Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Morfogenesis usus manusia membentuk fitur kripta-vili dari mikroarsitektur epitel 3D dan organisasi spasial. Struktur unik ini diperlukan untuk menjaga homeostasis usus dengan melindungi ceruk sel punca di kripta basal dari antigen mikroba eksogen dan metabolitnya. Selain itu, vili usus dan sekresi lendir menghadirkan sel epitel yang terdiferensiasi secara fungsional dengan penghalang pelindung pada permukaan mukosa usus. Oleh karena itu, menciptakan kembali struktur epitel 3D sangat penting untuk konstruksi model usus in vitro. Perlu dicatat, usus-pada-chip mimetik organik dapat menginduksi morfogenesis 3D spontan dari epitel usus dengan fungsi fisiologis dan biomekanik yang ditingkatkan. Di sini, kami menyediakan protokol yang dapat direproduksi untuk secara kuat menginduksi morfogenesis usus pada chip mikrofluida serta pada chip hibrida yang tertanam Transwell. Kami menjelaskan metode terperinci untuk fabrikasi perangkat, kultur sel epitel Caco-2 atau organoid usus dalam pengaturan konvensional serta pada platform mikrofluida, induksi 3D. Morfogenesis, dan karakterisasi epitel 3D yang telah terbentuk menggunakan berbagai modalitas pencitraan. Protokol ini mencapai regenerasi mikroarsitektur usus fungsional dengan mengontrol aliran cairan basolateral selama 5 hari. Metode morfogenesis in vitro kami menggunakan tegangan geser dan gerakan mekanis yang relevan secara fisiologis dan tidak memerlukan rekayasa atau manipulasi sel yang kompleks, yang mungkin mengungguli teknik lain yang ada. Kami membayangkan bahwa protokol yang kami usulkan dapat memiliki implikasi luas bagi komunitas penelitian biomedis, menyediakan metode untuk meregenerasi lapisan epitel usus 3D secara in vitro untuk aplikasi biomedis, klinis, dan farmasi.
Eksperimen menunjukkan bahwa sel epitel usus Caco-2 yang dikultur dalam gut-on-a-chip1,2,3,4,5 atau perangkat mikrofluida bilayer6,7 dapat mengalami morfogenesis 3D spontan secara in vitro tanpa pemahaman yang jelas tentang mekanisme yang mendasarinya. Dalam penelitian terbaru kami, kami menemukan bahwa penghapusan antagonis morfogen yang disekresikan secara basolateral dari perangkat kultur diperlukan dan cukup untuk menginduksi morfogenesis epitel 3D secara in vitro, yang telah ditunjukkan oleh Caco-2 dan organoid usus yang berasal dari pasien. Sel epitel divalidasi. Dalam studi ini, kami secara khusus berfokus pada produksi sel dan distribusi konsentrasi antagonis Wnt poten, Dickkopf-1 (DKK-1), dalam perangkat usus-pada-chip dan perangkat mikrofluida yang dimodifikasi yang mengandung sisipan Transwell, yang disebut "Hybrid Chip". Kami menunjukkan bahwa penambahan antagonis Wnt eksogen (seperti DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, atau Soggy-1) ke usus pada-chip menghambat morfogenesis atau mengganggu lapisan epitel 3D yang telah terstruktur sebelumnya, menunjukkan bahwa stres antagonis selama kultur bertanggung jawab atas morfogenesis usus secara in vitro. Oleh karena itu, pendekatan praktis untuk mencapai morfogenesis yang kuat pada antarmuka epitel adalah dengan menghilangkan atau mempertahankan kadar antagonis Wnt seminimal mungkin di kompartemen basolateral dengan pembilasan aktif (misalnya, pada platform usus-pada-chip atau hybrid-pada-chip) atau difusi. Media basolateral (misalnya, dari sisipan Transwell) ke dalam reservoir basolateral besar di sumur).
Dalam protokol ini, kami menyediakan metode terperinci untuk fabrikasi perangkat mikro usus-pada-chip dan chip hibrida yang dapat disisipkan Transwell (langkah 1-5) untuk mengkultur sel epitel usus pada membran berpori berbasis polidimetilsiloksan (PDMS) (langkah 6A, 7A, 8, 9) atau membran poliester dari sisipan Transwell (langkah 6B, 7B, 8, 9) dan menginduksi morfogenesis 3D secara in vitro (langkah 10). Kami juga mengidentifikasi fitur seluler dan molekuler yang menunjukkan histogenesis spesifik jaringan dan diferensiasi seluler yang bergantung pada garis keturunan dengan menerapkan berbagai modalitas pencitraan (langkah 11-24). Kami menginduksi morfogenesis menggunakan sel epitel usus manusia, seperti Caco-2 atau organoid usus, dalam dua format kultur dengan detail teknis termasuk modifikasi permukaan membran berpori, pembuatan monolayer 2D, dan reproduksi biokimia dan biomekanik lingkungan mikro usus secara in vitro. Untuk menginduksi morfogenesis 3D Dari lapisan epitel 2D, kami menghilangkan antagonis morfogen pada kedua bentuk kultur dengan mengalirkan medium ke kompartemen basolateral kultur. Terakhir, kami memberikan representasi kegunaan lapisan epitel 3D yang dapat diregenerasi yang dapat digunakan untuk memodelkan pertumbuhan epitel yang bergantung pada morfogen, kultur bersama inang-mikrobioma longitudinal, infeksi patogen, cedera inflamasi, disfungsi penghalang epitel, dan terapi berbasis probiotik.
