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मानव आंत का आकारिक विकास त्रिविमीय उपकला सूक्ष्म संरचना और स्थानिक संगठन की क्रिप्ट-विलस विशेषताओं को स्थापित करता है। यह अनूठी संरचना बेसल क्रिप्ट में स्टेम सेल निके को बाह्य सूक्ष्मजीव प्रतिजनों और उनके चयापचयों से बचाकर आंत के समस्थिति को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, आंतों के विली और स्रावित श्लेष्मा कार्यात्मक रूप से विभेदित उपकला कोशिकाओं को आंतों की श्लेष्मा सतह पर एक सुरक्षात्मक अवरोध प्रदान करते हैं। इसलिए, त्रिविमीय उपकला संरचनाओं का पुनर्निर्माण इन विट्रो आंत मॉडल के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, ऑर्गेनिक मिमेटिक गट-ऑन-ए-चिप उन्नत शारीरिक कार्यों और जैव यांत्रिकी के साथ आंतों के उपकला के सहज त्रिविमीय आकारिक विकास को प्रेरित कर सकता है। यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप के साथ-साथ एक ट्रांसवेल एम्बेडेड हाइब्रिड चिप पर आंत में आंतों के आकारिक विकास को मजबूती से प्रेरित करने के लिए एक प्रतिलिपि योग्य प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम डिवाइस निर्माण, कैको-2 या आंतों के ऑर्गेनॉइड उपकला कोशिकाओं की पारंपरिक सेटिंग्स के साथ-साथ एक पर संवर्धन के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म, 3डी मॉर्फोजेनेसिस का प्रेरण, और कई इमेजिंग विधियों का उपयोग करके स्थापित 3डी एपिथेलिया का लक्षण वर्णन। यह प्रोटोकॉल 5 दिनों तक बेसोलेटरल द्रव प्रवाह को नियंत्रित करके कार्यात्मक आंत माइक्रोआर्किटेक्चर के पुनर्जनन को प्राप्त करता है। हमारी इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस विधि शारीरिक रूप से प्रासंगिक कतरनी तनाव और यांत्रिक गति का उपयोग करती है और इसके लिए जटिल सेल इंजीनियरिंग या हेरफेर की आवश्यकता नहीं होती है, जो अन्य मौजूदा तकनीकों से बेहतर प्रदर्शन कर सकती है। हमारा मानना ​​है कि हमारे प्रस्तावित प्रोटोकॉल का जैव चिकित्सा अनुसंधान समुदाय के लिए व्यापक प्रभाव हो सकता है, जो जैव चिकित्सा, नैदानिक ​​और औषधीय अनुप्रयोगों के लिए इन विट्रो में 3डी आंतों के उपकला परतों को पुनर्जीवित करने की एक विधि प्रदान करता है।
प्रयोगों से पता चलता है कि आंत-ऑन-ए-चिप1,2,3,4,5 या द्विस्तरीय माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों6,7 में संवर्धित आंतों की उपकला कैको-2 कोशिकाएं अंतर्निहित तंत्र की स्पष्ट समझ के बिना इन विट्रो में स्वतःस्फूर्त 3डी मॉर्फोजेनेसिस से गुजर सकती हैं। हमारे हाल के अध्ययन में, हमने पाया कि संस्कृति उपकरणों से बेसोलेटरली स्रावित मॉर्फोजेन प्रतिपक्षियों को हटाना इन विट्रो में 3डी उपकला मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त है, जिसे कैको-2 और रोगी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड्स द्वारा प्रदर्शित किया गया है। उपकला कोशिकाओं का सत्यापन किया गया। इस अध्ययन में, हमने विशेष रूप से गट-ऑन-ए-चिप और ट्रांसवेल इंसर्ट युक्त संशोधित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों, जिन्हें "हाइब्रिड चिप" कहा जाता है, में एक शक्तिशाली Wnt प्रतिपक्षी, डिककोफ-1 (DKK-1) के कोशिका उत्पादन और सांद्रता वितरण पर ध्यान केंद्रित किया। हमने प्रदर्शित किया कि ऑन-चिप आंत में बाह्य Wnt प्रतिपक्षियों (जैसे DKK-1, Wnt रिप्रेसर 1, स्रावित फ्रिज़ल्ड-संबंधित प्रोटीन 1, या सोगी-1) को जोड़ने से आकारिकी बाधित होती है या पूर्व-संरचित 3D उपकला परत बाधित होती है, जिससे पता चलता है कि संवर्धन के दौरान प्रतिपक्षी तनाव इन विट्रो में आंतों की आकारिकी के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, उपकला इंटरफ़ेस पर मजबूत आकारिकी प्राप्त करने का एक व्यावहारिक तरीका सक्रिय फ्लशिंग (जैसे, गट-ऑन-ए-चिप या हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म में) या प्रसार द्वारा बेसोलेटरल कम्पार्टमेंट में Wnt प्रतिपक्षियों के स्तर को हटाना या न्यूनतम बनाए रखना है। बेसोलेटरल मीडिया (उदाहरण के लिए, कुओं में बड़े बेसोलेटरल जलाशयों में ट्रांसवेल इंसर्ट से)।
इस प्रोटोकॉल में, हम आंत-ऑन-ए-चिप माइक्रोडिवाइस और ट्रांसवेल-इन्सर्टेबल हाइब्रिड चिप्स (चरण 1-5) के निर्माण के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं, ताकि पॉलीडाइमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) आधारित छिद्रित झिल्लियों (चरण 6ए, 7ए, 8, 9) या ट्रांसवेल इन्सर्ट की पॉलिएस्टर झिल्लियों (चरण 6बी, 7बी, 8, 9) पर आंतों की उपकला कोशिकाओं को कल्चर किया जा सके और इन विट्रो में 3डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित किया जा सके (चरण 10)। हमने कई इमेजिंग विधियों (चरण 11-24) का उपयोग करके ऊतक-विशिष्ट हिस्टोजेनेसिस और वंश-निर्भर सेलुलर विभेदन के सूचक सेलुलर और आणविक विशेषताओं की भी पहचान की। हमने छिद्रित झिल्लियों के सतह संशोधन, 2डी मोनोलेयर के निर्माण और आंतों के जैव रासायनिक और जैवयांत्रिक सूक्ष्म वातावरण के पुनरुत्पादन सहित तकनीकी विवरणों के साथ दो कल्चर प्रारूपों में मानव आंतों की उपकला कोशिकाओं, जैसे कि कैको-2 या आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित किया। 2डी उपकला मोनोलेयर्स से 3डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, हमने कल्चर के बेसोलेटरल कम्पार्टमेंट में माध्यम प्रवाहित करके दोनों संवर्धित रूपों में मॉर्फोजेन प्रतिपक्षियों को हटा दिया। अंत में, हम एक पुनर्जीवित करने योग्य 3डी उपकला परत की उपयोगिता का प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं जिसका उपयोग मॉर्फोजेन-निर्भर उपकला वृद्धि, अनुदैर्ध्य मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों, रोगजनक संक्रमण, सूजन संबंधी चोट, उपकला बाधा शिथिलता और प्रोबायोटिक-आधारित उपचारों के उदाहरण के रूप में किया जा सकता है।
हमारा प्रोटोकॉल मौलिक (जैसे, आंतों की श्लेष्मा जीवविज्ञान, स्टेम सेल जीवविज्ञान और विकासात्मक जीवविज्ञान) और अनुप्रयुक्त अनुसंधान (जैसे, पूर्व-नैदानिक ​​दवा परीक्षण, रोग मॉडलिंग, ऊतक अभियांत्रिकी और गैस्ट्रोएंटरोलॉजी) में व्यापक प्रभाव वाले वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी हो सकता है। आंतों के उपकला के 3डी आकारिकी को इन विट्रो में प्रेरित करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल की पुनरुत्पादकता और मजबूती के कारण, हम कल्पना करते हैं कि हमारी तकनीकी रणनीति को आंतों के विकास, पुनर्जनन या समस्थिति के दौरान कोशिका संकेतन की गतिशीलता का अध्ययन करने वाले दर्शकों तक पहुँचाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हमारा प्रोटोकॉल विभिन्न संक्रामक एजेंटों जैसे नोरोवायरस 8, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2), क्लोस्ट्रीडियम डिफिसाइल, साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम 9 या विब्रियो कोलेरा के तहत संक्रमण की जांच के लिए उपयोगी है। रोग विकृति विज्ञान और रोगजनन के दर्शकों के लिए भी उपयोगी है। ऑन-चिप आंत माइक्रोफिजियोलॉजी प्रणाली का उपयोग अनुदैर्ध्य सह-संस्कृति 10 और उसके बाद मेजबान रक्षा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ में रोगजनक-संबंधित चोट की मरम्मत के आकलन की अनुमति दे सकता है 11। लीकी गट सिंड्रोम, सीलिएक रोग, क्रोहन रोग, अल्सरेटिव कोलाइटिस, पाउचिटिस, या इरिटेबल बाउल सिंड्रोम से जुड़े अन्य जीआई विकारों का अनुकरण तब किया जा सकता है जब रोगी की 3डी आंतों की उपकला परतों का उपयोग करके 3डी आंतों की उपकला परतें तैयार की जाती हैं। इन रोगों में विल्लोस शोष, क्रिप्ट छोटा होना, श्लेष्म क्षति, या बिगड़ा हुआ उपकला अवरोध शामिल हैं। बायोप्सी या स्टेम सेल-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड्स 12,13। रोग वातावरण की उच्च जटिलता को बेहतर ढंग से मॉडल करने के लिए, पाठक 3डी आंतों के विल्लोस-क्रिप्ट माइक्रोआर्किटेक्चर वाले मॉडल में रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) जैसे रोग-प्रासंगिक सेल प्रकारों को जोड़ने पर विचार कर सकते हैं। ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाएं, 5.
