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La morfogénesis del intestino humano establece las características de cripta-vellosidad de la microarquitectura epitelial 3D y la organización espacial. Esta estructura única es necesaria para mantener la homeostasis intestinal al proteger el nicho de células madre en la cripta basal de los antígenos microbianos exógenos y sus metabolitos. Además, las vellosidades intestinales y el moco secretor presentan células epiteliales funcionalmente diferenciadas con una barrera protectora en la superficie de la mucosa intestinal. Por lo tanto, recrear estructuras epiteliales 3D es crucial para la construcción de modelos intestinales in vitro. Cabe destacar que el intestino orgánico mimético en un chip puede inducir la morfogénesis 3D espontánea del epitelio intestinal con funciones fisiológicas y biomecánicas mejoradas. Aquí, proporcionamos un protocolo reproducible para inducir de manera robusta la morfogénesis intestinal en el intestino en un chip microfluídico, así como en un chip híbrido integrado en Transwell. Describimos métodos detallados para la fabricación del dispositivo, el cultivo de células epiteliales Caco-2 u organoides intestinales en entornos convencionales, así como en una plataforma microfluídica, la inducción de Morfogénesis 3D y caracterización de epitelios 3D establecidos mediante múltiples modalidades de imagen. Este protocolo logra la regeneración de la microarquitectura intestinal funcional controlando el flujo de fluido basolateral durante 5 días. Nuestro método de morfogénesis in vitro emplea tensión de cizallamiento y movimiento mecánico fisiológicamente relevantes y no requiere ingeniería celular compleja ni manipulación, lo que podría superar a otras técnicas existentes. Prevemos que nuestro protocolo propuesto podría tener amplias implicaciones para la comunidad de investigación biomédica, proporcionando un método para regenerar capas epiteliales intestinales 3D in vitro para aplicaciones biomédicas, clínicas y farmacéuticas.
Los experimentos demuestran que las células epiteliales intestinales Caco-2 cultivadas en dispositivos microfluídicos de intestino en un chip1,2,3,4,5 o de doble capa6,7 pueden experimentar morfogénesis 3D espontánea in vitro sin una comprensión clara del mecanismo subyacente. En nuestro estudio reciente, encontramos que la eliminación de los antagonistas morfógenos secretados basolateralmente de los dispositivos de cultivo es necesaria y suficiente para inducir la morfogénesis epitelial 3D in vitro, lo cual ha sido demostrado por organoides intestinales derivados de Caco-2 y de pacientes. Se validaron las células epiteliales. En este estudio, nos centramos específicamente en la producción celular y la distribución de la concentración de un potente antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), en intestino en un chip y dispositivos microfluídicos modificados que contienen insertos Transwell, denominados "chip híbrido". Demostramos que la adición de antagonistas de Wnt exógenos (como DKK-1, represor de Wnt 1, proteína 1 relacionada con Frizzled secretada o Soggy-1) al intestino en el chip inhibe la morfogénesis o altera la capa epitelial 3D preestructurada, lo que sugiere que el estrés antagónico durante el cultivo es responsable de la morfogénesis intestinal in vitro. Por lo tanto, un enfoque práctico para lograr una morfogénesis robusta en la interfaz epitelial es eliminar o mantener mínimamente los niveles de antagonistas de Wnt en el compartimento basolateral mediante lavado activo (por ejemplo, en plataformas de intestino en un chip o híbrido en un chip) o difusión. Medio basolateral (por ejemplo, de insertos Transwell a grandes depósitos basolaterales en pozos).
En este protocolo, proporcionamos un método detallado para fabricar microdispositivos de intestino en un chip y chips híbridos insertables en Transwell (pasos 1-5) para cultivar células epiteliales intestinales en membranas porosas a base de polidimetilsiloxano (PDMS) (pasos 6A, 7A, 8, 9) o membranas de poliéster de insertos Transwell (pasos 6B, 7B, 8, 9) e inducimos morfogénesis 3D in vitro (paso 10). También identificamos características celulares y moleculares indicativas de histogénesis específica de tejido y diferenciación celular dependiente del linaje mediante la aplicación de múltiples modalidades de imagen (pasos 11-24). Inducimos la morfogénesis utilizando células epiteliales intestinales humanas, como Caco-2 u organoides intestinales, en dos formatos de cultivo con detalles técnicos que incluyen la modificación de la superficie de las membranas porosas, la creación de monocapas 2D y la reproducción del microambiente bioquímico y biomecánico intestinal in vitro. Morfogénesis 3D a partir de monocapas epiteliales 2D, eliminamos los antagonistas de morfógenos en ambas formas cultivadas haciendo fluir el medio hacia el compartimento basolateral del cultivo. Finalmente, proporcionamos una representación de la utilidad de una capa epitelial 3D regenerable que puede usarse para modelar el crecimiento epitelial dependiente de morfógenos, cocultivos longitudinales huésped-microbioma, infección por patógenos, lesión inflamatoria, disfunción de la barrera epitelial y terapias basadas en probióticos. Ejemplo.influencias.
