Dziękujemy za odwiedzenie witryny Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby uzyskać najlepsze efekty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Tymczasem, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Morfogeneza ludzkiego jelita ustala cechy krypty-kosmków trójwymiarowej mikroarchitektury nabłonka i organizacji przestrzennej. Ta wyjątkowa struktura jest wymagana do utrzymania homeostazy jelita poprzez ochronę niszy komórek macierzystych w krypcie podstawnej przed egzogennymi antygenami bakteryjnymi i ich metabolitami. Ponadto kosmki jelitowe i wydzielający śluz prezentują funkcjonalnie zróżnicowane komórki nabłonkowe z barierą ochronną na powierzchni błony śluzowej jelita. Dlatego odtworzenie trójwymiarowych struktur nabłonkowych ma kluczowe znaczenie dla konstrukcji modeli jelit in vitro. Co ciekawe, organiczne jelito naśladujące układ chipowy może indukować spontaniczną trójwymiarową morfogenezę nabłonka jelitowego ze zwiększonymi funkcjami fizjologicznymi i biomechaniką. W tym artykule przedstawiamy powtarzalny protokół, aby solidnie indukować morfogenezę jelitową w jelicie na mikroprzepływowym układzie chipowym, jak również na hybrydowym układzie chipowym z wbudowanym układem Transwell. Opisujemy szczegółowe metody wytwarzania urządzeń, hodowli komórek nabłonkowych Caco-2 lub organoidów jelitowych w konwencjonalnych warunkach, jak również na platforma mikroprzepływowa, indukcja morfogenezy 3D i charakterystyka ustalonego nabłonka 3D przy użyciu wielu modalności obrazowania. Ten protokół umożliwia regenerację funkcjonalnej mikroarchitektury jelitowej poprzez kontrolowanie przepływu płynu basolateralnego przez 5 dni. Nasza metoda morfogenezy in vitro wykorzystuje fizjologicznie istotne naprężenie ścinające i ruch mechaniczny i nie wymaga złożonej inżynierii komórkowej ani manipulacji, co może przewyższyć inne istniejące techniki. Przewidujemy, że nasz proponowany protokół może mieć szerokie implikacje dla społeczności badawczej zajmującej się biomedycyną, zapewniając metodę regeneracji warstw nabłonka jelitowego 3D in vitro do zastosowań biomedycznych, klinicznych i farmaceutycznych.
Eksperymenty wykazują, że komórki nabłonka jelitowego Caco-2 hodowane w urządzeniach typu gut-on-a-chip1,2,3,4,5 lub dwuwarstwowych urządzeniach mikroprzepływowych6,7 mogą podlegać spontanicznej trójwymiarowej morfogenezie in vitro bez dokładnego zrozumienia mechanizmu leżącego u jej podstaw. W naszych ostatnich badaniach odkryliśmy, że usunięcie antagonistów morfogenów wydzielanych basolateralnie z urządzeń hodowlanych jest konieczne i wystarczające do wywołania trójwymiarowej morfogenezy nabłonka in vitro, co zostało wykazane w przypadku Caco-2 i organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów. Komórki nabłonkowe zostały zweryfikowane. W tym badaniu skupiliśmy się na produkcji komórkowej i dystrybucji stężeń silnego antagonisty Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), w jelitach na chipie i modyfikowanych urządzeniach mikroprzepływowych zawierających wkładki Transwell, określanych jako „Hybrydowy chip”. Wykazaliśmy, że dodanie egzogennych antagonistów Wnt (takich jak DKK-1, represor Wnt 1, wydzielane białko frizzled-related protein 1 lub Soggy-1) do jelita na chipie hamuje morfogenezę lub zakłóca wstępnie ustrukturyzowaną trójwymiarową warstwę nabłonka, co sugeruje, że antagonistyczny stres podczas hodowli jest odpowiedzialny za morfogenezę jelitową in vitro. Dlatego praktycznym podejściem do osiągnięcia solidnej morfogenezy na styku nabłonka jest usunięcie lub minimalne utrzymanie poziomów antagonistów Wnt w przedziale basolateralnym poprzez aktywne płukanie (np. na platformach gut-on-a-chip lub hybrydowych-on-a-chip) lub dyfuzję.Media basolateralne (np. z wkładek Transwell do dużych zbiorników basolateralnych w studzienkach).
W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę wytwarzania mikrourządzeń typu „jelito na chipie” i hybrydowych chipów z możliwością wprowadzania Transwell (kroki 1–5) w celu hodowli komórek nabłonka jelitowego na porowatych membranach na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS) (kroki 6A, 7A, 8, 9) lub poliestrowych membranach wkładek Transwell (kroki 6B, 7B, 8, 9) i indukowanej morfogenezy 3D in vitro (krok 10). Zidentyfikowaliśmy również cechy komórkowe i molekularne wskazujące na tkankowo-specyficzną histogenezę i zależne od linii różnicowanie komórkowe poprzez zastosowanie wielu modalności obrazowania (kroki 11–24). Indukujemy morfogenezę przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego, takich jak Caco-2 lub organoidy jelitowe, w dwóch formatach hodowli ze szczegółami technicznymi, w tym modyfikacją powierzchni porowatych membran, tworzeniem monowarstw 2D oraz biochemicznymi i reprodukcją mikrośrodowiska biomechanicznego.in in vitro. Aby wywołać morfogenezę 3D z monowarstw nabłonka 2D, usunęliśmy antagonistów morfogenów w obu hodowanych formach poprzez przepływ medium do przedziału bazolateralnego hodowli. Na koniec przedstawiamy reprezentację użyteczności regenerowalnej warstwy nabłonka 3D, która może być używana do modelowania zależnego od morfogenów wzrostu nabłonka, podłużnych współhodowli gospodarza i mikrobiomu, infekcji patogenami, uszkodzeń zapalnych, dysfunkcji bariery nabłonkowej i terapii opartych na probiotykach. Przykład.wpływów.
