនៅក្នុងពិធីការនេះដើម្បីបង្ហាញពី morphogenesis 3D។ កោសិកា epithelial ដាច់ដោយឡែកត្រូវបានសាបព្រោះនៅក្នុងឧបករណ៍ពោះវៀនដែលបានរៀបចំនៅលើបន្ទះឈីប (ការរៀបចំបន្ទះឈីប)។ នៅពេលដែលកោសិកាត្រូវបានសាបព្រោះ (សាបព្រោះ) និងភ្ជាប់ (ភ្ជាប់) ទៅនឹងភ្នាស porous PDMS នៅថ្ងៃទី 0 (D0) លំហូរ apical (AP) ត្រូវបានចាប់ផ្តើម និងរក្សាសម្រាប់រយៈពេល 2 ថ្ងៃដំបូង (លំហូរ, AP, D0-D2)។ លំហូរ Basolateral (BL) ក៏ត្រូវបានចាប់ផ្តើមរួមជាមួយនឹងចលនាលាតសន្ធឹងវដ្ត (លាតសន្ធឹង លំហូរ AP និង BL) នៅពេលដែល monolayer 2D ពេញលេញត្រូវបានបង្កើតឡើង។ morphogenesis ពោះវៀន 3D បានកើតឡើងដោយឯកឯងបន្ទាប់ពី 5 ថ្ងៃនៃការដាំដុះ microfluidic (morphogenesis, D5)។ រូបភាពផ្ទុយគ្នាដំណាក់កាលបង្ហាញ morphology តំណាងនៃកោសិកា Caco-2 នៅជំហានពិសោធន៍ ឬចំណុចពេលវេលានីមួយៗ (ក្រាហ្វរបារ 100 µm)។ ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍ចំនួនបួនដែលបង្ហាញពី cascades ដែលត្រូវគ្នានៃពោះវៀន។ morphogenesis (ខាងស្តាំខាងលើ)។ ព្រួញចំនុចៗនៅក្នុងគ្រោងការណ៍តំណាងឱ្យទិសដៅនៃលំហូរសារធាតុរាវ។ ខ, រូបភាព SEM បង្ហាញ topology ផ្ទៃនៃ epithelium Caco-2 3D ដែលបានបង្កើតឡើង (ខាងឆ្វេង)។ ធាតុបញ្ចូលដែលបន្លិចតំបន់ដែលបានពង្រីក (ប្រអប់ចំនុចៗពណ៌ស) បង្ហាញ microvilli ដែលបានបង្កើតឡើងវិញនៅលើស្រទាប់ Caco-2 3D (ខាងស្តាំ)។ គ, ទិដ្ឋភាពខាងមុខផ្ដេកនៃ Caco-2 3D ដែលបានបង្កើតឡើង, claudin (ZO-1, ពណ៌ក្រហម) និងភ្នាសព្រំដែនជក់បន្តដែលមានស្លាក F-actin (ពណ៌បៃតង) និងស្នូល (ពណ៌ខៀវ) ការមើលឃើញ confocal Immunofluorescence នៃកោសិកា epithelial នៅលើបន្ទះឈីបពោះវៀន។ ព្រួញចង្អុលទៅគ្រោងការណ៍កណ្តាលបង្ហាញពីទីតាំងនៃប្លង់ប្រសព្វសម្រាប់ទិដ្ឋភាព confocal នីមួយៗ។ ឃ, ដំណើរពេលវេលានៃការផ្លាស់ប្តូរ morphological នៅក្នុង organoids ដែលដាំដុះនៅលើបន្ទះឈីបដែលទទួលបានដោយមីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ដំណាក់កាលនៅថ្ងៃទី 3, 7, 9, 11, និង 13។ ធាតុបញ្ចូល (ខាងស្តាំខាងលើ) បង្ហាញពីការពង្រីកខ្ពស់នៃរូបភាពដែលបានផ្តល់ឱ្យ។ ង, រូបថតមីក្រូទស្សន៍ DIC នៃ epithelium 3D organoid ដែលបានបង្កើតឡើង។ នៅក្នុងពោះវៀននៅលើចំណិតដែលថតនៅថ្ងៃទី 7.f រូបភាពអ៊ីមមូណូហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍ដែលដាក់ពីលើគ្នាបង្ហាញសញ្ញាសម្គាល់សម្រាប់កោសិកាដើម (LGR5; ស្វាយ) កោសិកាហ្គូប្លេត (MUC2; បៃតង) F-actin (ប្រផេះ) និងស្នូល (ខៀវស្រងាត់) ដែលដាំដុះលើបន្ទះឈីបពោះវៀនរយៈពេល 3 ថ្ងៃរៀងៗខ្លួន (ខាងឆ្វេង) និងសរីរាង្គអាយុ 13 