Nuestro protocolo puede ser útil para una amplia gama de científicos en investigación básica (por ejemplo, biología de la mucosa intestinal, biología de células madre y biología del desarrollo) y aplicada (por ejemplo, pruebas preclínicas de fármacos, modelado de enfermedades, ingeniería de tejidos y gastroenterología) de amplio impacto. Debido a la reproducibilidad y robustez de nuestro protocolo para inducir la morfogénesis 3D del epitelio intestinal in vitro, prevemos que nuestra estrategia técnica puede ser difundida a audiencias que estudian la dinámica de la señalización celular durante el desarrollo, la regeneración o la homeostasis intestinal. Además, nuestro protocolo es útil para investigar la infección bajo varios agentes infecciosos como el norovirus 8, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae. Las audiencias de patología y patogénesis de enfermedades también son útiles. El uso de un sistema de microfisiología intestinal en un chip puede permitir el cocultivo longitudinal 10 y la evaluación posterior de la defensa del huésped, las respuestas inmunes y la reparación de lesiones relacionadas con patógenos en el tracto gastrointestinal (GI) 11. Otros trastornos GI asociados con el síndrome del intestino permeable, la enfermedad celíaca, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la pouchitis o el síndrome del intestino irritable pueden simularse cuando se preparan capas epiteliales intestinales 3D utilizando las capas epiteliales intestinales 3D del paciente, estas enfermedades incluyen atrofia vellosa, acortamiento de criptas, daño de la mucosa o barrera epitelial deteriorada. Organoides intestinales derivados de biopsia o células madre12,13. Para modelar mejor la mayor complejidad del entorno de la enfermedad, los lectores pueden considerar agregar tipos de células relevantes para la enfermedad, como células mononucleares de sangre periférica del paciente (PBMC), a modelos que contengan microarquitecturas de vellosidades y criptas intestinales 3D. células inmunes específicas del tejido, 5.
Dado que la microestructura epitelial 3D se puede fijar y visualizar sin el proceso de seccionamiento, los observadores que trabajan en transcriptómica espacial e imágenes de alta resolución o superresolución pueden estar interesados ​​en nuestro mapeo de la dinámica espaciotemporal de genes y proteínas en nichos epiteliales. Interesado en la tecnología. Respuesta a estímulos microbianos o inmunitarios. Además, la comunicación cruzada longitudinal huésped-microbioma 10, 14 que coordina la homeostasis intestinal se puede establecer en la capa mucosa intestinal 3D mediante el cocultivo de varias especies microbianas, comunidades microbianas o microbiota fecal, especialmente en el intestino en un chip. en la plataforma. Este enfoque es particularmente atractivo para audiencias que estudian inmunología de las mucosas, gastroenterología, microbioma humano, culturomics y microbiología clínica que buscan cultivar microbiota intestinal previamente no cultivada en el laboratorio. Si nuestro protocolo de morfogénesis in vitro se puede adaptar a formatos de cultivo escalables, como insertos de múltiples pocillos en placas de 24, 96 o 384 pocillos que reabastecen continuamente los compartimentos basolaterales, el protocolo también se puede difundir a aquellos que desarrollan plataformas farmacéuticas, biomédicas o de cribado o validación de alto rendimiento para la industria alimentaria. Como prueba de concepto, recientemente demostramos la viabilidad de un sistema de morfogénesis multiplex de alto rendimiento escalable a un formato de placa de 24 pocillos. Además, se han comercializado múltiples productos de órganos en un chip16,17,18. Por lo tanto, la validación de nuestro método de morfogénesis in vitro se puede acelerar y potencialmente adoptar por muchos laboratorios de investigación, industria o agencias gubernamentales y reguladoras para comprender la reprogramación celular de la microbiota intestinal in vitro. morfogénesis a nivel transcriptómico para probar fármacos o bioterapéuticos. La absorción y el transporte de los fármacos candidatos se evaluaron utilizando sustitutos intestinales en 3D o utilizando modelos de órganos en un chip personalizados o comerciales para evaluar la reproducibilidad del proceso de morfogénesis intestinal.
Se ha utilizado un número limitado de modelos experimentales relevantes para humanos para estudiar la morfogénesis del epitelio intestinal, principalmente debido a la falta de protocolos implementables para inducir la morfogénesis 3D in vitro. De hecho, gran parte del conocimiento actual sobre la morfogénesis intestinal se basa en estudios con animales (por ejemplo, pez cebra20, ratones21 o pollos22). Sin embargo, son laboriosos y costosos, pueden ser éticamente cuestionables y, lo que es más importante, no determinan con precisión los procesos de desarrollo humano. Estos modelos también son muy limitados en su capacidad de ser probados de manera escalable en múltiples direcciones. Por lo tanto, nuestro protocolo para regenerar estructuras de tejido 3D in vitro supera a los modelos animales in vivo, así como a otros modelos tradicionales de cultivo celular estático 2D. Como se describió anteriormente, la utilización de estructuras epiteliales 3D nos permitió examinar la localización espacial de células diferenciadas en el eje cripta-vellosidad en respuesta a varios estímulos mucosos o inmunitarios. Las capas epiteliales 3D pueden proporcionar un espacio para estudiar cómo las células microbianas compiten para formar nichos espaciales. y la evolución ecológica en respuesta a factores del huésped (por ejemplo, capas de moco internas frente a externas, secreción de IgA y péptidos antimicrobianos). Además, la morfología epitelial 3D nos permite comprender cómo la microbiota intestinal estructura sus comunidades y produce sinérgicamente metabolitos microbianos (por ejemplo, ácidos grasos de cadena corta) que dan forma a la organización celular y a los nichos de células madre en las criptas basales. Estas características solo se pueden demostrar cuando se establecen capas epiteliales 3D in vitro.
Además de nuestro método de creación de estructuras epiteliales intestinales 3D, existen varios métodos in vitro. El cultivo de organoides intestinales es una técnica de ingeniería de tejidos de vanguardia basada en el cultivo de células madre intestinales bajo condiciones morfógenas específicas23,24,25. Sin embargo, el uso de modelos de organoides 3D para análisis de transporte o cocultivos huésped-microbioma suele ser un desafío porque el lumen intestinal está encerrado dentro del organoide y, por lo tanto, la introducción de componentes luminales como células microbianas o antígenos exógenos es limitada. El acceso a los lúmenes de los organoides se puede mejorar utilizando un microinyector,26,27 pero este método es invasivo y laborioso y requiere conocimientos especializados para su realización. Además, los cultivos de organoides tradicionales mantenidos en andamios de hidrogel en condiciones estáticas no reflejan con precisión la biomecánica activa in vivo.