Nasz protokół może być przydatny dla szerokiego grona naukowców w badaniach podstawowych (np. biologia błony śluzowej jelit, biologia komórek macierzystych i biologia rozwoju) i stosowanych (np. przedkliniczne testy leków, modelowanie chorób, inżynieria tkankowa i gastroenterologia) o szerokim zasięgu. Ze względu na powtarzalność i solidność naszego protokołu w zakresie indukowania trójwymiarowej morfogenezy nabłonka jelitowego in vitro, przewidujemy, że nasza strategia techniczna może zostać rozpowszechniona wśród odbiorców badających dynamikę sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju jelit, regeneracji lub homeostazy. Ponadto nasz protokół jest przydatny do badania infekcji różnymi czynnikami zakaźnymi, takimi jak Norowirus 8, koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 lub Vibrio cholerae. Przydatne są również osoby zainteresowane patologią i patogenezą chorób. Zastosowanie układu mikrofizjologii jelit na chipie może umożliwić podłużną współhodowlę10 i późniejszą ocenę obrony gospodarza, odpowiedzi immunologicznej i naprawy uszkodzeń spowodowanych przez patogen w przewodzie pokarmowym (GI)11. Inne zaburzenia przewodu pokarmowego związane z zespołem nieszczelnego jelita, celiakią, chorobą Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, zapaleniem zbiornika jelitowego lub zespołem jelita drażliwego można symulować, gdy trójwymiarowe warstwy nabłonka jelitowego zostaną przygotowane przy użyciu trójwymiarowych warstw nabłonka jelitowego pacjenta. Choroby te obejmują zanik kosmków jelitowych, skracanie krypt, uszkodzenie błony śluzowej lub upośledzoną barierę nabłonkową. Biopsja lub organoidy jelitowe pochodzące z komórek macierzystych12,13. Aby lepiej modelować większą złożoność środowiska choroby, czytelnicy mogą rozważyć dodanie typów komórek istotnych dla choroby, takich jak mononuklearne komórki krwi obwodowej pacjenta (PBMC), do modeli zawierających trójwymiarowe mikroarchitektury kosmków jelitowych i krypt. komórki odpornościowe specyficzne dla danej tkanki, 5.
Ponieważ trójwymiarową mikrostrukturę nabłonka można utrwalić i zwizualizować bez procesu sekcjonowania, osoby pracujące nad transkryptomiką przestrzenną i obrazowaniem o wysokiej lub superrozdzielczości mogą być zainteresowane naszym mapowaniem dynamiki czasoprzestrzennej genów i białek w niszach nabłonkowych. Zainteresowany technologią.Reakcja na bodźce mikrobiologiczne lub immunologiczne.Ponadto, podłużne interakcje gospodarza z mikrobiomem 10, 14, które koordynują homeostazę jelit, można ustalić w trójwymiarowej warstwie śluzówki jelitowej poprzez współhodowlę różnych gatunków mikroorganizmów, społeczności mikrobiologicznych lub mikrobioty kałowej, zwłaszcza w jelicie na chipie. na platformie. Takie podejście jest szczególnie atrakcyjne dla odbiorców studiujących immunologię błon śluzowych, gastroenterologię, mikrobiom człowieka, kulturomikę i mikrobiologię kliniczną, którzy chcą hodować wcześniej niehodowaną mikrobiotę jelitową w laboratorium. Jeśli nasz protokół morfogenezy in vitro można dostosować do skalowalnych formatów hodowli, takich jak wkładki wielodołkowe w płytkach 24-, 96- lub 384-dołkowych, które stale uzupełniają przedziały basolateralne, protokół można również rozpowszechnić wśród osób opracowujących platformy farmaceutyczne, biomedyczne lub przesiewowe lub walidacyjne o wysokiej przepustowości dla przemysłu spożywczego. Jako dowód koncepcji niedawno wykazaliśmy wykonalność multipleksowego systemu morfogenezy o wysokiej przepustowości, skalowalnego do formatu płytki 24-dołkowej. Ponadto skomercjalizowano wiele produktów typu „organ-on-a-chip”16,17,18. Dlatego walidację naszej metody morfogenezy in vitro można przyspieszyć i potencjalnie przyjąć w wielu laboratoriach badawczych, przemyśle lub rządzie i agencje regulacyjne w celu zrozumienia przeprogramowania komórkowego morfogenezy jelita in vitro na poziomie transkryptomowym w celu testowania leków lub środków biologicznych. Wchłanianie i transport kandydatów na leki oceniano przy użyciu trójwymiarowych surogatów jelita lub niestandardowych lub komercyjnych modeli narządów na układzie scalonym w celu oceny powtarzalności procesu morfogenezy jelita.
Do badania morfogenezy nabłonka jelitowego wykorzystano ograniczoną liczbę modeli eksperymentalnych istotnych dla człowieka, głównie z powodu braku możliwych do wdrożenia protokołów do indukowania morfogenezy 3D in vitro. W rzeczywistości większość obecnej wiedzy na temat morfogenezy jelit opiera się na badaniach na zwierzętach (np. danio pręgowanym20, myszach21 lub kurach22). Są one jednak pracochłonne i kosztowne, mogą budzić wątpliwości etyczne, a co najważniejsze, nie określają precyzyjnie procesów rozwojowych człowieka. Modele te są również bardzo ograniczone w zakresie możliwości testowania w sposób skalowalny wielokierunkowo. Dlatego nasz protokół regeneracji struktur tkankowych 3D in vitro przewyższa modele zwierzęce in vivo, a także inne tradycyjne statyczne modele hodowli komórek 2D. Jak opisano wcześniej, wykorzystanie struktur nabłonkowych 3D pozwoliło nam zbadać lokalizację przestrzenną zróżnicowanych komórek w osi krypta-kosmek w odpowiedzi na różne bodźce śluzówkowe lub immunologiczne. Warstwy nabłonkowe 3D mogą zapewniają przestrzeń do badania, w jaki sposób komórki drobnoustrojów konkurują o tworzenie nisz przestrzennych i ewolucję ekologiczną w odpowiedzi na czynniki gospodarza (np. wewnętrzne i zewnętrzne warstwy śluzu, wydzielanie IgA i peptydów przeciwdrobnoustrojowych). Ponadto, trójwymiarowa morfologia nabłonka może pozwolić nam zrozumieć, w jaki sposób mikrobiota jelitowa kształtuje swoje społeczności i synergicznie wytwarza metabolity drobnoustrojów (np. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe), które kształtują organizację komórkową i nisze komórek macierzystych w kryptach podstawnych. Cechy te można wykazać tylko wtedy, gdy trójwymiarowe warstwy nabłonka zostaną ustanowione in vitro.
Oprócz naszej metody tworzenia trójwymiarowych struktur nabłonka jelitowego, istnieje kilka metod in vitro. Hodowla organoidów jelitowych jest najnowocześniejszą techniką inżynierii tkankowej opartą na hodowli komórek macierzystych jelit w określonych warunkach morfogenetycznych23,24,25. Jednak wykorzystanie trójwymiarowych modeli organoidów do analizy transportu lub współhodowli mikrobiomu gospodarza jest często trudne, ponieważ światło jelita jest zamknięte w organoidzie, a zatem wprowadzenie składników światła, takich jak komórki drobnoustrojów lub antygeny egzogenne, jest ograniczone. Dostęp do świateł organoidów można poprawić za pomocą mikrowstrzykiwacza26,27, ale ta metoda jest inwazyjna i pracochłonna, a do jej wykonania wymagana jest specjalistyczna wiedza. Ponadto tradycyjne kultury organoidów utrzymywane w rusztowaniach hydrożelowych w warunkach statycznych nie odzwierciedlają dokładnie aktywnej biomechaniki in vivo.
Inne podejścia stosowane przez kilka grup badawczych wykorzystują wstępnie ustrukturyzowane rusztowania hydrożelowe 3D w celu naśladowania struktury nabłonka jelit poprzez hodowlę izolowanych ludzkich komórek jelitowych na powierzchni żelu. Wytwarzaj rusztowania hydrożelowe przy użyciu form drukowanych w technologii 3D, mikrofrezowanych lub litograficznie wytwarzanych. Ta metoda pokazuje samorzutnie uporządkowany układ izolowanych komórek nabłonkowych in vitro z fizjologicznie istotnymi gradientami morfogenów, tworząc strukturę nabłonka o wysokim współczynniku kształtu i interakcję między podścieliskiem a nabłonkiem poprzez włączenie komórek podścieliska do rusztowania. Jednak natura wstępnie ustrukturyzowanych rusztowań może uniemożliwiać wyświetlanie samego spontanicznego procesu morfogenetycznego. Modele te nie zapewniają również dynamicznego przepływu światła ani śródmiąższowego, ponieważ brakuje naprężenia ścinającego płynu, którego komórki jelitowe potrzebują do przejścia morfogenezy i uzyskania funkcji fizjologicznej. W innym niedawnym badaniu wykorzystano rusztowania hydrożelowe na platformie mikroprzepływowej i wzorzyste struktury nabłonka jelitowego przy użyciu technik trawienia laserowego. Jelito myszy organoidy podążają za wytrawionymi wzorami, tworząc struktury kanalików jelitowych, a przepływ płynu wewnątrz światła jelita można odtworzyć za pomocą modułu mikroprzepływowego. Jednak ten model nie wykazuje spontanicznych procesów morfogenetycznych ani nie obejmuje mechanobiologicznych ruchów jelit. Techniki drukowania 3D z tej samej grupy pozwoliły na stworzenie miniaturowych rurek jelitowych ze spontanicznymi procesami morfogenetycznymi. Pomimo złożonej produkcji różnych segmentów jelita w rurce, model ten nie wykazuje również przepływu płynu w świetle jelita i odkształceń mechanicznych. Ponadto funkcjonalność modelu może być ograniczona, szczególnie po zakończeniu procesu biodrukowania, zakłócając warunki eksperymentalne lub interakcje między komórkami. Zamiast tego nasz proponowany protokół zapewnia spontaniczną morfogenezę jelita, fizjologicznie istotne naprężenie ścinające, biomechanikę naśladującą ruchliwość jelita, dostępność niezależnych przedziałów wierzchołkowych i boczno-podstawnych oraz odtwarzanie złożonych biologicznych mikrośrodowisk o modułowości. Dlatego nasz protokół morfogenezy 3D in vitro może zapewnić uzupełniające podejście do przezwyciężenia wyzwań związanych z istniejącymi metodami.
Nasz protokół jest w całości skoncentrowany na trójwymiarowej morfogenezie nabłonka, z hodowlą wyłącznie komórek nabłonka i bez innych typów otaczających komórek, takich jak komórki mezenchymalne, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe. Jak opisano wcześniej, sednem naszego protokołu jest indukcja morfogenezy nabłonka poprzez usunięcie inhibitorów morfogenezy wydzielanych po stronie podstawno-bocznej wprowadzonego medium. Podczas gdy solidna modułowość naszego jelita na chipie i hybrydy na chipie pozwala nam odtworzyć falującą trójwymiarową warstwę nabłonka, dodatkowe złożoności biologiczne, takie jak interakcje nabłonkowo-mezenchymalne33,34, odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)35 i, w naszym modelu, cechy krypty-kosmka, które przekazują nisze komórek macierzystych w kryptach podstawnych, pozostają do dalszego rozważenia. Komórki podścieliska (np. fibroblasty) w mezenchymie odgrywają kluczową rolę w produkcji białek ECM i regulacji morfogenezy jelitowej w vivo35,37,38.Dodanie komórek mezenchymalnych do naszego modelu poprawiło proces morfogenezy i wydajność przyłączania komórek.Warstwa śródbłonka (tj. naczynia włosowate lub limfatyczne) odgrywa ważną rolę w regulacji transportu molekularnego39 i rekrutacji komórek odpornościowych40 w mikrośrodowisku jelit.Co więcej, składniki układu naczyniowego, które mogą być połączone między modelami tkanek, są warunkiem wstępnym, gdy modele tkanek są projektowane w celu zademonstrowania interakcji wielonarządowych.W związku z tym może być konieczne uwzględnienie komórek śródbłonka w celu modelowania dokładniejszych cech fizjologicznych z rozdzielczością na poziomie narządów.Komórki odpornościowe pochodzące od pacjentów są również niezbędne do prezentowania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, prezentacji antygenów, wrodzonej adaptacyjnej interakcji immunologicznej i odporności swoistej tkankowo w kontekście naśladowania choroby jelit.
Zastosowanie hybrydowych chipów jest prostsze niż w przypadku technologii „jelito na chipie”, ponieważ konfiguracja urządzenia jest prostsza, a użycie wkładek Transwell umożliwia skalowalną hodowlę nabłonka jelitowego. Jednak dostępne w handlu wkładki Transwell z membranami poliestrowymi nie są elastyczne i nie mogą symulować ruchów perystaltycznych. Ponadto przedział wierzchołkowy wkładki Transwell umieszczonej w hybrydowym chipie pozostał nieruchomy, bez naprężeń ścinających po stronie wierzchołkowej. Oczywiste jest, że właściwości statyczne w przedziale wierzchołkowym rzadko umożliwiają długoterminową współhodowlę bakterii w hybrydowych chipach. Chociaż możemy skutecznie indukować morfogenezę 3D we wkładkach Transwell, stosując hybrydowe chipy, niedobór fizjologicznie istotnej biomechaniki i przepływu płynu wierzchołkowego może ograniczyć wykonalność platform hybrydowych chipów w potencjalnych zastosowaniach.
Pełnoskalowe rekonstrukcje osi krypta-kosmeks w kulturach jelito-na-chipie i hybryda-na-chipie nie zostały w pełni ustalone. Ponieważ morfogeneza zaczyna się od monowarstwy nabłonka, mikroarchitektury 3D niekoniecznie zapewniają morfologiczne podobieństwo do krypt in vivo. Chociaż scharakteryzowaliśmy proliferującą populację komórek w pobliżu domeny krypty podstawnej w mikroinżynieryjnym nabłonku 3D, krypty i obszary kosmków nie zostały wyraźnie odgraniczone. Chociaż wyższe górne kanały na chipie prowadzą do zwiększonej wysokości mikroinżynieryjnego nabłonka, maksymalna wysokość jest nadal ograniczona do ~300–400 µm. Rzeczywista głębokość ludzkich krypt jelitowych w jelicie cienkim i grubym wynosi odpowiednio ~135 µm i ~400 µm, a wysokość kosmków jelita cienkiego wynosi ~600 µm41.
