Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon egy frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Az emberi bél morfogenezise létrehozza a 3D hám mikroarchitektúrájának és térbeli szerveződésének kripta-bolyhos jellemzőit. Ez az egyedülálló struktúra szükséges a bél homeosztázisának fenntartásához azáltal, hogy megvédi az őssejtek niche-jét a bazális kriptában az exogén mikrobiális antigénektől és azok metabolitjaitól. Ezenkívül a bélbolyhok és a kiválasztódó nyálka funkcionálisan differenciált hámsejteket képviselnek, amelyek védőgáttal rendelkeznek a bélnyálkahártya felszínén. Ezért a 3D hámstruktúrák újraalkotása kulcsfontosságú az in vitro bélmodellek felépítéséhez. Nevezetesen, a szerves mimetikus gut-on-a-chip képes a bélhám spontán 3D morfogenezisét kiváltani, fokozott fiziológiai funkciókkal és biomechanikával. Itt egy reprodukálható protokollt biztosítunk a bél morfogenezisének robusztus kiváltására a bélben egy mikrofluidikai chipen, valamint egy Transwell beágyazott hibrid chipen. Részletes módszereket ismertetünk az eszközgyártásra, a Caco-2 vagy bél organoid hámsejtek tenyésztésére hagyományos beállításokban, valamint mikrofluidikai platformon, a 3D morfogenezis indukciójára és a kialakult 3D hám jellemzésére többféle képalkotó modalitás alkalmazásával. Ez a protokoll a funkcionális bél regenerációját éri el. mikroarchitektúra a bazolaterális folyadékáramlás 5 napig tartó szabályozásával. In vitro morfogenezis módszerünk fiziológiailag releváns nyírófeszültséget és mechanikai mozgást alkalmaz, és nem igényel komplex sejttervezést vagy manipulációt, ami felülmúlhatja más meglévő technikákat. Úgy véljük, hogy javasolt protokollunk széles körű következményekkel járhat a biomedicinális kutatói közösség számára, módszert biztosítva a 3D-s bélhámrétegek in vitro regenerálására biomedicinális, klinikai és gyógyszerészeti alkalmazásokhoz.
Kísérletek igazolják, hogy a gut-on-a-chip1,2,3,4,5 vagy kétrétegű mikrofluidikai eszközökben6,7 tenyésztett bélhámsejtekből származó Caco-2 sejtek spontán 3D morfogenezisen mehetnek keresztül in vitro anélkül, hogy a mögöttes mechanizmus világosan ismert lenne. Legutóbbi tanulmányunkban azt találtuk, hogy a bazolaterálisan szekretált morfogén antagonisták eltávolítása a tenyésztőeszközökből szükséges és elegendő a 3D hámsejtekből származó morfogenezis in vitro kiváltásához, amit a Caco-2 és a betegekből származó bélorganoidok is bizonyítottak. Epiteliális sejteket validáltunk. Ebben a tanulmányban kifejezetten egy erős Wnt antagonista, a Dickkopf-1 (DKK-1) sejttermelésére és koncentrációeloszlására összpontosítottunk gut-on-a-chipben és módosított mikrofluidikai eszközökben, amelyek Transwell betéteket tartalmaznak, az úgynevezett „hibrid chipben”. Bemutatjuk, hogy exogén Wnt antagonisták (például DKK-1, Wnt represszor 1, szekretált frizzled-related protein 1 vagy Soggy-1) hozzáadása a chipen lévő bélhez gátolja a morfogenezist vagy megzavarja az előstrukturált 3D hámréteget, ami arra utal, hogy az antagonista stressz a tenyészet során felelős a bél morfogeneziséért in vitro. Ezért a hámfelületen a robusztus morfogenezis elérésének gyakorlati megközelítése a Wnt antagonisták szintjének eltávolítása vagy minimális fenntartása a bazolaterális rekeszben aktív öblítéssel (pl. gut-on-a-chip vagy hibrid-on-a-chip platformokon) vagy diffúzióval. Bazolaterális közeg (pl. Transwell betétekből nagy bazolaterális rezervoárokba kutakban).
Ebben a protokollban részletes módszert ismertetünk „gut-on-a-chip” mikroeszközök és Transwell-beilleszthető hibrid chipek (1-5. lépések) előállítására, hogy bélhámsejteket tenyészthessünk polidimetil-sziloxán (PDMS) alapú porózus membránokon (6A, 7A, 8, 9. lépések) vagy Transwell-betétek poliészter membránjain (6B, 7B, 8, 9. lépések), és 3D morfogenezist indukáljunk in vitro (10. lépés). Több képalkotó modalitás alkalmazásával azonosítottunk olyan sejtes és molekuláris jellemzőket is, amelyek a szövetspecifikus hisztogenezisre és a leszármazási vonaltól függő sejtdifferenciálódásra utalnak (11-24. lépések). Emberi bélhámsejtek, például Caco-2 vagy bélorganoidok felhasználásával indukálunk morfogenezist két tenyésztési formátumban, technikai részletekkel, beleértve a porózus membránok felületmódosítását, 2D monorétegek létrehozását, valamint a bél biokémiai és biomechanikai mikro-környezetének reprodukcióját in vitro. A 3D morfogenezis 2D epiteliális monorétegekből történő indukálásához mindkét tenyésztett formában eltávolítottuk a morfogén antagonistákat a táptalaj áramoltatásával. a kultúra bazolaterális rekesze. Végül bemutatjuk egy regenerálható 3D hámréteg hasznosságát, amely felhasználható morfogén-függő hámnövekedés, longitudinális gazda-mikrobiom kokultúrák, kórokozó fertőzés, gyulladásos sérülés, hámbarrier diszfunkció és probiotikumokon alapuló terápiák modellezésére. Példa.hatások.