Protokol kami mungkin bermanfaat bagi berbagai ilmuwan dalam penelitian dasar (misalnya, biologi mukosa usus, biologi sel punca, dan biologi perkembangan) dan penelitian terapan (misalnya, pengujian obat praklinis, pemodelan penyakit, rekayasa jaringan, dan gastroenterologi) yang berdampak luas. Karena reproduktivitas dan kekokohan protokol kami untuk menginduksi morfogenesis 3D epitel usus secara in vitro, kami membayangkan bahwa strategi teknis kami dapat disebarluaskan kepada khalayak yang mempelajari dinamika pensinyalan sel selama perkembangan, regenerasi, atau homeostasis usus. Selain itu, protokol kami berguna untuk menyelidiki infeksi di bawah berbagai agen infeksi seperti Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 atau Vibrio cholerae. Audiens patologi dan patogenesis penyakit juga bermanfaat. Penggunaan sistem mikrofisiologi usus pada chip dapat memungkinkan ko-kultur longitudinal 10 dan penilaian selanjutnya terhadap pertahanan inang, respons imun, dan perbaikan cedera terkait patogen di saluran pencernaan (GI) 11. Gangguan GI lainnya yang terkait dengan sindrom usus bocor, penyakit celiac, penyakit Crohn, kolitis ulserativa, pouchitis, atau sindrom iritasi usus dapat disimulasikan ketika lapisan epitel usus 3D disiapkan menggunakan lapisan epitel usus 3D pasien, penyakit-penyakit ini termasuk atrofi vili, pemendekan kripta, kerusakan mukosa, atau gangguan penghalang epitel. Organoid usus yang berasal dari biopsi atau sel punca 12,13. Untuk memodelkan kompleksitas lingkungan penyakit yang lebih tinggi dengan lebih baik, pembaca dapat mempertimbangkan untuk menambahkan jenis sel yang relevan dengan penyakit, seperti sel mononuklear darah perifer pasien (PBMC), ke model yang mengandung mikroarsitektur vili-kripta usus 3D. sel imun spesifik jaringan, 5.
Karena mikrostruktur epitel 3D dapat difiksasi dan divisualisasikan tanpa proses pemotongan, para pengamat yang bekerja pada transkriptomik spasial dan pencitraan resolusi tinggi atau super-resolusi mungkin tertarik pada pemetaan kami tentang dinamika spasial dan temporal gen dan protein pada ceruk epitel. Tertarik pada teknologi. Respons terhadap rangsangan mikroba atau imun. Lebih lanjut, interaksi silang inang-mikrobioma longitudinal 10, 14 yang mengoordinasikan homeostasis usus dapat dibangun di lapisan mukosa usus 3D dengan mengkulturkan berbagai spesies mikroba, komunitas mikroba, atau mikrobiota feses, terutama pada usus-pada-chip. Pendekatan ini sangat menarik bagi audiens yang mempelajari imunologi mukosa, gastroenterologi, mikrobioma manusia, kulturomik, dan mikrobiologi klinis yang ingin membudidayakan mikrobiota usus yang sebelumnya belum dikultur di laboratorium. Jika protokol morfogenesis in vitro kami dapat diadaptasi ke format kultur yang dapat diskalakan, seperti sisipan multi-sumur dalam pelat 24, 96, atau 384 sumur yang terus menerus mengisi ulang kompartemen basolateral, protokol ini juga dapat disebarluaskan kepada mereka yang mengembangkan platform skrining atau validasi berkecepatan tinggi untuk industri makanan, baik untuk farmasi, biomedis, atau industri makanan. Sebagai bukti prinsip, kami baru-baru ini menunjukkan kelayakan sistem morfogenesis berkecepatan tinggi multipleks yang dapat diskalakan ke format pelat 24 sumur. Selain itu, beberapa produk organ-on-a-chip telah dikomersialkan16,17,18. Oleh karena itu, validasi metode morfogenesis in vitro kami dapat dipercepat dan berpotensi diadopsi oleh banyak laboratorium penelitian, industri, atau pemerintah dan badan pengatur untuk memahami pemrograman ulang seluler morfogenesis usus in vitro. Tingkat transkriptomik digunakan untuk menguji obat-obatan atau bioterapi. Penyerapan dan transportasi kandidat obat dinilai menggunakan model usus 3D atau menggunakan model organ-on-a-chip khusus atau komersial untuk menilai reproduktivitas proses morfogenesis usus.
Sejumlah model eksperimental yang relevan dengan manusia telah digunakan untuk mempelajari morfogenesis epitel usus, terutama karena kurangnya protokol yang dapat diimplementasikan untuk menginduksi morfogenesis 3D secara in vitro. Bahkan, sebagian besar pengetahuan saat ini tentang morfogenesis usus didasarkan pada studi hewan (misalnya, ikan zebra20, tikus21 atau ayam22). Namun, model-model ini membutuhkan banyak tenaga dan biaya, dapat dipertanyakan secara etis, dan yang terpenting, tidak secara tepat menentukan proses perkembangan manusia. Model-model ini juga sangat terbatas dalam kemampuannya untuk diuji secara multi-arah dan terukur. Oleh karena itu, protokol kami untuk meregenerasi struktur jaringan 3D secara in vitro mengungguli model hewan in vivo serta model kultur sel 2D statis tradisional lainnya. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, penggunaan struktur epitel 3D memungkinkan kami untuk memeriksa lokalisasi spasial sel yang terdiferensiasi pada sumbu kripta-vili sebagai respons terhadap berbagai rangsangan mukosa atau imun. Lapisan epitel 3D dapat menyediakan ruang untuk mempelajari bagaimana sel mikroba bersaing untuk membentuk ceruk spasial dan evolusi ekologis sebagai respons terhadap faktor inang (misalnya, lapisan lendir bagian dalam versus luar, sekresi IgA dan peptida antimikroba). Selain itu, morfologi epitel 3D memungkinkan kita untuk memahami bagaimana mikrobiota usus menyusun komunitasnya dan secara sinergis menghasilkan metabolit mikroba (misalnya, asam lemak rantai pendek) yang membentuk organisasi seluler dan ceruk sel punca di kripta basal. Fitur-fitur ini hanya dapat ditunjukkan ketika lapisan epitel 3D dibentuk secara in vitro.
Selain metode kami untuk membuat struktur epitel usus 3D, ada beberapa metode in vitro. Kultur organoid usus adalah teknik rekayasa jaringan mutakhir yang didasarkan pada kultivasi sel punca usus di bawah kondisi morfogen spesifik23,24,25. Namun, penggunaan model organoid 3D untuk analisis transportasi atau ko-kultur inang-mikrobioma seringkali menantang karena lumen usus tertutup di dalam organoid dan, oleh karena itu, pengenalan komponen luminal seperti sel mikroba atau antigen eksogen terbatas. Akses ke lumen organoid dapat ditingkatkan menggunakan mikroinjektor,26,27 tetapi metode ini invasif dan membutuhkan banyak tenaga kerja serta memerlukan pengetahuan khusus untuk melakukannya. Selain itu, kultur organoid tradisional yang dipelihara dalam perancah hidrogel di bawah kondisi statis tidak secara akurat mencerminkan biomekanik in vivo yang aktif.