ថ្ងៃ (កណ្តាល) នៅលើស្រទាប់អេពីធីលីល។ សូមមើលទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 3 ដែលបង្ហាញពីសញ្ញា LGR5 ដោយគ្មានសញ្ញា MUC2។ រូបភាពហ្វ្លុយអូរ៉េសង់ស៍បង្ហាញពីមីក្រូស្ត្រុកទ័រអេពីធីលីល (ខាងស្តាំ) នៃអេពីធីលីញ៉ូមសរីរាង្គ 3D ដែលបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបដោយការជ្រលក់ពណ៌ភ្នាសប្លាស្មាជាមួយនឹងថ្នាំជ្រលក់ CellMask (ខាងស្តាំ) នៅថ្ងៃទី 13 នៃការដាំដុះ។ របារមាត្រដ្ឋានគឺ 50 μm លុះត្រាតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះ។b បោះពុម្ពឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។2. សារព័ត៌មានសាកលវិទ្យាល័យ Oxford; c កែសម្រួលដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។2. សារព័ត៌មានសាកលវិទ្យាល័យ Oxford; e និង f កែសម្រួលដោយមានការអនុញ្ញាតដោយឯកសារយោង។12 ក្រោមអាជ្ញាប័ណ្ណ Creative Commons CC BY 4.0។
នៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប វាចាំបាច់ក្នុងការកែប្រែផ្ទៃ hydrophobic នៃភ្នាស porous PDMS សម្រាប់ថ្នាំកូត ECM ដែលទទួលបានជោគជ័យ។ នៅក្នុងពិធីការនេះ យើងអនុវត្តវិធីសាស្រ្តពីរផ្សេងគ្នាដើម្បីកែប្រែ hydrophobicity នៃភ្នាស PDMS។ សម្រាប់ការដាំដុះកោសិកា Caco-2 ការធ្វើឱ្យផ្ទៃសកម្មដោយការព្យាបាលដោយ UV/អូហ្សូនតែម្នាក់ឯងគឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីកាត់បន្ថយ hydrophobicity នៃផ្ទៃ PDMS ស្រោប ECM និងភ្ជាប់កោសិកា Caco-2 ទៅនឹងភ្នាស PDMS។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការដាំដុះ microfluidic នៃ epithelium organoid តម្រូវឱ្យមានមុខងារផ្ទៃដែលមានមូលដ្ឋានលើគីមី ដើម្បីសម្រេចបាននូវការដាក់ប្រូតេអ៊ីន ECM ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព ដោយការអនុវត្តជាបន្តបន្ទាប់នៃ polyethyleneimine (PEI) និង glutaraldehyde ទៅកាន់ microchannels PDMS។ បន្ទាប់ពីការកែប្រែផ្ទៃ ប្រូតេអ៊ីន ECM ត្រូវបានដាក់ដើម្បីគ្របដណ្តប់លើផ្ទៃ PDMS ដែលមានមុខងារ ហើយបន្ទាប់មកបានណែនាំទៅក្នុង epithelium organoid ដាច់ដោយឡែក។ បន្ទាប់ពីកោសិកាត្រូវបានភ្ជាប់ ការដាំដុះកោសិកា microfluidic ចាប់ផ្តើមដោយការបញ្ចូលតែឧបករណ៍ផ្ទុកទៅក្នុង microchannel ខាងលើរហូតដល់កោសិកាបង្កើតជា monolayer ពេញលេញ ខណៈពេលដែល microchannel ខាងក្រោមរក្សាលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្ត។ វិធីសាស្រ្តដែលបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងសម្រាប់ការធ្វើឱ្យផ្ទៃសកម្ម និងថ្នាំកូត ECM នេះអាចឱ្យមានការភ្ជាប់នៃ epithelium organoid។ ដើម្បីបង្កឱ្យមាន morphogenesis 3D នៅលើផ្ទៃ PDMS។