Otros enfoques empleados por varios grupos de investigación utilizan andamios de hidrogel 3D preestructurados para imitar la estructura epitelial intestinal mediante el cultivo de células intestinales humanas aisladas en la superficie del gel. Los andamios de hidrogel se fabrican utilizando moldes impresos en 3D, micromecanizados o fabricados litográficamente. Este método muestra la disposición autoorganizada de células epiteliales aisladas in vitro con gradientes de morfógenos fisiológicamente relevantes, estableciendo una estructura epitelial de alta relación de aspecto y comunicación cruzada estroma-epitelio al incluir células estromales en el andamio. Sin embargo, la naturaleza de los andamios preestructurados puede impedir la visualización del proceso morfogenético espontáneo en sí. Estos modelos tampoco proporcionan un flujo luminal o intersticial dinámico, careciendo del estrés de cizallamiento del fluido que las células intestinales necesitan para experimentar la morfogénesis y adquirir función fisiológica. Otro estudio reciente utilizó andamios de hidrogel en una plataforma microfluídica y modeló estructuras epiteliales intestinales utilizando técnicas de grabado láser. Los organoides intestinales de ratón siguen los patrones grabados para formar organoides. Las estructuras tubulares intestinales y el flujo de fluido intraluminal pueden reproducirse mediante un módulo microfluídico. Sin embargo, este modelo no presenta procesos morfogenéticos espontáneos ni incluye movimientos mecanobiológicos intestinales. Las técnicas de impresión 3D del mismo grupo lograron crear tubos intestinales en miniatura con procesos morfogenéticos espontáneos. A pesar de la compleja fabricación de diferentes segmentos intestinales dentro del tubo, este modelo también carece de flujo de fluido luminal y deformación mecánica. Además, la operatividad del modelo puede verse limitada, especialmente después de que se completa el proceso de bioimpresión, lo que perturba las condiciones experimentales o las interacciones célula a célula. En cambio, nuestro protocolo propuesto proporciona morfogénesis intestinal espontánea, tensión de corte fisiológicamente relevante, biomecánica que imita la motilidad intestinal, accesibilidad a compartimentos apicales y basolaterales independientes y recreación de microambientes biológicos complejos de modularidad. Por lo tanto, nuestro protocolo de morfogénesis 3D in vitro puede proporcionar un enfoque complementario para superar los desafíos de los métodos existentes.
Nuestro protocolo se centra completamente en la morfogénesis epitelial 3D, con solo células epiteliales en cultivo y sin otros tipos de células circundantes como células mesenquimales, células endoteliales y células inmunitarias. Como se describió anteriormente, el núcleo de nuestro protocolo es la inducción de la morfogénesis epitelial mediante la eliminación de los inhibidores de morfógenos secretados en el lado basolateral del medio introducido. Si bien la robusta modularidad de nuestro intestino en un chip e híbrido en un chip nos permite recrear la capa epitelial 3D ondulada, aún quedan por considerar otras complejidades biológicas como las interacciones epitelio-mesenquimales33,34, la deposición de la matriz extracelular (MEC)35 y, en nuestro modelo, las características cripta-vellosidad que transmiten nichos de células madre en las criptas basales. Las células estromales (por ejemplo, fibroblastos) en el mesénquima desempeñan un papel clave en la producción de proteínas de la MEC y la regulación de la morfogénesis intestinal. vivo35,37,38.La adición de células mesenquimales a nuestro modelo mejoró el proceso morfogenético y la eficiencia de adhesión celular.La capa endotelial (es decir, capilares o vasos linfáticos) juega un papel importante en la regulación del transporte molecular39 y el reclutamiento de células inmunes40 en el microambiente intestinal.Además, los componentes vasculares que se pueden conectar entre modelos de tejido son un requisito previo cuando los modelos de tejido se diseñan para demostrar interacciones multiorgánicas.Por lo tanto, puede ser necesario incluir células endoteliales para modelar características fisiológicas más precisas con resolución a nivel de órgano.Las células inmunes derivadas del paciente también son esenciales para mostrar respuestas inmunes innatas, presentación de antígenos, comunicación cruzada inmune adaptativa innata e inmunidad específica de tejido en el contexto de la imitación de la enfermedad intestinal.
El uso de chips híbridos es más sencillo que el de los sistemas de intestino en un chip, ya que la configuración del dispositivo es más simple y el uso de insertos Transwell permite el cultivo a gran escala del epitelio intestinal. Sin embargo, los insertos Transwell disponibles comercialmente con membranas de poliéster no son elásticos y no pueden simular movimientos peristálticos. Además, el compartimento apical del inserto Transwell colocado en el chip híbrido permaneció estacionario sin esfuerzo cortante en el lado apical. Claramente, las propiedades estáticas en el compartimento apical rara vez permiten el cocultivo bacteriano a largo plazo en chips híbridos. Si bien podemos inducir de manera robusta la morfogénesis 3D en los insertos Transwell al usar chips híbridos, la falta de biomecánica fisiológicamente relevante y flujo de fluido apical puede limitar la viabilidad de las plataformas de chips híbridos para posibles aplicaciones.
Las reconstrucciones a escala completa del eje cripta-vellosidad humana en cultivos de intestino en un chip e híbrido en un chip no se han establecido completamente. Dado que la morfogénesis comienza a partir de una monocapa epitelial, las microarquitecturas 3D no necesariamente proporcionan similitud morfológica con las criptas in vivo. Aunque caracterizamos la población de células proliferantes cerca del dominio de la cripta basal en el epitelio 3D microingenierizado, las regiones de cripta y vellosidad no estaban claramente delimitadas. Aunque los canales superiores más altos en el chip conducen a una mayor altura del epitelio microingenierizado, la altura máxima todavía está limitada a ~300–400 µm. La profundidad real de las criptas intestinales humanas en el intestino delgado y grueso es de ~135 µm y ~400 µm, respectivamente, y la altura de las vellosidades del intestino delgado es de ~600 µm41.
