Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo kwa CSS. Kwa matumizi bora, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime hali ya utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Umbile la utumbo wa binadamu huanzisha sifa za crypt-villus za usanifu mdogo wa epithelial wa 3D na mpangilio wa anga. Muundo huu wa kipekee unahitajika ili kudumisha homeostasis ya utumbo kwa kulinda niche ya seli shina kwenye crypt ya msingi kutoka kwa antijeni za vijidudu za nje na metaboliti zao. Zaidi ya hayo, villi ya utumbo na kamasi inayotoa hutoa seli za epithelial zilizotofautishwa kiutendaji zenye kizuizi cha kinga kwenye uso wa mucosal ya utumbo. Kwa hivyo, kuunda upya miundo ya epithelial ya 3D ni muhimu kwa ujenzi wa mifano ya utumbo ndani ya vitro. Ikumbukwe kwamba, uigaji wa kikaboni wa utumbo kwenye chip unaweza kusababisha umbile la 3D la epithelium ya utumbo kwa kazi zilizoboreshwa za kisaikolojia na biomekaniki. Hapa, tunatoa itifaki inayoweza kurudiwa ili kusababisha umbile la utumbo kwa nguvu kwenye utumbo kwenye chip ya microfluidic na pia kwenye chip mseto iliyopachikwa ya Transwell. Tunaelezea njia za kina za utengenezaji wa kifaa, kukuza seli za epithelial za Caco-2 au organoid ya utumbo katika mazingira ya kawaida na pia kwenye jukwaa la microfluidic, kuanzishwa kwa umbile la 3D, na Uainishaji wa epitheliamu ya 3D iliyoanzishwa kwa kutumia mbinu nyingi za upigaji picha. Itifaki hii inafanikisha kuzaliwa upya kwa usanifu mdogo wa utumbo unaofanya kazi kwa kudhibiti mtiririko wa maji ya msingi kwa siku 5. Mbinu yetu ya umbo la ndani ya vitro hutumia mkazo wa kukata unaohusiana na kisaikolojia na mwendo wa mitambo na haihitaji uhandisi au ujanja tata wa seli, ambao unaweza kufanya kazi zaidi ya mbinu zingine zilizopo. Tunaona kwamba itifaki yetu iliyopendekezwa inaweza kuwa na athari kubwa kwa jumuiya ya utafiti wa matibabu, ikitoa njia ya kuzaliwa upya kwa tabaka za epitheliamu ya 3D ya matumbo ndani ya vitro kwa matumizi ya matibabu, kliniki, na dawa.
Majaribio yanaonyesha kwamba seli za Caco-2 za epithelial za matumbo zilizokuzwa katika vifaa vya utumbo-kwenye-chip1,2,3,4,5 au bilayer microfluidic6,7 zinaweza kupitia umbo la 3D la hiari ndani ya vitro bila uelewa wazi wa utaratibu wa msingi. Katika utafiti wetu wa hivi karibuni, tuligundua kuwa kuondolewa kwa wapinzani wa mofogeni waliotolewa kwa msingi kutoka kwa vifaa vya utamaduni ni muhimu na vya kutosha kusababisha umbo la epithelial la 3D ndani ya vitro, ambalo limeonyeshwa na Caco-2 na organonoidi za matumbo zinazotokana na mgonjwa. Seli za epithelial zilithibitishwa. Katika utafiti huu, tulilenga hasa uzalishaji wa seli na usambazaji wa mkusanyiko wa mpinzani hodari wa Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), katika utumbo-kwenye-chipu na vifaa vilivyorekebishwa vya microfluidic vyenye viingilio vya Transwell, vinavyoitwa "Mseto wa Chipu". Tunaonyesha kwamba kuongezwa kwa wapinzani wa Wnt wa nje (kama vile DKK-1, Wnt repressor 1, protini 1 inayohusiana na frizzled iliyotolewa, au Soggy-1) kwenye utumbo wa on-chip huzuia umbo la seli au kuvuruga safu ya epithelial ya 3D iliyopangwa awali, ikidokeza kwamba mkazo wa upinzani wakati wa utamaduni unawajibika kwa umbo la seli za utumbo katika vitro. Kwa hivyo, mbinu ya vitendo ya kufikia umbo la seli imara katika kiolesura cha epithelial ni kuondoa au kudumisha viwango vya wapinzani wa Wnt katika sehemu ya msingi kwa kusafisha kwa nguvu (km, katika majukwaa ya utumbo-kwenye-chipu au mseto-kwenye-chipu) au usambazaji. Vyombo vya habari vya msingi (km, kutoka kwa Transwell huingiza kwenye hifadhi kubwa za msingi katika visima).
Katika itifaki hii, tunatoa mbinu ya kina ya kutengeneza vifaa vidogo vya utumbo-kwenye-chipu na chipsi mseto zinazoingizwa za Transwell (hatua ya 1-5) ili kukuza seli za epithelial za matumbo kwenye utando wenye vinyweleo unaotegemea polydimethylsiloxane (PDMS) (hatua ya 6A, 7A, 8, 9) au utando wa polyester wa Transwell inserts (hatua ya 6B, 7B, 8, 9) na kusababisha umbo la 3D katika vitro (hatua ya 10). Pia tulitambua sifa za seli na molekuli zinazoashiria histogenesis maalum ya tishu na utofautishaji wa seli unaotegemea ukoo kwa kutumia mbinu nyingi za upigaji picha (hatua ya 11-24). Tunasababisha umbo la jeni kwa kutumia seli za epithelial za matumbo ya binadamu, kama vile Caco-2 au organoids za matumbo, katika miundo miwili ya utamaduni yenye maelezo ya kiufundi ikiwa ni pamoja na urekebishaji wa uso wa utando wenye vinyweleo, uundaji wa monolayers za 2D, na biokemikali ya matumbo na Uzazi wa microenvironment ya kibiomechanical. katika vitro. Ili kusababisha umbo la 3D kutoka kwa epithelial ya 2D. tabaka moja, tuliondoa wapinzani wa mofojeni katika aina zote mbili zilizokuzwa kwa kutiririsha njia hiyo hadi kwenye sehemu ya msingi ya utamaduni. Hatimaye, tunatoa uwakilishi wa manufaa ya safu ya epithelial ya 3D inayoweza kuzaliwa upya ambayo inaweza kutumika kuiga ukuaji wa epithelial unaotegemea mofojeni, uundaji wa vijidudu vya muda mrefu kutoka kwa mwenyeji, maambukizi ya vimelea, jeraha la uchochezi, utendakazi mbaya wa kizuizi cha epithelial, na athari za matibabu zinazotegemea probiotic.