चूंकि 3डी उपकला सूक्ष्म संरचना को अनुभागन प्रक्रिया के बिना स्थिर और दृश्यित किया जा सकता है, इसलिए स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और उच्च-रिज़ॉल्यूशन या सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग पर काम करने वाले दर्शक उपकला निकेतों पर जीन और प्रोटीन की स्थानिक-सामयिक गतिशीलता के हमारे मानचित्रण में रुचि ले सकते हैं। प्रौद्योगिकी में रुचि। सूक्ष्मजीव या प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रिया। इसके अलावा, अनुदैर्ध्य मेजबान-सूक्ष्मजीव बायोम क्रॉसस्टॉक 10, 14 जो आंत के होमियोस्टेसिस का समन्वय करते हैं, विभिन्न सूक्ष्मजीव प्रजातियों, सूक्ष्मजीव समुदायों या मल माइक्रोबायोटा को सह-संवर्धन करके 3डी आंतों की श्लेष्म परत में स्थापित किया जा सकता है, विशेष रूप से गट-ऑन-ए-चिप में। इस प्लेटफॉर्म में। यह दृष्टिकोण विशेष रूप से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, मानव माइक्रोबायोम, कल्चरॉमिक्स और क्लिनिकल माइक्रोबायोलॉजी का अध्ययन करने वाले दर्शकों के लिए आकर्षक है जो प्रयोगशाला में पहले से असंवर्धित आंत माइक्रोबायोटा को विकसित करना चाहते हैं। यदि हमारे इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल को स्केलेबल कल्चर प्रारूपों, जैसे कि 24, 96 या 384 वेल प्लेटों में मल्टीवेल इंसर्ट, जो बेसोलेटरल कंपार्टमेंट को लगातार भरते हैं, के अनुकूल बनाया जा सकता है, तो प्रोटोकॉल को फार्मास्युटिकल, बायोमेडिकल या खाद्य उद्योग के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग या सत्यापन प्लेटफॉर्म विकसित करने वालों तक भी पहुंचाया जा सकता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हमने हाल ही में 24-वेल प्लेट प्रारूप में स्केलेबल मल्टीप्लेक्स उच्च-थ्रूपुट मॉर्फोजेनेसिस सिस्टम की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, कई ऑर्गन-ऑन-ए-चिप उत्पादों का व्यावसायीकरण किया गया है16,17,18। इसलिए, हमारी इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस विधि के सत्यापन में तेजी लाई जा सकती है और संभावित रूप से कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं, उद्योग या सरकार और नियामक एजेंसियों द्वारा सेलुलर रीप्रोग्रामिंग को समझने के लिए अपनाया जा सकता है। दवाओं या जैवचिकित्सीय पदार्थों के परीक्षण के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक स्तर पर इन विट्रो आंत आकारिकी का अध्ययन किया गया। दवा उम्मीदवारों के अवशोषण और परिवहन का मूल्यांकन 3डी आंत सरोगेट्स का उपयोग करके या आंत आकारिकी प्रक्रिया की पुनरुत्पादकता का आकलन करने के लिए कस्टम या वाणिज्यिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप मॉडल का उपयोग करके किया गया।
आंतों की उपकला संरचना के विकास का अध्ययन करने के लिए मानव-प्रासंगिक प्रायोगिक मॉडलों की संख्या सीमित रही है, जिसका मुख्य कारण इन विट्रो में 3डी संरचना को प्रेरित करने के लिए लागू करने योग्य प्रोटोकॉल की कमी है। वास्तव में, आंतों की संरचना के विकास के बारे में वर्तमान ज्ञान का अधिकांश भाग पशु अध्ययनों (जैसे, ज़ेब्राफ़िश20, चूहे21 या मुर्गियाँ22) पर आधारित है। हालाँकि, ये श्रम और लागत-प्रधान हैं, नैतिक रूप से संदिग्ध हो सकते हैं, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि ये मानव विकासात्मक प्रक्रियाओं को सटीक रूप से निर्धारित नहीं करते हैं। इन मॉडलों की बहु-स्तरीय परीक्षण क्षमता भी बहुत सीमित है। इसलिए, इन विट्रो में 3डी ऊतक संरचनाओं को पुनर्जीवित करने का हमारा प्रोटोकॉल इन विवो पशु मॉडलों के साथ-साथ अन्य पारंपरिक स्थिर 2डी कोशिका संवर्धन मॉडलों से बेहतर प्रदर्शन करता है। जैसा कि पहले बताया गया है, 3डी उपकला संरचनाओं का उपयोग करके हम विभिन्न श्लेष्मा या प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं के जवाब में क्रिप्ट-विलस अक्ष में विभेदित कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण की जांच कर सके। 3डी उपकला परतें यह अध्ययन करने के लिए एक स्थान प्रदान कर सकती हैं कि सूक्ष्मजीव कोशिकाएं कैसे विकसित होती हैं। मेजबान कारकों (जैसे, आंतरिक बनाम बाहरी श्लेष्म परतें, IgA और रोगाणुरोधी पेप्टाइड का स्राव) के जवाब में स्थानिक निकेत और पारिस्थितिक विकास बनाने के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं। इसके अलावा, 3D उपकला आकृति विज्ञान हमें यह समझने में मदद कर सकता है कि आंत माइक्रोबायोटा अपने समुदायों को कैसे संरचित करता है और सहक्रियात्मक रूप से माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स (जैसे, लघु-श्रृंखला वसा अम्ल) का उत्पादन करता है जो बेसल क्रिप्ट्स में कोशिकीय संगठन और स्टेम सेल निकेत को आकार देते हैं। इन विशेषताओं को केवल तभी प्रदर्शित किया जा सकता है जब 3D उपकला परतें इन विट्रो में स्थापित की जाती हैं।
3डी आंतों की उपकला संरचनाओं के निर्माण की हमारी विधि के अलावा, कई इन विट्रो विधियाँ भी हैं। आंतों के ऑर्गेनॉइड कल्चर एक अत्याधुनिक ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक है जो विशिष्ट मॉर्फोजेन स्थितियों के तहत आंतों की स्टेम कोशिकाओं की खेती पर आधारित है23,24,25। हालांकि, परिवहन विश्लेषण या मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों के लिए 3डी ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि आंतों का लुमेन ऑर्गेनॉइड के भीतर बंद होता है और इसलिए, माइक्रोबियल कोशिकाओं या बाह्य प्रतिजनों जैसे लुमेन घटकों का प्रवेश सीमित होता है। माइक्रोइंजेक्टर26,27 का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड लुमेन तक पहुंच में सुधार किया जा सकता है, लेकिन यह विधि आक्रामक और श्रमसाध्य है और इसे करने के लिए विशेष ज्ञान की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, स्थिर स्थितियों के तहत हाइड्रोजेल मचानों में बनाए रखी गई पारंपरिक ऑर्गेनॉइड संस्कृतियाँ सक्रिय इन विवो बायोमैकेनिक्स को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करती हैं।
