Grazie per aver visitato Nature.com. La versione del browser che stai utilizzando ha un supporto limitato per i CSS. Per un'esperienza ottimale, ti consigliamo di utilizzare un browser aggiornato (o di disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer). Nel frattempo, per garantire il supporto continuo, visualizzeremo il sito senza stili e JavaScript.
La morfogenesi dell'intestino umano stabilisce le caratteristiche cripta-villo della microarchitettura epiteliale 3D e dell'organizzazione spaziale. Questa struttura unica è necessaria per mantenere l'omeostasi intestinale proteggendo la nicchia delle cellule staminali nella cripta basale dagli antigeni microbici esogeni e dai loro metaboliti. Inoltre, i villi intestinali e il muco secretorio presentano cellule epiteliali funzionalmente differenziate con una barriera protettiva sulla superficie della mucosa intestinale. Pertanto, ricreare le strutture epiteliali 3D è cruciale per la costruzione di modelli intestinali in vitro. In particolare, l'intestino mimetico organico su chip può indurre una morfogenesi 3D spontanea dell'epitelio intestinale con funzioni fisiologiche e biomeccaniche migliorate. Qui, forniamo un protocollo riproducibile per indurre in modo robusto la morfogenesi intestinale nell'intestino su un chip microfluidico e in un chip ibrido incorporato Transwell. Descriviamo metodi dettagliati per la fabbricazione del dispositivo, la coltura di Caco-2 o Cellule epiteliali di organoidi intestinali in ambienti convenzionali e su una piattaforma microfluidica, induzione della morfogenesi 3D e caratterizzazione di epiteli 3D consolidati mediante molteplici modalità di imaging. Questo protocollo consente la rigenerazione della microarchitettura intestinale funzionale controllando il flusso di fluidi basolaterali per 5 giorni. Il nostro metodo di morfogenesi in vitro utilizza stress di taglio e movimento meccanico fisiologicamente rilevanti e non richiede complesse tecniche di ingegneria o manipolazione cellulare, il che potrebbe superare le prestazioni di altre tecniche esistenti. Prevediamo che il protocollo da noi proposto possa avere ampie implicazioni per la comunità della ricerca biomedica, fornendo un metodo per rigenerare strati epiteliali intestinali 3D in vitro per applicazioni biomediche, cliniche e farmaceutiche.
Gli esperimenti dimostrano che le cellule epiteliali intestinali Caco-2 coltivate in dispositivi "gut-on-a-chip"1,2,3,4,5 o in dispositivi microfluidici a doppio strato6,7 possono subire una morfogenesi 3D spontanea in vitro senza una chiara comprensione del meccanismo sottostante. Nel nostro recente studio, abbiamo scoperto che la rimozione degli antagonisti dei morfogeni secreti basolateralmente dai dispositivi di coltura è necessaria e sufficiente per indurre la morfogenesi epiteliale 3D in vitro, come dimostrato dalle cellule Caco-2 e dagli organoidi intestinali derivati ​​da pazienti. Le cellule epiteliali sono state validate. In questo studio, ci siamo concentrati specificamente sulla produzione cellulare e sulla distribuzione della concentrazione di un potente antagonista di Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), in gut-on-a-chip e dispositivi microfluidici modificati contenenti inserti Transwell, denominati "Hybrid Chip". Dimostriamo che l'aggiunta di antagonisti di Wnt esogeni (come DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1 o Soggy-1) all'intestino su chip inibisce la morfogenesi o interrompe lo strato epiteliale 3D prestrutturato, suggerendo che lo stress antagonista durante la coltura è responsabile della morfogenesi intestinale in vitro. Pertanto, un approccio pratico per ottenere una robusta morfogenesi all'interfaccia epiteliale è quello di rimuovere o mantenere minimamente i livelli di antagonisti di Wnt nel compartimento basolaterale mediante lavaggio attivo (ad esempio, in piattaforme gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip) o diffusione .Mezzi basolaterali (ad esempio, da inserti Transwell in grandi serbatoi basolaterali nei pozzi).
In questo protocollo, forniamo un metodo dettagliato per la fabbricazione di microdispositivi gut-on-a-chip e chip ibridi inseribili Transwell (passaggi 1-5) per coltivare cellule epiteliali intestinali su membrane porose a base di polidimetilsilossano (PDMS) (passaggi 6A, 7A, 8, 9) o membrane di poliestere di inserti Transwell (passaggi 6B, 7B, 8, 9) e abbiamo indotto la morfogenesi 3D in vitro (passaggio 10). Abbiamo anche identificato caratteristiche cellulari e molecolari indicative di istogenesi tessuto-specifica e differenziazione cellulare dipendente dal lignaggio applicando molteplici modalità di imaging (passaggi 11-24). Induciamo la morfogenesi utilizzando cellule epiteliali intestinali umane, come Caco-2 o organoidi intestinali, in due formati di coltura con dettagli tecnici che includono la modifica della superficie delle membrane porose, la creazione di monostrati 2D e la biochimica intestinale e la riproduzione del microambiente biomeccanico in vitro. Per indurre la morfogenesi 3D da monostrati epiteliali 2D, abbiamo rimosso gli antagonisti del morfogeno in entrambe le forme coltivate facendo fluire il mezzo nel compartimento basolaterale della coltura. Infine, forniamo una rappresentazione dell'utilità di uno strato epiteliale 3D rigenerabile che può essere utilizzato per modellare la crescita epiteliale dipendente dal morfogeno, le co-colture longitudinali ospite-microbioma, le infezioni da patogeni, le lesioni infiammatorie, la disfunzione della barriera epiteliale e le terapie basate sui probiotici. Esempio. influenze.