Desde el punto de vista de la imagen, la imagen de superresolución in situ de microarquitecturas 3D puede limitarse al intestino en un chip, ya que la distancia de trabajo requerida desde la lente del objetivo hasta la capa epitelial es del orden de unos pocos milímetros. Para superar este problema, puede ser necesario un objetivo distante. Además, hacer secciones delgadas para la preparación de muestras de imagen es un desafío debido a la alta elasticidad del PDMS. Además, dado que la microfabricación capa por capa del intestino en un chip implica una adhesión permanente entre cada capa, es extremadamente difícil abrir o quitar la capa superior para examinar la estructura superficial de la capa epitelial. Por ejemplo, mediante el uso de un microscopio electrónico de barrido (SEM).
La hidrofobicidad del PDMS ha sido un factor limitante en los estudios basados ​​en microfluídica que tratan con moléculas pequeñas hidrofóbicas, ya que el PDMS puede adsorber de forma no específica dichas moléculas hidrofóbicas. Se pueden considerar alternativas al PDMS con otros materiales poliméricos. Alternativamente, se puede considerar la modificación de la superficie del PDMS (por ejemplo, recubrimiento con materiales lipofílicos 42 o poli(etilenglicol) 43) para minimizar la adsorción de moléculas hidrofóbicas.
Finalmente, nuestro método no ha sido bien caracterizado en términos de proporcionar una plataforma experimental de cribado de alto rendimiento o "de talla única" y fácil de usar. El protocolo actual requiere una bomba de jeringa por microdispositivo, lo que ocupa espacio en una incubadora de CO2 e impide experimentos a gran escala. Esta limitación puede mejorarse significativamente mediante la escalabilidad de formatos de cultivo innovadores (por ejemplo, insertos porosos de 24, 96 o 384 pocillos que permiten la reposición y eliminación continua del medio basolateral).
Para inducir la morfogénesis 3D del epitelio intestinal humano in vitro, utilizamos un dispositivo intestinal de chip microfluídico que contiene dos microcanales paralelos y una membrana porosa elástica entre ellos para crear una interfaz lumen-capilar. También demostramos el uso de un dispositivo microfluídico de un solo canal (un chip híbrido) que proporciona un flujo basolateral continuo debajo de capas epiteliales polarizadas cultivadas en insertos Transwell. En ambas plataformas, la morfogénesis de varias células epiteliales intestinales humanas se puede demostrar aplicando manipulación direccional del flujo para eliminar antagonistas morfógenos del compartimento basolateral. El procedimiento experimental completo (Figura 1) consta de cinco partes: (i) microfabricación del chip intestinal o chip híbrido insertable Transwell (pasos 1-5; Recuadro 1), (ii) preparación de células epiteliales intestinales (células Caco-2) u organoides intestinales humanos; (Recuadros 2-5), (iii) cultivo de células epiteliales intestinales en chips intestinales o chips híbridos (pasos 6-9), (iv) inducción de morfogénesis 3D in vitro (paso 10) y (v) ) para caracterizar la microestructura epitelial 3D (pasos 11-24). Finalmente, se diseñó un grupo de control apropiado (que se analiza más adelante) para validar la eficacia de la morfogénesis in vitro comparando la morfogénesis epitelial con controles espaciales, temporales, condicionales o de procedimiento.
Utilizamos dos plataformas de cultivo diferentes: intestino en un chip con canales rectos o canales convolucionados no lineales, o chips híbridos que contienen insertos Transwell (TW) en un dispositivo microfluídico, fabricados como se describe en el Cuadro 1 y los pasos 1 a 5. "Fabricación del dispositivo" muestra los pasos principales para hacer un solo chip o un chip híbrido. "Cultivo de células epiteliales intestinales humanas" explica la fuente celular (Caco-2 u organoides intestinales humanos) y el procedimiento de cultivo utilizado en este protocolo. "Morfogénesis in vitro" muestra los pasos generales en los que las células epiteliales Caco-2 o derivadas de organoides se cultivan en un chip intestinal o en insertos Transwell de un chip híbrido, seguidos de la inducción de la morfogénesis 3D y la formación de una estructura epitelial caracterizada. El número de paso del programa o el número de cuadro se muestra debajo de cada flecha. La aplicación proporciona ejemplos de cómo se pueden utilizar las capas epiteliales intestinales establecidas, por ejemplo, en la caracterización de la diferenciación celular, estudios de fisiología intestinal, establecimiento de ecosistemas huésped-microbioma y modelado de enfermedades. Imágenes de inmunofluorescencia en “Diferenciación celular” que muestran núcleos, actina F y MUC2 expresados ​​en la capa epitelial 3D Caco-2 generada en el chip intestinal. La señalización de MUC2 está presente en las células caliciformes y el moco secretado de las superficies mucosas. Las imágenes fluorescentes en Fisiología intestinal muestran el moco producido por tinción de residuos de ácido siálico y N-acetilglucosamina utilizando aglutinina fluorescente de germen de trigo. Las dos imágenes superpuestas en “Cocultivos huésped-microbio” muestran cocultivos representativos huésped-microbioma en el intestino en un chip. El panel izquierdo muestra el cocultivo de E. coli que expresa proteína fluorescente verde (GFP) con células epiteliales 3D Caco-2 microingenierizadas. El panel derecho muestra la localización de E. coli GFP cocultivada con células epiteliales 3D Caco-2, seguida de tinción por inmunofluorescencia con actina F (rojo) y núcleos (azul). El modelado de enfermedades ilustra el intestino sano frente al intestino permeable en chips de inflamación intestinal bajo un desafío fisiológico con antígenos bacterianos (por ejemplo, lipopolisacárido, LPS) y células inmunes (por ejemplo, PBMC; verde). Las células Caco-2 se cultivaron para establecer una capa epitelial 3D. Barra de escala, 50 µm. Imágenes en la fila inferior: “Diferenciación de células” adaptado con permiso de la referencia 2. Oxford University Press; Reproducido con permiso de la referencia 5. NAS; “Cocultivo huésped-microbio” adaptado con permiso de la referencia 3. NAS; “Modelado de enfermedades” adaptado con permiso de la referencia 5. NAS.
