Eskerrik asko Nature.com webgunea bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakutsiko dugu.
Gizakien hesteetako morfogenesiak kripto-biloen 3D epitelio-mikroarkitekturaren eta espazio-antolaketaren ezaugarriak ezartzen ditu. Egitura berezi hau beharrezkoa da hesteetako homeostasia mantentzeko, kripto basaleko zelula amen nitxoa antigeno mikrobiano exogenoetatik eta haien metabolitoetatik babestuz. Gainera, hesteetako biloek eta muki jariatzaileek funtzionalki bereizitako zelula epitelialak aurkezten dituzte hesteetako mukosaren gainazalean babes-hesi batekin. Beraz, 3D epitelio-egiturak birsortzea ezinbestekoa da in vitro hesteetako ereduak eraikitzeko. Aipagarria da txipean dagoen hesteetako epitelioaren 3D morfogenesi espontaneoa eragin dezakeela, funtzio fisiologiko eta biomekanika hobetuekin. Hemen, protokolo erreproduzigarri bat eskaintzen dugu hesteetako morfogenesia sendo eragiteko txip mikrofluidiko batean eta Transwell txertatutako txip hibrido batean. Gailuak fabrikatzeko, Caco-2 edo hesteetako organoide epitelio-zelulak hazteko metodo zehatzak deskribatzen ditugu, baita plataforma mikrofluidiko batean ere. hainbat irudi modalitate erabiliz. Protokolo honek hesteetako mikroarkitektura funtzionalaren birsorkuntza lortzen du, fluido basolateralaren fluxua 5 egunez kontrolatuz. Gure in vitro morfogenesi metodoak fisiologikoki garrantzitsuak diren zizaila-tentsioak eta mugimendu mekanikoak erabiltzen ditu eta ez du zelulen ingeniaritza edo manipulazio konplexurik behar, eta horrek beste teknika batzuk gainditu ditzake. Uste dugu proposatutako protokoloak ondorio zabalak izan ditzakeela ikerketa biomedikoko komunitatearentzat, 3D hesteetako epitelio-geruzak in vitro birsortzeko metodo bat eskainiz aplikazio biomediko, kliniko eta farmazeutikoetarako.
Esperimentuek erakusten dute txip-ean1,2,3,4,5 edo geruza bikoitzeko gailu mikrofluidikoetan6,7 landutako hesteetako epitelioko Caco-2 zelulak in vitro 3D morfogenesi espontaneoa izan dezaketela azpiko mekanismoa argi ulertu gabe. Gure azken ikerketan, aurkitu dugu basolateralki jariatutako morfogenoen antagonistak hazkuntza-gailuetatik kentzea beharrezkoa eta nahikoa dela in vitro 3D epitelioko morfogenesia eragiteko, Caco-2-k eta pazienteengandik eratorritako hesteetako organoideek frogatu duten bezala. Zelula epitelialak balioztatu ziren. Ikerketa honetan, Wnt antagonista indartsu baten, Dickkopf-1 (DKK-1), zelulen ekoizpenean eta kontzentrazioaren banaketan zentratu gara bereziki, txipean dauden hesteetan eta Transwell txertaketak dituzten gailu mikrofluidiko aldatuetan, "Txipa Hibridoa" izenekoetan. Frogatzen dugu Wnt antagonista exogenoak (adibidez, DKK-1, Wnt errepresorea 1, jariatutako frizzled-erlazionatutako proteina 1 edo Soggy-1) txipean dauden hesteetan gehitzeak morfogenesia inhibitzen duela edo aurrez egituratutako 3D epitelio geruza eten egiten duela, eta horrek iradokitzen du hazkuntzan zehar gertatzen den estres antagonistak in vitro hesteetako morfogenesiaren erantzule dela. Beraz, epitelio interfazean morfogenesi sendoa lortzeko modu praktiko bat Wnt antagonisten mailak kentzea edo gutxien mantentzea da konpartimentu basolateralean, garbiketa aktiboaren bidez (adibidez, txipean dauden hesteetan edo txipean dauden hibrido plataformetan) edo difusioaren bidez. Basolateral ingurunea (adibidez, Transwell txertaketetatik putzuetako basolateral gordailu handietara).
Protokolo honetan, txip batean dauden hesteetako mikrogailuak eta Transwell txerta daitezkeen txip hibridoak (1-5 urratsak) fabrikatzeko metodo zehatz bat eskaintzen dugu, hesteetako epitelio-zelulak polidimetilsiloxanoan (PDMS) oinarritutako mintz porotsuetan (6A, 7A, 8, 9 urratsak) edo Transwell txertaketen poliesterrezko mintzetan (6B, 7B, 8, 9 urratsak) hazteko eta in vitro 3D morfogenesia eragiteko (10. urratsa). Ehun-espezifiko histogenesiaren eta lerro-menpeko zelulen bereizketaren adierazgarri diren ezaugarri zelular eta molekularrak ere identifikatu ditugu, hainbat irudi-modalitate aplikatuz (11-24 urratsak). Morfogenesia eragiteko, gizakien hesteetako epitelio-zelulak erabiliz, hala nola Caco-2 edo hesteetako organoideak, bi kultura-formatutan, xehetasun teknikoekin: mintz porotsuen gainazalaren aldaketa, 2D monogeruzen sorrera eta hesteetako biokimika eta mikroingurune biomekanikoaren erreprodukzioa in vitro. 2D epitelio-monogeruzen 3D morfogenesia eragiteko, morfogenoen antagonistak kendu ditugu bi kultibatuetan. Ingurunea kulturaren basolateral konpartimentuan isuriz sortzen da. Azkenik, morfogenoaren menpeko epitelio-hazkundea, ostalariaren eta mikrobiomaren arteko luzetarako ko-kulturak, patogenoen infekzioa, hanturazko lesioa, epitelio-hesiaren disfuntzioa eta probiotikoetan oinarritutako terapiak modelatzeko erabil daitekeen 3D epitelio-geruza birsorgarri baten erabilgarritasunaren irudikapena eskaintzen dugu. Adibidea. eraginak.