Itifaki yetu inaweza kuwa muhimu kwa wanasayansi mbalimbali katika msingi (km, biolojia ya utando wa utumbo, biolojia ya seli shina, na biolojia ya ukuaji) na utafiti uliotumika (km, upimaji wa dawa za kabla ya kliniki, uundaji wa modeli za magonjwa, uhandisi wa tishu, na ugonjwa wa utumbo) athari kubwa. Kwa sababu ya uzazi na uimara wa itifaki yetu ili kusababisha umbo la 3D la epitheliamu ya utumbo ndani ya vitro, tunaona kwamba mkakati wetu wa kiufundi unaweza kusambazwa kwa hadhira inayosoma mienendo ya ishara za seli wakati wa ukuaji wa utumbo, kuzaliwa upya au homeostasis. Kwa kuongezea, itifaki yetu ni muhimu kwa kuhoji maambukizi chini ya mawakala mbalimbali wa kuambukiza kama vile Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 au Vibrio cholerae. Hadhira ya ugonjwa na pathogenesis pia ni muhimu. Matumizi ya mfumo wa microphysiolojia ya utumbo kwenye chipu yanaweza kuruhusu ukuaji wa pamoja wa muda mrefu 10 na tathmini inayofuata ya ulinzi wa mwenyeji, majibu ya kinga na ukarabati wa majeraha yanayohusiana na vimelea katika njia ya utumbo (GI) 11. Matatizo mengine ya GI yanayohusiana na ugonjwa wa utumbo unaovuja, ugonjwa wa celiac, ugonjwa wa Crohn, ugonjwa wa kolitis ya kidonda, pouchitis, au ugonjwa wa utumbo wenye hasira yanaweza kuigwa wakati tabaka za epithelial za matumbo za 3D zinapoandaliwa kwa kutumia tabaka za epithelial za matumbo za mgonjwa za 3D, magonjwa haya ni pamoja na kudhoofika kwa villous, kufupisha crypt, uharibifu wa mucosal, au kizuizi cha epithelial kilichoharibika. Organoids za matumbo zinazotokana na biopsy au seli shina12,13. Ili kuiga vyema ugumu wa mazingira ya ugonjwa, wasomaji wanaweza kufikiria kuongeza aina za seli zinazohusiana na ugonjwa, kama vile seli za damu za pembeni za mgonjwa (PBMCs), kwa mifano iliyo na usanifu mdogo wa villus-crypt wa matumbo wa 3D. seli za kinga maalum za tishu, 5.
Kwa kuwa muundo mdogo wa epithelial wa 3D unaweza kurekebishwa na kuonyeshwa bila mchakato wa kugawanyika, watazamaji wanaofanya kazi kwenye transcriptomics za anga na upigaji picha wa ubora wa juu au ubora wa juu wanaweza kupendezwa na ramani yetu ya mienendo ya anga ya jeni na protini kwenye niches za epithelial. Wanavutiwa na teknolojia. Mwitikio wa vichocheo vya vijidudu au kinga. Zaidi ya hayo, mazungumzo ya muda mrefu ya vijidudu mwenyeji-vijidudu 10, 14 ambayo yanaratibu homeostasis ya utumbo yanaweza kuanzishwa katika safu ya mucosal ya matumbo ya 3D kwa kukuza spishi mbalimbali za vijidudu, jamii za vijidudu au vijidudu vya kinyesi, haswa katika utumbo-kwenye-chipu. katika jukwaa. Mbinu hii inavutia hasa hadhira inayosoma kingamwili ya utando wa mucous, gastroenterology, microbiome ya binadamu, culturomics na microbiolojia ya kliniki inayotaka kukuza microbiota ya utumbo ambayo haikuwa imekuzwa hapo awali katika maabara. Ikiwa itifaki yetu ya mofogenesis ya ndani ya vitro inaweza kubadilishwa kwa miundo ya utamaduni inayoweza kupanuliwa, kama vile viingilio vingi katika sahani 24, 96 au 384 za visima ambazo hujaza tena sehemu za msingi, itifaki inaweza pia kusambazwa kwa wale wanaounda majukwaa ya dawa, ya matibabu au ya uchunguzi wa kiwango cha juu au uthibitishaji kwa tasnia ya chakula. Kama uthibitisho wa kanuni, hivi majuzi tulionyesha uwezekano wa mfumo wa mofogenesis ya kiwango cha juu unaoweza kupanuliwa hadi umbizo la sahani 24 za visima. Zaidi ya hayo, bidhaa nyingi za viungo-kwenye-chipu zimeuzwa16,17,18. Kwa hivyo, uthibitisho wa mbinu yetu ya mofogenesis ya ndani ya vitro unaweza kuharakishwa na kupitishwa na maabara nyingi za utafiti, tasnia au serikali na mashirika ya udhibiti ili kuelewa upangaji upya wa seli wa mofogenesis ya utumbo wa ndani ya vitro katika kiwango cha transcriptomic ili kujaribu dawa au tiba ya kibiolojia Unyonyaji na usafirishaji wa dawa zinazohitajika ulipimwa kwa kutumia vibadala vya utumbo vya 3D au kwa kutumia mifumo maalum au ya kibiashara ya viungo-kwenye-chipu ili kutathmini uwezekano wa kuzaliana tena kwa mchakato wa umbo la utumbo.
Idadi ndogo ya mifano ya majaribio inayohusiana na binadamu imetumika kusoma umbo la epithelial ya utumbo, hasa kutokana na ukosefu wa itifaki zinazoweza kutekelezwa ili kusababisha umbo la 3D katika vitro. Kwa kweli, maarifa mengi ya sasa kuhusu umbo la utumbo yanategemea masomo ya wanyama (km, zebrafish20, panya21 au kuku22).Hata hivyo, ni ya kazi nyingi na ya gharama kubwa, yanaweza kutiliwa shaka kimaadili, na muhimu zaidi, hayaamui kwa usahihi michakato ya ukuaji wa binadamu. Mifumo hii pia ni midogo sana katika uwezo wake wa kujaribiwa kwa njia nyingi zinazoweza kupanuliwa.Kwa hivyo, itifaki yetu ya kurejesha miundo ya tishu ya 3D katika vitro inafanya kazi vizuri zaidi kuliko mifano ya wanyama katika vivo pamoja na mifano mingine ya kitamaduni ya utamaduni wa seli za 2D tuli.Kama ilivyoelezwa hapo awali, kutumia miundo ya epithelial ya 3D kulituruhusu kuchunguza ujanibishaji wa anga wa seli zilizotofautishwa katika mhimili wa crypt-villus kujibu vichocheo mbalimbali vya utando au kinga. Tabaka za epithelial za 3D zinaweza kutoa nafasi ya kusoma jinsi seli za vijidudu zinavyoshindana kuunda niches za anga na mageuko ya ikolojia katika kukabiliana na mambo ya mwenyeji (km, ndani dhidi ya tabaka za nje za kamasi, utokwaji wa IgA na peptidi za antimicrobial). Zaidi ya hayo, mofolojia ya epithelial ya 3D inaweza kuturuhusu kuelewa jinsi microbiota ya utumbo inavyounda jamii zake na kwa kushirikiana hutoa metabolites za vijidudu (k.m., asidi fupi ya mafuta) ambazo huunda mpangilio wa seli na niche za seli shina kwenye miamba ya msingi. Sifa hizi zinaweza kuonyeshwa tu wakati tabaka za epithelial ya 3D zinapoanzishwa katika vitro.
