ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
กระบวนการสร้างรูปร่างของลำไส้มนุษย์ก่อให้เกิดลักษณะเฉพาะของคริปต์-วิลลัส ซึ่งเป็นโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติและการจัดระเบียบเชิงพื้นที่ โครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์นี้จำเป็นต่อการรักษาสภาวะสมดุลของลำไส้โดยการปกป้องแหล่งกำเนิดเซลล์ต้นกำเนิดในคริปต์ฐานจากแอนติเจนของจุลินทรีย์ภายนอกและเมตาบอไลต์ของพวกมัน นอกจากนี้ วิลลัสในลำไส้และเมือกที่หลั่งออกมายังนำเสนอเซลล์เยื่อบุผิวที่แตกต่างกันตามหน้าที่พร้อมกับเกราะป้องกันบนพื้นผิวเยื่อบุลำไส้ ดังนั้น การสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติขึ้นใหม่จึงมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการสร้างแบบจำลองลำไส้ในหลอดทดลอง ที่น่าสนใจคือ ลำไส้จำลองบนชิปแบบอินทรีย์สามารถกระตุ้นการสร้างรูปร่างแบบ 3 มิติของเยื่อบุผิวลำไส้ได้เองโดยธรรมชาติ พร้อมด้วยฟังก์ชันทางสรีรวิทยาและกลไกทางชีวภาพที่เพิ่มขึ้น ในที่นี้ เราได้นำเสนอโปรโตคอลที่ทำซ้ำได้เพื่อกระตุ้นการสร้างรูปร่างของลำไส้ในลำไส้บนชิปไมโครฟลูอิดิกอย่างมีประสิทธิภาพ รวมถึงในชิปไฮบริดแบบฝัง Transwell เราได้อธิบายวิธีการโดยละเอียดสำหรับการผลิตอุปกรณ์ การเพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 หรือเซลล์เยื่อบุผิวของออร์แกนอยด์ลำไส้ในสภาพแวดล้อมแบบดั้งเดิมและบนแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิก การเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่างสามมิติ และการจำแนกลักษณะของเยื่อบุผิวสามมิติที่เกิดขึ้นโดยใช้เทคนิคการถ่ายภาพหลายรูปแบบ โปรโตคอลนี้ทำให้เกิดการสร้างโครงสร้างจุลภาคของลำไส้ที่ใช้งานได้ขึ้นใหม่โดยการควบคุมการไหลของของเหลวที่ฐานด้านข้างเป็นเวลา 5 วัน วิธีการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองของเราใช้แรงเฉือนและการเคลื่อนไหวเชิงกลที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา และไม่จำเป็นต้องใช้การวิศวกรรมเซลล์หรือการจัดการที่ซับซ้อน ซึ่งอาจมีประสิทธิภาพเหนือกว่าเทคนิคอื่นๆ ที่มีอยู่ เราคาดการณ์ว่าโปรโตคอลที่เราเสนออาจมีผลกระทบอย่างกว้างขวางต่อชุมชนวิจัยทางการแพทย์ โดยเป็นวิธีการสร้างชั้นเยื่อบุผิวลำไส้สามมิติขึ้นใหม่ในหลอดทดลองสำหรับการใช้งานทางการแพทย์ ทางคลินิก และทางเภสัชกรรม
การทดลองแสดงให้เห็นว่าเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ Caco-2 ที่เพาะเลี้ยงใน gut-on-a-chip1,2,3,4,5 หรืออุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกแบบสองชั้น6,7 สามารถเกิดการเปลี่ยนแปลงรูปร่างแบบ 3 มิติได้เองในหลอดทดลอง โดยไม่ต้องมีความเข้าใจที่ชัดเจนเกี่ยวกับกลไกพื้นฐาน ในการศึกษาล่าสุดของเรา เราพบว่าการกำจัดสารต้านมอร์โฟเจนที่หลั่งออกมาทางด้านฐานจากอุปกรณ์เพาะเลี้ยงนั้นมีความจำเป็นและเพียงพอที่จะกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติในหลอดทดลอง ซึ่งได้รับการพิสูจน์แล้วโดย Caco-2 และออร์แกนอยด์ลำไส้ที่ได้จากผู้ป่วย เซลล์เยื่อบุผิวได้รับการตรวจสอบแล้ว ในการศึกษานี้ เรามุ่งเน้นไปที่การผลิตเซลล์และการกระจายความเข้มข้นของสารต้าน Wnt ที่มีประสิทธิภาพสูงอย่าง Dickkopf-1 (DKK-1) ในลำไส้จำลองบนชิปและอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกที่ดัดแปลงแล้วซึ่งมีแผ่น Transwell แทรกอยู่ เรียกว่า "ไฮบริดชิป" เราแสดงให้เห็นว่าการเติมสารต้าน Wnt จากภายนอก (เช่น DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1 หรือ Soggy-1) ลงในลำไส้จำลองบนชิปจะยับยั้งการสร้างรูปร่างหรือทำลายชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติที่มีโครงสร้างไว้ล่วงหน้า ซึ่งบ่งชี้ว่าความเครียดจากสารต้านในระหว่างการเพาะเลี้ยงเป็นสาเหตุของการสร้างรูปร่างของลำไส้ในหลอดทดลอง ดังนั้น แนวทางปฏิบัติที่ได้ผลในการสร้างรูปร่างที่แข็งแรงที่ส่วนต่อประสานของเยื่อบุผิวคือการกำจัดหรือรักษาระดับของสารต้าน Wnt ในช่องฐานด้านข้างให้น้อยที่สุดโดยการชะล้างอย่างต่อเนื่อง (เช่น ในแพลตฟอร์มลำไส้จำลองบนชิปหรือไฮบริดชิป) หรือการแพร่กระจาย สื่อกลางด้านฐาน (เช่น จากแผ่นแทรก Transwell ลงในแหล่งกักเก็บขนาดใหญ่ด้านฐานในบ่อ)
ในโปรโตคอลนี้ เราได้นำเสนอวิธีการโดยละเอียดสำหรับการสร้างไมโครดีไวซ์ลำไส้บนชิปและชิปไฮบริดที่สามารถใส่ Transwell ได้ (ขั้นตอนที่ 1-5) เพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้บนเยื่อพรุนที่ทำจากโพลีไดเมทิลไซลอกเซน (PDMS) (ขั้นตอนที่ 6A, 7A, 8, 9) หรือเยื่อโพลีเอสเตอร์ของ Transwell (ขั้นตอนที่ 6B, 7B, 8, 9) และกระตุ้นการสร้างรูปร่างสามมิติในหลอดทดลอง (ขั้นตอนที่ 10) นอกจากนี้ เรายังได้ระบุลักษณะทางเซลล์และโมเลกุลที่บ่งชี้ถึงการเกิดเนื้อเยื่อเฉพาะและการแยกความแตกต่างของเซลล์ที่ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์โดยใช้เทคนิคการถ่ายภาพหลายรูปแบบ (ขั้นตอนที่ 11-24) เรากระตุ้นการสร้างรูปร่างโดยใช้เซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ เช่น Caco-2 หรือออร์แกนอยด์ลำไส้ ในสองรูปแบบการเพาะเลี้ยงพร้อมรายละเอียดทางเทคนิค รวมถึงการดัดแปลงพื้นผิวของเยื่อพรุน การสร้างโมโนเลเยอร์ 2 มิติ และชีวเคมีของลำไส้ และการจำลองคุณสมบัติทางชีวกลศาสตร์ สภาพแวดล้อมจุลภาคในหลอดทดลอง เพื่อชักนำให้เกิดการสร้างรูปร่างสามมิติจากชั้นเซลล์เยื่อบุผิวสองมิติ เราได้กำจัดสารต้านมอร์โฟเจนในทั้งสองรูปแบบการเพาะเลี้ยงโดยการไหลของตัวกลางเข้าไปในช่องฐานด้านข้างของการเพาะเลี้ยง สุดท้ายนี้ เราได้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของชั้นเยื่อบุผิวสามมิติที่สามารถสร้างใหม่ได้ ซึ่งสามารถนำมาใช้เป็นแบบจำลองการเจริญเติบโตของเยื่อบุผิวที่ขึ้นอยู่กับมอร์โฟเจน การเพาะเลี้ยงร่วมกันระหว่างโฮสต์และไมโครไบโอมในระยะยาว การติดเชื้อจากเชื้อโรค การบาดเจ็บจากการอักเสบ การทำงานผิดปกติของเยื่อบุผิว และการบำบัดด้วยโปรไบโอติก ตัวอย่าง อิทธิพล
โปรโตคอลของเราอาจเป็นประโยชน์ต่อนักวิทยาศาสตร์หลากหลายสาขา ทั้งงานวิจัยพื้นฐาน (เช่น ชีววิทยาของเยื่อบุลำไส้ ชีววิทยาของเซลล์ต้นกำเนิด และชีววิทยาการพัฒนา) และงานวิจัยประยุกต์ (เช่น การทดสอบยาในระยะก่อนคลินิก การสร้างแบบจำลองโรค วิศวกรรมเนื้อเยื่อ และระบบทางเดินอาหาร) เนื่องจากโปรโตคอลของเราสามารถทำซ้ำได้และมีความแข็งแกร่งในการกระตุ้นการสร้างรูปร่างสามมิติของเยื่อบุลำไส้ในหลอดทดลอง เราจึงคาดการณ์ว่ากลยุทธ์ทางเทคนิคของเราสามารถเผยแพร่ไปยังกลุ่มผู้ที่ศึกษาพลวัตของการส่งสัญญาณของเซลล์ในระหว่างการพัฒนา การสร้างใหม่ หรือภาวะสมดุลของลำไส้ นอกจากนี้ โปรโตคอลของเรายังมีประโยชน์สำหรับการตรวจสอบการติดเชื้อภายใต้เชื้อก่อโรคต่างๆ เช่น โนโรไวรัส 8, ไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ที่ก่อให้เกิดโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS-CoV-2), คลอสทริเดียม ดิฟฟิซิล, ซัลโมเนลลา ไทฟิมูเรียม 9 หรือวิบริโอ โคเลอเร กลุ่มเป้าหมายของการศึกษาพยาธิวิทยาและการเกิดโรคก็มีประโยชน์เช่นกัน การใช้ระบบจุลสรีรวิทยาของลำไส้บนชิปอาจช่วยให้สามารถเพาะเลี้ยงร่วมกันในระยะยาว 10 และประเมินการป้องกันของโฮสต์ การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน และการซ่อมแซมความเสียหายที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรคในระบบทางเดินอาหาร (GI) ในภายหลัง 11 ความผิดปกติของระบบทางเดินอาหารอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับกลุ่มอาการลำไส้รั่ว โรคเซลิแอค โรคโครห์น โรคลำไส้ใหญ่อักเสบ โรคถุงลำไส้อักเสบ หรือกลุ่มอาการลำไส้แปรปรวน สามารถจำลองได้เมื่อเตรียมชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ 3 มิติโดยใช้ชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ 3 มิติของผู้ป่วย โรคเหล่านี้รวมถึงภาวะฝ่อของวิลลัส การหดตัวของคริปต์ ความเสียหายของเยื่อเมือก หรือการทำงานของเยื่อบุผิวบกพร่อง การตรวจชิ้นเนื้อหรือออร์แกนอยด์ลำไส้ที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิด 12,13 เพื่อจำลองความซับซ้อนที่สูงขึ้นของสภาพแวดล้อมของโรคได้ดียิ่งขึ้น ผู้อ่านอาจพิจารณาเพิ่มเซลล์ชนิดที่เกี่ยวข้องกับโรค เช่น เซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดโมโนนิวเคลียร์จากเลือดส่วนปลายของผู้ป่วย (PBMCs) ลงในแบบจำลองที่มี 3 มิติ โครงสร้างจุลภาคของวิลลัสและคริปต์ในลำไส้ เซลล์ภูมิคุ้มกันเฉพาะเนื้อเยื่อ 5.
