Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कंपॅटिबिलिटी मोड बंद करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रदर्शित करू.
मानवी आतड्याची आकारनिर्मिती (मॉर्फोजेनेसिस) त्रिमितीय (3D) उपकला सूक्ष्म-वास्तुरचना (मायक्रोआर्किटेक्चर) आणि अवकाशीय संघटनेची (स्पेशियल ऑर्गनायझेशन) क्रिप्ट-व्हिलस वैशिष्ट्ये स्थापित करते. ही अद्वितीय रचना, बेसोल क्रिप्टमधील स्टेम सेल निकेशचे बाह्य सूक्ष्मजैविक प्रतिजन (अँटीजेन्स) आणि त्यांच्या चयापचय पदार्थांपासून (मेटाबोलाइट्स) संरक्षण करून आतड्याचे होमियोस्टॅसिस राखण्यासाठी आवश्यक आहे. याव्यतिरिक्त, आतड्यातील व्हिली आणि स्रवणारा श्लेष्मा (म्युकस), कार्यात्मकदृष्ट्या विभेदित उपकला पेशींना आतड्याच्या श्लेष्मल पृष्ठभागावर (म्युकोसल सरफेस) एक संरक्षक अडथळा प्रदान करतात. म्हणून, इन विट्रो आतड्याचे मॉडेल तयार करण्यासाठी त्रिमितीय (3D) उपकला संरचनांची पुनर्रचना करणे महत्त्वपूर्ण आहे. विशेष म्हणजे, ऑर्गेनिक मिमेटिक गट-ऑन-अ-चिप, वर्धित शारीरिक कार्ये आणि जैवयांत्रिकीसह आतड्याच्या उपकलेची उत्स्फूर्त त्रिमितीय (3D) आकारनिर्मिती प्रेरित करू शकते. येथे, आम्ही मायक्रोफ्लुइडिक चिपवर तसेच ट्रान्सवेल एम्बेडेड हायब्रीड चिपमध्ये आतड्याची आकारनिर्मिती प्रभावीपणे प्रेरित करण्यासाठी एक पुनरुत्पादक प्रोटोकॉल सादर करत आहोत. आम्ही उपकरणाची निर्मिती, पारंपरिक परिस्थितीत तसेच मायक्रोफ्लुइडिक प्लॅटफॉर्मवर कॅको-२ (Caco-2) किंवा आतड्याच्या ऑर्गेनॉइड उपकला पेशींचे संवर्धन, त्रिमितीय (3D) आकारनिर्मितीची प्रेरणा आणि वैशिष्ट्यीकरण यांसाठीच्या तपशीलवार पद्धतींचे वर्णन करतो. अनेक इमेजिंग पद्धती वापरून स्थापित ३डी एपिथेलियाचे पुनरुत्पादन केले जाते. हा प्रोटोकॉल ५ दिवसांसाठी बॅसोलॅटरल द्रव प्रवाहावर नियंत्रण ठेवून कार्यात्मक आतड्याच्या सूक्ष्म-रचनेचे पुनरुत्पादन साधतो. आमची इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस पद्धत शारीरिकदृष्ट्या संबंधित शियर स्ट्रेस आणि यांत्रिक गतीचा वापर करते आणि त्यासाठी जटिल सेल इंजिनिअरिंग किंवा हाताळणीची आवश्यकता नसते, ज्यामुळे ती इतर विद्यमान तंत्रांपेक्षा सरस ठरू शकते. आम्हाला असे वाटते की आमच्या प्रस्तावित प्रोटोकॉलचे बायोमेडिकल संशोधन समुदायासाठी व्यापक परिणाम होऊ शकतात, ज्यामुळे बायोमेडिकल, क्लिनिकल आणि फार्मास्युटिकल अनुप्रयोगांसाठी इन विट्रोमध्ये ३डी आतड्याच्या एपिथेलियल थरांचे पुनरुत्पादन करण्याची एक पद्धत उपलब्ध होईल.
प्रयोगांनी हे दाखवून दिले आहे की, गट-ऑन-अ-चिप¹,²,³,⁴,⁵ किंवा बायलेअर मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणांमध्ये⁶,⁷ संवर्धित केलेल्या आतड्याच्या एपिथेलियल Caco-2 पेशींमध्ये, त्यामागील यंत्रणेची स्पष्ट माहिती नसतानाही, इन विट्रोमध्ये उत्स्फूर्तपणे ३डी मॉर्फोजेनेसिस होऊ शकतो. आमच्या अलीकडील अभ्यासात, आम्हाला असे आढळले की इन विट्रोमध्ये ३डी एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी संवर्धन उपकरणांमधून बॅसोलॅटरली स्रवलेल्या मॉर्फोजेन अँटागोनिस्ट्सना काढून टाकणे आवश्यक आणि पुरेसे आहे, जे Caco-2 आणि रुग्णांपासून घेतलेल्या आतड्याच्या ऑर्गॅनॉइड्सद्वारे सिद्ध झाले आहे. एपिथेलियल पेशींची पडताळणी करण्यात आली. या अभ्यासात, आम्ही विशेषतः 'गट-ऑन-अ-चिप' आणि 'हायब्रीड चिप' नावाच्या, ट्रान्सवेल इन्सर्ट्स असलेल्या सुधारित मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणांमध्ये, एका प्रभावी Wnt अँटागोनिस्ट, डिककॉफ-1 (DKK-1) च्या पेशी उत्पादन आणि सांद्रता वितरणावर लक्ष केंद्रित केले. आम्ही हे दाखवून देतो की ऑन-चिप गटमध्ये बाह्य Wnt अँटागोनिस्ट्स (जसे की DKK-1, Wnt रिप्रेसर 1, सिक्रेटेड फ्रिझल्ड-रिलेटेड प्रोटीन 1, किंवा सॉगी-1) टाकल्याने मॉर्फोजेनेसिसला प्रतिबंध होतो किंवा पूर्वरचित 3D एपिथेलियल थर विस्कळीत होतो, जे सूचित करते की कल्चर दरम्यानचा अँटागोनिस्टिक ताण हा इन विट्रो आतड्यांच्या मॉर्फोजेनेसिससाठी जबाबदार आहे. म्हणून, एपिथेलियल इंटरफेसवर मजबूत मॉर्फोजेनेसिस साध्य करण्यासाठी एक व्यावहारिक दृष्टिकोन म्हणजे सक्रिय फ्लशिंग (उदा., गट-ऑन-अ-चिप किंवा हायब्रीड-ऑन-अ-चिप प्लॅटफॉर्ममध्ये) किंवा डिफ्यूजनद्वारे बॅसोलॅटरल कंपार्टमेंटमधील Wnt अँटागोनिस्ट्सची पातळी काढून टाकणे किंवा किमान राखणे. बॅसोलॅटरल मीडिया (उदा., ट्रान्सवेल इन्सर्ट्समधून मोठ्या विहिरींमधील बॅसोलॅटरल जलाशय).
या प्रोटोकॉलमध्ये, आम्ही गट-ऑन-अ-चिप मायक्रोडिव्हाइसेस आणि ट्रान्सवेल-इन्सर्टेबल हायब्रीड चिप्स (पायऱ्या १-५) तयार करण्याची एक सविस्तर पद्धत देतो, ज्याद्वारे पॉलीडायमेथिलसिलोक्सेन (PDMS)-आधारित सच्छिद्र पडद्यांवर (पायऱ्या ६अ, ७अ, ८, ९) किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्ट्सच्या पॉलिस्टर पडद्यांवर (पायऱ्या ६ब, ७ब, ८, ९) आतड्याच्या उपकला पेशींचे संवर्धन केले जाते आणि इन विट्रोमध्ये ३डी मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित केले जाते (पायरी १०). आम्ही अनेक इमेजिंग पद्धती (पायऱ्या ११-२४) वापरून ऊतक-विशिष्ट हिस्टोजेनेसिस आणि वंश-अवलंबित पेशीय विभेदन दर्शवणारी पेशीय आणि आण्विक वैशिष्ट्ये देखील ओळखली. आम्ही मानवी आतड्याच्या उपकला पेशी, जसे की Caco-2 किंवा आतड्याचे ऑर्गेनॉइड्स, वापरून दोन संवर्धन स्वरूपांमध्ये मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करतो, ज्यामध्ये सच्छिद्र पडद्यांचे पृष्ठभाग बदलणे, २डी मोनोलेयर्सची निर्मिती, आणि आतड्याच्या जैवरासायनिक आणि जैवयांत्रिक सूक्ष्म-पर्यावरणाचे इन विट्रोमध्ये पुनरुत्पादन यासह तांत्रिक तपशील समाविष्ट आहेत. २डी उपकला मोनोलेयर्समधून ३डी मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी, कल्चरच्या बॅसोलॅटरल कंपार्टमेंटमध्ये माध्यम प्रवाहित करून आम्ही दोन्ही कल्चर केलेल्या स्वरूपांमधील मॉर्फोजेन अँटागोनिस्ट काढून टाकले. शेवटी, आम्ही एका पुनरुत्पादक 3D एपिथेलियल थराच्या उपयुक्ततेचे सादरीकरण करतो, ज्याचा उपयोग मॉर्फोजेन-अवलंबित एपिथेलियल वाढ, अनुदैर्ध्य होस्ट-मायक्रोबायोम को-कल्चर, रोगजनक संसर्ग, दाहक इजा, एपिथेलियल बॅरियर डिसफंक्शन आणि प्रोबायोटिक-आधारित उपचार पद्धतींचे मॉडेल बनवण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
आमची कार्यपद्धती मूलभूत (उदा., आतड्याच्या श्लेष्मल त्वचेचे जीवशास्त्र, स्टेम सेल जीवशास्त्र आणि विकासात्मक जीवशास्त्र) आणि उपयोजित संशोधनातील (उदा., प्रीक्लिनिकल औषध चाचणी, रोग मॉडेलिंग, ऊतक अभियांत्रिकी आणि गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजी) शास्त्रज्ञांच्या विस्तृत वर्गासाठी उपयुक्त ठरू शकते. इन विट्रोमध्ये आतड्याच्या उपकलेचे ३डी आकारजनन (मॉर्फोजेनेसिस) प्रेरित करण्यासाठी आमच्या कार्यपद्धतीच्या पुनरुत्पादकता आणि मजबुतीमुळे, आम्हाला असे वाटते की आमची तांत्रिक रणनीती आतड्याच्या विकासादरम्यान, पुनरुत्पादनादरम्यान किंवा होमियोस्टॅसिस दरम्यान पेशी सिग्नलिंगच्या गतिशीलतेचा अभ्यास करणाऱ्या गटांपर्यंत पोहोचवली जाऊ शकते. याव्यतिरिक्त, आमची कार्यपद्धती नोरोव्हायरस ८, सीवर ॲक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनाव्हायरस २ (SARS-CoV-2), क्लोस्ट्रिडियम डिफिसाइल, साल्मोनेला टायफिम्युरियम ९ किंवा व्हिब्रिओ कॉलरा यांसारख्या विविध संसर्गजन्य घटकांखालील संसर्गाची तपासणी करण्यासाठी उपयुक्त आहे. रोगाचे विकृतिविज्ञान आणि रोगजननशास्त्र यांचे प्रेक्षक देखील उपयुक्त आहेत. ऑन-चिप गट मायक्रोफिजियोलॉजी प्रणालीचा वापर अनुदैर्ध्य सह-संवर्धन १० आणि त्यानंतर जठरांत्र (GI) मार्गातील यजमान संरक्षण, रोगप्रतिकारक प्रतिसाद आणि रोगजनक-संबंधित इजा दुरुस्तीचे मूल्यांकन ११ करण्यास अनुमती देऊ शकतो. लीकी गट सिंड्रोम, सेलिआक रोग, क्रोहन रोग, अल्सरेटिव्ह कोलायटिस, पाउचायटिस किंवा इरिटेबल बोवेल सिंड्रोमशी संबंधित इतर GI विकारांचे अनुकरण केले जाऊ शकते जेव्हा रुग्णाच्या 3D आतड्याच्या उपकला थरांचा वापर करून 3D आतड्याचे उपकला थर तयार केले जातात, या रोगांमध्ये व्हिलस ॲट्रोफी, क्रिप्ट शॉर्टनिंग, म्यूकोसल नुकसान किंवा बिघडलेला उपकला अडथळा यांचा समावेश होतो. बायोप्सी किंवा स्टेम सेल-व्युत्पन्न आतड्याचे ऑर्गेनॉइड्स१२,१३. रोगाच्या वातावरणाची उच्च जटिलता अधिक चांगल्या प्रकारे मॉडेल करण्यासाठी, वाचक 3D आतड्याच्या व्हिलस-क्रिप्ट सूक्ष्म-आर्किटेक्चर असलेल्या मॉडेल्समध्ये रुग्णाच्या परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर पेशी (PBMCs) सारख्या रोग-संबंधित पेशी प्रकार जोडण्याचा विचार करू शकतात. ऊतक-विशिष्ट रोगप्रतिकारक पेशी, ५.