कई शोध समूहों द्वारा अपनाए गए अन्य दृष्टिकोणों में पूर्व-संरचित 3डी हाइड्रोजेल स्कैफोल्ड का उपयोग करके जेल की सतह पर पृथक मानव आंत्र कोशिकाओं की संवर्धन द्वारा आंत्र उपकला संरचना की नकल की जाती है। 3डी-मुद्रित, माइक्रो-मिल्ड या लिथोग्राफिक रूप से निर्मित मोल्ड का उपयोग करके हाइड्रोजेल स्कैफोल्ड का निर्माण किया जाता है। यह विधि शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट के साथ इन विट्रो में पृथक उपकला कोशिकाओं की स्व-संगठित व्यवस्था को दर्शाती है, जिससे स्कैफोल्ड में स्ट्रोमल कोशिकाओं को शामिल करके एक उच्च पहलू अनुपात उपकला संरचना और स्ट्रोमा-उपकला क्रॉसस्टॉक स्थापित होता है। हालांकि, पूर्व-संरचित स्कैफोल्ड की प्रकृति स्वयं सहज मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रिया के प्रदर्शन को रोक सकती है। ये मॉडल गतिशील ल्यूमिनल या इंटरस्टिशियल प्रवाह भी प्रदान नहीं करते हैं, जिनमें द्रव कतरनी तनाव की कमी होती है जिसकी आंत्र कोशिकाओं को मॉर्फोजेनेसिस से गुजरने और शारीरिक कार्य प्राप्त करने के लिए आवश्यकता होती है। एक अन्य हालिया अध्ययन में माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में हाइड्रोजेल स्कैफोल्ड का उपयोग किया गया और लेजर-एचिंग तकनीकों का उपयोग करके आंत्र उपकला संरचनाओं को पैटर्न किया गया। माउस आंत्र ऑर्गेनोइड्स का अनुसरण किया जाता है। आंतों की नलिकाकार संरचनाओं को बनाने के लिए उत्कीर्ण पैटर्न का उपयोग किया जाता है, और माइक्रोफ्लुइडिक्स मॉड्यूल का उपयोग करके आंत्र के भीतर तरल प्रवाह को दोहराया जा सकता है। हालांकि, यह मॉडल न तो स्वतःस्फूर्त आकारिकी प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करता है और न ही इसमें आंत्र की यांत्रिक जैविक गतियाँ शामिल हैं। इसी समूह की 3डी प्रिंटिंग तकनीकों ने स्वतःस्फूर्त आकारिकी प्रक्रियाओं के साथ लघु आंत्र नलिकाएँ बनाने में सफलता प्राप्त की। नलिका के भीतर विभिन्न आंत्र खंडों के जटिल निर्माण के बावजूद, इस मॉडल में भी आंत्र के भीतर तरल प्रवाह और यांत्रिक विरूपण का अभाव है। इसके अतिरिक्त, मॉडल की संचालन क्षमता सीमित हो सकती है, विशेष रूप से बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया पूरी होने के बाद, जिससे प्रयोगात्मक स्थितियाँ या कोशिका-से-कोशिका अंतःक्रियाएँ बाधित हो सकती हैं। इसके बजाय, हमारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल स्वतःस्फूर्त आंत्र आकारिकी, शारीरिक रूप से प्रासंगिक अपरूपण तनाव, आंत्र गतिशीलता की नकल करने वाली जैवयांत्रिकी, स्वतंत्र शीर्ष और आधार-पार्श्व डिब्बों की सुलभता और मॉड्यूलरिटी के जटिल जैविक सूक्ष्म वातावरण का पुनर्निर्माण प्रदान करता है। इसलिए, हमारा इन विट्रो 3डी आकारिकी प्रोटोकॉल मौजूदा विधियों की चुनौतियों को दूर करने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है।
हमारा प्रोटोकॉल पूरी तरह से 3डी उपकला आकारिकी पर केंद्रित है, जिसमें केवल उपकला कोशिकाएं ही कल्चर में होती हैं और आसपास की अन्य प्रकार की कोशिकाएं जैसे कि मेसेनकाइमल कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं नहीं होती हैं। जैसा कि पहले बताया गया है, हमारे प्रोटोकॉल का मूल आधार माध्यम के बेसोलेटरल साइड पर स्रावित मॉर्फोजेन अवरोधकों को हटाकर उपकला आकारिकी को प्रेरित करना है। जबकि हमारे गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप की मजबूत मॉड्यूलरिटी हमें लहरदार 3डी उपकला परत को पुनः बनाने की अनुमति देती है, अतिरिक्त जैविक जटिलताएं जैसे कि उपकला-मेसेनकाइमल अंतःक्रियाएं33,34, बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) निक्षेपण35 और, हमारे मॉडल में, क्रिप्ट-विलस विशेषताएं जो बेसल क्रिप्ट में स्टेम सेल निचे को दर्शाती हैं, पर आगे विचार किया जाना बाकी है। मेसेनकाइम में स्ट्रोमल कोशिकाएं (जैसे, फाइब्रोब्लास्ट) ईसीएम प्रोटीन के उत्पादन और आंतों की आकारिकी के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। vivo35,37,38. हमारे मॉडल में मेसेनकाइमल कोशिकाओं को जोड़ने से मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रिया और कोशिका आसंजन दक्षता में वृद्धि हुई। एंडोथेलियल परत (यानी, केशिकाएं या लसीका वाहिकाएं) आंत के सूक्ष्म वातावरण में आणविक परिवहन39 और प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती40 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके अलावा, ऊतक मॉडलों के बीच जुड़ने योग्य संवहनी घटक एक पूर्वापेक्षा हैं जब ऊतक मॉडलों को बहु-अंग अंतःक्रियाओं को प्रदर्शित करने के लिए डिज़ाइन किया जाता है। इसलिए, अंग-स्तरीय संकल्प के साथ अधिक सटीक शारीरिक विशेषताओं को मॉडल करने के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं को शामिल करने की आवश्यकता हो सकती है। आंत्र रोग की नकल के संदर्भ में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, प्रतिजन प्रस्तुति, सहज अनुकूली प्रतिरक्षा क्रॉसस्टॉक और ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा को प्रदर्शित करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी आवश्यक हैं।
हाइब्रिड चिप्स का उपयोग गट-ऑन-ए-चिप की तुलना में अधिक सरल है क्योंकि डिवाइस सेटअप आसान है और ट्रांसवेल इंसर्ट के उपयोग से आंत उपकला की स्केलेबल कल्चर संभव हो पाती है। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलिएस्टर झिल्ली वाले ट्रांसवेल इंसर्ट लोचदार नहीं होते हैं और पेरिस्टाल्टिक जैसी गतियों का अनुकरण नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, हाइब्रिड चिप में रखे गए ट्रांसवेल इंसर्ट का एपिकल कम्पार्टमेंट स्थिर रहता है और एपिकल साइड पर कोई शियर स्ट्रेस नहीं होता है। स्पष्ट रूप से, एपिकल कम्पार्टमेंट के स्थिर गुण हाइब्रिड चिप्स में दीर्घकालिक जीवाणु सह-संस्कृति को शायद ही संभव बना पाते हैं। हालांकि हाइब्रिड चिप्स का उपयोग करते समय हम ट्रांसवेल इंसर्ट में 3डी मॉर्फोजेनेसिस को मजबूती से प्रेरित कर सकते हैं, शारीरिक रूप से प्रासंगिक बायोमैकेनिक्स और एपिकल द्रव प्रवाह की कमी संभावित अनुप्रयोगों के लिए हाइब्रिड चिप प्लेटफॉर्म की व्यवहार्यता को सीमित कर सकती है।
गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप कल्चर में मानव क्रिप्ट-विलस अक्ष के पूर्ण पैमाने पर पुनर्निर्माण पूरी तरह से स्थापित नहीं हो पाए हैं। चूंकि आकारिकी एक उपकला मोनोलेयर से शुरू होती है, इसलिए 3डी माइक्रोआर्किटेक्चर जरूरी नहीं कि जीवित जीवों में क्रिप्ट्स के साथ आकारिकीय समानता प्रदान करें। हालांकि हमने माइक्रोइंजीनियर्ड 3डी उपकला में बेसल क्रिप्ट डोमेन के पास प्रोलिफेरेटिंग सेल आबादी की विशेषता बताई, लेकिन क्रिप्ट और विल्लस क्षेत्रों को स्पष्ट रूप से सीमांकित नहीं किया गया था। हालांकि चिप पर ऊंचे ऊपरी चैनल माइक्रोइंजीनियर्ड उपकला की ऊंचाई में वृद्धि करते हैं, फिर भी अधिकतम ऊंचाई लगभग 300-400 µm तक सीमित है। छोटी और बड़ी आंतों में मानव आंतों के क्रिप्ट्स की वास्तविक गहराई क्रमशः लगभग 135 µm और लगभग 400 µm है, और छोटी आंत के विल्लस की ऊंचाई लगभग 600 µm41 है।