Il nostro protocollo può essere utile a una vasta gamma di scienziati nella ricerca di base (ad esempio, biologia della mucosa intestinale, biologia delle cellule staminali e biologia dello sviluppo) e applicata (ad esempio, test preclinici di farmaci, modellizzazione di malattie, ingegneria tissutale e gastroenterologia), con un ampio impatto. Grazie alla riproducibilità e alla robustezza del nostro protocollo per indurre la morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale in vitro, prevediamo che la nostra strategia tecnica possa essere diffusa a un pubblico che studia le dinamiche della segnalazione cellulare durante lo sviluppo, la rigenerazione o l'omeostasi intestinale. Inoltre, il nostro protocollo è utile per studiare l'infezione da vari agenti infettivi come Norovirus 8, Coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae. Anche gli esperti di patologia e patogenesi sono utili. L'uso di un sistema di microfisiologia intestinale su chip può consentire la co-coltura longitudinale 10 e la successiva valutazione della difesa dell'ospite, delle risposte immunitarie e della riparazione delle lesioni correlate ai patogeni nel tratto gastrointestinale (GI) 11. Altri disturbi GI associati alla sindrome dell'intestino permeabile, alla celiachia, al morbo di Crohn, alla colite ulcerosa, alla pouchite o alla sindrome dell'intestino irritabile possono essere simulati quando vengono preparati strati epiteliali intestinali 3D utilizzando gli strati epiteliali intestinali 3D del paziente; queste malattie includono atrofia dei villi, accorciamento delle cripte, danni alla mucosa o barriera epiteliale compromessa. Organoidi intestinali derivati ​​da biopsia o cellule staminali12,13. Per modellare meglio la maggiore complessità dell'ambiente patologico, i lettori possono considerare di aggiungere tipi di cellule rilevanti per la malattia, come le cellule mononucleate del sangue periferico del paziente (PBMC), a modelli contenenti villi e cripte intestinali 3D microarchitetture. cellule immunitarie tessuto-specifiche, 5.
Poiché la microstruttura epiteliale 3D può essere fissata e visualizzata senza il processo di sezionamento, gli osservatori che lavorano sulla trascrittomica spaziale e sull'imaging ad alta o super-risoluzione potrebbero essere interessati alla nostra mappatura delle dinamiche spazio-temporali di geni e proteine ​​nelle nicchie epiteliali. Interessato alla tecnologia. Risposta a stimoli microbici o immunitari. Inoltre, il crosstalk longitudinale ospite-microbioma 10, 14 che coordina l'omeostasi intestinale può essere stabilito nello strato mucosale intestinale 3D mediante la co-coltura di varie specie microbiche, comunità microbiche o microbiota fecale, in particolare nell'intestino su chip. nella piattaforma. Questo approccio è particolarmente interessante per il pubblico che studia l'immunologia delle mucose, la gastroenterologia, il microbioma umano, la culturomica e la microbiologia clinica che cercano di coltivare in laboratorio microbiota intestinale precedentemente non coltivato. Se il nostro protocollo di morfogenesi in vitro può essere adattato a formati di coltura scalabili, come inserti multi-pozzetto in piastre a 24, 96 o 384 pozzetti che riforniscono continuamente i compartimenti basolaterali, il protocollo può anche essere diffuso a coloro che sviluppano piattaforme farmaceutiche, biomediche o di screening o validazione ad alto rendimento per l'industria alimentare. Come prova di principio, abbiamo recentemente dimostrato la fattibilità di un sistema di morfogenesi multiplex ad alto rendimento scalabile a un formato di piastra a 24 pozzetti. Inoltre, sono stati commercializzati numerosi prodotti organo-su-chip16,17,18. Pertanto, la validazione del nostro metodo di morfogenesi in vitro può essere accelerata e potenzialmente adottata da molti laboratori di ricerca, industria o agenzie governative e regolatorie per comprendere la morfogenesi cellulare. Riprogrammazione della morfogenesi intestinale in vitro a livello trascrittomico per testare farmaci o biofarmaci. L'assorbimento e il trasporto di potenziali farmaci sono stati valutati utilizzando modelli surrogati intestinali 3D o modelli organo-su-chip personalizzati o commerciali per valutare la riproducibilità del processo di morfogenesi intestinale.
Un numero limitato di modelli sperimentali rilevanti per l'uomo è stato utilizzato per studiare la morfogenesi dell'epitelio intestinale, principalmente a causa della mancanza di protocolli implementabili per indurre la morfogenesi 3D in vitro. Infatti, gran parte delle attuali conoscenze sulla morfogenesi intestinale si basa su studi su animali (ad esempio, zebrafish20, topi21 o polli22). Tuttavia, questi sono laboriosi e costosi, possono essere eticamente discutibili e, soprattutto, non determinano con precisione i processi di sviluppo umani. Questi modelli sono anche molto limitati nella loro capacità di essere testati in modo scalabile e multidirezionale. Pertanto, il nostro protocollo per rigenerare strutture tissutali 3D in vitro supera i modelli animali in vivo così come altri modelli tradizionali di coltura cellulare 2D statica. Come precedentemente descritto, l'utilizzo di strutture epiteliali 3D ci ha permesso di esaminare la localizzazione spaziale delle cellule differenziate nell'asse cripta-villo in risposta a vari stimoli mucosali o immunitari. Gli strati epiteliali 3D possono fornire un spazio per studiare come le cellule microbiche competono per formare nicchie spaziali e l'evoluzione ecologica in risposta a fattori dell'ospite (ad esempio, strati di muco interni rispetto a quelli esterni, secrezione di IgA e peptidi antimicrobici). Inoltre, la morfologia epiteliale 3D può consentirci di comprendere come il microbiota intestinale struttura le sue comunità e produce sinergicamente metaboliti microbici (ad esempio, acidi grassi a catena corta) che modellano l'organizzazione cellulare e le nicchie delle cellule staminali nelle cripte basali. Queste caratteristiche possono essere dimostrate solo quando gli strati epiteliali 3D vengono stabiliti in vitro.
Oltre al nostro metodo di creazione di strutture epiteliali intestinali 3D, esistono diversi metodi in vitro. La coltura di organoidi intestinali è una tecnica di ingegneria tissutale all'avanguardia basata sulla coltivazione di cellule staminali intestinali in condizioni morfogenetiche specifiche23,24,25. Tuttavia, l'uso di modelli di organoidi 3D per l'analisi del trasporto o per le co-colture ospite-microbioma è spesso problematico perché il lume intestinale è racchiuso all'interno dell'organoide e, pertanto, l'introduzione di componenti luminali come cellule microbiche o antigeni esogeni è limitata. L'accesso ai lumi degli organoidi può essere migliorato utilizzando un microiniettore,26,27 ma questo metodo è invasivo e laborioso e richiede conoscenze specialistiche per essere eseguito. Inoltre, le colture di organoidi tradizionali mantenute in scaffold di idrogel in condizioni statiche non riflettono accuratamente la biomeccanica attiva in vivo.
