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Die Morphogenese des menschlichen Darms etabliert die Krypten-Zotten-Struktur der dreidimensionalen epithelialen Mikroarchitektur und räumlichen Organisation. Diese einzigartige Struktur ist notwendig, um die Darmhomöostase aufrechtzuerhalten, indem sie die Stammzellnische in der basalen Krypte vor exogenen mikrobiellen Antigenen und deren Metaboliten schützt. Darüber hinaus stellen Darmzotten und sezernierter Schleim funktionell differenzierte Epithelzellen mit einer Schutzbarriere auf der Darmschleimhaut dar. Daher ist die Nachbildung dreidimensionaler Epithelstrukturen entscheidend für die Entwicklung von In-vitro-Darmmodellen. Insbesondere kann das organische Darmmodell auf einem Chip die spontane dreidimensionale Morphogenese des Darmepithels mit verbesserten physiologischen Funktionen und biomechanischen Eigenschaften induzieren. Wir stellen hier ein reproduzierbares Protokoll vor, um die Darmmorphogenese sowohl auf einem mikrofluidischen Chip als auch auf einem Transwell-integrierten Hybridchip robust zu induzieren. Wir beschreiben detaillierte Methoden zur Geräteherstellung und zur Kultivierung von Caco-2-Zellen oder intestinalen Zellen. Organoide Epithelzellen werden sowohl in konventionellen Umgebungen als auch auf einer mikrofluidischen Plattform kultiviert. Die Induktion der 3D-Morphogenese und die Charakterisierung etablierter 3D-Epithelien erfolgen mittels verschiedener Bildgebungsverfahren. Dieses Protokoll ermöglicht die Regeneration einer funktionellen Darmmikroarchitektur durch die Kontrolle des basolateralen Flüssigkeitsflusses über 5 Tage. Unsere In-vitro-Morphogenesemethode nutzt physiologisch relevante Scherkräfte und mechanische Bewegungen und erfordert keine komplexe Zellmanipulation oder -optimierung, wodurch sie anderen bestehenden Techniken überlegen sein könnte. Wir gehen davon aus, dass unser vorgeschlagenes Protokoll weitreichende Implikationen für die biomedizinische Forschungsgemeinschaft haben und eine Methode zur In-vitro-Regeneration von 3D-Darmepithelschichten für biomedizinische, klinische und pharmazeutische Anwendungen bieten könnte.
Experimente zeigen, dass intestinale Epithelzellen der Linie Caco-2, die in Darm-auf-einem-Chip^1,2,3,4,5 oder in mikrofluidischen Zweischichtsystemen^6,7 kultiviert werden, in vitro spontan eine dreidimensionale Morphogenese durchlaufen können, ohne dass der zugrundeliegende Mechanismus vollständig verstanden ist. In unserer jüngsten Studie fanden wir heraus, dass die Entfernung basolateral sezernierter Morphogenantagonisten aus den Kultursystemen notwendig und ausreichend ist, um in vitro eine dreidimensionale Epithelmorphogenese auszulösen. Dies wurde sowohl an Caco-2-Zellen als auch an patienteneigenen intestinalen Organoiden gezeigt. Epithelzellen wurden validiert. In dieser Studie konzentrierten wir uns speziell auf die Zellproduktion und Konzentrationsverteilung des potenten Wnt-Antagonisten Dickkopf-1 (DKK-1) in Darm-auf-einem-Chip-Systemen und modifizierten mikrofluidischen Systemen mit Transwell-Einsätzen, den sogenannten „Hybrid-Chips“. Wir zeigen, dass die Zugabe exogener Wnt-Antagonisten (wie DKK-1, Wnt-Repressor 1, sezerniertes Frizzled-verwandtes Protein 1 oder Soggy-1) zum Darm auf dem Chip die Morphogenese hemmt oder die prästrukturierte 3D-Epithelschicht stört. Dies deutet darauf hin, dass antagonistischer Stress während der Kultivierung für die intestinale Morphogenese in vitro verantwortlich ist. Ein praktischer Ansatz zur Erzielung einer robusten Morphogenese an der Epithelgrenzfläche besteht daher darin, die Konzentrationen von Wnt-Antagonisten im basolateralen Kompartiment durch aktives Spülen (z. B. in Darm-auf-einem-Chip- oder Hybrid-auf-einem-Chip-Plattformen) oder Diffusion zu entfernen oder zumindest auf einem Minimum zu halten. Basolaterale Medien (z. B. von Transwell-Einsätzen in große basolaterale Reservoirs in Wells).
In diesem Protokoll beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Herstellung von Darm-auf-einem-Chip-Mikrogeräten und Transwell-kompatiblen Hybridchips (Schritte 1–5) zur Kultivierung von Darmepithelzellen auf porösen Membranen aus Polydimethylsiloxan (PDMS) (Schritte 6A, 7A, 8, 9) oder Polyestermembranen von Transwell-Einsätzen (Schritte 6B, 7B, 8, 9) und zur Induktion der 3D-Morphogenese in vitro (Schritt 10). Mithilfe verschiedener Bildgebungsverfahren identifizierten wir zelluläre und molekulare Merkmale, die auf gewebespezifische Histogenese und linienabhängige Zelldifferenzierung hinweisen (Schritte 11–24). Die Morphogenese wurde mit humanen Darmepithelzellen, wie z. B. Caco-2-Zellen oder intestinalen Organoiden, in zwei Kulturformaten induziert. Die technischen Details umfassen die Oberflächenmodifizierung poröser Membranen, die Erzeugung von 2D-Monolagen sowie die biochemische und biomechanische Reproduktion des Darms. Mikroumgebung in vitro. Um die 3D-Morphogenese aus 2D-Epithelmonolagen zu induzieren, entfernten wir Morphogenantagonisten in beiden Kulturformen, indem wir das Medium in das basolaterale Kompartiment der Kultur leiteten. Abschließend demonstrieren wir den Nutzen einer regenerierbaren 3D-Epithelschicht, die zur Modellierung von morphogenabhängigem Epithelwachstum, longitudinalen Wirt-Mikrobiom-Kokulturen, Pathogeninfektionen, Entzündungsschäden, Epithelbarriere-Dysfunktion und probiotikabasierten Therapien verwendet werden kann.
