Dziękujemy za odwiedzenie witryny Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Tymczasem, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Morfogeneza ludzkiego jelita ustala cechy krypty-kosmka mikroarchitektury nabłonka 3D i organizacji przestrzennej. Ta unikalna struktura jest niezbędna do utrzymania homeostazy jelita poprzez ochronę niszy komórek macierzystych w krypcie podstawnej przed egzogennymi antygenami bakteryjnymi i ich metabolitami. Ponadto kosmki jelitowe i wydzielający śluz prezentują funkcjonalnie zróżnicowane komórki nabłonkowe z barierą ochronną na powierzchni błony śluzowej jelita. Dlatego odtworzenie struktur nabłonka 3D jest kluczowe dla konstrukcji modeli jelita in vitro. Co istotne, organiczny mimetyk jelita na chipie może indukować spontaniczną morfogenezę 3D nabłonka jelitowego ze zwiększonymi funkcjami fizjologicznymi i biomechaniką. W niniejszym artykule przedstawiamy powtarzalny protokół, aby skutecznie indukować morfogenezę jelit na chipie mikroprzepływowym, a także na hybrydowym chipie z wbudowanym Transwell. Opisujemy szczegółowe metody wytwarzania urządzeń, hodowli komórek nabłonka Caco-2 lub organoidów jelitowych w warunkach konwencjonalnych, a także na platforma mikroprzepływowa, indukcja morfogenezy 3D i charakterystyka ustalonego nabłonka 3D przy użyciu wielu modalności obrazowania. Ten protokół umożliwia regenerację funkcjonalnej mikroarchitektury jelitowej poprzez kontrolowanie przepływu płynu boczno-podstawnego przez 5 dni. Nasza metoda morfogenezy in vitro wykorzystuje fizjologicznie istotne naprężenie ścinające i ruch mechaniczny i nie wymaga skomplikowanej inżynierii komórkowej ani manipulacji, co może przewyższyć inne istniejące techniki. Przewidujemy, że nasz proponowany protokół może mieć szerokie implikacje dla społeczności badań biomedycznych, zapewniając metodę regeneracji warstw nabłonka jelitowego 3D in vitro do zastosowań biomedycznych, klinicznych i farmaceutycznych.
Eksperymenty wykazują, że komórki nabłonka jelitowego Caco-2 hodowane w urządzeniach typu gut-on-a-chip1,2,3,4,5 lub dwuwarstwowych urządzeniach mikroprzepływowych6,7 mogą podlegać spontanicznej morfogenezie 3D in vitro bez dokładnego zrozumienia mechanizmu leżącego u jej podstaw. W naszych ostatnich badaniach odkryliśmy, że usunięcie antagonistów morfogenów wydzielanych bocznie od podstaw z urządzeń hodowlanych jest konieczne i wystarczające do wywołania morfogenezy 3D nabłonka in vitro, co zostało wykazane w przypadku Caco-2 i organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów. Komórki nabłonkowe zostały zweryfikowane. W tym badaniu skupiliśmy się na produkcji komórkowej i dystrybucji stężeń silnego antagonisty Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), w układzie jelitowym na chipie i zmodyfikowanych urządzeniach mikroprzepływowych zawierających wkładki Transwell, określanych jako „Hybrid Chip”. Wykazaliśmy, że dodanie egzogennych antagonistów Wnt (takich jak DKK-1, represor Wnt 1, wydzielone białko frizzled-related protein 1 lub Soggy-1) do jelita na chipie hamuje morfogenezę lub zakłóca wstępnie ustrukturyzowaną trójwymiarową warstwę nabłonka, co sugeruje, że antagonistyczny stres podczas hodowli jest odpowiedzialny za morfogenezę jelit in vitro. Dlatego praktycznym podejściem do osiągnięcia solidnej morfogenezy na styku nabłonka jest usunięcie lub minimalne utrzymanie poziomów antagonistów Wnt w przedziale basolateralnym przez aktywne płukanie (np. w platformach gut-on-a-chip lub hybryd-on-a-chip) lub dyfuzję.Media basolateralne (np. z wkładów Transwell do dużych zbiorników basolateralnych w studzienkach).
W niniejszym protokole przedstawiamy szczegółową metodę wytwarzania mikrourządzeń typu „jelito na chipie” i hybrydowych chipów z możliwością wprowadzania do układu Transwell (kroki 1–5) w celu hodowli komórek nabłonka jelitowego na porowatych membranach polidimetylosiloksanowych (PDMS) (kroki 6A, 7A, 8, 9) lub poliestrowych membranach z wkładkami Transwell (kroki 6B, 7B, 8, 9) oraz indukowanej morfogenezy 3D in vitro (krok 10). Zidentyfikowaliśmy również cechy komórkowe i molekularne wskazujące na histogenezę specyficzną dla tkanek i zależne od linii różnicowanie komórkowe, stosując wiele metod obrazowania (kroki 11–24). Indukujemy morfogenezę, wykorzystując ludzkie komórki nabłonka jelitowego, takie jak Caco-2 lub organoidy jelitowe, w dwóch formatach hodowli, ze szczegółami technicznymi obejmującymi modyfikację powierzchni membran porowatych, tworzenie monowarstw 2D oraz biochemiczne i reprodukcyjne właściwości mikrośrodowiska biomechanicznego jelit. in vitro. Aby wywołać morfogenezę 3D z monowarstw nabłonka 2D, usunęliśmy antagonistów morfogenów w obu hodowanych formach poprzez przepływ medium do przedziału bazolateralnego hodowli. Na koniec przedstawiamy reprezentację użyteczności regenerowalnej warstwy nabłonka 3D, która może być używana do modelowania zależnego od morfogenów wzrostu nabłonka, podłużnych współhodowli gospodarza i mikrobiomu, infekcji patogenami, uszkodzeń zapalnych, dysfunkcji bariery nabłonkowej i terapii opartych na probiotykach. Przykład.wpływów.