Z punktu widzenia obrazowania, obrazowanie in situ o superrozdzielczości mikroarchitektur 3D może być ograniczone do jelita na chipie, ponieważ wymagana odległość robocza od soczewki obiektywu do warstwy nabłonkowej wynosi rzędu kilku milimetrów. Aby przezwyciężyć ten problem, może być potrzebny odległy obiektyw. Ponadto wykonywanie cienkich skrawków do przygotowywania próbek obrazowych jest trudne ze względu na wysoką elastyczność PDMS. Ponadto, ponieważ mikrowytwarzanie jelita na chipie warstwa po warstwie wymaga trwałej przyczepności między każdą warstwą, niezwykle trudno jest otworzyć lub usunąć górną warstwę w celu zbadania struktury powierzchni warstwy nabłonkowej. Na przykład za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).
Hydrofobowość PDMS stanowi czynnik ograniczający w badaniach mikroprzepływowych dotyczących małych cząsteczek hydrofobowych, ponieważ PDMS może niespecyficznie adsorbować takie cząsteczki hydrofobowe. Alternatywą dla PDMS mogą być inne materiały polimerowe. Alternatywą może być modyfikacja powierzchni PDMS (np. powlekanie materiałami lipofilowymi 42 lub glikolem polietylenowym 43 ) w celu zminimalizowania adsorpcji cząsteczek hydrofobowych.
Wreszcie, nasza metoda nie została dobrze scharakteryzowana pod kątem zapewnienia przesiewu o wysokiej przepustowości lub przyjaznej dla użytkownika platformy eksperymentalnej „uniwersalnej”. Obecny protokół wymaga pompy strzykawkowej na każde mikrourządzenie, co zajmuje miejsce w inkubatorze CO2 i uniemożliwia przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę. To ograniczenie można znacznie poprawić dzięki skalowalności innowacyjnych formatów hodowli (np. 24-dołkowe, 96-dołkowe lub 384-dołkowe porowate wkładki, które umożliwiają ciągłe uzupełnianie i usuwanie pożywki basolateralnej).
Aby wywołać trójwymiarową morfogenezę nabłonka jelitowego człowieka in vitro, użyliśmy mikroprzepływowego urządzenia jelitowego z chipem zawierającego dwa równoległe mikrokanaliki i elastyczną porowatą membranę pomiędzy nimi, aby utworzyć interfejs światło-kapilara. Demonstrujemy również zastosowanie jednokanałowego urządzenia mikroprzepływowego (chip hybrydowy), który zapewnia ciągły przepływ basolateralny pod spolaryzowanymi warstwami nabłonka wyhodowanymi na wkładkach Transwell. Na obu platformach morfogenezę różnych ludzkich komórek nabłonka jelitowego można zademonstrować, stosując kierunkową manipulację przepływem w celu usunięcia antagonistów morfogenów z przedziału basolateralnego. Cała procedura eksperymentalna (rysunek 1) składa się z pięciu części: (i) mikrowytwarzanie chipa jelitowego lub wkładanego hybrydowego chipa Transwell (kroki 1-5; ramka 1), (ii) przygotowanie komórek nabłonka jelitowego (komórek Caco-2) lub ludzkich organoidów jelitowych; pola 2-5), (iii) hodowla komórek nabłonka jelitowego na chipach jelitowych lub chipach hybrydowych (kroki 6-9), (iv) indukcja morfogenezy 3D in vitro (krok 10) i (v) ) w celu scharakteryzowania mikrostruktury nabłonka 3D (kroki 11-24). Na koniec zaprojektowano odpowiednią grupę kontrolną (omówioną szerzej poniżej) w celu walidacji skuteczności morfogenezy in vitro poprzez porównanie morfogenezy nabłonka z kontrolami przestrzennymi, czasowymi, warunkowymi lub proceduralnymi.
Użyliśmy dwóch różnych platform hodowlanych: jelita na chipie z prostymi kanałami lub nieliniowymi kanałami krętymi lub hybrydowe chipy zawierające wkładki Transwell (TW) w urządzeniu mikroprzepływowym, wykonane zgodnie z opisem w Ramce 1, a krok 1-5. „Wytwarzanie urządzenia” przedstawia główne kroki w tworzeniu pojedynczego chipa lub hybrydowego chipa. „Kultura ludzkich komórek nabłonka jelitowego” wyjaśnia źródło komórek (Caco-2 lub ludzkie organoidy jelitowe) i procedurę hodowli stosowaną w tym protokole. „Morfogeneza in vitro” przedstawia ogólne kroki, w których komórki nabłonkowe pochodzące z Caco-2 lub organoidów są hodowane na chipie jelitowym lub na wkładkach Transwell hybrydowego chipa, a następnie indukowane są morfogenezy 3D i formowana jest scharakteryzowana struktura nabłonkowa. Numer kroku programu lub numer pola jest wyświetlany pod każdą strzałką. Aplikacja zawiera przykłady, w jaki sposób można wykorzystać ustalone warstwy nabłonka jelitowego, na przykład w charakterystyce różnicowania komórek, badaniach fizjologii jelit, ustanawianiu ekosystemów gospodarz-mikrobiom i modelowanie chorób. Obrazy immunofluorescencyjne w „Cell Differentiation” przedstawiające jądra, F-aktynę i MUC2 wyrażone w warstwie nabłonkowej 3D Caco-2 wygenerowanej na chipie jelitowym. Sygnalizacja MUC2 jest obecna w komórkach kubkowych i śluzie wydzielanym z powierzchni błon śluzowych. Obrazy fluorescencyjne w Gut Physiology przedstawiają śluz wytwarzany przez barwienie na reszty kwasu sialowego i N-acetyloglukozaminy przy użyciu fluorescencyjnej aglutyniny zarodków pszenicy. Dwa nakładające się obrazy w „Host-Microbe Co-Cultures” przedstawiają reprezentatywne współhodowle gospodarz-mikrobiom w jelicie na chipie. Lewy panel przedstawia współhodowlę E. coli wyrażającej zielone białko fluorescencyjne (GFP) z mikroinżynieryjnymi komórkami nabłonkowymi 3D Caco-2. Prawy panel przedstawia lokalizację GFP E. coli współhodowlanych z komórkami nabłonkowymi 3D Caco-2 komórki, a następnie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą F-aktyny (czerwony) i jąder (niebieski). Modelowanie choroby ilustruje zdrowe jelito w porównaniu z nieszczelnym jelitem w chipach zapalenia jelit poddanych wyzwaniu fizjologicznemu antygenami bakteryjnymi (np. lipopolisacharydem, LPS) i komórkami odpornościowymi (np. PBMC; zielony). Komórki Caco-2 hodowano w celu utworzenia trójwymiarowej warstwy nabłonkowej. Skala, 50 µm. Obrazy w dolnym rzędzie: „Differentiation of cells” zaadaptowane za zgodą z odniesienia.2. Oxford University Press; Reprodukowane za zgodą z odniesienia.5. NAS; „Host-Microbe Co-Culture” zaadaptowane za zgodą z odniesienia.3. NAS; „Disease Modeling” zaadaptowane za zgodą z odniesienia.5. NAS.