ការដាំដុះ Transwell ក៏តម្រូវឱ្យមានថ្នាំកូត ECM មុនពេលដាំកោសិកាផងដែរ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការដាំដុះ Transwell មិនតម្រូវឱ្យមានជំហានព្យាបាលមុនស្មុគស្មាញដើម្បីធ្វើឱ្យផ្ទៃនៃរន្ធដែលមានរន្ធសកម្មនោះទេ។ សម្រាប់ការដាំដុះកោសិកា Caco-2 នៅលើការដាំ Transwell ការដាំ ECM លើការដាំដែលមានរន្ធបង្កើនល្បឿននៃការភ្ជាប់កោសិកា Caco-2 ដែលផ្តាច់ចេញពីគ្នា (តិចជាង 1 ម៉ោង) និងការបង្កើតរបាំងប្រសព្វតឹង (តិចជាង 1-2 ថ្ងៃ)។ ដើម្បីដាំដុះសរីរាង្គនៅលើការដាំ Transwell សរីរាង្គដាច់ដោយឡែកត្រូវបានដាំនៅលើការដាំដែលស្រោបដោយ ECM ភ្ជាប់ទៅនឹងផ្ទៃភ្នាស (តិចជាង 3 ម៉ោង) ហើយរក្សារហូតដល់សរីរាង្គបង្កើតជាស្រទាប់តែមួយពេញលេញជាមួយនឹងភាពសុចរិតនៃរបាំង។ ការដាំដុះ Transwell ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងចាន 24 រន្ធដោយមិនប្រើបន្ទះឈីបកូនកាត់។
ការបង្កើតរូបរាង 3D នៅក្នុងវីត្រូអាចត្រូវបានផ្តួចផ្តើមដោយការអនុវត្តលំហូរសារធាតុរាវទៅកាន់ទិដ្ឋភាពបាតនៃស្រទាប់អេពីធីលីលដែលបានបង្កើតឡើង។ នៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ការបង្កើតរូបរាងអេពីធីលីលបានចាប់ផ្តើមនៅពេលដែលឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងមីក្រូឆានែលខាងលើ និងខាងក្រោម (រូបភាពទី 3a)។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន វាមានសារៈសំខាន់ណាស់ក្នុងការណែនាំលំហូរសារធាតុរាវនៅក្នុងបន្ទប់ខាងក្រោម (បាត) សម្រាប់ការដកយកចេញជាបន្តបន្ទាប់នៃសារធាតុទប់ស្កាត់ morphogen ដែលបញ្ចេញទិសដៅ។ ដើម្បីផ្តល់សារធាតុចិញ្ចឹម និងសេរ៉ូមគ្រប់គ្រាន់ដល់កោសិកាដែលចងនៅលើភ្នាសដែលមានរន្ធញើស និងបង្កើតភាពតានតឹងកាត់ពន្លឺ ជាធម្មតាយើងអនុវត្តលំហូរពីរនៅក្នុងពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប។ នៅក្នុងបន្ទះឈីបចម្រុះ ការបញ្ចូល Transwell ដែលមានស្រទាប់អេពីធីលីល monolayers ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងបន្ទះឈីបចម្រុះ។ បន្ទាប់មក ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានអនុវត្តនៅក្រោមផ្នែកបាតនៃបញ្ចូល Transwell ដែលមានរន្ធញើសតាមរយៈមីក្រូឆានែល។ ការបង្កើតរូបរាងពោះវៀនបានកើតឡើង 3-5 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការចាប់ផ្តើមនៃលំហូរបាតនៅក្នុងវេទិកាវប្បធម៌ទាំងពីរ។