Altri approcci impiegati da diversi gruppi di ricerca utilizzano scaffold di idrogel 3D prestrutturati per imitare la struttura epiteliale intestinale coltivando cellule intestinali umane isolate sulla superficie del gel. Gli scaffold di idrogel vengono fabbricati utilizzando stampi stampati in 3D, micromillati o realizzati litograficamente. Questo metodo mostra la disposizione auto-organizzata di cellule epiteliali isolate in vitro con gradienti di morfogeni fisiologicamente rilevanti, stabilendo una struttura epiteliale con un elevato rapporto d'aspetto e un'interazione stroma-epitelio includendo cellule stromali nello scaffold. Tuttavia, la natura degli scaffold prestrutturati può impedire la visualizzazione del processo morfogenetico spontaneo stesso. Questi modelli inoltre non forniscono un flusso luminale o interstiziale dinamico, mancando dello stress di taglio del fluido di cui le cellule intestinali hanno bisogno per subire la morfogenesi e acquisire la funzione fisiologica. Un altro studio recente ha utilizzato scaffold di idrogel in una piattaforma microfluidica e strutture epiteliali intestinali modellate. utilizzando tecniche di incisione laser. Gli organoidi intestinali di topo seguono modelli incisi per formare strutture tubulari intestinali e il flusso di fluido intraluminale può essere riprodotto utilizzando un modulo microfluidico. Tuttavia, questo modello non presenta processi morfogenetici spontanei né include movimenti meccanobiologici intestinali. Le tecniche di stampa 3D dello stesso gruppo sono state in grado di creare tubi intestinali in miniatura con processi morfogenetici spontanei. Nonostante la complessa fabbricazione di diversi segmenti intestinali all'interno del tubo, anche questo modello manca di flusso di fluido luminale e deformazione meccanica. Inoltre, l'operatività del modello può essere limitata, soprattutto dopo il completamento del processo di biostampa, perturbando le condizioni sperimentali o le interazioni cellula-cellula. Invece, il nostro protocollo proposto fornisce morfogenesi intestinale spontanea, stress di taglio fisiologicamente rilevante, biomeccanica che imita la motilità intestinale, accessibilità di compartimenti apicali e basolaterali indipendenti e ricreazione di complessi microambienti biologici di modularità. Pertanto, la nostra morfogenesi 3D in vitro Il protocollo potrebbe fornire un approccio complementare per superare le difficoltà dei metodi esistenti.
Il nostro protocollo è interamente focalizzato sulla morfogenesi epiteliale 3D, con solo cellule epiteliali in coltura e nessun altro tipo di cellule circostanti come cellule mesenchimali, cellule endoteliali e cellule immunitarie. Come precedentemente descritto, il nucleo del nostro protocollo è l'induzione della morfogenesi epiteliale mediante la rimozione degli inibitori del morfogeno secreti sul lato basolaterale del mezzo introdotto. Mentre la robusta modularità del nostro intestino su chip e ibrido su chip ci consente di ricreare lo strato epiteliale 3D ondulato, ulteriori complessità biologiche come le interazioni epitelio-mesenchimali33,34, la deposizione della matrice extracellulare (ECM)35 e, nel nostro modello, le caratteristiche cripta-villo che veicolano nicchie di cellule staminali nelle cripte basali devono essere ulteriormente considerate. Le cellule stromali (ad esempio, i fibroblasti) nel mesenchima svolgono un ruolo chiave nella produzione di proteine ​​ECM e nella regolazione intestinale morfogenesi in vivo35,37,38.L'aggiunta di cellule mesenchimali al nostro modello ha migliorato il processo morfogenetico e l'efficienza di adesione cellulare.Lo strato endoteliale (ad esempio, capillari o vasi linfatici) svolge un ruolo importante nella regolazione del trasporto molecolare39 e del reclutamento delle cellule immunitarie40 nel microambiente intestinale.Inoltre, i componenti vascolari che possono essere collegati tra modelli tissutali sono un prerequisito quando i modelli tissutali sono progettati per dimostrare interazioni multi-organo.Pertanto, potrebbe essere necessario includere cellule endoteliali per modellare caratteristiche fisiologiche più accurate con risoluzione a livello di organo.Le cellule immunitarie derivate dal paziente sono anche essenziali per mostrare risposte immunitarie innate, presentazione dell'antigene, crosstalk immunitario innato-adattativo e immunità tessuto-specifica nel contesto della simulazione di malattie intestinali.
L'utilizzo di chip ibridi è più semplice rispetto al modello "intestino su chip" perché la configurazione del dispositivo è più semplice e l'uso di inserti Transwell consente la coltura scalabile dell'epitelio intestinale. Tuttavia, gli inserti Transwell disponibili in commercio con membrane in poliestere non sono elastici e non possono simulare movimenti peristaltici. Inoltre, il compartimento apicale dell'inserto Transwell posizionato nel chip ibrido è rimasto statico, senza stress di taglio sul lato apicale. Chiaramente, le proprietà statiche del compartimento apicale raramente consentono una co-coltura batterica a lungo termine nei chip ibridi. Sebbene sia possibile indurre efficacemente la morfogenesi 3D negli inserti Transwell utilizzando chip ibridi, la mancanza di biomeccanica fisiologicamente rilevante e di flusso di fluidi apicali potrebbe limitare la fattibilità delle piattaforme a chip ibridi per potenziali applicazioni.
Ricostruzioni complete dell'asse cripta-villo umano in colture su chip e ibride su chip non sono state ancora completamente realizzate. Poiché la morfogenesi inizia da un monostrato epiteliale, le microarchitetture 3D non forniscono necessariamente una somiglianza morfologica con le cripte in vivo. Sebbene abbiamo caratterizzato la popolazione di cellule proliferanti vicino al dominio basale della cripta nell'epitelio 3D microingegnerizzato, le regioni della cripta e dei villi non erano chiaramente delimitate. Sebbene i canali superiori più alti sul chip portino a un aumento dell'altezza dell'epitelio microingegnerizzato, l'altezza massima è ancora limitata a ~300-400 µm. La profondità effettiva delle cripte intestinali umane nell'intestino tenue e crasso è rispettivamente di ~135 µm e ~400 µm, e l'altezza dei villi dell'intestino tenue è di ~600 µm41.