Zarówno układy scalone typu „jelito na chipie”, jak i układy hybrydowe zostały wytworzone przy użyciu replik PDMS wyjętych z form krzemowych metodą litografii miękkiej1,44 i wzorowanych przy użyciu SU-8. Projekt mikrokanałów w każdym układzie scalonym został określony na podstawie uwzględnienia dynamiki hydrodynamicznej, takiej jak naprężenie ścinające i ciśnienie hydrodynamiczne1,4,12. Oryginalny projekt układu scalonego typu „jelito na chipie” (rozszerzone dane, rys. 1a), który składał się z dwóch zestawionych ze sobą równoległych prostych mikrokanałów, ewoluował w złożony układ „jelito na chipie” (rozszerzone dane, rys. 1b), który obejmuje parę zakrzywionych mikrokanałów, aby wywołać zwiększony czas przebywania płynu, nieliniowe wzorce przepływu i wieloosiową deformację hodowanych komórek (rys. 2a–f) 12. Gdy konieczne jest odtworzenie bardziej złożonej biomechaniki jelit, można wybrać złożone układy „jelito na chipie”. Wykazaliśmy, że zawiły układ „jelito na chipie” silnie indukuje również morfogenezę 3D w podobny sposób ramy czasowe z podobnym stopniem wzrostu nabłonka w porównaniu do oryginalnego Gut-Chip, niezależnie od rodzaju hodowanych komórek. Dlatego też, aby wywołać morfogenezę 3D, liniowe i złożone projekty jelit na chipie są wymienne. Repliki PDMS utwardzone na formach silikonowych z wzorami SU-8 zapewniły negatywne cechy po wyjęciu z formy (rys. 2a). Aby wykonać jelito na chipie, przygotowana górna warstwa PDMS została sekwencyjnie połączona z porowatą folią PDMS, a następnie wyrównana z dolną warstwą PDMS poprzez nieodwracalne wiązanie przy użyciu urządzenia do obróbki koronowej (rys. 2b–f). Aby wykonać hybrydowe chipy, utwardzone repliki PDMS zostały połączone ze szklanymi szkiełkami, aby stworzyć jednokanałowe urządzenia mikroprzepływowe, które mogłyby pomieścić wkładki Transwell (rys. 2h i rozszerzone dane rys. 2). Proces wiązania jest wykonywany poprzez obróbkę powierzchni repliki PDMS i szkła plazmą tlenową lub obróbką koronową. Po sterylizacji mikroukładu przymocowanego do silikonowej rurki, urządzenie było gotowe do przeprowadzenia trójwymiarowej morfogenezy nabłonka jelitowego (rysunek 2g).
a, Schematyczna ilustracja przygotowania części PDMS z form krzemowych z wzorem SU-8. Nieutwardzony roztwór PDMS wylano na formę silikonową (po lewej), utwardzono w temperaturze 60 °C (w środku) i wyjęto z formy (po prawej). Wyjęty z formy PDMS pocięto na kawałki i wyczyszczono w celu dalszego wykorzystania. b, Zdjęcie formy silikonowej użytej do przygotowania górnej warstwy PDMS. c, Zdjęcie formy silikonowej użytej do wytworzenia porowatej membrany PDMS. d, Seria zdjęć górnych i dolnych komponentów PDMS oraz zmontowanego urządzenia jelitowego na układzie scalonym. e, Schemat ułożenia górnych, membranowych i dolnych komponentów PDMS. Każda warstwa jest nieodwracalnie połączona za pomocą obróbki plazmowej lub koronowej. f, Schemat wytworzonego urządzenia jelita na układzie scalonym z nałożonymi zawiłymi mikrokanalikami i komorami próżniowymi. g, Przygotowanie jelita na układzie scalonym do mikroprzepływowej hodowli komórek. Wytworzone jelito na układzie scalonym zmontowane za pomocą rurki silikonowej i strzykawkę umieszczono na szkiełku nakrywkowym. Układ scalony umieszczono na pokrywce 150 mm szalki Petriego w celu przetworzenia. Spoiwo użyto do zamknięcia silikonowej rurki.h, Wizualne migawki wytwarzania układu hybrydowego i morfogenezy 3D przy użyciu układów hybrydowych. Wkładki Transwell przygotowane niezależnie do hodowli 2D monowarstw komórek nabłonka jelitowego zostały umieszczone w układzie hybrydowym w celu zaindukowania morfogenezy 3D jelita. Medium jest perfundowane przez mikrokanaliki pod warstwą komórek utworzoną na wkładce Transwell. Skala, 1 cm.h Przedruk za zgodą źródła.4. Elsevier.
W tym protokole linia komórkowa Caco-2 i organoidy jelitowe były używane jako źródła nabłonkowe (Rys. 3a). Oba typy komórek hodowano niezależnie (ramka 2 i ramka 5) i użyto do zaszczepienia mikrokanalików pokrytych ECM w jelitach on-chip lub wkładkach Transwell. Gdy komórki są zlewne (>95% pokrycia w kolbach), rutynowo hodowane komórki Caco-2 (pomiędzy pasażami 10 i 50) w kolbach T są zbierane w celu przygotowania zawiesin rozdzielonych komórek za pomocą płynu trypsynizującego (ramka 2). Ludzkie organoidy jelitowe z biopsji jelit lub resekcji chirurgicznych hodowano w kopułach rusztowania Matrigel w 24-dołkowych płytkach w celu wsparcia strukturalnego mikrośrodowiska. Medium zawierające niezbędne morfogeny (takie jak Wnt, R-spondyna i Noggin) i czynniki wzrostu przygotowane zgodnie z opisem w ramce 3 było uzupełniane co drugi dzień, aż organoidy wzrosły do ​​~500 µm średnicy. W pełni wyrośnięte organoidy są zbierane i rozdzielane na pojedyncze komórki w celu zasiania na jelitach lub wkładkach Transwell na chipie (ramka 5). Jak już wcześniej informowaliśmy, można je różnicować według typu choroby12,13 (np. wrzodziejące zapalenie jelita grubego, choroba Leśniowskiego-Crohna, rak jelita grubego lub zdrowy dawca), miejsca uszkodzenia (np. uszkodzenie w porównaniu z obszarem bez uszkodzenia) i lokalizacji przewodu pokarmowego w przewodzie (np. dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, kątnica, okrężnica lub odbytnica). W ramce 5 przedstawiamy zoptymalizowany protokół hodowli organoidów okrężnicy (koloidów), które zazwyczaj wymagają wyższych stężeń morfogenów niż organoidy jelita cienkiego.