इमेजिंग के दृष्टिकोण से, 3डी माइक्रोआर्किटेक्चर की इन सीटू सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग चिप पर मौजूद आंत तक ही सीमित हो सकती है, क्योंकि ऑब्जेक्टिव लेंस से उपकला परत तक की आवश्यक कार्य दूरी कुछ मिलीमीटर के क्रम में होती है। इस समस्या को दूर करने के लिए, एक दूरस्थ ऑब्जेक्टिव की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, पीडीएमएस की उच्च लोच के कारण इमेजिंग नमूना तैयार करने के लिए पतले सेक्शन बनाना चुनौतीपूर्ण है। साथ ही, चिप पर मौजूद आंत के परत-दर-परत माइक्रोफैब्रिकेशन में प्रत्येक परत के बीच स्थायी आसंजन शामिल होता है, इसलिए उपकला परत की सतह संरचना की जांच करने के लिए ऊपरी परत को खोलना या हटाना अत्यंत चुनौतीपूर्ण है। उदाहरण के लिए, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) का उपयोग करके ऐसा किया जा सकता है।
पीडीएमएस की जलविरोधकता, जलविरोधक छोटे अणुओं से संबंधित सूक्ष्म द्रव-आधारित अध्ययनों में एक सीमित कारक रही है, क्योंकि पीडीएमएस ऐसे जलविरोधक अणुओं को गैर-विशिष्ट रूप से सोख सकता है। पीडीएमएस के विकल्प के रूप में अन्य बहुलक सामग्रियों पर विचार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, जलविरोधक अणुओं के सोखने को कम करने के लिए पीडीएमएस की सतह का संशोधन (जैसे, लिपोफिलिक सामग्री 42 या पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) 43 के साथ कोटिंग) पर विचार किया जा सकता है।
अंत में, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग या "वन-साइज़-फिट्स-ऑल" उपयोगकर्ता-अनुकूल प्रायोगिक मंच प्रदान करने के संदर्भ में हमारी विधि का अच्छी तरह से वर्णन नहीं किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रत्येक माइक्रोडिवाइस के लिए एक सिरिंज पंप की आवश्यकता होती है, जो CO2 इनक्यूबेटर में जगह घेरता है और बड़े पैमाने पर प्रयोगों को रोकता है। इस सीमा को नवीन कल्चर प्रारूपों (जैसे, 24-वेल, 96-वेल, या 384-वेल पोरस इंसर्ट जो बेसोलेटरल मीडिया की निरंतर पुनःपूर्ति और निष्कासन की अनुमति देते हैं) की स्केलेबिलिटी द्वारा काफी हद तक सुधारा जा सकता है।
मानव आंतों के उपकला के 3डी मॉर्फोजेनेसिस को इन विट्रो में प्रेरित करने के लिए, हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप आंत उपकरण का उपयोग किया जिसमें दो समानांतर माइक्रोचैनल और उनके बीच एक लोचदार छिद्रित झिल्ली थी जो ल्यूमेन-केशिका इंटरफ़ेस बनाती थी। हमने एक एकल-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण (एक हाइब्रिड चिप) के उपयोग को भी प्रदर्शित किया जो ट्रांसवेल इंसर्ट पर विकसित ध्रुवीकृत उपकला परतों के नीचे निरंतर बेसोलेटरल प्रवाह प्रदान करता है। दोनों प्लेटफार्मों में, बेसोलेटरल कम्पार्टमेंट से मॉर्फोजेन विरोधियों को हटाने के लिए प्रवाह के दिशात्मक हेरफेर को लागू करके विभिन्न मानव आंतों के उपकला कोशिकाओं के मॉर्फोजेनेसिस को प्रदर्शित किया जा सकता है। पूरी प्रायोगिक प्रक्रिया (चित्र 1) में पाँच भाग होते हैं: (i) आंत चिप या ट्रांसवेल सम्मिलित करने योग्य हाइब्रिड चिप का माइक्रोफैब्रिकेशन (चरण 1-5; बॉक्स 1), (ii) आंतों के उपकला कोशिकाओं (कैको-2 कोशिकाओं) या मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स की तैयारी; बॉक्स 2-5), (iii) आंतों के चिप्स या हाइब्रिड चिप्स पर आंतों की उपकला कोशिकाओं की संस्कृति (चरण 6-9), (iv) इन विट्रो में 3डी मॉर्फोजेनेसिस का प्रेरण (चरण 10) और (v) 3डी उपकला सूक्ष्म संरचना का लक्षण वर्णन (चरण 11-24)। अंत में, इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस की प्रभावशीलता को मान्य करने के लिए एक उपयुक्त नियंत्रण समूह (जिस पर आगे चर्चा की गई है) को डिज़ाइन किया गया था, जिसमें उपकला मॉर्फोजेनेसिस की तुलना स्थानिक, लौकिक, सशर्त या प्रक्रियात्मक नियंत्रणों से की गई थी।
हमने दो अलग-अलग कल्चर प्लेटफॉर्म का उपयोग किया: सीधे चैनलों या गैर-रेखीय घुमावदार चैनलों के साथ गट-ऑन-ए-चिप, या माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में ट्रांसवेल (TW) इंसर्ट वाले हाइब्रिड चिप्स, जिन्हें बॉक्स 1 और चरण 1-5 में वर्णित अनुसार निर्मित किया गया था। "डिवाइस निर्माण" एक सिंगल चिप या हाइब्रिड चिप बनाने के मुख्य चरणों को दर्शाता है। "मानव आंतों की उपकला कोशिकाओं का कल्चर" इस ​​प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए कोशिका स्रोत (Caco-2 या मानव आंतों के ऑर्गेनोइड) और कल्चर प्रक्रिया की व्याख्या करता है। "इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस" उन समग्र चरणों को दर्शाता है जिनमें Caco-2 या ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं को एक आंतों की चिप या हाइब्रिड चिप के ट्रांसवेल इंसर्ट पर कल्चर किया जाता है, जिसके बाद 3D मॉर्फोजेनेसिस का प्रेरण और एक विशिष्ट उपकला संरचना का निर्माण होता है। प्रत्येक तीर के नीचे प्रोग्राम चरण संख्या या बॉक्स संख्या प्रदर्शित होती है। यह एप्लिकेशन उदाहरण प्रदान करता है कि कैसे स्थापित आंतों की उपकला परतों का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कोशिका विभेदन लक्षण वर्णन, आंत शरीर विज्ञान अध्ययन, आदि में। होस्ट-माइक्रोबायोम पारिस्थितिकी तंत्र और रोग मॉडलिंग। "सेल डिफरेंशिएशन" में इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां आंत चिप पर उत्पन्न 3डी कैको-2 उपकला परत में व्यक्त नाभिक, एफ-एक्टिन और एमयूसी2 को दर्शाती हैं। एमयूसी2 सिग्नलिंग गोब्लेट कोशिकाओं और श्लेष्म सतहों से स्रावित बलगम में मौजूद है। आंत शरीर विज्ञान में फ्लोरोसेंट छवियां फ्लोरोसेंट गेहूं जर्म एग्लूटिनिन का उपयोग करके सियालिक एसिड और एन-एसिटाइलग्लूकोसामाइन अवशेषों के लिए दाग लगाकर उत्पादित बलगम को दर्शाती हैं। "होस्ट-माइक्रोब को-कल्चर" में दो अतिव्यापी छवियां चिप पर आंत में प्रतिनिधि होस्ट-माइक्रोबायोम को-कल्चर को दर्शाती हैं। बायां पैनल माइक्रोइंजीनियर्ड 3डी कैको-2 उपकला कोशिकाओं के साथ हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) व्यक्त करने वाले ई. कोलाई के को-कल्चर को दर्शाता है। दायां पैनल 3डी कैको-2 उपकला कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित जीएफपी ई. कोलाई के स्थानीयकरण को दर्शाता है। इसके बाद एफ-एक्टिन (लाल) और नाभिक (नीला) के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग की गई। रोग मॉडलिंग, जीवाणु प्रतिजनों (जैसे, लिपोपॉलीसेकेराइड, एलपीएस) और प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, पीबीएमसी; हरा) के साथ शारीरिक चुनौती के तहत आंत की सूजन चिप्स में स्वस्थ बनाम लीकी आंत को दर्शाती है। 3डी उपकला परत स्थापित करने के लिए कैको-2 कोशिकाओं को संवर्धित किया गया। स्केल बार, 50 µm। निचली पंक्ति में चित्र: "कोशिकाओं का विभेदन" संदर्भ 2 से अनुमति के साथ अनुकूलित। ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस; संदर्भ 5 से अनुमति के साथ पुनरुत्पादित। एनएएस; "मेजबान-सूक्ष्मजीव सह-संवर्धन" संदर्भ 3 से अनुमति के साथ अनुकूलित। एनएएस; "रोग मॉडलिंग" संदर्भ 5 से अनुमति के साथ अनुकूलित। एनएएस।