Nasz protokół może być przydatny dla szerokiego grona naukowców w zakresie badań podstawowych (np. biologii błony śluzowej jelit, biologii komórek macierzystych i biologii rozwoju) i stosowanych (np. przedklinicznych testów leków, modelowania chorób, inżynierii tkankowej i gastroenterologii) o szerokim zasięgu. Ze względu na powtarzalność i solidność naszego protokołu w zakresie indukowania trójwymiarowej morfogenezy nabłonka jelitowego in vitro, przewidujemy, że nasza strategia techniczna może zostać rozpowszechniona wśród odbiorców badających dynamikę sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju jelit, regeneracji lub homeostazy. Ponadto nasz protokół jest przydatny do badania infekcji różnymi czynnikami zakaźnymi, takimi jak Norowirus 8, koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 lub Vibrio cholerae. Użyteczne są również grupy docelowe patologii i patogenezy chorób. Zastosowanie układu mikrofizjologii jelit na chipie może umożliwić podłużną współhodowlę 10 i późniejszą ocenę obrony gospodarza, odpowiedzi immunologicznej i naprawy uszkodzeń spowodowanych przez patogen w przewodzie pokarmowym (GI) 11 . Inne zaburzenia żołądkowo-jelitowe związane z zespołem nieszczelnego jelita, celiakią, chorobą Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, zapaleniem zbiornika jelitowego lub zespołem jelita drażliwego można symulować, przygotowując trójwymiarowe warstwy nabłonka jelitowego przy użyciu trójwymiarowych warstw nabłonka jelitowego pacjenta. Choroby te obejmują zanik kosmków jelitowych, skracanie krypt, uszkodzenie błony śluzowej lub upośledzoną barierę nabłonkową. Biopsja lub organoidy jelitowe pochodzące z komórek macierzystych 12,13. Aby lepiej modelować większą złożoność środowiska choroby, czytelnicy mogą rozważyć dodanie typów komórek istotnych dla choroby, takich jak mononuklearne komórki krwi obwodowej pacjenta (PBMC), do modeli zawierających trójwymiarowe mikroarchitektury kosmków jelitowych i krypt. komórki układu odpornościowego specyficzne dla danej tkanki, 5.
Ponieważ trójwymiarową mikrostrukturę nabłonka można utrwalić i zwizualizować bez konieczności cięcia, osoby zajmujące się transkryptomiką przestrzenną i obrazowaniem o wysokiej lub superrozdzielczości mogą być zainteresowane naszym mapowaniem dynamiki czasoprzestrzennej genów i białek w niszach nabłonkowych. Zainteresowania technologiczne. Reakcja na bodźce mikrobiologiczne lub immunologiczne. Ponadto, w warstwie błony śluzowej jelita 3D można ustalić podłużną interakcję gospodarza z mikrobiomem 10, 14, która koordynuje homeostazę jelit, poprzez współhodowlę różnych gatunków drobnoustrojów, społeczności drobnoustrojów lub mikrobioty kałowej, zwłaszcza w jelicie na chipie. na platformie. To podejście jest szczególnie atrakcyjne dla odbiorców studiujących immunologię błon śluzowych, gastroenterologię, mikrobiom człowieka, kultururomikę i mikrobiologię kliniczną, którzy chcą hodować wcześniej niehodowaną mikrobiotę jelitową w laboratorium. Jeśli nasz protokół morfogenezy in vitro można dostosować do skalowalnych formatów hodowli, takich jak wkładki wielodołkowe w płytkach 24-, 96- lub 384-dołkowych, które stale uzupełniają przedziały bazolateralne, protokół można również rozpowszechnić wśród osób opracowujących platformy farmaceutyczne, biomedyczne lub wysokoprzepustowe do badań przesiewowych lub walidacyjnych dla przemysłu spożywczego. Jako dowód koncepcji niedawno zademonstrowaliśmy wykonalność multipleksowego systemu morfogenezy o wysokiej przepustowości, skalowalnego do formatu płytki 24-dołkowej. Ponadto skomercjalizowano wiele produktów typu „organ-on-a-chip”16,17,18. Dlatego walidacja naszej metody morfogenezy in vitro może zostać przyspieszona i potencjalnie przyjęta przez wiele laboratoriów badawczych, przemysł lub rząd i agencje regulacyjne w celu zrozumienia przeprogramowania komórkowego morfogenezy jelit in vitro na poziomie transkryptomowym w celu testowania leków lub środków biologicznych. Wchłanianie i transport kandydatów na leki oceniano przy użyciu trójwymiarowych zastępczych modeli jelit lub przy użyciu niestandardowych lub komercyjnych modeli narządów na układzie scalonym w celu oceny powtarzalności procesu morfogenezy jelit.
Do badania morfogenezy nabłonka jelitowego wykorzystano ograniczoną liczbę modeli eksperymentalnych istotnych dla człowieka, głównie ze względu na brak możliwych do wdrożenia protokołów indukujących morfogenezę 3D in vitro. W rzeczywistości znaczna część obecnej wiedzy na temat morfogenezy jelit opiera się na badaniach na zwierzętach (np. danio pręgowanym20, myszach21 lub kurach22). Są one jednak pracochłonne i kosztowne, mogą budzić wątpliwości etyczne i, co najważniejsze, nie określają precyzyjnie procesów rozwojowych człowieka. Modele te mają również bardzo ograniczone możliwości testowania w sposób skalowalny wielokierunkowo. Dlatego nasz protokół regeneracji struktur tkankowych 3D in vitro przewyższa modele zwierzęce in vivo, a także inne tradycyjne statyczne modele hodowli komórkowych 2D. Jak opisano wcześniej, wykorzystanie struktur nabłonkowych 3D pozwoliło nam zbadać lokalizację przestrzenną zróżnicowanych komórek w osi krypta-kosmek w odpowiedzi na różne bodźce śluzówkowe lub immunologiczne. Warstwy nabłonka 3D mogą zapewniają przestrzeń do badania, w jaki sposób komórki drobnoustrojów konkurują o tworzenie nisz przestrzennych i ewolucję ekologiczną w odpowiedzi na czynniki gospodarza (np. wewnętrzne i zewnętrzne warstwy śluzu, wydzielanie IgA i peptydów przeciwdrobnoustrojowych). Ponadto trójwymiarowa morfologia nabłonka może pozwolić nam zrozumieć, w jaki sposób mikrobiota jelitowa kształtuje swoje społeczności i synergistycznie produkuje metabolity drobnoustrojów (np. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe), które kształtują organizację komórkową i nisze komórek macierzystych w kryptach podstawnych. Cechy te można wykazać jedynie po utworzeniu trójwymiarowych warstw nabłonka in vitro.
Oprócz naszej metody tworzenia trójwymiarowych struktur nabłonka jelitowego, istnieje kilka metod in vitro. Hodowla organoidów jelitowych to najnowocześniejsza technika inżynierii tkankowej oparta na hodowli jelitowych komórek macierzystych w określonych warunkach morfogenicznych23,24,25. Jednak wykorzystanie trójwymiarowych modeli organoidów do analizy transportu lub współhodowli mikrobiomu gospodarza jest często trudne, ponieważ światło jelita jest zamknięte w organoidzie, a zatem wprowadzenie składników światła, takich jak komórki drobnoustrojów lub antygeny egzogenne, jest ograniczone. Dostęp do światła organoidów można poprawić za pomocą mikrowstrzykiwacza26,27, ale ta metoda jest inwazyjna i pracochłonna, a jej wykonanie wymaga specjalistycznej wiedzy. Ponadto, tradycyjne hodowle organoidów utrzymywane w rusztowaniach hydrożelowych w warunkach statycznych nie odzwierciedlają dokładnie aktywnej biomechaniki in vivo.