Mbali na mbinu yetu ya kuunda miundo ya epithelial ya utumbo wa 3D, kuna mbinu kadhaa za ndani ya vitro. Utamaduni wa organoid ya utumbo ni mbinu ya kisasa ya uhandisi wa tishu kulingana na kilimo cha seli shina za utumbo chini ya hali maalum za mofolojia23,24,25. Hata hivyo, matumizi ya mifano ya organoid ya 3D kwa ajili ya uchambuzi wa usafiri au uundaji wa pamoja wa vijidudu-vijidudu mara nyingi ni changamoto kwa sababu lumen ya utumbo imefungiwa ndani ya organoid na, kwa hivyo, kuanzishwa kwa vipengele vya luminal kama vile seli za vijidudu au antijeni za nje ni mdogo. Upatikanaji wa lumens za organoid unaweza kuboreshwa kwa kutumia sindano ndogo,26,27 lakini njia hii ni vamizi na inahitaji nguvu nyingi na inahitaji ujuzi maalum ili kufanya kazi. Zaidi ya hayo, tamaduni za kitamaduni za organoid zinazodumishwa katika scaffolds za hidrojeli chini ya hali tuli haziakisi kwa usahihi biomekaniki hai ya ndani ya mwili.
Mbinu zingine zinazotumiwa na vikundi kadhaa vya utafiti hutumia viunzi vya hidrojeli vya 3D vilivyopangwa awali ili kuiga muundo wa epithelial ya utumbo kwa kukuza seli za utumbo wa binadamu zilizotengwa kwenye uso wa jeli. Tengeneza viunzi vya hidrojeli kwa kutumia ukungu zilizochapishwa kwa 3D, zilizosagwa kidogo, au zilizotengenezwa kwa lithographically. Njia hii inaonyesha mpangilio uliojipanga wa seli za epithelial zilizotengwa ndani ya vitro zenye gradients za mofogen husika kisaikolojia, kuanzisha muundo wa epithelial wa uwiano wa juu na mazungumzo ya stroma-epithelial kwa kujumuisha seli za stromal kwenye kiunzi. Hata hivyo, asili ya viunzi vilivyopangwa awali inaweza kuzuia uonyeshaji wa mchakato wa mofolojia wa hiari yenyewe. Mifumo hii pia haitoi mtiririko wa nguvu wa mwangaza au wa kati, bila mkazo wa kukata maji ambao seli za utumbo zinahitaji kupitia umbo la morphogenesis na kupata utendaji wa kisaikolojia. Utafiti mwingine wa hivi karibuni ulitumia viunzi vya hidrojeli kwenye jukwaa la microfluidic na miundo ya epithelial ya matumbo yenye muundo kwa kutumia mbinu za kuchora kwa leza. Organoids ya matumbo ya panya hufuata mifumo iliyochongwa ili kuunda miundo ya mirija ya matumbo, na mtiririko wa maji ndani ya luminal unaweza Ielezwe upya kwa kutumia moduli ya microfluidics.Hata hivyo, modeli hii haionyeshi michakato ya mofolojia ya hiari wala haijumuishi mienendo ya kimekaniki ya utumbo. Mbinu za uchapishaji wa 3D kutoka kundi moja ziliweza kuunda mirija midogo ya utumbo yenye michakato ya mofolojia ya hiari.Licha ya utengenezaji tata wa sehemu tofauti za utumbo ndani ya mirija, modeli hii pia haina mtiririko wa umajimaji wa mwanga na uundaji wa mitambo.Zaidi ya hayo, uendeshaji wa modeli unaweza kuwa mdogo, haswa baada ya mchakato wa uchapishaji wa kibiolojia kukamilika, na kusumbua hali za majaribio au mwingiliano wa seli hadi seli.Badala yake, itifaki yetu iliyopendekezwa hutoa umbo la utumbo la hiari, mkazo wa kukata unaofaa kisaikolojia, biomekaniki zinazoiga mwendo wa utumbo, ufikiaji wa sehemu huru za apical na basolateral, na uundaji upya wa mazingira magumu ya kibiolojia ya moduli.Kwa hivyo, itifaki yetu ya mofolojia ya 3D ya ndani ya vitro inaweza kutoa mbinu inayosaidiana ili kushinda changamoto za mbinu zilizopo.
Itifaki yetu inalenga kikamilifu umbo la epithelial la 3D, huku seli za epithelial pekee zikiwa katika utamaduni na hakuna aina nyingine za seli zinazozunguka kama vile seli za mesenchymal, seli za endothelial, na seli za kinga. Kama ilivyoelezwa hapo awali, kiini cha itifaki yetu ni kuanzishwa kwa umbo la epithelial kwa kuondoa vizuizi vya mofogeni vilivyotolewa upande wa msingi wa njia iliyoletwa. Ingawa moduli imara ya utumbo wetu kwenye chipu na mseto-kwenye-chipu huturuhusu kuunda upya safu ya epithelial ya 3D inayozunguka, ugumu wa ziada wa kibiolojia kama vile mwingiliano wa epithelial-mesenchymal33,34, uwekaji wa Matrix ya nje ya seli (ECM) 35 na, katika mfumo wetu, sifa za crypt-villus zinazowasilisha niches za seli shina katika crypts za msingi bado hazijazingatiwa zaidi. Seli za stromal (km, fibroblasts) katika mesenchyme zina jukumu muhimu katika uzalishaji wa protini za ECM na udhibiti wa umbo la matumbo katika vivo35,37,38. Kuongezwa kwa seli za mesenchymal Kwa mfumo wetu, iliboresha mchakato wa kimofolojia na ufanisi wa uunganishaji wa seli. Safu ya endothelial (yaani, kapilari au limfu) ina jukumu muhimu katika kudhibiti usafirishaji wa molekuli39 na uajiri wa seli za kinga40 katika mazingira madogo ya utumbo. Zaidi ya hayo, vipengele vya mishipa ya damu ambavyo vinaweza kuunganishwa kati ya mifumo ya tishu ni sharti wakati mifumo ya tishu imeundwa kuonyesha mwingiliano wa viungo vingi. Kwa hivyo, seli za endothelial zinaweza kuhitaji kujumuishwa ili kuiga sifa sahihi zaidi za kisaikolojia zenye azimio la kiwango cha viungo. Seli za kinga zinazotokana na mgonjwa pia ni muhimu kwa kuonyesha majibu ya kinga ya asili, uwasilishaji wa antijeni, mazungumzo ya kinga yanayobadilika ya asili, na kinga maalum ya tishu katika muktadha wa kuiga ugonjwa wa utumbo.
Matumizi ya chipsi mseto ni rahisi zaidi kuliko gut-on-a-chip kwa sababu usanidi wa kifaa ni rahisi zaidi na matumizi ya viingilio vya Transwell huruhusu utamaduni unaoweza kupanuliwa wa epithelium ya utumbo.Hata hivyo, viingilio vya Transwell vinavyopatikana kibiashara vyenye utando wa polyester si laini na haviwezi kuiga mienendo kama ya peristaltic.Zaidi ya hayo, sehemu ya apical ya kiingilio cha Transwell kilichowekwa kwenye chipsi mseto kilibaki bila mkazo wowote upande wa apical.Ni wazi, sifa tuli katika sehemu ya apical mara chache huwezesha utamaduni wa bakteria wa muda mrefu katika chipsi mseto.Ingawa tunaweza kusababisha umbo la 3D kwa nguvu katika viingilio vya Transwell tunapotumia chipsi mseto, uhaba wa biomekaniki husika kisaikolojia na mtiririko wa maji ya apical unaweza kupunguza uwezekano wa majukwaa ya chipsi mseto kwa matumizi yanayowezekana.