a, Przepływ pracy do indukcji morfogenezy jelita w chipie jelitowym. Ludzki nabłonek jelitowy Caco-2 i organoidy jelitowe są używane w tym protokole do zademonstrowania morfogenezy 3D. Wyizolowane komórki nabłonkowe zostały zasiane w przygotowanym urządzeniu gut-on-a-chip (przygotowanie chipa). Po zasianiu komórek (zasiane) i przytwierdzeniu (przytwierdzeniu) do porowatej membrany PDMS w dniu 0 (D0), rozpoczyna się przepływ wierzchołkowy (AP) i utrzymuje się go przez pierwsze 2 dni (przepływ, AP, D0-D2). Przepływ bazolateralny (BL) jest również inicjowany wraz z cyklicznymi ruchami rozciągającymi (rozciąganie, przepływ, AP i BL), gdy utworzona zostaje kompletna monowarstwa 2D. Morfogeneza 3D jelita wystąpiła spontanicznie po 5 dniach hodowli mikroprzepływowej (morfogeneza, D5). Obrazy z kontrastem fazowym pokazują reprezentatywną morfologię komórek Caco-2 na każdym etapie eksperymentu lub punkcie czasowym (wykres słupkowy, 100 µm). Cztery schematyczne diagramy ilustrujące odpowiadające im kaskady morfogenezy jelita (góra, prawy). Przerywane strzałki na schemacie oznaczają kierunek przepływu płynu. b, obraz SEM pokazujący topologię powierzchni utworzonego nabłonka Caco-2 3D (po lewej). Wstawka podświetlająca powiększony obszar (białe przerywane pole) pokazuje zregenerowane mikrokosmki na warstwie Caco-2 3D (po prawej). c, poziomy widok czołowy utworzonego Caco-2 3D, klaudyny (ZO-1, czerwony) i ciągłych błon rąbka szczoteczkowego oznaczonych jako F-aktyna (zielony) i jądra (niebieski). Wizualizacja konfokalna immunofluorescencyjna komórek nabłonkowych na chipach jelitowych. Strzałki wskazujące na środkowy schemat wskazują lokalizację płaszczyzny ogniskowej dla każdego widoku konfokalnego. d, przebieg czasowy zmian morfologicznych w organoidach hodowanych na chipie uzyskanym za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej w dniach 3, 7, 9, 11 i 13. Wstawka (w prawym górnym rogu) pokazuje duże powiększenie dostarczonego obrazu.e, Mikrofotografia DIC trójwymiarowego nabłonka organoidowego utworzonego w jelicie na skrawku wykonanym 7. dnia.f, Nałożone obrazy immunofluorescencji pokazujące markery komórek macierzystych (LGR5; magenta), komórek kubkowych (MUC2; zielony), F-aktyny (szary) i jąder (cyjan) hodowanych na chipach jelitowych przez 3 dni, odpowiednio (po lewej) i 13-dniowych (w środku) organoidów na warstwie nabłonkowej.Zobacz także rozszerzone dane Rysunek 3, który podkreśla sygnalizację LGR5 bez sygnalizacji MUC2. Obrazy fluorescencyjne pokazujące mikrostrukturę nabłonka (po prawej) trójwymiarowego nabłonka organoidowego utworzonego w jelicie na chipie przez barwienie błony plazmatycznej barwnikiem CellMask (po prawej) 13. dnia hodowli. Skala wynosi 50 μm, o ile nie zaznaczono inaczej.b Przedruk za zgodą odniesienia.2. Oxford University Press; c Zaadaptowano za zgodą z Reference.2. Oxford University Press; e i f zaadaptowano za zgodą przez reference.12 Na podstawie licencji Creative Commons CC BY 4.0.
W jelicie na chipie konieczna jest modyfikacja hydrofobowej powierzchni porowatej membrany PDMS w celu skutecznego powlekania ECM. W tym protokole stosujemy dwie różne metody modyfikacji hydrofobowości membran PDMS. W przypadku hodowli komórek Caco-2 sama aktywacja powierzchni za pomocą promieniowania UV/ozonu wystarczyła do zmniejszenia hydrofobowości powierzchni PDMS, pokrycia ECM i przyłączenia komórek Caco-2 do membrany PDMS. Jednak mikroprzepływowa hodowla nabłonka organoidowego wymaga chemicznej funkcjonalizacji powierzchni w celu uzyskania wydajnego osadzania białek ECM poprzez sekwencyjne nakładanie polietylenoiminy (PEI) i glutaraldehydu do mikrokanalików PDMS. Po modyfikacji powierzchni osadzano białka ECM w celu pokrycia funkcjonalizowanej powierzchni PDMS, a następnie wprowadzano je do izolowanego nabłonka organoidowego. Po przyłączeniu komórek mikroprzepływowa hodowla komórek rozpoczyna się od perfuzji wyłącznie medium do górnego mikrokanalika, aż komórki utworzą pełną monowarstwę, podczas gdy dolny mikrokanalik utrzymuje warunki statyczne. Ta zoptymalizowana metoda aktywacji powierzchni i powlekania ECM umożliwia przyłączenie nabłonka organoidowego w celu wywołania morfogenezy 3D na powierzchni PDMS.
Kultury Transwell również wymagają pokrycia powłoką ECM przed wysianiem komórek; jednak kultury Transwell nie wymagają skomplikowanych etapów wstępnej obróbki w celu aktywacji powierzchni porowatych wkładek. W przypadku hodowli komórek Caco-2 na wkładkach Transwell powłoka ECM na porowatych wkładkach przyspiesza przyleganie zdysocjowanych komórek Caco-2 (<1 godzina) i tworzenie bariery połączeń ścisłych (<1-2 dni). Aby hodować organoidy na wkładkach Transwell, wyizolowane organoidy wysiewa się na wkładki pokryte powłoką ECM, przyczepia do powierzchni membrany (<3 godziny) i utrzymuje do momentu, aż organoidy utworzą kompletną monowarstwę z integralnością bariery. Hodowle Transwell przeprowadza się na płytkach 24-dołkowych bez użycia chipów hybrydowych.