Tanto los chips intestinales en chip como los chips híbridos se fabricaron utilizando réplicas de PDMS que se desmoldaron de moldes de silicio mediante litografía blanda1,44 y se modelaron con SU-8. El diseño de los microcanales en cada chip se determina considerando la hidrodinámica, como el esfuerzo cortante y la presión hidrodinámica1,4,12. El diseño original del chip intestinal en chip (Figura 1a de datos extendidos), que consistía en dos microcanales rectos paralelos yuxtapuestos, ha evolucionado hacia un chip intestinal en chip complejo (Figura 1b de datos extendidos) que incluye un par de microcanales curvos para inducir un mayor tiempo de residencia del fluido, patrones de flujo no lineales y deformación multiaxial de las células cultivadas (Figura 2a-f) 12. Cuando se necesita recrear una biomecánica intestinal más compleja, se pueden elegir chips intestinales en chip complejos. Hemos demostrado que el Gut-Chip convoluto también induce fuertemente la morfogénesis 3D en un marco de tiempo similar con un grado similar de crecimiento epitelial en comparación con el Gut-Chip original, independientemente del tipo de célula cultivada. Por lo tanto, para inducir la morfogénesis 3D, los diseños de intestino en chip lineales y complejos son intercambiables. Las réplicas de PDMS curadas en moldes de silicio con patrones de SU-8 proporcionaron características negativas después del desmoldeo (Fig. 2a). Para fabricar el intestino en un chip, la capa superior de PDMS preparada se unió secuencialmente a una película de PDMS porosa y luego se alineó con la capa inferior de PDMS mediante unión irreversible utilizando un tratador de corona (Fig. 2b-f). Para fabricar chips híbridos, las réplicas de PDMS curadas se unieron a portaobjetos de vidrio para crear dispositivos microfluídicos de un solo canal que pudieran albergar insertos Transwell (Fig. 2h y Fig. 2 de datos extendidos). El proceso de unión se realiza tratando las superficies de la réplica de PDMS y el vidrio con plasma de oxígeno o tratamiento de corona. Después de la esterilización del dispositivo microfabricado unido al tubo de silicona, la configuración del dispositivo estaba lista para realizar la morfogénesis 3D del epitelio intestinal (Figura 2g).
a, Ilustración esquemática de la preparación de piezas de PDMS a partir de moldes de silicio con patrón SU-8. La solución de PDMS sin curar se vertió sobre un molde de silicio (izquierda), se curó a 60 °C (centro) y se desmoldó (derecha). El PDMS desmoldado se cortó en piezas y se limpió para su posterior uso. b, Fotografía del molde de silicio utilizado para preparar la capa superior de PDMS. c, Fotografía del molde de silicio utilizado para fabricar la membrana porosa de PDMS. d, Una serie de fotografías de los componentes superior e inferior de PDMS y el dispositivo intestinal en chip ensamblado. e, Esquema de la alineación de los componentes superior, membrana e inferior de PDMS. Cada capa se une irreversiblemente mediante tratamiento de plasma o corona. f, Esquema del dispositivo intestino en un chip fabricado con microcanales convolucionados superpuestos y cámaras de vacío. g, Configuración del intestino en un chip para cultivo celular microfluídico. El intestino en un chip fabricado, ensamblado con un tubo de silicona y una jeringa, se colocó sobre un cubreobjetos. El dispositivo de chip se colocó sobre la tapa de un Placa de Petri de 150 mm para procesamiento. El aglutinante se utiliza para cerrar el tubo de silicona. h, Instantáneas visuales de la fabricación del chip híbrido y la morfogénesis 3D utilizando chips híbridos. Se insertaron insertos Transwell preparados independientemente para cultivar monocapas 2D de células epiteliales intestinales en el chip híbrido para inducir la morfogénesis 3D intestinal. El medio se perfunde a través de microcanales debajo de la capa celular establecida en el inserto Transwell. Barra de escala, 1 cm. h Reimpreso con permiso de la referencia 4. Elsevier.
En este protocolo, la línea celular Caco-2 y los organoides intestinales se utilizaron como fuentes epiteliales (Fig. 3a). Ambos tipos de células se cultivaron de forma independiente (Recuadro 2 y Recuadro 5) y se utilizaron para sembrar los microcanales recubiertos de ECM de los insertos intestinales en chip o Transwell. Cuando las células son confluentes (>95% de cobertura en los matraces), las células Caco-2 cultivadas rutinariamente (entre los pasajes 10 y 50) en matraces T se recolectan para preparar suspensiones de células disociadas mediante fluido de tripsinización (recuadro 2). Los organoides intestinales humanos de biopsias intestinales o resecciones quirúrgicas se cultivaron en domos de andamiaje de Matrigel en placas de 24 pocillos para soportar el microambiente estructural. El medio que contenía morfógenos esenciales (como Wnt, R-spondin y Noggin) y factores de crecimiento preparados como se describe en el Recuadro 3 se suplementó cada dos días hasta que los organoides crecieron a ~500 µm de diámetro. Los organoides completamente desarrollados son cosechadas y disociadas en células individuales para sembrarlas en insertos intestinales o Transwell en un chip (Recuadro 5). Como hemos informado anteriormente, se puede diferenciar según el tipo de enfermedad12,13 (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, cáncer colorrectal o donante normal), el sitio de la lesión (por ejemplo, área lesionada versus área no lesionada) y la ubicación gastrointestinal en el tracto (por ejemplo, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon o recto). Proporcionamos un protocolo optimizado en el Recuadro 5 para el cultivo de organoides colónicos (coloides) que normalmente requieren concentraciones más altas de morfógenos que los organoides del intestino delgado.