Inne podejścia stosowane przez kilka grup badawczych wykorzystują wstępnie ustrukturyzowane rusztowania hydrożelowe 3D do imitacji struktury nabłonka jelit poprzez hodowlę izolowanych ludzkich komórek jelitowych na powierzchni żelu. Rusztowania hydrożelowe można wytwarzać przy użyciu form drukowanych w 3D, mikrofrezowanych lub litograficznie wytwarzanych. Ta metoda pokazuje samoorganizujący się układ izolowanych komórek nabłonkowych in vitro z fizjologicznie istotnymi gradientami morfogenów, tworząc strukturę nabłonkową o dużym współczynniku kształtu i interakcję między podścieliskiem a nabłonkiem poprzez włączenie komórek podścieliska do rusztowania. Jednakże natura wstępnie ustrukturyzowanych rusztowań może uniemożliwiać zaprezentowanie samego spontanicznego procesu morfogenezy. Modele te nie zapewniają również dynamicznego przepływu światła ani śródmiąższowego, ponieważ brakuje im ścinającego naprężenia płynu, którego komórki jelitowe potrzebują do przejścia morfogenezy i uzyskania funkcji fizjologicznych. W innym niedawnym badaniu wykorzystano rusztowania hydrożelowe na platformie mikroprzepływowej i wzorzyste struktury nabłonkowe jelit przy użyciu technik trawienia laserowego. Jelita myszy Organoidy podążają za wytrawionymi wzorami, tworząc struktury kanalików jelitowych, a przepływ płynu wewnątrz światła jelita można odtworzyć za pomocą modułu mikroprzepływowego. Jednak ten model nie wykazuje spontanicznych procesów morfogenetycznych ani nie uwzględnia ruchów mechanobiologicznych jelit. Techniki druku 3D z tej samej grupy pozwoliły na stworzenie miniaturowych rurek jelitowych ze spontanicznymi procesami morfogenetycznymi. Pomimo złożonego wytwarzania różnych segmentów jelita wewnątrz rurki, model ten nie uwzględnia również przepływu płynu w świetle jelita ani odkształceń mechanicznych. Ponadto funkcjonalność modelu może być ograniczona, zwłaszcza po zakończeniu procesu biodrukowania, co zaburza warunki eksperymentalne lub interakcje międzykomórkowe. Zamiast tego nasz proponowany protokół zapewnia spontaniczną morfogenezę jelita, fizjologicznie istotne naprężenie ścinające, biomechanikę naśladującą ruchliwość jelita, dostępność niezależnych przedziałów wierzchołkowych i boczno-podstawnych oraz odtwarzanie złożonych mikrośrodowisk biologicznych o modułowej strukturze. Dlatego nasz protokół morfogenezy 3D in vitro może stanowić uzupełniające podejście do pokonania wyzwań związanych z istniejącymi metodami.
Nasz protokół jest w całości skoncentrowany na trójwymiarowej morfogenezie nabłonka, z hodowlą wyłącznie komórek nabłonka i bez innych typów otaczających komórek, takich jak komórki mezenchymalne, komórki śródbłonka i komórki układu odpornościowego. Jak opisano wcześniej, sednem naszego protokołu jest indukcja morfogenezy nabłonka poprzez usunięcie inhibitorów morfogenezy wydzielanych po stronie podstawno-bocznej wprowadzonego podłoża. Podczas gdy solidna modułowość naszego układu „jelito na chipie” i hybrydy na chipie pozwala nam odtworzyć falistą trójwymiarową warstwę nabłonka, dodatkowe złożoności biologiczne, takie jak interakcje nabłonka i mezenchymy33,34, odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)35 oraz, w naszym modelu, cechy krypty i kosmka, które przekazują nisze komórek macierzystych w kryptach podstawnych, pozostają do dalszego rozważenia. Komórki podścieliska (np. fibroblasty) w mezenchymie odgrywają kluczową rolę w produkcji białek ECM i regulacji morfogenezy jelitowej w vivo35,37,38.Dodanie komórek mezenchymalnych do naszego modelu poprawiło proces morfogenezy i wydajność przylegania komórek. Warstwa śródbłonka (tj. naczynia włosowate lub limfatyczne) odgrywa ważną rolę w regulacji transportu molekularnego39 i rekrutacji komórek odpornościowych40 w mikrośrodowisku jelit. Ponadto elementy układu naczyniowego, które można połączyć między modelami tkankowymi, są warunkiem koniecznym, gdy modele tkankowe są projektowane w celu wykazania interakcji między narządami. Dlatego może być konieczne uwzględnienie komórek śródbłonka w celu dokładniejszego modelowania cech fizjologicznych z rozdzielczością na poziomie narządów. Komórki odpornościowe pochodzące od pacjentów są również niezbędne do prezentowania wrodzonych odpowiedzi odpornościowych, prezentacji antygenów, wrodzonej adaptacyjnej interakcji odpornościowej i odporności swoistej tkankowo w kontekście naśladowania choroby jelit.
Zastosowanie układów hybrydowych jest prostsze niż w przypadku układu jelitowego typu „jelito na układzie scalonym”, ponieważ konfiguracja urządzenia jest prostsza, a użycie wkładek Transwell umożliwia skalowalną hodowlę nabłonka jelitowego. Jednak dostępne w sprzedaży wkładki Transwell z membranami poliestrowymi nie są elastyczne i nie mogą symulować ruchów perystaltycznych. Ponadto przedział wierzchołkowy wkładki Transwell umieszczonej w układzie hybrydowym pozostał nieruchomy, bez naprężeń ścinających po stronie wierzchołkowej. Oczywiste jest, że właściwości statyczne w przedziale wierzchołkowym rzadko umożliwiają długoterminową współhodowlę bakterii w układach hybrydowych. Chociaż możemy skutecznie indukować morfogenezę 3D we wkładkach Transwell przy użyciu układów hybrydowych, niedobór fizjologicznie istotnej biomechaniki i przepływu płynu wierzchołkowego może ograniczyć wykonalność platform układów hybrydowych w potencjalnych zastosowaniach.
Pełnoskalowe rekonstrukcje osi krypta-kosmek w ludzkich kulturach jelito-na-chipie i hybryda-na-chipie nie zostały jeszcze w pełni ustalone. Ponieważ morfogeneza zaczyna się od monowarstwy nabłonka, mikroarchitektury 3D niekoniecznie zapewniają morfologiczne podobieństwo do krypt in vivo. Chociaż scharakteryzowaliśmy proliferującą populację komórek w pobliżu domeny krypty podstawnej w mikroinżynierowanym nabłonku 3D, krypty i obszary kosmków nie zostały wyraźnie odgraniczone. Chociaż wyższe górne kanały na chipie prowadzą do zwiększenia wysokości mikroinżynierowanego nabłonka, maksymalna wysokość jest nadal ograniczona do ~300–400 µm. Rzeczywista głębokość ludzkich krypt jelitowych w jelicie cienkim i grubym wynosi odpowiednio ~135 µm i ~400 µm, a wysokość kosmków jelita cienkiego to ~600 µm41.