Protokollunk széles körű tudósok számára hasznos lehet az alapkutatásban (pl. bélnyálkahártya-biológia, őssejt-biológia és fejlődésbiológia) és az alkalmazott kutatásban (pl. preklinikai gyógyszertesztelés, betegségmodellezés, szövetmérnökség és gasztroenterológia) egyaránt. Mivel protokollunk reprodukálható és robusztus módon képes in vitro kiváltani a bélhám 3D-s morfogenezisét, úgy gondoljuk, hogy technikai stratégiánk terjeszthető a bélfejlődés, a regeneráció vagy a homeosztázis során a sejtjelzés dinamikáját tanulmányozó közönség számára. Ezenkívül protokollunk hasznos különféle fertőző ágensek, például norovírus 8, súlyos akut légúti szindrómát okozó koronavírus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 vagy Vibrio cholerae okozta fertőzések vizsgálatára. A betegség patológiájának és patogenezisének célközönségei is hasznosak. Egy on-chip bélmikrofiziológiai rendszer használata lehetővé teheti a longitudinális ko-kultúrát,10 és az azt követő gazdaszervezet védekezésének, az immunválaszoknak és a kórokozókkal összefüggő sérülések helyreállításának értékelését a gyomor-bél traktusban (GI).11 Egyéb, a szivárgó bél szindrómához, a lisztérzékenységhez, a Crohn-betegséghez, a fekélyes vastagbélgyulladáshoz, a pouchitishez vagy az irritábilis bél szindrómához kapcsolódó GI-rendellenességek szimulálhatók, amikor 3D-s bélhámrétegeket készítenek a beteg 3D-s bélhámrétegeiből. Ezek a betegségek közé tartozik a bélboholy atrófia, a kriptarövidülés, a nyálkahártya-károsodás vagy a károsodott hámbarrier. Biopszia vagy őssejtekből származó bélorganoidok12,13. A betegségkörnyezet nagyobb komplexitásának jobb modellezése érdekében az olvasók fontolóra vehetik a betegséggel kapcsolatos sejttípusok, például a beteg perifériás vérének mononukleáris sejtjeinek (PBMC-k) hozzáadását a 3D-s bélboholy-kripta mikroarchitektúrákat tartalmazó modellekhez. Szövetspecifikus immunsejtek, 5.
Mivel a 3D-s hámmikroszerkezet rögzíthető és vizualizálható metszeti folyamat nélkül, a térbeli transzkriptomikával és nagy felbontású vagy szuperfelbontású képalkotással foglalkozó nézőket érdekelheti a gének és fehérjék téridőbeli dinamikájának feltérképezése hámrétegeken. Érdekli a technológia. Válasz mikrobiális vagy immun ingerekre. Továbbá a bél homeosztázisát koordináló longitudinális gazda-mikrobiom áthallás 10, 14 létrehozható a 3D-s bélnyálkahártya rétegben különböző mikrobiális fajok, mikrobiális közösségek vagy székletmikrobiota együttes tenyésztésével, különösen a gut-on-a-chipben. a platformon. Ez a megközelítés különösen vonzó a nyálkahártya-immunológiát, a gasztroenterológiát, az emberi mikrobiomot, a kulturomikát és a klinikai mikrobiológiát tanulmányozó közönség számára, akik korábban nem tenyésztett bélmikrobiotát szeretnének laboratóriumban tenyészteni. Ha in vitro morfogenezis protokollunkat skálázható tenyésztési formátumokhoz, például 24, 96 vagy 384 lyukú lemezekbe helyezett többlyukú inszertekhez lehet adaptálni, amelyek folyamatosan feltöltik a bazolaterális rekeszeket, akkor a protokoll terjeszthető azok számára is, akik gyógyszeripari, biomedicinális vagy nagy áteresztőképességű szűrő- vagy validációs platformokat fejlesztenek az élelmiszeripar számára. Elvi bizonyítékként nemrégiben bemutattuk egy multiplex, nagy áteresztőképességű morfogenezis rendszer megvalósíthatóságát, amely 24 lyukú lemez formátumra skálázható. Ezenkívül több szerv-on-a-chip termék is kereskedelmi forgalomba került16,17,18. Ezért in vitro morfogenezis módszerünk validálása felgyorsítható, és potenciálisan számos kutatólaboratórium, ipar vagy kormányzati és szabályozó ügynökség alkalmazhatja, hogy megértsék az in vitro bélmorfogenezis sejtes átprogramozását transzkriptomikai szinten gyógyszerek vagy bioterápiás szerek tesztelése céljából. A gyógyszerjelöltek felszívódását és transzportját a következőkkel értékelték: 3D bélrendszer-helyettesítők, vagy egyedi vagy kereskedelmi forgalomban kapható szerv-chip modellek használata a bélrendszer morfogenezis folyamatának reprodukálhatóságának felmérésére.
Korlátozott számú, emberre vonatkozó kísérleti modellt alkalmaztak a bélhám morfogenezisének vizsgálatára, főként a 3D morfogenezis in vitro indukálására alkalmas megvalósítható protokollok hiánya miatt. Valójában a bél morfogenezisével kapcsolatos jelenlegi ismeretek nagy része állatkísérleteken alapul (pl. zebrahal20, egerek21 vagy csirkék22). Ezek azonban munkaigényesek és költségigényesek, etikailag megkérdőjelezhetők lehetnek, és ami a legfontosabb, nem határozzák meg pontosan az emberi fejlődési folyamatokat. Ezek a modellek a többirányú, skálázható tesztelés tekintetében is nagyon korlátozottak. Ezért a 3D szövetszerkezetek in vitro regenerálására szolgáló protokollunk felülmúlja az in vivo állatmodelleket, valamint más hagyományos statikus 2D sejtkultúra-modelleket. Amint azt korábban leírtuk, a 3D hámszerkezetek használata lehetővé tette számunkra, hogy megvizsgáljuk a differenciálódott sejtek térbeli lokalizációját a kripta-bolyhok tengelyében különböző nyálkahártya- vagy immun ingerekre adott válaszként. A 3D hámrétegek teret biztosíthatnak annak tanulmányozására, hogy a mikrobiális sejtek hogyan versengenek a térbeli niche-ek kialakításáért és az ökológiai evolúcióért a gazdaszervezet tényezőire adott válaszként (pl. belső és külső nyálkahártya-rétegek, IgA és antimikrobiális peptidek szekréciója). Továbbá, A 3D hámréteg morfológiája lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük, hogyan strukturálja a bélmikrobiota a közösségeit, és hogyan termel szinergikusan mikrobiális metabolitokat (pl. rövid szénláncú zsírsavakat), amelyek alakítják a sejtek szerveződését és az őssejtek helyét a bazális kriptákban. Ezek a tulajdonságok csak akkor mutathatók ki, ha a 3D hámrétegek in vitro létrejönnek.
A 3D-s bélhámstruktúrák létrehozására szolgáló módszerünkön kívül számos in vitro módszer létezik. A bél organoid tenyésztése egy korszerű szövetmérnöki technika, amely a bél őssejtek specifikus morfogén körülmények között történő tenyésztésén alapul23,24,25. A 3D-s organoid modellek használata transzportanalízishez vagy gazda-mikrobiom kokultúrákhoz azonban gyakran kihívást jelent, mivel a bél lumenét az organoid zárja be, ezért a lumen komponenseinek, például mikrobiális sejteknek vagy exogén antigéneknek a bevitele korlátozott. Az organoid lumenekhez való hozzáférés javítható mikroinjektorral,26,27 de ez a módszer invazív és munkaigényes, és speciális ismereteket igényel a végrehajtása. Továbbá a hidrogel állványzatokban statikus körülmények között fenntartott hagyományos organoid tenyészetek nem tükrözik pontosan az aktív in vivo biomechanikát.