Dal punto di vista dell'imaging, l'imaging in situ a super-risoluzione di microarchitetture 3D può essere limitato all'intestino su chip, poiché la distanza di lavoro richiesta tra l'obiettivo e lo strato epiteliale è dell'ordine di pochi millimetri. Per superare questo problema, potrebbe essere necessario un obiettivo distante. Inoltre, la preparazione di sezioni sottili per l'imaging del campione è complessa a causa dell'elevata elasticità del PDMS. Inoltre, poiché la microfabbricazione strato per strato dell'intestino su chip implica un'adesione permanente tra ogni strato, è estremamente difficile aprire o rimuovere lo strato superiore per esaminare la struttura superficiale dello strato epiteliale. Ad esempio, utilizzando un microscopio elettronico a scansione (SEM).
L'idrofobicità del PDMS è stata un fattore limitante negli studi basati sulla microfluidica che si occupano di piccole molecole idrofobiche, poiché il PDMS può adsorbire in modo non specifico tali molecole idrofobiche. Si possono considerare alternative al PDMS con altri materiali polimerici. In alternativa, si può considerare la modifica superficiale del PDMS (ad esempio, il rivestimento con materiali lipofili 42 o poli(etilenglicole) 43) per minimizzare l'adsorbimento di molecole idrofobiche.
Infine, il nostro metodo non è stato ben caratterizzato in termini di fornitura di uno screening ad alto rendimento o di una piattaforma sperimentale di facile utilizzo "universale". Il protocollo attuale richiede una pompa a siringa per ogni microdispositivo, che occupa spazio in un incubatore a CO2 e impedisce esperimenti su larga scala. Questa limitazione può essere significativamente migliorata dalla scalabilità di formati di coltura innovativi (ad esempio, inserti porosi a 24, 96 o 384 pozzetti che consentono il rifornimento e la rimozione continui del terreno basolaterale).
Per indurre la morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale umano in vitro, abbiamo utilizzato un dispositivo intestinale microfluidico contenente due microcanali paralleli e una membrana porosa elastica interposta per creare un'interfaccia lume-capillare. Dimostriamo anche l'uso di un dispositivo microfluidico a canale singolo (un chip ibrido) che fornisce un flusso basolaterale continuo al di sotto di strati epiteliali polarizzati cresciuti su inserti Transwell. In entrambe le piattaforme, la morfogenesi di varie cellule epiteliali intestinali umane può essere dimostrata applicando una manipolazione direzionale del flusso per rimuovere gli antagonisti del morfogeno dal compartimento basolaterale. L'intera procedura sperimentale (Figura 1) consiste in cinque parti: (i) microfabbricazione del chip intestinale o del chip ibrido inseribile Transwell (fasi 1-5; riquadro 1), (ii) preparazione di cellule epiteliali intestinali (cellule Caco-2) o organoidi intestinali umani; (iii) coltura di cellule epiteliali intestinali su chip intestinali o chip ibridi (fasi 6-9), (iv) induzione della morfogenesi 3D in vitro (fase 10) e (v) ) per caratterizzare la microstruttura epiteliale 3D (fasi 11-24). Infine, è stato progettato un gruppo di controllo appropriato (discusso più avanti) per convalidare l'efficacia della morfogenesi in vitro confrontando la morfogenesi epiteliale con controlli spaziali, temporali, condizionali o procedurali.
Abbiamo utilizzato due diverse piattaforme di coltura: gut-on-a-chip con canali rettilinei o canali contorti non lineari, oppure chip ibridi contenenti inserti Transwell (TW) in un dispositivo microfluidico, fabbricato come descritto nel riquadro 1 e nelle fasi 1-5. "Fabbricazione del dispositivo" mostra le fasi principali per la realizzazione di un singolo chip o di un chip ibrido. "Coltura di cellule epiteliali intestinali umane" spiega la fonte cellulare (Caco-2 o organoidi intestinali umani) e la procedura di coltura utilizzata in questo protocollo. "Morfogenesi in vitro" mostra le fasi generali in cui le cellule epiteliali Caco-2 o derivate da organoidi vengono coltivate su un chip intestinale o su inserti Transwell di un chip ibrido, seguite dall'induzione della morfogenesi 3D e dalla formazione di una struttura epiteliale caratterizzata. Il numero della fase del programma o il numero del riquadro è visualizzato sotto ogni freccia. L'applicazione fornisce esempi di come gli strati epiteliali intestinali stabiliti possono essere utilizzati, ad esempio, nella caratterizzazione della differenziazione cellulare, nella fisiologia intestinale. studi, creazione di ecosistemi ospite-microbioma e modellizzazione delle malattie. Immagini di immunofluorescenza in "Differenziazione cellulare" che mostrano nuclei, F-actina e MUC2 espressi nello strato epiteliale 3D Caco-2 generato sul chip intestinale. La segnalazione MUC2 è presente nelle cellule caliciformi e nel muco secreto dalle superfici mucose. Immagini fluorescenti in Fisiologia intestinale mostrano il muco prodotto dalla colorazione per i residui di acido sialico e N-acetilglucosamina utilizzando l'agglutinina fluorescente del germe di grano. Le due immagini sovrapposte in "Co-colture ospite-microbioma" mostrano co-colture ospite-microbioma rappresentative nell'intestino su un chip. Il pannello di sinistra mostra la co-coltura di E. coli che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) con cellule epiteliali 3D Caco-2 microingegnerizzate. Il pannello di destra mostra la localizzazione di E. coli GFP co-coltivato con cellule epiteliali 3D Caco-2, seguita da immunofluorescenza Colorazione con F-actina (rosso) e nuclei (blu). La modellazione della malattia illustra l'intestino sano rispetto all'intestino permeabile in chip di infiammazione intestinale sottoposti a stimolazione fisiologica con antigeni batterici (ad es. lipopolisaccaride, LPS) e cellule immunitarie (ad es. PBMC; verde). Le cellule Caco-2 sono state coltivate per stabilire uno strato epiteliale 3D. Barra di scala, 50 µm. Immagini nella riga inferiore: "Differenziazione delle cellule" adattata con il permesso dalla referenza 2. Oxford University Press; Riproduzione autorizzata dalla referenza 5. NAS; "Co-coltura ospite-microbo" adattata con il permesso dalla referenza 3. NAS; "Modellazione della malattia" adattata con il permesso dalla referenza 5. NAS.