Morfogenezę 3D in vitro można zainicjować, stosując przepływ płynu do bocznej części podstawy ustalonej warstwy nabłonkowej. W jelicie na chipie morfogeneza nabłonka rozpoczęła się, gdy medium zostało wprowadzone do górnych i dolnych mikrokanalików (ryc. 3a). Jak opisano wcześniej, kluczowe jest wprowadzenie przepływu płynu do dolnej (boczno-podstawnej) komory w celu ciągłego usuwania kierunkowych wydzielanych inhibitorów morfogenów. Aby dostarczyć wystarczającą ilość składników odżywczych i surowicy do komórek związanych na porowatych błonach i wygenerować naprężenie ścinające w świetle, zwykle stosujemy podwójny przepływ w jelicie na chipie. W hybrydowych chipach wkładki Transwell zawierające monowarstwy nabłonkowe zostały wstawione do hybrydowych chipów. Następnie medium zostało wprowadzone pod boczno-podstawną stronę porowatej wkładki Transwell przez mikrokanaliki. Morfogeneza jelita nastąpiła 3-5 dni po rozpoczęciu przepływu bocznego w obu platformach hodowlanych.
Cechy morfologiczne mikroinżynieryjnych warstw nabłonka 3D można analizować, stosując różne modalności obrazowania, w tym mikroskopię z kontrastem fazowym, mikroskopię z kontrastem różnicowo-interferencyjnym (DIC), SEM lub mikroskopię konfokalną immunofluorescencyjną (rysunki 3 i 4). Obrazowanie z kontrastem fazowym lub DIC można łatwo wykonać w dowolnym momencie hodowli, aby monitorować kształt i wypukłość warstw nabłonka 3D. Ze względu na przezroczystość optyczną folii PDMS i poliestrowych, zarówno platformy typu „jelito na chipie”, jak i hybrydowe platformy chipowe mogą zapewniać obrazowanie in situ w czasie rzeczywistym bez konieczności cięcia lub demontażu urządzenia. Podczas wykonywania obrazowania immunofluorescencyjnego (rysunki 1, 3c, f i 4b, c) komórki są zazwyczaj utrwalane 4% (wag./obj.) paraformaldehydem (PFA), a następnie Tritonem X-100 i 2% (wag./obj.) albuminą surowicy bydlęcej (BSA), w zamówienie.W zależności od rodzaju komórki, można stosować różne utrwalacze, permeabilizatory i czynniki blokujące.Pierwotne przeciwciała skierowane na zależne od linii markery komórek lub regionów są używane do wyróżniania komórek unieruchomionych in situ na chipie, a następnie przeciwciała wtórne wraz z barwnikiem kontrastowym skierowanym na jądro (np. 4′,6-diamidino-2-fenylen) indol, DAPI) lub F-aktynę (np. znakowaną fluorescencyjnie falloidynę).Obrazowanie na żywo oparte na fluorescencji można również wykonać in situ w celu wykrycia produkcji śluzu (Rys. 1, „Różnicowanie komórek” i „Fizjologia jelit”), losowej kolonizacji komórek drobnoustrojów (Rys. 1, „Współhodowla gospodarza i drobnoustrojów”), rekrutacji komórek odpornościowych (Rys. 1, „Modelowanie chorób”) lub konturów trójwymiarowej morfologii nabłonka (Rys. 3c, f i 4b, c).Podczas modyfikacji jelita na chipie, aby oddzielić górną warstwę od dolnej warstwy mikrokanalików, jak opisano w ref.Jak pokazano na rys. 2, trójwymiarową morfologię nabłonka, a także mikrokosmki na wierzchołkowej rąbku szczoteczkowym można uwidocznić za pomocą SEM (rys. 3b).Ekspresję markerów różnicowania można ocenić, wykonując ilościową reakcję PCR5 lub sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.W tym przypadku trójwymiarowe warstwy komórek nabłonkowych hodowanych na chipach jelitowych lub chipach hybrydowych są zbierane przez trypsynizację, a następnie wykorzystywane do analizy molekularnej lub genetycznej.
a, Przepływ pracy do indukcji morfogenezy jelitowej w hybrydowym chipie. Caco-2 i organoidy jelitowe są używane w tym protokole do zademonstrowania morfogenezy 3D na platformie hybrydowego chipa. Rozdzielone komórki nabłonkowe zostały zasiane w przygotowanych wkładkach Transwell (przygotowanie TW; patrz rysunek poniżej). Po zasianiu komórek (zasianiu) i przymocowaniu ich do membran poliestrowych we wkładkach Transwell, wszystkie komórki hodowano w warunkach statycznych (hodowla TW). Po 7 dniach pojedyncza wkładka Transwell zawierająca 2D monowarstwę komórek nabłonkowych została zintegrowana z hybrydowym chipem w celu wprowadzenia przepływu basolateralnego (przepływ, BL), co ostatecznie doprowadziło do wygenerowania warstwy nabłonkowej 3D (morfogeneza). Mikrofotografie z kontrastem fazowym pokazujące cechy morfologiczne ludzkich komórek nabłonkowych narządów pochodzących z okrężnicy wstępującej normalnego dawcy (linia C103) na każdym etapie eksperymentu lub w każdym punkcie czasowym. Schematy w górnych warstwach ilustrują konfigurację eksperymentalną dla każdego etapu.b, Chipy hybrydowe (schemat z lewej) może prowadzić do morfogenezy 3D komórek nabłonkowych organoidów z widokami mikroskopii konfokalnej z góry do dołu pobranymi w różnych pozycjach Z (górna, środkowa i dolna; patrz schemat z prawej i odpowiadające im linie przerywane). wykazały oczywiste cechy morfologiczne.F-aktyna (cyjan), jądro (szary).c, Mikrofotografie konfokalne fluorescencyjne (widok pod kątem 3D) komórek nabłonkowych pochodzących z organoidów hodowanych w statycznym Transwell (TW; wstawka w białym przerywanym polu) w porównaniu z chipem hybrydowym (największe pełne ujęcie) porównujące morfologię 2D i 3D.Para pionowych widoków przekroju 2D (wstawka w prawym górnym rogu; „XZ”) również pokazuje cechy 2D i 3D.Podziałka, 100 µm.c Przedruk za zgodą odniesienia.4. Elsevier.
Kontrole można przygotować poprzez hodowlę tych samych komórek (Caco-2 lub komórek nabłonka organoidowego jelit) w dwuwymiarowych monowarstwach w konwencjonalnych warunkach hodowli statycznej. Należy zauważyć, że wyczerpanie składników odżywczych może być wynikiem ograniczonej pojemności objętościowej mikrokanalików (tj. ~4 µL w górnym kanale w oryginalnym projekcie chipa jelitowego). Dlatego też można również porównać morfologię nabłonka przed i po zastosowaniu przepływu basolateralnego.
Proces miękkiej litografii powinien być przeprowadzany w czystym pomieszczeniu. Dla każdej warstwy na chipie (górnej i dolnej warstwy oraz membrany) oraz chipów hybrydowych zastosowano różne fotomaski i wytworzono je na oddzielnych płytkach krzemowych, ponieważ wysokości mikrokanałów były różne. Docelowe wysokości górnych i dolnych mikrokanałów jelita na chipie wynoszą odpowiednio 500 µm i 200 µm. Docelowa wysokość kanału hybrydowego chipa wynosi 200 µm.