Számos kutatócsoport által alkalmazott más megközelítések előstrukturált 3D hidrogél állványokat használnak a bélhám szerkezetének utánzására azáltal, hogy izolált emberi bélsejteket tenyésztenek a gél felületén. Hidrogél állványok készítése 3D nyomtatott, mikromarással vagy litográfiailag előállított formákkal. Ez a módszer az izolált hámsejtek in vitro önszerveződő elrendeződését mutatja be fiziológiailag releváns morfogén gradiensekkel, nagy oldalarányú hámszerkezetet és sztróma-hám áthallást hozva létre a sztrómasejtek vázba való beépítésével. Az előstrukturált állványok természete azonban megakadályozhatja magának a spontán morfogenetikus folyamatnak a megjelenítését. Ezek a modellek nem biztosítanak dinamikus luminális vagy intersticiális áramlást, hiányzik belőle a folyadék nyírófeszültsége, amelyre a bélsejteknek szükségük van a morfogenezishez és a fiziológiai funkció elnyeréséhez. Egy másik újabb tanulmány hidrogél állványokat használt mikrofluidikai platformon, és lézermaratási technikákkal mintázta a bélhám szerkezeteket. Az egér bél organoidjai a maratott mintákat követve bélcsőszerű szerkezeteket alkotnak, és az intraluminális folyadékáramlás egy mikrofluidikai modul segítségével reprodukálható. Ez a modell azonban nem mutat spontán morfogenetikus folyamatokat, és nem tartalmazza... bél mechanobiológiai mozgásai. Ugyanezen csoport 3D nyomtatási technikáival képesek voltak miniatűr bélcsöveket létrehozni spontán morfogenetikus folyamatokkal. A csövön belüli különböző bélszegmensek összetett előállítása ellenére ebből a modellből hiányzik a lumen folyadékáramlása és a mechanikai deformáció. Ezenkívül a modell működőképessége korlátozott lehet, különösen a bionyomtatási folyamat befejezése után, ami zavarhatja a kísérleti körülményeket vagy a sejtek közötti interakciókat. Ehelyett javasolt protokollunk spontán bélmorfogenezist, fiziológiailag releváns nyírófeszültséget, a bélmozgást utánzó biomechanikát, független apikális és bazolaterális rekeszek hozzáférhetőségét, valamint a modularitás komplex biológiai mikro-környezeteinek újrateremtését biztosítja. Ezért in vitro 3D morfogenezis protokollunk kiegészítő megközelítést kínálhat a meglévő módszerek kihívásainak leküzdésére.
Protokollunk teljes mértékben a 3D epiteliális morfogenezisre összpontosít, kizárólag epiteliális sejteket használva a tenyészetben, és nincsenek más típusú környező sejtek, például mezenchimális sejtek, endoteliális sejtek és immunsejtek. Amint azt korábban leírtuk, protokollunk lényege az epiteliális morfogenezis indukciója a bevitt táptalaj bazolaterális oldalán kiválasztott morfogén inhibitorok eltávolításával. Míg a chip-bélrendszerünk és a chip-hibrid rendszerünk robusztus modularitása lehetővé teszi a hullámzó 3D epiteliális réteg újraalkotását, további biológiai komplexitásokat, mint például az epiteliális-mezenchimális kölcsönhatásokat33,34, az extracelluláris mátrix (ECM) lerakódását35 és modellünkben a bazális kriptákban őssejt-niche-eket hordozó kripta-bolyhos jellemzőket, még figyelembe kell venni. A mesenchymában található stromális sejtek (pl. fibroblasztok) kulcsszerepet játszanak az ECM fehérjék termelésében és a bél morfogenezisének szabályozásában in vivo35,37,38. A mezenchimális sejtek hozzáadása modellünkhöz fokozta a morfogenetikus folyamatot és a sejtek tapadásának hatékonyságát. Az endoteliális réteg (azaz a kapillárisok vagy a nyirokerek) fontos szerepet játszik a szabályozásában molekuláris transzport39 és immunsejtek toborzása40 a bél mikrokörnyezetében. Továbbá a szövetmodellek között összekapcsolható érrendszeri komponensek előfeltételei a több szerv közötti interakciók bemutatására szolgáló szövetmodellek tervezésének. Ezért az endothelsejteket be kell vonni a pontosabb fiziológiai jellemzők szervszintű felbontással történő modellezéséhez. A betegből származó immunsejtek elengedhetetlenek a veleszületett immunválaszok, az antigénprezentáció, a veleszületett adaptív immun-áthallás és a szövetspecifikus immunitás megjelenítéséhez a bélbetegségek utánzásának kontextusában.
A hibrid chipek használata egyszerűbb, mint a „bél-a-chip” módszer, mivel az eszköz beállítása egyszerűbb, és a Transwell-betétek használata lehetővé teszi a bélhám skálázható tenyésztését. A kereskedelmi forgalomban kapható poliészter membránnal ellátott Transwell-betétek azonban nem rugalmasak, és nem képesek a perisztaltikus mozgásokhoz hasonló mozgásokat szimulálni. Továbbá a hibrid chipbe helyezett Transwell-betét apikális rekesze mozdulatlan maradt, az apikális oldalon nem volt nyírófeszültség. Nyilvánvaló, hogy az apikális rekesz statikus tulajdonságai ritkán teszik lehetővé a hosszú távú bakteriális együtt-tenyésztést a hibrid chipekben. Míg a hibrid chipek használatával robusztusan indukálhatunk 3D-s morfogenezist a Transwell-betétekben, a fiziológiailag releváns biomechanika és az apikális folyadékáramlás hiánya korlátozhatja a hibrid chipplatformok megvalósíthatóságát a potenciális alkalmazásokban.
Az emberi kripta-bolyhok tengelyének teljes körű rekonstrukciója gut-on-a-chip és hybrid-on-a-chip kultúrákban még nem teljesen bizonyított. Mivel a morfogenezis egy epiteliális monorétegből kezdődik, a 3D mikroarchitektúrák nem feltétlenül biztosítanak morfológiai hasonlóságot a kriptákkal in vivo. Bár jellemeztük a proliferáló sejtpopulációt a bazális kripta domén közelében a mikromérnöki úton létrehozott 3D hámban, a kripta és a bolyhok régiói nem voltak egyértelműen elhatárolva. Bár a chipen lévő magasabb felső csatornák a mikromérnöki úton létrehozott hám magasságának növekedéséhez vezetnek, a maximális magasság még mindig ~300–400 µm-re korlátozódik. Az emberi bélkripták tényleges mélysége a vékony- és vastagbélben ~135 µm, illetve ~400 µm, a vékonybél bolyhainak magassága pedig ~600 µm41.