Uundaji upya kamili wa mhimili wa crypt-villus wa binadamu katika tamaduni za utumbo-kwenye-chipu na mseto-kwenye-chipu haujathibitishwa kikamilifu. Kwa kuwa umbo huanza kutoka kwa safu moja ya epithelial, usanifu mdogo wa 3D sio lazima utoe kufanana kwa kimofolojia na crypts katika mwili. Ingawa tulibainisha idadi ya seli zinazoongezeka karibu na kikoa cha msingi cha crypt katika epithelium ya 3D iliyotengenezwa kwa njia ndogo, crypt na maeneo ya villous hayakuwekwa wazi. Ingawa njia za juu za juu kwenye chip husababisha urefu ulioongezeka wa epithelium iliyotengenezwa kwa njia ndogo, urefu wa juu bado ni mdogo kwa ~300–400 µm. Kina halisi cha crypts za utumbo wa binadamu katika utumbo mdogo na mkubwa ni ~135 µm na ~400 µm, mtawalia, na urefu wa villi ndogo ya utumbo ni ~600 µm41.
Kwa mtazamo wa upigaji picha, upigaji picha wa ubora wa juu wa usanifu mdogo wa 3D katika hali halisi unaweza kupunguzwa hadi kwenye utumbo kwenye chipu, kwa kuwa umbali unaohitajika wa kufanya kazi kutoka kwa lenzi ya lengo hadi safu ya epithelial ni kama milimita chache. Ili kushinda tatizo hili, lengo la mbali linaweza kuhitajika. Zaidi ya hayo, kutengeneza sehemu nyembamba kwa ajili ya utayarishaji wa sampuli ya upigaji picha ni changamoto kutokana na unyumbufu mkubwa wa PDMS. Zaidi ya hayo, kwa kuwa uundaji mdogo wa utumbo kwenye chipu unahusisha kushikamana kwa kudumu kati ya kila safu, ni vigumu sana kufungua au kuondoa safu ya juu ili kuchunguza muundo wa uso wa safu ya epithelial. Kwa mfano, kwa kutumia darubini ya elektroni ya kuchanganua (SEM).
Uozo wa majimaji wa PDMS umekuwa kikwazo katika tafiti zinazotegemea microfluidic zinazoshughulikia molekuli ndogo zinazooza majimaji, kwa kuwa PDMS inaweza kufyonza molekuli hizo zisizooza majimaji. Njia mbadala za PDMS zinaweza kuzingatiwa na vifaa vingine vya polima. Vinginevyo, marekebisho ya uso wa PDMS (km., mipako na vifaa vya lipofili 42 au poli(ethilini glikoli) 43) yanaweza kuzingatiwa ili kupunguza ufyonzaji wa molekuli zinazooza majimaji.
Hatimaye, mbinu yetu haijabainishwa vyema katika suala la kutoa uchunguzi wa kiwango cha juu au jukwaa la majaribio la "saizi moja linalofaa wote" linalofaa kwa mtumiaji. Itifaki ya sasa inahitaji pampu ya sindano kwa kila kifaa kidogo, ambayo inachukua nafasi katika kihifadhi cha CO2 na kuzuia majaribio makubwa. Kikwazo hiki kinaweza kuboreshwa kwa kiasi kikubwa na uwezo wa kupanuka wa miundo bunifu ya utamaduni (km, viingilio vyenye vinyweleo 24, visima 96, au visima 384 vinavyoruhusu kujaza tena na kuondoa vyombo vya habari vya msingi).
Ili kusababisha umbo la 3D la epitheliamu ya utumbo wa binadamu katika vitro, tulitumia kifaa cha utumbo cha chipu ndogo ya maji kilicho na njia mbili ndogo sambamba na utando wa vinyweleo vyenye elastic katikati ili kuunda kiolesura cha lumen-kapilari. Pia tunaonyesha matumizi ya kifaa cha microfluidic cha njia moja (chipu mseto) ambacho hutoa mtiririko endelevu wa msingi chini ya tabaka za epithelia zilizogawanywa kwenye viingilio vya Transwell. Katika majukwaa yote mawili, umbo la seli mbalimbali za epitheliamu ya utumbo wa binadamu linaweza kuonyeshwa kwa kutumia ujanja wa mwelekeo wa mtiririko ili kuondoa wapinzani wa mofojeni kutoka kwa sehemu ya msingi. Utaratibu mzima wa majaribio (Mchoro 1) una sehemu tano: (i) uundaji mdogo wa chipu ya utumbo au chipu mseto inayoweza kuingizwa ya Transwell (hatua ya 1-5; Sanduku la 1), (ii) utayarishaji wa seli za epitheliamu ya utumbo (seli za Caco-2) au organinoidi za utumbo wa binadamu; visanduku 2-5), (iii) utamaduni wa seli za epithelial za matumbo kwenye vipande vya matumbo au vipande mseto (hatua ya 6-9), (iv) uanzishaji wa umbo la 3D ndani ya vitro (hatua ya 10) na (v) ) ili kuainisha muundo mdogo wa epithelial wa 3D (hatua ya 11-24). Hatimaye, kikundi kinachofaa cha udhibiti (kilichojadiliwa zaidi hapa chini) kilibuniwa ili kuthibitisha ufanisi wa umbo la ndani ya vitro kwa kulinganisha umbo la epithelial na vidhibiti vya anga, vya muda, vya masharti, au vya kiutaratibu.
Tulitumia majukwaa mawili tofauti ya utamaduni: utumbo-kwenye-chipu yenye mifereji iliyonyooka au mifereji isiyo na mstari iliyounganishwa, au vijiti mseto vyenye viingilio vya Transwell (TW) kwenye kifaa chenye maji kidogo, kilichotengenezwa kama ilivyoelezwa katika Kisanduku cha 1, na hatua ya 1 -5. "Uundaji wa Kifaa" inaonyesha hatua kuu za kutengeneza chipu moja au chipu mseto. "Utamaduni wa Seli za Epithelial za Utumbo wa Binadamu" inaelezea chanzo cha seli (Caco-2 au organonoidi za utumbo wa binadamu) na utaratibu wa utamaduni unaotumika katika itifaki hii. "Mofogenesis ya ndani ya vitro" inaonyesha hatua za jumla ambazo seli za epithelial zinazotokana na Caco-2 au organoidi hupandwa kwenye chipu ya utumbo au kwenye viingilio vya Transwell vya chipu mseto, ikifuatiwa na uanzishaji wa mofogenesis ya 3D na uundaji wa muundo maalum wa epithelial. Nambari ya hatua ya programu au nambari ya kisanduku imeonyeshwa chini ya kila mshale. Programu hutoa mifano ya jinsi tabaka za epithelial za matumbo zilizoanzishwa zinaweza kutumika, kwa mfano, katika uainishaji wa utofautishaji wa seli, masomo ya fiziolojia ya utumbo, uanzishwaji wa mifumo ikolojia ya vijidudu-wanyama, na magonjwa. uundaji wa mifano. Picha za kinga mwilini katika "Utofautishaji wa Seli" zinazoonyesha viini, F-actin na MUC2 zilizoonyeshwa katika safu ya epithelial ya 3D Caco-2 inayozalishwa kwenye chipu ya utumbo. Ishara ya MUC2 inapatikana katika seli za kikombe na kamasi inayotolewa kutoka kwenye nyuso za utando wa utumbo. Picha za mwangaza katika Fiziolojia ya Utumbo zinaonyesha kamasi inayozalishwa kwa kuchafua asidi ya sialic na mabaki ya N-acetylglucosamine kwa kutumia agglutinin ya ngano ya fluorescent. Picha mbili zinazoingiliana katika "Host-Microbe Co-Cultures" zinaonyesha uundaji wa viini mwilini unaowakilisha mwenyeji kwenye utumbo kwenye chipu. Paneli ya kushoto inaonyesha uundaji wa pamoja wa protini ya kijani kibichi ya fluorescent (GFP) yenye seli za epithelial za 3D Caco-2 zilizoundwa kwa njia ndogo. Paneli ya kulia inaonyesha ujanibishaji wa GFP E. coli iliyokuzwa pamoja na seli za epithelial za 3D Caco-2, ikifuatiwa na kuchafua kinga mwilini na F-actin (nyekundu) na viini (bluu). Uundaji wa mifano ya magonjwa unaonyesha utumbo wenye afya dhidi ya uvujaji kwenye utumbo. Vipande vya uvimbe vilivyo chini ya changamoto ya kisaikolojia na antijeni za bakteria (km, lipopolysaccharide, LPS) na seli za kinga (km, PBMC; kijani). Seli za Caco-2 zilikuzwa ili kuanzisha safu ya epithelial ya 3D. Upau wa kipimo, 50 µm. Picha katika safu ya chini: "Utofautishaji wa seli" zilizorekebishwa kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.2. Oxford University Press; Imetolewa tena kwa ruhusa kutoka kwa Marejeleo.5. NAS; "Utamaduni Mwenza wa Vijidudu Mwenyeji" zilizorekebishwa kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.3. NAS; "Uundaji wa Mfano wa Magonjwa" zilizorekebishwa kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.5. NAS.