Unser Protokoll könnte für ein breites Spektrum von Wissenschaftlern in der Grundlagenforschung (z. B. Darmmukosabiologie, Stammzellbiologie und Entwicklungsbiologie) sowie in der angewandten Forschung (z. B. präklinische Arzneimittelprüfung, Krankheitsmodellierung, Tissue Engineering und Gastroenterologie) von Nutzen sein. Aufgrund der Reproduzierbarkeit und Robustheit unseres Protokolls zur Induktion der 3D-Morphogenese des Darmepithels in vitro gehen wir davon aus, dass unsere technische Strategie für Forschergruppen, die die Dynamik der Zellsignalisierung während der Darmentwicklung, -regeneration oder -homöostase untersuchen, von Nutzen sein wird. Darüber hinaus eignet sich unser Protokoll zur Untersuchung von Infektionen mit verschiedenen Erregern wie Norovirus 8, SARS-CoV-2, Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 oder Vibrio cholerae. Auch die Untersuchung von Krankheitspathologie und Pathogenese ist hilfreich. Der Einsatz eines On-Chip-Mikrophysiologiesystems für den Darm ermöglicht longitudinale Kokulturen¹⁰ und die anschließende Beurteilung der Wirtsabwehr, der Immunantworten und der Reparatur pathogenbedingter Schäden im Gastrointestinaltrakt¹¹. Andere gastrointestinale Erkrankungen wie das Leaky-Gut-Syndrom, Zöliakie, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Pouchitis oder das Reizdarmsyndrom lassen sich simulieren, indem dreidimensionale Darmepithelschichten aus den dreidimensionalen Darmepithelschichten des Patienten hergestellt werden. Zu diesen Erkrankungen zählen Zottenatrophie, Kryptenverkürzung, Schleimhautschädigung oder eine gestörte Epithelbarriere. Biopsie- oder aus Stammzellen gewonnene Darmorganoide^12,13 können ebenfalls verwendet werden. Um die höhere Komplexität der Krankheitsumgebung besser abzubilden, können Anwender krankheitsrelevante Zelltypen, wie z. B. mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (PBMCs) des Patienten, in Modelle mit dreidimensionalen Darmzotten-Krypten-Mikroarchitekturen integrieren. gewebespezifische Immunzellen, 5.
Da die dreidimensionale Epithelmikrostruktur ohne Schnittpräparation fixiert und visualisiert werden kann, dürfte unsere Kartierung der raumzeitlichen Dynamik von Genen und Proteinen in epithelialen Nischen für Forscher im Bereich der räumlichen Transkriptomik und der hochauflösenden bzw. superauflösenden Bildgebung von Interesse sein. Darüber hinaus kann die longitudinale Interaktion zwischen Wirt und Mikrobiom (10, 14), die die Darmhomöostase koordiniert, in der dreidimensionalen Darmschleimhautschicht durch Kokultivierung verschiedener Mikroorganismen, mikrobieller Gemeinschaften oder der fäkalen Mikrobiota, insbesondere im Darm-auf-einem-Chip, etabliert werden. Dieser Ansatz ist besonders attraktiv für Forscher in den Bereichen Schleimhautimmunologie, Gastroenterologie, humanes Mikrobiom, Kulturomik und klinische Mikrobiologie, die bisher nicht kultivierte Darmmikrobiota im Labor ansiedeln möchten. Lässt sich unser In-vitro-Morphogenese-Protokoll an skalierbare Kulturformate wie Multiwell-Einsätze in 24-, 96- oder 384-Well-Platten anpassen, die die basolateralen Kompartimente kontinuierlich auffüllen, kann es auch an Entwickler von pharmazeutischen, biomedizinischen oder Hochdurchsatz-Screening- bzw. Validierungsplattformen für die Lebensmittelindustrie weitergegeben werden. Als Machbarkeitsnachweis haben wir kürzlich die Realisierbarkeit eines Multiplex-Hochdurchsatz-Morphogenese-Systems im 24-Well-Plattenformat demonstriert. Darüber hinaus sind bereits mehrere Organ-on-a-Chip-Produkte kommerzialisiert worden.^16,17,18 Daher kann die Validierung unserer In-vitro-Morphogenese-Methode beschleunigt und potenziell von zahlreichen Forschungslaboren, der Industrie sowie Regierungs- und Aufsichtsbehörden übernommen werden, um die Darmmikrobiota besser zu verstehen. Zelluläre Reprogrammierung der Darmmorphogenese in vitro auf transkriptomischer Ebene zum Testen von Arzneimitteln oder Biotherapeutika. Die Absorption und der Transport von Arzneimittelkandidaten wurden mithilfe von 3D-Darmsurrogaten oder mithilfe von kundenspezifischen oder kommerziellen Organ-on-a-Chip-Modellen untersucht, um die Reproduzierbarkeit des Darmmorphogeneseprozesses zu beurteilen.
Für die Untersuchung der intestinalen Epithelmorphogenese wurden bisher nur wenige humanrelevante Tiermodelle eingesetzt, hauptsächlich aufgrund fehlender praktikabler Protokolle zur Induktion dreidimensionaler Morphogenese in vitro. Tatsächlich basiert ein Großteil des aktuellen Wissens über die Darmmorphogenese auf Tierstudien (z. B. Zebrafische²⁰, Mäuse²¹ oder Hühner²²). Diese sind jedoch arbeits- und kostenintensiv, ethisch fragwürdig und bilden vor allem menschliche Entwicklungsprozesse nicht präzise ab. Zudem sind diese Modelle nur sehr eingeschränkt skalierbar. Unser Protokoll zur Regeneration dreidimensionaler Gewebestrukturen in vitro ist daher sowohl In-vivo-Tiermodellen als auch anderen traditionellen statischen 2D-Zellkulturmodellen überlegen. Wie bereits beschrieben, ermöglichte uns die Verwendung dreidimensionaler Epithelstrukturen die Untersuchung der räumlichen Verteilung differenzierter Zellen entlang der Krypten-Zotten-Achse als Reaktion auf verschiedene mukosale oder immunologische Reize. Dreidimensionale Epithelschichten bieten zudem Raum für die Untersuchung des Wettbewerbsverhaltens mikrobieller Zellen. Die Bildung räumlicher Nischen und die ökologische Evolution erfolgen in Reaktion auf Wirtsfaktoren (z. B. innere versus äußere Schleimschichten, Sekretion von IgA und antimikrobiellen Peptiden). Darüber hinaus ermöglicht die dreidimensionale Epithelmorphologie Einblicke in die Strukturierung der Darmmikrobiota und die synergistische Produktion mikrobieller Metaboliten (z. B. kurzkettiger Fettsäuren), welche die Zellorganisation und Stammzellnischen in den basalen Krypten prägen. Diese Merkmale lassen sich nur nachweisen, wenn dreidimensionale Epithelschichten in vitro etabliert werden.
Neben unserer Methode zur Erzeugung dreidimensionaler intestinaler Epithelstrukturen existieren verschiedene In-vitro-Methoden. Die intestinale Organoidkultur ist eine hochmoderne Technik des Tissue Engineering, die auf der Kultivierung intestinaler Stammzellen unter spezifischen Morphogenbedingungen basiert^23,24,25. Die Verwendung von 3D-Organoidmodellen für Transportanalysen oder Wirt-Mikrobiom-Kokulturen ist jedoch oft problematisch, da das Darmlumen im Organoid eingeschlossen ist und somit die Zufuhr von luminalen Komponenten wie mikrobiellen Zellen oder exogenen Antigenen eingeschränkt ist. Der Zugang zum Organoidlumen kann zwar mithilfe eines Mikroinjektors verbessert werden^26,27, diese Methode ist jedoch invasiv, arbeitsintensiv und erfordert Spezialkenntnisse. Darüber hinaus spiegeln traditionelle Organoidkulturen, die in Hydrogelgerüsten unter statischen Bedingungen gehalten werden, die aktive In-vivo-Biomechanik nicht präzise wider.