Gure protokoloa erabilgarria izan daiteke oinarrizko ikerketan (adibidez, hesteetako mukosaren biologia, zelula amen biologia eta garapen-biologia) eta ikerketa aplikatuan (adibidez, sendagaien aurreklinikoen probak, gaixotasunen modelizazioa, ehunen ingeniaritza eta gastroenterologia), eragin zabaleko zientzialari sorta zabalarentzat. Hesteetako epitelioaren 3D morfogenesia in vitro eragiteko gure protokoloaren erreproduzigarritasuna eta sendotasuna direla eta, aurreikusten dugu gure estrategia teknikoa hesteetako garapenean, birsorkuntzan edo homeostasian zehar zelulen seinaleztapenaren dinamika aztertzen duten publikoei zabaldu ahal izango zaiela. Horrez gain, gure protokoloa erabilgarria da infekzioa hainbat agente infekziosoren pean galdekatzeko, hala nola Norovirus 8, Arnas Sindrome Akutu Larriaren Koronabirusa 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 edo Vibrio cholerae. Gaixotasunen patologia eta patogenesiaren audientziak ere erabilgarriak dira. Txipean dagoen hesteetako mikrofisiologia sistema baten erabilerak ko-kultura longitudinala ahalbidetu dezake 10 eta ondorengo ebaluazioa ostalariaren defentsan, erantzun immunologikoetan eta patogenoekin lotutako lesioen konponketan digestio-aparatuan 11. Heste-ihes sindromearekin, gaixotasun zeliakoarekin, Crohn gaixotasunarekin, kolitis ultzeragarriarekin, pouchitisarekin edo heste narritagarriaren sindromearekin lotutako beste GI nahasmendu batzuk simulatu daitezke 3D hesteetako epitelio geruzak pazientearen 3D hesteetako epitelio geruzak erabiliz prestatzen direnean, gaixotasun horien artean daude biloen atrofia, kriptoen laburdura, mukosaren kaltea edo epitelio-hesiaren narritadura. Biopsia edo zelula amen bidez eratorritako hesteetako organoideak 12,13. Gaixotasunaren ingurunearen konplexutasun handiagoa hobeto modelatzeko, irakurleek gaixotasunarekin lotutako zelula motak gehitzea kontuan har dezakete, hala nola pazientearen odol periferikoko zelula mononuklearrak (PBMC), 3D hesteetako bilo-kripta mikroarkitekturak dituzten modeloetan. ehun-espezifiko zelula immunologikoak, 5.
3D epitelioaren mikroegitura finkatu eta bistaratu daitekeenez sekzio-prozesurik gabe, transkriptomika espazialean eta bereizmen handiko edo superbereizmeneko irudietan lan egiten duten ikusleek interesa izan dezakete epitelio-nitxoetan geneen eta proteinen dinamika espazio-tenporalaren mapaketan. Teknologian interesa. Estimulu mikrobiano edo immunologikoei emandako erantzuna. Gainera, hesteetako homeostasia koordinatzen duen ostalari-mikrobiomaren arteko elkarrizketa longitudinala 10, 14 ezar daiteke 3D hesteetako mukosa-geruzan, hainbat espezie mikrobiano, komunitate mikrobiano edo gorotz-mikrobiota batera landuz, batez ere txipean dauden gut-on-a-microbiotan. plataforman. Ikuspegi hau bereziki erakargarria da mukosen immunologia, gastroenterologia, giza mikrobioma, kulturomika eta mikrobiologia klinikoa ikasten ari direnentzat, aurretik laborategian landu gabeko hesteetako mikrobiota landu nahi dutenentzat. Gure in vitro morfogenesi protokoloa eskalagarriak diren kultura formatuetara egokitu badaiteke, hala nola 24, 96 edo 384 putzuko plaketan dauden putzu anitzeko txertaketetara, etengabe basolateral konpartimentuak betetzen dituztenak, protokoloa elikagaien industriarako plataforma farmazeutikoak, biomedikoak edo errendimendu handiko baheketa edo baliozkotze plataformak garatzen dituztenei ere zabaldu ahal zaie. Printzipioaren froga gisa, duela gutxi frogatu dugu 24 putzuko plaka formatura eskalagarria den errendimendu handiko morfogenesi sistema multiplex baten bideragarritasuna. Horrez gain, hainbat organo-txip produktu merkaturatu dira16,17,18. Beraz, gure in vitro morfogenesi metodoaren baliozkotzea bizkortu eta ikerketa laborategi, industria edo gobernu eta erakunde arautzaile askok erabil dezakete in vitro hesteetako morfogenesiaren birprogramazio zelularra maila transkriptomikoan ulertzeko, sendagaiak probatzeko edo bioterapeutikoak Sendagai hautagaien xurgapena eta garraioa 3D heste-ordezkoak erabiliz edo txip batean dauden organo-eredu pertsonalizatuak edo komertzialak erabiliz ebaluatu ziren heste-morfogenesi prozesuaren erreproduzigarritasuna ebaluatzeko.
Gizakientzako garrantzitsuak diren eredu esperimental kopuru mugatu bat erabili da hesteetako epitelioaren morfogenesia aztertzeko, batez ere in vitro 3D morfogenesia eragiteko protokolo ez dagoelako inplementatzeko modukoak. Izan ere, hesteetako morfogenesiari buruzko egungo ezagutzaren zati handi bat animalien ikerketetan oinarritzen da (adibidez, zebra arraina20, saguak21 edo oiloak22). Hala ere, lan eta kostu handikoak dira, etikoki zalantzagarriak izan daitezke eta, batez ere, ez dituzte zehazki zehazten giza garapen prozesuak. Eredu hauek oso mugatuak dira modu eskalagarri anitzekoan probatzeko duten gaitasunari dagokionez. Beraz, in vitro 3D ehunen egiturak birsortzeko gure protokoloak in vivo animalia ereduak eta beste 2D zelula kultura eredu estatiko tradizional batzuk gainditzen ditu. Aurretik deskribatu bezala, 3D epitelio egiturak erabiltzeak zelula bereiztuen kokapen espaziala aztertzeko aukera eman zigun kripto-bilo ardatzean, mukosa edo immunitate estimulu desberdinen aurrean. 3D epitelio geruzek espazio bat eman dezakete zelula mikrobianoek nola lehiatzen diren nitxo espazialak eta eboluzio ekologikoa ostalari faktoreen aurrean (adibidez, barneko eta kanpoko mukosa geruzak, jariaketa) osaeran aztertzeko. IgA eta antimikrobiano peptidoen). Gainera, 3D epitelio morfologiak hesteetako mikrobiotak bere komunitateak nola egituratzen dituen eta sinergikoki nola sortzen dituen metabolito mikrobianoak (adibidez, kate laburreko gantz-azidoak) ulertzen laguntzen digu, zelulen antolaketa eta zelula amen nitxoak moldatzen dituztenak kripta basaletan. Ezaugarri hauek 3D epitelio geruzak in vitro ezartzen direnean bakarrik frogatu daitezke.
3D hesteetako epitelio-egiturak sortzeko gure metodoaz gain, in vitro metodo ugari daude. Hesteetako organoideen kultura ehunen ingeniaritza teknika aurreratua da, hesteetako zelula amen laborantzan oinarritua morfogeno-baldintza espezifikoetan23,24,25. Hala ere, 3D organoideen ereduak erabiltzea garraio-analisietarako edo ostalariaren mikrobiomaren ko-kulturetarako askotan erronka bat da, hesteetako lumena organoidearen barruan baitago eta, beraz, lumen-osagaien sarrera, hala nola zelula mikrobianoak edo antigeno exogenoak, mugatua baita. Organoideen lumenetarako sarbidea mikroinjektore bat erabiliz hobetu daiteke,26,27 baina metodo hau inbaditzailea eta lan-intentsiboa da eta ezagutza espezializatua behar du egiteko. Gainera, baldintza estatikoetan hidrogel-egituratan mantentzen diren organoideen kultura tradizionalek ez dute zehatz-mehatz islatzen in vivo biomekanika aktiboa.