गट-ऑन-चिप और हाइब्रिड चिप्स दोनों को पीडीएमएस प्रतिकृतियों का उपयोग करके निर्मित किया गया था, जिन्हें सॉफ्ट लिथोग्राफी1,44 द्वारा सिलिकॉन मोल्ड से निकाला गया था और एसयू-8 के साथ पैटर्न किया गया था। प्रत्येक चिप में माइक्रोचैनलों का डिज़ाइन अपरूपण तनाव और हाइड्रोडायनामिक दबाव1,4,12 जैसे हाइड्रोडायनामिक्स को ध्यान में रखते हुए निर्धारित किया जाता है। मूल गट-ऑन-चिप डिज़ाइन (विस्तारित डेटा चित्र 1ए), जिसमें दो समानांतर सीधे माइक्रोचैनल शामिल थे, एक जटिल गट-ऑन-चिप (विस्तारित डेटा चित्र 1बी) में विकसित हुआ है जिसमें द्रव निवास समय में वृद्धि, गैर-रेखीय प्रवाह पैटर्न और संवर्धित कोशिकाओं के बहुअक्षीय विरूपण (चित्र 2ए-एफ) 12 को प्रेरित करने के लिए घुमावदार माइक्रोचैनलों की एक जोड़ी शामिल है। जब अधिक जटिल आंत जैवयांत्रिकी को पुन: उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है, तो जटिल गट-ऑन-चिप का चयन किया जा सकता है। हमने प्रदर्शित किया है कि कनवोल्यूटेड गट-चिप भी समान समय सीमा में समान डिग्री के साथ 3डी मॉर्फोजेनेसिस को दृढ़ता से प्रेरित करता है। मूल गट-चिप की तुलना में उपकला वृद्धि, संवर्धित कोशिका प्रकार की परवाह किए बिना, देखी गई। इसलिए, 3डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, रैखिक और जटिल ऑन-चिप गट डिज़ाइन विनिमेय हैं। SU-8 पैटर्न के साथ सिलिकॉन मोल्ड पर तैयार किए गए PDMS प्रतिकृतियों ने डीमोल्डिंग के बाद नकारात्मक विशेषताएं प्रदान कीं (चित्र 2a)। चिप पर गट बनाने के लिए, तैयार ऊपरी PDMS परत को क्रमिक रूप से एक झरझरा PDMS फिल्म से जोड़ा गया और फिर कोरोना ट्रीटर का उपयोग करके अपरिवर्तनीय बंधन द्वारा निचली PDMS परत के साथ संरेखित किया गया (चित्र 2b-f)। हाइब्रिड चिप्स बनाने के लिए, तैयार PDMS प्रतिकृतियों को ग्लास स्लाइड से जोड़ा गया ताकि एकल-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण बनाए जा सकें जिनमें ट्रांसवेल इंसर्ट समाहित हो सकें (चित्र 2h और विस्तारित डेटा चित्र 2)। बंधन प्रक्रिया PDMS प्रतिकृति और ग्लास की सतहों को ऑक्सीजन प्लाज्मा या कोरोना उपचार से उपचारित करके की जाती है। सिलिकॉन ट्यूब से जुड़े माइक्रोफैब्रिकेटेड डिवाइस के नसबंदी के बाद, डिवाइस सेटअप 3डी प्रदर्शन के लिए तैयार था। आंतों के उपकला का आकारिकी विकास (चित्र 2जी)।
a, SU-8 पैटर्न वाले सिलिकॉन मोल्ड से PDMS भागों की तैयारी का योजनाबद्ध चित्रण। बिना पका हुआ PDMS घोल सिलिकॉन मोल्ड पर डाला गया (बाएं), 60 °C पर पकाया गया (मध्य) और मोल्ड से निकाला गया (दाएं)। मोल्ड से निकाले गए PDMS को टुकड़ों में काटकर आगे उपयोग के लिए साफ किया गया। b, PDMS की ऊपरी परत तैयार करने के लिए उपयोग किए गए सिलिकॉन मोल्ड की तस्वीर। c, PDMS छिद्रित झिल्ली बनाने के लिए उपयोग किए गए सिलिकॉन मोल्ड की तस्वीर। d, ऊपरी और निचले PDMS घटकों और असेंबल किए गए ऑन-चिप आंत उपकरण की तस्वीरों की एक श्रृंखला। e, ऊपरी, झिल्ली और निचले PDMS घटकों के संरेखण का योजनाबद्ध चित्रण। प्रत्येक परत को प्लाज्मा या कोरोना उपचार द्वारा अपरिवर्तनीय रूप से जोड़ा जाता है। f, सुपरइम्पोज़्ड कनवोल्यूटेड माइक्रोचैनल और वैक्यूम चैंबर के साथ निर्मित गट-ऑन-ए-चिप उपकरण का योजनाबद्ध चित्रण। g, माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर के लिए गट-ऑन-ए-चिप की स्थापना। सिलिकॉन ट्यूब के साथ असेंबल किए गए चिप पर निर्मित गट। सिरिंज को कवरस्लिप पर रखा गया था। चिप डिवाइस को प्रोसेसिंग के लिए 150 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन पर रखा गया था। सिलिकॉन ट्यूब को बंद करने के लिए बाइंडर का उपयोग किया जाता है। हाइब्रिड चिप निर्माण और हाइब्रिड चिप्स का उपयोग करके 3डी मॉर्फोजेनेसिस के दृश्य स्नैपशॉट। आंतों की उपकला कोशिकाओं की 2डी मोनोलेयर्स को कल्चर करने के लिए स्वतंत्र रूप से तैयार किए गए ट्रांसवेल इंसर्ट को आंतों के 3डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए हाइब्रिड चिप में डाला गया था। ट्रांसवेल इंसर्ट पर स्थापित सेल परत के नीचे माइक्रोचैनल के माध्यम से माध्यम प्रवाहित किया जाता है। स्केल बार, 1 सेमी। संदर्भ 4 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। एल्सेवियर।
इस प्रोटोकॉल में, Caco-2 सेल लाइन और आंतों के ऑर्गेनॉइड्स को उपकला स्रोतों के रूप में उपयोग किया गया (चित्र 3a)। दोनों प्रकार की कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से संवर्धित किया गया (बॉक्स 2 और बॉक्स 5) और ऑन-चिप आंत या ट्रांसवेल इंसर्ट के ECM-लेपित माइक्रोचैनलों में सीडिंग के लिए उपयोग किया गया। जब कोशिकाएं सघन हो जाती हैं (>95% फ्लास्क में कवरेज), तो T-फ्लास्क में नियमित रूप से संवर्धित Caco-2 कोशिकाओं (पैसेज 10 और 50 के बीच) को ट्रिप्सिनाइजेशन द्रव द्वारा पृथक कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए निकाला जाता है (बॉक्स 2)। आंतों की बायोप्सी या सर्जिकल रिसेक्शन से प्राप्त मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड्स को संरचनात्मक सूक्ष्म वातावरण को सहारा देने के लिए 24-वेल प्लेटों में मैट्रिजेल स्कैफोल्ड डोम में संवर्धित किया गया। बॉक्स 3 में वर्णित अनुसार तैयार किए गए आवश्यक मॉर्फोजेन (जैसे Wnt, R-स्पोंडिन और नोगिन) और वृद्धि कारकों वाले माध्यम को हर दूसरे दिन तब तक पूरक किया गया जब तक कि ऑर्गेनॉइड्स लगभग 500 µm तक नहीं बढ़ गए। व्यास में। पूरी तरह से विकसित ऑर्गेनॉइड्स को काटा जाता है और चिप पर आंत या ट्रांसवेल इंसर्ट पर सीडिंग के लिए एकल कोशिकाओं में अलग किया जाता है (बॉक्स 5)। जैसा कि हमने पहले बताया है, इसे रोग के प्रकार12,13 (जैसे अल्सरेटिव कोलाइटिस, क्रोहन रोग, कोलोरेक्टल कैंसर, या सामान्य दाता), घाव के स्थान (जैसे, घाव बनाम गैर-घाव वाला क्षेत्र) और पाचन तंत्र में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थान (जैसे, ग्रहणी, जेजुनम, इलियम, सीकम, बृहदान्त्र, या मलाशय) के अनुसार विभेदित किया जा सकता है। हम बॉक्स 5 में कोलोनिक ऑर्गेनॉइड्स (कोलोइड्स) की खेती के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिन्हें आमतौर पर छोटी आंत के ऑर्गेनॉइड्स की तुलना में मॉर्फोजेन की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है।