Képalkotási szempontból a 3D mikroarchitektúrák in situ szuperfelbontású képalkotása a chipen lévő bélre korlátozódhat, mivel az objektívlencsétől a hámrétegig szükséges munkatávolság néhány milliméter nagyságrendű. Ennek a problémának a leküzdéséhez távoli objektívre lehet szükség. Továbbá a képalkotó mintaelőkészítéshez szükséges vékony metszetek készítése kihívást jelent a PDMS nagyfokú rugalmassága miatt. Továbbá, mivel a bél rétegenkénti mikrogyártása egy chipen állandó tapadást eredményez az egyes rétegek között, rendkívül nehéz a felső réteget kinyitni vagy eltávolítani az hámréteg felületi szerkezetének vizsgálatához. Például pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM).
A PDMS hidrofóbicitása korlátozó tényező volt a hidrofób kis molekulákkal foglalkozó mikrofluidikai alapú vizsgálatokban, mivel a PDMS nem specifikusan képes adszorbeálni az ilyen hidrofób molekulákat. A PDMS alternatívái más polimer anyagokkal is szóba jöhetnek. Alternatív megoldásként a PDMS felületmódosítása (pl. lipofil anyagokkal 42 vagy poli(etilénglikollal) 43 történő bevonat) is szóba jöhet a hidrofób molekulák adszorpciójának minimalizálása érdekében.
Végül, módszerünket még nem jellemezték kellőképpen nagy áteresztőképességű szűrővizsgálatok vagy „mindenki számára egységes”, felhasználóbarát kísérleti platform biztosítása szempontjából. A jelenlegi protokoll fecskendőpumpát igényel mikroeszközönként, ami helyet foglal a CO2 inkubátorban, és megakadályozza a nagyméretű kísérleteket. Ez a korlátozás jelentősen javítható az innovatív tenyésztési formátumok skálázhatóságával (pl. 24-lyukú, 96-lyukú vagy 384-lyukú porózus betétek, amelyek lehetővé teszik a bazolaterális táptalaj folyamatos utántöltését és eltávolítását).
Az emberi bélhám 3D-s morfogenezisének in vitro kiváltásához egy mikrofluidikai chip bélrendszeri eszközt használtunk, amely két párhuzamos mikrocsatornát és egy rugalmas porózus membránt tartalmazott a lumen-kapilláris határfelület létrehozásához. Bemutatjuk egy egycsatornás mikrofluidikai eszköz (egy hibrid chip) használatát is, amely folyamatos bazolaterális áramlást biztosít a Transwell betéteken növesztett polarizált hámrétegek alatt. Mindkét platformon a különféle emberi bélhámsejtek morfogenezise demonstrálható az áramlás irányított manipulációjával, hogy eltávolítsuk a morfogén antagonistákat a bazolaterális rekeszből. A teljes kísérleti eljárás (1. ábra) öt részből áll: (i) a bélchip vagy a Transwell beilleszthető hibrid chip mikrogyártása (1-5. lépések; 1. doboz), (ii) bélhámsejtek (Caco-2 sejtek) vagy emberi bélorganoidok előkészítése; 2–5. dobozok), (iii) bélhámsejtek tenyésztése bélchipeken vagy hibrid chipeken (6–9. lépések), (iv) 3D morfogenezis indukciója in vitro (10. lépés) és (v) a 3D hámmikrostruktúra jellemzésére (11–24. lépések). Végül egy megfelelő kontrollcsoportot (erről alább részletesebben) terveztek az in vitro morfogenezis hatékonyságának validálására az hámmorfogenezis térbeli, időbeli, feltételes vagy eljárási kontrollokkal való összehasonlításával.
Két különböző tenyésztő platformot használtunk: egyenes csatornákkal vagy nemlineáris tekervényes csatornákkal ellátott gut-on-a-chip-et, illetve Transwell (TW) betéteket tartalmazó hibrid chipeket egy mikrofluidikai eszközben, amelyeket az 1. dobozban leírtak szerint állítottunk elő, és az 1-5. lépésben („Eszközgyártás”) bemutatjuk egyetlen chip vagy egy hibrid chip elkészítésének főbb lépéseit. „Emberi bélhámsejtek tenyésztése” elmagyarázza a sejtforrást (Caco-2 vagy emberi bélorganoidok) és a protokollban alkalmazott tenyésztési eljárást. „In vitro morfogenezis” bemutatja azokat a lépéseket, amelyek során a Caco-2 vagy organoid eredetű hámsejteket bélchipen vagy egy hibrid chip Transwell betétjein tenyésztjük, majd 3D morfogenezist indukálunk és egy jellemzett hámszerkezet alakul ki. A programlépés száma vagy a doboz száma minden nyíl alatt látható. Az alkalmazás példákat mutat be arra, hogyan lehet a kialakult bélhámrétegeket felhasználni például a sejtek differenciálódásának jellemzésére, a bélfiziológiai vizsgálatokra, a gazda-mikrobiom ökoszisztémák létrehozására és a betegségek modellezésére. A „Sejtdifferenciálódás” című részben immunfluoreszcens képek mutatják a sejtmagokat, az F-aktint és a A bélcsipeken létrehozott 3D Caco-2 hámrétegben expresszált MUC2. A MUC2 jelátvitel jelen van a kehelysejtekben és a nyálkahártya felszínéről kiválasztott nyálkában. A Gut Physiology fluoreszcens képei a szialinsav és az N-acetilglükózamin aminosavmaradékok fluoreszcens búzacsíra-agglutininnel történő festésével előállított nyálkát mutatják. A „Host-Microbe Co-Cultures” két átfedő képe a bélben egy chipen lévő reprezentatív gazda-mikrobiom kokultúrákat mutat. A bal oldali panel a zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) expresszáló E. coli és a mikromérnöki úton létrehozott 3D Caco-2 hámsejtek kokultúráját mutatja. A jobb oldali panel a GFP E. coli és a 3D Caco-2 hámsejtek kokultúrájának lokalizációját mutatja, majd az F-aktinnal (piros) és sejtmagokkal (kék) végzett immunfluoreszcens festést. A betegségmodellezés az egészséges és a szivárgó bél közötti különbséget szemlélteti a bélgyulladásos chipeken fiziológiás bakteriális antigénekkel (pl. lipopoliszacharid, LPS) és immunsejtekkel (pl. PBMC; zöld) történő fertőzés hatására. A Caco-2 sejteket tenyésztették egy 3D hámréteg létrehozása érdekében. Lépték sáv, 50 µm. Az alsó sorban látható képek: „Sejtek differenciálódása”, a 2. hivatkozás engedélyével adaptálva. Oxford University Press; az 5. hivatkozás engedélyével reprodukálva. NAS; „Gazda-mikroba ko-kultúra”, a 3. hivatkozás engedélyével adaptálva. NAS; „Betegségmodellezés”, az 5. hivatkozás engedélyével adaptálva. NAS.