លក្ខណៈពិសេសនៃរូបរាងនៃស្រទាប់អេពីធីលីល 3D ដែលត្រូវបានរចនាឡើងដោយមីក្រូស្កុបអាចត្រូវបានវិភាគដោយការអនុវត្តមធ្យោបាយថតរូបភាពផ្សេងៗ រួមទាំងមីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ដំណាក់កាល មីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ការជ្រៀតជ្រែកឌីផេរ៉ង់ស្យែល (DIC) SEM ឬមីក្រូទស្សន៍កុងហ្វូកាល់អ៊ីមមូណូហ្វ្លុយអូរីស (រូបភាពទី 3 និងទី 4)។ ការថតរូបភាពកម្រិតពណ៌ដំណាក់កាល ឬការថតរូបភាព DIC អាចត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងងាយស្រួលនៅពេលណាក៏បានក្នុងអំឡុងពេលដាំដុះ ដើម្បីតាមដានរូបរាង និងការលេចចេញនៃស្រទាប់អេពីធីលីល 3D។ ដោយសារតែតម្លាភាពអុបទិកនៃខ្សែភាពយន្ត PDMS និង polyester ទាំងវេទិកាពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប និងបន្ទះឈីបចម្រុះអាចផ្តល់ការថតរូបភាពនៅនឹងកន្លែងជាក់ស្តែងដោយមិនចាំបាច់កាត់ ឬរុះរើឧបករណ៍នោះទេ។ នៅពេលអនុវត្តការថតរូបភាពអ៊ីមមូណូហ្វ្លុយអូរីស (រូបភាពទី 1, 3c, f និង 4b, c) កោសិកាជាធម្មតាត្រូវបានជួសជុលជាមួយប៉ារ៉ាហ្វ័រម៉ាល់ដេអ៊ីត (PFA) 4% (wt/vol) បន្ទាប់មកដោយ Triton X-100 និងអាល់ប៊ុយមីនសេរ៉ូមគោ (BSA) 2% (wt/vol) តាមលំដាប់លំដោយ។ អាស្រ័យលើប្រភេទកោសិកា សារធាតុជួសជុលផ្សេងៗគ្នា សារធាតុ permeabilizers និងសារធាតុទប់ស្កាត់អាចត្រូវបានប្រើ។ អង្គបដិប្រាណបឋមដែលកំណត់គោលដៅសញ្ញាសម្គាល់កោសិកា ឬតំបន់ដែលពឹងផ្អែកលើពូជពង្សត្រូវបានប្រើដើម្បីបន្លិចកោសិកាដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យអសកម្មនៅនឹងកន្លែងនៅលើបន្ទះឈីប បន្ទាប់មកដោយអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំរួមជាមួយថ្នាំជ្រលក់ប្រឆាំងដែលកំណត់គោលដៅស្នូល (ឧទាហរណ៍ 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) ឬ F-actin (ឧទាហរណ៍ phalloidin ដែលមានស្លាក fluorescent)។ ការថតរូបភាពផ្ទាល់ដែលមានមូលដ្ឋានលើ fluorescence ក៏អាចត្រូវបានអនុវត្តនៅនឹងកន្លែងដើម្បីរកឃើញការផលិតទឹករំអិល (រូបភាពទី 1 "ភាពខុសគ្នានៃកោសិកា" និង "សរីរវិទ្យាពោះវៀន") ការធ្វើអាណានិគមចៃដន្យនៃកោសិកាមីក្រូប (រូបភាពទី 1 "ការដាំដុះរួមគ្នារវាងម៉ាស៊ីន និងមីក្រូប") ការជ្រើសរើសកោសិកាភាពស៊ាំ (រូបភាពទី 1 'ការធ្វើគំរូជំងឺ') ឬវណ្ឌវង្កនៃរូបរាងអេពីធីលីល 3D (រូបភាពទី 3c, f និង 4b, c)។ នៅពេលកែប្រែពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបដើម្បីបំបែកស្រទាប់ខាងលើចេញពីស្រទាប់មីក្រូឆានែលខាងក្រោម ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងឯកសារយោង។ ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 2 3D រូបរាងអេពីធីលីល ក៏ដូចជាមីក្រូវីលីនៅលើព្រំដែនជក់កំពូលអាចមើលឃើញដោយ SEM (រូបភាពទី 3b)។ ការបញ្ចេញមតិនៃសញ្ញាសម្គាល់ឌីផេរ៉ង់ស្យែលអាចត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការអនុវត្ត PCR5 បរិមាណ ឬលំដាប់ RNA កោសិកាតែមួយ។ ក្នុងករណីនេះ ស្រទាប់ 3D នៃកោសិកាអេពីធីលីលដែលដាំដុះក្នុងបន្ទះពោះវៀន ឬបន្ទះកូនកាត់ត្រូវបានប្រមូលផលដោយទ្រីបស៊ីណាស្យុង ហើយបន្ទាប់មកប្រើសម្រាប់ការវិភាគម៉ូលេគុល ឬហ្សែន។
ក, លំហូរការងារសម្រាប់ការបញ្ចូល morphogenesis ពោះវៀននៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់។ Caco-2 និង organoids ពោះវៀនត្រូវបានប្រើនៅក្នុងពិធីការនេះដើម្បីបង្ហាញពី morphogenesis 3D នៅក្នុងវេទិកាបន្ទះឈីបកូនកាត់។ កោសិកា epithelial ដែលផ្តាច់ចេញត្រូវបានសាបព្រោះនៅក្នុងការបញ្ចូល Transwell ដែលបានរៀបចំ (ការរៀបចំ TW; សូមមើលរូបភាពខាងក្រោម)។ នៅពេលដែលកោសិកាត្រូវបានសាបព្រោះ (សាបព្រោះ) និងភ្ជាប់ទៅនឹងភ្នាស polyester នៅក្នុងការបញ្ចូល Transwell កោសិកាទាំងអស់ត្រូវបានដាំដុះក្រោមលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្ត (វប្បធម៌ TW)។ បន្ទាប់ពី 7 ថ្ងៃ ការបញ្ចូល Transwell តែមួយដែលមានស្រទាប់កោសិកា epithelial 2D monolayer ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងបន្ទះឈីបកូនកាត់ដើម្បីណែនាំលំហូរ basolateral (Flow, BL) ដែលនៅទីបំផុតនាំឱ្យមានការបង្កើតស្រទាប់ epithelial 3D (morphogenesis)។ មីក្រូក្រាហ្វផ្ទុយគ្នាដំណាក់កាលដែលបង្ហាញពីលក្ខណៈពិសេស morphological នៃកោសិកា epithelial សរីរាង្គរបស់មនុស្សដែលទទួលបានពីពោះវៀនធំរបស់អ្នកបរិច្ចាគធម្មតា (ខ្សែ C103) នៅជំហានពិសោធន៍នីមួយៗ ឬចំណុចពេលវេលា។ គ្រោងការណ៍នៅក្នុងស្រទាប់ខាងលើបង្ហាញពីការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធពិសោធន៍សម្រាប់ជំហាននីមួយៗ។ ខ, បន្ទះឈីបកូនកាត់ (គ្រោងការណ៍ខាងឆ្វេង) អាចនាំឱ្យមាន morphogenesis 3D នៃកោសិកា epithelial សរីរាង្គ។ ជាមួយនឹងទិដ្ឋភាពមីក្រូទស្សន៍ខនហ្វូកាល់ពីលើចុះក្រោមដែលថតនៅទីតាំង Z ផ្សេងៗគ្នា (ខាងលើ កណ្តាល និងខាងក្រោម; សូមមើលគ្រោងការណ៍ខាងស្តាំ និងបន្ទាត់ចំនុចដែលត្រូវគ្នា)។ បានបង្ហាញលក្ខណៈរូបវិទ្យាជាក់ស្តែង។F-actin (ខៀវស្រងាត់), ស្នូល (ពណ៌ប្រផេះ)។c, មីក្រូទស្សន៍ខនហ្វូកាល់ហ្វ្លុយអូរីសង់ (ទិដ្ឋភាពមុំ 3D) នៃកោសិកាអេពីថេលីលដែលទទួលបានពីសរីរាង្គដែលត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុង Transwell ឋិតិវន្ត (TW; រូបភាពបញ្ចូលក្នុងប្រអប់ចំនុចពណ៌ស) ទល់នឹងបន្ទះឈីបកូនកាត់ (រូបថតពេញធំបំផុត) ប្រៀបធៀបរូបវិទ្យា 2D ទល់នឹង 3D រៀងៗខ្លួន។ ទិដ្ឋភាពកាត់បញ្ឈរ 2D មួយគូ (រូបភាពបញ្ចូលនៅជ្រុងខាងស្តាំខាងលើ; “XZ”) ក៏បង្ហាញលក្ខណៈពិសេស 2D និង 3D ផងដែរ។ របារមាត្រដ្ឋាន 100 µm។c បោះពុម្ពឡើងវិញដោយមានការអនុញ្ញាតពីឯកសារយោង។4. Elsevier។