Z punktu widzenia obrazowania, obrazowanie in situ superrozdzielczości mikroarchitektur 3D może być ograniczone do jelita na chipie, ponieważ wymagana odległość robocza od soczewki obiektywu do warstwy nabłonkowej wynosi rzędu kilku milimetrów. Aby pokonać ten problem, może być potrzebny odległy obiektyw. Ponadto, wykonywanie cienkich skrawków do obrazowania preparatów jest trudne ze względu na wysoką elastyczność PDMS. Ponadto, ponieważ mikrofabrykacja jelita na chipie warstwa po warstwie wymaga trwałej przyczepności między każdą warstwą, otwarcie lub usunięcie górnej warstwy w celu zbadania struktury powierzchni warstwy nabłonkowej jest niezwykle trudne. Na przykład przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).
Hydrofobowość PDMS stanowi czynnik ograniczający w badaniach mikroprzepływowych dotyczących małych cząsteczek hydrofobowych, ponieważ PDMS może niespecyficznie adsorbować takie cząsteczki hydrofobowe. Można rozważyć alternatywy dla PDMS z wykorzystaniem innych materiałów polimerowych. Można również rozważyć modyfikację powierzchni PDMS (np. powlekanie materiałami lipofilowymi 42 lub glikolem polietylenowym 43 ) w celu zminimalizowania adsorpcji cząsteczek hydrofobowych.
Wreszcie, nasza metoda nie została dobrze scharakteryzowana pod kątem zapewnienia przesiewu o wysokiej przepustowości lub uniwersalnej, przyjaznej dla użytkownika platformy eksperymentalnej. Obecny protokół wymaga pompy strzykawkowej na każde mikrourządzenie, co zajmuje miejsce w inkubatorze CO2 i uniemożliwia przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę. To ograniczenie można znacznie zredukować dzięki skalowalności innowacyjnych formatów hodowli (np. 24-, 96- lub 384-dołkowych porowatych wkładek, które umożliwiają ciągłe uzupełnianie i usuwanie pożywki basolateralnej).
Aby wywołać trójwymiarową morfogenezę ludzkiego nabłonka jelitowego in vitro, użyliśmy mikroprzepływowego urządzenia jelitowego z chipem zawierającego dwa równoległe mikrokanaliki i elastyczną porowatą membranę pomiędzy nimi, aby utworzyć interfejs światło-kapilara. Demonstrujemy również zastosowanie jednokanałowego urządzenia mikroprzepływowego (hybrydowego chipa), który zapewnia ciągły przepływ basolateralny pod spolaryzowanymi warstwami nabłonka wyhodowanymi na wkładkach Transwell. Na obu platformach morfogenezę różnych ludzkich komórek nabłonka jelitowego można zademonstrować, stosując kierunkową manipulację przepływem w celu usunięcia antagonistów morfogenów z przedziału basolateralnego. Cała procedura eksperymentalna (Rysunek 1) składa się z pięciu części: (i) mikrowytwarzanie chipa jelitowego lub hybrydowego chipa wkładanego Transwell (kroki 1-5; Ramka 1), (ii) przygotowanie komórek nabłonka jelitowego (komórek Caco-2) lub ludzkich organoidów jelitowych; pola 2-5), (iii) hodowla komórek nabłonka jelitowego na chipach jelitowych lub chipach hybrydowych (kroki 6-9), (iv) indukcja morfogenezy 3D in vitro (krok 10) i (v) w celu scharakteryzowania mikrostruktury nabłonka 3D (kroki 11-24). Na koniec zaprojektowano odpowiednią grupę kontrolną (omówioną szerzej poniżej) w celu walidacji skuteczności morfogenezy in vitro poprzez porównanie morfogenezy nabłonka z kontrolami przestrzennymi, czasowymi, warunkowymi lub proceduralnymi.
Użyliśmy dwóch różnych platform hodowlanych: jelita na chipie z prostymi kanałami lub nieliniowymi kanałami zawiłymi lub hybrydowych chipów zawierających wkładki Transwell (TW) w urządzeniu mikroprzepływowym, wytworzonym zgodnie z opisem w Ramce 1, a krok 1-5 „Wytwarzanie urządzenia” przedstawia główne kroki w tworzeniu pojedynczego chipa lub hybrydowego chipa. „Hodowla ludzkich komórek nabłonka jelitowego” wyjaśnia źródło komórek (Caco-2 lub ludzkie organoidy jelitowe) i procedurę hodowli stosowaną w tym protokole. „Morogeneza in vitro” przedstawia ogólne kroki, w których komórki nabłonkowe pochodzące z Caco-2 lub organoidów są hodowane na chipie jelitowym lub na wkładkach Transwell hybrydowego chipa, a następnie indukowane jest morfogeneza 3D i formowanie scharakteryzowanej struktury nabłonkowej. Numer kroku programu lub numer pola jest wyświetlany pod każdą strzałką. Aplikacja zawiera przykłady, w jaki sposób można wykorzystać ustalone warstwy nabłonka jelitowego, na przykład w charakterystyce różnicowania komórek, badaniach fizjologii jelit, ustanawianiu ekosystemów gospodarz-mikrobiom i modelowanie chorób. Obrazy immunofluorescencyjne w „Cell Differentiation” przedstawiające jądra, F-aktynę i MUC2 wyrażone w warstwie nabłonkowej 3D Caco-2 wygenerowanej na chipie jelitowym. Sygnalizacja MUC2 jest obecna w komórkach kubkowych i śluzie wydzielanym z powierzchni błon śluzowych. Obrazy fluorescencyjne w Gut Physiology przedstawiają śluz wytworzony przez barwienie na reszty kwasu sialowego i N-acetyloglukozaminy przy użyciu fluorescencyjnej aglutyniny kiełków pszenicy. Dwa nakładające się obrazy w „Host-Microbe Co-Cultures” przedstawiają reprezentatywne współhodowle gospodarz-mikrobiom w jelicie na chipie. Lewy panel przedstawia współhodowlę E. coli wyrażającej zielone białko fluorescencyjne (GFP) z mikroinżynierowanymi komórkami nabłonkowymi 3D Caco-2. Prawy panel przedstawia lokalizację GFP E. coli hodowanych wspólnie z komórkami nabłonkowymi 3D Caco-2 komórki, a następnie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą F-aktyny (czerwony) i jąder (niebieski). Modelowanie chorób ilustruje zdrowe jelito w porównaniu z nieszczelnym na chipach zapalenia jelit w warunkach fizjologicznego wyzwania antygenami bakteryjnymi (np. lipopolisacharydem, LPS) i komórkami odpornościowymi (np. PBMC; zielonym). Komórki Caco-2 hodowano w celu utworzenia trójwymiarowej warstwy nabłonkowej. Skala: 50 µm. Obrazy w dolnym rzędzie: „Różnicowanie komórek” zaadaptowano za zgodą z odniesienia.2. Oxford University Press; Reprodukowano za zgodą z Ref.5. NAS; „Host-Microbe Co-Culture” zaadaptowano za zgodą z ref.3. NAS; „Disease Modeling” zaadaptowano za zgodą z odniesienia.5. NAS.