Andere Ansätze verschiedener Forschungsgruppen nutzen vorstrukturierte 3D-Hydrogelgerüste, um die Darmepithelstruktur durch Kultivierung isolierter menschlicher Darmzellen auf der Geloberfläche nachzubilden. Die Hydrogelgerüste werden mittels 3D-Druck, Mikrofräsen oder lithografisch hergestellter Formen gefertigt. Diese Methode ermöglicht die selbstorganisierte Anordnung isolierter Epithelzellen in vitro mit physiologisch relevanten Morphogengradienten. Dadurch entsteht eine Epithelstruktur mit hohem Aspektverhältnis und eine Wechselwirkung zwischen Stroma und Epithel durch Einbettung von Stromazellen in das Gerüst. Die Beschaffenheit vorstrukturierter Gerüste kann jedoch die Darstellung des spontanen morphogenetischen Prozesses selbst verhindern. Diese Modelle bieten auch keine dynamische Strömung im Lumen oder Interstitium und es fehlt ihnen die Scherkraft, die Darmzellen für die Morphogenese und die Erlangung physiologischer Funktionen benötigen. Eine weitere aktuelle Studie nutzte Hydrogelgerüste in einer mikrofluidischen Plattform und strukturierte Darmepithelzellen mittels Laserätzverfahren. Intestinale Organoide folgen geätzten Mustern und bilden so röhrenförmige Darmstrukturen. Der intraluminale Flüssigkeitsfluss lässt sich mithilfe eines Mikrofluidikmoduls nachbilden. Dieses Modell zeigt jedoch weder spontane morphogenetische Prozesse noch mechanobiologische Bewegungen des Darms. 3D-Drucktechniken derselben Arbeitsgruppe ermöglichten die Herstellung miniaturisierter Darmröhren mit spontanen morphogenetischen Prozessen. Trotz der komplexen Herstellung verschiedener Darmsegmente innerhalb der Röhre weist auch dieses Modell keinen luminalen Flüssigkeitsfluss und keine mechanische Deformation auf. Zudem kann die Anwendbarkeit des Modells eingeschränkt sein, insbesondere nach Abschluss des Bioprinting-Prozesses, da dies die experimentellen Bedingungen oder Zell-Zell-Interaktionen beeinflussen kann. Unser vorgeschlagenes Protokoll hingegen ermöglicht spontane Darmmorphogenese, physiologisch relevante Scherkräfte, eine die Darmmotilität nachahmende Biomechanik, die Zugänglichkeit unabhängiger apikaler und basolateraler Kompartimente sowie die Nachbildung komplexer, modularer biologischer Mikroumgebungen. Daher stellt unser In-vitro-3D-Morphogenese-Protokoll einen komplementären Ansatz dar, um die Herausforderungen bestehender Methoden zu bewältigen.
Unser Protokoll konzentriert sich vollständig auf die dreidimensionale Epithelmorphogenese. Dabei werden ausschließlich Epithelzellen kultiviert, ohne dass andere umgebende Zelltypen wie Mesenchymzellen, Endothelzellen oder Immunzellen vorhanden sind. Wie bereits beschrieben, besteht der Kern unseres Protokolls in der Induktion der Epithelmorphogenese durch Entfernung von Morphogeninhibitoren, die an der basolateralen Seite des zugeführten Mediums sezerniert werden. Die robuste Modularität unserer Darm-auf-einem-Chip- und Hybrid-auf-einem-Chip-Systeme ermöglicht zwar die Nachbildung der wellenförmigen dreidimensionalen Epithelschicht, jedoch müssen weitere biologische Komplexitäten wie epithelial-mesenchymale Interaktionen^33,34, die Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM)³⁵ und, in unserem Modell, Krypten-Zotten-Strukturen, die Stammzellnischen in den basalen Krypten bilden, noch genauer untersucht werden. Stromazellen (z. B. Fibroblasten) im Mesenchym spielen eine Schlüsselrolle bei der Produktion von ECM-Proteinen und der Regulation der intestinalen Morphogenese. Die Zugabe mesenchymaler Zellen zu unserem Modell verbesserte den morphogenetischen Prozess und die Zelladhäsionseffizienz. Die Endothelschicht (d. h. Kapillaren oder Lymphgefäße) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Molekültransports³⁹ und der Rekrutierung von Immunzellen⁴⁰ im Darmmikromilieu. Darüber hinaus sind Gefäßkomponenten, die zwischen Gewebemodellen verbunden werden können, eine Voraussetzung für die Entwicklung von Gewebemodellen zur Darstellung von Interaktionen zwischen mehreren Organen. Daher kann die Einbeziehung von Endothelzellen erforderlich sein, um physiologische Merkmale mit höherer Auflösung auf Organebene genauer abzubilden. Patienteneigene Immunzellen sind ebenfalls essenziell für die Darstellung angeborener Immunantworten, der Antigenpräsentation, der Interaktion zwischen angeborener und adaptiver Immunität sowie der gewebespezifischen Immunität im Kontext der Nachahmung von Darmerkrankungen.
Die Verwendung von Hybridchips ist unkomplizierter als die von Darm-auf-einem-Chip-Systemen, da der Geräteaufbau einfacher ist und die Verwendung von Transwell-Einsätzen eine skalierbare Kultivierung von Darmepithelzellen ermöglicht. Kommerziell erhältliche Transwell-Einsätze mit Polyestermembranen sind jedoch nicht elastisch und können keine peristaltischen Bewegungen simulieren. Darüber hinaus blieb das apikale Kompartiment des im Hybridchip platzierten Transwell-Einsatzes stationär, ohne dass Scherkräfte auf der apikalen Seite auftraten. Offensichtlich ermöglichen die statischen Eigenschaften im apikalen Kompartiment selten eine langfristige bakterielle Kokultur in Hybridchips. Obwohl wir mit Hybridchips eine robuste 3D-Morphogenese in Transwell-Einsätzen induzieren können, kann der Mangel an physiologisch relevanter Biomechanik und apikaler Flüssigkeitsströmung die Anwendbarkeit von Hybridchip-Plattformen für potenzielle Anwendungen einschränken.