Hainbat ikerketa-taldek erabilitako beste ikuspegi batzuek aurrez egituratutako 3D hidrogel andamioak erabiltzen dituzte hesteetako epitelioaren egitura imitatzeko, gizakien hesteetako zelula isolatuak gelaren gainazalean landuz. Fabrikatu hidrogel andamioak 3D inprimatutako, mikrofresatutako edo litografikoki fabrikatutako moldeak erabiliz. Metodo honek in vitro zelula epitelial isolatuen autoantolaketa erakusten du, morfogeno gradiente fisiologikoki garrantzitsuekin, itxura-erlazio handiko epitelio-egitura eta estroma-epitelio gurutzaketa ezarriz, zelula estromalak andamioan sartuz. Hala ere, aurrez egituratutako andamioen izaerak prozesu morfogenetiko espontaneoa bera bistaratzea eragotzi dezake. Modelo hauek ere ez dute fluxu luminal edo interstizial dinamikorik ematen, hesteetako zelulek morfogenesia jasateko eta funtzio fisiologikoa lortzeko behar duten fluido-tentsio zizailagarririk gabe. Beste ikerketa berri batek hidrogel andamioak erabili zituen plataforma mikrofluidiko batean eta hesteetako epitelio-egiturak modelatu zituen laser bidezko grabatze teknikak erabiliz. Sagu-hesteetako organoideek grabatutako ereduak jarraitzen dituzte hesteetako hodi-egiturak osatzeko, eta fluido intraluminalaren fluxua mikrofluidika modulu bat erabiliz laburbil daiteke. Hala ere, modelo honek ez... ez ditu prozesu morfogenetiko espontaneoak erakusten, ezta hesteetako mugimendu mekanobiologikoak ere barne hartzen. Talde bereko 3D inprimaketa teknikek hesteetako hodi miniaturak sortzeko gai izan ziren prozesu morfogenetiko espontaneoak dituztenak. Hodiaren barruan heste-segmentu desberdinak fabrikatu arren, modelo honek ez du luminal fluidoen fluxurik eta deformazio mekanikorik. Gainera, modeloaren funtzionamendua mugatua izan daiteke, batez ere bioinprimaketa prozesua amaitu ondoren, baldintza esperimentalak edo zelula arteko elkarrekintzak asaldatuz. Horren ordez, gure proposatutako protokoloak hesteetako morfogenesi espontaneoa, fisiologikoki garrantzitsua den zizaila-tentsioa, hesteetako mugikortasuna imitatzen duen biomekanika, konpartimentu apikal eta basolateral independenteen irisgarritasuna eta modularitateko mikroingurune biologiko konplexuen birsorkuntza eskaintzen ditu. Beraz, gure in vitro 3D morfogenesi protokoloak osagarri bat izan daiteke dauden metodoen erronkak gainditzeko.
Gure protokoloa 3D epitelio morfogenesian zentratzen da erabat, zelula epitelialak soilik kulturan eta inguruko beste zelula motarik gabe, hala nola zelula mesenkimalak, zelula endotelialak eta zelula immunologikoak. Aurretik deskribatu bezala, gure protokoloaren muina epitelio morfogenesiaren indukzioa da, sartutako ingurunearen alde basolateralean jariatzen diren morfogeno inhibitzaileak kenduz. Gure gut-on-a-chip eta hybrid-on-a-chip-en modularitate sendoak 3D epitelio geruza uhintsua birsortzea ahalbidetzen digun arren, konplexutasun biologiko gehigarriak, hala nola epitelio-mesenkima elkarrekintzak33,34, matrize estrazelularraren (ECM) metaketa35 eta, gure ereduan, kripto-biloen ezaugarriak, kripto basaletan zelula amen nitxoak eramaten dituztenak. Mesenkimako zelula estromalek (adibidez, fibroblastoek) funtsezko zeregina dute ECM proteinen ekoizpenean eta in vivo hesteetako morfogenesiaren erregulazioan35,37,38. Zelula mesenkimalak gure ereduari gehitzeak prozesu morfogenetikoa hobetu zuen. eta zelulen atxikimendu-eraginkortasuna. Endotelio-geruzak (hau da, kapilarrak edo linfatikoak) zeregin garrantzitsua du garraio molekularra39 eta zelula immuneen errekrutatze40 hesteetako mikroingurunean erregulatzen. Gainera, ehun-ereduen artean konekta daitezkeen baskulatura-osagaiak ezinbestekoak dira ehun-ereduak organo anitzeko elkarrekintzak erakusteko diseinatzen direnean. Beraz, zelula endotelialak sartu beharko lirateke organo-mailako bereizmenarekin ezaugarri fisiologiko zehatzagoak modelatzeko. Pazienteengandik eratorritako zelula immuneak ere ezinbestekoak dira erantzun immune jaiotzetikoak, antigenoen aurkezpena, immunitate gurutzaketa moldakor jaiotzetikoa eta ehunen immunitate espezifikoa bistaratzeko, hesteetako gaixotasunak imitatzeko testuinguruan.
Txip hibridoen erabilera errazagoa da gut-on-a-chip baino, gailuaren konfigurazioa errazagoa delako eta Transwell txertaketen erabilerak heste-epitelioaren kultura eskalagarria ahalbidetzen duelako. Hala ere, poliesterrezko mintzak dituzten merkataritzan eskuragarri dauden Transwell txertaketak ez dira elastikoak eta ezin dituzte mugimendu peristaltikoak simulatu. Gainera, txip hibridoan jarritako Transwell txertaketaren konpartimentu apikala geldirik mantendu zen, alde apikalean tentsio zizailaturik gabe. Argi dago konpartimentu apikaleko propietate estatikoek gutxitan ahalbidetzen dutela epe luzeko bakterioen ko-kultura txip hibridoetan. Txip hibridoak erabiltzean Transwell txertaketetan 3D morfogenesia sendo eragin dezakegun arren, biomekanika fisiologikoki garrantzitsuaren eta fluido-fluxu apikalaren gabeziak txip hibridoen plataformen bideragarritasuna mugatu dezake aplikazio potentzialetarako.
Giza kripto-biloen ardatzaren berreraikuntza osoak txipean dauden hesteetan eta txipean dauden hibridoetan ez dira guztiz ezarri. Morfogenesia epitelio-monogeruza batetik hasten denez, 3D mikroarkitekturek ez dute zertan antzekotasun morfologikorik eman in vivo kriptoekin. Mikroingeniaritzako 3D epitelioan kripto-domeinu basalaren ondoan ugaltzen ari den zelula-populazioa karakterizatu dugun arren, kripto- eta bilo-eskualdeak ez ziren argi eta garbi mugatu. Txipeko goiko kanal altuagoek mikroingeniaritzako epitelioaren altuera handitzen duten arren, altuera maximoa oraindik ~300-400 µm-ra mugatzen da. Giza hesteetako kriptoen benetako sakonera heste meharrean eta lodian ~135 µm eta ~400 µm da, hurrenez hurren, eta heste meharreko biloen altuera ~600 µm da41.