a, Flujo de trabajo para la inducción de la morfogénesis intestinal en el chip intestinal. En este protocolo se utilizan células epiteliales intestinales humanas Caco-2 y organoides intestinales para demostrar la morfogénesis 3D. Las células epiteliales aisladas se sembraron en el dispositivo intestino en un chip preparado (preparación del chip). Una vez que las células se sembraron y se adhirieron a la membrana porosa de PDMS el día 0 (D0), se inició el flujo apical (AP) y se mantuvo durante los primeros 2 días (flujo, AP, D0-D2). También se inició el flujo basolateral (BL) junto con movimientos de estiramiento cíclicos (estiramiento, flujo, AP y BL) cuando se formó una monocapa 2D completa. La morfogénesis intestinal 3D ocurrió espontáneamente después de 5 días de cultivo microfluídico (morfogénesis, D5). Las imágenes de contraste de fase muestran la morfología representativa de las células Caco-2 en cada paso experimental o punto de tiempo (gráfico de barras, 100 µm). Cuatro diagramas esquemáticos a, Ilustrando las cascadas correspondientes de morfogénesis intestinal (arriba a la derecha). Las flechas punteadas en el esquema representan la dirección del flujo de fluido. b, Imagen SEM que muestra la topología de la superficie del epitelio Caco-2 3D establecido (izquierda). El recuadro que resalta el área ampliada (recuadro blanco punteado) muestra las microvellosidades regeneradas en la capa Caco-2 3D (derecha). c, Vista frontal horizontal de Caco-2 3D establecido, claudina (ZO-1, rojo) y membranas continuas del borde en cepillo etiquetadas como actina F (verde) y núcleos (azul). Visualización confocal de inmunofluorescencia de células epiteliales en chips intestinales. Las flechas que apuntan al esquema central indican la ubicación del plano focal para cada vista confocal. d, Evolución temporal de los cambios morfológicos en organoides cultivados en un chip obtenidos mediante microscopía de contraste de fase en los días 3, 7, 9, 11 y 13. El recuadro (arriba a la derecha) muestra la alta ampliación de la imagen proporcionada. imagen.e, Fotomicrografía DIC del epitelio 3D de organoide establecido en el intestino en una sección tomada el día 7.f, Imágenes de inmunofluorescencia superpuestas que muestran marcadores para células madre (LGR5; magenta), células caliciformes (MUC2; verde), actina F (gris) y núcleos (cian) cultivados en chips intestinales durante 3 días, respectivamente (izquierda) y organoides de 13 días (centro) en la capa epitelial. Véase también la Figura 3 de datos extendidos, que destaca la señalización de LGR5 sin señalización de MUC2. Imágenes de fluorescencia que muestran la microestructura epitelial (derecha) del epitelio de organoide 3D establecido en el intestino en un chip mediante la tinción de la membrana plasmática con tinte CellMask (derecha) en el día 13 de cultivo. La barra de escala es de 50 μm a menos que se indique lo contrario.b Reimpreso con permiso de la referencia 2. Oxford University Press; c Adaptado con permiso de la referencia 2. Oxford University Press; e y f adaptadas con permiso por referencia.12 Bajo licencia Creative Commons CC BY 4.0.
En el intestino en un chip, es necesario modificar la superficie hidrofóbica de la membrana porosa de PDMS para un recubrimiento exitoso de ECM. En este protocolo, aplicamos dos métodos diferentes para modificar la hidrofobicidad de las membranas de PDMS. Para el cultivo de células Caco-2, la activación de la superficie mediante tratamiento UV/ozono fue suficiente para reducir la hidrofobicidad de la superficie de PDMS, recubrir la ECM y adherir las células Caco-2 a la membrana de PDMS. Sin embargo, el cultivo microfluídico de epitelio organoide requiere una funcionalización de la superficie basada en productos químicos para lograr una deposición eficiente de proteínas ECM mediante la aplicación secuencial de polietilenimina (PEI) y glutaraldehído a los microcanales de PDMS. Después de la modificación de la superficie, las proteínas ECM se depositaron para cubrir la superficie de PDMS funcionalizada y luego se introdujeron en el epitelio organoide aislado. Después de que las células se adhieren, el cultivo celular microfluídico comienza perfundiendo solo el medio en el microcanal superior hasta que las células formen una monocapa completa, mientras que el microcanal inferior mantiene condiciones estáticas. Este método optimizado para la activación de la superficie y el recubrimiento de ECM permite la adhesión de Epitelio organoide para inducir la morfogénesis 3D en la superficie de PDMS.
Los cultivos Transwell también requieren recubrimiento de ECM antes de la siembra celular; sin embargo, no requieren pasos de pretratamiento complejos para activar la superficie de los insertos porosos. Para cultivar células Caco-2 en insertos Transwell, el recubrimiento de ECM en los insertos porosos acelera la adhesión de las células Caco-2 disociadas (<1 hora) y la formación de la barrera de uniones estrechas (<1-2 días). Para cultivar organoides en insertos Transwell, los organoides aislados se siembran en insertos recubiertos de ECM, se adhieren a la superficie de la membrana (<3 h) y se mantienen hasta que los organoides forman una monocapa completa con integridad de barrera. Los cultivos Transwell se realizan en placas de 24 pocillos sin el uso de chips híbridos.
La morfogénesis 3D in vitro puede iniciarse aplicando flujo de fluido al aspecto basolateral de una capa epitelial establecida. En el intestino en un chip, la morfogénesis epitelial comenzó cuando el medio se perfundió en los microcanales superior e inferior (Fig. 3a). Como se describió anteriormente, es fundamental introducir flujo de fluido en el compartimento inferior (basolateral) para la eliminación continua de los inhibidores de morfógeno secretados direccionalmente. Para proporcionar suficientes nutrientes y suero a las células unidas a membranas porosas y generar tensión de cizallamiento luminal, normalmente aplicamos flujo dual en el intestino en un chip. En los chips híbridos, se insertaron insertos Transwell que contenían monocapas epiteliales en los chips híbridos. Luego, el medio se aplicó debajo del lado basolateral del inserto Transwell poroso a través del microcanal. La morfogénesis intestinal ocurrió de 3 a 5 días después del inicio del flujo basolateral en ambas plataformas de cultivo.