Pendekatan lain yang digunakan oleh beberapa kelompok penelitian memanfaatkan perancah hidrogel 3D yang telah distrukturkan sebelumnya untuk meniru struktur epitel usus dengan mengkultur sel usus manusia yang terisolasi pada permukaan gel. Perancah hidrogel dibuat menggunakan cetakan yang dicetak 3D, digiling mikro, atau dibuat secara litografis. Metode ini menunjukkan susunan sel epitel terisolasi yang terorganisasi sendiri secara in vitro dengan gradien morfogen yang relevan secara fisiologis, membentuk struktur epitel dengan rasio aspek tinggi dan interaksi stroma-epitel dengan memasukkan sel stroma ke dalam perancah. Namun, sifat perancah yang telah distrukturkan sebelumnya dapat mencegah tampilan proses morfogenetik spontan itu sendiri. Model-model ini juga tidak menyediakan aliran luminal atau interstisial yang dinamis, karena kurangnya tegangan geser fluida yang dibutuhkan sel usus untuk menjalani morfogenesis dan memperoleh fungsi fisiologis. Studi terbaru lainnya menggunakan perancah hidrogel dalam platform mikrofluida dan membentuk struktur epitel usus menggunakan teknik etsa laser. Organoid usus tikus mengikuti pola yang terukir untuk membentuk struktur tubular usus, dan cairan intraluminal Aliran dapat direkapitulasi menggunakan modul mikrofluida. Namun, model ini tidak menunjukkan proses morfogenetik spontan maupun mencakup gerakan mekanobiologis usus. Teknik pencetakan 3D dari kelompok yang sama mampu menciptakan tabung usus miniatur dengan proses morfogenetik spontan. Terlepas dari fabrikasi kompleks berbagai segmen usus di dalam tabung, model ini juga kekurangan aliran fluida luminal dan deformasi mekanis. Selain itu, pengoperasian model mungkin terbatas, terutama setelah proses bioprinting selesai, yang mengganggu kondisi eksperimental atau interaksi antar sel. Sebaliknya, protokol yang kami usulkan menyediakan morfogenesis usus spontan, tegangan geser yang relevan secara fisiologis, biomekanik yang meniru motilitas usus, aksesibilitas kompartemen apikal dan basolateral independen, dan penciptaan kembali lingkungan mikro biologis kompleks yang modular. Oleh karena itu, protokol morfogenesis 3D in vitro kami dapat memberikan pendekatan komplementer untuk mengatasi tantangan metode yang ada.
Protokol kami sepenuhnya berfokus pada morfogenesis epitel 3D, hanya dengan sel epitel dalam kultur dan tidak ada jenis sel lain di sekitarnya seperti sel mesenkim, sel endotel, dan sel imun. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, inti dari protokol kami adalah induksi morfogenesis epitel dengan menghilangkan inhibitor morfogen yang disekresikan di sisi basolateral medium yang dimasukkan. Meskipun modularitas yang kuat dari gut-on-a-chip dan hybrid-on-a-chip kami memungkinkan kami untuk menciptakan kembali lapisan epitel 3D yang bergelombang, kompleksitas biologis tambahan seperti interaksi epitel-mesenkim33,34, deposisi Matriks Ekstraseluler (ECM)35 dan, dalam model kami, fitur kripta-vili yang menyampaikan ceruk sel punca di kripta basal masih perlu dipertimbangkan lebih lanjut. Sel stroma (misalnya, fibroblas) di mesenkim memainkan peran kunci dalam produksi protein ECM dan regulasi morfogenesis usus in vivo35,37,38. Penambahan sel mesenkim Model kami meningkatkan proses morfogenetik dan efisiensi perlekatan sel. Lapisan endotel (yaitu, kapiler atau limfatik) memainkan peran penting dalam mengatur transportasi molekuler39 dan perekrutan sel imun40 di lingkungan mikro usus. Selain itu, komponen pembuluh darah yang dapat dihubungkan antar model jaringan merupakan prasyarat ketika model jaringan dirancang untuk menunjukkan interaksi multi-organ. Oleh karena itu, sel endotel mungkin perlu disertakan untuk memodelkan fitur fisiologis yang lebih akurat dengan resolusi tingkat organ. Sel imun yang berasal dari pasien juga penting untuk menampilkan respons imun bawaan, presentasi antigen, interaksi imun adaptif bawaan, dan imunitas spesifik jaringan dalam konteks meniru penyakit usus.
Penggunaan chip hibrida lebih mudah daripada gut-on-a-chip karena pengaturan perangkat lebih sederhana dan penggunaan insert Transwell memungkinkan kultur epitel usus yang dapat diskalakan. Namun, insert Transwell yang tersedia secara komersial dengan membran poliester tidak elastis dan tidak dapat mensimulasikan gerakan seperti peristaltik. Lebih lanjut, kompartemen apikal insert Transwell yang ditempatkan di chip hibrida tetap diam tanpa tegangan geser di sisi apikal. Jelas, sifat statis di kompartemen apikal jarang memungkinkan ko-kultur bakteri jangka panjang dalam chip hibrida. Meskipun kita dapat secara kuat menginduksi morfogenesis 3D dalam insert Transwell saat menggunakan chip hibrida, kekurangan biomekanik yang relevan secara fisiologis dan aliran fluida apikal dapat membatasi kelayakan platform chip hibrida untuk aplikasi potensial.
Rekonstruksi skala penuh sumbu kripta-vili manusia dalam kultur gut-on-a-chip dan hybrid-on-a-chip belum sepenuhnya berhasil dilakukan. Karena morfogenesis dimulai dari lapisan epitel tunggal, mikroarsitektur 3D tidak selalu memberikan kemiripan morfologis dengan kripta in vivo. Meskipun kami mengkarakterisasi populasi sel yang berproliferasi di dekat domain kripta basal dalam epitel 3D hasil rekayasa mikro, daerah kripta dan vili tidak dibatasi dengan jelas. Meskipun saluran atas yang lebih tinggi pada chip menyebabkan peningkatan tinggi epitel hasil rekayasa mikro, tinggi maksimum masih terbatas pada ~300–400 µm. Kedalaman sebenarnya dari kripta usus manusia di usus kecil dan besar masing-masing adalah ~135 µm dan ~400 µm, dan tinggi vili usus kecil adalah ~600 µm41.