Mind a „gut-on-a-chip”, mind a hibrid chipeket PDMS replikákból állították elő, amelyeket lágy litográfiával1,44 szedtek ki szilikon öntőformákból, és SU-8-cal mintáztak. Az egyes chipek mikrocsatornáinak kialakítását a hidrodinamikai tényezők, például a nyírófeszültség és a hidrodinamikai nyomás1,4,12 figyelembevételével határozták meg. Az eredeti „gut-on-a-chip” kialakítás (kibővített adatok, 1a. ábra), amely két egymás melletti párhuzamos egyenes mikrocsatornából állt, egy komplex „gut-on-a-chip”-pé fejlődött (kibővített adatok, 1b. ábra), amely egy pár görbe mikrocsatornát tartalmaz a megnövekedett folyadék tartózkodási idő, a nemlineáris áramlási minták és a tenyésztett sejtek többtengelyű deformációjának kiváltására (2a–f. ábra)12. Amikor összetettebb bélbiomechanikát kell újraalkotni, komplex „gut-on-a-chip” választható. Bebizonyítottuk, hogy a tekervényes Gut-Chip hasonló időkereten belül és hasonló mértékű hámnövekedéssel erősen indukál 3D morfogenezist az eredeti Gut-Chiphez képest, függetlenül a... tenyésztett sejttípus. Ezért a 3D morfogenezis kiváltásához a lineáris és komplex chipre szerelt bélszerkezetek felcserélhetők. Az SU-8 mintázatokkal ellátott szilikon öntőformákon kikeményített PDMS replikák negatív tulajdonságokat mutattak a formából való kibontás után (2a. ábra). A chipre szerelt bél előállításához az előkészített felső PDMS réteget egymás után egy porózus PDMS filmhez kötötték, majd koronakisüléses kezelővel visszafordíthatatlan kötéssel az alsó PDMS réteggel illesztették (2b–f. ábra). Hibrid chipek előállításához a kikeményített PDMS replikákat üveglemezekre kötötték, hogy egycsatornás mikrofluidikai eszközöket hozzanak létre, amelyek Transwell-betéteket tudtak befogadni (2h. ábra és kibővített adatok 2. ábra). A kötési folyamatot a PDMS replika és az üveg felületének oxigénplazmával vagy koronakisüléses kezelésével végezték. A szilikoncsőhöz rögzített mikrogyártott eszköz sterilizálása után az eszköz összeállítása készen állt a bélhám 3D morfogenezisének elvégzésére (2g. ábra).
a, PDMS alkatrészek előállításának sematikus ábrázolása SU-8 mintázatú szilikon öntőformákból. A kikeményítetlen PDMS oldatot szilikon öntőformára öntöttük (balra), 60 °C-on kikeményítettük (középen), majd kiszedtük a formából (jobbra). A kiszedett PDMS-t darabokra vágtuk és megtisztítottuk további felhasználás céljából. b, A PDMS felső rétegének elkészítéséhez használt szilikon öntőforma fényképe. c, A PDMS porózus membránjának előállításához használt szilikon öntőforma fényképe. d, A felső és alsó PDMS komponensek, valamint az összeszerelt, chipre szerelt bélrendszer fényképsorozata. e, A felső, a membrán és az alsó PDMS komponensek illesztésének sematikus ábrázolása. Minden réteg plazma- vagy koronakezeléssel visszafordíthatatlanul össze van kötve. f, A létrehozott chipre szerelt „gut-on-a-chip” eszköz sematikus ábrázolása egymásra helyezett, tekervényes mikrocsatornákkal és vákuumkamrákkal. g, A „gut-on-a-chip” beállítása mikrofluidikai sejtkultúrához. A szilikon csővel és fecskendővel összeszerelt, chipen lévő, elkészített bélrendszert fedőlemezre helyeztük. A chiprendszert egy 150 mm-es Petri-csésze fedelére helyeztük... feldolgozás. A kötőanyaggal zárják le a szilikon csövet. h, Vizuális pillanatképek a hibrid chip gyártásáról és a 3D morfogenezisről hibrid chipek segítségével. A bélhámsejtek 2D monorétegeinek tenyésztéséhez függetlenül elkészített Transwell betéteket helyeztek a hibrid chipbe a bél 3D morfogenezisének kiváltása érdekében. A táptalajt mikrocsatornákon keresztül perfundálják a Transwell betéten létrehozott sejtréteg alatt. Lépték, 1 cm. h Újranyomtatva a hivatkozás engedélyével. 4. Elsevier.
Ebben a protokollban Caco-2 sejtvonalat és bélrendszeri organoidokat használtunk hámforrásként (3a. ábra). Mindkét sejttípust külön-külön tenyésztettük (2. és 5. doboz), és ECM-mel bevont mikrocsatornák beoltására használtuk chipen lévő bél- vagy Transwell-betétekben. Amikor a sejtek konfluensek (>95%-os lefedettség a lombikokban), a rutinszerűen tenyésztett Caco-2 sejteket (a 10. és 50. passzázs között) T-lombikokban begyűjtöttük, hogy tripszinizációs folyadékkal disszociált sejtszuszpenziókat készítsünk (2. doboz). A bélbiopsziákból vagy sebészeti reszekciókból származó emberi bélrendszeri organoidokat Matrigel állványkupolákban tenyésztettük 24-lyukú lemezeken a strukturális mikro-környezet támogatása érdekében. Az esszenciális morfogéneket (például Wnt, R-spondin és Noggin) és a 3. dobozban leírtak szerint előkészített növekedési faktorokat tartalmazó táptalajt minden második nap kiegészítettük, amíg az organoidok átmérője elérte a ~500 µm-t. A teljesen kifejlett organoidokat begyűjtöttük, és egyetlen sejtté disszociáltuk, hogy chipen lévő bél- vagy Transwell-betétekre helyezzük őket (2. doboz). 5). Amint azt korábban már beszámoltuk, megkülönböztethető a betegség típusa12,13 (pl. fekélyes vastagbélgyulladás, Crohn-betegség, vastagbélrák vagy normál donor), az elváltozás helye (pl. elváltozás vs. nem elváltozásos terület) és a gyomor-bél traktusban elfoglalt helye (pl. nyombél, jejunum, ileum, vakbél, vastagbél vagy végbél) szerint. Az 5. dobozban optimalizált protokollt biztosítunk a vastagbél organoidok (koloidok) tenyésztésére, amelyek jellemzően magasabb morfogén koncentrációt igényelnek, mint a vékonybél organoidjai.