a, गट चिप में आंत के आकारिकी को प्रेरित करने के लिए कार्यप्रवाह। इस प्रोटोकॉल में 3डी आकारिकी को प्रदर्शित करने के लिए कैको-2 मानव आंत उपकला और आंत ऑर्गेनोइड्स का उपयोग किया जाता है। पृथक उपकला कोशिकाओं को तैयार गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस (चिप तैयारी) में बोया गया था। एक बार जब कोशिकाएं बोई जाती हैं (बोई गई) और दिन 0 (D0) पर PDMS छिद्रित झिल्ली से जुड़ जाती हैं (जुड़ी हुई), तो एपिकल (AP) प्रवाह शुरू किया जाता है और पहले 2 दिनों तक बनाए रखा जाता है (प्रवाह, AP, D0-D2)। जब एक पूर्ण 2डी मोनोलेयर बन जाता है, तो चक्रीय खिंचाव गतियों (खिंचाव, प्रवाह, AP और BL) के साथ बेसोलेटरल (BL) प्रवाह भी शुरू किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर के 5 दिनों के बाद आंत की 3डी आकारिकी स्वतः ही हो गई (आकारिकी, D5)। फेज कंट्रास्ट छवियां प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण या समय बिंदु पर कैको-2 कोशिकाओं की प्रतिनिधि आकृति विज्ञान को दर्शाती हैं (बार ग्राफ, 100 µm)। चार योजनाबद्ध आंत के आकारिकी के संबंधित अनुक्रमों को दर्शाने वाले आरेख (ऊपर दाईं ओर)। आरेख में बिंदीदार तीर द्रव प्रवाह की दिशा को दर्शाते हैं। b, स्थापित 3D Caco-2 उपकला की सतह स्थलाकृति को दर्शाने वाली SEM छवि (बाईं ओर)। आवर्धित क्षेत्र (सफेद बिंदीदार बॉक्स) को उजागर करने वाला इनसेट 3D Caco-2 परत पर पुनर्जीवित माइक्रोविली को दर्शाता है (दाईं ओर)। c, स्थापित Caco-2 3D, क्लॉडिन (ZO-1, लाल) और निरंतर ब्रश बॉर्डर झिल्ली का क्षैतिज अग्र दृश्य, जिसे F-एक्टिन (हरा) और नाभिक (नीला) के रूप में लेबल किया गया है। आंतों के चिप्स पर उपकला कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस कन्फोकल विज़ुअलाइज़ेशन। मध्य आरेख की ओर इंगित करने वाले तीर प्रत्येक कन्फोकल दृश्य के लिए फोकल तल के स्थान को दर्शाते हैं। d, चिप पर संवर्धित ऑर्गेनॉइड्स में रूपात्मक परिवर्तनों का समय क्रम, जो चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा 3, 7, 9, 11 और 13 दिनों में प्राप्त किया गया है। इनसेट (ऊपर) (दाएं) दी गई छवि का उच्च आवर्धन दर्शाता है। e, 7वें दिन लिए गए स्लाइस पर आंत में स्थापित ऑर्गेनॉइड 3D उपकला का DIC फोटोमाइक्रोग्राफ। f, उपकला परत पर क्रमशः 3 दिनों (बाएं) और 13-दिन (मध्य) के लिए आंत चिप्स पर विकसित स्टेम कोशिकाओं (LGR5; मैजेंटा), गोब्लेट कोशिकाओं (MUC2; हरा), F-एक्टिन (ग्रे) और नाभिक (सियान) के मार्करों को दर्शाने वाली ओवरलेड इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। विस्तारित डेटा चित्र 3 भी देखें, जो MUC2 सिग्नलिंग के बिना LGR5 सिग्नलिंग को उजागर करता है। कल्चर के 13वें दिन सेलमास्क डाई (दाएं) से प्लाज्मा झिल्ली को रंगकर चिप पर आंत में स्थापित 3D ऑर्गेनॉइड उपकला की उपकला सूक्ष्म संरचना (दाएं) को दर्शाने वाली फ्लोरेसेंस छवियां। स्केल बार 50 μm है जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो। b संदर्भ 2 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस; c संदर्भ 2 से अनुमति लेकर रूपांतरित। ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस; e और f संदर्भ 12 से अनुमति लेकर रूपांतरित। क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस CC BY 4.0 के अंतर्गत।
चिप पर स्थित आंत में, ईसीएम कोटिंग की सफलता के लिए पीडीएमएस छिद्रित झिल्ली की जलरोधी सतह को संशोधित करना आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, हम पीडीएमएस झिल्लियों की जलरोधीता को संशोधित करने के लिए दो अलग-अलग विधियों का उपयोग करते हैं। कैको-2 कोशिकाओं की संवर्धन के लिए, यूवी/ओजोन उपचार द्वारा सतह सक्रियण अकेले ही पीडीएमएस सतह की जलरोधीता को कम करने, ईसीएम को कोट करने और कैको-2 कोशिकाओं को पीडीएमएस झिल्ली से जोड़ने के लिए पर्याप्त था। हालांकि, ऑर्गेनॉइड उपकला की माइक्रोफ्लुइडिक संवर्धन के लिए, ईसीएम प्रोटीन के कुशल निक्षेपण को प्राप्त करने के लिए रासायनिक-आधारित सतह कार्यात्मकता की आवश्यकता होती है, जिसके लिए पीडीएमएस माइक्रोचैनलों पर पॉलीइथिलीनइमाइन (पीईआई) और ग्लूटाराल्डिहाइड को क्रमिक रूप से लगाया जाता है। सतह संशोधन के बाद, ईसीएम प्रोटीन को कार्यात्मक पीडीएमएस सतह को ढकने के लिए जमा किया गया और फिर पृथक ऑर्गेनॉइड उपकला में डाला गया। कोशिकाओं के जुड़ने के बाद, माइक्रोफ्लुइडिक कोशिका संवर्धन ऊपरी माइक्रोचैनल में केवल माध्यम प्रवाहित करके शुरू होता है जब तक कि कोशिकाएं एक पूर्ण मोनोलेयर नहीं बना लेतीं, जबकि निचला माइक्रोचैनल स्थिर रहता है। परिस्थितियाँ। सतह सक्रियण और ईसीएम कोटिंग के लिए यह अनुकूलित विधि पीडीएमएस सतह पर 3डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए ऑर्गेनॉइड उपकला के जुड़ाव को सक्षम बनाती है।
ट्रांसवेल कल्चर में सेल सीडिंग से पहले ईसीएम कोटिंग की आवश्यकता होती है; हालांकि, ट्रांसवेल कल्चर में पोरस इंसर्ट की सतह को सक्रिय करने के लिए जटिल प्रीट्रीटमेंट चरणों की आवश्यकता नहीं होती है। ट्रांसवेल इंसर्ट पर कैको-2 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, पोरस इंसर्ट पर ईसीएम कोटिंग अलग की गई कैको-2 कोशिकाओं के जुड़ाव (<1 घंटा) और टाइट जंक्शन बैरियर के निर्माण (<1-2 दिन) को तेज करती है। ट्रांसवेल इंसर्ट पर ऑर्गेनॉइड्स को कल्चर करने के लिए, अलग किए गए ऑर्गेनॉइड्स को ईसीएम-कोटेड इंसर्ट पर सीड किया जाता है, झिल्ली की सतह से जोड़ा जाता है (<3 घंटे) और तब तक बनाए रखा जाता है जब तक कि ऑर्गेनॉइड्स बैरियर अखंडता के साथ एक पूर्ण मोनोलेयर नहीं बना लेते। ट्रांसवेल कल्चर 24-वेल प्लेट्स में हाइब्रिड चिप्स के उपयोग के बिना किए जाते हैं।