Chipu zote mbili za utumbo kwenye chipu na mseto zilitengenezwa kwa kutumia nakala za PDMS ambazo ziliondolewa kutoka kwa ukungu za silikoni kwa kutumia lithography laini1,44 na kupangiliwa kwa kutumia SU-8. Ubunifu wa njia ndogo katika kila chipu huamuliwa kwa kuzingatia hidrodinamiki kama vile mkazo wa kukata na shinikizo la hidrodinamiki1,4,12. Muundo wa awali wa utumbo kwenye chipu (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 1a), ambao ulikuwa na njia ndogo mbili sambamba zilizounganishwa, umebadilika na kuwa gut-on-a-chipu tata (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 1b) ambao unajumuisha jozi ya njia ndogo zilizopinda ili kusababisha Muda wa makazi ya majimaji ulioongezeka, mifumo isiyo ya mstari wa mtiririko, na uundaji wa axial nyingi wa seli zilizokuzwa (Mchoro 2a–f) 12. Wakati biomekaniki ngumu zaidi ya utumbo zinahitaji kuundwa upya, gut-on-a-chipu tata zinaweza kuchaguliwa. Tumeonyesha kuwa Gut-Chip iliyochanganyikiwa pia husababisha kwa nguvu umbo la 3D katika muda sawa na kiwango sawa cha ukuaji wa epithelial ikilinganishwa na asili. Gut-Chip, bila kujali aina ya seli zilizokuzwa. Kwa hivyo, ili kusababisha umbo la 3D, miundo ya utumbo ya mstari na tata kwenye chipu inaweza kubadilishwa. Nakala za PDMS zilizotibiwa kwenye ukungu za silikoni zenye mifumo ya SU-8 zilitoa sifa hasi baada ya kufutwa (Mchoro 2a). Ili kutengeneza utumbo kwenye chipu, safu ya juu ya PDMS iliyoandaliwa iliunganishwa mfululizo kwenye filamu ya PDMS yenye vinyweleo na kisha kuunganishwa na safu ya chini ya PDMS kwa kuunganisha bila kubadilika kwa kutumia kisafishaji cha korona (Mchoro 2b–f). Ili kutengeneza chipu mseto, nakala za PDMS zilizotibiwa ziliunganishwa kwenye slaidi za glasi ili kuunda vifaa vya microfluidic vya njia moja ambavyo vinaweza kubeba viingilio vya Transwell (Mchoro 2h na Mchoro wa Data Iliyoongezwa 2). Mchakato wa kuunganisha unafanywa kwa kutibu nyuso za nakala ya PDMS na glasi kwa plasma ya oksijeni au matibabu ya korona. Baada ya kuua vijidudu kwa kifaa kilichotengenezwa kwa microfabricated kilichounganishwa kwenye bomba la silikoni, usanidi wa kifaa ulikuwa tayari kufanya umbo la 3D la epithelium ya utumbo (Mchoro 2g).
a, Mchoro wa kimkakati wa utayarishaji wa sehemu za PDMS kutoka kwa ukungu za silikoni zenye muundo wa SU-8. Myeyusho wa PDMS ambao haujatibiwa ulimwagwa kwenye ukungu wa silikoni (kushoto), ukaponywa kwa 60 °C (katikati) na ukaondolewa (kulia). PDMS iliyoondolewa ilikatwa vipande vipande na kusafishwa kwa matumizi zaidi.b, Picha ya ukungu wa silikoni uliotumika kuandaa safu ya juu ya PDMS.c, Picha ya ukungu wa silikoni uliotumika kutengeneza utando wenye vinyweleo vya PDMS.d, Mfululizo wa picha za vipengele vya juu na vya chini vya PDMS na kifaa cha utumbo kilichokusanyika kwenye chip.k., Mchoro wa mpangilio wa vipengele vya juu, utando, na vya chini vya PDMS.Kila safu imeunganishwa bila kubadilika na matibabu ya plasma au corona.f, Mchoro wa kifaa kilichotengenezwa cha utumbo-kwenye-chipu chenye njia ndogo zilizounganishwa na vyumba vya utupu.k., Usanidi wa utumbo-kwenye-chipu kwa ajili ya uundaji wa seli ndogo za maji.Utumbo uliotengenezwa kwenye chip uliokusanywa na bomba la silikoni na sindano uliwekwa kwenye kifuniko.Kifaa cha chip kiliwekwa kwenye kifuniko cha Sahani ya Petri ya milimita 150 kwa ajili ya usindikaji. Kifungashio hutumika kufunga bomba la silikoni.h, Picha za kuona za utengenezaji wa chipu mseto na umbo la 3D kwa kutumia chipu mseto. Viingilio vya Transwell vilivyotayarishwa kwa kujitegemea ili kukuza tabaka moja za 2D za seli za epithelial za matumbo viliingizwa kwenye chipu mseto ili kusababisha umbo la 3D la matumbo. Kifaa hupitiwa kupitia njia ndogo chini ya safu ya seli iliyowekwa kwenye kiingilio cha Transwell. Upau wa kipimo, 1 cm.h Imechapishwa tena kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.4. Elsevier.