Las características morfológicas de las capas epiteliales 3D microingenierizadas se pueden analizar aplicando diversas modalidades de imagen, incluyendo microscopía de contraste de fase, microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), SEM o microscopía confocal de inmunofluorescencia (Figuras 3 y 4). La imagen de contraste de fase o DIC se puede realizar fácilmente en cualquier momento durante el cultivo para monitorear la forma y la protrusión de las capas epiteliales 3D. Debido a la transparencia óptica de las películas de PDMS y poliéster, tanto las plataformas de intestino en un chip como las de chips híbridos pueden proporcionar imágenes in situ en tiempo real sin necesidad de seccionar o desmontar el dispositivo. Al realizar imágenes de inmunofluorescencia (Figuras 1, 3c, f y 4b, c), las células se fijan típicamente con paraformaldehído (PFA) al 4% (p/v), seguido de Triton X-100 y albúmina de suero bovino (BSA) al 2% (p/v), en ese orden. Dependiendo del tipo de célula, se utilizan diferentes fijadores, Se pueden utilizar permeabilizadores y agentes bloqueadores. Se utilizan anticuerpos primarios dirigidos a marcadores de células o regiones dependientes del linaje para resaltar las células inmovilizadas in situ en el chip, seguidos de anticuerpos secundarios junto con un colorante de contratinción dirigido al núcleo (por ejemplo, 4′,6-diamidino-2-fenileno) indol, DAPI) o a la actina F (por ejemplo, faloidina marcada con fluorescencia). También se puede realizar una imagen en vivo basada en fluorescencia in situ para detectar la producción de moco (Fig. 1, “Diferenciación celular” y “Fisiología intestinal”), la colonización aleatoria de células microbianas (Fig. 1, “Cocultivo huésped-microbio”), el reclutamiento de células inmunes (Fig. 1, “Modelado de enfermedades”) o los contornos de la morfología epitelial 3D (Fig. 3c,f y 4b,c). Al modificar el intestino en el chip para separar la capa superior de la capa inferior de microcanales, como se describe en la referencia. Como se muestra en la Fig. 2, la morfología epitelial 3D, así como las microvellosidades en el borde en cepillo apical, se pueden visualizar mediante SEM (Fig. 3b). La expresión de marcadores de diferenciación se puede evaluar mediante PCR cuantitativa5 o secuenciación de ARN de célula única. En este caso, las capas 3D de células epiteliales cultivadas en chips intestinales o chips híbridos se cosechan mediante tripsinización y luego se utilizan para análisis molecular o genético.
a, Flujo de trabajo para la inducción de la morfogénesis intestinal en un chip híbrido. En este protocolo se utilizan células Caco-2 y organoides intestinales para demostrar la morfogénesis 3D en una plataforma de chip híbrido. Se sembraron células epiteliales disociadas en insertos Transwell preparados (preparación TW; véase la figura siguiente). Una vez sembradas las células y adheridas a las membranas de poliéster en los insertos Transwell, todas las células se cultivaron en condiciones estáticas (cultivo TW). Después de 7 días, un único inserto Transwell que contenía una monocapa 2D de células epiteliales se integró en un chip híbrido para introducir un flujo basolateral (flujo, BL), lo que finalmente condujo a la generación de una capa epitelial 3D (morfogénesis). Micrografías de contraste de fase que muestran las características morfológicas de las células epiteliales de órganos humanos derivadas del colon ascendente de un donante normal (línea C103) en cada paso o punto temporal experimental. Los esquemas de las capas superiores ilustran la configuración experimental para cada paso. b, Los chips híbridos (esquema de la izquierda) pueden conducir a la morfogénesis 3D. morfogénesis de células epiteliales organoides con vistas de microscopía confocal de arriba hacia abajo tomadas en diferentes posiciones Z (superior, media e inferior; ver esquema de la derecha y líneas punteadas correspondientes). mostraron características morfológicas obvias. Actina F (cian), núcleo (gris). c, Micrografías confocales de fluorescencia (vista angular 3D) de células epiteliales derivadas de organoides cultivadas en Transwell estático (TW; recuadro dentro del cuadro punteado blanco) versus chip híbrido (toma completa más grande) comparando la morfología 2D versus 3D, respectivamente. Un par de vistas de corte transversal vertical 2D (recuadro en la esquina superior derecha; “XZ”) también muestran características 2D y 3D. Barra de escala, 100 µm. c Reimpreso con permiso de la referencia.4. Elsevier.
Los controles pueden prepararse cultivando las mismas células (Caco-2 o células epiteliales de organoides intestinales) en monocapas bidimensionales bajo condiciones de cultivo estático convencionales. Cabe destacar que el agotamiento de nutrientes puede deberse a la capacidad de volumen limitada de los microcanales (es decir, ~4 µL en el canal superior del diseño original del chip intestinal). Por lo tanto, también se puede comparar la morfología epitelial antes y después de la aplicación del flujo basolateral.
El proceso de litografía blanda debe realizarse en una sala limpia. Para cada capa del chip (capas superior e inferior y membranas) y chips híbridos, se utilizaron fotomáscaras diferentes que se fabricaron en obleas de silicio separadas debido a que las alturas de los microcanales eran diferentes. Las alturas objetivo de los microcanales superior e inferior del chip son de 500 µm y 200 µm, respectivamente. La altura objetivo del canal del chip híbrido es de 200 µm.