เนื่องจากโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติสามารถตรึงและมองเห็นได้โดยไม่ต้องผ่านกระบวนการตัดแบ่ง ผู้ชมที่ทำงานด้านทรานสคริปโตมิกส์เชิงพื้นที่และการถ่ายภาพความละเอียดสูงหรือความละเอียดสูงพิเศษอาจสนใจการทำแผนที่พลวัตเชิงพื้นที่และเวลาของยีนและโปรตีนในช่องว่างของเยื่อบุผิวของเรา นอกจากนี้ การสื่อสารข้ามระหว่างโฮสต์และไมโครไบโอมในระยะยาว 10, 14 ที่ประสานการรักษาสมดุลของลำไส้สามารถสร้างขึ้นได้ในชั้นเยื่อเมือกลำไส้แบบ 3 มิติโดยการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์หลายชนิด ชุมชนจุลินทรีย์ หรือจุลินทรีย์ในอุจจาระร่วมกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในลำไส้จำลองบนชิป ในแพลตฟอร์มนี้ แนวทางนี้ดึงดูดกลุ่มเป้าหมายที่ศึกษาด้านภูมิคุ้มกันวิทยาของเยื่อบุทางเดินอาหาร จุลชีววิทยาในมนุษย์ คัลตูโรมิกส์ และจุลชีววิทยาทางคลินิกเป็นพิเศษ ซึ่งต้องการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ในลำไส้ที่ไม่เคยเพาะเลี้ยงมาก่อนในห้องปฏิบัติการ หากโปรโตคอลการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองของเราสามารถปรับให้เข้ากับรูปแบบการเพาะเลี้ยงที่ขยายขนาดได้ เช่น แผ่นเพาะเลี้ยงแบบหลายหลุมในจานเพาะเลี้ยง 24, 96 หรือ 384 หลุม ที่เติมเต็มช่องฐานด้านข้างอย่างต่อเนื่อง โปรโตคอลนี้ก็สามารถเผยแพร่ไปยังผู้ที่กำลังพัฒนาแพลตฟอร์มด้านเภสัชกรรม ชีวการแพทย์ หรือการคัดกรองหรือการตรวจสอบความถูกต้องที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับอุตสาหกรรมอาหารได้เช่นกัน ในฐานะที่เป็นหลักฐานเชิงหลักการ เราได้แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของระบบการสร้างรูปร่างแบบมัลติเพล็กซ์ที่มีประสิทธิภาพสูงซึ่งสามารถขยายขนาดได้ในรูปแบบจานเพาะเลี้ยง 24 หลุม นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์ออร์แกนบนชิปหลายรายการได้ถูกนำไปจำหน่ายในเชิงพาณิชย์แล้ว16,17,18 ดังนั้น การตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองของเราจึงสามารถเร่งและอาจนำไปใช้โดยห้องปฏิบัติการวิจัย อุตสาหกรรม หรือรัฐบาลและหน่วยงานกำกับดูแลหลายแห่ง หน่วยงานต่างๆ ใช้เพื่อทำความเข้าใจการปรับเปลี่ยนโปรแกรมระดับเซลล์ของการสร้างรูปร่างลำไส้ในหลอดทดลองในระดับทรานสคริปโตมิก เพื่อทดสอบยาหรือชีวบำบัด การดูดซึมและการขนส่งของยาที่กำลังทดสอบได้รับการประเมินโดยใช้แบบจำลองลำไส้ 3 มิติ หรือใช้แบบจำลองอวัยวะบนชิปแบบกำหนดเองหรือเชิงพาณิชย์ เพื่อประเมินความสามารถในการทำซ้ำของกระบวนการสร้างรูปร่างลำไส้
มีการใช้แบบจำลองการทดลองที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์จำนวนจำกัดในการศึกษาการสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวลำไส้ ส่วนใหญ่เป็นเพราะขาดโปรโตคอลที่สามารถนำไปใช้ได้จริงเพื่อกระตุ้นการสร้างรูปร่างแบบ 3 มิติในหลอดทดลอง อันที่จริง ความรู้ในปัจจุบันเกี่ยวกับการสร้างรูปร่างของลำไส้ส่วนใหญ่มาจากการศึกษาในสัตว์ (เช่น ปลาซีบราฟิช20 หนู21 หรือไก่22) อย่างไรก็ตาม แบบจำลองเหล่านี้ต้องใช้แรงงานและค่าใช้จ่ายสูง อาจมีข้อสงสัยทางจริยธรรม และที่สำคัญที่สุดคือ ไม่สามารถระบุถึงกระบวนการพัฒนาของมนุษย์ได้อย่างแม่นยำ แบบจำลองเหล่านี้ยังมีข้อจำกัดมากในการทดสอบในลักษณะที่ปรับขนาดได้หลายวิธี ดังนั้น โปรโตคอลของเราสำหรับการสร้างโครงสร้างเนื้อเยื่อ 3 มิติในหลอดทดลองจึงมีประสิทธิภาพเหนือกว่าแบบจำลองสัตว์ในร่างกาย รวมถึงแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 2 มิติแบบดั้งเดิมอื่นๆ ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การใช้โครงสร้างเยื่อบุผิว 3 มิติทำให้เราสามารถตรวจสอบตำแหน่งเชิงพื้นที่ของเซลล์ที่แตกต่างกันในแกนคริปต์-วิลลัสเพื่อตอบสนองต่อสิ่งกระตุ้นจากเยื่อเมือกหรือภูมิคุ้มกันต่างๆ ชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติสามารถ การสร้างโครงสร้างสามมิติของเยื่อบุผิวในหลอดทดลองช่วยให้สามารถศึกษาได้ว่าเซลล์จุลินทรีย์แข่งขันกันอย่างไรในการสร้างแหล่งที่อยู่อาศัยเฉพาะที่ และวิวัฒนาการทางนิเวศวิทยาเพื่อตอบสนองต่อปัจจัยของโฮสต์ (เช่น ชั้นเมือกด้านในและด้านนอก การหลั่ง IgA และเปปไทด์ต้านจุลินทรีย์) นอกจากนี้ สัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิวสามมิติยังช่วยให้เราเข้าใจว่าจุลินทรีย์ในลำไส้สร้างชุมชนของมันอย่างไร และร่วมกันผลิตสารเมตาบอไลต์ของจุลินทรีย์ (เช่น กรดไขมันสายสั้น) ที่กำหนดรูปร่างการจัดระเบียบของเซลล์และแหล่งที่อยู่อาศัยของเซลล์ต้นกำเนิดในโพรงฐาน คุณสมบัติเหล่านี้สามารถแสดงให้เห็นได้ก็ต่อเมื่อมีการสร้างชั้นเยื่อบุผิวสามมิติในหลอดทดลองเท่านั้น
นอกเหนือจากวิธีการสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิวลำไส้แบบ 3 มิติของเราแล้ว ยังมีวิธีการในหลอดทดลองอีกหลายวิธี การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ลำไส้เป็นเทคนิควิศวกรรมเนื้อเยื่อที่ทันสมัยซึ่งอาศัยการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดลำไส้ภายใต้สภาวะมอร์โฟเจนที่เฉพาะเจาะจง23,24,25 อย่างไรก็ตาม การใช้แบบจำลองออร์แกนอยด์ 3 มิติสำหรับการวิเคราะห์การขนส่งหรือการเพาะเลี้ยงร่วมกันระหว่างโฮสต์และไมโครไบโอมมักเป็นเรื่องท้าทาย เนื่องจากช่องว่างภายในลำไส้ถูกปิดล้อมอยู่ภายในออร์แกนอยด์ ดังนั้นการนำส่วนประกอบภายในช่องว่าง เช่น เซลล์จุลินทรีย์หรือแอนติเจนภายนอกจึงมีข้อจำกัด การเข้าถึงช่องว่างภายในออร์แกนอยด์สามารถปรับปรุงได้โดยใช้ไมโครอินเจคเตอร์26,27 แต่วิธีนี้เป็นการรุกรานและต้องใช้แรงงานมาก และต้องมีความรู้เฉพาะทางในการดำเนินการ นอกจากนี้ การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์แบบดั้งเดิมที่รักษาไว้ในโครงสร้างไฮโดรเจลภายใต้สภาวะคงที่ไม่ได้สะท้อนถึงกลไกทางชีวภาพในร่างกายอย่างแม่นยำ