Sia i chip gut-on-a-chip che i chip ibridi sono stati fabbricati utilizzando repliche in PDMS che sono state sformate da stampi in silicio mediante litografia morbida1,44 e modellate con SU-8. Il design dei microcanali in ciascun chip è determinato considerando l'idrodinamica come lo stress di taglio e la pressione idrodinamica1,4,12. Il design originale gut-on-a-chip (Fig. 1a dei Dati Estesi), che consisteva in due microcanali rettilinei paralleli giustapposti, si è evoluto in un gut-on-a-chip complesso (Fig. 1b dei Dati Estesi) che include una coppia di microcanali curvi per indurre un aumento del tempo di residenza del fluido, modelli di flusso non lineari e deformazione multiassiale delle cellule in coltura (Fig. 2a-f) 12. Quando è necessario ricreare una biomeccanica intestinale più complessa, è possibile scegliere gut-on-a-chip complessi. Abbiamo dimostrato che il Gut-Chip convoluto induce fortemente anche la morfogenesi 3D in un intervalli di tempo simili con un grado simile di crescita epiteliale rispetto al Gut-Chip originale, indipendentemente dal tipo di cellula coltivata. Pertanto, per indurre la morfogenesi 3D, i design intestinali lineari e complessi su chip sono intercambiabili. Le repliche in PDMS polimerizzate su stampi in silicio con modelli SU-8 hanno fornito caratteristiche negative dopo la rimozione dallo stampo (Fig. 2a). Per fabbricare l'intestino su un chip, lo strato superiore di PDMS preparato è stato sequenzialmente legato a una pellicola porosa di PDMS e quindi allineato con lo strato inferiore di PDMS mediante legame irreversibile utilizzando un trattatore a corona (Fig. 2b-f). Per fabbricare chip ibridi, le repliche in PDMS polimerizzate sono state legate a vetrini per creare dispositivi microfluidici a canale singolo che potevano ospitare inserti Transwell (Fig. 2h e Fig. 2 dei dati estesi). Il processo di legame viene eseguito trattando le superfici della replica in PDMS e del vetro con plasma di ossigeno o trattamento a corona. Dopo la sterilizzazione del dispositivo microfabbricato attaccato al silicone Nel tubo, la configurazione del dispositivo era pronta per eseguire la morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale (Figura 2g).
a, Illustrazione schematica della preparazione di parti in PDMS da stampi in silicio con pattern in SU-8. La soluzione di PDMS non polimerizzata è stata versata su uno stampo in silicio (a sinistra), polimerizzata a 60 °C (al centro) e sformata (a destra). Il PDMS sformato è stato tagliato in pezzi e pulito per l'uso successivo. b, Fotografia dello stampo in silicio utilizzato per preparare lo strato superiore in PDMS. c, Fotografia dello stampo in silicio utilizzato per fabbricare la membrana porosa in PDMS. d, Una serie di fotografie dei componenti superiore e inferiore in PDMS e del dispositivo intestinale su chip assemblato. e, Schema dell'allineamento dei componenti superiore, della membrana e inferiore in PDMS. Ogni strato è legato in modo irreversibile mediante trattamento al plasma o corona. f, Schema del dispositivo intestino su chip fabbricato con microcanali contorti e camere a vuoto sovrapposti. g, Configurazione dell'intestino su chip per la coltura cellulare microfluidica. L'intestino su chip fabbricato è assemblato con un tubo in silicone e una siringa. è stato posizionato su un vetrino coprioggetti. Il dispositivo chip è stato posizionato sul coperchio di una piastra di Petri da 150 mm per la lavorazione. Il legante viene utilizzato per chiudere il tubo di silicone. h, Istantanee visive della fabbricazione del chip ibrido e della morfogenesi 3D utilizzando chip ibridi. Gli inserti Transwell preparati indipendentemente per la coltura di monostrati 2D di cellule epiteliali intestinali sono stati inseriti nel chip ibrido per indurre la morfogenesi intestinale 3D. Il mezzo viene perfuso attraverso microcanali sotto lo strato cellulare stabilito sull'inserto Transwell. Barra di scala, 1 cm. h Ristampato con il permesso del riferimento.4. Elsevier.
In questo protocollo, la linea cellulare Caco-2 e gli organoidi intestinali sono stati utilizzati come fonti epiteliali (Fig. 3a). Entrambi i tipi di cellule sono stati coltivati ​​indipendentemente (Box 2 e Box 5) e utilizzati per seminare i microcanali rivestiti di ECM degli inserti intestinali su chip o Transwell. Quando le cellule sono confluenti (>95% di copertura nelle fiasche), le cellule Caco-2 coltivate di routine (tra il passaggio 10 e il 50) in fiasche T vengono raccolte per preparare sospensioni cellulari dissociate mediante liquido di tripsinizzazione (box 2). Gli organoidi intestinali umani da biopsie intestinali o resezioni chirurgiche sono stati coltivati ​​in cupole di scaffold di Matrigel in piastre a 24 pozzetti per supportare il microambiente strutturale. Il terreno contenente morfogeni essenziali (come Wnt, R-spondin e Noggin) e fattori di crescita preparati come descritto nel Box 3 è stato integrato a giorni alterni fino a quando gli organoidi non hanno raggiunto circa 500 µm di diametro. Gli organoidi completamente sviluppati vengono raccolti e dissociati in singole cellule per la semina su inserti intestinali o Transwell su un chip (Box 5). Come abbiamo precedentemente riportato, può essere differenziato in base al tipo di malattia12,13 (ad esempio colite ulcerosa, malattia di Crohn, cancro del colon-retto o donatore normale), alla sede della lesione (ad esempio, lesione rispetto all'area non lesionata) e alla posizione gastrointestinale nel tratto (ad esempio duodeno, digiuno, ileo, cieco, colon o retto). Nel Box 5 forniamo un protocollo ottimizzato per la coltura di organoidi del colon (coloidi) che in genere richiedono concentrazioni di morfogeni più elevate rispetto agli organoidi dell'intestino tenue.