Irudien ikuspuntutik, 3D mikroarkitekturen in situ superbereizmeneko irudiak txip bateko hesteetara mugatu daitezke, objektiboaren lentearen eta epitelio-geruza arteko lan-distantzia milimetro gutxi batzuetakoa baita. Arazo hau gainditzeko, objektibo urrun bat beharrezkoa izan daiteke. Gainera, laginak prestatzeko irudiak lortzeko sekzio meheak egitea erronka bat da, PDMSren elastikotasun handia dela eta. Gainera, txip bateko hesteen geruzaz geruzako mikrofabrikazioak geruza bakoitzaren arteko atxikimendu iraunkorra dakarrenez, oso zaila da goiko geruza irekitzea edo kentzea epitelio-geruzaren gainazaleko egitura aztertzeko. Adibidez, eskaneatze-mikroskopio elektroniko bat (SEM) erabiliz.
PDMS-ren hidrofobikotasuna faktore mugatzailea izan da molekula txiki hidrofoboekin lan egiten duten mikrofluidoetan oinarritutako ikerketetan, PDMS-k molekula hidrofobo horiek modu ez-espezifikoan adsorbatu baititzake. PDMS-ren alternatibak beste material polimeriko batzuekin kontuan har daitezke. Bestela, PDMS-ren gainazalaren aldaketa (adibidez, material lipofilikoekin 42 edo poli(etilen glikol) 43 estaldura) kontuan har daiteke molekula hidrofoboen adsorzioa minimizatzeko.
Azkenik, gure metodoa ez da ondo karakterizatu errendimendu handiko baheketa edo "tamaina bakarra guztientzako" erabilerraza den esperimentu-plataforma bat eskaintzeari dagokionez. Gaur egungo protokoloak xiringa-ponpa bat behar du mikrogailu bakoitzeko, eta horrek lekua hartzen du CO2 inkubagailu batean eta eskala handiko esperimentuak eragozten ditu. Muga hori nabarmen hobetu daiteke kultura-formatu berritzaileen eskalagarritasunaren bidez (adibidez, 24 putzuko, 96 putzuko edo 384 putzuko txertatze porotsuak, basolateral medioak etengabe berritu eta kentzeko aukera ematen dutenak).
Giza hesteetako epitelioaren 3D morfogenesia in vitro eragiteko, bi mikrokanal paralelo eta tartean mintz porotsu elastiko bat dituen txip mikrofluidiko gailu bat erabili genuen lumen-kapilar interfazea sortzeko. Transwell txertaketetan hazitako epitelio geruza polarizatuen azpian fluxu basolateral jarraitua ematen duen kanal bakarreko gailu mikrofluidiko baten (txip hibridoa) erabilera ere erakusten dugu. Bi plataformetan, giza hesteetako epitelio zelula desberdinen morfogenesia fluxuaren manipulazio norabidetua aplikatuz frogatu daiteke, morfogeno antagonistak konpartimentu basolateraletik kentzeko. Prozedura esperimental osoak (1. irudia) bost zati ditu: (i) hesteetako txiparen edo Transwell txerta daitekeen txip hibridoaren mikrofabrikazioa (1-5 urratsak; 1. koadroa), (ii) hesteetako epitelio zelulen (Caco-2 zelulak) edo giza hesteetako organoideen prestaketa; 2-5 laukiak), (iii) hesteetako epitelio-zelulen kultura hesteetako txipetan edo txip hibridoetan (6-9 urratsak), (iv) 3D morfogenesiaren indukzioa in vitro (10. urratsa) eta (v)) 3D epitelio-mikroegitura karakterizatzeko (11-24 urratsak). Azkenik, kontrol-talde egoki bat (behean gehiago azalduko dena) diseinatu zen in vitro morfogenesiaren eraginkortasuna balioztatzeko, epitelio-morfogenesia kontrol espazial, tenporal, baldintzatu edo prozedurazkoekin alderatuz.
Bi kultura-plataforma desberdin erabili genituen: txip batean egindako hesteak, kanal zuzenekin edo kanal ez-lineal bihurrituekin, edo mikrofluido-gailu batean Transwell (TW) txertaketak dituzten txip hibridoak, 1. koadroan deskribatutako moduan fabrikatuak, eta 1-5 urratsetan. "Gailuaren fabrikazioa" txip bakarra edo txip hibrido bat egiteko urrats nagusiak erakusten ditu. "Giza hesteetako epitelio-zelulen kultura" protokolo honetan erabilitako zelula-iturria (Caco-2 edo gizakien hesteetako organoideak) eta kultura-prozedura azaltzen du. "In vitro morfogenesia" Caco-2 edo organoideetatik eratorritako epitelio-zelulak hesteetako txip batean edo txip hibrido baten Transwell txertaketetan lantzeko urrats orokorrak erakusten ditu, ondoren 3D morfogenesiaren indukzioa eta epitelio-egitura karakterizatu baten eraketa eginez. Programaren urrats-zenbakia edo koadro-zenbakia gezi bakoitzaren azpian bistaratzen da. Aplikazioak ezarritako hesteetako epitelio-geruzak nola erabil daitezkeen adibideak eskaintzen ditu, adibidez, zelulen bereizketaren karakterizazioan, hesteetako fisiologia-azterketetan, ostalariaren mikrobioma-ekosistemen ezarpenean eta gaixotasunen modelizazioan. Immunofluoreszentzia-irudiak "Zelula" atalean. "Diferentziazioa" erakusten du, hesteetako txipean sortutako 3D Caco-2 epitelio geruzan adierazitako nukleoak, F-aktina eta MUC2 erakusten dituena. MUC2 seinaleztapena zelula kaliformeetan eta mukosa gainazaletatik jariatzen den mukian dago. Hesteetako Fisiologiako irudi fluoreszenteek azido sialiko eta N-azetilglukosamina hondarrekin tindatuz sortutako mukia erakusten dute, gari-germen aglutinina fluoreszentea erabiliz. "Ostalaria-Mikrobioaren Ko-Kulturak" ataleko bi irudi gainjarriek hesteetako ostalariaren mikrobiomaren ko-kultura adierazgarriak erakusten dituzte txipean. Ezkerreko panelak proteina fluoreszente berdea (GFP) adierazten duen E. coli-ren ko-kultura erakusten du mikroingeniaritzako 3D Caco-2 epitelio-zelulekin. Eskuineko panelak GFP-ren lokalizazioa erakusten du. E. coli-ren 3D Caco-2 epitelio-zelulekin batera landua, eta ondoren F-aktinarekin (gorria) eta nukleoekin (urdina) immunofluoreszentzia tindaketa. Gaixotasunen modelatzeak heste osasuntsua eta iragazkorra erakusten ditu hesteetako hantura-txipetan, bakterioen antigenoekin (adibidez, lipopolisakaridoa, erronka fisiologikopean). LPS) eta zelula immunologikoak (adibidez, PBMC; berdea).Caco-2 zelulak landu ziren 3D epitelio geruza bat ezartzeko.Eskala barra, 50 µm.Beheko errenkadako irudiak: “Zelulen bereizketa” erreferentziaren baimenarekin egokitua.2. Oxford University Press; 5. erreferentziaren baimenarekin erreproduzitua. NAS; “Ostalaria-mikrobioaren ko-kultura” 3. erreferentziaren baimenarekin egokitua. NAS; “Gaixotasunen modelatzea” erreferentziaren baimenarekin egokitua.5. NAS.