แนวทางอื่นๆ ที่กลุ่มวิจัยหลายกลุ่มใช้คือการใช้โครงสร้างไฮโดรเจล 3 มิติที่เตรียมไว้ล่วงหน้าเพื่อเลียนแบบโครงสร้างเยื่อบุผิวลำไส้ โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ลำไส้ของมนุษย์ที่แยกออกมาบนพื้นผิวเจล การสร้างโครงสร้างไฮโดรเจลทำได้โดยใช้แม่พิมพ์ที่พิมพ์ด้วยเครื่องพิมพ์ 3 มิติ แม่พิมพ์ที่กัดด้วยเครื่องจักรขนาดเล็ก หรือแม่พิมพ์ที่สร้างขึ้นด้วยวิธีลิโทกราฟี วิธีนี้แสดงให้เห็นถึงการจัดเรียงตัวแบบจัดระเบียบตัวเองของเซลล์เยื่อบุผิวที่แยกออกมาในหลอดทดลองด้วยการไล่ระดับของมอร์โฟเจนที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา ทำให้เกิดโครงสร้างเยื่อบุผิวที่มีอัตราส่วนความยาวต่อความกว้างสูง และการสื่อสารระหว่างสโตรมาและเยื่อบุผิวโดยการรวมเซลล์สโตรมาไว้ในโครงสร้าง อย่างไรก็ตาม ลักษณะของโครงสร้างที่เตรียมไว้ล่วงหน้าอาจขัดขวางการแสดงกระบวนการสร้างรูปร่างที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ แบบจำลองเหล่านี้ยังไม่ให้การไหลของของเหลวในช่องว่างหรือช่องว่างระหว่างเซลล์แบบไดนามิก ขาดแรงเฉือนของของเหลวที่เซลล์ลำไส้ต้องการเพื่อการสร้างรูปร่างและได้รับหน้าที่ทางสรีรวิทยา งานวิจัยล่าสุดอีกชิ้นหนึ่งใช้โครงสร้างไฮโดรเจลในแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกและสร้างลวดลายลำไส้ โครงสร้างเยื่อบุผิวโดยใช้เทคนิคการแกะสลักด้วยเลเซอร์ ออร์แกนอยด์ลำไส้ของหนูจะเคลื่อนที่ตามแบบที่แกะสลักไว้เพื่อสร้างโครงสร้างท่อลำไส้ และสามารถจำลองการไหลของของเหลวภายในลำไส้ได้โดยใช้โมดูลไมโครฟลูอิดิกส์ อย่างไรก็ตาม แบบจำลองนี้ไม่แสดงกระบวนการสร้างรูปร่างตามธรรมชาติและไม่รวมถึงการเคลื่อนไหวทางกลชีวภาพของลำไส้ เทคนิคการพิมพ์ 3 มิติจากกลุ่มเดียวกันสามารถสร้างท่อลำไส้ขนาดเล็กที่มีกระบวนการสร้างรูปร่างตามธรรมชาติได้ แม้ว่าการสร้างส่วนต่างๆ ของลำไส้ภายในท่อจะซับซ้อน แต่แบบจำลองนี้ก็ยังขาดการไหลของของเหลวภายในลำไส้และการเปลี่ยนแปลงรูปร่างทางกล นอกจากนี้ ความสามารถในการใช้งานของแบบจำลองอาจมีข้อจำกัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากกระบวนการพิมพ์ชีวภาพเสร็จสมบูรณ์ ซึ่งอาจรบกวนสภาวะการทดลองหรือปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ ในทางกลับกัน โปรโตคอลที่เราเสนอให้การสร้างรูปร่างของลำไส้ตามธรรมชาติ แรงเฉือนที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา กลศาสตร์ชีวภาพที่เลียนแบบการเคลื่อนไหวของลำไส้ การเข้าถึงช่องส่วนปลายและส่วนฐานที่เป็นอิสระ และการสร้างกระบวนการทางชีวภาพที่ซับซ้อนขึ้นมาใหม่ สภาพแวดล้อมขนาดเล็กของความเป็นโมดูลาร์ ดังนั้น โปรโตคอลการสร้างรูปร่างสามมิติในหลอดทดลองของเรา อาจเป็นแนวทางเสริมเพื่อเอาชนะความท้าทายของวิธีการที่มีอยู่เดิม
โปรโตคอลของเรามุ่งเน้นไปที่การสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติโดยเฉพาะ โดยมีเพียงเซลล์เยื่อบุผิวในวัฒนธรรมเท่านั้น และไม่มีเซลล์ชนิดอื่น ๆ รอบข้าง เช่น เซลล์มีเซนไคม์ เซลล์บุผนังหลอดเลือด และเซลล์ภูมิคุ้มกัน ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ หัวใจสำคัญของโปรโตคอลของเราคือการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวโดยการกำจัดสารยับยั้งการสร้างรูปร่างที่หลั่งออกมาทางด้านฐานของตัวกลางที่นำเข้ามา ในขณะที่ความสามารถในการปรับเปลี่ยนที่แข็งแกร่งของลำไส้จำลองบนชิปและไฮบริดบนชิปของเราช่วยให้เราสามารถสร้างชั้นเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติที่โค้งงอได้ แต่ความซับซ้อนทางชีวภาพเพิ่มเติม เช่น ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเยื่อบุผิวและเซลล์มีเซนไคม์33,34 การสะสมของเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) 35 และในแบบจำลองของเรา คุณลักษณะของคริปต์-วิลลัสที่ส่งผ่านแหล่งที่อยู่ของเซลล์ต้นกำเนิดในคริปต์ฐานยังคงต้องได้รับการพิจารณาเพิ่มเติม เซลล์สโตรมัล (เช่น ไฟโบรบลาสต์) ในมีเซนไคม์มีบทบาทสำคัญในการผลิตโปรตีน ECM และการควบคุมการสร้างรูปร่างของลำไส้ vivo35,37,38 การเพิ่มเซลล์เมเซนไคม์ลงในแบบจำลองของเราช่วยเพิ่มกระบวนการสร้างรูปร่างและประสิทธิภาพการยึดเกาะของเซลล์ ชั้นเอนโดธีเลียม (เช่น เส้นเลือดฝอยหรือหลอดน้ำเหลือง) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการขนส่งโมเลกุล39 และการดึงดูดเซลล์ภูมิคุ้มกัน40 ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของลำไส้ นอกจากนี้ ส่วนประกอบของหลอดเลือดที่สามารถเชื่อมต่อระหว่างแบบจำลองเนื้อเยื่อเป็นสิ่งจำเป็นเมื่อออกแบบแบบจำลองเนื้อเยื่อเพื่อแสดงปฏิสัมพันธ์ระหว่างอวัยวะหลายส่วน ดังนั้น อาจจำเป็นต้องรวมเซลล์เอนโดธีเลียมเพื่อสร้างแบบจำลองคุณลักษณะทางสรีรวิทยาที่แม่นยำยิ่งขึ้นด้วยความละเอียดระดับอวัยวะ เซลล์ภูมิคุ้มกันที่ได้จากผู้ป่วยยังมีความสำคัญต่อการแสดงการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด การนำเสนอแอนติเจน การสื่อสารระหว่างภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและภูมิคุ้มกันปรับตัว และภูมิคุ้มกันเฉพาะเนื้อเยื่อในบริบทของการจำลองโรคในลำไส้
การใช้ชิปไฮบริดนั้นตรงไปตรงมามากกว่าการจำลองลำไส้บนชิป เนื่องจากโครงสร้างอุปกรณ์ง่ายกว่า และการใช้แผ่น Transwell ช่วยให้สามารถเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุลำไส้ได้ในปริมาณมาก อย่างไรก็ตาม แผ่น Transwell ที่มีจำหน่ายทั่วไปซึ่งมีเยื่อโพลีเอสเตอร์นั้นไม่ยืดหยุ่นและไม่สามารถจำลองการเคลื่อนไหวแบบบีบตัวของลำไส้ได้ นอกจากนี้ ช่องด้านบนของแผ่น Transwell ที่วางอยู่ในชิปไฮบริดยังคงอยู่กับที่โดยไม่มีแรงเฉือนที่ด้านบน เห็นได้ชัดว่า คุณสมบัติคงที่ในช่องด้านบนนั้นแทบจะไม่เอื้อต่อการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียร่วมกันในระยะยาวในชิปไฮบริด แม้ว่าเราจะสามารถกระตุ้นการสร้างรูปร่างสามมิติในแผ่น Transwell ได้อย่างมีประสิทธิภาพเมื่อใช้ชิปไฮบริด แต่การขาดแคลนกลไกทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาและการไหลของของเหลวที่ด้านบนอาจจำกัดความเป็นไปได้ของแพลตฟอร์มชิปไฮบริดสำหรับการใช้งานในอนาคต
การสร้างแบบจำลองขนาดเต็มของแกนคริปต์-วิลลัสของมนุษย์ในระบบเพาะเลี้ยงลำไส้บนชิปและระบบเพาะเลี้ยงไฮบริดบนชิปยังไม่ได้รับการพัฒนาอย่างสมบูรณ์ เนื่องจากกระบวนการสร้างรูปร่างเริ่มต้นจากชั้นเยื่อบุผิวชั้นเดียว สถาปัตยกรรมจุลภาค 3 มิติจึงไม่จำเป็นต้องมีความคล้ายคลึงทางสัณฐานวิทยากับคริปต์ในร่างกาย แม้ว่าเราจะระบุลักษณะของประชากรเซลล์ที่เพิ่มจำนวนใกล้กับโดเมนคริปต์ฐานในเยื่อบุผิว 3 มิติที่สร้างขึ้นด้วยวิศวกรรมจุลภาค แต่บริเวณคริปต์และวิลลัสก็ยังไม่ถูกกำหนดขอบเขตอย่างชัดเจน แม้ว่าช่องด้านบนที่สูงขึ้นบนชิปจะนำไปสู่ความสูงของเยื่อบุผิวที่สร้างขึ้นด้วยวิศวกรรมจุลภาคที่เพิ่มขึ้น แต่ความสูงสูงสุดก็ยังจำกัดอยู่ที่ประมาณ 300–400 ไมโครเมตร ความลึกที่แท้จริงของคริปต์ลำไส้ของมนุษย์ในลำไส้เล็กและลำไส้ใหญ่คือประมาณ 135 ไมโครเมตรและ 400 ไมโครเมตร ตามลำดับ และความสูงของวิลลัสในลำไส้เล็กคือประมาณ 600 ไมโครเมตร41