3D एपिथेलियल सूक्ष्मसंरचना सेक्शनिंग प्रक्रियेशिवाय स्थिर आणि दृश्यमान केली जाऊ शकत असल्याने, स्पॅशियल ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि उच्च-रिझोल्यूशन किंवा सुपर-रिझोल्यूशन इमेजिंगवर काम करणाऱ्या दर्शकांना एपिथेलियल निकेशवरील जनुके आणि प्रथिनांच्या स्पॅशियोटेम्पोरल डायनॅमिक्सच्या आमच्या मॅपिंगमध्ये रस असू शकतो. तंत्रज्ञानामध्ये रस. सूक्ष्मजैविक किंवा रोगप्रतिकारक उत्तेजनांना प्रतिसाद. शिवाय, आतड्यांच्या होमियोस्टॅसिसचे समन्वय साधणारा लॉंगिट्यूडिनल होस्ट-मायक्रोबायोम क्रॉसटॉक 10, 14 हा 3D आतड्याच्या श्लेष्मल थरात विविध सूक्ष्मजैविक प्रजाती, सूक्ष्मजैविक समुदाय किंवा विष्ठेतील मायक्रोबायोटाचे सह-संवर्धन करून, विशेषतः गट-ऑन-अ-चिपमध्ये स्थापित केला जाऊ शकतो. प्लॅटफॉर्ममध्ये. हा दृष्टिकोन विशेषतः म्युकोसल इम्युनोलॉजी, गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजी, ह्युमन मायक्रोबायोम, कल्चरॉमिक्स आणि क्लिनिकल मायक्रोबायोलॉजीचा अभ्यास करणाऱ्या प्रेक्षकांसाठी आकर्षक आहे, जे प्रयोगशाळेत पूर्वी कल्चर न केलेल्या आतड्यांतील मायक्रोबायोटाचे कल्चर करू इच्छितात. जर आमचा इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल स्केलेबल कल्चर फॉरमॅट्समध्ये, जसे की 24, 96 किंवा 384 वेल प्लेट्समधील मल्टीवेल इन्सर्ट्समध्ये, जे बॅसोलॅटरल कंपार्टमेंट्स सतत भरतात, जुळवून घेता आला, तर हा प्रोटोकॉल फार्मास्युटिकल, बायोमेडिकल किंवा अन्न उद्योगासाठी हाय-थ्रूपुट स्क्रीनिंग किंवा व्हॅलिडेशन प्लॅटफॉर्म विकसित करणाऱ्यांपर्यंत देखील पोहोचवला जाऊ शकतो. तत्त्वाच्या पुराव्यासाठी, आम्ही अलीकडेच 24-वेल प्लेट फॉरमॅटपर्यंत स्केलेबल असलेल्या मल्टिप्लेक्स हाय-थ्रूपुट मॉर्फोजेनेसिस प्रणालीची व्यवहार्यता प्रदर्शित केली. याव्यतिरिक्त, अनेक ऑर्गन-ऑन-अ-चिप उत्पादने व्यावसायिकरित्या उपलब्ध झाली आहेत16,17,18. त्यामुळे, आमच्या इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस पद्धतीचे व्हॅलिडेशन जलद केले जाऊ शकते आणि अनेक संशोधन प्रयोगशाळा, उद्योग किंवा सरकारी आणि नियामक संस्थांद्वारे इन विट्रो आतड्यांतील पेशींच्या रीप्रोग्रामिंगला समजून घेण्यासाठी संभाव्यतः स्वीकारले जाऊ शकते. औषधे किंवा बायोथेरप्युटिक्सची चाचणी घेण्यासाठी ट्रान्सक्रिप्टोमिक स्तरावर मॉर्फोजेनेसिस. आतड्याच्या मॉर्फोजेनेसिस प्रक्रियेची पुनरुत्पादकता तपासण्यासाठी 3D आतड्याच्या सरोगेट्सचा किंवा कस्टम किंवा व्यावसायिक ऑर्गन-ऑन-अ-चिप मॉडेल्सचा वापर करून औषध उमेदवारांचे शोषण आणि वहन यांचे मूल्यांकन केले गेले.
आतड्याच्या उपकला आकारविज्ञानाचा (intestinal epithelial morphogenesis) अभ्यास करण्यासाठी मानवाशी संबंधित मर्यादित प्रायोगिक मॉडेल्सचा वापर केला गेला आहे, याचे मुख्य कारण म्हणजे इन विट्रो (in vitro) मध्ये ३डी आकारविज्ञान (3D morphogenesis) प्रेरित करण्यासाठी अंमलबजावणीयोग्य प्रोटोकॉलचा अभाव. खरं तर, आतड्याच्या आकारविज्ञानाबद्दलचे सध्याचे बरेचसे ज्ञान प्राण्यांवरील अभ्यासावर आधारित आहे (उदा., झेब्राफिश२०, उंदीर२१ किंवा कोंबड्या२२). तथापि, हे अभ्यास श्रम- आणि खर्चिक आहेत, नैतिकदृष्ट्या शंकास्पद असू शकतात आणि सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, ते मानवी विकासात्मक प्रक्रिया अचूकपणे निश्चित करत नाहीत. या मॉडेल्सची बहु-मार्गी स्केलेबल पद्धतीने चाचणी करण्याची क्षमता देखील खूप मर्यादित आहे. म्हणून, इन विट्रोमध्ये ३डी ऊती संरचना पुनरुत्पादित करण्यासाठी आमचा प्रोटोकॉल इन विवो (in vivo) प्राणी मॉडेल्स तसेच इतर पारंपरिक स्थिर २डी पेशी संवर्धन मॉडेल्सपेक्षा सरस ठरतो. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, ३डी उपकला संरचनांचा वापर करून आम्हाला विविध श्लेष्मल किंवा रोगप्रतिकारक उत्तेजनांच्या प्रतिसादात क्रिप्ट-व्हिलस अक्षातील विभेदित पेशींचे अवकाशीय स्थानिकीकरण तपासता आले. ३डी उपकला थर हे अभ्यासण्यासाठी एक जागा प्रदान करू शकतात की सूक्ष्मजीव पेशी अवकाशीय जागा तयार करण्यासाठी कशी स्पर्धा करतात आणि यजमान घटकांच्या (उदा., आतील विरुद्ध बाहेरील) प्रतिसादात पर्यावरणीय उत्क्रांती कशी होते. बाह्य श्लेष्मल थर, IgA आणि प्रतिजैविक पेप्टाइड्सचा स्राव). शिवाय, 3D एपिथेलियल मॉर्फोलॉजीमुळे आपल्याला हे समजण्यास मदत होते की आतड्यातील मायक्रोबायोटा आपले समुदाय कसे तयार करते आणि सहक्रियात्मकरित्या सूक्ष्मजैविक चयापचय उत्पादने (उदा., शॉर्ट-चेन फॅटी ॲसिड) तयार करते, जे बेसल क्रिप्ट्समधील पेशीय रचना आणि स्टेम सेल निकेशला आकार देतात. ही वैशिष्ट्ये केवळ तेव्हाच प्रदर्शित केली जाऊ शकतात जेव्हा 3D एपिथेलियल थर इन विट्रोमध्ये स्थापित केले जातात.