स्थापित उपकला परत के बेसोलेटरल भाग पर द्रव प्रवाह लागू करके इन विट्रो 3डी मॉर्फोजेनेसिस को आरंभ किया जा सकता है। चिप पर आंत में, उपकला मॉर्फोजेनेसिस तब शुरू हुआ जब माध्यम को ऊपरी और निचले माइक्रोचैनलों में प्रवाहित किया गया (चित्र 3a)। जैसा कि पहले बताया गया है, दिशात्मक रूप से स्रावित मॉर्फोजेन अवरोधकों को निरंतर हटाने के लिए अवर (बेसोलेटरल) भाग में द्रव प्रवाह शुरू करना महत्वपूर्ण है। छिद्रित झिल्लियों पर बंधी कोशिकाओं को पर्याप्त पोषक तत्व और सीरम प्रदान करने और ल्यूमिनल शियर स्ट्रेस उत्पन्न करने के लिए, हम आमतौर पर चिप पर आंत में दोहरा प्रवाह लागू करते हैं। हाइब्रिड चिप्स में, उपकला मोनोलेयर युक्त ट्रांसवेल इंसर्ट को हाइब्रिड चिप्स में डाला गया था। फिर, माइक्रोचैनल के माध्यम से छिद्रित ट्रांसवेल इंसर्ट के बेसोलेटरल भाग के नीचे माध्यम लगाया गया। दोनों कल्चर प्लेटफॉर्म में बेसोलेटरल प्रवाह शुरू होने के 3-5 दिन बाद आंत का मॉर्फोजेनेसिस हुआ।
माइक्रोइंजीनियर्ड 3डी उपकला परतों की रूपात्मक विशेषताओं का विश्लेषण विभिन्न इमेजिंग विधियों, जैसे कि फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, एसईएम, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्र 3 और 4) का उपयोग करके किया जा सकता है। 3डी उपकला परतों के आकार और उभार की निगरानी के लिए कल्चर के दौरान किसी भी समय फेज कंट्रास्ट या डीआईसी इमेजिंग आसानी से की जा सकती है। पीडीएमएस और पॉलिएस्टर फिल्मों की ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड चिप दोनों प्लेटफॉर्म डिवाइस को सेक्शन करने या अलग करने की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में इन सीटू इमेजिंग प्रदान कर सकते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग (चित्र 1, 3सी, एफ और 4बी, सी) करते समय, कोशिकाओं को आमतौर पर 4% (वजन/आयतन) पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ स्थिर किया जाता है, इसके बाद ट्राइटन एक्स-100 और 2% (वजन/आयतन) बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) का उपयोग किया जाता है। कोशिका के प्रकार के आधार पर विभिन्न प्रकार के फिक्सेटिव, परमीएबिलाइज़र और ब्लॉकिंग एजेंटों का उपयोग किया जा सकता है। वंश-निर्भर कोशिका या क्षेत्र मार्करों को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग चिप पर स्थिर कोशिकाओं को उजागर करने के लिए किया जाता है, इसके बाद द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ एक काउंटरस्टेन डाई का उपयोग किया जाता है जो या तो नाभिक (जैसे, 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलीन इंडोल, DAPI) या F-एक्टिन (जैसे, फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किया गया फैलोइडिन) को लक्षित करता है। बलगम उत्पादन (चित्र 1, "कोशिका विभेदन" और "आंत शरीर विज्ञान"), सूक्ष्मजीव कोशिकाओं के यादृच्छिक उपनिवेशीकरण (चित्र 1, "मेजबान-सूक्ष्मजीव सह-संस्कृति"), प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती (चित्र 1, 'रोग मॉडलिंग') या 3D उपकला आकृति विज्ञान की रूपरेखा (चित्र 3c,f और 4b,c) का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंस-आधारित लाइव इमेजिंग भी की जा सकती है। चिप पर आंत को संशोधित करते समय ऊपरी परत को निचली माइक्रोचैनल परत से अलग करने के लिए, जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है, 3डी उपकला आकृति विज्ञान के साथ-साथ शीर्ष ब्रश सीमा पर सूक्ष्म विलाई को एसईएम (चित्र 3बी) द्वारा देखा जा सकता है। विभेदन मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन मात्रात्मक पीसीआर5 या एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण द्वारा किया जा सकता है। इस मामले में, आंत चिप्स या हाइब्रिड चिप्स में विकसित उपकला कोशिकाओं की 3डी परतों को ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा काटा जाता है और फिर आणविक या आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।
a, हाइब्रिड चिप में आंतों के आकारिकी निर्माण को प्रेरित करने की कार्यप्रणाली। इस प्रोटोकॉल में हाइब्रिड चिप प्लेटफॉर्म पर 3D आकारिकी निर्माण को प्रदर्शित करने के लिए Caco-2 और आंतों के ऑर्गेनॉइड का उपयोग किया जाता है। अलग किए गए उपकला कोशिकाओं को तैयार ट्रांसवेल इंसर्ट (TW तैयारी; नीचे चित्र देखें) में बोया गया। कोशिकाओं को बोने (बीज बोने) और ट्रांसवेल इंसर्ट में पॉलिएस्टर झिल्ली से जोड़ने के बाद, सभी कोशिकाओं को स्थिर परिस्थितियों में संवर्धित किया गया (TW संवर्धन)। 7 दिनों के बाद, उपकला कोशिकाओं की 2D मोनोलेयर युक्त एक ट्रांसवेल इंसर्ट को एक हाइब्रिड चिप में एकीकृत किया गया ताकि एक बेसोलेटरल प्रवाह (प्रवाह, BL) शुरू किया जा सके, जिससे अंततः एक 3D उपकला परत (आकारिकी निर्माण) का निर्माण हुआ। प्रत्येक प्रायोगिक चरण या समय बिंदु पर सामान्य दाता (C103 लाइन) आरोही बृहदान्त्र से प्राप्त मानव अंग उपकला कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं को दर्शाने वाले चरण कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ। ऊपरी परतों में आरेख प्रत्येक चरण के लिए प्रायोगिक विन्यास को दर्शाते हैं। b, हाइब्रिड चिप्स (बाएं आरेख) 3D निर्माण को प्रेरित कर सकते हैं। विभिन्न Z स्थितियों (ऊपरी, मध्य और निचली; दाईं ओर आरेख और संबंधित बिंदीदार रेखाएँ देखें) पर लिए गए टॉप-डाउन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दृश्यों के साथ ऑर्गेनॉइड उपकला कोशिकाओं के आकारिकी में स्पष्ट रूपात्मक विशेषताएँ दिखाई देती हैं। F-एक्टिन (सियान), नाभिक (ग्रे)। c, स्थिर ट्रांसवेल (TW; सफेद धराशायी बॉक्स के भीतर इनसेट) बनाम हाइब्रिड चिप (सबसे बड़ा पूर्ण शॉट) में संवर्धित ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ (3D कोणीय दृश्य) क्रमशः 2D बनाम 3D आकारिकी की तुलना करते हैं। 2D ऊर्ध्वाधर क्रॉस-कट दृश्यों की एक जोड़ी (ऊपरी दाएं कोने में इनसेट; "XZ") भी 2D और 3D विशेषताओं को दर्शाती है। स्केल बार, 100 µm। c संदर्भ 4 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। एल्सेवियर।
नियंत्रण तैयार करने के लिए, उन्हीं कोशिकाओं (Caco-2 या आंतों के ऑर्गेनॉइड उपकला कोशिकाओं) को पारंपरिक स्थिर संवर्धन स्थितियों के तहत द्वि-आयामी मोनोलेयर में संवर्धित किया जा सकता है। विशेष रूप से, माइक्रोचैनलों की सीमित आयतन क्षमता (अर्थात मूल गट-चिप डिज़ाइन में शीर्ष चैनल में लगभग 4 µL) के कारण पोषक तत्वों की कमी हो सकती है। इसलिए, बेसोलेटरल प्रवाह लागू करने से पहले और बाद में उपकला आकृति विज्ञान की तुलना भी की जा सकती है।