Txip hibridoak eta hesteetakoak PDMS erreplikak erabiliz fabrikatu ziren, litografia bigunaren bidez silikonazko moldeetatik desmoldatu eta SU-8-rekin modelatu zirenak. Txip bakoitzeko mikrokanalen diseinua hidrodinamika kontuan hartuta zehazten da, hala nola zizailadura-tentsioa eta presio hidrodinamikoa1,4,12. Jatorrizko hesteetakoak (Datu Hedatuen 1a irudia), bi mikrokanal paralelo zuzen elkartuz osatua, hesteetakoak konplexu bihurtu dira (Datu Hedatuen 1b irudia), eta horrek mikrokanal kurbatu pare bat barne hartzen ditu fluidoen egoitza-denbora handitzeko, fluxu-eredu ez-linealak eta zelula landuen deformazio multiaxiala eragiteko (2a-f irudia)12. Hesteetako biomekanika konplexuagoa birsortu behar denean, hesteetakoak konplexuak aukeratu daitezke. Frogatu dugu Hesteetako Txip Korapilatsuak 3D morfogenesia ere indarrez eragiten duela denbora-tarte berean, jatorrizkoarekin alderatuta epitelio-hazkunde maila antzekoarekin. Heste-Txipa, landutako zelula mota edozein dela ere. Beraz, 3D morfogenesia eragiteko, txipeko heste-diseinu linealak eta konplexuak trukagarriak dira. SU-8 ereduekin silikonazko moldeetan sendatutako PDMS erreplikek ezaugarri negatiboak eman zituzten desmoldeatu ondoren (2a irudia). Txip batean hestea fabrikatzeko, prestatutako goiko PDMS geruza sekuentzialki PDMS film porotsu bati lotu zitzaion eta gero beheko PDMS geruzarekin lerrokatu zen korona tratatzaile bat erabiliz lotura itzulezin baten bidez (2b-f irudiak). Txip hibridoak fabrikatzeko, sendatutako PDMS erreplikak beirazko laminetan lotu ziren Transwell txertaketak onartu zitzaketen kanal bakarreko mikrofluidiko gailu sortzeko (2h irudia eta Datu Hedatuen 2. irudia). Lotura-prozesua PDMS erreplikaren eta beiraren gainazalak oxigeno plasmarekin edo korona tratamenduarekin tratatuz egiten da. Silikonazko hodiari lotutako mikrofabrikatutako gailuaren esterilizazioa egin ondoren, gailuaren konfigurazioa prest zegoen heste-epitelioaren 3D morfogenesia egiteko (2g irudia).
a, SU-8 eredudun silikonazko moldeetatik PDMS piezen prestaketaren eskema-ilustrazioa. Sendotu gabeko PDMS disoluzioa silikonazko molde batean isuri zen (ezkerrean), 60 °C-tan sendotu zen (erdian) eta desmoldatu zen (eskuinean). Desmoldatutako PDMS zatitan moztu eta gero erabiltzeko garbitu zen.b, PDMS goiko geruza prestatzeko erabilitako silikonazko moldearen argazkia.c, PDMS mintz porotsua fabrikatzeko erabilitako silikonazko moldearen argazkia.d, Goiko eta beheko PDMS osagaien eta txipean muntatutako heste-gailuaren argazki-serie bat.e, Goiko, mintzeko eta beheko PDMS osagaien lerrokaduraren eskema.Geruza bakoitza plasma edo korona tratamendu bidez lotzen da modu itzulezinean.f, Txip batean fabrikatutako heste-gailuaren eskema, gainjarritako mikrokanal bihurgunetsu eta huts-ganberekin.g, Zelula mikrofluidikoen hazkuntzarako heste-txiparen konfigurazioa. Silikonazko hodi eta xiringa batekin muntatutako txipean fabrikatutako hestea estalki batean jarri zen.Txipa gailua jarri zen... 150 mm-ko Petri plaka baten estalkian prozesatzeko. Lotzailea silikonazko hodia ixteko erabiltzen da.h, Txip hibridoen fabrikazioaren eta 3D morfogenesiaren argazki bisualak txip hibridoak erabiliz. Hesteetako epitelio-zelulen 2D monogeruzak hazteko modu independentean prestatutako Transwell txertaketak txip hibridoan sartu ziren hesteetako 3D morfogenesia eragiteko. Ingurunea Transwell txertaketan ezarritako zelula-geruzaren azpiko mikrokanalen bidez perfusatzen da. Eskala-barra, 1 cm.h Erreferentziaren baimenarekin berrargitaratua.4. Elsevier.
Protokolo honetan, Caco-2 zelula-lerroa eta hesteetako organoideak erabili ziren epitelio-iturri gisa (3a irudia). Bi zelula motak modu independentean landu ziren (2. eta 5. koadroa) eta txipean dauden hesteetako edo Transwell txertatutako ECMz estalitako mikrokanalak ereiteko erabili ziren. Zelulak konfluenteak direnean (matrazeetan % 95eko estaldura baino handiagoa), T-matrazeetan landutako Caco-2 zelulak (10. eta 50. pasarteen artean) biltzen dira tripsinizazio-fluidoaren bidez zelula-esesekidura disoziatuak prestatzeko (2. koadroa). Hesteetako biopsietatik edo ebakuntza-erreskzioetatik eratorritako giza hesteetako organoideak Matrigel eskafolda-kupuletan landu ziren 24 putzuko plaketan, mikroingurune estrukturala laguntzeko. Morfogeno esentzialak (Wnt, R-spondina eta Noggin bezalakoak) eta 3. koadroan deskribatutako moduan prestatutako hazkuntza-faktoreak zituen medioa bi egunetik behin osatu zen organoideak ~500 µm-ko diametrora iritsi arte. Hazitako organoideak biltzen eta zelula bakarretan disoziatzen dira ereiteko. hesteetako edo Transwell txertaketak txip batean (5. koadroa). Aurretik jakinarazi dugun bezala, gaixotasun motaren arabera bereiz daiteke12,13 (adibidez, kolitis ultzeragarria, Crohn-en gaixotasuna, koloneko eta ondesteko minbizia edo emaile normala), lesioaren kokapenaren arabera (adibidez, lesioa vs. lesiorik gabeko eremua) eta digestio-aparatuaren kokapenaren arabera (adibidez, duodenoa, jejunoa, ileona, zekua, kolona edo ondestea). 5. koadroan protokolo optimizatu bat eskaintzen dugu heste meharreko organoideek baino morfogeno kontzentrazio handiagoak behar dituzten koloneko organoideak (koloideak) hazteko.