a, Munkafolyamat a bél morfogenezisének indukciójához a bélchipben. Ebben a protokollban Caco-2 humán bélhámot és bélorganoidokat használunk a 3D morfogenezis bemutatására. Az izolált hámsejteket az előkészített gut-on-a-chip eszközbe helyeztük (chip előkészítése). Miután a sejteket a 0. napon (D0) beoltottuk és a PDMS porózus membránhoz rögzítettük (rögzítettük), megindul az apikális (AP) áramlás, amelyet az első 2 napon fenntartunk (áramlás, AP, D0-D2). A bazolaterális (BL) áramlás is megindul ciklikus nyújtási mozgásokkal (nyújtás, áramlás, AP és BL) együtt, amikor egy teljes 2D monoréteg kialakul. A bél 3D morfogenezise spontán módon zajlott le 5 napos mikrofluidikai tenyészet után (morfogenezis, D5). A fáziskontraszt képek a Caco-2 sejtek reprezentatív morfológiáját mutatják az egyes kísérleti lépésekben vagy időpontokban (oszlopdiagram, 100 µm). Négy vázlatos ábra, amely a bél morfogenezisének megfelelő kaszkádjait szemlélteti (jobb felső sarok). A vázlatban a szaggatott nyilak a ... irányát jelölik. folyadékáramlás.b, SEM kép, amely a kialakult 3D Caco-2 hám felszíni topológiáját mutatja (balra). A nagyított területet kiemelő betét (fehér szaggatott doboz) a regenerálódott mikrobolyhokat mutatja a 3D Caco-2 rétegen (jobbra).c, A kialakult Caco-2 3D vízszintes elölnézete, claudin (ZO-1, piros) és folytonos kefeszegély membránok, F-aktinnal (zöld) és sejtmagokkal (kék) jelölve. Immunofluoreszcens konfokális vizualizáció hámsejtekről bélcsipeken. A középső vázlatra mutató nyilak az egyes konfokális nézetekhez tartozó fókuszsík helyét jelzik.d, A chipen tenyésztett organoidok morfológiai változásainak időbeli lefolyása, fáziskontraszt mikroszkóppal a 3., 7., 9., 11. és 13. napon. A betét (jobb felső sarok) a megadott kép nagy nagyítását mutatja.e, DIC fotomikrográfia a bélben kialakult organoid 3D hámról, a 7. napon készített szeleten.f, Átfedéses immunfluoreszcens képek, amelyek az őssejtek (LGR5; bíborvörös) és a kehelysejtek (MUC2; zöld) markereit mutatják. F-aktin (szürke) és sejtmagok (cián) 3 napig bélchipeken tenyésztve (balra), illetve 13 napos (középső) organoidok az epiteliális rétegen. Lásd még a kibővített adatok 3. ábráját, amely az LGR5 jelátvitelt emeli ki MUC2 jelátvitel nélkül. Fluoreszcencia képek, amelyek a bélben egy chipen létrehozott 3D organoid hám epiteliális mikroszerkezetét (jobbra) mutatják a plazmamembrán CellMask festékkel történő festésével (jobbra) a tenyésztés 13. napján. A lépték 50 μm, hacsak másképp nem jelezzük. b Újranyomva a referencia engedélyével.2. Oxford University Press; c A referencia engedélyével adaptálva.2. Oxford University Press; e és f a referencia engedélyével adaptálva.12 Creative Commons CC BY 4.0 licenc alatt.
Egy chipen lévő bélben a PDMS porózus membrán hidrofób felületének módosítása szükséges a sikeres ECM bevonáshoz. Ebben a protokollban két különböző módszert alkalmazunk a PDMS membránok hidrofóbicitásának módosítására. A Caco-2 sejtek tenyésztéséhez az UV/ózon kezeléssel történő felületaktiválás önmagában elegendő volt a PDMS felület hidrofóbicitásának csökkentéséhez, az ECM bevonásához és a Caco-2 sejtek PDMS membránhoz rögzítéséhez. Az organoid hám mikrofluidikai tenyésztése azonban kémiai alapú felületfunkcionalizálást igényel az ECM fehérjék hatékony lerakódásának eléréséhez, polietilén-imin (PEI) és glutaraldehid egymást követő alkalmazásával a PDMS mikrocsatornákra. A felületmódosítás után az ECM fehérjéket leraktuk a funkcionalizált PDMS felület befedésére, majd bevittük az izolált organoid hámba. Miután a sejtek rögzítődtek, a mikrofluidikai sejtkultúra azzal kezdődik, hogy csak a táptalajt perfundálja a felső mikrocsatornába, amíg a sejtek teljes monoréteget nem képeznek, míg az alsó mikrocsatorna statikus körülményeket tart fenn. Ez az optimalizált felületaktiválási és ECM bevonási módszer lehetővé teszi az organoid hám tapadását, ami 3D morfogenezist indukál a PDMS felületén.
A Transwell-tenyészetekhez ECM-bevonatra is szükség van a sejtek beoltása előtt; azonban a Transwell-tenyészetek nem igényelnek komplex előkezelési lépéseket a porózus betétek felületének aktiválásához. A Caco-2 sejtek Transwell-betéteken történő tenyésztéséhez az ECM-bevonat a porózus betéteken felgyorsítja a disszociált Caco-2 sejtek tapadását (<1 óra) és a szoros junction-gát kialakulását (<1-2 nap). Az organoidok Transwell-betéteken történő tenyésztéséhez izolált organoidokat helyeznek ECM-bevonatú betétekre, a membrán felületéhez rögzítik (<3 óra), és addig tartják fenn, amíg az organoidok egy teljes monoréteget képeznek, amely gátintegritással rendelkezik. A Transwell-tenyészeteket 24-lyukú lemezeken végzik hibrid chipek használata nélkül.