ការគ្រប់គ្រងអាចត្រូវបានរៀបចំដោយការដាំដុះកោសិកាដូចគ្នា (Caco-2 ឬកោសិកាអេពីថេលីលសរីរាង្គពោះវៀន) ទៅជាស្រទាប់តែមួយពីរវិមាត្រក្រោមលក្ខខណ្ឌវប្បធម៌ឋិតិវន្តធម្មតា។ ជាពិសេស ការថយចុះសារធាតុចិញ្ចឹមអាចកើតឡើងដោយសារតែសមត្ថភាពបរិមាណមានកំណត់នៃមីក្រូឆានែល (ឧ. ~4 µL នៅក្នុងឆានែលខាងលើលើការរចនាបន្ទះឈីបពោះវៀនដើម)។ ដូច្នេះ រូបរាងអេពីថេលីលមុន និងក្រោយពេលអនុវត្តលំហូរបាតក៏អាចត្រូវបានប្រៀបធៀបផងដែរ។
ដំណើរការបោះពុម្ពលីតូក្រាហ្វីទន់គួរតែត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងបន្ទប់ស្អាត។ សម្រាប់ស្រទាប់នីមួយៗនៅលើបន្ទះឈីប (ស្រទាប់ខាងលើ និងខាងក្រោម និងភ្នាស) និងបន្ទះឈីបចម្រុះ ហ្វូតូម៉ាសផ្សេងៗគ្នាត្រូវបានប្រើ និងផលិតនៅលើបន្ទះស៊ីលីកុនដាច់ដោយឡែកពីគ្នា ព្រោះកម្ពស់នៃមីក្រូឆានែលគឺខុសគ្នា។ កម្ពស់គោលដៅនៃមីក្រូឆានែលខាងលើ និងខាងក្រោមនៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីបគឺ 500 µm និង 200 µm រៀងៗខ្លួន។ កម្ពស់គោលដៅឆានែលរបស់បន្ទះឈីបចម្រុះគឺ 200 µm។
ដាក់បន្ទះស៊ីលីកុនទំហំ ៣អ៊ីញក្នុងចានដែលមានអាសេតូន។ បង្វិលចានថ្នមៗរយៈពេល ៣០វិនាទី បន្ទាប់មកសម្ងួតបន្ទះដោយខ្យល់។ ដាក់បន្ទះស៊ីលីកុនទៅក្នុងចានដែលមាន IPA បន្ទាប់មកបង្វិលចានរយៈពេល ៣០វិនាទីដើម្បីសម្អាត។
ដំណោះស្រាយពីរ៉ាន់ហា (ល្បាយអ៊ីដ្រូសែនប៉េរ៉ុកស៊ីត និងអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរិកកំហាប់ 1:3 (វ៉ុល/វ៉ុល)) អាចត្រូវបានប្រើជាជម្រើស ដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពការយកសំណល់សរីរាង្គចេញពីផ្ទៃបន្ទះស៊ីលីកុន។
ទឹកថ្នាំពីរ៉ាន់ហាមានលក្ខណៈกัดกร่อนខ្លាំង និងបង្កើតកំដៅ។ ការប្រុងប្រយ័ត្នសុវត្ថិភាពបន្ថែមគឺចាំបាច់។ ចំពោះការចោលកាកសំណល់ សូមទុកឱ្យទឹកថ្នាំត្រជាក់សិន រួចផ្ទេរទៅក្នុងធុងសំរាមស្អាត និងស្ងួត។ ប្រើធុងសំរាមបន្ទាប់បន្សំ និងដាក់ស្លាកធុងសំរាមឲ្យបានត្រឹមត្រូវ។ សូមអនុវត្តតាមគោលការណ៍ណែនាំសុវត្ថិភាពរបស់កន្លែងសម្រាប់នីតិវិធីលម្អិតបន្ថែម។
សម្ងួតនំវ៉ាហ្វឺរដោយដាក់វានៅលើចានក្តៅ 200°C រយៈពេល 10 នាទី។ បន្ទាប់ពីសម្ងួតរួច នំវ៉ាហ្វឺរត្រូវបានអង្រួនប្រាំដងក្នុងខ្យល់ឲ្យត្រជាក់។