a, Heste-morfogenesia txipean induzitzeko lan-fluxua. Caco-2 gizakien heste-epitelioa eta heste-organoideak erabiltzen dira protokolo honetan 3D morfogenesia frogatzeko. Zelula epitelialak prestatutako gut-on-a-chip gailuan erein ziren (txiparen prestaketa). Zelulak erein (ereinarazi) eta PDMS mintz porotsuari atxiki (eranskin) ondoren 0 egunean (D0), fluxu apikala (AP) hasten da eta mantentzen da lehen 2 egunetan (fluxua, AP, D0-D2). Basolateral (BL) fluxua ere hasten da luzatze-mugimendu ziklikoekin batera (luzatzea, fluxua, AP eta BL) 2D monokapa oso bat sortzen denean. Heste-3D morfogenesia espontaneoki gertatu zen mikrofluidoen kulturaren 5 eguneko ondoren (morfogenesia, D5). Fase-kontraste irudiek Caco-2 zelulen morfologia adierazgarria erakusten dute urrats edo denbora-puntu esperimental bakoitzean (barra-grafikoa, 100 µm). Heste-morfogenesiaren kaskada dagokien lau diagrama eskematiko (goian eskuinean). Gezi etenak Eskematikoki fluidoaren fluxuaren norabidea adierazten da.b, ezarritako 3D Caco-2 epitelioaren gainazaleko topologia erakusten duen SEM irudia (ezkerrean). Handitutako eremua nabarmentzen duen txertatuak (kutxa zuri etenduna) 3D Caco-2 geruzan birsortutako mikrobiloak erakusten ditu (eskuinean).c, ezarritako Caco-2 3Dren aurrealdeko ikuspegi horizontala, klaudina (ZO-1, gorria) eta F-aktina (berdea) eta nukleoak (urdina) markatutako eskuila-ertzeko mintz jarraituak hesteetako txipetan epitelio-zelulen immunofluoreszentzia konfokal bidezko bistaratze-prozesua.Erdiko eskematikorantz doazen geziek plano fokalaren kokapena adierazten dute ikuspegi konfokal bakoitzerako.d, txip batean landutako organoideen aldaketa morfologikoen denbora-ibilbidea, fase-kontraste mikroskopia bidez lortua 3, 7, 9, 11 eta 13 egunetan.Txertatuak (goian eskuinean) emandako irudiaren handitze handia erakusten du.e, hesteetan ezarritako 3D organoide epitelioaren DIC fotomikrografia, 7. egunean hartutako xerran.f, Gainjarria Immunofluoreszentzia irudiak, heste-txipetan 3 egunez hazitako zelula amen (LGR5; magenta), zelula kalikoen (MUC2; berdea), F-aktinaren (grisa) eta nukleoen (ziana) markatzaileak erakusten dituztenak, hurrenez hurren (ezkerrean) eta epitelio-geruzan 13 eguneko organoideen (erdian). Ikusi baita ere Datu Hedatuen 3. irudia, non LGR5 seinaleztapena nabarmentzen den MUC2 seinaleztapenik gabe. Fluoreszentzia irudiak, hesteetan txip batean ezarritako 3D organoide epitelioaren mikroegitura epitelialaren (eskuinean), plasma-mintza CellMask koloratzailearekin tindatuz (eskuinean), kulturaren 13. egunean. Eskala-barra 50 μm-koa da, bestelakorik adierazi ezean. b Erreferentziaren baimenarekin berrargitaratua. 2. Oxford University Press; c Erreferentziaren baimenarekin egokitua. 2. Oxford University Press; e eta f erreferentziaren baimenarekin egokituak. 12 Creative Commons CC BY 4.0 lizentziapean.
Txip batean dagoen hesteetan, PDMS mintz porotsuaren gainazal hidrofoboa aldatu behar da ECM estaldura arrakastatsua lortzeko. Protokolo honetan, bi metodo desberdin aplikatzen ditugu PDMS mintzen hidrofobikotasuna aldatzeko. Caco-2 zelulak hazteko, UV/ozono tratamenduaren bidezko gainazalaren aktibazioa nahikoa izan zen PDMS gainazalaren hidrofobikotasuna murrizteko, ECM estaltzeko eta Caco-2 zelulak PDMS mintzari lotzeko. Hala ere, organoide epitelioaren mikrofluidoen kulturak gainazalaren funtzionalizazio kimikoa behar du ECM proteinen metaketa eraginkorra lortzeko, polietilenimina (PEI) eta glutaraldehidoa sekuentzialki aplikatuz PDMS mikrokanaletan. Gainazalaren aldaketaren ondoren, ECM proteinak metatu ziren funtzionalizatutako PDMS gainazala estaltzeko eta gero isolatutako organoide epitelioan sartu ziren. Zelulak erantsi ondoren, zelula mikrofluidikoen kulturak ingurunea bakarrik goiko mikrokanalean perfusatzen hasten da, zelulek geruza bakar bat osatu arte, beheko mikrokanalak baldintza estatikoak mantentzen dituen bitartean. Gainazalaren aktibaziorako eta ECM estaldurarako metodo optimizatu honek organoideen atxikimendua ahalbidetzen du. epitelioa PDMS gainazalean 3D morfogenesia eragiteko.
Transwell kulturek ECM estaldura behar dute zelulak erein aurretik; hala ere, Transwell kulturek ez dute aurretratamendu urrats konplexurik behar txertatze porotsuen gainazala aktibatzeko. Caco-2 zelulak Transwell txertatzeetan hazteko, txertatze porotsuetan ECM estaldurak disoziatutako Caco-2 zelulen atxikimendua (<1 ordu) eta lotura estuen hesiaren eraketa (<1-2 egun) bizkortzen ditu. Transwell txertatzeetan organoideak hazteko, organoide isolatuak ECMz estalitako txertatzeetan ereiten dira, mintzaren gainazalera itsasten dira (<3 ordu) eta mantentzen dira organoideek hesiaren osotasuna duen monokapa oso bat osatu arte. Transwell kulturek 24 putzuko plaketan egiten dira, txip hibridoak erabili gabe.