a, Flusso di lavoro per l'induzione della morfogenesi intestinale nel chip intestinale. In questo protocollo vengono utilizzati epitelio intestinale umano Caco-2 e organoidi intestinali per dimostrare la morfogenesi 3D. Le cellule epiteliali isolate sono state seminate nel dispositivo intestino su chip preparato (preparazione del chip). Una volta che le cellule sono state seminate (seminate) e attaccate (attaccate) alla membrana porosa in PDMS al giorno 0 (D0), viene avviato il flusso apicale (AP) e mantenuto per i primi 2 giorni (flusso, AP, D0-D2). Viene avviato anche il flusso basolaterale (BL) insieme a movimenti di stiramento ciclici (stiramento, flusso, AP e BL) quando si forma un monostrato 2D completo. La morfogenesi intestinale 3D si è verificata spontaneamente dopo 5 giorni di coltura microfluidica (morfogenesi, D5). Le immagini in contrasto di fase mostrano la morfologia rappresentativa delle cellule Caco-2 in ogni fase sperimentale o punto temporale (grafico a barre, 100 µm). Quattro diagrammi schematici che illustrano le corrispondenti cascate della morfogenesi intestinale (in alto a destra). Le frecce tratteggiate nello schema rappresentano la direzione del flusso del fluido. b, Immagine SEM che mostra la topologia superficiale dell'epitelio Caco-2 3D stabilito (a sinistra). L'inserto che evidenzia l'area ingrandita (riquadro tratteggiato bianco) mostra i microvilli rigenerati sullo strato Caco-2 3D (a destra). c, Vista frontale orizzontale di Caco-2 3D stabilito, claudina (ZO-1, rosso) e membrane continue a orletto a spazzola etichettate F-actina (verde) e nuclei (blu) Visualizzazione confocale a immunofluorescenza di cellule epiteliali su chip intestinali. Le frecce che puntano allo schema centrale indicano la posizione del piano focale per ogni vista confocale. d, Andamento temporale dei cambiamenti morfologici negli organoidi coltivati ​​su un chip ottenuti mediante microscopia a contrasto di fase nei giorni 3, 7, 9, 11 e 13. L'inserto (in alto a destra) mostra l'ingrandimento elevato dell'immagine fornita.e, Microfotografia DIC dell'epitelio 3D dell'organoide stabilito nell'intestino su una sezione prelevata al giorno 7.f, Immagini di immunofluorescenza sovrapposte che mostrano i marcatori per le cellule staminali (LGR5; magenta), le cellule caliciformi (MUC2; verde), l'actina F (grigio) e i nuclei (ciano) coltivati ​​su chip intestinali per 3 giorni, rispettivamente (a sinistra) e organoidi di 13 giorni (al centro) sullo strato epiteliale.Vedi anche la Figura 3 dei Dati Estesi, che evidenzia la segnalazione di LGR5 senza segnalazione di MUC2.Immagini di fluorescenza che mostrano la microstruttura epiteliale (a destra) dell'epitelio 3D dell'organoide stabilito nell'intestino su un chip colorando la membrana plasmatica con il colorante CellMask (a destra) al giorno 13 di coltura.La barra di scala è di 50 μm se non diversamente indicato.b Ristampato con il permesso del riferimento 2. Oxford University Press; c Adattato con il permesso del riferimento 2. Oxford University Press; e e f adattati con autorizzazione tramite riferimento.12 Sotto licenza Creative Commons CC BY 4.0.
Nell'intestino su chip, è necessario modificare la superficie idrofobica della membrana porosa in PDMS per un rivestimento ECM efficace. In questo protocollo, applichiamo due diversi metodi per modificare l'idrofobicità delle membrane in PDMS. Per la coltura di cellule Caco-2, l'attivazione della superficie mediante trattamento UV/ozono da sola è stata sufficiente a ridurre l'idrofobicità della superficie in PDMS, rivestire l'ECM e attaccare le cellule Caco-2 alla membrana in PDMS. Tuttavia, la coltura microfluidica dell'epitelio organoide richiede una funzionalizzazione della superficie basata su sostanze chimiche per ottenere un'efficiente deposizione di proteine ​​ECM applicando sequenzialmente polietilenimmina (PEI) e glutaraldeide ai microcanali in PDMS. Dopo la modifica della superficie, le proteine ​​ECM sono state depositate per coprire la superficie in PDMS funzionalizzata e quindi introdotte nell'epitelio organoide isolato. Dopo che le cellule sono attaccate, la coltura cellulare microfluidica inizia perfondendo solo il mezzo nel microcanale superiore fino a quando le cellule formano un monostrato completo, mentre il microcanale inferiore mantiene condizioni statiche. Questo metodo ottimizzato per l'attivazione della superficie e il rivestimento ECM consente l'adesione dell'epitelio organoide per indurre la morfogenesi 3D sulla superficie del PDMS.
Anche le colture Transwell richiedono un rivestimento con ECM prima della semina cellulare; tuttavia, non necessitano di complesse fasi di pretrattamento per attivare la superficie degli inserti porosi. Per la crescita di cellule Caco-2 su inserti Transwell, il rivestimento con ECM sugli inserti porosi accelera l'adesione delle cellule Caco-2 dissociate (<1 ora) e la formazione della barriera delle giunzioni strette (<1-2 giorni). Per coltivare organoidi su inserti Transwell, gli organoidi isolati vengono seminati su inserti rivestiti con ECM, aderiscono alla superficie della membrana (<3 ore) e mantenuti fino a quando gli organoidi formano un monostrato completo con integrità della barriera. Le colture Transwell vengono eseguite in piastre a 24 pozzetti senza l'uso di chip ibridi.
La morfogenesi 3D in vitro può essere avviata applicando un flusso di fluido al lato basolaterale di uno strato epiteliale già formato. Nell'intestino su chip, la morfogenesi epiteliale è iniziata quando il mezzo di coltura è stato perfuso nei microcanali superiore e inferiore (Fig. 3a). Come precedentemente descritto, è fondamentale introdurre un flusso di fluido nel compartimento inferiore (basolaterale) per la rimozione continua degli inibitori morfogenici secreti in modo direzionale. Per fornire nutrienti e siero sufficienti alle cellule legate alle membrane porose e generare stress di taglio luminale, in genere applichiamo un doppio flusso nell'intestino su chip. Nei chip ibridi, gli inserti Transwell contenenti monostrati epiteliali sono stati inseriti nei chip ibridi. Quindi, il mezzo di coltura è stato applicato sotto il lato basolaterale dell'inserto Transwell poroso attraverso il microcanale. La morfogenesi intestinale si è verificata 3-5 giorni dopo l'inizio del flusso basolaterale in entrambe le piattaforme di coltura.