จากมุมมองด้านการถ่ายภาพ การถ่ายภาพความละเอียดสูงแบบ in situ ของโครงสร้างจุลภาค 3 มิติ อาจมีข้อจำกัดอยู่ที่ลำไส้บนชิป เนื่องจากระยะการทำงานที่ต้องการจากเลนส์วัตถุไปยังชั้นเยื่อบุผิวอยู่ในระดับไม่กี่มิลลิเมตร เพื่อแก้ไขปัญหานี้ อาจจำเป็นต้องใช้เลนส์วัตถุที่อยู่ห่างออกไป นอกจากนี้ การเตรียมชิ้นส่วนบางๆ สำหรับการถ่ายภาพตัวอย่างทำได้ยากเนื่องจากความยืดหยุ่นสูงของ PDMS ยิ่งไปกว่านั้น เนื่องจากกระบวนการสร้างลำไส้บนชิปแบบทีละชั้นเกี่ยวข้องกับการยึดติดถาวรระหว่างแต่ละชั้น จึงเป็นเรื่องยากอย่างยิ่งที่จะเปิดหรือนำชั้นบนออกเพื่อตรวจสอบโครงสร้างพื้นผิวของชั้นเยื่อบุผิว ตัวอย่างเช่น โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM)
ความไม่ชอบน้ำของ PDMS เป็นปัจจัยจำกัดในการศึกษาเกี่ยวกับโมเลกุลขนาดเล็กที่ไม่ชอบน้ำโดยใช้ไมโครฟลูอิดิก เนื่องจาก PDMS สามารถดูดซับโมเลกุลที่ไม่ชอบน้ำดังกล่าวได้โดยไม่จำเพาะเจาะจง อาจพิจารณาใช้วัสดุพอลิเมอร์อื่นแทน PDMS หรืออาจพิจารณาปรับเปลี่ยนพื้นผิวของ PDMS (เช่น การเคลือบด้วยวัสดุที่ชอบไขมัน 42 หรือโพลี(เอทิลีนไกลคอล) 43) เพื่อลดการดูดซับโมเลกุลที่ไม่ชอบน้ำ
สุดท้ายนี้ วิธีการของเรายังไม่ได้รับการอธิบายอย่างชัดเจนในแง่ของการให้การคัดกรองที่มีประสิทธิภาพสูงหรือแพลตฟอร์มการทดลองที่เป็นมิตรต่อผู้ใช้แบบ "เหมาะสำหรับทุกกรณี" โปรโตคอลปัจจุบันต้องใช้ปั๊มฉีดสารต่อไมโครดีไวซ์ ซึ่งกินพื้นที่ในตู้อบ CO2 และขัดขวางการทดลองขนาดใหญ่ ข้อจำกัดนี้สามารถปรับปรุงได้อย่างมากโดยการขยายขนาดของรูปแบบการเพาะเลี้ยงที่เป็นนวัตกรรมใหม่ (เช่น แผ่นแทรกพรุน 24 หลุม 96 หลุม หรือ 384 หลุม ที่ช่วยให้สามารถเติมและกำจัดสื่อเพาะเลี้ยงด้านฐานได้อย่างต่อเนื่อง)
เพื่อกระตุ้นการสร้างรูปร่างสามมิติของเยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ในหลอดทดลอง เราใช้ชิปไมโครฟลูอิดิกรูปทรงลำไส้ที่มีไมโครแชนเนลคู่ขนานสองช่องและเยื่อพรุนยืดหยุ่นอยู่ตรงกลางเพื่อสร้างส่วนต่อประสานระหว่างลูเมนและเส้นเลือดฝอย นอกจากนี้ เรายังสาธิตการใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกแบบช่องเดียว (ชิปไฮบริด) ที่ให้การไหลด้านข้างอย่างต่อเนื่องใต้ชั้นเยื่อบุผิวที่มีขั้วซึ่งปลูกบนแผ่น Transwell ในทั้งสองแพลตฟอร์ม การสร้างรูปร่างของเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ต่างๆ สามารถสาธิตได้โดยการใช้การควบคุมทิศทางการไหลเพื่อกำจัดสารต้านการสร้างรูปร่างออกจากช่องด้านข้าง ขั้นตอนการทดลองทั้งหมด (รูปที่ 1) ประกอบด้วยห้าส่วน: (i) การสร้างชิปลำไส้หรือชิปไฮบริดที่ใส่ใน Transwell ได้ (ขั้นตอนที่ 1-5; กล่องที่ 1), (ii) การเตรียมเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ (เซลล์ Caco-2) หรือออร์แกนอยด์ลำไส้ของมนุษย์ (iii) การเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุลำไส้บนชิปลำไส้หรือชิปไฮบริด (ขั้นตอนที่ 6-9) (iv) การเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่างสามมิติในหลอดทดลอง (ขั้นตอนที่ 10) และ (v) เพื่อศึกษาลักษณะโครงสร้างจุลภาคของเยื่อบุผิวสามมิติ (ขั้นตอนที่ 11-24) สุดท้ายนี้ ได้มีการออกแบบกลุ่มควบคุมที่เหมาะสม (ซึ่งจะกล่าวถึงต่อไป) เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของการสร้างรูปร่างในหลอดทดลอง โดยเปรียบเทียบการสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวกับกลุ่มควบคุมเชิงพื้นที่ เวลา เงื่อนไข หรือขั้นตอน
เราใช้แพลตฟอร์มการเพาะเลี้ยงสองแบบที่แตกต่างกัน ได้แก่ ลำไส้บนชิปที่มีช่องทางตรงหรือช่องทางคดเคี้ยวแบบไม่เป็นเส้นตรง หรือชิปไฮบริดที่มีแผ่น Transwell (TW) ในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก ซึ่งผลิตขึ้นตามที่อธิบายไว้ในกล่องที่ 1 และขั้นตอนที่ 1-5 “การผลิตอุปกรณ์” แสดงขั้นตอนหลักในการสร้างชิปเดี่ยวหรือชิปไฮบริด “การเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์” อธิบายแหล่งที่มาของเซลล์ (Caco-2 หรือออร์แกนอยด์ลำไส้ของมนุษย์) และขั้นตอนการเพาะเลี้ยงที่ใช้ในโปรโตคอลนี้ “การสร้างรูปร่างในหลอดทดลอง” แสดงขั้นตอนโดยรวมที่เซลล์เยื่อบุผิว Caco-2 หรือเซลล์เยื่อบุผิวที่ได้จากออร์แกนอยด์ถูกเพาะเลี้ยงบนชิปลำไส้หรือบนแผ่น Transwell ของชิปไฮบริด ตามด้วยการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่าง 3 มิติและการสร้างโครงสร้างเยื่อบุผิวที่มีลักษณะเฉพาะ หมายเลขขั้นตอนของโปรแกรมหรือหมายเลขกล่องจะแสดงอยู่ด้านล่างลูกศรแต่ละอัน แอปพลิเคชันนี้ให้ตัวอย่างวิธีการใช้ชั้นเยื่อบุผิวลำไส้ที่สร้างขึ้นแล้ว เช่น ในการกำหนดลักษณะการแตกต่างของเซลล์ สรีรวิทยาของลำไส้ การศึกษา การสร้างระบบนิเวศของโฮสต์-ไมโครไบโอม และการสร้างแบบจำลองโรค ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ในหัวข้อ “การจำแนกเซลล์” แสดงนิวเคลียส F-actin และ MUC2 ที่แสดงออกในชั้นเยื่อบุผิว Caco-2 แบบ 3 มิติที่สร้างขึ้นบนชิปลำไส้ การส่งสัญญาณ MUC2 มีอยู่ในเซลล์โกเบล็ตและเมือกที่หลั่งออกมาจากพื้นผิวเยื่อเมือก ภาพฟลูออเรสเซนต์ในหัวข้อ สรีรวิทยาของลำไส้ แสดงเมือกที่ผลิตโดยการย้อมสีกรดไซอะลิกและสารตกค้าง N-acetylglucosamine โดยใช้ฟลูออเรสเซนต์วีทเจิร์มอะกกลูตินิน ภาพที่ซ้อนทับกันสองภาพในหัวข้อ “การเพาะเลี้ยงร่วมของโฮสต์-จุลินทรีย์” แสดงการเพาะเลี้ยงร่วมของโฮสต์-ไมโครไบโอมในลำไส้บนชิป แผงด้านซ้ายแสดงการเพาะเลี้ยงร่วมของ E. coli ที่แสดงโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) กับเซลล์เยื่อบุผิว Caco-2 แบบ 3 มิติที่สร้างขึ้นด้วยวิศวกรรมไมโคร แผงด้านขวาแสดงตำแหน่งของ GFP E. coli ที่เพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์เยื่อบุผิว Caco-2 แบบ 3 มิติ ตามด้วย โดยการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ด้วย F-actin (สีแดง) และนิวเคลียส (สีน้ำเงิน) การจำลองโรคแสดงให้เห็นถึงลำไส้ที่แข็งแรงเทียบกับลำไส้รั่วในชิปการอักเสบของลำไส้ภายใต้ความท้าทายทางสรีรวิทยาด้วยแอนติเจนของแบคทีเรีย (เช่น ไลโปโพลีแซคคาไรด์, LPS) และเซลล์ภูมิคุ้มกัน (เช่น PBMC; สีเขียว) เซลล์ Caco-2 ถูกเพาะเลี้ยงเพื่อสร้างชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ แถบมาตราส่วน 50 µm ภาพในแถวล่าง: “การจำแนกเซลล์” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 2. Oxford University Press; ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 5. NAS; “การเพาะเลี้ยงร่วมระหว่างโฮสต์และจุลินทรีย์” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 3. NAS; “การจำลองโรค” ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 5. NAS