Katika itifaki hii, mstari wa seli za Caco-2 na oganoidi za matumbo zilitumika kama vyanzo vya epithelial (Mchoro 3a). Aina zote mbili za seli zilikuzwa kwa kujitegemea (Kisanduku 2 na Kisanduku 5) na kutumika kupanda njia ndogo za utumbo zilizofunikwa na ECM au viingilio vya Transwell. Wakati seli zinapokutana (>95% ya kifuniko katika chupa), seli za Caco-2 zilizokuzwa mara kwa mara (kati ya vifungu 10 na 50) katika chupa za T huvunwa ili kuandaa viunganishi vya seli vilivyotenganishwa na maji ya trypsinize (kisanduku 2). Oganoidi za matumbo ya binadamu kutoka kwa biopsy ya matumbo au upasuaji zilikuzwa katika kuba za jukwaa la Matrigel katika sahani za visima 24 ili kusaidia mazingira madogo ya kimuundo. Viumbe vya kati vyenye mofolojia muhimu (kama vile Wnt, R-spondin, na Noggin) na vipengele vya ukuaji vilivyoandaliwa kama ilivyoelezwa katika Kisanduku 3 viliongezwa kila siku nyingine hadi oganoidi zitakapokua hadi ~500 µm kwa kipenyo. Oganoidi zilizokua kikamilifu huvunwa na Imetenganishwa katika seli moja kwa ajili ya kupanda kwenye utumbo au viingilio vya Transwell kwenye chip (Sanduku la 5). Kama tulivyoripoti hapo awali, inaweza kutofautishwa kulingana na aina ya ugonjwa12,13 (km ugonjwa wa kolitis ya kidonda, ugonjwa wa Crohn, saratani ya utumbo mpana, au mtoaji wa kawaida), eneo la kidonda (km, kidonda dhidi ya eneo lisilo na vidonda) na eneo la utumbo katika njia ya utumbo (km, duodenum, jejunum, ileum, cecum, utumbo mpana, au rectum). Tunatoa itifaki iliyoboreshwa katika Sanduku la 5 kwa ajili ya kukuza organoids za koloni (coloids) ambazo kwa kawaida huhitaji viwango vya juu vya morphogens kuliko organoids za matumbo madogo.
a, Mtiririko wa kazi kwa ajili ya kuanzishwa kwa umbo la utumbo katika chipu ya utumbo. Epithelium ya utumbo wa binadamu wa Caco-2 na oganoidi za utumbo hutumika katika itifaki hii kuonyesha umbo la 3D. Seli za epithelial zilizotengwa zilipandwa katika kifaa kilichoandaliwa cha utumbo-kwenye-chipu (maandalizi ya chipu). Mara tu seli zinapopandwa (kupandwa) na kuunganishwa (kuunganishwa) kwenye utando wenye vinyweleo vya PDMS siku ya 0 (D0), mtiririko wa apical (AP) huanzishwa na kudumishwa kwa siku 2 za kwanza (mtiririko, AP, D0-D2). Mtiririko wa msingi (BL) pia huanzishwa pamoja na mwendo wa kunyoosha mzunguko (kunyoosha, mtiririko, AP na BL) wakati safu moja kamili ya 2D imeundwa. Umbo la 3D la utumbo lilitokea ghafla baada ya siku 5 za utamaduni wa microfluidic (mofogenesis, D5). Picha za utofautishaji wa awamu zinaonyesha umbo wakilishi wa seli za Caco-2 katika kila hatua ya majaribio au wakati (grafu ya mihimili, 100 µm). Michoro minne ya michoro inayoonyesha msururu unaolingana ya umbo la utumbo (juu kulia). Mishale yenye vitone katika mpangilio inawakilisha mwelekeo wa mtiririko wa maji.b, picha ya SEM inayoonyesha topolojia ya uso wa epithelium ya 3D Caco-2 iliyoanzishwa (kushoto). Kipande kinachoangazia eneo lililokuzwa (sanduku jeupe lenye vitone) kinaonyesha microvilli iliyotengenezwa upya kwenye safu ya 3D Caco-2 (kulia).c, Mwonekano wa mbele mlalo wa Caco-2 3D iliyoanzishwa, claudin (ZO-1, nyekundu) na utando wa mpaka wa brashi unaoendelea ulioandikwa F-actin (kijani) na viini (bluu) Taswira ya kinga ya seli za epithelial kwenye vipande vya matumbo. Mishale inayoelekeza kwenye mpangilio wa kati inaonyesha eneo la ndege ya kitovu kwa kila mwonekano wa kitovu.d, Mkondo wa muda wa mabadiliko ya kimofolojia katika organoids zilizokuzwa kwenye chipu iliyopatikana kwa hadubini ya utofautishaji wa awamu siku ya 3, 7, 9, 11, na 13. Kipande kinachoangazia (juu kulia) kinaonyesha ukuzaji wa juu wa picha iliyotolewa.k., fotografi ya DIC ya epithelium ya 3D ya organoid iliyoanzishwa kwenye utumbo kwenye kipande kilichochukuliwa siku ya 7.f, Picha za kinga zilizofunikwa zinazoonyesha alama za seli shina (LGR5; magenta), seli za kikombe (MUC2; kijani), F-actin (kijivu) na viini (cyan) vilivyopandwa kwenye vipande vya utumbo kwa siku 3, mtawalia (Kushoto) na organoidi za siku 13 (katikati) kwenye safu ya epithelial.Tazama pia Mchoro wa Data Iliyoongezwa 3, unaoangazia ishara ya LGR5 bila ishara ya MUC2.Picha za mwangaza zinazoonyesha muundo mdogo wa epithelial (kulia) wa epithelium ya organoid ya 3D iliyowekwa kwenye utumbo kwenye chipu kwa kuchafua utando wa plasma na rangi ya CellMask (kulia) siku ya 13 ya utamaduni. Upau wa kipimo ni 50 μm isipokuwa imeelezwa vinginevyo.b Imechapishwa tena kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.2. Oxford University Press; c Imebadilishwa kwa ruhusa kutoka kwa Marejeleo.2. Oxford University Press; e na f imebadilishwa kwa ruhusa kwa marejeleo.12 Chini ya Leseni ya Creative Commons CC BY 4.0.
Katika utumbo kwenye chipu, ni muhimu kurekebisha uso wa hidrofobi wa utando wenye vinyweleo vya PDMS kwa ajili ya mipako ya ECM iliyofanikiwa. Katika itifaki hii, tunatumia mbinu mbili tofauti kurekebisha hidrofobi ya utando wa PDMS. Kwa ajili ya kukuza seli za Caco-2, uanzishaji wa uso kwa matibabu ya UV/ozoni pekee ulitosha kupunguza hidrofobi ya uso wa PDMS, kufunika ECM na kuunganisha seli za Caco-2 kwenye utando wa PDMS. Hata hivyo, utamaduni wa microfluidic wa epithelium ya organoid unahitaji utendaji kazi wa uso unaotegemea kemikali ili kufikia uwekaji mzuri wa protini za ECM kwa kutumia polyethilinimine (PEI) na glutaraldehyde mfululizo kwenye njia ndogo za PDMS. Baada ya marekebisho ya uso, protini za ECM ziliwekwa ili kufunika uso wa PDMS unaofanya kazi na kisha kuletwa kwenye epithelium ya organoid iliyotengwa. Baada ya seli kuunganishwa, utamaduni wa seli ya microfluidic huanza kwa kuingiza tu kati kwenye njia ndogo ya juu hadi seli zitengeneze safu moja kamili, huku njia ndogo ya chini ikidumisha hali tuli. Njia hii iliyoboreshwa ya uanzishaji wa uso na mipako ya ECM huwezesha uunganishaji wa organoid. epitheliamu ili kusababisha umbo la 3D kwenye uso wa PDMS.