3D आतड्याच्या एपिथेलियल संरचना तयार करण्याच्या आमच्या पद्धतीव्यतिरिक्त, अनेक इन विट्रो पद्धती आहेत. आतड्याचे ऑर्गॅनॉइड कल्चर हे विशिष्ट मॉर्फोजेन परिस्थितीत आतड्याच्या स्टेम पेशींच्या संवर्धनावर आधारित एक अत्याधुनिक टिश्यू इंजिनिअरिंग तंत्र आहे23,24,25. तथापि, वहन विश्लेषणासाठी किंवा होस्ट-मायक्रोबायोम सह-संवर्धनासाठी 3D ऑर्गॅनॉइड मॉडेल्सचा वापर अनेकदा आव्हानात्मक असतो कारण आतड्याची पोकळी (ल्युमेन) ऑर्गॅनॉइडमध्ये बंदिस्त असते आणि त्यामुळे, सूक्ष्मजीव पेशी किंवा बाह्य प्रतिजन (एक्सोजिनस अँटीजेन्स) यांसारख्या पोकळीतील घटकांचा प्रवेश मर्यादित असतो. मायक्रोइंजेक्टरचा वापर करून ऑर्गॅनॉइडच्या पोकळीत प्रवेश सुधारला जाऊ शकतो,26,27 परंतु ही पद्धत आक्रमक (इन्व्हेसिव्ह) आणि श्रम-केंद्रित आहे आणि ती करण्यासाठी विशेष ज्ञानाची आवश्यकता असते. शिवाय, स्थिर परिस्थितीत हायड्रोजेल स्कॅफोल्डमध्ये ठेवलेले पारंपरिक ऑर्गॅनॉइड कल्चर सक्रिय इन विवो बायोमेकॅनिक्सचे अचूकपणे प्रतिबिंब दर्शवत नाहीत.
अनेक संशोधन गटांनी वापरलेल्या इतर पद्धतींमध्ये, जेलच्या पृष्ठभागावर वेगळ्या केलेल्या मानवी आतड्याच्या पेशींचे संवर्धन करून आतड्याच्या उपकला संरचनेची नक्कल करण्यासाठी पूर्वरचित ३डी हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्सचा उपयोग केला जातो. ३डी-मुद्रित, मायक्रो-मिल्ड किंवा लिथोग्राफिकली तयार केलेल्या साच्यांचा वापर करून हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्स तयार केले जातात. ही पद्धत शरीरशास्त्रीयदृष्ट्या संबंधित मॉर्फोजेन ग्रेडियंट्ससह इन विट्रोमध्ये वेगळ्या केलेल्या उपकला पेशींची स्व-संघटित मांडणी दर्शवते, ज्यामुळे स्कॅफोल्डमध्ये स्ट्रोमल पेशींचा समावेश करून उच्च अस्पेक्ट रेशो असलेली उपकला संरचना आणि स्ट्रोमा-उपकला क्रॉसटॉक स्थापित होतो. तथापि, पूर्वरचित स्कॅफोल्ड्सचे स्वरूप स्वयंस्फूर्त मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियेच्या प्रदर्शनास प्रतिबंध करू शकते. हे मॉडेल गतिशील ल्युमिनल किंवा इंटरस्टिशियल प्रवाह देखील प्रदान करत नाहीत, ज्यामुळे आतड्याच्या पेशींना मॉर्फोजेनेसिसमधून जाण्यासाठी आणि शारीरिक कार्य प्राप्त करण्यासाठी आवश्यक असलेल्या फ्लुइड शियर स्ट्रेसची कमतरता भासते. आणखी एका अलीकडील अभ्यासात मायक्रोफ्लुइडिक प्लॅटफॉर्ममध्ये हायड्रोजेल स्कॅफोल्ड्सचा वापर केला गेला आणि लेझर-एचिंग तंत्रांचा वापर करून आतड्याच्या उपकला संरचनांचे नमुने तयार केले गेले. उंदराचे आतड्याचे ऑर्गेनॉइड्स एच केलेल्या नमुन्यांचे अनुसरण करून आतड्याच्या नळीसारख्या संरचना तयार करतात आणि इंट्राल्युमिनल द्रव प्रवाहाची पुनरावृत्ती केली जाऊ शकते. मायक्रोफ्लुइडिक्स मॉड्यूल. तथापि, हे मॉडेल स्वयंस्फूर्त आकारजनन प्रक्रिया दर्शवत नाही किंवा त्यात आतड्यांच्या यांत्रिक-जैविक हालचालींचा समावेश नाही. त्याच गटाच्या ३डी प्रिंटिंग तंत्राद्वारे स्वयंस्फूर्त आकारजनन प्रक्रिया असलेल्या लहान आतड्यांच्या नळ्या तयार करणे शक्य झाले. नळीमध्ये आतड्यांच्या वेगवेगळ्या भागांची गुंतागुंतीची निर्मिती असूनही, या मॉडेलमध्ये देखील पोकळीतील द्रव प्रवाह आणि यांत्रिक विकृतीचा अभाव आहे. याव्यतिरिक्त, मॉडेलची कार्यक्षमता मर्यादित असू शकते, विशेषतः बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया पूर्ण झाल्यानंतर, ज्यामुळे प्रायोगिक परिस्थिती किंवा पेशी-पेशींमधील आंतरक्रिया विचलित होतात. त्याऐवजी, आमचा प्रस्तावित प्रोटोकॉल स्वयंस्फूर्त आतड्यांचे आकारजनन, शारीरिकदृष्ट्या संबंधित कर्तन ताण, आतड्यांच्या हालचालींची नक्कल करणारी जैवयांत्रिकी, स्वतंत्र अग्र आणि अधोपार्श्व कप्प्यांची सुलभता आणि मॉड्यूलरिटीच्या गुंतागुंतीच्या जैविक सूक्ष्म-वातावरणांची पुनर्निर्मिती प्रदान करतो. म्हणून, आमचा इन विट्रो ३डी आकारजनन प्रोटोकॉल विद्यमान पद्धतींमधील आव्हानांवर मात करण्यासाठी एक पूरक दृष्टिकोन प्रदान करू शकतो.
आमचा प्रोटोकॉल पूर्णपणे ३डी एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिसवर केंद्रित आहे, ज्यामध्ये कल्चरमध्ये फक्त एपिथेलियल पेशी असतात आणि मेसेनकायमल पेशी, एंडोथेलियल पेशी आणि रोगप्रतिकारक पेशी यांसारख्या इतर प्रकारच्या सभोवतालच्या पेशी नसतात. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, आमच्या प्रोटोकॉलचा गाभा म्हणजे सादर केलेल्या माध्यमाच्या बॅसोलॅटरल बाजूला स्रवलेले मॉर्फोजेन इनहिबिटर काढून टाकून एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करणे. आमच्या गट-ऑन-अ-चिप आणि हायब्रीड-ऑन-अ-चिपची मजबूत मॉड्युलॅरिटी आम्हाला लहरीदार ३डी एपिथेलियल थर पुन्हा तयार करण्यास अनुमती देत ​​असली तरी, एपिथेलियल-मेसेनकायमल इंटरॅक्शन्स३३,३४, एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्स (ECM) डिपॉझिशन३५ आणि, आमच्या मॉडेलमध्ये, क्रिप्ट-व्हिलस वैशिष्ट्ये जी बेसल क्रिप्ट्समध्ये स्टेम सेल निकेश प्रदान करतात, यांसारख्या अतिरिक्त जैविक गुंतागुंतींचा अधिक विचार करणे बाकी आहे. मेसेनकायममधील स्ट्रोमल पेशी (उदा., फायब्रोब्लास्ट) ECM प्रथिनांच्या उत्पादनात आणि इन विवोमध्ये आतड्याच्या मॉर्फोजेनेसिसच्या नियमनात महत्त्वाची भूमिका बजावतात३५,३७,३८. आमच्या मॉडेलमध्ये मेसेनकायमल पेशींच्या समावेशामुळे मॉर्फोजेनेटिक वाढ झाली. प्रक्रिया आणि पेशी संलग्नता कार्यक्षमता. आतड्याच्या सूक्ष्म वातावरणात आण्विक वहन39 आणि रोगप्रतिकारक पेशींची भरती40 नियंत्रित करण्यात एंडोथेलियल थर (म्हणजेच, केशवाहिन्या किंवा लसिकावाहिन्या) महत्त्वाची भूमिका बजावतो. शिवाय, जेव्हा बहु-अवयव आंतरक्रिया दर्शवण्यासाठी ऊतींचे मॉडेल तयार केले जातात, तेव्हा ऊतींच्या मॉडेल्समध्ये जोडले जाऊ शकणारे रक्तवाहिन्यांचे घटक ही एक पूर्वअट असते. म्हणून, अवयव-स्तरीय रिझोल्यूशनसह अधिक अचूक शारीरिक वैशिष्ट्यांचे मॉडेलिंग करण्यासाठी एंडोथेलियल पेशींचा समावेश करणे आवश्यक असू शकते. आतड्याच्या रोगाचे अनुकरण करण्याच्या संदर्भात जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रतिसाद, अँटीजेन सादरीकरण, जन्मजात अनुकूलक रोगप्रतिकारक संवाद आणि ऊती-विशिष्ट रोगप्रतिकारशक्ती प्रदर्शित करण्यासाठी रुग्णाकडून घेतलेल्या रोगप्रतिकारक पेशी देखील आवश्यक आहेत.
गट-ऑन-अ-चिपच्या तुलनेत हायब्रीड चिप्सचा वापर अधिक सरळ आहे, कारण डिव्हाइसची मांडणी सोपी असते आणि ट्रान्सवेल इन्सर्ट्सच्या वापरामुळे आतड्याच्या उपकलेचे मोठ्या प्रमाणावर संवर्धन करणे शक्य होते. तथापि, पॉलिस्टर पडदे असलेले व्यावसायिकरित्या उपलब्ध ट्रान्सवेल इन्सर्ट्स लवचिक नसतात आणि ते पेरिस्टॅल्टिक-सारख्या हालचालींचे अनुकरण करू शकत नाहीत. शिवाय, हायब्रीड चिपमध्ये ठेवलेल्या ट्रान्सवेल इन्सर्टचा अग्रभाग स्थिर राहिला आणि त्याच्या अग्रभागी कोणताही कर्तन ताण (shear stress) नव्हता. स्पष्टपणे, अग्रभागातील स्थिर गुणधर्मांमुळे हायब्रीड चिप्समध्ये दीर्घकाळ जिवाणूंचे सह-संवर्धन क्वचितच शक्य होते. हायब्रीड चिप्स वापरताना आपण ट्रान्सवेल इन्सर्ट्समध्ये ३डी आकारजनन (3D morphogenesis) प्रभावीपणे प्रेरित करू शकत असलो तरी, शारीरिकदृष्ट्या संबंधित जैवयांत्रिकी (biomechanics) आणि अग्रभागातील द्रव प्रवाहाची कमतरता संभाव्य उपयोगांसाठी हायब्रीड चिप प्लॅटफॉर्मची व्यवहार्यता मर्यादित करू शकते.