Die vollständige Rekonstruktion der menschlichen Krypten-Zotten-Achse in Darm-auf-einem-Chip- und Hybrid-auf-einem-Chip-Kulturen ist noch nicht vollständig etabliert. Da die Morphogenese von einer epithelialen Monolage ausgeht, bieten 3D-Mikroarchitekturen nicht zwangsläufig morphologische Ähnlichkeit mit Krypten in vivo. Obwohl wir die proliferierende Zellpopulation nahe der basalen Kryptendomäne im mikrostrukturierten 3D-Epithel charakterisiert haben, waren die Krypten- und Zottenregionen nicht klar abgegrenzt. Obwohl höhere obere Kanäle auf dem Chip zu einer größeren Höhe des mikrostrukturierten Epithels führen, ist die maximale Höhe weiterhin auf etwa 300–400 µm begrenzt. Die tatsächliche Tiefe der menschlichen Darmkrypten im Dünn- und Dickdarm beträgt etwa 135 µm bzw. 400 µm, und die Höhe der Dünndarmzotten beträgt etwa 600 µm.⁴¹
Aus bildgebender Sicht ist die In-situ-Superauflösungsbildgebung von 3D-Mikroarchitekturen möglicherweise auf den Darm auf einem Chip beschränkt, da der erforderliche Arbeitsabstand zwischen Objektiv und Epithelschicht in der Größenordnung von wenigen Millimetern liegt. Um dieses Problem zu überwinden, kann ein weiter entferntes Objektiv erforderlich sein. Darüber hinaus ist die Herstellung dünner Schnitte für die Probenpräparation aufgrund der hohen Elastizität von PDMS eine Herausforderung. Da die schichtweise Mikrostrukturierung des Darms auf einem Chip eine permanente Adhäsion zwischen den einzelnen Schichten bedingt, ist es äußerst schwierig, die oberste Schicht zu öffnen oder zu entfernen, um die Oberflächenstruktur der Epithelschicht zu untersuchen, beispielsweise mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops (REM).
Die Hydrophobie von PDMS stellt in mikrofluidischen Studien mit hydrophoben kleinen Molekülen einen limitierenden Faktor dar, da PDMS solche Moleküle unspezifisch adsorbieren kann. Alternativen zu PDMS könnten andere Polymermaterialien sein. Alternativ kann eine Oberflächenmodifizierung von PDMS (z. B. Beschichtung mit lipophilen Materialien⁴² oder Polyethylenglykol⁴³) in Betracht gezogen werden, um die Adsorption hydrophober Moleküle zu minimieren.
Schließlich ist unsere Methode hinsichtlich ihrer Eignung für ein Hochdurchsatz-Screening oder eine universell einsetzbare, benutzerfreundliche experimentelle Plattform noch nicht ausreichend charakterisiert. Das aktuelle Protokoll erfordert eine Spritzenpumpe pro Mikrogerät, was Platz im CO₂-Inkubator beansprucht und groß angelegte Experimente verhindert. Diese Einschränkung lässt sich durch die Skalierbarkeit innovativer Kulturformate (z. B. poröse Einsätze mit 24, 96 oder 384 Wells, die ein kontinuierliches Nachfüllen und Entfernen des basolateralen Mediums ermöglichen) deutlich verbessern.
Um die 3D-Morphogenese des menschlichen Darmepithels in vitro zu induzieren, verwendeten wir einen mikrofluidischen Chip mit zwei parallelen Mikrokanälen und einer dazwischenliegenden elastischen, porösen Membran zur Erzeugung einer Lumen-Kapillar-Grenzfläche. Wir demonstrieren außerdem die Anwendung eines Einkanal-Mikrofluidik-Chips (eines Hybrid-Chips), der einen kontinuierlichen basolateralen Fluss unterhalb polarisierter Epithelschichten ermöglicht, die auf Transwell-Einsätzen kultiviert wurden. Auf beiden Plattformen lässt sich die Morphogenese verschiedener menschlicher Darmepithelzellen durch gezielte Flussmanipulation demonstrieren, um Morphogen-Antagonisten aus dem basolateralen Kompartiment zu entfernen. Das gesamte experimentelle Verfahren (Abbildung 1) besteht aus fünf Teilen: (i) Mikrofabrikation des Darm-Chips oder des in Transwell-Einsätze einsetzbaren Hybrid-Chips (Schritte 1–5; Kasten 1), (ii) Präparation von Darmepithelzellen (Caco-2-Zellen) oder menschlichen Darmorganoiden; Kästchen 2–5), (iii) Kultivierung von Darmepithelzellen auf Darmchips oder Hybridchips (Schritte 6–9), (iv) Induktion der 3D-Morphogenese in vitro (Schritt 10) und (v) Charakterisierung der 3D-Mikrostruktur des Epithels (Schritte 11–24). Abschließend wurde eine geeignete Kontrollgruppe (weiter unten beschrieben) entworfen, um die Effektivität der In-vitro-Morphogenese durch Vergleich der Epithelmorphogenese mit räumlichen, zeitlichen, konditionalen oder verfahrenstechnischen Kontrollen zu validieren.
Wir verwendeten zwei verschiedene Kulturplattformen: Darm-auf-einem-Chip mit geraden oder nichtlinearen, gewundenen Kanälen sowie Hybrid-Chips mit Transwell-Einsätzen (TW) in einem mikrofluidischen Chip, hergestellt wie in Box 1 und den Schritten 1–5 beschrieben. „Geräteherstellung“ zeigt die Hauptschritte zur Herstellung eines Einzelchips oder eines Hybrid-Chips. „Kultur menschlicher Darmepithelzellen“ erläutert die Zellquelle (Caco-2-Zellen oder menschliche Darmorganoide) und das in diesem Protokoll verwendete Kulturverfahren. „In-vitro-Morphogenese“ zeigt die einzelnen Schritte der Kultivierung von Caco-2- oder Organoid-abgeleiteten Epithelzellen auf einem Darm-Chip oder auf Transwell-Einsätzen eines Hybrid-Chips, gefolgt von der Induktion der 3D-Morphogenese und der Bildung einer charakterisierten Epithelstruktur. Die Programmschritt- oder Boxnummer wird unter jedem Pfeil angezeigt. Die Anwendung liefert Beispiele für die Verwendung etablierter Darmepithelschichten, beispielsweise zur Charakterisierung der Zelldifferenzierung, für Studien zur Darmphysiologie und zur Etablierung von … Wirt-Mikrobiom-Ökosysteme und Krankheitsmodellierung. Immunfluoreszenzaufnahmen in „Zelldifferenzierung“ zeigen Zellkerne, F-Aktin und MUC2, die in der auf dem Darmchip generierten 3D-Caco-2-Epithelschicht exprimiert werden. MUC2-Signalisierung ist in Becherzellen und im von Schleimhautoberflächen sezernierten Schleim vorhanden. Fluoreszenzaufnahmen in „Darmphysiologie“ zeigen Schleim, der durch Anfärbung von Sialinsäure- und N-Acetylglucosaminresten mit fluoreszierendem Weizenkeimagglutinin nachgewiesen wurde. Die beiden überlappenden Bilder in „Wirt-Mikroben-Kokulturen“ zeigen repräsentative Wirt-Mikrobiom-Kokulturen im Darm auf einem Chip. Das linke Bild zeigt die Kokultur von E. coli, das grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert, mit mikrostrukturierten 3D-Caco-2-Epithelzellen. Das rechte Bild zeigt die Lokalisierung von GFP-exprimierenden E. coli in Kokultur mit 3D-Caco-2-Epithelzellen, gefolgt von einer Immunfluoreszenzfärbung mit F-Aktin. (rot) und Zellkerne (blau). Die Krankheitsmodellierung veranschaulicht einen gesunden versus einen durchlässigen Darm in Darmentzündungs-Chips unter physiologischer Belastung mit bakteriellen Antigenen (z. B. Lipopolysaccharid, LPS) und Immunzellen (z. B. PBMC; grün). Caco-2-Zellen wurden kultiviert, um eine dreidimensionale Epithelschicht zu etablieren. Maßstabsbalken: 50 µm. Abbildungen in der unteren Reihe: „Differenzierung von Zellen“ mit freundlicher Genehmigung aus Referenz 2, Oxford University Press; reproduziert mit freundlicher Genehmigung aus Referenz 5, NAS; „Wirt-Mikroben-Kokultur“ mit freundlicher Genehmigung aus Referenz 3, NAS; „Krankheitsmodellierung“ mit freundlicher Genehmigung aus Referenz 5, NAS.