Utamaduni wa Transwell pia unahitaji mipako ya ECM kabla ya kupanda seli; hata hivyo, utamaduni wa Transwell hauhitaji hatua ngumu za matibabu ya awali ili kuamsha uso wa viingilio vyenye vinyweleo. Kwa ajili ya kukuza seli za Caco-2 kwenye viingilio vya Transwell, mipako ya ECM kwenye viingilio vyenye vinyweleo huharakisha kushikamana kwa seli za Caco-2 zilizotenganishwa (
Sifa za kimofolojia za tabaka za epithelial za 3D zilizoundwa kwa njia ndogo zinaweza kuchanganuliwa kwa kutumia mbinu mbalimbali za upigaji picha, ikiwa ni pamoja na hadubini ya utofautishaji wa awamu, hadubini ya utofautishaji wa tofauti (DIC), SEM, au hadubini ya confocal ya immunofluorescence (Michoro 3 na 4). Upigaji picha wa utofautishaji wa awamu au DIC unaweza kufanywa kwa urahisi wakati wowote wakati wa uundaji ili kufuatilia umbo na utokezi wa tabaka za epithelial za 3D. Kutokana na uwazi wa macho wa PDMS na filamu za polyester, majukwaa ya gut-on-a-chip na mseto wa chipu yanaweza kutoa upigaji picha wa wakati halisi bila hitaji la kugawa au kutenganisha kifaa. Wakati wa kufanya upigaji picha wa immunofluorescence (Michoro 1, 3c, f na 4b, c), seli kwa kawaida huwekwa na 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), ikifuatiwa na Triton X-100 na 2% (wt/vol)) serum albumin (BSA), kwa mpangilio. Kulingana na aina ya seli, virekebisho tofauti, Vipenyezaji, na mawakala wa kuzuia vinaweza kutumika. Viungo vya kingamwili vya msingi vinavyolenga alama za seli au eneo linalotegemea ukoo hutumika kuangazia seli ambazo haziwezi kuhama kwenye chipu, ikifuatiwa na kingamwili za pili pamoja na rangi ya kupinga inayolenga kiini (km, 4′, 6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) au F-actin (km, phalloidin yenye lebo ya fluorescent). Upigaji picha wa moja kwa moja unaotegemea fluorescence unaweza pia kufanywa katika chipu ili kugundua uzalishaji wa kamasi (Mchoro 1, "Utofautishaji wa seli" na "Fiziolojia ya Utumbo"), ukoloni wa nasibu wa seli za vijidudu (Mchoro 1, "Utamaduni mwenza wa vijidudu mwenyeji"), uajiri wa seli za kinga (Mchoro 1, 'Uundaji wa Mfano wa Magonjwa') au mtaro wa mofolojia ya epithelial ya 3D (Mchoro 3c, f na 4b, c). Wakati wa kurekebisha utumbo kwenye chipu ili kutenganisha safu ya juu kutoka kwa safu ya chini ya mikrochaneli, kama ilivyoelezwa katika marejeleo. Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 2, epithelial ya 3D Mofolojia pamoja na villi ndogo kwenye mpaka wa brashi ya apical inaweza kuonyeshwa kwa kutumia SEM (Mchoro 3b). Usemi wa alama za utofautishaji unaweza kutathminiwa kwa kufanya PCR5 ya kiasi au mpangilio wa RNA ya seli moja. Katika hali hii, tabaka za 3D za seli za epithelial zinazopandwa kwenye chipsi za utumbo au chipsi mseto huvunwa kwa kutumia trypsination na kisha kutumika kwa uchambuzi wa molekuli au kijenetiki.
a, Mtiririko wa kazi kwa ajili ya kuanzishwa kwa umbo la utumbo katika chipu mseto. Caco-2 na oganoidi za utumbo hutumika katika itifaki hii kuonyesha umbo la 3D katika jukwaa la chipu mseto. Seli za epithelial zilizotenganishwa zilipandwa katika viingilio vya Transwell vilivyoandaliwa (maandalizi ya TW; tazama mchoro hapa chini). Mara tu seli zilipopandwa (kupandwa) na kuunganishwa na utando wa polyester katika viingilio vya Transwell, seli zote zilikuzwa chini ya hali tuli (utamaduni wa TW). Baada ya siku 7, kiingilio kimoja cha Transwell chenye safu moja ya 2D ya seli za epithelial kiliunganishwa kwenye chipu mseto ili kuanzisha mtiririko wa msingi (Flow, BL), ambao hatimaye ulisababisha kizazi cha safu ya epithelial ya 3D (umbo). Mikrografu ya utofautishaji wa awamu inayoonyesha sifa za umbo la seli za epithelial za viungo vya binadamu zinazotokana na koloni inayopanda ya kawaida (mstari wa C103) katika kila hatua ya majaribio au wakati. Michoro katika tabaka za juu inaonyesha usanidi wa majaribio kwa kila hatua.b, Chipu mseto (mchoro wa kushoto) unaweza kusababisha umbo la 3D la epithelial ya organoid seli zenye mitazamo ya hadubini ya juu-chini iliyochukuliwa katika nafasi tofauti za Z (juu, kati, na chini; tazama mistari ya mchoro wa kulia na mistari yenye nukta inayolingana). zilionyesha sifa dhahiri za kimofolojia. F-actin (cyan), kiini (kijivu).c, Mikrografu ya mchoro wa Fluorescence (mwonekano wa pembe ya 3D) ya seli za epithelial zinazotokana na organoidi zilizokuzwa katika Transwell tuli (TW; kipengee ndani ya kisanduku cheupe chenye dashibodi) dhidi ya chipu mseto (picha kamili kubwa zaidi) ikilinganisha mofolojia ya 2D dhidi ya 3D, mtawalia. Jozi ya mitazamo ya mtambuka ya wima ya 2D (kipengee ndani ya kona ya juu kulia; "XZ") pia inaonyesha vipengele vya 2D na 3D. Upau wa kipimo, 100 µm.c Imechapishwa tena kwa ruhusa kutoka kwa marejeleo.4. Elsevier.
Vidhibiti vinaweza kutayarishwa kwa kukuza seli zile zile (Caco-2 au seli za epithelial za organoid za matumbo) katika tabaka moja zenye pande mbili chini ya hali ya kitamaduni ya kitamaduni tuli. Ikumbukwe kwamba, kupungua kwa virutubisho kunaweza kusababishwa na uwezo mdogo wa ujazo wa njia ndogo (yaani ~4 µL katika mfereji wa juu kwenye muundo wa asili wa utumbo-chip). Kwa hivyo, mofolojia ya epithelial kabla na baada ya matumizi ya mtiririko wa msingi pia inaweza kulinganishwa.
Mchakato wa lithografia laini unapaswa kufanywa katika chumba safi. Kwa kila safu kwenye chipu (tabaka na utando wa juu na chini) na chipu mseto, barakoa tofauti za picha zilitumika na kutengenezwa kwenye wafer tofauti za silikoni kwa sababu urefu wa chaneli ndogo ulikuwa tofauti. Urefu unaolengwa wa chaneli ndogo za juu na chini za utumbo kwenye chipu ni 500 µm na 200 µm, mtawalia. Urefu unaolengwa wa chaneli ya chipu mseto ni 200 µm.
Weka wafer ya silikoni ya inchi 3 kwenye sahani yenye asetoni. Zungusha sahani kwa upole kwa sekunde 30, kisha kausha wafer kwa hewa. Hamisha wafer kwenye sahani yenye IPA, kisha zungusha sahani kwa sekunde 30 ili kuisafisha.