ចាក់សារធាតុ photoresist SU-8 2100 ប្រហែល 10 ក្រាមទៅលើចំណុចកណ្តាលនៃបន្ទះស៊ីលីកុនដែលបានសម្អាត។ ប្រើដង្កៀបដើម្បីលាបសារធាតុ photoresist ឲ្យស្មើៗគ្នាលើបន្ទះស៊ីលីកុន។ ពេលខ្លះដាក់បន្ទះស៊ីលីកុននៅលើចានក្តៅដែលមានសីតុណ្ហភាព 65°C ដើម្បីធ្វើឲ្យសារធាតុ photoresist មិនសូវស្អិត និងងាយស្រួលលាប។ កុំដាក់បន្ទះស៊ីលីកុនដោយផ្ទាល់នៅលើចានក្តៅ។
SU-8 ត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នានៅលើបន្ទះ wafer ដោយប្រើថ្នាំកូតបង្វិល។ កំណត់កម្មវិធីបង្វិលចូលនៃ SU-8 រយៈពេល 5-10 វិនាទី ដើម្បីសាយភាយក្នុងល្បឿន 500 rpm ក្នុងល្បឿន 100 rpm/វិនាទី។ កំណត់ការបង្វិលមេសម្រាប់លំនាំកម្រាស់ 200 µm ក្នុងល្បឿន 1,500 rpm ឬសម្រេចបានកម្រាស់ 250 µm (ធ្វើឱ្យកម្ពស់ 500 µm សម្រាប់ស្រទាប់ខាងលើនៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប; សូមមើល "ជំហានសំខាន់ៗ" ខាងក្រោម) កំណត់នៅល្បឿន 300 rpm/វិនាទី 30 វិនាទី ក្នុងល្បឿន 1,200 rpm។
ល្បឿនបង្វិលសំខាន់អាចត្រូវបានកែតម្រូវតាមកម្រាស់គោលដៅនៃលំនាំ SU-8 នៅលើបន្ទះស៊ីលីកុន។
ដើម្បីបង្កើតលំនាំ SU-8 ដែលមានកម្ពស់ 500 µm សម្រាប់ស្រទាប់ខាងលើនៃពោះវៀននៅលើបន្ទះឈីប ជំហាននៃការស្រោបបង្វិល និងជំហានដុតនំទន់នៃប្រអប់នេះ (ជំហានទី 7 និង 8) ត្រូវបានធ្វើឡើងវិញជាបន្តបន្ទាប់ (សូមមើលជំហានទី 9) ដើម្បីផលិតស្រទាប់ពីរដែលមានកម្រាស់ 250 µm ដែលអាចដាក់ជាស្រទាប់ៗ និងភ្ជាប់គ្នាដោយការប៉ះពាល់នឹងកាំរស្មីយូវីក្នុងជំហានទី 12 នៃប្រអប់នេះ ដែលធ្វើឱ្យស្រទាប់មានកម្ពស់ 500 µm។
ដុតនំវ៉ាហ្វឺរដែលស្រោបដោយ SU-8 ឱ្យទន់ៗ ដោយដាក់វ៉ាហ្វឺរដោយប្រុងប្រយ័ត្ននៅលើចានក្តៅនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 5 នាទី បន្ទាប់មកប្តូរការកំណត់ទៅ 95°C ហើយភ្ញាស់រយៈពេល 40 នាទីបន្ថែម។
ដើម្បីសម្រេចបានកម្ពស់ 500 μm នៃលំនាំ SU-8 នៅក្នុងមីក្រូឆានែលខាងលើ សូមធ្វើជំហានទី 7 និង 8 ម្តងទៀតដើម្បីបង្កើតស្រទាប់ SU-8 ពីរកម្រាស់ 250 μm។
ដោយប្រើឧបករណ៍តម្រឹមរបាំងមុខ UV សូមធ្វើតេស្តចង្កៀងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត ដើម្បីគណនាពេលវេលាប៉ះពាល់នៃបន្ទះ wafer។ (ពេលវេលាប៉ះពាល់, ms) = (កម្រិតថ្នាំប៉ះពាល់, mJ/cm2)/(ថាមពលចង្កៀង, mW/cm2)។
បន្ទាប់ពីកំណត់ពេលវេលានៃការប៉ះពាល់រួច សូមដាក់ហ្វូតូម៉ាសនៅលើកន្លែងដាក់ម៉ាស់របស់ឧបករណ៍តម្រឹមម៉ាស់ UV ហើយដាក់ហ្វូតូម៉ាសនៅលើបន្ទះបន្ទះស្រោប SU-8។
ដាក់ផ្ទៃដែលបានបោះពុម្ពនៃ photomask ដោយផ្ទាល់នៅលើផ្នែកដែលស្រោបដោយ SU-8 នៃបន្ទះស៊ីលីកុន ដើម្បីកាត់បន្ថយការសាយភាយកាំរស្មីយូវី។
លាតបន្ទះស្តើងស្រោបដោយ SU-8 និងហ្វូតូម៉ាសបញ្ឈរទៅនឹងពន្លឺយូវី 260 mJ/cm2 សម្រាប់ពេលវេលាដែលបានកំណត់ទុក (សូមមើលជំហានទី 10 នៃប្រអប់នេះ)។