Dari sudut pandang pencitraan, pencitraan super-resolusi in situ dari mikroarsitektur 3D mungkin terbatas pada usus pada chip, karena jarak kerja yang dibutuhkan dari lensa objektif ke lapisan epitel berada pada orde beberapa milimeter. Untuk mengatasi masalah ini, objektif yang lebih jauh mungkin diperlukan. Selain itu, membuat irisan tipis untuk persiapan spesimen pencitraan merupakan tantangan karena elastisitas PDMS yang tinggi. Lebih lanjut, karena fabrikasi mikro lapis demi lapis usus pada chip melibatkan adhesi permanen antara setiap lapisan, sangat sulit untuk membuka atau melepaskan lapisan atas untuk memeriksa struktur permukaan lapisan epitel. Misalnya, dengan menggunakan mikroskop elektron pemindai (SEM).
Hidrofobisitas PDMS telah menjadi faktor pembatas dalam studi berbasis mikrofluida yang berkaitan dengan molekul kecil hidrofobik, karena PDMS dapat secara nonspesifik menyerap molekul hidrofobik tersebut. Alternatif untuk PDMS dapat dipertimbangkan dengan bahan polimer lainnya. Atau, modifikasi permukaan PDMS (misalnya, pelapisan dengan bahan lipofilik 42 atau poli(etilena glikol) 43) dapat dipertimbangkan untuk meminimalkan penyerapan molekul hidrofobik.
Terakhir, metode kami belum dikarakterisasi dengan baik dalam hal menyediakan platform eksperimental yang ramah pengguna, baik untuk skrining berkecepatan tinggi maupun yang "cocok untuk semua". Protokol saat ini membutuhkan pompa jarum suntik per perangkat mikro, yang memakan ruang di inkubator CO2 dan mencegah eksperimen skala besar. Keterbatasan ini dapat ditingkatkan secara signifikan dengan skalabilitas format kultur inovatif (misalnya, sisipan berpori 24 sumur, 96 sumur, atau 384 sumur yang memungkinkan pengisian ulang dan pembuangan media basolateral secara terus menerus).
Untuk menginduksi morfogenesis 3D epitel usus manusia secara in vitro, kami menggunakan perangkat usus berupa chip mikrofluida yang berisi dua mikrokanal paralel dan membran berpori elastis di antaranya untuk menciptakan antarmuka lumen-kapiler. Kami juga mendemonstrasikan penggunaan perangkat mikrofluida saluran tunggal (chip hibrida) yang menyediakan aliran basolateral kontinu di bawah lapisan epitel terpolarisasi yang ditumbuhkan pada sisipan Transwell. Pada kedua platform tersebut, morfogenesis berbagai sel epitel usus manusia dapat didemonstrasikan dengan menerapkan manipulasi aliran terarah untuk menghilangkan antagonis morfogen dari kompartemen basolateral. Seluruh prosedur eksperimental (Gambar 1) terdiri dari lima bagian: (i) fabrikasi mikro chip usus atau chip hibrida yang dapat disisipkan Transwell (langkah 1-5; Kotak 1), (ii) persiapan sel epitel usus (sel Caco-2) atau organoid usus manusia; (iii) kultur sel epitel usus pada chip usus atau chip hibrida (langkah 6-9), (iv) induksi morfogenesis 3D in vitro (langkah 10) dan (v) untuk mengkarakterisasi mikrostruktur epitel 3D (langkah 11-24). Terakhir, kelompok kontrol yang sesuai (dibahas lebih lanjut di bawah) dirancang untuk memvalidasi efektivitas morfogenesis in vitro dengan membandingkan morfogenesis epitel dengan kontrol spasial, temporal, kondisional, atau prosedural.
Kami menggunakan dua platform kultur yang berbeda: gut-on-a-chip dengan saluran lurus atau saluran berbelit-belit nonlinier, atau chip hibrida yang berisi sisipan Transwell (TW) dalam perangkat mikrofluida, yang dibuat seperti yang dijelaskan dalam Kotak 1, dan langkah 1-5. “Pembuatan Perangkat” menunjukkan langkah-langkah utama dalam pembuatan chip tunggal atau chip hibrida. “Kultur Sel Epitel Usus Manusia” menjelaskan sumber sel (Caco-2 atau organoid usus manusia) dan prosedur kultur yang digunakan dalam protokol ini. “Morfogenesis In Vitro” menunjukkan langkah-langkah keseluruhan di mana sel epitel Caco-2 atau yang berasal dari organoid dikultur pada chip usus atau pada sisipan Transwell dari chip hibrida, diikuti dengan induksi morfogenesis 3D dan pembentukan struktur epitel yang terkarakterisasi. Nomor langkah program atau nomor kotak ditampilkan di bawah setiap panah. Aplikasi ini memberikan contoh bagaimana lapisan epitel usus yang telah terbentuk dapat digunakan, misalnya, dalam karakterisasi diferensiasi sel, studi fisiologi usus, pembentukan ekosistem inang-mikrobioma, dan penyakit. Pemodelan. Gambar imunofluoresensi dalam “Diferensiasi Sel” menunjukkan inti, F-aktin, dan MUC2 yang diekspresikan dalam lapisan epitel Caco-2 3D yang dihasilkan pada chip usus. Sinyal MUC2 hadir dalam sel goblet dan lendir yang disekresikan dari permukaan mukosa. Gambar fluoresensi dalam Fisiologi Usus menunjukkan lendir yang diproduksi dengan pewarnaan untuk residu asam sialat dan N-asetilglukosamin menggunakan aglutinin kecambah gandum fluoresen. Dua gambar yang tumpang tindih dalam “Kultur Ko-Inang-Mikroba” menunjukkan kultur ko-inang-mikrobioma representatif di usus pada chip. Panel kiri menunjukkan kultur ko-E. coli yang mengekspresikan protein fluoresen hijau (GFP) dengan sel epitel Caco-2 3D yang direkayasa mikro. Panel kanan menunjukkan lokalisasi E. coli GFP yang dikultur bersama dengan sel epitel Caco-2 3D, diikuti dengan pewarnaan imunofluoresensi dengan F-aktin (merah) dan inti (biru). Pemodelan penyakit Ilustrasi perbandingan usus sehat versus usus bocor pada chip peradangan usus di bawah tantangan fisiologis dengan antigen bakteri (misalnya, lipopolisakarida, LPS) dan sel imun (misalnya, PBMC; hijau). Sel Caco-2 dikultur untuk membentuk lapisan epitel 3D. Skala bar, 50 µm. Gambar di baris bawah: “Diferensiasi sel” diadaptasi dengan izin dari referensi 2. Oxford University Press; Direproduksi dengan izin dari Ref. 5. NAS; “Kultur Bersama Inang-Mikroba” diadaptasi dengan izin dari ref. 3. NAS; “Pemodelan Penyakit” diadaptasi dengan izin dari referensi 5. NAS.