Coloque una oblea de silicio de 3 pulgadas en un plato con acetona. Agite suavemente el plato durante 30 segundos y luego deje secar la oblea al aire. Transfiera la oblea a un plato con alcohol isopropílico y luego haga girar el plato durante 30 segundos para limpiarlo.
Opcionalmente, se puede utilizar una solución de piraña (mezcla de peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico concentrado, 1:3 (vol/vol)) para maximizar la eliminación de residuos orgánicos de la superficie de la oblea de silicio.
La solución Piranha es extremadamente corrosiva y genera calor. Se requieren precauciones de seguridad adicionales. Para desechar los residuos, deje que la solución se enfríe y transfiérala a un contenedor de residuos limpio y seco. Utilice contenedores secundarios y etiquete correctamente los contenedores de residuos. Siga las normas de seguridad de la instalación para obtener información más detallada sobre los procedimientos.
Deshidrata las obleas colocándolas sobre una placa calefactora a 200 °C durante 10 minutos. Tras la deshidratación, la oblea se agitó cinco veces al aire para enfriarla.
Vierta aproximadamente 10 g de fotorresina SU-8 2100 en el centro de la oblea de silicio limpia. Use pinzas para extender la fotorresina uniformemente sobre la oblea. Ocasionalmente, coloque la oblea sobre una placa calefactora a 65 °C para que la fotorresina sea menos pegajosa y más fácil de extender. No coloque la oblea directamente sobre la placa calefactora.
El SU-8 se distribuyó uniformemente en la oblea mediante recubrimiento por centrifugación. Programe una rotación entrante del SU-8 durante 5 a 10 s para que se propague a 500 rpm con una aceleración de 100 rpm/s. Configure el giro principal para un patrón de espesor de 200 µm a 1500 rpm, o logre un espesor de 250 µm (creando una altura de 500 µm para la capa superior del núcleo en el chip; consulte "Pasos críticos" a continuación) configurado a una aceleración de 300 rpm/s durante 30 segundos a 1200 rpm.
La velocidad de giro principal se puede ajustar en función del grosor deseado del patrón de SU-8 sobre la oblea de silicio.
Para fabricar patrones de SU-8 de 500 µm de altura para la capa superior del intestino en el chip, los pasos de recubrimiento por centrifugación y horneado suave de esta caja (pasos 7 y 8) se repitieron secuencialmente (ver paso 9) para producir dos capas de 250 µm de espesor de SU-8, que se pueden superponer y unir mediante exposición UV en el paso 12 de esta caja, creando una capa de 500 µm de altura.
Para un horneado suave, coloque con cuidado las obleas recubiertas con SU-8 sobre una placa calefactora a 65 °C durante 5 minutos, luego cambie la temperatura a 95 °C e incúbelas durante 40 minutos adicionales.
Para lograr una altura de 500 μm del patrón de SU-8 en el microcanal superior, repita los pasos 7 y 8 para generar dos capas de SU-8 de 250 μm de espesor.
Utilizando el alineador de máscaras UV, realice una prueba de lámpara según las instrucciones del fabricante para calcular el tiempo de exposición de la oblea. (tiempo de exposición, ms) = (dosis de exposición, mJ/cm2)/(potencia de la lámpara, mW/cm2).
Tras determinar el tiempo de exposición, coloque la fotomáscara en el soporte de la alineadora de máscaras UV y colóquela sobre la oblea recubierta con SU-8.
Coloque la superficie impresa de la fotomáscara directamente sobre el lado recubierto con SU-8 de la oblea de silicio para minimizar la dispersión de los rayos UV.
Exponga la oblea recubierta con SU-8 y la fotomáscara verticalmente a 260 mJ/cm2 de luz UV durante el tiempo de exposición predeterminado (consulte el paso 10 de este recuadro).
Tras la exposición a la luz ultravioleta, las obleas de silicio recubiertas con SU-8 se hornearon a 65 °C durante 5 minutos y a 95 °C durante 15 minutos en cada placa calefactora para fabricar patrones con una altura de 200 μm. Para fabricar patrones con una altura de 500 µm, se prolongó el tiempo de posthorneado a 95 °C hasta 30 minutos.
El revelador se vierte en un recipiente de vidrio y la oblea horneada se coloca en el recipiente. El volumen de revelador SU-8 puede variar según el tamaño de la placa de vidrio. Asegúrese de usar suficiente revelador SU-8 para eliminar por completo el SU-8 no expuesto. Por ejemplo, cuando utilice un recipiente de vidrio de 150 mm de diámetro con una capacidad de 1 L, use ~300 ml de revelador SU-8. Revele el molde durante 25 minutos con rotaciones suaves ocasionales.
Enjuague el molde revelado con aproximadamente 10 ml de revelador fresco, seguido de IPA, rociando la solución con una pipeta.
Coloque la oblea en un limpiador de plasma y expóngala al plasma de oxígeno (gas atmosférico, presión objetivo 1 × 10−5 Torr, potencia 125 W) durante 1,5 min.
Coloque la oblea en un desecador al vacío con un portaobjetos de vidrio en su interior. Las obleas y los portaobjetos se pueden colocar uno al lado del otro. Si el desecador al vacío está dividido en varias capas por una placa, coloque los portaobjetos en la cámara inferior y las obleas en la cámara superior. Vierta 100 μL de solución de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil)silano sobre un portaobjetos de vidrio y aplique vacío para la silanización.
Descongele un vial de células Caco-2 congeladas en un baño de agua a 37 °C y, a continuación, transfiera las células descongeladas a un matraz T75 que contenga 15 ml de medio Caco-2 precalentado a 37 °C.
Para cultivar células Caco-2 con una confluencia de aproximadamente el 90%, primero caliente el medio Caco-2, PBS y tripsina al 0,25%/EDTA 1 mM en un baño de agua a 37 °C.
Aspire el medio mediante aspiración al vacío. Lave las células dos veces con 5 ml de PBS tibio repitiendo la aspiración al vacío y añadiendo PBS fresco.