Az in vitro 3D morfogenezis elindítható folyadékáramlás alkalmazásával egy kialakult hámréteg bazolaterális aspektusában. Egy chipen lévő bélben az hámmorfogenezis akkor kezdődött, amikor a táptalajt a felső és alsó mikrocsatornákba perfundálták (3a. ábra). Amint azt korábban leírtuk, kritikus fontosságú a folyadékáramlás bevezetése az alsó (bazolaterális) rekeszben az irányítottan kiválasztott morfogén inhibitorok folyamatos eltávolítása érdekében. Annak érdekében, hogy elegendő tápanyagot és szérumot biztosítsunk a porózus membránokhoz kötött sejteknek, és lumenális nyírófeszültséget generáljunk, jellemzően kettős áramlást alkalmazunk a chipen lévő bélben. A hibrid chipekben hámréteget tartalmazó Transwell-betéteket helyeztünk a hibrid chipekbe. Ezután a táptalajt a porózus Transwell-betét bazolaterális oldala alá vittük fel a mikrocsatornán keresztül. A bélmorfogenezis 3-5 nappal a bazolaterális áramlás megkezdése után következett be mindkét tenyésztő platformon.
A mikromérnöki úton létrehozott 3D hámrétegek morfológiai jellemzői különféle képalkotó modalitásokkal elemezhetők, beleértve a fáziskontraszt-mikroszkópiát, a differenciális interferencia-kontraszt (DIC) mikroszkópiát, a SEM-et vagy az immunfluoreszcens konfokális mikroszkópiát (3. és 4. ábra). A fáziskontraszt- vagy DIC-képalkotás a tenyésztés bármely szakaszában könnyen elvégezhető a 3D hámrétegek alakjának és kiemelkedésének monitorozására. A PDMS és a poliészter filmek optikai átlátszóságának köszönhetően mind a gut-on-a-chip, mind a hibrid chip platformok valós idejű in situ képalkotást biztosítanak az eszköz szétválasztása vagy szétszerelése nélkül. Immunfluoreszcens képalkotás során (1., 3c., f. és 4b., c. ábra) a sejteket jellemzően 4% (tömeg/térfogat) paraformaldehiddel (PFA) fixálják, majd Triton X-100-zal és 2% (tömeg/térfogat) marhaszérumalbuminnal (BSA) követik, ebben a sorrendben. A sejttípustól függően különböző fixálószerek, permeabilizálószerek és blokkoló szerek alkalmazhatók. A leszármazási vonaltól függő sejt- vagy régiómarkereket célzó primer antitesteket az immobilizált sejtek kiemelésére használják. in situ a chipen, majd másodlagos antitestek, valamint egy kontrasztfesték, amely vagy a sejtmagot (pl. 4',6-diamidino-2-fenilén) indolt, DAPI-t) vagy az F-aktint (pl. fluoreszcensen jelölt falloidin) célozza meg. Fluoreszcencia alapú élő képalkotás in situ is elvégezhető a nyálkahártya-termelés (1. ábra, „Sejtdifferenciálódás” és „Bélfiziológia”), a mikrobiális sejtek véletlenszerű kolonizációja (1. ábra, „Gazda-mikroba kokultúra”), az immunsejtek toborzása (1. ábra, „Betegségmodellezés”) vagy a 3D hámmorfológia kontúrjainak (3c, f és 4b, c) kimutatására. Amikor a chipen lévő bélrendszert módosítják a felső réteg elválasztása érdekében az alsó mikrocsatorna rétegtől, a hivatkozásban leírtak szerint. Amint a 2. ábrán látható, a 3D hámmorfológia, valamint az apikális kefeszegélyen lévő mikrobolyhok SEM-mel vizualizálhatók (3b ábra). A differenciálódási markerek expressziója kvantitatív PCR5 vagy egysejtes RNS-szekvenálással értékelhető. Ebben az esetben a bélchipekben vagy hibrid chipekben tenyésztett hámsejtek 3D-s rétegeit tripszinizációval gyűjtik össze, majd molekuláris vagy genetikai elemzéshez használják.
a, Munkafolyamat a bél morfogenezisének indukciójához egy hibrid chipen. Ebben a protokollban Caco-2-t és bél organoidokat használnak a 3D morfogenezis bemutatására egy hibrid chip platformon. Disszociált hámsejteket ültettek be előkészített Transwell betétekbe (TW előkészítés; lásd az alábbi ábrát). Miután a sejteket beoltották (oltották) és poliészter membránokhoz rögzítették a Transwell betétekben, az összes sejtet statikus körülmények között tenyésztették (TW kultúra). 7 nap elteltével egyetlen Transwell betétet, amely egy 2D monorétegű hámsejteket tartalmazott, integráltak egy hibrid chipbe, hogy bazolaterális áramlást (Flow, BL) vezessenek be, ami végül egy 3D hámréteg kialakulásához vezetett (morfogenezis). Fáziskontráz mikrográfok, amelyek a normál donor (C103 vonal) felszálló vastagbélből származó emberi szerv hámsejtek morfológiai jellemzőit mutatják minden kísérleti lépésben vagy időpontban. A felső rétegekben lévő vázlatok az egyes lépések kísérleti konfigurációját szemléltetik. b, A hibrid chipek (bal oldali vázlat) organoid hámsejtek 3D morfogeneziséhez vezethetnek, felülről lefelé irányuló konfokális mikroszkópos nézetekkel, különböző Z pozíciókban (felső, középső és alsó; lásd a jobb oldali vázlatot és a hozzá tartozó szaggatott vonalakat). nyilvánvaló morfológiai jellemzőket mutatott. F-aktin (cián), sejtmag (szürke). c, Fluoreszcencia konfokális mikrográfiák (3D ferde nézet) statikus Transwellben (TW; beillesztés a fehér szaggatott keretben) vs. hibrid chipben (legnagyobb teljes kép) tenyésztett organoid eredetű hámsejtekről, összehasonlítva a 2D és a 3D morfológiát. Két 2D függőleges keresztmetszetű nézet (beillesztés a jobb felső sarokban; „XZ”) szintén mutatja a 2D és 3D jellemzőket. Léptéksáv, 100 µm. c Újranyomva a hivatkozás engedélyével. 4. Elsevier.
Kontrollként ugyanazokat a sejteket (Caco-2 vagy bélrendszeri organoid hámsejtek) kétdimenziós monorétegekben, hagyományos statikus tenyésztési körülmények között tenyészthetjük. Figyelemre méltó, hogy a mikrocsatornák korlátozott térfogatkapacitása (azaz ~4 µL a felső csatornában az eredeti bélchip-terv esetében) tápanyaghiányt okozhat. Ezért a bazolaterális áramlás alkalmazása előtti és utáni hámmorfológia is összehasonlítható.
A lágylitográfiai eljárást tiszta helyiségben kell elvégezni. A chip minden rétegéhez (felső és alsó rétegek, valamint membránok) és a hibrid chipekhez különböző fotomaszkokat használtak és külön szilíciumlapokon gyártottak, mivel a mikrocsatornák magassága eltérő volt. A chipen lévő bél felső és alsó mikrocsatornáinak célmagassága 500 µm, illetve 200 µm. A hibrid chip csatorna célmagassága 200 µm.