ทั้งชิปจำลองลำไส้และชิปไฮบริดถูกสร้างขึ้นโดยใช้แบบจำลอง PDMS ที่ถอดออกจากแม่พิมพ์ซิลิคอนโดยใช้การพิมพ์หินแบบอ่อน1,44 และสร้างลวดลายด้วย SU-8 การออกแบบไมโครแชนเนลในแต่ละชิปถูกกำหนดโดยพิจารณาจากอุทกพลศาสตร์ เช่น แรงเฉือนและความดันอุทกพลศาสตร์1,4,12 การออกแบบชิปจำลองลำไส้แบบดั้งเดิม (รูปภาพข้อมูลเพิ่มเติม 1a) ซึ่งประกอบด้วยไมโครแชนเนลตรงขนานสองอันที่วางติดกัน ได้พัฒนาไปเป็นชิปจำลองลำไส้ที่ซับซ้อน (รูปภาพข้อมูลเพิ่มเติม 1b) ซึ่งรวมถึงไมโครแชนเนลโค้งคู่หนึ่งเพื่อกระตุ้นให้เกิดเวลาการคงอยู่ของของเหลวที่เพิ่มขึ้น รูปแบบการไหลที่ไม่เป็นเชิงเส้น และการเสียรูปหลายแกนของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง (รูปที่ 2a–f) 12 เมื่อต้องการสร้างกลไกทางชีวภาพของลำไส้ที่ซับซ้อนมากขึ้น สามารถเลือกใช้ชิปจำลองลำไส้ที่ซับซ้อนได้ เราได้แสดงให้เห็นว่าชิปจำลองลำไส้แบบคดเคี้ยวยังกระตุ้นการสร้างรูปร่าง 3 มิติอย่างมากในกรอบเวลาที่คล้ายคลึงกันด้วย ระดับการเจริญเติบโตของเยื่อบุผิวที่คล้ายคลึงกันเมื่อเทียบกับ Gut-Chip ดั้งเดิม โดยไม่คำนึงถึงชนิดของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง ดังนั้น เพื่อกระตุ้นการสร้างรูปร่างสามมิติ การออกแบบลำไส้บนชิปแบบเส้นตรงและแบบซับซ้อนจึงสามารถใช้แทนกันได้ แบบจำลอง PDMS ที่แข็งตัวบนแม่พิมพ์ซิลิโคนที่มีลวดลาย SU-8 ให้คุณลักษณะเชิงลบหลังจากถอดออกจากแม่พิมพ์ (รูปที่ 2a) ในการสร้างลำไส้บนชิป ชั้น PDMS ด้านบนที่เตรียมไว้จะถูกเชื่อมติดกับฟิล์ม PDMS ที่มีรูพรุนตามลำดับ จากนั้นจัดเรียงให้ตรงกับชั้น PDMS ด้านล่างโดยการเชื่อมติดแบบถาวรโดยใช้เครื่องบำบัดโคโรนา (รูปที่ 2b–f) ในการสร้างชิปไฮบริด แบบจำลอง PDMS ที่แข็งตัวแล้วจะถูกเชื่อมติดกับแผ่นกระจกเพื่อสร้างอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกแบบช่องเดียวที่สามารถรองรับแผ่นแทรก Transwell ได้ (รูปที่ 2h และรูปข้อมูลเพิ่มเติม 2) กระบวนการเชื่อมติดทำได้โดยการบำบัดพื้นผิวของแบบจำลอง PDMS และกระจกด้วยพลาสมาออกซิเจนหรือการบำบัดโคโรนา หลังจากฆ่าเชื้ออุปกรณ์ไมโครที่ผลิตขึ้นซึ่งติดอยู่กับท่อซิลิโคนแล้ว อุปกรณ์นั้น อุปกรณ์พร้อมสำหรับการสร้างรูปร่างสามมิติของเยื่อบุผิวลำไส้ (รูปที่ 2g)
a, ภาพประกอบแผนผังแสดงขั้นตอนการเตรียมชิ้นส่วน PDMS จากแม่พิมพ์ซิลิโคน SU-8 เทสารละลาย PDMS ที่ยังไม่แข็งตัวลงบนแม่พิมพ์ซิลิโคน (ซ้าย) อบให้แข็งตัวที่อุณหภูมิ 60 °C (กลาง) และถอดออกจากแม่พิมพ์ (ขวา) ชิ้นส่วน PDMS ที่ถอดออกจากแม่พิมพ์แล้วจะถูกตัดเป็นชิ้นๆ และทำความสะอาดเพื่อนำไปใช้ต่อ b, ภาพถ่ายแม่พิมพ์ซิลิโคนที่ใช้ในการเตรียมชั้นบนของ PDMS c, ภาพถ่ายแม่พิมพ์ซิลิโคนที่ใช้ในการผลิตเยื่อพรุน PDMS d, ชุดภาพถ่ายของส่วนประกอบ PDMS ด้านบนและด้านล่าง และอุปกรณ์ลำไส้จำลองบนชิปที่ประกอบเสร็จแล้ว e, แผนผังแสดงการจัดเรียงของส่วนประกอบ PDMS ด้านบน เยื่อ และด้านล่าง แต่ละชั้นจะยึดติดกันอย่างถาวรด้วยการบำบัดด้วยพลาสมาหรือโคโรนา f, แผนผังของอุปกรณ์ลำไส้จำลองบนชิปที่สร้างขึ้น โดยมีไมโครแชนเนลและห้องสุญญากาศซ้อนกัน g, การจัดวางอุปกรณ์ลำไส้จำลองบนชิปสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบไมโครฟลูอิดิก อุปกรณ์ลำไส้จำลองบนชิปที่สร้างขึ้นประกอบเข้ากับท่อซิลิโคนและ วางกระบอกฉีดยาลงบนแผ่นกระจกปิด วางอุปกรณ์ชิปไว้บนฝาจานเพาะเชื้อขนาด 150 มม. เพื่อทำการประมวลผล ใช้สารยึดเกาะเพื่อปิดท่อซิลิโคน ภาพถ่ายแสดงขั้นตอนการสร้างชิปไฮบริดและการสร้างรูปร่างสามมิติโดยใช้ชิปไฮบริด ใส่แผ่น Transwell ที่เตรียมไว้แยกกันเพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้แบบ 2 มิติลงในชิปไฮบริดเพื่อกระตุ้นการสร้างรูปร่างสามมิติของลำไส้ สารละลายถูกส่งผ่านไมโครแชนเนลใต้ชั้นเซลล์ที่สร้างขึ้นบนแผ่น Transwell แถบมาตราส่วน 1 ซม. พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 4. Elsevier
ในโปรโตคอลนี้ เซลล์สายพันธุ์ Caco-2 และออร์แกนอยด์ลำไส้ถูกใช้เป็นแหล่งของเยื่อบุผิว (รูปที่ 3a) เซลล์ทั้งสองชนิดถูกเพาะเลี้ยงแยกกัน (กล่องที่ 2 และกล่องที่ 5) และใช้ในการเพาะเลี้ยงในไมโครแชนเนลที่เคลือบด้วย ECM ของลำไส้จำลองบนชิปหรือแผ่น Transwell เมื่อเซลล์เจริญเติบโตเต็มที่ (>95% ของพื้นที่ในขวดเพาะเลี้ยง) เซลล์ Caco-2 ที่เพาะเลี้ยงตามปกติ (ระหว่างรอบการเพาะเลี้ยงที่ 10 ถึง 50) ในขวด T จะถูกเก็บเกี่ยวเพื่อเตรียมสารละลายเซลล์ที่แยกออกจากกันโดยใช้ของเหลวทริปซินไนเซชัน (กล่องที่ 2) ออร์แกนอยด์ลำไส้ของมนุษย์จากชิ้นเนื้อลำไส้หรือการผ่าตัดถูกเพาะเลี้ยงในโดมโครงสร้าง Matrigel ในจานเพาะเลี้ยง 24 หลุม เพื่อรองรับสภาพแวดล้อมจุลภาคของโครงสร้าง สารอาหารที่มีมอร์โฟเจนที่จำเป็น (เช่น Wnt, R-spondin และ Noggin) และปัจจัยการเจริญเติบโตที่เตรียมไว้ตามที่อธิบายไว้ในกล่องที่ 3 จะถูกเติมทุกๆ สองวันจนกว่าออร์แกนอยด์จะเจริญเติบโตถึงประมาณ 500 เซลล์ ออร์แกนอยด์มีเส้นผ่านศูนย์กลาง µm เมื่อเจริญเติบโตเต็มที่แล้ว จะเก็บเกี่ยวและแยกเซลล์เดี่ยวๆ เพื่อนำไปเพาะเลี้ยงบนลำไส้หรือแผ่น Transwell บนชิป (กล่อง 5) ดังที่เราได้รายงานไว้ก่อนหน้านี้ สามารถจำแนกได้ตามประเภทของโรค12,13 (เช่น โรคแผลในลำไส้ใหญ่ โรคโครห์น มะเร็งลำไส้ใหญ่ หรือผู้บริจาคปกติ) ตำแหน่งของรอยโรค (เช่น บริเวณที่เป็นรอยโรคเทียบกับบริเวณที่ไม่เป็นรอยโรค) และตำแหน่งในระบบทางเดินอาหาร (เช่น ลำไส้เล็กส่วนต้น ลำไส้เล็กส่วนกลาง ลำไส้เล็กส่วนปลาย ลำไส้ใหญ่ส่วนต้น ลำไส้ใหญ่ หรือไส้ตรง) เราได้จัดเตรียมโปรโตคอลที่เหมาะสมที่สุดในกล่อง 5 สำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ลำไส้ใหญ่ (โคลอยด์) ซึ่งโดยทั่วไปแล้วต้องการความเข้มข้นของมอร์โฟเจนที่สูงกว่าออร์แกนอยด์ลำไส้เล็ก