Le caratteristiche morfologiche degli strati epiteliali 3D microingegnerizzati possono essere analizzate applicando varie modalità di imaging, tra cui la microscopia a contrasto di fase, la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC), la SEM o la microscopia confocale a immunofluorescenza (Figure 3 e 4). L'imaging a contrasto di fase o DIC può essere facilmente eseguito in qualsiasi momento durante la coltura per monitorare la forma e la protrusione degli strati epiteliali 3D. Grazie alla trasparenza ottica dei film di PDMS e poliestere, sia le piattaforme gut-on-a-chip che ibride chip possono fornire imaging in situ in tempo reale senza la necessità di sezionare o smontare il dispositivo. Quando si esegue l'imaging a immunofluorescenza (Figure 1, 3c, f e 4b, c), le cellule vengono tipicamente fissate con paraformaldeide (PFA) al 4% (p/v), seguita da Triton X-100 e albumina di siero bovino (BSA) al 2% (p/v), in ordine. A seconda del tipo di cellula, diversi È possibile utilizzare fissativi, permeabilizzanti e agenti bloccanti. Anticorpi primari mirati a marcatori cellulari o regionali dipendenti dal lignaggio vengono utilizzati per evidenziare le cellule immobilizzate in situ sul chip, seguiti da anticorpi secondari insieme a un colorante di contrasto mirato al nucleo (ad esempio, 4′,6-diamidino-2-fenilene) indolo, DAPI) o all'actina F (ad esempio, falloidina marcata fluorescentemente). L'imaging live basato sulla fluorescenza può anche essere eseguito in situ per rilevare la produzione di muco (Fig. 1, "Differenziazione cellulare" e "Fisiologia intestinale"), la colonizzazione casuale di cellule microbiche (Fig. 1, "Co-coltura ospite-microbo"), il reclutamento di cellule immunitarie (Fig. 1, "Modellazione della malattia") o i contorni della morfologia epiteliale 3D (Fig. 3c,f e 4b,c). Quando si modifica l'intestino sul chip per separare lo strato superiore dallo strato inferiore dei microcanali, come descritto in Come mostrato nella Fig. 2, la morfologia epiteliale 3D e i microvilli sul bordo a spazzola apicale possono essere visualizzati tramite SEM (Fig. 3b). L'espressione dei marcatori di differenziazione può essere valutata eseguendo PCR quantitativa5 o sequenziamento dell'RNA a singola cellula. In questo caso, gli strati 3D di cellule epiteliali coltivate in chip intestinali o chip ibridi vengono raccolti mediante tripsinizzazione e quindi utilizzati per analisi molecolari o genetiche.
a, Flusso di lavoro per l'induzione della morfogenesi intestinale in un chip ibrido. In questo protocollo vengono utilizzati Caco-2 e organoidi intestinali per dimostrare la morfogenesi 3D in una piattaforma a chip ibrido. Cellule epiteliali dissociate sono state seminate in inserti Transwell preparati (TW prep; vedere la figura sottostante). Una volta seminate (seeded) e fissate alle membrane di poliestere negli inserti Transwell, tutte le cellule sono state coltivate in condizioni statiche (TW culture). Dopo 7 giorni, un singolo inserto Transwell contenente un monostrato 2D di cellule epiteliali è stato integrato in un chip ibrido per introdurre un flusso basolaterale (Flow, BL), che ha portato alla generazione di uno strato epiteliale 3D (morfogenesi). Micrografie a contrasto di fase che mostrano le caratteristiche morfologiche delle cellule epiteliali di organi umani derivate dal colon ascendente di un donatore normale (linea C103) in ogni fase sperimentale o punto temporale. Gli schemi negli strati superiori illustrano la configurazione sperimentale per ogni fase. b, Chip ibridi (schema a sinistra) può portare alla morfogenesi 3D di cellule epiteliali organoidi con viste di microscopia confocale dall'alto verso il basso prese in diverse posizioni Z (superiore, centrale e inferiore; vedere lo schema a destra e le corrispondenti linee tratteggiate). hanno mostrato caratteristiche morfologiche evidenti. F-actina (ciano), nucleo (grigio). c, Micrografie confocali a fluorescenza (vista angolata 3D) di cellule epiteliali derivate da organoidi coltivate in Transwell statico (TW; riquadro all'interno del riquadro tratteggiato bianco) rispetto al chip ibrido (immagine intera più grande) confrontando rispettivamente la morfologia 2D rispetto alla 3D. Una coppia di viste di sezione trasversale verticale 2D (riquadro nell'angolo in alto a destra; "XZ") mostrano anche caratteristiche 2D e 3D. Barra di scala, 100 µm. c Ristampato con il permesso del riferimento.4. Elsevier.
È possibile preparare controlli coltivando le stesse cellule (Caco-2 o cellule epiteliali di organoidi intestinali) in monostrati bidimensionali in condizioni di coltura statica convenzionali. In particolare, l'esaurimento dei nutrienti può verificarsi a causa della capacità di volume limitata dei microcanali (ovvero ~4 µL nel canale superiore nel design originale del chip intestinale). Pertanto, è possibile confrontare anche la morfologia epiteliale prima e dopo l'applicazione del flusso basolaterale.
Il processo di soft litografia deve essere eseguito in una camera bianca. Per ogni strato del chip (strati superiore e inferiore e membrane) e dei chip ibridi, sono state utilizzate diverse fotomaschere, fabbricate su wafer di silicio separati, poiché le altezze dei microcanali erano diverse. Le altezze target dei microcanali superiore e inferiore del chip sono rispettivamente di 500 µm e 200 µm. L'altezza target del canale del chip ibrido è di 200 µm.