Sowohl Darm-auf-Chip- als auch Hybrid-Chips wurden mithilfe von PDMS-Repliken hergestellt, die mittels Weichlithographie aus Siliziumformen entformt wurden^1,44 und mit SU-8 strukturiert wurden. Die Gestaltung der Mikrokanäle in jedem Chip wird unter Berücksichtigung hydrodynamischer Faktoren wie Scherspannung und hydrodynamischem Druck bestimmt^1,4,12. Das ursprüngliche Darm-auf-Chip-Design (Ergänzende Abbildung 1a), bestehend aus zwei nebeneinanderliegenden parallelen geraden Mikrokanälen, wurde zu einem komplexen Darm-auf-Chip (Ergänzende Abbildung 1b) weiterentwickelt, der ein Paar gekrümmter Mikrokanäle umfasst, um eine erhöhte Flüssigkeitsverweilzeit, nichtlineare Strömungsmuster und mehrachsige Deformationen kultivierter Zellen zu induzieren (Abb. 2a–f)¹². Wenn komplexere Darmbiomechaniken nachgebildet werden sollen, können komplexe Darm-auf-Chips gewählt werden. Wir haben gezeigt, dass der gewundene Darm-Chip ebenfalls eine starke 3D-Morphogenese in einem ähnlichen Zeitrahmen mit einem ähnlichen Grad an … induziert. Im Vergleich zum ursprünglichen Darm-Chip wurde unabhängig vom Zelltyp ein Epithelwachstum beobachtet. Daher sind lineare und komplexe On-Chip-Darmstrukturen austauschbar, um eine 3D-Morphogenese zu induzieren. Auf Silikonformen mit SU-8-Mustern ausgehärtete PDMS-Repliken wiesen nach dem Entformen Negativstrukturen auf (Abb. 2a). Zur Herstellung des Darms auf einem Chip wurde die vorbereitete obere PDMS-Schicht nacheinander mit einem porösen PDMS-Film verbunden und anschließend mittels irreversibler Verbindung mit einem Corona-Beschichter mit der unteren PDMS-Schicht ausgerichtet (Abb. 2b–f). Zur Herstellung von Hybrid-Chips wurden ausgehärtete PDMS-Repliken auf Glasobjektträger geklebt, um einkanalige mikrofluidische Bauteile zu erzeugen, die Transwell-Einsätze aufnehmen können (Abb. 2h und Abb. 2 im Anhang). Der Klebeprozess erfolgt durch Behandlung der Oberflächen der PDMS-Replika und des Glases mit Sauerstoffplasma oder Corona-Beschichtung. Nach der Sterilisation des an den Silikonschlauch angeschlossenen mikrostrukturierten Bauteils war die Anordnung bereit für die Durchführung der 3D-Morphogenese. des Darmepithels (Abbildung 2g).
a) Schematische Darstellung der Herstellung von PDMS-Teilen aus SU-8-strukturierten Silikonformen. Die ungehärtete PDMS-Lösung wurde in eine Silikonform gegossen (links), bei 60 °C ausgehärtet (Mitte) und entformt (rechts). Das entformte PDMS wurde in Stücke geschnitten und für die weitere Verwendung gereinigt. b) Foto der Silikonform zur Herstellung der oberen PDMS-Schicht. c) Foto der Silikonform zur Herstellung der porösen PDMS-Membran. d) Fotoserie der oberen und unteren PDMS-Komponenten sowie des montierten On-Chip-Darmsystems. e) Schematische Darstellung der Ausrichtung der oberen, der Membran- und der unteren PDMS-Komponenten. Jede Schicht wird durch Plasma- oder Koronabehandlung irreversibel verbunden. f) Schematische Darstellung des hergestellten Darm-auf-einem-Chip-Systems mit überlagerten, gewundenen Mikrokanälen und Vakuumkammern. g) Aufbau des Darm-auf-einem-Chip-Systems für die mikrofluidische Zellkultur. Das mit einem Silikonschlauch und einer Spritze montierte Darm-auf-einem-Chip-System wurde auf einem Deckglas platziert. Die Vorrichtung wurde zur Weiterverarbeitung auf den Deckel einer 150-mm-Petrischale gelegt. Das Bindemittel dient zum Verschließen des Silikonschlauchs. Abb. h: Visuelle Momentaufnahmen der Hybridchip-Herstellung und der 3D-Morphogenese mithilfe von Hybridchips. Unabhängig hergestellte Transwell-Einsätze zur Kultivierung von 2D-Monolagen intestinaler Epithelzellen wurden in den Hybridchip eingesetzt, um die intestinale 3D-Morphogenese zu induzieren. Das Medium wird durch Mikrokanäle unterhalb der auf dem Transwell-Einsatz etablierten Zellschicht perfundiert. Maßstabsbalken: 1 cm. Abb. h: Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Elsevier (Referenz 4).
In diesem Protokoll wurden die Caco-2-Zelllinie und intestinale Organoide als Epithelzellen verwendet (Abb. 3a). Beide Zelltypen wurden unabhängig voneinander kultiviert (Box 2 und Box 5) und zur Besiedlung der mit extrazellulärer Matrix (ECM) beschichteten Mikrokanäle von On-Chip-Darm- oder Transwell-Einsätzen verwendet. Sobald die Zellen konfluent waren (>95 % Bedeckung in den Kulturflaschen), wurden routinemäßig kultivierte Caco-2-Zellen (zwischen Passage 10 und 50) in T-Kolben geerntet, um mittels Trypsinisierungslösung dissoziierte Zellsuspensionen herzustellen (Box 2). Menschliche intestinale Organoide aus Darmbiopsien oder chirurgischen Resektionen wurden in Matrigel-Gerüstkuppeln in 24-Well-Platten kultiviert, um die strukturelle Mikroumgebung zu unterstützen. Medium mit essentiellen Morphogenen (wie Wnt, R-Spondin und Noggin) und Wachstumsfaktoren, hergestellt wie in Box 3 beschrieben, wurde jeden zweiten Tag ergänzt, bis die Organoide auf ~500 Å angewachsen waren. Die Organoide haben einen Durchmesser von wenigen Mikrometern. Vollständig ausgewachsene Organoide werden geerntet und in Einzelzellen dissoziiert, um sie auf Darm- oder Transwell-Einsätze auf einem Chip auszusäen (Kasten 5). Wie bereits berichtet, können sie nach Krankheitstyp^12,13 (z. B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Kolorektalkarzinom oder gesundem Spender), Läsionsort (z. B. Läsion vs. nicht-lädiertes Areal) und gastrointestinaler Lage (z. B. Duodenum, Jejunum, Ileum, Zäkum, Kolon oder Rektum) differenziert werden. In Kasten 5 stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Kultivierung von Kolonorganoiden (Koloiden) bereit, die typischerweise höhere Morphogenkonzentrationen benötigen als Dünndarmorganoide.