ก. ขั้นตอนการทำงานสำหรับการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่างของลำไส้ในชิปจำลองลำไส้ ในโปรโตคอลนี้ใช้เซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ของมนุษย์ Caco-2 และออร์แกนอยด์ลำไส้เพื่อสาธิตการสร้างรูปร่างแบบ 3 มิติ เซลล์เยื่อบุผิวที่แยกได้ถูกเพาะเลี้ยงในอุปกรณ์จำลองลำไส้บนชิปที่เตรียมไว้ (การเตรียมชิป) เมื่อเซลล์ถูกเพาะเลี้ยง (seeded) และยึดติด (attached) กับเยื่อพรุน PDMS ในวันที่ 0 (D0) การไหลในทิศทางยอด (AP) จะเริ่มต้นและคงไว้เป็นเวลา 2 วันแรก (flow, AP, D0-D2) การไหลในทิศทางฐาน (BL) ก็จะเริ่มต้นพร้อมกับการยืดแบบเป็นวงจร (stretch, flow, AP and BL) เมื่อเกิดชั้นโมโนเลเยอร์ 2 มิติที่สมบูรณ์ การสร้างรูปร่างแบบ 3 มิติของลำไส้เกิดขึ้นเองโดยธรรมชาติหลังจากเพาะเลี้ยงในระบบไมโครฟลูอิดิกเป็นเวลา 5 วัน (morphogenesis, D5) ภาพคอนทราสต์เฟสแสดงรูปร่างที่เป็นตัวแทนของเซลล์ Caco-2 ในแต่ละขั้นตอนการทดลองหรือจุดเวลา (กราฟแท่ง) 100 µm) แผนภาพโครงร่างสี่ภาพแสดงลำดับขั้นของการสร้างรูปร่างของลำไส้ (บนขวา) ลูกศรเส้นประในโครงร่างแสดงทิศทางการไหลของของเหลว b, ภาพ SEM แสดงลักษณะพื้นผิวของเยื่อบุผิว 3 มิติ Caco-2 ที่สร้างขึ้น (ซ้าย) ภาพแทรกที่เน้นบริเวณที่ขยาย (กรอบเส้นประสีขาว) แสดงไมโครวิลลีที่สร้างใหม่บนชั้น Caco-2 3 มิติ (ขวา) c, มุมมองด้านหน้าแนวนอนของ Caco-2 3 มิติที่สร้างขึ้น คลอดีน (ZO-1, สีแดง) และเยื่อหุ้มขอบแปรงต่อเนื่องที่ติดฉลาก F-actin (สีเขียว) และนิวเคลียส (สีน้ำเงิน) การมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ของเซลล์เยื่อบุผิวบนชิปลำไส้ ลูกศรที่ชี้ไปที่โครงร่างตรงกลางแสดงตำแหน่งของระนาบโฟกัสสำหรับมุมมองคอนโฟคอลแต่ละมุม d, ลำดับเวลาของการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาในออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงบนชิปที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสในวันที่ 3 7, 9, 11 และ 13 ภาพแทรก (บนขวา) แสดงภาพขยายสูงของภาพที่ให้มา e, ภาพถ่ายจุลทรรศน์ DIC ของเนื้อเยื่อบุผิว 3 มิติของออร์แกนอยด์ที่สร้างขึ้นในลำไส้บนชิ้นเนื้อที่ถ่ายในวันที่ 7 f, ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่ซ้อนทับกันแสดงเครื่องหมายสำหรับเซลล์ต้นกำเนิด (LGR5; สีม่วงแดง), เซลล์โกเบล็ต (MUC2; สีเขียว), F-actin (สีเทา) และนิวเคลียส (สีฟ้า) ที่ปลูกบนชิปลำไส้เป็นเวลา 3 วัน (ซ้าย) และออร์แกนอยด์ 13 วัน (กลาง) บนชั้นเนื้อเยื่อบุผิว ตามลำดับ ดูเพิ่มเติมที่รูปภาพข้อมูลเพิ่มเติม 3 ซึ่งเน้นการส่งสัญญาณ LGR5 โดยไม่มีการส่งสัญญาณ MUC2 ภาพฟลูออเรสเซนซ์แสดงโครงสร้างจุลภาคของเนื้อเยื่อบุผิว (ขวา) ของเนื้อเยื่อบุผิว 3 มิติของออร์แกนอยด์ที่สร้างขึ้นในลำไส้บนชิปโดยการย้อมเยื่อหุ้มพลาสมาด้วยสีย้อม CellMask (ขวา) ในวันที่ 13 ของการเพาะเลี้ยง แถบมาตราส่วนคือ 50 μm เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น b พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจาก อ้างอิง 2. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด; c ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก อ้างอิง 2. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด; e และ f ดัดแปลงโดยได้รับอนุญาตจาก อ้างอิง 12 ภายใต้ใบอนุญาต Creative Commons CC BY 4.0
ในการจำลองลำไส้บนชิป จำเป็นต้องปรับเปลี่ยนพื้นผิวที่ไม่ชอบน้ำของเยื่อพรุน PDMS เพื่อให้การเคลือบ ECM ประสบความสำเร็จ ในโปรโตคอลนี้ เราใช้วิธีการสองวิธีที่แตกต่างกันในการปรับเปลี่ยนคุณสมบัติไม่ชอบน้ำของเยื่อ PDMS สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 การกระตุ้นพื้นผิวด้วยรังสี UV/โอโซนเพียงอย่างเดียวก็เพียงพอที่จะลดคุณสมบัติไม่ชอบน้ำของพื้นผิว PDMS เคลือบ ECM และยึดเซลล์ Caco-2 กับเยื่อ PDMS ได้ อย่างไรก็ตาม การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ในระบบไมโครฟลูอิดิกส์จำเป็นต้องมีการปรับแต่งพื้นผิวด้วยสารเคมีเพื่อให้การสะสมของโปรตีน ECM มีประสิทธิภาพ โดยการใช้โพลีเอทิลีนอิมีน (PEI) และกลูตารัลดีไฮด์กับไมโครแชนเนล PDMS ตามลำดับ หลังจากปรับเปลี่ยนพื้นผิวแล้ว โปรตีน ECM จะถูกสะสมเพื่อปกคลุมพื้นผิว PDMS ที่ได้รับการปรับแต่งแล้ว จากนั้นจึงนำเข้าสู่เนื้อเยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ที่แยกออกมา หลังจากที่เซลล์ยึดติดแล้ว การเพาะเลี้ยงเซลล์ในระบบไมโครฟลูอิดิกส์จะเริ่มต้นโดยการไหลของเฉพาะตัวกลางเข้าไปในไมโครแชนเนลด้านบนจนกว่าเซลล์จะก่อตัวเป็นชั้นเดียวที่สมบูรณ์ ในขณะที่ไมโครแชนเนลด้านล่างจะคงที่ ภายใต้เงื่อนไขดังกล่าว วิธีการปรับพื้นผิวให้เหมาะสมและการเคลือบ ECM นี้ช่วยให้เซลล์เยื่อบุผิวของออร์แกนอยด์สามารถยึดเกาะและเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างรูปร่างสามมิติบนพื้นผิว PDMS ได้
การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ Transwell จำเป็นต้องมีการเคลือบ ECM ก่อนการเพาะเลี้ยงเซลล์เช่นกัน อย่างไรก็ตาม การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ Transwell ไม่จำเป็นต้องมีขั้นตอนการเตรียมการที่ซับซ้อนเพื่อกระตุ้นพื้นผิวของแผ่นกรองที่มีรูพรุน สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 บนแผ่นกรอง Transwell การเคลือบ ECM บนแผ่นกรองที่มีรูพรุนจะช่วยเร่งการยึดเกาะของเซลล์ Caco-2 ที่แยกตัวออกมา (<1 ชั่วโมง) และการสร้างกำแพงรอยต่อแน่น (<1-2 วัน) สำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์บนแผ่นกรอง Transwell ออร์แกนอยด์ที่แยกตัวออกมาจะถูกเพาะลงบนแผ่นกรองที่เคลือบ ECM แล้ว ยึดติดกับพื้นผิวเมมเบรน (<3 ชั่วโมง) และเลี้ยงไว้จนกว่าออร์แกนอยด์จะสร้างชั้นโมโนเลเยอร์ที่สมบูรณ์พร้อมความสมบูรณ์ของกำแพงกั้น การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ Transwell ทำในจานเพาะเลี้ยง 24 หลุมโดยไม่ต้องใช้ชิปไฮบริด