सॉफ्ट लिथोग्राफी प्रक्रिया को क्लीन रूम में किया जाना चाहिए। चिप की प्रत्येक परत (ऊपरी और निचली परतें और झिल्ली) और हाइब्रिड चिप्स के लिए, अलग-अलग फोटोमास्क का उपयोग किया गया और उन्हें अलग-अलग सिलिकॉन वेफर्स पर निर्मित किया गया क्योंकि माइक्रोचैनल की ऊँचाई अलग-अलग थी। चिप पर ऊपरी और निचली माइक्रोचैनल की लक्षित ऊँचाई क्रमशः 500 µm और 200 µm है। हाइब्रिड चिप की चैनल लक्षित ऊँचाई 200 µm है।
एक 3 इंच सिलिकॉन वेफर को एसीटोन से भरे बर्तन में रखें। बर्तन को 30 सेकंड तक धीरे से घुमाएँ, फिर वेफर को हवा में सूखने दें। वेफर को आईपीए से भरी प्लेट पर रखें, फिर प्लेट को 30 सेकंड तक घुमाकर साफ करें।
सिलिकॉन वेफर की सतह से कार्बनिक अवशेषों को अधिकतम मात्रा में हटाने के लिए वैकल्पिक रूप से पिरान्हा सॉल्यूशन (हाइड्रोजन पेरोक्साइड और सांद्र सल्फ्यूरिक एसिड का मिश्रण, 1:3 (वॉल्यूम/वॉल्यूम)) का उपयोग किया जा सकता है।
पिरान्हा सॉल्यूशन अत्यंत संक्षारक है और ऊष्मा उत्पन्न करता है। अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियां आवश्यक हैं। अपशिष्ट निपटान के लिए, सॉल्यूशन को ठंडा होने दें और इसे एक साफ, सूखे अपशिष्ट पात्र में डालें। द्वितीयक पात्रों का उपयोग करें और अपशिष्ट पात्रों पर उचित लेबल लगाएं। अधिक विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए कृपया सुविधा के सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें।
वेफर्स को 200 डिग्री सेल्सियस के गर्म तवे पर 10 मिनट के लिए रखकर निर्जलित करें। निर्जलीकरण के बाद, वेफर को ठंडा करने के लिए हवा में पांच बार हिलाया गया।
साफ किए गए सिलिकॉन वेफर के केंद्र में लगभग 10 ग्राम फोटोरेसिस्ट SU-8 2100 डालें। चिमटी की सहायता से फोटोरेसिस्ट को वेफर पर समान रूप से फैलाएं। फोटोरेसिस्ट को कम चिपचिपा और आसानी से फैलाने के लिए वेफर को बीच-बीच में 65°C गर्म प्लेट पर रखें। वेफर को सीधे गर्म प्लेट पर न रखें।
स्पिन कोटिंग द्वारा वेफर पर SU-8 को समान रूप से वितरित किया गया। SU-8 के आने वाले घूर्णन को 5-10 सेकंड के लिए 500 rpm की गति से 100 rpm/s के त्वरण पर प्रसारित करने के लिए प्रोग्राम करें। 200 µm मोटाई की पैटर्निंग के लिए मुख्य स्पिन को 1,500 rpm पर सेट करें, या 250 µm मोटाई प्राप्त करें (चिप पर गट की ऊपरी परत के लिए 500 µm की ऊंचाई बनाते हुए; नीचे "महत्वपूर्ण चरण" देखें) 300 rpm/s के त्वरण पर 30 सेकंड के लिए 1,200 rpm पर सेट करें।
सिलिकॉन वेफर पर SU-8 पैटर्न की लक्षित मोटाई के अनुसार मुख्य स्पिन गति को समायोजित किया जा सकता है।
चिप पर आंत की ऊपरी परत के लिए 500 µm ऊंचाई के SU-8 पैटर्न बनाने के लिए, इस बॉक्स के स्पिन कोटिंग और सॉफ्ट बेक चरणों (चरण 7 और 8) को क्रमिक रूप से दोहराया गया (चरण 9 देखें) ताकि 250 µm मोटी SU-8 की दो परतें तैयार की जा सकें, जिन्हें इस बॉक्स के चरण 12 में UV एक्सपोजर द्वारा परतबद्ध और जोड़ा जा सकता है, जिससे 500 µm ऊंची एक परत बन जाती है।
SU-8 लेपित वेफर्स को सावधानीपूर्वक 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर 5 मिनट के लिए रखकर सॉफ्ट बेक करें, फिर सेटिंग को 95 डिग्री सेल्सियस पर स्विच करें और अतिरिक्त 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
ऊपरी माइक्रोचैनल में SU-8 पैटर्न की 500 μm ऊंचाई प्राप्त करने के लिए, दो 250 μm मोटी SU-8 परतें बनाने के लिए चरण 7 और 8 को दोहराएं।
यूवी मास्क अलाइनर का उपयोग करके, निर्माता के निर्देशों के अनुसार लैंप परीक्षण करें ताकि वेफर के एक्सपोज़र समय की गणना की जा सके। (एक्सपोज़र समय, मिलीसेकंड) = (एक्सपोज़र डोज़, मिलीजूल/सेमी2)/(लैंप पावर, मिलीवॉट/सेमी2)।
एक्सपोज़र समय निर्धारित करने के बाद, फोटोमास्क को यूवी मास्क अलाइनर के मास्क होल्डर पर रखें और फोटोमास्क को SU-8 लेपित वेफर पर रखें।
पराबैंगनी किरणों के फैलाव को कम करने के लिए फोटोमास्क की मुद्रित सतह को सीधे सिलिकॉन वेफर के SU-8 लेपित भाग पर रखें।
SU-8 लेपित वेफर और फोटोमास्क को पूर्व निर्धारित एक्सपोज़र समय के लिए 260 mJ/cm2 यूवी प्रकाश के लंबवत रूप से एक्सपोज़ करें (इस बॉक्स के चरण 10 को देखें)।
यूवी किरणों के संपर्क में आने के बाद, SU-8 लेपित सिलिकॉन वेफर्स को प्रत्येक हॉट प्लेट पर 65°C पर 5 मिनट और 95°C पर 15 मिनट के लिए बेक किया गया ताकि 200 μm की ऊंचाई वाले पैटर्न तैयार किए जा सकें। 95°C पर पोस्ट-बेकिंग का समय बढ़ाकर 30 मिनट करने पर 500 µm की ऊंचाई वाले पैटर्न तैयार किए गए।
डेवलपर को कांच के बर्तन में डालें और बेक किए हुए वेफर को बर्तन में रखें। SU-8 डेवलपर की मात्रा कांच के बर्तन के आकार के अनुसार भिन्न हो सकती है। यह सुनिश्चित करें कि आप पर्याप्त मात्रा में SU-8 डेवलपर का उपयोग करें ताकि बचा हुआ SU-8 पूरी तरह से निकल जाए। उदाहरण के लिए, 1 लीटर क्षमता वाले 150 मिमी व्यास के कांच के बर्तन का उपयोग करते समय, लगभग 300 मिलीलीटर SU-8 डेवलपर का उपयोग करें। मोल्ड को बीच-बीच में हल्के से घुमाते हुए 25 मिनट तक डेवलप करें।
तैयार किए गए मोल्ड को लगभग 10 मिलीलीटर ताजे डेवलपर से धोएं और फिर पिपेट का उपयोग करके घोल को स्प्रे करते हुए आईपीए से उपचारित करें।
वेफर को प्लाज्मा क्लीनर में रखें और 1.5 मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा (वायुमंडलीय गैस, लक्षित दबाव 1 × 10−5 टॉर, शक्ति 125 W) के संपर्क में लाएं।
वेफर को एक वैक्यूम डेसिकेटर में रखें जिसके अंदर एक ग्लास स्लाइड हो। वेफर और स्लाइड को अगल-बगल रखा जा सकता है। यदि वैक्यूम डेसिकेटर को एक प्लेट द्वारा कई परतों में विभाजित किया गया है, तो स्लाइड को निचले कक्ष में और वेफर को ऊपरी कक्ष में रखें। ग्लास स्लाइड पर 100 μL ट्राइक्लोरो(1H, 1H, 2H, 2H-परफ्लोरोऑक्टाइल)सिलान विलयन की बूंद डालें और सिलनाइजेशन के लिए वैक्यूम लगाएं।
जमे हुए Caco-2 कोशिकाओं से भरी एक शीशी को 37°C के पानी के स्नान में पिघलाएं, फिर पिघली हुई कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर 37°C पर पहले से गर्म किए गए Caco-2 माध्यम वाले T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
लगभग 90% सघनता पर Caco-2 कोशिकाओं को पास करने के लिए, सबसे पहले Caco-2 माध्यम, PBS और 0.25% ट्रिप्सिन/1 mM EDTA को 37°C के वाटर बाथ में गर्म करें।
वैक्यूम एस्पिरेशन द्वारा माध्यम को निकाल लें। वैक्यूम एस्पिरेशन को दोहराते हुए और ताजा पीबीएस मिलाकर कोशिकाओं को 5 मिलीलीटर गर्म पीबीएस से दो बार धोएं।