Helyezz egy 7,5 cm-es szilíciumlapkát egy acetonos tálba. Óvatosan körkörös mozdulatokkal mozgasd a lemezt 30 másodpercig, majd szárítsd meg levegőn. Helyezd át a lapkát egy IPA-val telített lemezre, majd centrifugáld a lemezt 30 másodpercig a tisztításhoz.
Opcionálisan piranha oldatot (hidrogén-peroxid és tömény kénsav 1:3 arányú keverékét (térfogat/térfogat)) is lehet használni a szerves maradványok szilíciumlapka felületéről történő eltávolításának maximalizálására.
A piranhaoldat rendkívül korrozív és hőt termel. További biztonsági óvintézkedések szükségesek. A hulladék ártalmatlanításához hagyja az oldatot lehűlni, majd öntse át egy tiszta, száraz hulladéktároló edénybe. Használjon másodlagos tartályokat, és címkézze fel megfelelően a hulladéktároló edényeket. Kérjük, kövesse a létesítmény biztonsági irányelveit a részletesebb eljárásokért.
A ostyákat 10 percre 200 °C-os forró lapra helyezve szárítsa. A szárítás után az ostyát ötször rázogatva, levegőn hűtötte.
Öntsön ~10 g SU-8 2100 fotorezisztet a megtisztított szilíciumlap közepére. Csipesszel egyenletesen terítse el a fotorezisztet a lapon. Időnként helyezze a lapot egy 65°C-os forró lapra, hogy a fotoreziszt kevésbé tapadjon és könnyebben kenhető legyen. Ne helyezze a lapot közvetlenül a forró lapra.
Az SU-8-at egyenletesen osztottuk el a lapkán pörgetéssel történő bevonatolás segítségével. Programozzuk az SU-8 bejövő forgását 5-10 másodpercig, hogy 500 fordulat/perc sebességgel és 100 fordulat/perc gyorsulással terjedjen. Állítsuk be a fő pörgetést 200 µm vastagságú mintázásra 1500 fordulat/perc sebességgel, vagy érjünk el 250 µm vastagságot (500 µm magasságot biztosítva a chip bélrétegének felső rétegéhez; lásd a „Kritikus lépések” részt alább) 300 fordulat/perc gyorsuláson 30 másodperc alatt 1200 fordulat/perc sebességgel.
A fő centrifugálási sebesség a szilíciumlapon lévő SU-8 minta célvastagságának megfelelően állítható.
A chip bélrétegének 500 µm magas SU-8 mintázatainak előállításához a doboz centrifugális bevonatolási és lágy sütési lépéseit (7. és 8. lépés) egymás után megismételtük (lásd a 9. lépést), így két, egyenként 250 µm vastag SU-8 réteget hoztunk létre, amelyeket a doboz 12. lépésében UV-besugárzással rétegezhetünk és egyesíthetünk, így egy 500 µm magas réteget kapunk.
Az SU-8 bevonatú ostyákat óvatosan helyezd egy forró lapra 65 °C-on 5 percig, majd kapcsold át a hőmérsékletet 95 °C-ra, és inkubáld további 40 percig.
A felső mikrocsatornában az SU-8 minta 500 μm magasságának eléréséhez ismételje meg a 7. és 8. lépést két 250 μm vastag SU-8 réteg létrehozásához.
Az UV Mask Aligner segítségével a gyártó utasításai szerint végezzen lámpatesztet a lapka expozíciós idejének kiszámításához. (expozíciós idő, ms) = (expozíciós dózis, mJ/cm2)/(lámpateljesítmény, mW/cm2).
Az expozíciós idő meghatározása után helyezze a fotomaszkot az UV-maszk igazító maszktartójára, majd helyezze a fotomaszkot az SU-8 bevonatú lapkára.
A fotomaszk nyomtatott felületét közvetlenül a szilíciumlap SU-8 bevonatú oldalára kell helyezni az UV-diszperzió minimalizálása érdekében.
Az SU-8 bevonatú ostyát és a fotomaszkot függőlegesen exponáljuk 260 mJ/cm2 UV-fénnyel az előre meghatározott expozíciós időn keresztül (lásd a doboz 10. lépését).
UV-besugárzás után az SU-8-bevonatú szilíciumlapokat 65°C-on 5 percig, majd 95°C-on 15 percig sütöttük mindkét forró lapon, így 200 μm magas mintákat hoztunk létre. A 95°C-on töltött utósütési időt 30 percre növeltük, így 500 µm magas mintákat kaptunk.
Az előhívót egy üvegtálba öntjük, és a sült ostyát a tálba helyezzük. Az SU-8 előhívó mennyisége az üveglap méretétől függően változhat. Ügyeljen arra, hogy elegendő SU-8 előhívót használjon a nem exponált SU-8 teljes eltávolításához. Például, ha egy 150 mm átmérőjű, 1 literes üvegtálat használ, használjon ~300 ml SU-8 előhívót. Fejlessze ki a formát 25 percig, időnként finom forgatással.
Öblítsd le az előhívott formát ~10 ml friss előhívóval, majd pipettával permetezd be az oldatot IPA-val.
Helyezd a wafert egy plazmatisztítóba, és tedd ki oxigénplazma hatásának (légköri gáz, célnyomás 1 × 10−5 Torr, teljesítmény 125 W) 1,5 percig.
Helyezd a lapkát egy vákuumexszikkátorba, benne egy üveglemezzel. A lapkák és a tárgylemezek egymás mellé is helyezhetők. Ha a vákuumexszikkátor egy lemezzel több rétegre van osztva, helyezd a tárgylemezeket az alsó, a lapkákat pedig a felső kamrába. Cseppents 100 μL triklór(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktil)szilán oldatot egy üveglemezre, és vákuumot alkalmazz a szilanizáláshoz.
Olvasszon fel egy fiola fagyasztott Caco-2 sejteket 37°C-os vízfürdőben, majd tegye át a felolvasztott sejteket egy T75-ös lombikba, amely 15 ml 37°C-ra előmelegített Caco-2 táptalajt tartalmaz.
A ~90%-os konfluenciájú Caco-2 sejtek átoltásához először melegítsük fel a Caco-2 táptalajt, a PBS-t és a 0,25% tripszin/1 mM EDTA-t 37°C-os vízfürdőben.
Vákuumszívással szívjuk le a táptalajt. A sejteket kétszer mossuk 5 ml meleg PBS-sel, a vákuumszívás megismétlésével és friss PBS hozzáadásával.