Zarówno układy scalone jelitowe, jak i hybrydowe, wytworzono przy użyciu replik PDMS wyjętych z form krzemowych metodą miękkiej litografii1,44 i ukształtowanych przy użyciu SU-8. Projekt mikrokanałów w każdym układzie scalonym określono, biorąc pod uwagę dynamikę hydrodynamiczną, taką jak naprężenie ścinające i ciśnienie hydrodynamiczne1,4,12. Oryginalny projekt układu scalonego jelitowego (rozszerzone dane, rys. 1a), który składał się z dwóch zestawionych ze sobą równoległych prostych mikrokanałów, ewoluował w złożony układ scalony jelitowy (rozszerzone dane, rys. 1b), który obejmuje parę zakrzywionych mikrokanałów, aby wywołać zwiększony czas przebywania płynu, nieliniowe wzorce przepływu i wieloosiową deformację hodowanych komórek (rys. 2a–f) 12. Gdy konieczne jest odtworzenie bardziej złożonej biomechaniki jelit, można wybrać złożone układy scalone jelitowe. Wykazaliśmy, że zawiły układ scalony jelitowy silnie indukuje również morfogenezę 3D w podobny sposób ramy czasowe z podobnym stopniem wzrostu nabłonka w porównaniu do oryginalnego Gut-Chip, niezależnie od rodzaju hodowanych komórek. Dlatego, aby wywołać morfogenezę 3D, liniowe i złożone projekty jelit na chipie są wymienne. Repliki PDMS utwardzone na formach silikonowych z wzorami SU-8 zapewniły cechy negatywne po wyjęciu z formy (rys. 2a). Aby wytworzyć jelito na chipie, przygotowana górna warstwa PDMS została sekwencyjnie połączona z porowatą folią PDMS, a następnie wyrównana z dolną warstwą PDMS poprzez nieodwracalne wiązanie przy użyciu urządzenia do obróbki koronowej (rys. 2b–f). Aby wytworzyć hybrydowe chipy, utwardzone repliki PDMS zostały połączone ze szklanymi szkiełkami, aby stworzyć jednokanałowe urządzenia mikroprzepływowe, które mogły pomieścić wkładki Transwell (rys. 2h i rozszerzone dane rys. 2). Proces łączenia przeprowadza się poprzez obróbkę powierzchni repliki PDMS i szkła plazmą tlenową lub obróbką koronową. Po sterylizacji mikrourządzenia przymocowanego do silikonowej rurki, Urządzenie było gotowe do przeprowadzenia trójwymiarowej morfogenezy nabłonka jelitowego (rysunek 2g).
a, Schematyczna ilustracja przygotowania części PDMS z form silikonowych z wzorem SU-8. Nieutwardzony roztwór PDMS wylano na formę silikonową (po lewej), utwardzono w temperaturze 60°C (w środku) i wyjęto z formy (po prawej). Wyjęty z formy PDMS pocięto na kawałki i oczyszczono do dalszego użycia. b, Zdjęcie formy silikonowej użytej do przygotowania górnej warstwy PDMS. c, Zdjęcie formy silikonowej użytej do wytworzenia porowatej membrany PDMS. d, Seria zdjęć górnych i dolnych komponentów PDMS oraz zmontowanego urządzenia jelitowego na chipie. e, Schemat ułożenia górnego, membranowego i dolnego komponentu PDMS. Każda warstwa jest nieodwracalnie połączona za pomocą obróbki plazmowej lub koronowej. f, Schemat wytworzonego urządzenia jelitowego na chipie z nałożonymi na siebie mikrokanalikami konwolucyjnymi i komorami próżniowymi. g, Przygotowanie urządzenia jelitowego na chipie do mikroprzepływowej hodowli komórek. Wytworzone jelito na chipie zmontowane za pomocą rurki silikonowej i strzykawkę umieszczono na szkiełku nakrywkowym. Układ scalony umieszczono na pokrywce 150 mm szalki Petriego w celu przetworzenia. Spoiwo użyto do zamknięcia silikonowej rurki.h, Wizualne migawki wytwarzania układu hybrydowego i morfogenezy 3D z wykorzystaniem układów hybrydowych. Wkładki Transwell, przygotowane niezależnie do hodowli 2D monowarstw komórek nabłonka jelitowego, wprowadzono do układu hybrydowego w celu zaindukowania morfogenezy 3D jelita. Medium jest perfundowane przez mikrokanaliki pod warstwą komórek utworzoną na wkładce Transwell. Skala, 1 cm.h Przedruk za zgodą źródła.4. Elsevier.
W tym protokole linia komórkowa Caco-2 i organoidy jelitowe były używane jako źródła nabłonkowe (ryc. 3a). Oba typy komórek hodowano niezależnie (ramka 2 i ramka 5) i wykorzystano do zasiania mikrokanalików pokrytych ECM w jelitach on-chip lub wkładkach Transwell. Gdy komórki osiągnęły zlewność (>95% pokrycia w kolbach), rutynowo hodowane komórki Caco-2 (pomiędzy pasażami 10 i 50) w kolbach T zbierano w celu przygotowania zawiesiny komórek zdysocjowanych za pomocą płynu trypsynizującego (ramka 2). Ludzkie organoidy jelitowe z biopsji jelit lub resekcji chirurgicznych hodowano w kopułach rusztowania Matrigel w płytkach 24-dołkowych w celu wsparcia mikrośrodowiska strukturalnego. Pożywkę zawierającą niezbędne morfogeny (takie jak Wnt, R-spondyna i Noggin) i czynniki wzrostu przygotowane zgodnie z opisem w ramce 3 uzupełniano co drugi dzień, aż organoidy osiągnęły ~500 µm średnicy. W pełni wyrośnięte organoidy są zbierane i rozdzielane na pojedyncze komórki w celu zasiania na jelita lub wkłady Transwell na chipie (ramka 5). Jak już wcześniej informowaliśmy, można je różnicować według rodzaju choroby12,13 (np. wrzodziejące zapalenie jelita grubego, choroba Leśniowskiego-Crohna, rak jelita grubego lub zdrowy dawca), miejsca uszkodzenia (np. uszkodzenie w porównaniu z obszarem bez uszkodzenia) i lokalizacji w przewodzie pokarmowym (np. dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, kątnica, okrężnica lub odbytnica). W ramce 5 przedstawiamy zoptymalizowany protokół hodowli organoidów okrężnicy (koloidów), które zazwyczaj wymagają wyższych stężeń morfogenów niż organoidy jelita cienkiego.