a) Arbeitsablauf zur Induktion der Darmmorphogenese im Darmchip. In diesem Protokoll werden humane Caco-2-Darmepithelzellen und Darmorganoide verwendet, um die 3D-Morphogenese zu demonstrieren. Die isolierten Epithelzellen wurden in das vorbereitete Darm-auf-einem-Chip-System eingebracht (Chippräparation). Sobald die Zellen am Tag 0 (D0) eingebracht und an der porösen PDMS-Membran anhaften, wird der apikale Fluss (AP) initiiert und für die ersten zwei Tage aufrechterhalten (Fluss, AP, D0–D2). Der basolaterale Fluss (BL) wird ebenfalls initiiert, begleitet von zyklischen Dehnungsbewegungen (Dehnung, Fluss, AP und BL), sobald sich eine vollständige 2D-Monoschicht gebildet hat. Die intestinale 3D-Morphogenese erfolgte spontan nach fünf Tagen mikrofluidischer Kultur (Morphogenese, D5). Phasenkontrastbilder zeigen die repräsentative Morphologie der Caco-2-Zellen in jedem experimentellen Schritt bzw. Zeitpunkt (Balkendiagramm, 100 µm). Vier schematische Darstellungen veranschaulichen den Arbeitsablauf. Die entsprechenden Kaskaden der Darmmorphogenese (oben rechts). Die gestrichelten Pfeile in der schematischen Darstellung zeigen die Richtung des Flüssigkeitsflusses an. b) REM-Aufnahme der Oberflächenstruktur des etablierten 3D-Caco-2-Epithels (links). Der Ausschnitt mit dem vergrößerten Bereich (weiß gestrichelter Kasten) zeigt die regenerierten Mikrovilli auf der 3D-Caco-2-Schicht (rechts). c) Horizontale Frontalansicht von etabliertem 3D-Caco-2, Claudin (ZO-1, rot) und durchgehenden Bürstensaummembranen, markiert mit F-Aktin (grün) und Zellkernen (blau). Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie von Epithelzellen auf Darmchips. Die Pfeile in der Mitte der schematischen Darstellung zeigen die Position der Fokusebene für jede konfokale Ansicht an. d) Zeitlicher Verlauf der morphologischen Veränderungen in Organoiden, die auf einem Chip kultiviert wurden, aufgenommen mittels Phasenkontrastmikroskopie an den Tagen 3, 7, 9, 11 und 13. Der Ausschnitt (oben rechts) zeigt die hohe Vergrößerung der bereitgestellten Abb. e, DIC-Mikrofotografie des in einem Darmgewebeschnitt etablierten 3D-Organoidepithels, aufgenommen an Tag 7. f, Überlagerte Immunfluoreszenzbilder zeigen Marker für Stammzellen (LGR5; magenta), Becherzellen (MUC2; grün), F-Aktin (grau) und Zellkerne (cyan), die jeweils 3 Tage lang auf Darmchips kultiviert wurden (links), sowie 13 Tage alte Organoide (Mitte) auf der Epithelschicht. Siehe auch Abbildung 3 der erweiterten Daten, die die LGR5-Signalgebung ohne MUC2-Signalgebung hervorhebt. Fluoreszenzbilder zeigen die Epithelmikrostruktur (rechts) des in einem Darmgewebechip etablierten 3D-Organoidepithels durch Anfärbung der Plasmamembran mit CellMask-Farbstoff (rechts) an Tag 13 der Kultur. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm, sofern nicht anders angegeben. b Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 2. Oxford University Press; c Adaptiert mit freundlicher Genehmigung von Referenz 2. Oxford University Press; e und f wurden mit freundlicher Genehmigung unter Bezugnahme übernommen.12 Unter der Creative Commons Lizenz CC BY 4.0.
Für eine erfolgreiche ECM-Beschichtung ist es notwendig, die hydrophobe Oberfläche der porösen PDMS-Membran im Darm-auf-einem-Chip-System zu modifizieren. In diesem Protokoll wenden wir zwei verschiedene Methoden zur Modifizierung der Hydrophobie von PDMS-Membranen an. Für die Kultivierung von Caco-2-Zellen reichte die Oberflächenaktivierung durch UV/Ozon-Behandlung allein aus, um die Hydrophobie der PDMS-Oberfläche zu reduzieren, die ECM zu beschichten und Caco-2-Zellen an die PDMS-Membran anzuhaften. Die mikrofluidische Kultur von Organoid-Epithelzellen erfordert jedoch eine chemische Oberflächenfunktionalisierung, um eine effiziente Abscheidung von ECM-Proteinen durch sequenzielles Auftragen von Polyethylenimin (PEI) und Glutaraldehyd auf PDMS-Mikrokanäle zu erreichen. Nach der Oberflächenmodifizierung wurden ECM-Proteine ​​auf die funktionalisierte PDMS-Oberfläche aufgebracht und anschließend in das isolierte Organoid-Epithel eingebracht. Nach dem Anhaften der Zellen beginnt die mikrofluidische Zellkultur, indem zunächst nur Medium in den oberen Mikrokanal perfundiert wird, bis die Zellen eine vollständige Monolage bilden, während im unteren Mikrokanal statische Bedingungen aufrechterhalten werden. Diese optimierte Methode zur Oberflächenaktivierung und Die ECM-Beschichtung ermöglicht die Anhaftung von Organoidepithel und induziert so eine dreidimensionale Morphogenese auf der PDMS-Oberfläche.
Transwell-Kulturen benötigen vor der Zellsaat ebenfalls eine ECM-Beschichtung; allerdings sind keine komplexen Vorbehandlungsschritte zur Aktivierung der Oberfläche poröser Einsätze erforderlich. Bei der Kultivierung von Caco-2-Zellen auf Transwell-Einsätzen beschleunigt die ECM-Beschichtung die Anhaftung dissoziierter Caco-2-Zellen (< 1 Stunde) und die Ausbildung von Tight Junctions (< 1–2 Tage). Zur Kultivierung von Organoiden auf Transwell-Einsätzen werden isolierte Organoide auf ECM-beschichtete Einsätze ausgesät, haften an der Membranoberfläche (< 3 h) und werden so lange kultiviert, bis sie eine vollständige Monolage mit intakter Barriere bilden. Transwell-Kulturen werden in 24-Well-Platten ohne Verwendung von Hybridchips durchgeführt.