गट-ऑन-अ-चिप आणि हायब्रीड-ऑन-अ-चिप कल्चरमध्ये मानवी क्रिप्ट-व्हिलस अक्षाची पूर्ण-प्रमाणातील पुनर्रचना अद्याप पूर्णपणे स्थापित झालेली नाही. आकारजनन (मॉर्फोजेनेसिस) एपिथेलियल मोनोलेयरपासून सुरू होत असल्याने, ३डी सूक्ष्म-वास्तुरचना (मायक्रोआर्किटेक्चर्स) शरीरातील (इन व्हिविओ) क्रिप्ट्सशी आकारिक समानता प्रदान करतीलच असे नाही. जरी आम्ही सूक्ष्म-अभियांत्रिकी (मायक्रोइंजिनिअर्ड) ३डी एपिथेलियममधील मूळ क्रिप्ट डोमेनजवळील वाढणाऱ्या पेशींच्या समूहाचे वैशिष्ट्यीकरण केले असले, तरी क्रिप्ट आणि व्हिलस प्रदेश स्पष्टपणे सीमांकित झाले नव्हते. जरी चिपवरील उंच वरच्या चॅनेलमुळे सूक्ष्म-अभियांत्रिकी एपिथेलियमची उंची वाढली असली, तरी कमाल उंची अजूनही ~३००–४०० µm पर्यंत मर्यादित आहे. लहान आणि मोठ्या आतड्यांमधील मानवी आतड्यांच्या क्रिप्ट्सची वास्तविक खोली अनुक्रमे ~१३५ µm आणि ~४०० µm आहे, आणि लहान आतड्यांच्या व्हिलीची उंची ~६०० µm४१ आहे.
इमेजिंगच्या दृष्टिकोनातून, ३डी सूक्ष्म-रचनांचे इन-सिटू सुपर-रिझोल्यूशन इमेजिंग 'गट ऑन अ चिप'पुरते मर्यादित असू शकते, कारण ऑब्जेक्टिव्ह लेन्सपासून एपिथेलियल थरापर्यंत आवश्यक असलेले वर्किंग डिस्टन्स काही मिलिमीटरच्या श्रेणीतील असते. ही समस्या दूर करण्यासाठी, एका दूरच्या ऑब्जेक्टिव्हची आवश्यकता असू शकते. शिवाय, PDMS च्या उच्च लवचिकतेमुळे इमेजिंग नमुना तयार करण्यासाठी पातळ सेक्शन्स बनवणे आव्हानात्मक आहे. याव्यतिरिक्त, 'गट ऑन अ चिप'च्या थर-दर-थर सूक्ष्म-निर्मितीमध्ये प्रत्येक थरामध्ये कायमस्वरूपी आसंजन (adhesion) समाविष्ट असल्यामुळे, एपिथेलियल थराच्या पृष्ठभागाची रचना तपासण्यासाठी वरचा थर उघडणे किंवा काढणे अत्यंत आव्हानात्मक आहे. उदाहरणार्थ, स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (SEM) वापरून.
हायड्रोफोबिक लहान रेणूंशी संबंधित मायक्रोफ्लुइडिक-आधारित अभ्यासांमध्ये PDMS ची हायड्रोफोबिसिटी हा एक मर्यादा घालणारा घटक ठरला आहे, कारण PDMS अशा हायड्रोफोबिक रेणूंना अनैच्छिकपणे शोषून घेऊ शकते. PDMS ला पर्याय म्हणून इतर पॉलिमरिक पदार्थांचा विचार केला जाऊ शकतो. याव्यतिरिक्त, हायड्रोफोबिक रेणूंचे शोषण कमी करण्यासाठी PDMS च्या पृष्ठभागाचे बदल (उदा. लिपोफिलिक पदार्थ ४२ किंवा पॉली(इथिलीन ग्लायकॉल) ४३ सह लेपन) करण्याचा विचार केला जाऊ शकतो.
शेवटी, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग किंवा "सर्वांसाठी एकच" वापरकर्ता-अनुकूल प्रायोगिक प्लॅटफॉर्म प्रदान करण्याच्या दृष्टीने आमच्या पद्धतीचे पुरेसे वैशिष्ट्यीकरण झालेले नाही. सध्याच्या प्रोटोकॉलनुसार प्रत्येक मायक्रोडिव्हाइससाठी एका सिरिंज पंपाची आवश्यकता असते, जो CO2 इनक्यूबेटरमध्ये जागा व्यापतो आणि मोठ्या प्रमाणावरील प्रयोगांना प्रतिबंध करतो. नाविन्यपूर्ण कल्चर फॉरमॅट्सच्या (उदा., २४-वेल, ९६-वेल, किंवा ३८४-वेल पोरस इन्सर्ट्स जे बॅसोलॅटरल मीडियाचे सतत पुनर्भरण आणि काढण्याची परवानगी देतात) स्केलेबिलिटीद्वारे ही मर्यादा लक्षणीयरीत्या सुधारली जाऊ शकते.
मानवी आतड्याच्या उपकलेचे इन विट्रो (in vitro) 3D आकारजनन (morphogenesis) घडवून आणण्यासाठी, आम्ही एक मायक्रोफ्लुइडिक चिप आतड्याचे उपकरण वापरले, ज्यामध्ये दोन समांतर मायक्रोचॅनेल आणि ल्युमेन-केशिका इंटरफेस (lumen-capillary interface) तयार करण्यासाठी त्यांच्यामध्ये एक लवचिक सच्छिद्र पडदा होता. आम्ही एका सिंगल-चॅनेल मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणाचा (एक हायब्रीड चिप) वापर देखील दाखवतो, जे ट्रान्सवेल इन्सर्टवर वाढवलेल्या ध्रुवीकृत उपकलेच्या थरांखाली सतत बॅसोलॅटरल प्रवाह प्रदान करते. दोन्ही प्लॅटफॉर्मवर, बॅसोलॅटरल कंपार्टमेंटमधून मॉर्फोजेन अँटागोनिस्ट (morphogen antagonists) काढून टाकण्यासाठी प्रवाहाची दिशात्मक हाताळणी करून विविध मानवी आतड्याच्या उपकलेच्या पेशींचे आकारजनन प्रदर्शित केले जाऊ शकते. संपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रियेमध्ये (आकृती 1) पाच भाग आहेत: (i) गट चिप किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्टेबल हायब्रीड चिपचे मायक्रोफॅब्रिकेशन (पायऱ्या 1-5; बॉक्स 1), (ii) आतड्याच्या उपकलेच्या पेशी (Caco-2 पेशी) किंवा मानवी आतड्याच्या ऑर्गेनॉइड्सची तयारी; बॉक्स २-५), (iii) आतड्याच्या चिप्स किंवा हायब्रीड चिप्सवर आतड्याच्या उपकला पेशींचे संवर्धन (पायऱ्या ६-९), (iv) इन विट्रो ३डी मॉर्फोजेनेसिसचे प्रेरण (पायरी १०) आणि (v) ३डी उपकला सूक्ष्मसंरचनेचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी (पायऱ्या ११-२४). शेवटी, उपकला मॉर्फोजेनेसिसची तुलना अवकाशीय, कालिक, सशर्त किंवा प्रक्रियात्मक नियंत्रणांशी करून इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिसची परिणामकारकता प्रमाणित करण्यासाठी एक योग्य नियंत्रण गट (ज्याची चर्चा खाली अधिक केली आहे) तयार करण्यात आला.
आम्ही दोन भिन्न कल्चर प्लॅटफॉर्म वापरले: सरळ चॅनेल किंवा नॉन-लिनियर कॉन्व्होल्यूटेड चॅनेल असलेले 'गट-ऑन-अ-चिप', किंवा बॉक्स १ आणि पायरी १-५ मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे तयार केलेल्या मायक्रोफ्लुइडिक डिव्हाइसमधील ट्रान्सवेल (TW) इन्सर्ट असलेल्या हायब्रीड चिप्स. "डिव्हाइस फॅब्रिकेशन" सिंगल चिप किंवा हायब्रीड चिप बनवण्यातील मुख्य पायऱ्या दर्शवते. "मानवी आतड्याच्या एपिथेलियल पेशींचे कल्चर" या प्रोटोकॉलमध्ये वापरलेला पेशींचा स्रोत (Caco-2 किंवा मानवी आतड्याचे ऑर्गेनॉइड्स) आणि कल्चर प्रक्रिया स्पष्ट करते. "इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस" एकूण पायऱ्या दर्शवते ज्यामध्ये Caco-2 किंवा ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न एपिथेलियल पेशी आतड्याच्या चिपवर किंवा हायब्रीड चिपच्या ट्रान्सवेल इन्सर्टवर कल्चर केल्या जातात, त्यानंतर ३डी मॉर्फोजेनेसिसचे प्रेरण आणि एका वैशिष्ट्यपूर्ण एपिथेलियल संरचनेची निर्मिती होते. प्रत्येक बाणाच्या खाली प्रोग्राम पायरी क्रमांक किंवा बॉक्स क्रमांक दर्शविला आहे. हे ॲप्लिकेशन उदाहरणे प्रदान करते की स्थापित आतड्याच्या एपिथेलियल थरांचा वापर कसा केला जाऊ शकतो, उदाहरणार्थ, पेशी विभेदन वैशिष्ट्यीकरण, आतड्याच्या शरीरविज्ञानाचा अभ्यास, होस्ट-मायक्रोबायोम परिसंस्थांची स्थापना आणि रोग मॉडेलिंगमध्ये. इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमांमध्ये "पेशी विभेदन" आतड्याच्या चिपवर तयार केलेल्या 3D Caco-2 उपकला थरात व्यक्त होणारे केंद्रक, F-actin आणि MUC2 दर्शवते. MUC2 सिग्नलिंग गोब्लेट पेशींमध्ये आणि श्लेष्मल पृष्ठभागातून स्रवणाऱ्या श्लेष्मामध्ये असते. आतड्याच्या शरीरविज्ञानातील प्रतिदीप्त प्रतिमा, प्रतिदीप्त गहू अंकुर ॲग्लुटिनिन वापरून सियालिक ॲसिड आणि N-ॲसिटिलग्लुकोसामाइन अवशेषांसाठी रंगविल्यानंतर तयार झालेला श्लेष्मा दर्शवतात. "यजमान-सूक्ष्मजीव सह-संवर्धन" मधील दोन एकमेकांवर येणाऱ्या प्रतिमा चिपवरील आतड्यातील प्रातिनिधिक यजमान-सूक्ष्मजीव सह-संवर्धन दर्शवतात. डावीकडील पॅनेल सूक्ष्म-अभियांत्रिकी 3D Caco-2 उपकला पेशींसोबत हिरवे प्रतिदीप्त प्रथिन (GFP) व्यक्त करणाऱ्या E. coli चे सह-संवर्धन दर्शवते. उजवीकडील पॅनेल 3D Caco-2 उपकला पेशींसोबत सह-संवर्धित GFP E. coli चे स्थानिकीकरण दर्शवते, ज्यानंतर F-actin (लाल) आणि केंद्रक (निळा) वापरून इम्युनोफ्लोरोसेन्स रंगविणी केली आहे. रोग मॉडेलिंग, जिवाणू प्रतिजनांसह शारीरिक आव्हानाखाली आतड्याच्या दाह चिप्समध्ये निरोगी विरुद्ध गळती असलेले आतडे स्पष्ट करते. (उदा., लिपोपॉलीसॅकराइड, LPS) आणि रोगप्रतिकारक पेशी (उदा., PBMC; हिरव्या). 3D एपिथेलियल थर स्थापित करण्यासाठी Caco-2 पेशींचे संवर्धन केले गेले. स्केल बार, 50 µm. खालच्या ओळीतील प्रतिमा: “पेशींचे विभेदन” संदर्भ 2 मधून परवानगीने रूपांतरित. ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेस; संदर्भ 5 मधून परवानगीने पुनर्मुद्रित. NAS; “यजमान-सूक्ष्मजीव सह-संवर्धन” संदर्भ 3 मधून परवानगीने रूपांतरित. NAS; “रोग मॉडेलिंग” संदर्भ 5 मधून परवानगीने रूपांतरित. NAS.