Posizionare un wafer di silicio da 3 pollici in una capsula contenente acetone. Agitare delicatamente la capsula per 30 secondi, quindi lasciare asciugare il wafer all'aria. Trasferire il wafer su una capsula contenente IPA (alcol isopropilico), quindi far ruotare la capsula per 30 secondi per pulirla.
Per massimizzare la rimozione dei residui organici dalla superficie del wafer di silicio, è possibile utilizzare, facoltativamente, una soluzione di piranha (miscela di perossido di idrogeno e acido solforico concentrato, 1:3 (v/v)).
La soluzione di piranha è estremamente corrosiva e genera calore. Sono necessarie ulteriori precauzioni di sicurezza. Per lo smaltimento dei rifiuti, lasciare raffreddare la soluzione e trasferirla in un contenitore per rifiuti pulito e asciutto. Utilizzare contenitori secondari ed etichettare correttamente i contenitori dei rifiuti. Si prega di seguire le linee guida di sicurezza della struttura per procedure più dettagliate.
Disidratare le cialde posizionandole su una piastra riscaldante a 200 °C per 10 minuti. Dopo la disidratazione, le cialde sono state agitate cinque volte all'aria per raffreddarle.
Versare circa 10 g di fotoresist SU-8 2100 al centro del wafer di silicio pulito. Utilizzare delle pinzette per distribuire uniformemente il fotoresist sul wafer. Occasionalmente, posizionare il wafer su una piastra riscaldante a 65 °C per rendere il fotoresist meno appiccicoso e più facile da distribuire. Non posizionare il wafer direttamente sulla piastra riscaldante.
Il SU-8 è stato distribuito uniformemente sul wafer mediante spin coating. Programmare una rotazione in entrata del SU-8 per 5-10 s per propagarsi a 500 rpm con un'accelerazione di 100 rpm/s. Impostare la rotazione principale per una modellazione di spessore 200 µm a 1.500 rpm, oppure ottenere uno spessore di 250 µm (creando un'altezza di 500 µm per lo strato superiore del nucleo sul chip; vedere "Fasi critiche" di seguito) impostato a un'accelerazione di 300 rpm/s per 30 secondi a 1.200 rpm.
La velocità di rotazione principale può essere regolata in base allo spessore desiderato del pattern in SU-8 sul wafer di silicio.
Per fabbricare pattern di SU-8 di 500 µm di altezza per lo strato superiore dell'intestino sul chip, le fasi di spin coating e soft bake di questo riquadro (fasi 7 e 8) sono state ripetute in sequenza (vedere la fase 9) per produrre due strati di SU-8 di 250 µm di spessore, che possono essere sovrapposti e uniti mediante esposizione UV nella fase 12 di questo riquadro, creando uno strato di 500 µm di altezza.
Preriscaldare gradualmente i wafer rivestiti di SU-8 posizionandoli con cura su una piastra riscaldante a 65 °C per 5 minuti, quindi impostare la temperatura a 95 °C e incubare per altri 40 minuti.
Per ottenere un'altezza di 500 μm del motivo in SU-8 nel microcanale superiore, ripetere i passaggi 7 e 8 per generare due strati di SU-8 spessi 250 μm.
Utilizzando l'allineatore per maschere UV, eseguire un test della lampada secondo le istruzioni del produttore per calcolare il tempo di esposizione del wafer. (tempo di esposizione, ms) = (dose di esposizione, mJ/cm2)/(potenza della lampada, mW/cm2).
Dopo aver determinato il tempo di esposizione, posizionare la fotomaschera sul supporto della maschera dell'allineatore per maschere UV e posizionare la fotomaschera sul wafer rivestito in SU-8.
Posizionare la superficie stampata della fotomaschera direttamente sul lato del wafer di silicio rivestito in SU-8 per ridurre al minimo la dispersione UV.
Esporre il wafer rivestito in SU-8 e la fotomaschera verticalmente a una luce UV di 260 mJ/cm2 per il tempo di esposizione predeterminato (vedere il passaggio 10 di questo riquadro).
Dopo l'esposizione ai raggi UV, i wafer di silicio rivestiti con SU-8 sono stati cotti a 65 °C per 5 minuti e a 95 °C per 15 minuti su ciascuna piastra riscaldante per realizzare strutture con un'altezza di 200 μm. Estendere il tempo di post-cottura a 95 °C a 30 minuti per realizzare strutture con un'altezza di 500 μm.
Il rivelatore viene versato in una capsula di vetro e il wafer cotto viene posizionato al suo interno. Il volume del rivelatore SU-8 può variare a seconda delle dimensioni della capsula di vetro. Assicurarsi di utilizzare una quantità sufficiente di rivelatore SU-8 per rimuovere completamente l'SU-8 non esposto. Ad esempio, quando si utilizza una capsula di vetro di 150 mm di diametro con una capacità di 1 litro, utilizzare circa 300 ml di rivelatore SU-8. Sviluppare lo stampo per 25 minuti ruotandolo delicatamente di tanto in tanto.
Risciacquare lo stampo sviluppato con circa 10 ml di sviluppatore fresco, seguito da IPA, spruzzando la soluzione con una pipetta.
Posizionare il wafer in un pulitore al plasma ed esporlo al plasma di ossigeno (gas atmosferico, pressione target 1 × 10−5 Torr, potenza 125 W) per 1,5 minuti.
Posizionare il wafer in un essiccatore sottovuoto con un vetrino all'interno. Wafer e vetrini possono essere posizionati uno accanto all'altro. Se l'essiccatore sottovuoto è diviso in più strati da una piastra, posizionare i vetrini nella camera inferiore e i wafer nella camera superiore. Versare 100 μL di soluzione di tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil)silano su un vetrino e applicare il vuoto per la silanizzazione.
Scongelare una fiala di cellule Caco-2 congelate in un bagno termostatico a 37 °C, quindi trasferire le cellule scongelate in una fiasca T75 contenente 15 mL di terreno di coltura Caco-2 preriscaldato a 37 °C.
Per far passare le cellule Caco-2 a una confluenza di circa il 90%, riscaldare innanzitutto il terreno di coltura Caco-2, PBS e tripsina allo 0,25%/EDTA 1 mM in un bagno termostatico a 37 °C.
Aspirare il terreno di coltura mediante aspirazione sottovuoto. Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS caldo ripetendo l'aspirazione sottovuoto e aggiungendo PBS fresco.