Baik gut-on-a-chip maupun chip hibrida dibuat menggunakan replika PDMS yang dilepas dari cetakan silikon dengan litografi lunak1,44 dan diberi pola dengan SU-8. Desain mikrokanal di setiap chip ditentukan dengan mempertimbangkan hidrodinamika seperti tegangan geser dan tekanan hidrodinamik1,4,12. Desain gut-on-a-chip asli (Gambar Data Tambahan 1a), yang terdiri dari dua mikrokanal lurus paralel yang berdampingan, telah berevolusi menjadi gut-on-a-chip kompleks (Gambar Data Tambahan 1b) yang mencakup sepasang mikrokanal melengkung untuk menginduksi peningkatan waktu tinggal fluida, pola aliran nonlinier, dan deformasi multiaxial sel yang dikultur (Gambar 2a–f) 12. Ketika biomekanik usus yang lebih kompleks perlu direplikasi, gut-on-a-chip kompleks dapat dipilih. Kami telah menunjukkan bahwa Gut-Chip yang berbelit-belit juga sangat menginduksi morfogenesis 3D dalam kerangka waktu yang serupa dengan tingkat pertumbuhan epitel yang serupa. Dibandingkan dengan Gut-Chip asli, terlepas dari jenis sel yang dikultur. Oleh karena itu, untuk menginduksi morfogenesis 3D, desain usus on-chip linier dan kompleks dapat dipertukarkan. Replika PDMS yang diawetkan pada cetakan silikon dengan pola SU-8 memberikan fitur negatif setelah pelepasan cetakan (Gambar 2a). Untuk membuat usus pada chip, lapisan PDMS atas yang telah disiapkan secara berurutan diikat ke film PDMS berpori dan kemudian disejajarkan dengan lapisan PDMS bawah dengan pengikatan ireversibel menggunakan alat perlakuan korona (Gambar 2b–f). Untuk membuat chip hibrida, replika PDMS yang telah diawetkan diikat ke slide kaca untuk membuat perangkat mikrofluida saluran tunggal yang dapat menampung sisipan Transwell (Gambar 2h dan Gambar Data Tambahan 2). Proses pengikatan dilakukan dengan memperlakukan permukaan replika PDMS dan kaca dengan plasma oksigen atau perlakuan korona. Setelah sterilisasi perangkat mikrofabrikasi yang terpasang pada tabung silikon, pengaturan perangkat siap untuk melakukan morfogenesis 3D epitel usus (Gambar 2g).
a, Ilustrasi skematis pembuatan bagian PDMS dari cetakan silikon berpola SU-8. Larutan PDMS yang belum mengeras dituangkan ke cetakan silikon (kiri), dikeraskan pada suhu 60 °C (tengah) dan dilepas dari cetakan (kanan). PDMS yang telah dilepas dari cetakan dipotong-potong dan dibersihkan untuk penggunaan selanjutnya. b, Foto cetakan silikon yang digunakan untuk menyiapkan lapisan atas PDMS. c, Foto cetakan silikon yang digunakan untuk membuat membran berpori PDMS. d, Serangkaian foto komponen PDMS atas dan bawah serta perangkat usus on-chip yang telah dirakit. e, Skema penyelarasan komponen PDMS atas, membran, dan bawah. Setiap lapisan diikat secara permanen dengan perlakuan plasma atau korona. f, Skema perangkat usus on-a-chip yang telah dibuat dengan mikrokanal berbelit-belit dan ruang vakum yang ditumpangkan. g, Pengaturan usus on-a-chip untuk kultur sel mikrofluida. Usus on-a-chip yang telah dibuat dan dirakit dengan tabung silikon dan jarum suntik ditempatkan di atas kaca penutup. Perangkat chip ditempatkan di atas tutup cawan Petri 150 mm untuk diproses. Pengikat digunakan untuk menutup tabung silikon.h, Cuplikan visual fabrikasi chip hibrida dan morfogenesis 3D menggunakan chip hibrida. Sisipan Transwell yang disiapkan secara independen untuk mengkultur monolayer 2D sel epitel usus dimasukkan ke dalam chip hibrida untuk menginduksi morfogenesis 3D usus. Medium dialirkan melalui mikrokanal di bawah lapisan sel yang terbentuk pada sisipan Transwell. Skala bar, 1 cm.h Dicetak ulang dengan izin dari referensi.4. Elsevier.
Dalam protokol ini, sel Caco-2 dan organoid usus digunakan sebagai sumber epitel (Gambar 3a). Kedua jenis sel dikultur secara independen (Kotak 2 dan Kotak 5) dan digunakan untuk menanamkan mikrokanal berlapis ECM pada usus on-chip atau sisipan Transwell. Ketika sel mencapai konfluensi (>95% cakupan dalam labu), sel Caco-2 yang dikultur secara rutin (antara passage 10 dan 50) dalam labu T dipanen untuk menyiapkan suspensi sel terdisosiasi dengan cairan tripsinasi (kotak 2). Organoid usus manusia dari biopsi usus atau reseksi bedah dikultur dalam kubah perancah Matrigel dalam pelat 24 sumur untuk mendukung lingkungan mikro struktural. Medium yang mengandung morfogen esensial (seperti Wnt, R-spondin, dan Noggin) dan faktor pertumbuhan yang disiapkan seperti yang dijelaskan dalam Kotak 3 ditambahkan setiap dua hari sekali sampai organoid tumbuh hingga ~500 µm. Diameter. Organoid yang telah tumbuh sempurna dipanen dan dipisahkan menjadi sel tunggal untuk ditanamkan ke dalam usus atau sisipan Transwell pada chip (Kotak 5). Seperti yang telah kami laporkan sebelumnya, organoid dapat dibedakan berdasarkan jenis penyakit12,13 (misalnya kolitis ulserativa, penyakit Crohn, kanker kolorektal, atau donor normal), lokasi lesi (misalnya, lesi versus area non-lesi) dan lokasi gastrointestinal di saluran pencernaan (misalnya, duodenum, jejunum, ileum, sekum, kolon, atau rektum). Kami menyediakan protokol yang dioptimalkan dalam Kotak 5 untuk mengkultur organoid kolon (koloid) yang biasanya membutuhkan konsentrasi morfogen yang lebih tinggi daripada organoid usus halus.