गट-ऑन-चिप आणि हायब्रीड चिप्स दोन्ही, सॉफ्ट लिथोग्राफी¹,⁴⁴ द्वारे सिलिकॉन मोल्डमधून डिमोल्ड केलेल्या आणि एसयू-८ (SU-8) ने पॅटर्न केलेल्या पीडीएमएस (PDMS) प्रतिकृती वापरून तयार केल्या गेल्या. प्रत्येक चिपमधील मायक्रोचॅनेलची रचना शियर स्ट्रेस आणि हायड्रोडायनॅमिक प्रेशर¹,⁴,¹² यांसारख्या हायड्रोडायनॅमिक्सचा विचार करून ठरवली जाते. मूळ गट-ऑन-अ-चिप डिझाइन (विस्तारित डेटा आकृती १अ), ज्यामध्ये दोन एकमेकांना लागून असलेले समांतर सरळ मायक्रोचॅनेल होते, ते एका जटिल गट-ऑन-अ-चिपमध्ये (विस्तारित डेटा आकृती १ब) विकसित झाले आहे, ज्यामध्ये वाढीव द्रव निवास वेळ, नॉन-लिनियर प्रवाह नमुने आणि संवर्धित पेशींचे बहुअक्षीय विरूपण (आकृती २अ-फ)¹² प्रेरित करण्यासाठी वक्र मायक्रोचॅनेलची एक जोडी समाविष्ट आहे. जेव्हा अधिक जटिल आतड्यांच्या बायोमेकॅनिक्सची पुनर्रचना करण्याची आवश्यकता असते, तेव्हा जटिल गट-ऑन-अ-चिप्स निवडल्या जाऊ शकतात. आम्ही हे दाखवून दिले आहे की, कॉन्व्होल्यूटेड गट-चिप देखील, मूळ रचनेच्या तुलनेत, समान कालावधीत आणि समान प्रमाणात एपिथेलियल वाढीसह ३डी मॉर्फोजेनेसिसला जोरदारपणे प्रेरित करते. मूळ गट-चिप, संवर्धित पेशींच्या प्रकाराची पर्वा न करता. म्हणून, 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी, रेखीय आणि जटिल ऑन-चिप गट डिझाइन अदलाबदल करण्यायोग्य आहेत. SU-8 पॅटर्नसह सिलिकॉन मोल्डवर क्युअर केलेल्या PDMS प्रतिकृतींनी डिमोल्डिंगनंतर नकारात्मक वैशिष्ट्ये प्रदान केली (आकृती 2a). चिपवर आतडे तयार करण्यासाठी, तयार केलेला वरचा PDMS थर एका सच्छिद्र PDMS फिल्मला क्रमशः जोडला गेला आणि नंतर कोरोना ट्रीटर वापरून अपरिवर्तनीय बंधनाद्वारे खालच्या PDMS थराशी संरेखित केला गेला (आकृती 2b–f). हायब्रीड चिप्स तयार करण्यासाठी, क्युअर केलेल्या PDMS प्रतिकृती काचेच्या स्लाईड्सवर जोडल्या गेल्या, ज्यामुळे एकल-चॅनल मायक्रोफ्लुइडिक उपकरणे तयार झाली ज्यात ट्रान्सवेल इन्सर्ट सामावून घेता येतील (आकृती 2h आणि विस्तारित डेटा आकृती 2). PDMS प्रतिकृती आणि काचेच्या पृष्ठभागांवर ऑक्सिजन प्लाझ्मा किंवा कोरोना उपचार करून बंधन प्रक्रिया केली जाते. सिलिकॉन ट्यूबला जोडलेल्या मायक्रोफॅब्रिकेटेड उपकरणाच्या निर्जंतुकीकरणानंतर, आतड्याच्या उपकलेचे 3D मॉर्फोजेनेसिस करण्यासाठी उपकरण सेटअप तयार होते (आकृती). २ ग्रॅम).
a, SU-8 पॅटर्न असलेल्या सिलिकॉन मोल्डमधून PDMS भाग तयार करण्याची योजनाबद्ध आकृती. न घट्ट झालेले PDMS द्रावण सिलिकॉन मोल्डवर ओतले (डावीकडे), 60 °C वर घट्ट केले (मध्यभागी) आणि मोल्डमधून काढले (उजवीकडे). मोल्डमधून काढलेले PDMS तुकड्यांमध्ये कापले आणि पुढील वापरासाठी स्वच्छ केले. b, PDMS चा वरचा थर तयार करण्यासाठी वापरलेल्या सिलिकॉन मोल्डचे छायाचित्र. c, PDMS सच्छिद्र पडदा तयार करण्यासाठी वापरलेल्या सिलिकॉन मोल्डचे छायाचित्र. d, वरच्या आणि खालच्या PDMS घटकांची आणि एकत्र जोडलेल्या ऑन-चिप आतड्याच्या उपकरणाची छायाचित्रांची मालिका. e, वरच्या, पडद्याच्या आणि खालच्या PDMS घटकांच्या मांडणीची योजनाबद्ध आकृती. प्रत्येक थर प्लाझ्मा किंवा कोरोना उपचाराने अपरिवर्तनीयपणे जोडलेला आहे. f, तयार केलेल्या गट-ऑन-अ-चिप उपकरणाची योजनाबद्ध आकृती, ज्यावर वळणदार सूक्ष्म-वाहिन्या आणि निर्वात कक्ष आहेत. g, सूक्ष्म-द्रव पेशी संवर्धनासाठी गट-ऑन-अ-चिपची मांडणी. सिलिकॉन ट्यूब आणि सिरिंजसह एकत्र जोडलेले तयार केलेले गट-ऑन-अ-चिप एका कव्हरस्लिप. प्रक्रियेसाठी चिप उपकरण १५० मिमी पेट्री डिशच्या झाकणावर ठेवण्यात आले. सिलिकॉन ट्यूब बंद करण्यासाठी बाइंडरचा वापर केला जातो. हायब्रीड चिप फॅब्रिकेशन आणि हायब्रीड चिप्स वापरून ३डी मॉर्फोजेनेसिसची दृश्य स्नॅपशॉट्स. आतड्याच्या एपिथेलियल पेशींचे २डी मोनोलेयर्स कल्चर करण्यासाठी स्वतंत्रपणे तयार केलेले ट्रान्सवेल इन्सर्ट्स, आतड्याचे ३डी मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी हायब्रीड चिपमध्ये टाकण्यात आले. ट्रान्सवेल इन्सर्टवर स्थापित केलेल्या पेशींच्या थराखालील मायक्रोचॅनेल्समधून माध्यम प्रवाहित केले जाते. स्केल बार, १ सेमी. संदर्भ ४ मधून परवानगीने पुनर्मुद्रित. एल्सव्हियर.