a, Przebieg pracy indukcji morfogenezy jelita w chipie jelitowym. W tym protokole do zademonstrowania morfogenezy 3D wykorzystano nabłonek jelitowy Caco-2 i organoidy jelitowe. Wyizolowane komórki nabłonkowe wysiano w przygotowanym urządzeniu jelito-na-chip (przygotowanie chipa). Po wysadzeniu komórek (wysienie) i ich przyłączeniu (przyłączenie) do porowatej membrany PDMS w dniu 0 (D0), zainicjowano przepływ szczytowy (AP) i utrzymywano go przez pierwsze 2 dni (przepływ, AP, D0-D2). Rozpoczęto również przepływ bazolateralny (BL) wraz z cyklicznymi ruchami rozciągającymi (rozciąganie, przepływ, AP i BL), gdy utworzy się kompletna monowarstwa 2D. Trójwymiarowa morfogeneza jelita wystąpiła spontanicznie po 5 dniach hodowli mikroprzepływowej (morfogeneza, D5). Obrazy z kontrastem fazowym przedstawiają reprezentatywną morfologię komórek Caco-2 na każdym etapie eksperymentu lub w każdym punkcie czasowym (wykres słupkowy, 100 µm). Cztery schematyczne diagramy ilustrujące odpowiadające im kaskady morfogenezy jelit (prawy górny róg). Przerywane strzałki na schemacie oznaczają kierunek przepływu płynu. b, obraz SEM pokazujący topologię powierzchni ustalonego nabłonka Caco-2 3D (po lewej). Wstawka podświetlająca powiększony obszar (białe przerywane pole) pokazuje zregenerowane mikrokosmki na warstwie Caco-2 3D (po prawej). c, poziomy widok czołowy ustalonego Caco-2 3D, klaudyny (ZO-1, czerwonej) i ciągłych błon rąbka szczoteczkowego oznaczonych jako F-aktyna (zielona) i jądra (niebieskie). Wizualizacja konfokalna komórek nabłonkowych na chipach jelitowych za pomocą immunofluorescencji. Strzałki skierowane w stronę środkowego schematu wskazują położenie płaszczyzny ogniskowej dla każdego widoku konfokalnego. d, przebieg czasowy zmian morfologicznych w organoidach hodowanych na chipie uzyskanych za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej w dniach 3, 7, 9, 11 i 13. Wstawka (w prawym górnym rogu) przedstawia duże powiększenie dostarczonego obrazu.e, Mikrofotografia DIC trójwymiarowego nabłonka organoidowego utworzonego w jelicie na skrawku wykonanym 7. dnia.f, Nałożone obrazy immunofluorescencji przedstawiające markery komórek macierzystych (LGR5; magenta), komórek kubkowych (MUC2; zielony), F-aktyny (szary) i jąder (cyjan) hodowanych na chipach jelitowych przez odpowiednio 3 dni (po lewej) i 13-dniowych (w środku) organoidów na warstwie nabłonkowej.Zobacz także rozszerzone dane, Rysunek 3, który przedstawia sygnalizację LGR5 bez sygnalizacji MUC2. Obrazy fluorescencyjne przedstawiające mikrostrukturę nabłonka (po prawej) trójwymiarowego nabłonka organoidowego utworzonego w jelicie na chipie przez barwienie błony plazmatycznej barwnikiem CellMask (po prawej) 13. dnia hodowli. Skala wynosi 50 μm, o ile nie zaznaczono inaczej.b Przedruk za zgodą źródła.2. Oxford University Press; c Zaadaptowano za zgodą z Reference.2. Oxford University Press; e i f zaadaptowano za zgodą przez reference.12 Na podstawie licencji Creative Commons CC BY 4.0.
W jelicie na chipie konieczna jest modyfikacja hydrofobowej powierzchni porowatej membrany PDMS w celu skutecznego powlekania ECM. W tym protokole stosujemy dwie różne metody modyfikacji hydrofobowości membran PDMS. W przypadku hodowli komórek Caco-2, aktywacja powierzchni za pomocą samego promieniowania UV/ozonu wystarczyła do zmniejszenia hydrofobowości powierzchni PDMS, pokrycia ECM i przyłączenia komórek Caco-2 do membrany PDMS. Jednakże, mikroprzepływowa hodowla nabłonka organoidowego wymaga chemicznej funkcjonalizacji powierzchni w celu osiągnięcia wydajnego osadzania białek ECM poprzez sekwencyjne nakładanie polietylenoiminy (PEI) i glutaraldehydu do mikrokanalików PDMS. Po modyfikacji powierzchni, białka ECM zostały osadzone w celu pokrycia funkcjonalizowanej powierzchni PDMS, a następnie wprowadzone do izolowanego nabłonka organoidowego. Po przyłączeniu komórek, mikroprzepływowa hodowla komórek rozpoczyna się od perfuzji tylko pożywki do górnego mikrokanalika, aż komórki utworzą pełną monowarstwę, podczas gdy dolny mikrokanalik utrzymuje warunki statyczne. Ta zoptymalizowana metoda aktywacji powierzchni i powlekania ECM umożliwia przyłączenie nabłonka organoidowego w celu wywołania morfogenezy 3D na powierzchni PDMS.
Hodowle Transwell również wymagają pokrycia ECM przed wysianiem komórek; jednak kultury Transwell nie wymagają skomplikowanych etapów wstępnej obróbki w celu aktywacji powierzchni porowatych wkładek. W przypadku hodowli komórek Caco-2 na wkładkach Transwell, powłoka ECM na porowatych wkładkach przyspiesza przyleganie rozdzielonych komórek Caco-2 (<1 godz.) i tworzenie bariery ścisłych połączeń (<1-2 dni). Aby hodować organoidy na wkładkach Transwell, wyizolowane organoidy wysiewa się na wkładki pokryte ECM, przylega do powierzchni membrany (<3 godz.) i utrzymuje do momentu, aż organoidy utworzą kompletną monowarstwę z integralnością bariery. Hodowle Transwell przeprowadza się na płytkach 24-dołkowych bez użycia chipów hybrydowych.