In vitro 3D morfogenesia has daiteke fluido-fluxua epitelio-geruza finkatu baten alde basolateralean aplikatuz. Txip bateko hesteetan, epitelio-morfogenesia medioa goiko eta beheko mikrokanaletan perfusatu zenean hasi zen (3a irudia). Aurretik deskribatu bezala, ezinbestekoa da fluido-fluxua beheko (basolateral) konpartimentuan sartzea, norabidean jariatutako morfogeno-inhibitzaileen etengabeko kentzea lortzeko. Mintz porotsuetan lotutako zelulei mantenugai eta serum nahikoa emateko eta luminalaren zizailadura-tentsioa sortzeko, normalean fluxu bikoitza aplikatzen dugu hesteetan txip batean. Txip hibridoetan, epitelio-monogeruzak dituzten Transwell txertaketak txertatu ziren txip hibridoetan. Ondoren, medioa Transwell txertatze porotsuaren alde basolateralaren azpian aplikatu zen mikrokanalaren bidez. Heste-morfogenesia bi hazkuntza-plataformetan basolateral fluxua hasi eta 3-5 egunera gertatu zen.
Mikroingeniaritzako 3D epitelio geruzen ezaugarri morfologikoak hainbat irudi modalitate aplikatuz azter daitezke, besteak beste, fase kontraste mikroskopia, interferentzia diferentzial kontraste (DIC) mikroskopia, SEM edo immunofluoreszentzia konfokal mikroskopia (3. eta 4. irudiak). Fase kontraste edo DIC irudigintza erraz egin daiteke edozein unetan kulturan zehar 3D epitelio geruzen forma eta irtengunea kontrolatzeko. PDMS eta poliester filmen gardentasun optikoa dela eta, bai txip-bateko bai txip hibrido plataformek denbora errealeko in situ irudigintza eman dezakete, gailua sekzionatu edo desmuntatu beharrik gabe. Immunofluoreszentzia irudigintza egiterakoan (1., 3c, f eta 4b, c irudiak), zelulak normalean % 4ko (pisu/bolumen) paraformaldehidoarekin (PFA) finkatzen dira, ondoren Triton X-100 eta % 2ko (pisu/bolumen) behi serum albumina (BSA) erabiliz, ordena horretan. Zelula motaren arabera, finkatzaile, iragazgaizle eta blokeatzaile desberdinak erabil daitezke. Lehen mailakoak Leinuaren araberako zelula edo eskualde markatzaileak helburu dituzten antigorputzak erabiltzen dira txipan in situ immobilizatutako zelulak nabarmentzeko, eta ondoren bigarren mailako antigorputzak erabiltzen dira, nukleoari (adibidez, 4′,6-diamidino-2-fenileno) indola, DAPI) edo F-aktinari (adibidez, fluoreszenteki markatutako faloidina) zuzendutako kontra-koloratzaile batekin batera. Fluoreszentzian oinarritutako zuzeneko irudiak in situ ere egin daitezke mukiaren ekoizpena detektatzeko (1. irudia, "Zelulen bereizketa" eta "Hesteen fisiologia"), zelula mikrobianoen ausazko kolonizazioa (1. irudia, "Ostalariaren eta mikrobioaren arteko ko-kultura"), zelula immunologikoen errekrutatzea (1. irudia, 'Gaixotasunen modelatzea') edo 3D epitelio morfologiaren konturoak detektatzeko (3c, f eta 4b, c irudiak). Txipean hestea aldatzean goiko geruza beheko mikrokanal geruzatik bereizteko, erreferentzian deskribatzen den bezala. 2. irudian erakusten den bezala, 3D epitelio morfologia eta apikal eskuila ertzeko mikrobiloak SEM bidez ikus daitezke (1. irudia...). 3b). Bereizketa-markatzaileen adierazpena PCR5 kuantitatiboa edo zelula bakarreko RNA sekuentziazioa eginez ebaluatu daiteke. Kasu honetan, heste-txipetan edo txip hibridoetan hazitako zelula epitelialen 3D geruzak tripsinizazio bidez biltzen dira eta ondoren analisi molekular edo genetikoetarako erabiltzen dira.
a, Txip hibrido batean hesteetako morfogenesia eragiteko lan-fluxua. Caco-2 eta hesteetako organoideak erabiltzen dira protokolo honetan 3D morfogenesia frogatzeko txip hibrido plataforma batean. Zelula epitelialak prestatutako Transwell txertaketetan erein ziren (TW prestaketa; ikus beheko irudia). Zelulak erein (ereindu) eta Transwell txertaketetan poliesterrezko mintzei lotu ondoren, zelula guztiak baldintza estatikoetan landu ziren (TW kultura). 7 egun igaro ondoren, zelula epitelialen 2D monokapa bat zuen Transwell txertaketa bakarra txip hibrido batean integratu zen basolateral fluxu bat sartzeko (Flow, BL), eta horrek azkenean 3D epitelio geruza bat sortzea ekarri zuen (morfogenesia). Fase-kontraste mikrografiak, emaile normaleko (C103 lerroa) kolon goranzkotik eratorritako giza organoen epitelio zelulen ezaugarri morfologikoak erakusten dituztenak urrats edo denbora-puntu esperimental bakoitzean. Goiko geruzen eskemek urrats bakoitzerako konfigurazio esperimentala ilustratzen dute. b, Txip hibridoek (ezkerreko eskema) organoide epitelio zelulen 3D morfogenesia ekar dezakete goitik beherako mikroskopia konfokaleko ikuspegiekin. Z posizio desberdinetan hartuak (goian, erdian eta behean; ikusi eskuineko eskema eta dagokien puntu-lerroak). Ezaugarri morfologiko nabariak erakutsi zituzten. F-aktina (ziana), nukleoa (grisa). c, Transwell estatikoan (TW; txertatua laukitxo zuri etenaren barruan) hazitako organoideetatik eratorritako zelula epitelialen fluoreszentzia-mikrografia konfokalak (3D angeluko ​​ikuspegia) txip hibridoaren aurka (plano oso handiena), 2D eta 3D morfologia alderatuz, hurrenez hurren. 2Dko zeharkako ikuspegi bertikal pare batek (goiko eskuineko izkinan txertatua; "XZ") 2D eta 3D ezaugarriak ere erakusten dituzte. Eskala-barra, 100 µm. c Erreferentziaren baimenarekin berrargitaratua. 4. Elsevier.
Kontrolak zelula berdinak (Caco-2 edo hesteetako organoide epitelio-zelulak) bi dimentsioko monokapetan landuz prestatu daitezke, ohiko hazkuntza-baldintza estatikoetan. Azpimarratzekoa da mantenugaien agortzea gerta daitekeela mikrokanalen bolumen-ahalmen mugatuagatik (hau da, ~4 µL goiko kanalean jatorrizko heste-txiparen diseinuan). Beraz, epitelioaren morfologia basolateral fluxua aplikatu aurretik eta ondoren ere alderatu daiteke.