या प्रोटोकॉलमध्ये, एपिथेलियल स्त्रोत म्हणून कॅको-२ (Caco-2) सेल लाइन आणि आतड्यांचे ऑर्गॅनॉइड्स वापरले गेले (आकृती ३अ). दोन्ही प्रकारच्या पेशी स्वतंत्रपणे कल्चर केल्या गेल्या (बॉक्स २ आणि बॉक्स ५) आणि ऑन-चिप गट किंवा ट्रान्सवेल इन्सर्ट्सच्या ईसीएम-कोटेड मायक्रोचॅनेल्समध्ये पेरण्यासाठी वापरल्या गेल्या. जेव्हा पेशी कॉन्फ्लुएंट होतात (फ्लास्कमध्ये >९५% कव्हरेज), तेव्हा ट्रायप्सिनायझेशन फ्लुइडद्वारे डिसोसिएटेड सेल सस्पेंशन तयार करण्यासाठी टी-फ्लास्कमधील नियमितपणे कल्चर केलेल्या कॅको-२ पेशी (पॅसेज १० ते ५० दरम्यान) काढल्या जातात (बॉक्स २). आतड्यांच्या बायोप्सी किंवा सर्जिकल रिसेक्शनमधून घेतलेले मानवी आतड्यांचे ऑर्गॅनॉइड्स स्ट्रक्चरल मायक्रोएन्व्हायर्नमेंटला आधार देण्यासाठी २४-वेल प्लेट्समधील मॅट्रिजेल स्कॅफोल्ड डोम्समध्ये कल्चर केले गेले. ऑर्गॅनॉइड्सचा व्यास सुमारे ५०० µm होईपर्यंत, बॉक्स ३ मध्ये वर्णन केल्यानुसार तयार केलेले आवश्यक मॉर्फोजेन्स (जसे की डब्लूएनटी, आर-स्पॉन्डिन आणि नॉगिन) आणि ग्रोथ फॅक्टर्स असलेले माध्यम दर दुसऱ्या दिवशी पुरवले गेले. पूर्ण वाढ झालेले ऑर्गॅनॉइड्स काढले जातात. आणि आतड्यावर किंवा चिपवरील ट्रान्सवेल इन्सर्टवर पेरणी करण्यासाठी एकल पेशींमध्ये विलग केले जाते (बॉक्स ५). आम्ही पूर्वी अहवाल दिल्याप्रमाणे, रोगाच्या प्रकारानुसार¹²,¹³ (उदा. अल्सरेटिव्ह कोलायटिस, क्रोहन रोग, कोलोरेक्टल कर्करोग, किंवा सामान्य दाता), जखमेच्या जागेनुसार (उदा., जखम विरुद्ध जखम नसलेला भाग) आणि जठरांत्र मार्गातील स्थानानुसार (उदा., ड्युओडेनम, जेजुनम, इलियम, सेकम, कोलन, किंवा रेक्टम) त्याचे वर्गीकरण केले जाऊ शकते. आम्ही बॉक्स ५ मध्ये कोलोनिक ऑर्गॅनॉइड्स (कोलॉइड्स) च्या संवर्धनासाठी एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करतो, ज्यांना सामान्यतः लहान आतड्याच्या ऑर्गॅनॉइड्सपेक्षा मॉर्फोजेन्सच्या उच्च सांद्रतेची आवश्यकता असते.
अ, गट चिपमध्ये आतड्याच्या आकारविज्ञानाच्या प्रेरणेसाठी कार्यप्रवाह. या प्रोटोकॉलमध्ये ३डी आकारविज्ञान प्रदर्शित करण्यासाठी कॅको-२ मानवी आतड्याचे उपकला आणि आतड्याचे ऑर्गेनॉइड्स वापरले जातात. वेगळ्या केलेल्या उपकला पेशी तयार केलेल्या गट-ऑन-अ-चिप उपकरणामध्ये (चिप तयारी) पेरण्यात आल्या. एकदा पेशी पेरल्या (सीडेड) आणि दिवस ० (डी०) रोजी पीडीएमएस सच्छिद्र पटलाला जोडल्या (अटॅच्ड) की, एपिकल (एपी) प्रवाह सुरू केला जातो आणि पहिल्या २ दिवसांसाठी (फ्लो, एपी, डी०-डी२) तो कायम ठेवला जातो. जेव्हा एक संपूर्ण २डी मोनोलेयर तयार होतो, तेव्हा चक्रीय ताणण्याच्या गतीसह (स्ट्रेच, फ्लो, एपी आणि बीएल) बॅसोलॅटरल (बीएल) प्रवाह देखील सुरू केला जातो. मायक्रोफ्लुइडिक कल्चरच्या ५ दिवसांनंतर आतड्याचे ३डी आकारविज्ञान आपोआप घडले (मॉर्फोजेनेसिस, डी५). फेज कॉन्ट्रास्ट प्रतिमा प्रत्येक प्रायोगिक टप्प्यावर किंवा वेळेच्या बिंदूवर कॅको-२ पेशींचे प्रातिनिधिक आकारविज्ञान दर्शवतात (बार ग्राफ, १०० µm). संबंधित कॅस्केड्स स्पष्ट करणाऱ्या चार योजनाबद्ध आकृत्या. आतड्याच्या आकारविज्ञानाचे (वर उजवीकडे). आकृतीमधील तुटक बाण द्रव प्रवाहाची दिशा दर्शवतात. b, स्थापित 3D Caco-2 उपकलेची पृष्ठभागाची रचना दर्शवणारी SEM प्रतिमा (डावीकडे). वर्धित भाग (पांढरा तुटक चौकोन) हायलाइट करणारी लहान आकृती 3D Caco-2 थरावर पुनरुत्पादित मायक्रोव्हिली दर्शवते (उजवीकडे). c, स्थापित Caco-2 3D चे क्षैतिज समोरील दृश्य, क्लॉडिन (ZO-1, लाल) आणि F-ॲक्टिन (हिरवा) व केंद्रके (निळा) लेबल केलेले सतत ब्रश बॉर्डर पडदे. आतड्याच्या चिप्सवरील उपकला पेशींचे इम्युनोफ्लोरेसन्स कॉन्फोकल व्हिज्युअलायझेशन. मधल्या आकृतीकडे निर्देशित करणारे बाण प्रत्येक कॉन्फोकल दृश्यासाठी फोकल प्लेनचे स्थान दर्शवतात. d, चिपवर संवर्धित केलेल्या ऑर्गॅनॉइड्समधील आकारिक बदलांचा कालावधी, जो फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे तिसऱ्या, सातव्या, नवव्या, अकराव्या आणि तेराव्या दिवशी मिळवला आहे. लहान आकृती (वर उजवीकडे) दिलेल्या प्रतिमेचे उच्च विवर्धन दर्शवते. e, ऑर्गॅनॉइडचा DIC फोटोमायक्रोग्राफ. ७ व्या दिवशी घेतलेल्या स्लाईसवर आतड्यात स्थापित केलेले ३डी एपिथेलियम.f, आतड्याच्या चिप्सवर ३ दिवसांसाठी वाढवलेल्या स्टेम सेल्स (LGR5; किरमिजी), गॉब्लेट सेल्स (MUC2; हिरवा), एफ-ॲक्टिन (राखाडी) आणि केंद्रके (निळा) यांचे मार्कर दर्शविणाऱ्या ओव्हरलेड इम्युनोफ्लोरेसन्स प्रतिमा (डावीकडे) आणि एपिथेलियल थरावरील १३-दिवसांचे (मध्यभागी) ऑर्गॅनॉइड्स. विस्तारित डेटा आकृती ३ देखील पहा, जी MUC2 सिग्नलिंगशिवाय LGR5 सिग्नलिंगवर प्रकाश टाकते. कल्चरच्या १३ व्या दिवशी सेलमास्क डायने प्लाझ्मा मेम्ब्रेनला रंग देऊन चिपवर आतड्यात स्थापित केलेल्या ३डी ऑर्गॅनॉइड एपिथेलियमची एपिथेलियल सूक्ष्मरचना (उजवीकडे) दर्शविणाऱ्या फ्लोरेसन्स प्रतिमा. अन्यथा नमूद केल्याशिवाय स्केल बार ५० μm आहे.b संदर्भ २. ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेसच्या परवानगीने पुनर्मुद्रित; c संदर्भ २. ऑक्सफर्ड युनिव्हर्सिटी प्रेसच्या परवानगीने रूपांतरित; e आणि f संदर्भ.१२ च्या परवानगीने रूपांतरित. क्रिएटिव्ह कॉमन्स लायसन्स CC BY 4.0 अंतर्गत.
'गट ऑन अ चिप'मध्ये, यशस्वी ECM कोटिंगसाठी PDMS सच्छिद्र पडद्याच्या हायड्रोफोबिक पृष्ठभागात बदल करणे आवश्यक आहे. या प्रोटोकॉलमध्ये, आम्ही PDMS पडद्यांची हायड्रोफोबिसिटी बदलण्यासाठी दोन वेगवेगळ्या पद्धती वापरतो. Caco-2 पेशींच्या कल्चरिंगसाठी, केवळ UV/ओझोन उपचाराद्वारे पृष्ठभाग सक्रिय करणे हे PDMS पृष्ठभागाची हायड्रोफोबिसिटी कमी करण्यासाठी, ECM चा थर देण्यासाठी आणि Caco-2 पेशींना PDMS पडद्याला जोडण्यासाठी पुरेसे होते. तथापि, ऑर्गॅनॉइड एपिथेलियमच्या मायक्रोफ्लुइडिक कल्चरसाठी, PDMS मायक्रोचॅनेल्सवर अनुक्रमे पॉलीएथिलीनइमाइन (PEI) आणि ग्लुटाराल्डिहाइड लावून ECM प्रथिनांचे कार्यक्षम निक्षेपण साध्य करण्याकरिता रासायनिक-आधारित पृष्ठभाग कार्यात्मकीकरणाची आवश्यकता असते. पृष्ठभाग बदलानंतर, कार्यात्मकीकृत PDMS पृष्ठभाग झाकण्यासाठी ECM प्रथिने निक्षेपित केली गेली आणि नंतर ती वेगळ्या केलेल्या ऑर्गॅनॉइड एपिथेलियममध्ये प्रविष्ट केली गेली. पेशी जोडल्यानंतर, वरच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये फक्त माध्यम प्रवाहित करून मायक्रोफ्लुइडिक पेशी कल्चर सुरू केले जाते, जोपर्यंत पेशींचा एक संपूर्ण मोनोलेयर तयार होत नाही, तर खालचा मायक्रोचॅनेल स्थिर स्थिती राखतो. पृष्ठभाग सक्रियकरण आणि ECM कोटिंगसाठी ही अनुकूलित पद्धत पेशींचे जोडले जाणे शक्य करते. PDMS पृष्ठभागावर 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करण्यासाठी ऑर्गॅनॉइड एपिथेलियमचा वापर.
ट्रान्सवेल कल्चरमध्ये पेशी पेरण्यापूर्वी ईसीएम कोटिंगची आवश्यकता असते; तथापि, सच्छिद्र इन्सर्टचा पृष्ठभाग सक्रिय करण्यासाठी ट्रान्सवेल कल्चरमध्ये जटिल पूर्व-उपचार चरणांची आवश्यकता नसते. ट्रान्सवेल इन्सर्टवर कॅको-२ पेशी वाढवण्यासाठी, सच्छिद्र इन्सर्टवरील ईसीएम कोटिंग विलग झालेल्या कॅको-२ पेशींच्या संलग्नतेला (<१ तास) आणि टाइट जंक्शन अडथळ्याच्या निर्मितीला (<१-२ दिवस) गती देते. ट्रान्सवेल इन्सर्टवर ऑर्गॅनॉइड्सचे कल्चर करण्यासाठी, विलग केलेले ऑर्गॅनॉइड्स ईसीएम-कोटेड इन्सर्टवर पेरले जातात, पडद्याच्या पृष्ठभागाला संलग्न केले जातात (<३ तास) आणि जोपर्यंत ऑर्गॅनॉइड्स अडथळ्याच्या अखंडतेसह एक संपूर्ण मोनोलेयर तयार करत नाहीत तोपर्यंत त्यांची देखभाल केली जाते. ट्रान्सवेल कल्चर हायब्रीड चिप्सचा वापर न करता २४-वेल प्लेट्समध्ये केले जातात.