Morfogenezę 3D in vitro można zainicjować, stosując przepływ płynu do boczno-podstawnej części ustalonej warstwy nabłonkowej. W jelicie na chipie morfogeneza nabłonka rozpoczęła się, gdy medium zostało perfundowane do górnych i dolnych mikrokanałów (rys. 3a). Jak opisano wcześniej, kluczowe jest wprowadzenie przepływu płynu do dolnego (boczno-podstawnego) przedziału w celu ciągłego usuwania kierunkowo wydzielanych inhibitorów morfogenów. Aby dostarczyć wystarczającą ilość składników odżywczych i surowicy do komórek związanych na porowatych błonach i wygenerować naprężenie ścinające w świetle, zwykle stosujemy podwójny przepływ w jelicie na chipie. W hybrydowych chipach wkładki Transwell zawierające monowarstwy nabłonkowe zostały wprowadzone do hybrydowych chipów. Następnie medium zostało podane pod boczno-podstawną stronę porowatej wkładki Transwell przez mikrokanał. Morfogeneza jelita nastąpiła 3-5 dni po rozpoczęciu przepływu boczno-podstawnego w obu platformach hodowlanych.
Cechy morfologiczne mikroinżynierowanych warstw nabłonka 3D można analizować, stosując różne modalności obrazowania, w tym mikroskopię fazowo-kontrastową, mikroskopię różnicowo-interferencyjną (DIC), SEM lub mikroskopię konfokalną immunofluorescencyjną (rysunki 3 i 4). Obrazowanie fazowo-kontrastowe lub DIC można łatwo wykonać w dowolnym momencie hodowli, aby monitorować kształt i wypukłość warstw nabłonka 3D. Ze względu na optyczną przezroczystość PDMS i folii poliestrowych, zarówno platforma jelita na chipie, jak i hybrydowe platformy chipowe mogą zapewnić obrazowanie in situ w czasie rzeczywistym bez potrzeby cięcia lub demontażu urządzenia. Podczas wykonywania obrazowania immunofluorescencyjnego (rysunki 1, 3c, f i 4b, c) komórki są zazwyczaj utrwalane 4% (wag./obj.) paraformaldehydem (PFA), a następnie Tritonem X-100 i 2% (wag./obj.) albuminą surowicy bydlęcej (BSA), w zamówienie. W zależności od rodzaju komórki, można stosować różne utrwalacze, permeabilizatory i czynniki blokujące. Pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko markerom komórek lub regionów zależnych od linii komórkowej są używane do wyróżnienia komórek unieruchomionych in situ na chipie, a następnie przeciwciała drugorzędowe wraz z barwnikiem kontrastowym skierowanym przeciwko jądru (np. 4′,6-diamidino-2-fenylen) indol, DAPI) lub F-aktynie (np. fluorescencyjnie znakowana falloidyna). Obrazowanie na żywo oparte na fluorescencji można również wykonać in situ w celu wykrycia produkcji śluzu (ryc. 1, „Różnicowanie komórek” i „Fizjologia jelit”), losowej kolonizacji komórek drobnoustrojów (ryc. 1, „Współhodowla gospodarza i drobnoustrojów”), rekrutacji komórek odpornościowych (ryc. 1, „Modelowanie chorób”) lub konturów morfologii nabłonka 3D (ryc. 3c, f i 4b, c). Podczas modyfikacji jelita na chipie, aby oddzielić warstwę górną od dolnej warstwy mikrokanalików, jak opisano w ref. Jak pokazano na rys. 2, trójwymiarową morfologię nabłonka, a także mikrokosmki na wierzchołkowej rąbku szczoteczkowym można uwidocznić za pomocą SEM (rys. 3b). Ekspresję markerów różnicowania można ocenić, wykonując ilościową reakcję PCR5 lub sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. W tym przypadku trójwymiarowe warstwy komórek nabłonkowych hodowanych na chipach jelitowych lub chipach hybrydowych są zbierane przez trypsynizację, a następnie wykorzystywane do analizy molekularnej lub genetycznej.
a, Przebieg pracy indukcji morfogenezy jelitowej na hybrydowym chipie. W tym protokole wykorzystano Caco-2 i organoidy jelitowe do zademonstrowania morfogenezy 3D na platformie hybrydowego chipa. Rozdzielone komórki nabłonkowe wysiano do przygotowanych wkładek Transwell (przygotowanie TW; patrz rysunek poniżej). Po wysadzeniu komórek (zasianiu) i przymocowaniu ich do membran poliestrowych we wkładkach Transwell, wszystkie komórki hodowano w warunkach statycznych (hodowla TW). Po 7 dniach pojedynczą wkładkę Transwell zawierającą 2D monowarstwę komórek nabłonkowych zintegrowano z hybrydowym chipem w celu wprowadzenia przepływu basolateralnego (przepływ, BL), co ostatecznie doprowadziło do wygenerowania 3D warstwy nabłonkowej (morfogeneza). Mikrofotografie z kontrastem fazowym przedstawiające cechy morfologiczne ludzkich komórek nabłonkowych narządów pochodzących z okrężnicy wstępującej zdrowego dawcy (linia C103) na każdym etapie eksperymentu lub w każdym punkcie czasowym. Schematy w górnych warstwach ilustrują konfigurację eksperymentu dla każdego etapu.b, Chipy hybrydowe (schemat po lewej) może prowadzić do morfogenezy 3D komórek nabłonkowych organoidów z widokami mikroskopii konfokalnej z góry do dołu pobranymi w różnych pozycjach Z (górnej, środkowej i dolnej; patrz schemat po prawej i odpowiadające im linie przerywane). wykazały oczywiste cechy morfologiczne.F-aktyna (cyjan), jądro (szary).c, Mikrofotografie konfokalne z fluorescencją (widok pod kątem 3D) komórek nabłonkowych pochodzących z organoidów hodowanych w statycznym Transwell (TW; wstawka w białym przerywanym polu) w porównaniu z chipem hybrydowym (największe pełne ujęcie) porównujące morfologię 2D i 3D.Para pionowych widoków 2D przekroju poprzecznego (wstawka w prawym górnym rogu; „XZ”) również pokazuje cechy 2D i 3D.Podziałka, 100 µm.c Przedruk za zgodą odniesienia.4. Elsevier.
Kontrole można przygotować, hodując te same komórki (Caco-2 lub komórki nabłonka organoidowego jelita) w dwuwymiarowych monowarstwach w konwencjonalnych warunkach hodowli statycznej. Należy zauważyć, że wyczerpanie składników odżywczych może nastąpić z powodu ograniczonej pojemności objętościowej mikrokanalików (tj. ~4 µl w górnym kanale w oryginalnej konstrukcji chipa jelitowego). Dzięki temu można również porównać morfologię nabłonka przed i po zastosowaniu przepływu basolateralnego.
Proces miękkiej litografii powinien być przeprowadzany w czystym pomieszczeniu. Dla każdej warstwy na chipie (warstwy górnej i dolnej oraz membrany) oraz chipów hybrydowych zastosowano różne fotomaski i wytworzono je na oddzielnych płytkach krzemowych, ponieważ wysokości mikrokanałów były różne. Docelowe wysokości górnych i dolnych mikrokanałów jelita na chipie wynoszą odpowiednio 500 µm i 200 µm. Docelowa wysokość kanału chipa hybrydowego wynosi 200 µm.