Die dreidimensionale Morphogenese in vitro kann durch Anlegen eines Flüssigkeitsstroms an die basolaterale Seite einer etablierten Epithelschicht initiiert werden. Im Darm-auf-einem-Chip-Modell begann die Epithelmorphogenese mit der Perfusion des Mediums in die oberen und unteren Mikrokanäle (Abb. 3a). Wie bereits beschrieben, ist die Einleitung eines Flüssigkeitsstroms in das untere (basolaterale) Kompartiment entscheidend für die kontinuierliche Entfernung gerichtet sezernierter Morphogeninhibitoren. Um die an poröse Membranen gebundenen Zellen mit ausreichend Nährstoffen und Serum zu versorgen und eine luminale Scherkraft zu erzeugen, wenden wir im Darm-auf-einem-Chip-Modell typischerweise einen dualen Fluss an. In Hybridchips wurden Transwell-Einsätze mit Epithelmonolagen in die Hybridchips eingesetzt. Anschließend wurde das Medium durch den Mikrokanal unter die basolaterale Seite des porösen Transwell-Einsatzes appliziert. Die intestinale Morphogenese erfolgte in beiden Kulturplattformen 3–5 Tage nach Beginn des basolateralen Flusses.
Die morphologischen Merkmale mikrostrukturierter 3D-Epithelschichten lassen sich mithilfe verschiedener Bildgebungsverfahren analysieren, darunter Phasenkontrastmikroskopie, Differenzialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC), Rasterelektronenmikroskopie (REM) oder Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie (Abbildungen 3 und 4). Phasenkontrast- oder DIC-Bildgebung kann jederzeit während der Kultivierung durchgeführt werden, um Form und Ausstülpung der 3D-Epithelschichten zu überwachen. Dank der optischen Transparenz von PDMS- und Polyesterfolien ermöglichen sowohl die Darm-auf-einem-Chip- als auch die Hybrid-Chip-Plattformen Echtzeit-In-situ-Bildgebung ohne Schneiden oder Demontage des Geräts. Bei der Immunfluoreszenz-Bildgebung (Abbildungen 1, 3c, f und 4b, c) werden die Zellen typischerweise mit 4 % (w/v) Paraformaldehyd (PFA), gefolgt von Triton X-100 und 2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) fixiert. Je nach Zelltyp werden unterschiedliche Fixiermittel verwendet. Permeabilisierungsmittel und Blockierungsmittel können verwendet werden. Primäre Antikörper gegen zelllinienabhängige oder regionsspezifische Marker dienen der Markierung von in situ auf dem Chip immobilisierten Zellen. Anschließend werden sekundäre Antikörper zusammen mit einem Gegenfärbemittel eingesetzt, das entweder den Zellkern (z. B. 4′,6-Diamidino-2-phenylenindol, DAPI) oder F-Aktin (z. B. fluoreszenzmarkiertes Phalloidin) markiert. Fluoreszenzbasierte Lebendzellmikroskopie kann ebenfalls in situ durchgeführt werden, um die Schleimproduktion (Abb. 1, „Zelldifferenzierung“ und „Darmphysiologie“), die zufällige Besiedlung durch Mikroorganismen (Abb. 1, „Wirt-Mikroben-Kokultur“), die Rekrutierung von Immunzellen (Abb. 1, „Krankheitsmodellierung“) oder die Konturen der dreidimensionalen Epithelmorphologie (Abb. 3c,f und 4b,c) zu detektieren. Bei der Modifizierung des Darms auf dem Chip zur Trennung der oberen Schicht von der unteren Mikrokanalschicht, wie in [Referenz einfügen] beschrieben, … Wie in Abb. 2 gezeigt, lassen sich die dreidimensionale Epithelmorphologie sowie die Mikrovilli am apikalen Bürstensaum mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) darstellen (Abb. 3b). Die Expression von Differenzierungsmarkern kann durch quantitative PCR⁵ oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung analysiert werden. Hierfür werden dreidimensionale Epithelzellschichten, die in Darm- oder Hybridchips kultiviert wurden, durch Trypsinisierung geerntet und anschließend für molekulare oder genetische Analysen verwendet.
a) Arbeitsablauf zur Induktion der intestinalen Morphogenese in einem Hybridchip. Caco-2-Zellen und intestinale Organoide werden in diesem Protokoll verwendet, um die 3D-Morphogenese in einer Hybridchip-Plattform zu demonstrieren. Dissoziierte Epithelzellen wurden in vorbereitete Transwell-Einsätze (TW-Präparation; siehe Abbildung unten) ausgesät. Nachdem die Zellen in den Transwell-Einsätzen ausgesät und an Polyestermembranen gebunden waren, wurden alle Zellen unter statischen Bedingungen kultiviert (TW-Kultur). Nach 7 Tagen wurde ein einzelner Transwell-Einsatz mit einer 2D-Monolage von Epithelzellen in einen Hybridchip integriert, um einen basolateralen Fluss (Flow, BL) einzuführen, der letztendlich zur Bildung einer 3D-Epithelschicht (Morphogenese) führte. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen zeigen morphologische Merkmale von menschlichen Organepithelzellen, die aus dem Colon ascendens eines gesunden Spenders (C103-Linie) stammen, zu jedem experimentellen Schritt bzw. Zeitpunkt. Die Schemata in den oberen Ebenen veranschaulichen die experimentelle Konfiguration für jeden Schritt. b) Hybridchips (linkes Schema) können zu … führen. Die 3D-Morphogenese von Organoid-Epithelzellen wurde mittels konfokaler Mikroskopie aus verschiedenen Z-Positionen (oben, Mitte und unten; siehe Schema rechts und zugehörige gestrichelte Linien) untersucht. Dabei zeigten sich deutliche morphologische Merkmale. F-Aktin (cyan), Zellkern (grau). c) Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie (3D-Schrägansicht) von Organoid-abgeleiteten Epithelzellen, die in statischen Transwell-Einsätzen (TW; Ausschnitt im weiß gestrichelten Kasten) bzw. auf einem Hybrid-Chip (größte Gesamtansicht) kultiviert wurden. Vergleich der 2D- und 3D-Morphologie. Zwei vertikale 2D-Querschnittsansichten (Ausschnitt oben rechts; „XZ“) zeigen ebenfalls 2D- und 3D-Merkmale. Maßstabsbalken: 100 µm. c) Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Elsevier (Referenz 4).
Kontrollen können durch Kultivierung derselben Zellen (Caco-2- oder intestinale Organoid-Epithelzellen) zu zweidimensionalen Monolagen unter herkömmlichen statischen Kulturbedingungen hergestellt werden. Zu beachten ist, dass es aufgrund des begrenzten Volumens der Mikrokanäle (d. h. ~4 µL im oberen Kanal des ursprünglichen Darm-Chip-Designs) zu Nährstoffmangel kommen kann. Daher kann auch die Epithelmorphologie vor und nach Anwendung des basolateralen Flusses verglichen werden.
Der Softlithographieprozess sollte in einem Reinraum durchgeführt werden. Für jede Schicht auf dem Chip (obere und untere Schicht sowie Membranen) und den Hybridchips wurden unterschiedliche Fotomasken verwendet und auf separaten Siliziumwafern hergestellt, da die Mikrokanalhöhen unterschiedlich waren. Die Zielhöhen der oberen und unteren Mikrokanäle des Chips betragen 500 µm bzw. 200 µm. Die Zielhöhe der Kanäle des Hybridchips beträgt 200 µm.