स्थापित उपकला थराच्या बेसोलॅटरल बाजूला द्रव प्रवाह लागू करून इन विट्रो ३डी मॉर्फोजेनेसिस सुरू करता येते. 'गट ऑन अ चिप'मध्ये, जेव्हा वरच्या आणि खालच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये माध्यम प्रवाहित केले गेले तेव्हा उपकला मॉर्फोजेनेसिस सुरू झाले (आकृती ३अ). पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, दिशात्मक स्रावित मॉर्फोजेन अवरोधकांना सतत काढून टाकण्यासाठी खालच्या (बेसोलॅटरल) कप्प्यात द्रव प्रवाह सुरू करणे महत्त्वाचे आहे. सच्छिद्र पडद्यांवर बांधलेल्या पेशींना पुरेसे पोषक आणि सीरम पुरवण्यासाठी आणि ल्युमिनल शियर स्ट्रेस निर्माण करण्यासाठी, आम्ही सामान्यतः 'गट ऑन अ चिप'मध्ये दुहेरी प्रवाह लागू करतो. हायब्रीड चिप्समध्ये, उपकला मोनोलेयर्स असलेले ट्रान्सवेल इन्सर्ट हायब्रीड चिप्समध्ये घातले गेले. त्यानंतर, सच्छिद्र ट्रान्सवेल इन्सर्टच्या बेसोलॅटरल बाजूला मायक्रोचॅनेलद्वारे माध्यम लागू केले गेले. दोन्ही कल्चर प्लॅटफॉर्ममध्ये बेसोलॅटरल प्रवाह सुरू झाल्यानंतर ३-५ दिवसांनी आतड्याचे मॉर्फोजेनेसिस झाले.
फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट (DIC) मायक्रोस्कोपी, SEM, किंवा इम्युनोफ्लोरेसन्स कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी (आकृती ३ आणि ४) यांसारख्या विविध इमेजिंग पद्धती वापरून मायक्रोइंजिनिअर्ड ३डी एपिथेलियल थरांच्या आकारशास्त्रीय वैशिष्ट्यांचे विश्लेषण केले जाऊ शकते. ३डी एपिथेलियल थरांचा आकार आणि फुगवटा यांचे निरीक्षण करण्यासाठी कल्चर दरम्यान कोणत्याही वेळी फेज कॉन्ट्रास्ट किंवा DIC इमेजिंग सहजपणे केले जाऊ शकते. PDMS आणि पॉलिस्टर फिल्म्सच्या ऑप्टिकल पारदर्शकतेमुळे, गट-ऑन-अ-चिप आणि हायब्रीड चिप हे दोन्ही प्लॅटफॉर्म डिव्हाइसचे सेक्शनिंग किंवा डिसअसेम्ब्ली न करता रिअल-टाइम इन-सिटू इमेजिंग प्रदान करू शकतात. इम्युनोफ्लोरेसन्स इमेजिंग करताना (आकृती १, ३c, f आणि ४b, c), पेशी सामान्यतः ४% (wt/vol) पॅराफॉर्मल्डिहाइड (PFA), त्यानंतर ट्रायटन X-100 आणि २% (wt/vol) बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन (BSA) ने अनुक्रमे फिक्स केल्या जातात. पेशींच्या प्रकारानुसार, वेगवेगळे फिक्सेटिव्ह, परमिएबिलायझर आणि ब्लॉकिंग एजंट वापरले जाऊ शकतात. वापरले जातात. चिपवर इन सिटू (in situ) स्थिर केलेल्या पेशींना हायलाइट करण्यासाठी, वंश-अवलंबित पेशी किंवा प्रदेश मार्करना लक्ष्य करणारे प्राथमिक अँटीबॉडीज वापरले जातात, त्यानंतर केंद्रक (उदा., 4′,6-डायअमिडिनो-2-फेनिलीन) इंडोल, DAPI) किंवा एफ-अ‍ॅक्टिन (उदा., फ्लोरोसेंटली लेबल केलेले फॅलॉयडिन) यांना लक्ष्य करणाऱ्या काउंटरस्टेन डाय सोबत दुय्यम अँटीबॉडीज वापरल्या जातात. श्लेष्मा उत्पादन (आकृती १, “पेशी विभेदन” आणि “आतड्याचे शरीरशास्त्र”), सूक्ष्मजीव पेशींचे यादृच्छिक वसाहतीकरण (आकृती १, “यजमान-सूक्ष्मजीव सह-संवर्धन”), रोगप्रतिकारक पेशींची भरती (आकृती १, ‘रोग मॉडेलिंग’) किंवा ३डी एपिथेलियल मॉर्फोलॉजीच्या बाह्यरेखा (आकृती ३c,f आणि ४b,c) शोधण्यासाठी इन सिटू (in situ) फ्लोरोसेन्स-आधारित लाइव्ह इमेजिंग देखील केले जाऊ शकते. संदर्भामध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, चिपवरील आतड्यामध्ये बदल करून वरचा थर खालच्या मायक्रोचॅनल थरापासून वेगळा केला जातो. आकृती २ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, ३डी एपिथेलियल मॉर्फोलॉजी तसेच मायक्रोव्हिली एपिकल ब्रश बॉर्डर SEM द्वारे पाहिली जाऊ शकते (आकृती ३ब). विभेदन मार्करची अभिव्यक्ती क्वांटिटेटिव्ह PCR⁵ किंवा सिंगल-सेल RNA सिक्वेन्सिंग करून तपासली जाऊ शकते. या प्रकरणात, गट चिप्स किंवा हायब्रीड चिप्समध्ये वाढवलेल्या एपिथेलियल पेशींचे ३डी थर ट्रिप्सिनायझेशनद्वारे काढले जातात आणि नंतर आण्विक किंवा अनुवांशिक विश्लेषणासाठी वापरले जातात.
अ, हायब्रीड चिपमध्ये आतड्याच्या आकारजननाच्या प्रेरणेसाठी कार्यप्रवाह. हायब्रीड चिप प्लॅटफॉर्मवर ३डी आकारजनन प्रदर्शित करण्यासाठी या प्रोटोकॉलमध्ये कॅको-२ (Caco-2) आणि आतड्याचे ऑर्गॅनॉइड्स वापरले जातात. विलग केलेल्या एपिथेलियल पेशी तयार केलेल्या ट्रान्सवेल इन्सर्ट्समध्ये (टीडब्ल्यू प्रेप; खालील आकृती पहा) पेरण्यात आल्या. एकदा पेशी पेरल्या (सीडेड) आणि ट्रान्सवेल इन्सर्ट्समधील पॉलिस्टर पडद्यांना जोडल्या गेल्या की, सर्व पेशी स्थिर परिस्थितीत (टीडब्ल्यू कल्चर) संवर्धित केल्या गेल्या. ७ दिवसांनंतर, एपिथेलियल पेशींचा २डी मोनोलेयर असलेला एकच ट्रान्सवेल इन्सर्ट बॅसोलॅटरल प्रवाह (फ्लो, बीएल) सुरू करण्यासाठी हायब्रीड चिपमध्ये समाकलित करण्यात आला, ज्यामुळे अखेरीस ३डी एपिथेलियल थराची (आकारजनन) निर्मिती झाली. प्रत्येक प्रायोगिक टप्प्यावर किंवा वेळेच्या बिंदूवर सामान्य दात्याच्या (सी१०३ लाइन) आरोही बृहदांत्रातून घेतलेल्या मानवी अवयव एपिथेलियल पेशींची आकारिक वैशिष्ट्ये दर्शवणारे फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोग्राफ. वरच्या थरांमधील योजना प्रत्येक टप्प्यासाठी प्रायोगिक रचना स्पष्ट करतात. ब, हायब्रीड चिप्स (डावी योजना) टॉप-डाउन कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी दृश्यांसह ऑर्गॅनॉइड एपिथेलियल पेशींच्या ३डी आकारजननास कारणीभूत ठरू शकतात. वेगवेगळ्या Z स्थितींवर (वर, मध्य आणि खाली; उजवीकडील आकृती आणि संबंधित तुटक रेषा पहा) घेतलेले. स्पष्ट आकारशास्त्रीय वैशिष्ट्ये दर्शविली. एफ-ॲक्टिन (निळा), केंद्रक (राखाडी). c, स्थिर ट्रान्सवेल (TW; पांढऱ्या तुटक चौकटीतील लहान चित्र) विरुद्ध हायब्रीड चिप (सर्वात मोठा पूर्ण शॉट) मध्ये संवर्धित केलेल्या ऑर्गॅनॉइड-व्युत्पन्न उपकला पेशींचे अनुक्रमे 2D विरुद्ध 3D आकारशास्त्राची तुलना करणारे प्रतिदीप्ती कॉन्फोकल मायक्रोग्राफ (3D तिरकस दृश्य). 2D उभ्या आडव्या छेदांची एक जोडी (वरच्या उजव्या कोपऱ्यातील लहान चित्र; “XZ”) देखील 2D आणि 3D वैशिष्ट्ये दर्शवते. स्केल बार, 100 µm. c संदर्भ 4 मधून परवानगीने पुनर्मुद्रित. एल्सेव्हियर.
पारंपरिक स्थिर संवर्धन परिस्थितीत त्याच पेशी (Caco-2 किंवा आतड्याच्या ऑर्गेनॉइड एपिथेलियल पेशी) द्विमितीय मोनोलेयर्समध्ये संवर्धित करून नियंत्रक नमुने तयार केले जाऊ शकतात. विशेषतः, मायक्रोचॅनेल्सच्या मर्यादित आकारमान क्षमतेमुळे (म्हणजे मूळ गट-चिप डिझाइनमधील वरच्या चॅनेलमध्ये ~४ µL) पोषक तत्वांची कमतरता निर्माण होऊ शकते. त्यामुळे, बॅसोलॅटरल प्रवाह लागू करण्यापूर्वी आणि नंतरच्या एपिथेलियल मॉर्फोलॉजीची तुलना देखील केली जाऊ शकते.