Litografia biguna prozesua gela garbi batean egin behar da. Txipeko geruza bakoitzerako (goiko eta beheko geruzak eta mintzak) eta txip hibridoetarako, fotomaskara desberdinak erabili eta siliziozko oblea bereizietan fabrikatu ziren, mikrokanalen altuerak desberdinak zirelako. Txipeko hesteetako goiko eta beheko mikrokanalen helburu-altuerak 500 µm eta 200 µm dira, hurrenez hurren. Txip hibridoaren kanalaren helburu-altuera 200 µm da.
Jarri 3 hazbeteko siliziozko oblea bat azetona duen ontzi batean. Nahastu plaka astiro 30 segundoz, eta gero lehortu oblea airean. Transferitu oblea IPA duen plaka batera, eta gero biratu plaka 30 segundoz garbitzeko.
Siliziozko oblearen gainazaleko hondakin organikoak ahalik eta gehien kentzeko, piraña disoluzio bat (hidrogeno peroxidoaren eta azido sulfuriko kontzentratuaren nahasketa, 1:3 (bol/bol)) erabil daiteke aukeran.
Piranha disoluzioa oso korrosiboa da eta beroa sortzen du. Segurtasun neurri gehigarriak beharrezkoak dira. Hondakinak botatzeko, utzi disoluzioa hozten eta eraman hondakin-ontzi garbi eta lehor batera. Erabili bigarren mailako ontziak eta etiketatu hondakin-ontziak behar bezala. Jarraitu instalazioaren segurtasun-jarraibideak prozedura zehatzagoak lortzeko.
Deshidratatu obleak 200 °C-ko plaka bero batean 10 minutuz jarriz. Deshidratatu ondoren, oblea bost aldiz astindu zen airean hozteko.
Bota ~10 g SU-8 2100 fotoerresistente garbituaren erdian. Erabili pintzak fotoerresistentea oblean uniformeki zabaltzeko. Noizean behin jarri oblea 65 °C-ko plaka bero batean, fotoerresistentea itsaskorragoa izan dadin eta errazago zabaltzeko. Ez jarri oblea zuzenean plaka beroan.
SU-8 oblean uniformeki banatu zen biraketa-estalduraren bidez. Programatu SU-8aren sarrerako biraketa 5-10 segundoz 500 bira/min-tan hedatzeko 100 bira/min/s-ko azelerazioarekin. Ezarri biraketa nagusia 200 µm-ko lodierako patroirako 1.500 bira/min-tan, edo lortu 250 µm-ko lodiera (txiparen hestearen goiko geruzarentzat 500 µm-ko altuera eginez; ikus beheko "Urrats kritikoak") 300 bira/min/s 30 segundoko azelerazioan ezarrita 1.200 bira/min-tan.
Biraketa-abiadura nagusia siliziozko oblearen SU-8 ereduaren lodieraren arabera doi daiteke.
Txipeko hestearen goiko geruzarako 500 µm-ko altuerako SU-8 ereduak fabrikatzeko, kutxa honetako spin coating eta soft bake urratsak (7. eta 8. urratsak) sekuentzialki errepikatu ziren (ikus 9. urratsa) 250 µm-ko lodierako SU-8 geruza bi sortzeko, kutxa honetako 12. urratsean UV esposizioaren bidez geruzatu eta lotu daitezkeenak, 500 µm-ko altuerako geruza bat osatuz.
SU-8z estalitako obleak labean berotu arretaz plaka bero batean 65 °C-tan 5 minutuz, eta gero aldatu ezarpena 95 °C-ra eta inkubatu beste 40 minutuz.
Goiko mikrokanalean SU-8 ereduaren 500 μm-ko altuera lortzeko, errepikatu 7. eta 8. urratsak 250 μm-ko lodierako bi SU-8 geruza sortzeko.
UV Mask Aligner erabiliz, egin lanpara-proba fabrikatzailearen argibideen arabera oblearen esposizio-denbora kalkulatzeko. (esposizio-denbora, ms) = (esposizio-dosia, mJ/cm2)/(lanpararen potentzia, mW/cm2).
Esposizio-denbora zehaztu ondoren, jarri fotomaskara UV maskara lerrokatzailearen maskara-euskarrian eta jarri fotomaskara SU-8 estalitako oblearen gainean.
Jarri fotomaskaren gainazal inprimatua zuzenean siliziozko oblearen SU-8 estalitako aldean, UV sakabanaketa minimizatzeko.
Jarri SU-8 estalitako oblea eta fotomaskara bertikalki 260 mJ/cm2 UV argiaren eraginpean aurrez zehaztutako esposizio-denboran (ikus koadro honetako 10. urratsa).
UV izpien eraginpean egon ondoren, SU-8z estalitako siliziozko obleak labean sartu ziren 65 °C-tan 5 minutuz eta 95 °C-tan 15 minutuz plaka bero bakoitzean, 200 μm-ko altuerako ereduak fabrikatzeko. Luzatu labean egosi osteko denbora 95 °C-tan 30 minutura 500 µm-ko altuerako ereduak fabrikatzeko.
Garatzailea beirazko ontzi batean isurtzen da, eta labean egindako oblea ontzian jartzen da. SU-8 garatzailearen bolumena alda daiteke beirazko plakaren tamainaren arabera. Ziurtatu SU-8 garatzaile nahikoa erabiltzen duzula esposiziorik gabeko SU-8 guztiz kentzeko. Adibidez, 150 mm-ko diametroko eta 1 L-ko edukiera duen beirazko ontzi bat erabiltzean, erabili ~300 ml SU-8 garatzaile. Garatu moldea 25 minutuz noizean behin biratuz.
Garbitu garatutako moldea ~10 mL garatzaile freskoarekin, eta ondoren IPA gehitu disoluzioa pipeta bat erabiliz ihinztatuz.
Jarri oblea plasma garbigailu batean eta jarri oxigeno plasmaren eraginpean (gas atmosferikoa, 1 × 10−5 Torr-eko presioa, 125 W-ko potentzia) 1,5 minutuz.
Jarri oblea hutsean lehortzeko gailu batean, beirazko laminarekin barruan. Obleak eta laminak bata bestearen ondoan jar daitezke. Hutsean lehortzeko gailua hainbat geruzatan banatuta badago plaka batek, jarri laminak beheko ganberan eta obleak goiko ganberan. Bota 100 μL trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silano disoluzio beirazko laminaren gainean eta aplikatu hutsunea silanizaziorako.
Desizoztu Caco-2 zelula izoztuen fiala 37 °C-ko ur-bainu batean, eta ondoren, desizoztutako zelulak T75 matraze batera eraman, 15 mL 37 °C-tan aurrez berotutako Caco-2 medioarekin.
Caco-2 zelulak ~% 90eko konfluentzian pasatzeko, lehenik berotu Caco-2 medioa, PBS eta % 0,25eko tripsina/1 mM EDTA 37 °C-ko ur-bainu batean.
Aspiratu medioa hutsean aspiratuz. Garbitu zelulak bi aldiz 5 ml PBS epelarekin, hutsean aspirazioa errepikatuz eta PBS freskoa gehituz.