Umieść płytkę silikonową o średnicy 3 cali w naczyniu z acetonem. Delikatnie obracaj płytką przez 30 sekund, a następnie pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu. Przenieś płytkę na płytkę z IPA, a następnie obracaj płytkę przez 30 sekund, aby ją wyczyścić.
Opcjonalnie można zastosować roztwór piranii (mieszanina nadtlenku wodoru i stężonego kwasu siarkowego w stosunku 1:3 (obj./obj.)), aby zmaksymalizować usuwanie pozostałości organicznych z powierzchni płytki krzemowej.
Roztwór piranii jest niezwykle żrący i wytwarza ciepło. Konieczne jest podjęcie dodatkowych środków ostrożności. Przed utylizacją odpadów należy odczekać, aż roztwór ostygnie, a następnie przelać go do czystego, suchego pojemnika na odpady. Należy używać pojemników wtórnych i odpowiednio opisywać pojemniki na odpady. W celu uzyskania szczegółowych procedur należy przestrzegać wytycznych bezpieczeństwa obowiązujących w placówce.
Odwodnij wafle, umieszczając je na płycie grzewczej o temperaturze 200 °C na 10 min. Po odwodnieniu wafel należy pięciokrotnie wstrząsnąć na powietrzu, aby go ostudzić.
Na środek oczyszczonej płytki krzemowej nanieś około 10 g fotorezystu SU-8 2100. Za pomocą pęsety równomiernie rozprowadź fotorezyst na płytce. Od czasu do czasu umieszczaj płytkę na płycie grzewczej o temperaturze 65°C, aby fotorezyst był mniej lepki i łatwiejszy do rozprowadzenia. Nie umieszczaj płytki bezpośrednio na płycie grzewczej.
SU-8 równomiernie rozprowadzono na waflu poprzez uruchomienie powlekania wirowego. Zaprogramuj przychodzący obrót SU-8 na 5–10 s, aby rozchodził się z prędkością 500 obr./min przy przyspieszeniu 100 obr./s. Ustaw główny obrót na wzór grubości 200 µm przy 1500 obr./min lub uzyskaj grubość 250 µm (tworząc wysokość 500 µm dla górnej warstwy jelita na chipie; patrz „Kroki krytyczne” poniżej) przy przyspieszeniu 300 obr./s przez 30 sekund przy 1200 obr./min.
Główną prędkość wirowania można regulować w zależności od docelowej grubości wzoru SU-8 na waflu krzemowym.
Aby wytworzyć wzory SU-8 o wysokości 500 µm dla górnej warstwy jelita na chipie, powtórzono sekwencyjnie kroki powlekania wirowego i miękkiego wypalania tego pudełka (kroki 7 i 8) (patrz krok 9), aby wytworzyć dwie warstwy o grubości 250 µm. Gruba warstwa SU-8, którą można nakładać warstwami i łączyć za pomocą naświetlania UV w kroku 12 tego pudełka, tworząc warstwę o wysokości 500 µm.
Delikatnie wypiecz wafle pokryte powłoką SU-8, ostrożnie umieszczając je na płycie grzejnej w temperaturze 65°C na 5 minut, a następnie przełącz ustawienie na 95°C i inkubuj przez kolejne 40 minut.
Aby uzyskać wysokość wzoru SU-8 wynoszącą 500 μm w górnym mikrokanale, powtórz kroki 7 i 8, aby wygenerować dwie warstwy SU-8 o grubości 250 μm.
Za pomocą urządzenia UV Mask Aligner wykonaj test lampy zgodnie z instrukcją producenta, aby obliczyć czas ekspozycji płytki. (czas ekspozycji, ms) = (dawka ekspozycji, mJ/cm2)/(moc lampy, mW/cm2).
Po ustaleniu czasu naświetlania umieść fotomaskę w uchwycie maski urządzenia do wyrównywania maski UV i umieść fotomaskę na powleczonym waflu SU-8.
Umieść zadrukowaną powierzchnię fotomaski bezpośrednio na stronie płytki krzemowej pokrytej powłoką SU-8, aby zminimalizować dyspersję UV.
Poddaj płytkę pokrytą powłoką SU-8 i fotomaskę działaniu promieniowania ultrafioletowego o natężeniu 260 mJ/cm2 w pozycji pionowej przez ustalony czas (patrz krok 10 w tym polu).
Po naświetleniu promieniami UV płytki krzemowe pokryte powłoką SU-8 wypiekano w temperaturze 65°C przez 5 min i 95°C przez 15 min na każdej płycie grzewczej, aby uzyskać wzory o wysokości 200 μm. Aby uzyskać wzory o wysokości 500 μm, wydłużono czas wypalania w temperaturze 95°C do 30 min.
Wywoływacz wlewa się do szklanej miski, a następnie umieszcza się w niej upieczony opłatek. Objętość wywoływacza SU-8 może się różnić w zależności od rozmiaru szklanej płytki. Należy upewnić się, że użyto wystarczającej ilości wywoływacza SU-8, aby całkowicie usunąć nienaświetlony SU-8. Na przykład, używając szklanej miski o średnicy 150 mm i pojemności 1 l, należy użyć około 300 ml wywoływacza SU-8. Wywoływać formę przez 25 minut, od czasu do czasu delikatnie obracając.
Wywołaną formę należy przepłukać około 10 ml świeżego wywoływacza, a następnie roztworem IPA spryskując go pipetą.
Umieść płytkę w urządzeniu czyszczącym plazmowym i poddaj działaniu plazmy tlenowej (gaz atmosferyczny, ciśnienie docelowe 1 × 10−5 Torr, moc 125 W) przez 1,5 minuty.
Umieść płytkę w eksykatorze próżniowym z szkiełkiem podstawowym w środku. Płytki i szkiełka podstawowe można układać obok siebie. Jeżeli eksykator próżniowy jest podzielony płytką na kilka warstw, umieść szkiełka podstawowe w dolnej komorze, a płytki podstawowe w górnej. Nanieś 100 μl roztworu trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanu na szkiełko podstawowe i zastosuj próżnię w celu silanizacji.
Rozmroź fiolkę zamrożonych komórek Caco-2 w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, a następnie przenieś rozmrożone komórki do kolby T75 zawierającej 15 ml podgrzanego do 37°C podłoża Caco-2.
Aby przepuścić komórki Caco-2 przy ~90% zbieżności, najpierw należy ogrzać medium Caco-2, PBS i 0,25% trypsyny/1 mM EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
Odessać medium za pomocą odsysania próżniowego. Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml ciepłego PBS, powtarzając odsysanie próżniowe i dodając świeżego PBS.