การสร้างรูปร่างสามมิติในหลอดทดลองสามารถเริ่มต้นได้โดยการใช้การไหลของของเหลวไปยังด้านฐาน (basolateral) ของชั้นเยื่อบุผิวที่ก่อตัวขึ้นแล้ว ในลำไส้จำลองบนชิป การสร้างรูปร่างของเยื่อบุผิวเริ่มต้นขึ้นเมื่อมีการส่งสารละลายเลี้ยงเซลล์เข้าไปในไมโครแชนเนลด้านบนและด้านล่าง (รูปที่ 3a) ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การนำการไหลของของเหลวเข้าไปในช่องด้านล่าง (ด้านฐาน) เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการกำจัดสารยับยั้งการสร้างรูปร่างที่หลั่งออกมาอย่างต่อเนื่อง เพื่อให้สารอาหารและซีรั่มเพียงพอแก่เซลล์ที่ยึดติดบนเยื่อพรุนและสร้างแรงเฉือนในช่องว่าง เรามักจะใช้การไหลแบบคู่ในลำไส้จำลองบนชิป ในชิปไฮบริด แผ่น Transwell ที่มีชั้นเยื่อบุผิวชั้นเดียวถูกใส่เข้าไปในชิปไฮบริด จากนั้น สารละลายเลี้ยงเซลล์จะถูกส่งเข้าไปใต้ด้านฐานของแผ่น Transwell ที่มีรูพรุนผ่านทางไมโครแชนเนล การสร้างรูปร่างของลำไส้เกิดขึ้น 3-5 วันหลังจากเริ่มต้นการไหลด้านฐานในทั้งสองแพลตฟอร์มการเพาะเลี้ยง
ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติที่สร้างขึ้นด้วยวิศวกรรมไมโคร สามารถวิเคราะห์ได้โดยการใช้เทคนิคการถ่ายภาพต่างๆ รวมถึงกล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ กล้องจุลทรรศน์แบบดิฟเฟอเรนเชียลอินเตอร์เฟอเรนซ์คอนทราสต์ (DIC) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) หรือกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (ภาพที่ 3 และ 4) การถ่ายภาพแบบเฟสคอนทราสต์หรือ DIC สามารถทำได้ง่ายๆ ตลอดเวลาในระหว่างการเพาะเลี้ยงเพื่อตรวจสอบรูปร่างและการยื่นออกมาของชั้นเยื่อบุผิว 3 มิติ เนื่องจากความโปร่งใสทางแสงของฟิล์ม PDMS และโพลีเอสเตอร์ ทั้งแพลตฟอร์ม gut-on-a-chip และ hybrid chip จึงสามารถให้การถ่ายภาพแบบเรียลไทม์ในสถานที่โดยไม่จำเป็นต้องตัดหรือถอดชิ้นส่วนอุปกรณ์ เมื่อทำการถ่ายภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (ภาพที่ 1, 3c, f และ 4b, c) เซลล์มักจะถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มาลดีไฮด์ (PFA) 4% (wt/vol) ตามด้วย Triton X-100 และอัลบูมินจากซีรั่มวัว (BSA) 2% (wt/vol) ตามลำดับ ขึ้นอยู่กับเซลล์ สามารถใช้สารตรึงชนิดต่างๆ สารเพิ่มการซึมผ่าน และสารปิดกั้นได้ แอนติบอดีหลักที่กำหนดเป้าหมายไปยังเซลล์หรือเครื่องหมายบริเวณที่ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์จะถูกใช้เพื่อเน้นเซลล์ที่ตรึงอยู่กับที่บนชิป ตามด้วยแอนติบอดีรองพร้อมกับสีย้อมที่กำหนดเป้าหมายไปยังนิวเคลียส (เช่น 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) หรือ F-actin (เช่น phalloidin ที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์) การถ่ายภาพสดด้วยฟลูออเรสเซนต์ยังสามารถทำได้ในตำแหน่งเดิมเพื่อตรวจจับการผลิตเมือก (รูปที่ 1 “การจำแนกเซลล์” และ “สรีรวิทยาของลำไส้”) การตั้งรกรากแบบสุ่มของเซลล์จุลินทรีย์ (รูปที่ 1 “การเพาะเลี้ยงร่วมกันระหว่างโฮสต์และจุลินทรีย์”) การดึงดูดเซลล์ภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 1 “การจำลองโรค”) หรือรูปร่างของสัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิว 3 มิติ (รูปที่ 3c,f และ 4b,c) เมื่อปรับเปลี่ยนลำไส้บนชิปเพื่อแยกชั้นบนออก จากชั้นไมโครแชนเนลด้านล่าง ดังที่อธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง ดังแสดงในรูปที่ 2 สามารถมองเห็นสัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติ รวมทั้งไมโครวิลลีบนขอบแปรงส่วนปลายได้ด้วย SEM (รูปที่ 3b) การแสดงออกของเครื่องหมายการแยกแยะสามารถประเมินได้โดยการทำ PCR เชิงปริมาณ5 หรือการจัดลำดับ RNA ของเซลล์เดี่ยว ในกรณีนี้ ชั้น 3 มิติของเซลล์เยื่อบุผิวที่ปลูกในชิปลำไส้หรือชิปไฮบริดจะถูกเก็บเกี่ยวโดยการใช้ทริปซิน แล้วนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางโมเลกุลหรือทางพันธุกรรม
a, ขั้นตอนการทำงานสำหรับการเหนี่ยวนำการสร้างรูปร่างของลำไส้ในชิปไฮบริด โปรโตคอลนี้ใช้เซลล์ Caco-2 และออร์แกนอยด์ของลำไส้เพื่อแสดงให้เห็นถึงการสร้างรูปร่างแบบ 3 มิติในแพลตฟอร์มชิปไฮบริด เซลล์เยื่อบุผิวที่แยกตัวแล้วถูกเพาะลงในแผ่น Transwell ที่เตรียมไว้ (TW prep; ดูรูปด้านล่าง) เมื่อเซลล์ถูกเพาะ (seeded) และยึดติดกับเยื่อโพลีเอสเตอร์ในแผ่น Transwell แล้ว เซลล์ทั้งหมดจะถูกเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (TW culture) หลังจาก 7 วัน แผ่น Transwell เดี่ยวที่มีเซลล์เยื่อบุผิวแบบชั้นเดียว 2 มิติถูกรวมเข้ากับชิปไฮบริดเพื่อสร้างการไหลด้านข้างฐาน (Flow, BL) ซึ่งในที่สุดนำไปสู่การสร้างชั้นเยื่อบุผิวแบบ 3 มิติ (morphogenesis) ภาพถ่ายไมโครสโคปแบบเฟสคอนทราสต์แสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์เยื่อบุผิวอวัยวะมนุษย์ที่ได้จากผู้บริจาคปกติ (สายพันธุ์ C103) ลำไส้ใหญ่ส่วนขึ้นในแต่ละขั้นตอนการทดลองหรือจุดเวลา แผนผังในชั้นบนแสดงให้เห็นถึงการกำหนดค่าการทดลองสำหรับแต่ละขั้นตอน b, ชิปไฮบริด (แผนภาพด้านซ้าย) สามารถนำไปสู่การสร้างรูปร่างสามมิติของเซลล์เยื่อบุผิวออร์แกนอยด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบมองจากด้านบนที่ตำแหน่ง Z ต่างๆ (บน กลาง และล่าง ดูแผนภาพด้านขวาและเส้นประที่สอดคล้องกัน) แสดงให้เห็นลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ชัดเจน F-actin (สีฟ้า) นิวเคลียส (สีเทา) c, ภาพถ่ายไมโครสโคปคอนโฟคอลเรืองแสง (มุมมองสามมิติ) ของเซลล์เยื่อบุผิวที่ได้จากออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงใน Transwell แบบคงที่ (TW; ภาพแทรกภายในกรอบเส้นประสีขาว) เทียบกับชิปไฮบริด (ภาพเต็มขนาดใหญ่ที่สุด) เปรียบเทียบสัณฐานวิทยา 2 มิติกับ 3 มิติ ตามลำดับ ภาพตัดขวางแนวตั้ง 2 มิติสองภาพ (ภาพแทรกในมุมบนขวา; “XZ”) ยังแสดงคุณลักษณะ 2 มิติและ 3 มิติ แถบมาตราส่วน 100 µm c พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากเอกสารอ้างอิง 4. Elsevier
สามารถเตรียมกลุ่มควบคุมได้โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ชนิดเดียวกัน (Caco-2 หรือเซลล์เยื่อบุผิวของออร์แกนอยด์ลำไส้) ให้เป็นชั้นเดียวแบบสองมิติภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ทั่วไป ที่สำคัญคือ อาจเกิดการขาดแคลนสารอาหารเนื่องจากปริมาตรความจุของไมโครแชนเนลมีจำกัด (เช่น ประมาณ 4 µL ในช่องด้านบนของชิปลำไส้แบบดั้งเดิม) ดังนั้นจึงสามารถเปรียบเทียบสัณฐานวิทยาของเยื่อบุผิวก่อนและหลังการใช้การไหลแบบเบโซลาเทอรัลได้