a. Alur kerja untuk induksi morfogenesis usus pada chip usus. Epitel usus manusia Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk mendemonstrasikan morfogenesis 3D. Sel epitel yang diisolasi ditanamkan pada perangkat usus-pada-chip yang telah disiapkan (persiapan chip). Setelah sel ditanamkan (seeded) dan menempel (attached) pada membran berpori PDMS pada hari ke-0 (D0), aliran apikal (AP) dimulai dan dipertahankan selama 2 hari pertama (flow, AP, D0-D2). Aliran basolateral (BL) juga dimulai bersamaan dengan gerakan peregangan siklik (stretch, flow, AP dan BL) ketika lapisan tunggal 2D lengkap terbentuk. Morfogenesis 3D usus terjadi secara spontan setelah 5 hari kultur mikrofluida (morfogenesis, D5). Gambar kontras fase menunjukkan morfologi representatif sel Caco-2 pada setiap langkah eksperimental atau titik waktu (grafik batang, 100 µm). Empat diagram skematik. a, Mengilustrasikan kaskade morfogenesis usus yang sesuai (kanan atas). Panah putus-putus dalam skema menunjukkan arah aliran cairan. b, Gambar SEM yang menunjukkan topologi permukaan epitel Caco-2 3D yang telah terbentuk (kiri). Sisipan yang menyoroti area yang diperbesar (kotak putus-putus putih) menunjukkan mikrovili yang beregenerasi pada lapisan Caco-2 3D (kanan). c, Tampilan frontal horizontal dari Caco-2 3D yang telah terbentuk, claudin (ZO-1, merah) dan membran brush border kontinu yang diberi label F-aktin (hijau) dan inti (biru). Visualisasi imunofluoresensi konfokal sel epitel pada chip usus. Panah yang menunjuk ke skema tengah menunjukkan lokasi bidang fokus untuk setiap tampilan konfokal. d, Perjalanan waktu perubahan morfologis pada organoid yang dikultur pada chip yang diperoleh dengan mikroskop kontras fase pada hari ke-3, 7, 9, 11, dan 13. Sisipan (kanan atas) menunjukkan perbesaran tinggi dari yang disediakan. Gambar e, Mikrograf DIC dari epitel 3D organoid yang dibentuk di usus pada irisan yang diambil pada hari ke-7. f, Gambar imunofluoresensi yang ditumpangkan menunjukkan penanda untuk sel punca (LGR5; magenta), sel goblet (MUC2; hijau), F-aktin (abu-abu) dan inti (sian) yang ditumbuhkan pada chip usus selama 3 hari, masing-masing (Kiri) dan organoid 13 hari (tengah) pada lapisan epitel. Lihat juga Gambar Data Tambahan 3, yang menyoroti pensinyalan LGR5 tanpa pensinyalan MUC2. Gambar fluoresensi menunjukkan mikrostruktur epitel (kanan) dari epitel organoid 3D yang dibentuk di usus pada chip dengan mewarnai membran plasma dengan pewarna CellMask (kanan) pada hari ke-13 kultur. Skala bar adalah 50 μm kecuali dinyatakan lain. b Dicetak ulang dengan izin dari referensi 2. Oxford University Press; c Diadaptasi dengan izin dari Referensi 2. Oxford University Press; Gambar e dan f diadaptasi dengan izin melalui referensi.12 Di bawah Lisensi Creative Commons CC BY 4.0.
Dalam sistem usus pada chip, perlu dilakukan modifikasi permukaan hidrofobik membran berpori PDMS agar pelapisan ECM berhasil. Dalam protokol ini, kami menerapkan dua metode berbeda untuk memodifikasi hidrofobisitas membran PDMS. Untuk kultur sel Caco-2, aktivasi permukaan dengan perlakuan UV/ozon saja sudah cukup untuk mengurangi hidrofobisitas permukaan PDMS, melapisi ECM, dan menempelkan sel Caco-2 ke membran PDMS. Namun, kultur mikrofluida epitel organoid membutuhkan fungsionalisasi permukaan berbasis kimia untuk mencapai pengendapan protein ECM yang efisien dengan menerapkan polietilenimina (PEI) dan glutaraldehida secara berurutan ke mikrokanal PDMS. Setelah modifikasi permukaan, protein ECM diendapkan untuk menutupi permukaan PDMS yang telah difungsionalisasi dan kemudian dimasukkan ke dalam epitel organoid yang terisolasi. Setelah sel menempel, kultur sel mikrofluida dimulai dengan hanya mengalirkan medium ke mikrokanal atas hingga sel membentuk lapisan tunggal yang lengkap, sementara mikrokanal bawah mempertahankan kondisi statis. Metode yang dioptimalkan ini untuk aktivasi permukaan dan pelapisan ECM memungkinkan penempelan organoid. epitel untuk menginduksi morfogenesis 3D pada permukaan PDMS.
Kultur Transwell juga memerlukan pelapisan ECM sebelum penanaman sel; namun, kultur Transwell tidak memerlukan langkah pra-perlakuan yang kompleks untuk mengaktifkan permukaan sisipan berpori. Untuk menumbuhkan sel Caco-2 pada sisipan Transwell, pelapisan ECM pada sisipan berpori mempercepat pelekatan sel Caco-2 yang terdisosiasi (<1 jam) dan pembentukan penghalang sambungan ketat (<1-2 hari). Untuk mengkultur organoid pada sisipan Transwell, organoid yang diisolasi ditanam pada sisipan berlapis ECM, dilekatkan ke permukaan membran (<3 jam) dan dipertahankan hingga organoid membentuk lapisan tunggal lengkap dengan integritas penghalang. Kultur Transwell dilakukan dalam pelat 24 sumur tanpa menggunakan chip hibrida.