Mmumunyo wa piranha (mchanganyiko wa peroksidi ya hidrojeni na asidi ya sulfuriki iliyokolea, 1:3 (vol/vol)) unaweza kutumika kwa hiari ili kuondoa mabaki ya kikaboni kutoka kwenye uso wa wafer wa silikoni.
Mmumunyo wa Piranha ni babuzi sana na hutoa joto. Tahadhari zaidi za usalama zinahitajika. Kwa utupaji taka, acha mchanganyiko upoe na uhamishe kwenye chombo safi na kikavu cha taka. Tumia vyombo vya ziada na uweke lebo sahihi kwenye vyombo vya taka. Tafadhali fuata miongozo ya usalama ya kituo kwa taratibu zaidi.
Kausha wafers kwa kuziweka kwenye sahani ya moto yenye joto la nyuzi joto 200 kwa dakika 10. Baada ya upungufu wa maji mwilini, wafer ilitikiswa mara tano hewani ili ipoe.
Mimina ~10 g ya kipingamizi cha mwanga SU-8 2100 katikati ya wafer ya silikoni iliyosafishwa. Tumia kibano kusambaza kipingamizi cha mwanga sawasawa kwenye wafer. Mara kwa mara weka wafer kwenye sahani ya moto yenye joto la 65°C ili kufanya kipingamizi cha mwanga kisishikamane na iwe rahisi kusambaa. Usiweke wafer moja kwa moja kwenye sahani ya moto.
SU-8 ilisambazwa sawasawa kwenye wafer kwa kutumia mipako ya mzunguko. Panga mzunguko unaoingia wa SU-8 kwa sekunde 5-10 ili kuenea kwa kasi ya 500 rpm kwa kasi ya 100 rpm/s. Weka mzunguko mkuu kwa mpangilio wa unene wa 200 µm kwa kasi ya 1,500 rpm, au fikia unene wa 250 µm (na kufanya urefu wa 500 µm kwa safu ya juu ya utumbo kwenye chip; tazama "Hatua muhimu" hapa chini) iliyowekwa kwa kasi ya 300 rpm/s kwa sekunde 30 kwa kasi ya 1,200 rpm.
Kasi kuu ya mzunguko inaweza kubadilishwa kulingana na unene unaolengwa wa muundo wa SU-8 kwenye wafer ya silikoni.
Ili kutengeneza mifumo ya SU-8 yenye urefu wa µm 500 kwa safu ya juu ya utumbo kwenye chipu, mipako ya mzunguko na hatua za kuoka laini za Sanduku hili (hatua ya 7 na 8) zilirudiwa mfululizo (tazama hatua ya 9) ili kutoa tabaka mbili za µm 250. Safu nene ya SU-8, ambayo inaweza kuunganishwa na kuunganishwa na mfiduo wa UV katika hatua ya 12 ya sanduku hili, na kufanya safu kuwa na urefu wa µm 500.
Oka laini vipande vya wafer vilivyofunikwa na SU-8 kwa kuweka vipande vya wafer kwa uangalifu kwenye sahani yenye joto kali kwa nyuzi joto 65 kwa dakika 5, kisha badilisha mpangilio hadi nyuzi joto 95 na uviweke kwenye incubator kwa dakika 40 zaidi.
Ili kufikia urefu wa μm 500 wa muundo wa SU-8 katika njia ndogo ya juu, rudia hatua za 7 na 8 ili kutoa tabaka mbili za SU-8 zenye unene wa μm 250.
Kwa kutumia Kilinganishi cha Barakoa cha UV, fanya jaribio la taa kulingana na maagizo ya mtengenezaji ili kuhesabu muda wa mfiduo wa wafer. (muda wa mfiduo, ms) = (kipimo cha mfiduo, mJ/cm2)/(nguvu ya taa, mW/cm2).
Baada ya kubaini muda wa kuathiriwa, weka barakoa ya picha kwenye kishikilia barakoa cha kilinganishi cha barakoa cha UV na uweke barakoa ya picha kwenye wafer iliyofunikwa na SU-8.
Weka uso uliochapishwa wa barakoa ya picha moja kwa moja kwenye upande uliofunikwa na SU-8 wa wafer ya silikoni ili kupunguza utawanyiko wa UV.
Weka wafer iliyofunikwa na SU-8 na barakoa ya picha wima hadi 260 mJ/cm2 ya mwanga wa UV kwa muda uliopangwa wa mfiduo (tazama hatua ya 10 ya kisanduku hiki).
Baada ya kuathiriwa na miale ya UV, wafers za silikoni zilizofunikwa na SU-8 ziliokwa kwa joto la 65°C kwa dakika 5 na 95°C kwa dakika 15 kwenye kila sahani ya moto ili kutengeneza mifumo yenye urefu wa 200 μm. Ongeza muda wa baada ya kuoka kwa 95°C hadi dakika 30 ili kutengeneza mifumo yenye urefu wa 500 μm.
Kifaa cha kutengeneza hutiwa kwenye sahani ya kioo, na wafer iliyookwa huwekwa kwenye sahani. Kiasi cha kifaa cha kutengeneza SU-8 kinaweza kutofautiana kulingana na ukubwa wa sahani ya kioo. Hakikisha unatumia kifaa cha kutengeneza SU-8 cha kutosha kuondoa kabisa SU-8 isiyo wazi. Kwa mfano, unapotumia sahani ya kioo yenye kipenyo cha milimita 150 yenye ujazo wa lita 1, tumia ~mL 300 za kifaa cha kutengeneza SU-8. Tengeneza umbo hilo kwa dakika 25 kwa mzunguko mpole mara kwa mara.
Suuza ukungu uliotengenezwa kwa kutumia ~10 mL ya kifaa kipya cha kutengeneza na kufuatiwa na IPA kwa kunyunyizia mchanganyiko kwa kutumia bomba.
Weka wafer kwenye kisafishaji cha plasma na uweke kwenye plasma ya oksijeni (gesi ya angahewa, shinikizo lengwa 1 × 10−5 Torr, nguvu 125 W) kwa dakika 1.5.
Weka wafer kwenye kiondoa utupu chenye slaidi ya kioo ndani. Wafer na slaidi zinaweza kuwekwa kando kando. Ikiwa kiondoa utupu kimegawanywa katika tabaka kadhaa kwa kutumia bamba, weka slaidi kwenye chumba cha chini na wafer kwenye chumba cha juu. Tonesha 100 μL ya mchanganyiko wa trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane kwenye slaidi ya kioo na upake utupu kwa ajili ya silanization.
Yeyusha chupa ya seli za Caco-2 zilizogandishwa kwenye bafu ya maji yenye joto la nyuzi joto 37, kisha uhamishe seli zilizoyeyushwa kwenye chupa ya T75 yenye mililita 15 za kiyoyozi cha Caco-2 chenye joto la nyuzi joto 37.
Ili kupitisha seli za Caco-2 katika mkunjo wa ~90%, kwanza tumia mchanganyiko wa joto wa Caco-2, PBS, na 0.25% trypsin/1 mM EDTA katika bafu ya maji yenye joto la 37°C.
Pumua hewa kwenye chombo kwa kufyonza kwa utupu. Osha seli mara mbili kwa kutumia mililita 5 za PBS zenye joto kwa kurudia kufyonza kwa utupu na kuongeza PBS mpya.
Muda wa chapisho: Julai-16-2022