กระบวนการพิมพ์หินแบบอ่อนควรดำเนินการในห้องปลอดเชื้อ สำหรับแต่ละชั้นบนชิป (ชั้นบน ชั้นล่าง และเมมเบรน) และชิปไฮบริด จะใช้โฟโตมาสก์ที่แตกต่างกันและผลิตบนแผ่นเวเฟอร์ซิลิคอนที่แยกจากกัน เนื่องจากความสูงของไมโครแชนเนลแตกต่างกัน ความสูงเป้าหมายของไมโครแชนเนลด้านบนและด้านล่างของชิปคือ 500 µm และ 200 µm ตามลำดับ ความสูงเป้าหมายของแชนเนลในชิปไฮบริดคือ 200 µm
วางแผ่นเวเฟอร์ซิลิคอนขนาด 3 นิ้วลงในจานที่มีอะซิโตน หมุนจานเบาๆ เป็นเวลา 30 วินาที แล้วผึ่งลมให้แห้ง ย้ายแผ่นเวเฟอร์ไปวางบนจานที่มีไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ (IPA) แล้วหมุนจานเป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อทำความสะอาด
อาจใช้สารละลายพิรานยา (ส่วนผสมของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และกรดซัลฟิวริกเข้มข้น ในอัตราส่วน 1:3 (ปริมาตรต่อปริมาตร)) เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการกำจัดสารตกค้างอินทรีย์ออกจากพื้นผิวเวเฟอร์ซิลิคอน
สารละลายพิรานฮามีฤทธิ์กัดกร่อนสูงมากและก่อให้เกิดความร้อน จึงจำเป็นต้องมีมาตรการความปลอดภัยเพิ่มเติม สำหรับการกำจัดของเสีย ให้รอให้สารละลายเย็นลงก่อน แล้วจึงถ่ายเทลงในภาชนะบรรจุของเสียที่สะอาดและแห้ง ใช้ภาชนะบรรจุสำรองและติดฉลากภาชนะบรรจุของเสียให้ถูกต้อง โปรดปฏิบัติตามแนวทางความปลอดภัยของโรงงานสำหรับขั้นตอนโดยละเอียดเพิ่มเติม
ทำให้แผ่นเวเฟอร์แห้งโดยวางไว้บนแผ่นความร้อนที่อุณหภูมิ 200 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที หลังจากนั้น เขย่าแผ่นเวเฟอร์ในอากาศ 5 ครั้งเพื่อให้เย็นลง
เทสารไวแสง SU-8 2100 ประมาณ 10 กรัม ลงตรงกลางแผ่นเวเฟอร์ซิลิคอนที่ทำความสะอาดแล้ว ใช้แหนบเกลี่ยสารไวแสงให้ทั่วแผ่นเวเฟอร์อย่างสม่ำเสมอ วางแผ่นเวเฟอร์บนแผ่นความร้อน 65°C เป็นครั้งคราว เพื่อให้สารไวแสงเหนียวน้อยลงและเกลี่ยได้ง่ายขึ้น ห้ามวางแผ่นเวเฟอร์ลงบนแผ่นความร้อนโดยตรง
SU-8 ถูกกระจายอย่างสม่ำเสมอทั่วแผ่นเวเฟอร์โดยใช้การเคลือบแบบหมุน (spin coating) ตั้งโปรแกรมการหมุนขาเข้าของ SU-8 เป็นเวลา 5–10 วินาที เพื่อให้เคลื่อนที่ด้วยความเร็ว 500 รอบต่อนาที ที่อัตราเร่ง 100 รอบต่อนาทีต่อวินาที ตั้งค่าการหมุนหลักสำหรับการสร้างลวดลายที่มีความหนา 200 ไมโครเมตร ที่ความเร็ว 1,500 รอบต่อนาที หรือเพื่อให้ได้ความหนา 250 ไมโครเมตร (ทำให้ชั้นบนสุดของเส้นลวดบนชิปมีความสูง 500 ไมโครเมตร ดู “ขั้นตอนสำคัญ” ด้านล่าง) โดยตั้งค่าอัตราเร่งที่ 300 รอบต่อนาทีต่อวินาที เป็นเวลา 30 วินาที ที่ความเร็ว 1,200 รอบต่อนาที
สามารถปรับความเร็วในการหมุนหลักได้ตามความหนาเป้าหมายของลวดลาย SU-8 บนแผ่นเวเฟอร์ซิลิคอน
เพื่อสร้างลวดลาย SU-8 ที่มีความสูง 500 µm สำหรับชั้นบนสุดของลำไส้บนชิป ขั้นตอนการเคลือบแบบหมุนและการอบอ่อนในกล่องนี้ (ขั้นตอนที่ 7 และ 8) จะถูกทำซ้ำตามลำดับ (ดูขั้นตอนที่ 9) เพื่อสร้างชั้น SU-8 สองชั้นที่มีความหนา 250 µm ซึ่งสามารถซ้อนและเชื่อมต่อกันได้ด้วยการฉายรังสี UV ในขั้นตอนที่ 12 ของกล่องนี้ ทำให้ได้ชั้นที่มีความสูง 500 µm
นำเวเฟอร์เคลือบ SU-8 ไปอบแบบอ่อนๆ โดยวางเวเฟอร์บนแผ่นความร้อนที่อุณหภูมิ 65 °C เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นเปลี่ยนอุณหภูมิเป็น 95 °C และอบต่ออีก 40 นาที
เพื่อให้ได้ลวดลาย SU-8 ที่มีความสูง 500 ไมโครเมตรในไมโครแชนเนลด้านบน ให้ทำซ้ำขั้นตอนที่ 7 และ 8 เพื่อสร้างชั้น SU-8 หนา 250 ไมโครเมตรสองชั้น
ใช้เครื่องมือจัดตำแหน่งหน้ากาก UV ทำการทดสอบหลอดไฟตามคำแนะนำของผู้ผลิตเพื่อคำนวณเวลาการฉายแสงของเวเฟอร์ (เวลาการฉายแสง, มิลลิวินาที) = (ปริมาณแสงที่ได้รับ, มิลลิจูล/ซม.²) / (กำลังไฟของหลอดไฟ, มิลลิวัตต์/ซม.²)
หลังจากกำหนดเวลาการฉายแสงแล้ว ให้วางโฟโตมาสก์ลงบนที่ยึดมาสก์ของเครื่องจัดตำแหน่งมาสก์ UV และวางโฟโตมาสก์ลงบนเวเฟอร์ที่เคลือบด้วย SU-8
วางพื้นผิวที่พิมพ์แล้วของโฟโตมาสก์ลงบนด้านที่เคลือบด้วย SU-8 ของแผ่นเวเฟอร์ซิลิคอนโดยตรง เพื่อลดการกระจายของรังสียูวีให้น้อยที่สุด
นำแผ่นเวเฟอร์เคลือบ SU-8 และโฟโตมาสก์ไปฉายแสง UV ในแนวตั้งด้วยความเข้ม 260 mJ/cm2 เป็นเวลาตามที่กำหนดไว้ล่วงหน้า (ดูขั้นตอนที่ 10 ในกรอบนี้)
หลังจากฉายรังสียูวีแล้ว แผ่นเวเฟอร์ซิลิคอนเคลือบ SU-8 จะถูกอบที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที และ 95°C เป็นเวลา 15 นาที บนแผ่นความร้อนแต่ละแผ่น เพื่อสร้างลวดลายที่มีความสูง 200 ไมโครเมตร จากนั้นเพิ่มเวลาอบต่อที่ 95°C เป็น 30 นาที เพื่อสร้างลวดลายที่มีความสูง 500 ไมโครเมตร
เทน้ำยา现像ลงในจานแก้ว แล้ววางเวเฟอร์ที่อบแล้วลงในจาน ปริมาณน้ำยา现像 SU-8 อาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับขนาดของจานแก้ว ตรวจสอบให้แน่ใจว่าใช้น้ำยา现像 SU-8 เพียงพอที่จะล้าง SU-8 ที่ไม่ได้รับแสงออกให้หมด ตัวอย่างเช่น เมื่อใช้จานแก้วขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 150 มม. ความจุ 1 ลิตร ให้ใช้น้ำยา现像 SU-8 ประมาณ 300 มล. 现像เป็นเวลา 25 นาที โดยหมุนเบาๆ เป็นครั้งคราว
ล้างแม่พิมพ์ที่พัฒนาแล้วด้วยน้ำยาพัฒนาภาพประมาณ 10 มิลลิลิตร ตามด้วยไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ (IPA) โดยฉีดพ่นด้วยปิเปต
วางแผ่นเวเฟอร์ลงในเครื่องทำความสะอาดพลาสมาและสัมผัสกับพลาสมาออกซิเจน (ก๊าซบรรยากาศ ความดันเป้าหมาย 1 × 10−5 Torr กำลังไฟ 125 W) เป็นเวลา 1.5 นาที
วางแผ่นเวเฟอร์ลงในเครื่องดูดความชื้นแบบสุญญากาศโดยมีแผ่นสไลด์แก้วอยู่ด้านใน สามารถวางแผ่นเวเฟอร์และแผ่นสไลด์ไว้ข้างๆ กันได้ หากเครื่องดูดความชื้นแบบสุญญากาศถูกแบ่งออกเป็นหลายชั้นด้วยแผ่นกั้น ให้วางแผ่นสไลด์ไว้ในช่องด้านล่างและวางแผ่นเวเฟอร์ไว้ในช่องด้านบน หยดสารละลายไตรคลอโร(1H, 1H, 2H, 2H-เพอร์ฟลูออโรออกทิล)ไซเลน 100 ไมโครลิตรลงบนแผ่นสไลด์แก้ว แล้วใช้สุญญากาศเพื่อทำการไซลาไนเซชัน
ละลายเซลล์ Caco-2 ที่แช่แข็งในหลอดทดลองโดยแช่ในอ่างน้ำอุ่น 37°C จากนั้นย้ายเซลล์ที่ละลายแล้วไปยังขวดเพาะเลี้ยง T75 ที่บรรจุอาหารเลี้ยงเซลล์ Caco-2 อุ่นไว้ที่ 37°C ปริมาณ 15 มล.
ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ Caco-2 ให้มีความหนาแน่นประมาณ 90% ให้เริ่มด้วยการอุ่นอาหารเลี้ยงเซลล์ Caco-2, PBS และสารละลาย trypsin 0.25%/EDTA 1 mM ในอ่างน้ำอุ่น 37°C
ดูดเอาสารละลายเลี้ยงเซลล์ออกโดยใช้เครื่องดูดสุญญากาศ ล้างเซลล์สองครั้งด้วยสารละลาย PBS อุ่น 5 มิลลิลิตร โดยทำซ้ำขั้นตอนการดูดสุญญากาศและเติมสารละลาย PBS ใหม่