सॉफ्ट लिथोग्राफी प्रक्रिया क्लीन रूममध्ये केली पाहिजे. चिपवरील प्रत्येक थरासाठी (वरचे आणि खालचे थर आणि मेम्ब्रेन) आणि हायब्रीड चिप्ससाठी, वेगवेगळे फोटोमास्क वापरले गेले आणि ते स्वतंत्र सिलिकॉन वेफर्सवर तयार केले गेले, कारण मायक्रोचॅनेल्सची उंची वेगवेगळी होती. चिपवरील गटच्या वरच्या आणि खालच्या मायक्रोचॅनेल्सची लक्ष्यित उंची अनुक्रमे ५०० µm आणि २०० µm आहे. हायब्रीड चिपच्या चॅनेलची लक्ष्यित उंची २०० µm आहे.
३-इंचाचा सिलिकॉन वेफर ॲसिटोन असलेल्या भांड्यात ठेवा. प्लेट ३० सेकंदांसाठी हळुवारपणे फिरवा, नंतर वेफर हवेत सुकू द्या. वेफर आयपीए (IPA) असलेल्या प्लेटवर स्थानांतरित करा, नंतर स्वच्छ करण्यासाठी प्लेट ३० सेकंदांसाठी फिरवा.
सिलिकॉन वेफरच्या पृष्ठभागावरून सेंद्रिय अवशेष जास्तीत जास्त प्रमाणात काढून टाकण्यासाठी, वैकल्पिकरित्या पिरान्हा द्रावण (हायड्रोजन पेरॉक्साइड आणि संहत सल्फ्यूरिक ऍसिडचे १:३ (घनफळ/घनफळ) मिश्रण) वापरले जाऊ शकते.
पिरान्हा द्रावण अत्यंत संक्षारक असून उष्णता निर्माण करते. अतिरिक्त सुरक्षा खबरदारी घेणे आवश्यक आहे. कचऱ्याच्या विल्हेवाटीसाठी, द्रावण थंड होऊ द्या आणि एका स्वच्छ, कोरड्या कचरा कंटेनरमध्ये स्थानांतरित करा. दुय्यम कंटेनर वापरा आणि कचरा कंटेनरवर योग्य लेबल लावा. अधिक तपशीलवार कार्यपद्धतींसाठी कृपया सुविधेच्या सुरक्षा मार्गदर्शक तत्त्वांचे पालन करा.
वेफर्सना २००°C तापमानाच्या हॉट प्लेटवर १० मिनिटे ठेवून त्यातील पाणी काढून टाका. पाणी काढल्यानंतर, वेफर थंड करण्यासाठी हवेत पाच वेळा हलवण्यात आले.
स्वच्छ केलेल्या सिलिकॉन वेफरच्या मध्यभागी सुमारे १० ग्रॅम फोटोरेझिस्ट एसयू-८ २१०० टाका. वेफरवर फोटोरेझिस्ट समान रीतीने पसरवण्यासाठी चिमट्याचा वापर करा. फोटोरेझिस्टचा चिकटपणा कमी करण्यासाठी आणि ते पसरवणे सोपे जावे यासाठी, वेफर अधूनमधून ६५°C तापमानाच्या हॉट प्लेटवर ठेवा. वेफर थेट हॉट प्लेटवर ठेवू नका.
स्पिन कोटिंग चालवून SU-8 वेफरवर समान रीतीने वितरित केले गेले. SU-8 चे येणारे रोटेशन 5-10 सेकंदांसाठी 100 rpm/s च्या प्रवेगाने 500 rpm वेगाने पुढे जाण्यासाठी प्रोग्राम करा. 200 µm जाडीच्या पॅटर्निंगसाठी मुख्य स्पिन 1,500 rpm वर सेट करा, किंवा 250 µm जाडी (चिपवरील गटच्या वरच्या थरासाठी 500 µm उंची तयार करून; खालील "महत्त्वाचे टप्पे" पहा) 300 rpm/s च्या प्रवेगाने 1,200 rpm वर 30 सेकंदांसाठी मिळवा.
सिलिकॉन वेफरवरील SU-8 पॅटर्नच्या लक्ष्यित जाडीनुसार मुख्य फिरण्याचा वेग समायोजित केला जाऊ शकतो.
चिपवरील आतड्याच्या वरच्या थरासाठी 500 µm उंचीचे SU-8 नमुने तयार करण्यासाठी, या बॉक्समधील स्पिन कोटिंग आणि सॉफ्ट बेकच्या पायऱ्या (पायऱ्या 7 आणि 8) अनुक्रमे पुन्हा केल्या गेल्या (पायरी 9 पहा) ज्यामुळे 250 µm जाडीचे SU-8 चे दोन थर तयार झाले, जे या बॉक्सच्या पायरी 12 मध्ये UV किरणांच्या संपर्कात आणून एकावर एक रचले आणि जोडले जाऊ शकतात, ज्यामुळे 500 µm उंचीचा एक थर तयार होतो.
SU-8 लेपित वेफर्सना सॉफ्ट बेक करण्यासाठी, वेफर्स काळजीपूर्वक 65 °C तापमानावर 5 मिनिटांसाठी हॉट प्लेटवर ठेवा, नंतर सेटिंग 95 °C वर बदला आणि अतिरिक्त 40 मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा.
वरच्या मायक्रोचॅनेलमध्ये 500 μm उंचीचा SU-8 पॅटर्न मिळवण्यासाठी, 250 μm जाडीचे SU-8 चे दोन थर तयार करण्यासाठी पायरी 7 आणि 8 ची पुनरावृत्ती करा.
UV मास्क अलाइनर वापरून, निर्मात्याच्या सूचनांनुसार लॅम्प टेस्ट करा आणि वेफरचा एक्सपोजर टाइम मोजा. (एक्सपोजर टाइम, ms) = (एक्सपोजर डोस, mJ/cm2)/(लॅम्प पॉवर, mW/cm2).
एक्सपोजर वेळ निश्चित केल्यानंतर, फोटोमास्क UV मास्क अलाइनरच्या मास्क होल्डरवर ठेवा आणि फोटोमास्क SU-8 कोटेड वेफरवर ठेवा.
UV किरणांचा फैलाव कमी करण्यासाठी, फोटोमास्कचा छापलेला पृष्ठभाग थेट सिलिकॉन वेफरच्या SU-8 लेपित बाजूवर ठेवा.
SU-8 लेपित वेफर आणि फोटोमास्कला पूर्वनिर्धारित एक्सपोजर वेळेसाठी 260 mJ/cm2 UV प्रकाशात उभे ठेवा (या बॉक्समधील पायरी 10 पहा).
UV किरणांच्या संपर्कात आणल्यानंतर, 200 μm उंचीचे नमुने तयार करण्यासाठी SU-8-लेपित सिलिकॉन वेफर्स प्रत्येक हॉट प्लेटवर 65°C तापमानावर 5 मिनिटे आणि 95°C तापमानावर 15 मिनिटे बेक केले गेले. 500 µm उंचीचे नमुने तयार करण्यासाठी 95°C तापमानावर बेक केल्यानंतरचा वेळ 30 मिनिटांपर्यंत वाढवा.
डेव्हलपर एका काचेच्या डिशमध्ये ओतला जातो आणि बेक केलेला वेफर त्या डिशमध्ये ठेवला जातो. एसयू-८ डेव्हलपरचे प्रमाण काचेच्या प्लेटच्या आकारानुसार बदलू शकते. न उघडलेला एसयू-८ पूर्णपणे काढून टाकण्यासाठी पुरेसा एसयू-८ डेव्हलपर वापरण्याची खात्री करा. उदाहरणार्थ, १ लिटर क्षमतेची आणि १५० मिमी व्यासाची काचेची डिश वापरताना, सुमारे ३०० मिली एसयू-८ डेव्हलपर वापरा. ​​अधूनमधून हलक्या हाताने फिरवत, २५ मिनिटांसाठी मोल्ड डेव्हलप करा.
तयार झालेला साचा सुमारे १० मिली ताज्या डेव्हलपरने धुवा आणि त्यानंतर पिपेटने द्रावण फवारून आयपीए (IPA) वापरा.
वेफरला प्लाझ्मा क्लीनरमध्ये ठेवा आणि १.५ मिनिटांसाठी ऑक्सिजन प्लाझ्माच्या संपर्कात ठेवा (वातावरणातील वायू, लक्ष्याचा दाब १ × १०−५ टॉर, शक्ती १२५ वॅट).
आतमध्ये काचेची स्लाईड ठेवून वेफर व्हॅक्यूम डेसिकेटरमध्ये ठेवा. वेफर्स आणि स्लाईड्स एकमेकांच्या शेजारी ठेवता येतात. जर व्हॅक्यूम डेसिकेटर एका प्लेटने अनेक थरांमध्ये विभागलेला असेल, तर खालच्या कप्प्यात स्लाईड्स आणि वरच्या कप्प्यात वेफर्स ठेवा. काचेच्या स्लाईडवर ट्रायक्लोरो(1H, 1H, 2H, 2H-परफ्लुरोऑक्टिल)सिलेन द्रावणाचे १०० μL थेंब टाका आणि सिनायझेशनसाठी व्हॅक्यूम लावा.
गोठवलेल्या Caco-2 पेशींची कुपी 37°C पाण्याच्या बाथमध्ये वितळवा, नंतर वितळलेल्या पेशी 37°C तापमानावर आधीच गरम केलेल्या 15 mL Caco-2 माध्यमा असलेल्या T75 फ्लास्कमध्ये स्थानांतरित करा.
Caco-2 पेशी सुमारे 90% घनतेवर पास करण्यासाठी, प्रथम Caco-2 माध्यम, PBS, आणि 0.25% ट्रायप्सिन/1 mM EDTA 37°C पाण्याच्या बाथमध्ये गरम करा.
व्हॅक्यूम ॲस्पिरेशनद्वारे माध्यम काढून घ्या. व्हॅक्यूम ॲस्पिरेशनची पुनरावृत्ती करून आणि ताजे पीबीएस (PBS) घालून, पेशी ५ मिली कोमट पीबीएसने दोनदा धुवा.