Umieść 3-calowy wafel silikonowy w naczyniu z acetonem. Delikatnie obracaj płytką przez 30 sekund, a następnie osusz wafel na powietrzu. Przenieś wafel na płytkę z IPA, a następnie obracaj płytką przez 30 sekund, aby ją wyczyścić.
Opcjonalnie można zastosować roztwór piranii (mieszanina nadtlenku wodoru i stężonego kwasu siarkowego w stosunku 1:3 (obj./obj.)) w celu zmaksymalizowania usuwania pozostałości organicznych z powierzchni płytki krzemowej.
Roztwór piranii jest niezwykle żrący i wytwarza ciepło. Konieczne jest podjęcie dodatkowych środków ostrożności. Przed utylizacją odpadów należy odczekać, aż roztwór ostygnie, a następnie przelać go do czystego, suchego pojemnika na odpady. Należy używać pojemników wtórnych i odpowiednio opisywać pojemniki na odpady. W celu uzyskania bardziej szczegółowych procedur należy postępować zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa obowiązującymi w placówce.
Odwodnij wafle umieszczając je na 10 min na płycie grzewczej o temperaturze 200°C. Po odwodnieniu wafel pięciokrotnie potrząsaj na powietrzu, aby go ostudzić.
Nanieś około 10 g fotorezystu SU-8 2100 na środek oczyszczonego wafla krzemowego. Za pomocą pęsety równomiernie rozprowadź fotorezyst na waflu. Od czasu do czasu umieszczaj wafel na płycie grzewczej o temperaturze 65°C, aby fotorezyst był mniej lepki i łatwiejszy do rozprowadzenia. Nie umieszczaj wafla bezpośrednio na płycie grzewczej.
SU-8 został równomiernie rozprowadzony na waflu poprzez uruchomienie powlekania wirowego. Zaprogramuj przychodzący obrót SU-8 na 5–10 s, aby rozprzestrzeniał się z prędkością 500 obr./min przy przyspieszeniu 100 obr./s. Ustaw główny obrót na wzorowanie grubości 200 µm przy 1500 obr./min lub uzyskaj grubość 250 µm (tworząc 500 µm wysokości dla górnej warstwy jelita na chipie; patrz „Krytyczne kroki” poniżej) przy przyspieszeniu 300 obr./s przez 30 sekund przy 1200 obr./min.
Główną prędkość wirowania można regulować w zależności od docelowej grubości wzoru SU-8 na płytce krzemowej.
Aby wytworzyć wzory SU-8 o wysokości 500 µm dla górnej warstwy jelita na chipie, powtórzono sekwencyjnie etapy powlekania wirowego i miękkiego wypalania tego pudełka (etapy 7 i 8) (patrz etap 9), aby wytworzyć dwie warstwy o grubości 250 µm. Gruba warstwa SU-8, którą można nakładać warstwami i łączyć za pomocą naświetlania promieniami UV w etapie 12 tego pudełka, tworząc warstwę o wysokości 500 µm.
Delikatnie wypiecz wafle z powłoką SU-8, ostrożnie umieszczając je na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 5 minut, a następnie przełącz ustawienie na 95 °C i inkubuj przez kolejne 40 minut.
Aby uzyskać wysokość wzoru SU-8 wynoszącą 500 μm w górnym mikrokanale, należy powtórzyć kroki 7 i 8, aby wygenerować dwie warstwy SU-8 o grubości 250 μm.
Za pomocą urządzenia UV Mask Aligner wykonaj test lampy zgodnie z instrukcją producenta, aby obliczyć czas ekspozycji płytki. (czas ekspozycji, ms) = (dawka ekspozycji, mJ/cm2)/(moc lampy, mW/cm2).
Po ustaleniu czasu naświetlania umieść fotomaskę w uchwycie maski urządzenia do wyrównywania maski UV i umieść fotomaskę na powleczonym waflu SU-8.
Umieść zadrukowaną powierzchnię fotomaski bezpośrednio na pokrytej warstwą SU-8 stronie płytki krzemowej, aby zminimalizować dyspersję UV.
Poddaj płytkę pokrytą powłoką SU-8 i fotomaskę działaniu promieniowania UV o natężeniu 260 mJ/cm2 w pozycji pionowej przez ustalony czas (patrz krok 10 w tym polu).
Po naświetleniu promieniami UV, płytki krzemowe pokryte powłoką SU-8 wypiekano w temperaturze 65°C przez 5 min. i 95°C przez 15 min. na każdej płycie grzewczej, aby uzyskać wzory o wysokości 200 μm. Wydłużono czas wypiekania po nałożeniu w temperaturze 95°C do 30 min., aby uzyskać wzory o wysokości 500 μm.
Wywoływacz wlewa się do szklanego naczynia, a następnie umieszcza się w nim upieczony opłatek. Objętość wywoływacza SU-8 może się różnić w zależności od rozmiaru szklanej płytki. Upewnij się, że używasz wystarczającej ilości wywoływacza SU-8, aby całkowicie usunąć nienaświetlony SU-8. Na przykład, używając szklanego naczynia o średnicy 150 mm i pojemności 1 l, użyj około 300 ml wywoływacza SU-8. Wywoływaj formę przez 25 minut, okazjonalnie delikatnie obracając.
Wywołaną formę należy przepłukać ok. 10 ml świeżego wywoływacza, a następnie roztworem IPA spryskując go za pomocą pipety.
Umieścić płytkę w urządzeniu czyszczącym plazmowym i wystawić na działanie plazmy tlenowej (gaz atmosferyczny, ciśnienie docelowe 1 × 10−5 Torr, moc 125 W) przez 1,5 minuty.
Umieść płytkę w eksykatorze próżniowym z płytką szklaną w środku. Płytki i płytki można umieszczać obok siebie. Jeśli eksykator próżniowy jest podzielony płytką na kilka warstw, umieść płytki w dolnej komorze, a płytki w górnej komorze. Nanieś 100 μl roztworu trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanu na płytkę szklaną i zastosuj próżnię w celu silanizacji.
Rozmroź fiolkę zamrożonych komórek Caco-2 w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, a następnie przenieś rozmrożone komórki do kolby T75 zawierającej 15 ml podgrzanego do 37°C podłoża Caco-2.
Aby przepuścić komórki Caco-2 przy ~90% zbieżności, najpierw należy ogrzać medium Caco-2, PBS i 0,25% trypsyny/1 mM EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
Odessać podłoże za pomocą odsysania próżniowego. Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml ciepłego PBS, powtarzając odsysanie próżniowe i dodając świeżego PBS.