បន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់នឹងកាំរស្មីយូវី បន្ទះស៊ីលីកុនស្រោបដោយ SU-8 ត្រូវបានដុតនំនៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 5 នាទី និង 95°C រយៈពេល 15 នាទីនៅលើចានក្តៅនីមួយៗ ដើម្បីបង្កើតលំនាំដែលមានកម្ពស់ 200 μm។ ពន្យារពេលវេលាក្រោយដុតនំនៅសីតុណ្ហភាព 95°C ដល់ 30 នាទី ដើម្បីបង្កើតលំនាំដែលមានកម្ពស់ 500 µm។
សារធាតុអភិវឌ្ឍន៍ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងចានកែវ ហើយនំវ៉ាហ្វឺរដែលដុតត្រូវបានដាក់ចូលទៅក្នុងចាន។ បរិមាណសារធាតុអភិវឌ្ឍន៍ SU-8 អាចប្រែប្រួលអាស្រ័យលើទំហំចានកែវ។ ត្រូវប្រាកដថាប្រើសារធាតុអភិវឌ្ឍន៍ SU-8 គ្រប់គ្រាន់ដើម្បីយកសារធាតុ SU-8 ដែលមិនបានលាតត្រដាងចេញទាំងស្រុង។ ឧទាហរណ៍ នៅពេលប្រើចានកែវដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 150 មីលីម៉ែត្រ ដែលមានសមត្ថភាព 1 លីត្រ សូមប្រើសារធាតុអភិវឌ្ឍន៍ SU-8 ប្រហែល 300 មីលីលីត្រ។ អភិវឌ្ឍផ្សិតរយៈពេល 25 នាទីដោយបង្វិលថ្នមៗម្តងម្កាល។
លាងសម្អាតផ្សិតដែលបានបង្កើតរួចជាមួយនឹងសារធាតុ developer ស្រស់ប្រហែល 10 មីលីលីត្រ បន្ទាប់មកដោយ IPA ដោយបាញ់ថ្នាំដោយប្រើ pipette។
ដាក់បន្ទះបន្ទះនៅក្នុងឧបករណ៍សម្អាតប្លាស្មា ហើយទុកឱ្យប្លាស្មាអុកស៊ីសែន (ឧស្ម័នបរិយាកាស សម្ពាធគោលដៅ 1 × 10−5 Torr ថាមពល 125 W) រយៈពេល 1.5 នាទី។
ដាក់បន្ទះសៀគ្វីក្នុងឧបករណ៍សម្ងួតដោយសុញ្ញកាសដែលមានបន្ទះកញ្ចក់នៅខាងក្នុង។ បន្ទះសៀគ្វី និងបន្ទះសៀគ្វីអាចដាក់នៅក្បែរគ្នា។ ប្រសិនបើឧបករណ៍សម្ងួតដោយសុញ្ញកាសត្រូវបានបែងចែកជាស្រទាប់ជាច្រើនដោយចាន សូមដាក់បន្ទះសៀគ្វីនៅក្នុងបន្ទប់ខាងក្រោម និងបន្ទះសៀគ្វីនៅក្នុងបន្ទប់ខាងលើ។ ទម្លាក់ដំណោះស្រាយ trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane ចំនួន 100 μL លើបន្ទះកញ្ចក់ ហើយអនុវត្តសុញ្ញកាសសម្រាប់ស៊ីលីនីស្យុង។
រលាយកោសិកា Caco-2 កកមួយដបក្នុងអាងងូតទឹកសីតុណ្ហភាព 37°C បន្ទាប់មកផ្ទេរកោសិកាដែលរលាយទៅក្នុងដប T75 ដែលមានផ្ទុកសារធាតុ Caco-2 ដែលបានកំដៅមុននៅសីតុណ្ហភាព 37°C ចំនួន 15 មីលីលីត្រ។
ដើម្បីឆ្លងកាត់កោសិកា Caco-2 ក្នុងកម្រិតរលាយប្រហែល 90% ត្រូវកំដៅឧបករណ៍ផ្ទុក Caco-2, PBS និង 0.25% trypsin/1 mM EDTA ក្នុងអាងទឹកដែលមានសីតុណ្ហភាព 37°C ជាមុន។
ស្រូបយកឧបករណ៍ផ្ទុកដោយការស្រូបយកក្នុងសុញ្ញកាស។ លាងសម្អាតកោសិកាពីរដងជាមួយនឹងសារធាតុ PBS ក្តៅឧណ្ហៗ 5 មីលីលីត្រ ដោយការស្រូបយកក្នុងសុញ្ញកាសម្តងទៀត និងបន្ថែមសារធាតុ PBS ថ្មី។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ១៦ ខែកក្កដា ឆ្នាំ ២០២២