Legen Sie einen 3-Zoll-Siliziumwafer in eine Schale mit Aceton. Schwenken Sie die Schale 30 Sekunden lang vorsichtig und lassen Sie den Wafer anschließend an der Luft trocknen. Übertragen Sie den Wafer auf eine Schale mit Isopropanol und drehen Sie diese 30 Sekunden lang, um ihn zu reinigen.
Zur Maximierung der Entfernung organischer Rückstände von der Siliziumwaferoberfläche kann optional eine Piranha-Lösung (Mischung aus Wasserstoffperoxid und konzentrierter Schwefelsäure, 1:3 (Vol./Vol.)) verwendet werden.
Piranha-Lösung ist stark ätzend und erzeugt Hitze. Zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen sind erforderlich. Zur Entsorgung die Lösung abkühlen lassen und in einen sauberen, trockenen Abfallbehälter umfüllen. Bitte verwenden Sie Mehrwegbehälter und kennzeichnen Sie diese ordnungsgemäß. Weitere Informationen zu den genauen Vorgehensweisen finden Sie in den Sicherheitsrichtlinien der Einrichtung.
Die Waffeln werden durch Erhitzen auf einer 200 °C heißen Platte 10 Minuten lang getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Waffeln fünfmal an der Luft geschüttelt, um sie abzukühlen.
Geben Sie etwa 10 g Fotolack SU-8 2100 mittig auf den gereinigten Siliziumwafer. Verteilen Sie den Fotolack mit einer Pinzette gleichmäßig auf dem Wafer. Legen Sie den Wafer gelegentlich auf eine 65 °C warme Heizplatte, um den Fotolack weniger klebrig und leichter verteilbar zu machen. Legen Sie den Wafer nicht direkt auf die Heizplatte.
SU-8 wurde mittels Spin-Coating gleichmäßig auf dem Wafer verteilt. Die Rotation des SU-8 wurde für 5–10 s so programmiert, dass es sich mit 500 U/min und einer Beschleunigung von 100 U/min/s ausbreitete. Die Hauptrotation für eine Strukturierung mit 200 µm Dicke wurde auf 1.500 U/min eingestellt. Alternativ konnte eine Dicke von 250 µm (entsprechend einer Höhe von 500 µm für die obere Schicht der Struktur auf dem Chip; siehe „Wichtige Schritte“ unten) durch eine Beschleunigung von 300 U/min/s über 30 Sekunden bei 1.200 U/min erreicht werden.
Die Hauptdrehzahl kann entsprechend der gewünschten Dicke des SU-8-Musters auf dem Siliziumwafer eingestellt werden.
Zur Herstellung von SU-8-Strukturen mit einer Höhe von 500 µm für die obere Schicht des Darms auf dem Chip wurden die Schritte des Spin-Coatings und Soft-Bakes dieser Box (Schritte 7 und 8) nacheinander wiederholt (siehe Schritt 9), um zwei Schichten von jeweils 250 µm dicker SU-8-Schicht zu erzeugen, die in Schritt 12 dieser Box durch UV-Belichtung übereinandergelegt und verbunden werden können, wodurch eine 500 µm hohe Schicht entsteht.
Die mit SU-8 beschichteten Wafer werden vorgeheizt, indem man sie vorsichtig 5 Minuten lang auf eine Heizplatte bei 65 °C legt. Anschließend wird die Temperatur auf 95 °C erhöht und die Wafer weitere 40 Minuten lang inkubiert.
Um eine Höhe des SU-8-Musters von 500 μm im oberen Mikrokanal zu erreichen, wiederholen Sie die Schritte 7 und 8, um zwei 250 μm dicke SU-8-Schichten zu erzeugen.
Mit Hilfe des UV-Maskenjustierers wird ein Lampentest gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, um die Belichtungszeit des Wafers zu berechnen. (Belichtungszeit, ms) = (Belichtungsdosis, mJ/cm2)/(Lampenleistung, mW/cm2).
Nachdem die Belichtungszeit ermittelt wurde, wird die Fotomaske auf den Maskenhalter des UV-Maskenjustierers gesetzt und anschließend auf den mit SU-8 beschichteten Wafer platziert.
Um die UV-Streuung zu minimieren, sollte die bedruckte Oberfläche der Fotomaske direkt auf die SU-8-beschichtete Seite des Siliziumwafers gelegt werden.
Belichten Sie den mit SU-8 beschichteten Wafer und die Fotomaske senkrecht mit 260 mJ/cm² UV-Licht für die vorgegebene Belichtungszeit (siehe Schritt 10 dieses Kastens).
Nach der UV-Belichtung wurden SU-8-beschichtete Siliziumwafer auf jeder Heizplatte 5 Minuten lang bei 65 °C und anschließend 15 Minuten lang bei 95 °C gebacken, um Strukturen mit einer Höhe von 200 µm herzustellen. Um Strukturen mit einer Höhe von 500 µm herzustellen, wurde die Nachbackzeit bei 95 °C auf 30 Minuten verlängert.
Der Entwickler wird in eine Glasschale gegossen und die gebrannte Oblate hineingelegt. Die benötigte Menge SU-8-Entwickler kann je nach Größe der Glasschale variieren. Achten Sie darauf, genügend SU-8-Entwickler zu verwenden, um nicht belichtetes SU-8 vollständig zu entfernen. Verwenden Sie beispielsweise bei einer Glasschale mit 150 mm Durchmesser und 1 Liter Fassungsvermögen ca. 300 ml SU-8-Entwickler. Entwickeln Sie die Form 25 Minuten lang unter gelegentlichem, leichtem Drehen.
Spülen Sie die entwickelte Form mit ca. 10 ml frischem Entwickler und anschließend mit IPA ab, indem Sie die Lösung mit einer Pipette aufsprühen.
Legen Sie den Wafer in einen Plasmareiniger und setzen Sie ihn 1,5 min lang einem Sauerstoffplasma aus (atmosphärisches Gas, Zieldruck 1 × 10−5 Torr, Leistung 125 W).
Legen Sie den Wafer zusammen mit einem Objektträger in einen Vakuumexsikkator. Wafer und Objektträger können nebeneinander platziert werden. Ist der Vakuumexsikkator durch eine Trennwand in mehrere Kammern unterteilt, legen Sie die Objektträger in die untere und die Wafer in die obere Kammer. Geben Sie 100 μL Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan-Lösung auf einen Objektträger und silanisieren Sie die Lösung durch Anlegen von Vakuum.
Eine Ampulle mit gefrorenen Caco-2-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen lassen und anschließend die aufgetauten Zellen in einen T75-Kolben mit 15 ml vorgewärmtem Caco-2-Medium (37 °C) überführen.
Um Caco-2-Zellen bei einer Konfluenz von ~90% zu passieren, erwärmen Sie zunächst das Caco-2-Medium, PBS und 0,25% Trypsin/1 mM EDTA in einem 37°C warmen Wasserbad.
Das Medium mittels Vakuumaspiration absaugen. Die Zellen zweimal mit je 5 ml warmem PBS waschen, indem die Vakuumaspiration wiederholt und frisches PBS hinzugegeben wird.