Morfogenesis 3D in vitro dapat dimulai dengan menerapkan aliran fluida ke aspek basolateral dari lapisan epitel yang telah terbentuk. Pada usus di atas chip, morfogenesis epitel dimulai ketika medium dialirkan ke dalam mikrokanal atas dan bawah (Gambar 3a). Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, sangat penting untuk memasukkan aliran fluida di kompartemen inferior (basolateral) untuk pembuangan terus menerus inhibitor morfogen yang disekresikan secara terarah. Untuk menyediakan nutrisi dan serum yang cukup bagi sel-sel yang terikat pada membran berpori dan menghasilkan tegangan geser luminal, kami biasanya menerapkan aliran ganda pada usus di atas chip. Pada chip hibrida, sisipan Transwell yang berisi monolayer epitel dimasukkan ke dalam chip hibrida. Kemudian, medium diaplikasikan di bawah sisi basolateral sisipan Transwell berpori melalui mikrokanal. Morfogenesis usus terjadi 3-5 hari setelah dimulainya aliran basolateral di kedua platform kultur.
Fitur morfologi lapisan epitel 3D hasil rekayasa mikro dapat dianalisis dengan menerapkan berbagai modalitas pencitraan, termasuk mikroskopi kontras fase, mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC), SEM, atau mikroskopi konfokal imunofluoresensi (Gambar 3 dan 4). Pencitraan kontras fase atau DIC dapat dengan mudah dilakukan kapan saja selama kultur untuk memantau bentuk dan tonjolan lapisan epitel 3D. Karena transparansi optik film PDMS dan poliester, baik platform gut-on-a-chip maupun hybrid chip dapat memberikan pencitraan in situ secara real-time tanpa perlu pemotongan atau pembongkaran perangkat. Saat melakukan pencitraan imunofluoresensi (Gambar 1, 3c, f dan 4b, c), sel biasanya difiksasi dengan paraformaldehida (PFA) 4% (berat/volume), diikuti oleh Triton X-100 dan albumin serum sapi (BSA) 2% (berat/volume), secara berurutan. Tergantung pada jenis sel, fiksatif yang berbeda, Permeabilizer dan agen penghambat dapat digunakan. Antibodi primer yang menargetkan penanda sel atau wilayah yang bergantung pada garis keturunan digunakan untuk menyoroti sel yang diimobilisasi in situ pada chip, diikuti oleh antibodi sekunder bersama dengan pewarna kontras yang menargetkan nukleus (misalnya, 4′,6-diamidino-2-fenilena indol, DAPI) atau F-aktin (misalnya, faloidin berlabel fluoresen). Pencitraan langsung berbasis fluoresensi juga dapat dilakukan in situ untuk mendeteksi produksi lendir (Gambar 1, “Diferensiasi sel” dan “Fisiologi usus”), kolonisasi acak sel mikroba (Gambar 1, “Kultur bersama inang-mikroba”), perekrutan sel imun (Gambar 1, 'Pemodelan Penyakit') atau kontur morfologi epitel 3D (Gambar 3c,f dan 4b,c). Saat memodifikasi usus pada chip untuk memisahkan lapisan atas dari lapisan mikrokanal bawah, seperti yang dijelaskan dalam referensi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2. Morfologi epitel 3D serta mikrovili pada batas sikat apikal dapat divisualisasikan dengan SEM (Gambar 3b). Ekspresi penanda diferensiasi dapat dinilai dengan melakukan PCR kuantitatif5 atau sekuensing RNA sel tunggal. Dalam hal ini, lapisan 3D sel epitel yang ditumbuhkan dalam chip usus atau chip hibrida dipanen dengan tripsinasi dan kemudian digunakan untuk analisis molekuler atau genetik.
a, Alur kerja untuk induksi morfogenesis usus pada chip hibrida. Sel Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk mendemonstrasikan morfogenesis 3D pada platform chip hibrida. Sel epitel yang terdisosiasi ditanam dalam sisipan Transwell yang telah disiapkan (TW prep; lihat gambar di bawah). Setelah sel ditanam (seeded) dan menempel pada membran poliester dalam sisipan Transwell, semua sel dikultur dalam kondisi statis (TW culture). Setelah 7 hari, satu sisipan Transwell yang berisi lapisan tunggal sel epitel 2D diintegrasikan ke dalam chip hibrida untuk memperkenalkan aliran basolateral (Flow, BL), yang pada akhirnya menyebabkan terbentuknya lapisan epitel 3D (morfogenesis). Mikrograf kontras fase menunjukkan fitur morfologis sel epitel organ manusia yang berasal dari donor normal (garis C103) kolon asenden pada setiap langkah atau titik waktu eksperimental. Skema pada lapisan atas menggambarkan konfigurasi eksperimental untuk setiap langkah. b, Chip hibrida (skema kiri) dapat menyebabkan morfogenesis 3D organoid Sel epitel dengan tampilan mikroskopi konfokal dari atas ke bawah yang diambil pada posisi Z yang berbeda (atas, tengah, dan bawah; lihat skema kanan dan garis putus-putus yang sesuai). menunjukkan karakteristik morfologi yang jelas. F-aktin (sian), nukleus (abu-abu). c, Mikrograf konfokal fluoresensi (tampilan miring 3D) dari sel epitel turunan organoid yang dikultur dalam Transwell statis (TW; sisipan di dalam kotak putus-putus putih) versus chip hibrida (gambar penuh terbesar) membandingkan morfologi 2D versus 3D, masing-masing. Sepasang tampilan potongan melintang vertikal 2D (sisipan di sudut kanan atas; "XZ") juga menunjukkan fitur 2D dan 3D. Skala bar, 100 µm. c Dicetak ulang dengan izin dari referensi.4. Elsevier.
Kontrol dapat disiapkan dengan mengkultur sel yang sama (Caco-2 atau sel epitel organoid usus) menjadi lapisan tunggal dua dimensi di bawah kondisi kultur statis konvensional. Perlu dicatat, penipisan nutrisi dapat terjadi karena kapasitas volume mikrokanal yang terbatas (yaitu ~4 µL di saluran atas pada desain chip usus asli). Oleh karena itu, morfologi epitel sebelum dan sesudah penerapan aliran basolateral juga dapat dibandingkan.
Proses litografi lunak harus dilakukan di ruang bersih. Untuk setiap lapisan pada chip (lapisan atas dan bawah serta membran) dan chip hibrida, digunakan fotomask yang berbeda dan dibuat pada wafer silikon terpisah karena ketinggian mikrokanal berbeda. Ketinggian target mikrokanal atas dan bawah pada chip masing-masing adalah 500 µm dan 200 µm. Ketinggian target kanal pada chip hibrida adalah 200 µm.
Letakkan lempengan silikon berukuran 3 inci dalam wadah berisi aseton. Putar perlahan piringan selama 30 detik, lalu keringkan lempengan dengan udara. Pindahkan lempengan ke piring berisi IPA, lalu putar piringan selama 30 detik untuk membersihkan.
Larutan piranha (campuran hidrogen peroksida dan asam sulfat pekat, 1:3 (vol/vol)) dapat digunakan sebagai pilihan untuk memaksimalkan penghilangan residu organik dari permukaan wafer silikon.
Larutan piranha sangat korosif dan menghasilkan panas. Tindakan pencegahan keselamatan tambahan diperlukan. Untuk pembuangan limbah, biarkan larutan mendingin dan pindahkan ke wadah limbah yang bersih dan kering. Gunakan wadah sekunder dan beri label yang tepat pada wadah limbah. Harap ikuti pedoman keselamatan fasilitas untuk prosedur yang lebih rinci.
Dehidrasi wafer dilakukan dengan meletakkannya di atas pelat pemanas bersuhu 200 °C selama 10 menit. Setelah dehidrasi, wafer digoyangkan lima kali di udara untuk mendinginkan.
Tuangkan sekitar 10 g photoresist SU-8 2100 ke tengah wafer silikon yang telah dibersihkan. Gunakan pinset untuk meratakan photoresist secara merata pada wafer. Sesekali letakkan wafer di atas pelat pemanas 65°C agar photoresist tidak terlalu lengket dan lebih mudah diratakan. Jangan letakkan wafer langsung di atas pelat pemanas.
SU-8 didistribusikan secara merata pada wafer dengan menjalankan pelapisan putar (spin coating). Programkan rotasi masuk SU-8 selama 5–10 detik untuk merambat pada 500 rpm dengan akselerasi 100 rpm/s. Atur putaran utama untuk pola ketebalan 200 µm pada 1.500 rpm, atau capai ketebalan 250 µm (membuat tinggi 500 µm untuk lapisan atas usus pada chip; lihat “Langkah-langkah penting” di bawah) yang diatur pada akselerasi 300 rpm/s selama 30 detik pada 1.200 rpm.
Kecepatan putaran utama dapat disesuaikan sesuai dengan ketebalan target pola SU-8 pada wafer silikon.
Untuk membuat pola SU-8 dengan tinggi 500 µm untuk lapisan atas usus pada chip, langkah pelapisan putar dan pemanggangan lunak pada Box ini (langkah 7 dan 8) diulangi secara berurutan (lihat langkah 9) untuk menghasilkan dua lapisan SU-8 setebal 250 µm, yang dapat dilapis dan disambung dengan paparan UV pada langkah 12 dari box ini, sehingga menghasilkan lapisan setinggi 500 µm.
Panggang wafer berlapis SU-8 secara perlahan dengan meletakkan wafer dengan hati-hati di atas pelat pemanas pada suhu 65 °C selama 5 menit, kemudian ubah suhu menjadi 95 °C dan inkubasi selama 40 menit tambahan.
Untuk mencapai ketinggian pola SU-8 sebesar 500 μm di mikrokanal bagian atas, ulangi langkah 7 dan 8 untuk menghasilkan dua lapisan SU-8 setebal 250 μm.
Dengan menggunakan UV Mask Aligner, lakukan uji lampu sesuai petunjuk pabrikan untuk menghitung waktu paparan wafer. (waktu paparan, ms) = (dosis paparan, mJ/cm2)/(daya lampu, mW/cm2).
Setelah menentukan waktu pemaparan, letakkan fotomask pada dudukan mask dari alat penyejajar mask UV dan letakkan fotomask pada wafer yang dilapisi SU-8.
Letakkan permukaan fotomask yang telah dicetak langsung pada sisi wafer silikon yang dilapisi SU-8 untuk meminimalkan dispersi UV.
Paparkan wafer dan fotomask yang dilapisi SU-8 secara vertikal ke cahaya UV sebesar 260 mJ/cm2 selama waktu pemaparan yang telah ditentukan (lihat langkah 10 pada kotak ini).
Setelah terpapar sinar UV, wafer silikon berlapis SU-8 dipanggang pada suhu 65°C selama 5 menit dan 95°C selama 15 menit pada masing-masing pelat pemanas untuk membuat pola dengan ketinggian 200 μm. Perpanjang waktu pemanggangan pasca-pencahayaan pada suhu 95°C menjadi 30 menit untuk membuat pola dengan ketinggian 500 µm.
Cairan pengembang dituangkan ke dalam cawan kaca, dan wafer yang telah dipanggang diletakkan di dalam cawan tersebut. Volume cairan pengembang SU-8 dapat bervariasi tergantung pada ukuran pelat kaca. Pastikan untuk menggunakan cairan pengembang SU-8 yang cukup untuk menghilangkan SU-8 yang tidak terpapar sepenuhnya. Misalnya, saat menggunakan cawan kaca berdiameter 150 mm dengan kapasitas 1 L, gunakan sekitar 300 mL cairan pengembang SU-8. Kembangkan cetakan selama 25 menit dengan sesekali diputar perlahan.
Bilas cetakan yang telah dikembangkan dengan sekitar 10 mL larutan pengembang baru, kemudian semprotkan larutan tersebut dengan IPA menggunakan pipet.
Tempatkan wafer di dalam pembersih plasma dan paparkan pada plasma oksigen (gas atmosfer, tekanan target 1 × 10−5 Torr, daya 125 W) selama 1,5 menit.
Letakkan wafer di dalam desikator vakum dengan slide kaca di dalamnya. Wafer dan slide dapat diletakkan berdampingan. Jika desikator vakum dibagi menjadi beberapa lapisan oleh sebuah pelat, letakkan slide di ruang bawah dan wafer di ruang atas. Teteskan 100 μL larutan trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane pada slide kaca dan berikan vakum untuk silanisasi.
Cairkan vial sel Caco-2 beku dalam penangas air 37°C, kemudian pindahkan sel yang telah dicairkan ke labu T75 yang berisi 15 mL medium Caco-2 yang telah dihangatkan sebelumnya hingga 37°C.
Untuk mekultur sel Caco-2 pada tingkat konfluensi ~90%, pertama-tama hangatkan medium Caco-2, PBS, dan 0,25% tripsin/1 mM EDTA dalam penangas air 37°C.
Sedot medium dengan aspirasi vakum. Cuci sel dua kali dengan 5 mL PBS hangat dengan mengulangi aspirasi vakum dan menambahkan PBS segar.