Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, ënnerstëtzt CSS limitéiert. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript uweisen.
D'Morphogenese vum mënschleche Darm etabléiert Krypt-Villus-Charakteristike vun der 3D-Epithel-Mikroarchitektur a raimlecher Organisatioun. Dës eenzegaarteg Struktur ass noutwendeg fir d'Darmhomöostase z'erhalen, andeems d'Stammzellnisch an der Basalkrypt virun exogenen mikrobiellen Antigenen an hire Metabolitte geschützt gëtt. Zousätzlech presentéieren d'Darmvilli an de sekretéierende Schleim funktionell differenzéiert Epithelzellen mat enger Schutzbarriär op der Darmschleimhautuewerfläch. Dofir ass d'Rekonstruktioun vun 3D-Epithelstrukturen entscheedend fir de Bau vun In-vitro-Darmmodeller. Besonnesch den organesche mimetesche Gut-on-a-Chip kann eng spontan 3D-Morphogenese vum Darmepithel mat verbesserte physiologesche Funktiounen a Biomechanik induzéieren. Hei bidden mir e reproduzéierbare Protokoll fir robust d'Darmmorphogenese am Darm op engem mikrofluidesche Chip souwéi an engem Transwell-embedded Hybridchip ze induzéieren. Mir beschreiwen detailléiert Methoden fir d'Fabrikatioun vun Apparater, d'Kultivatioun vu Caco-2 oder Darmorganoid-Epithelzellen a konventionelle Kontexter souwéi op enger mikrofluidescher Plattform, d'Induktioun vun der 3D-Morphogenese an d'Charakteriséierung. vun etabléierten 3D-Epithelen mat Hëllef vu verschiddene Bildgebungsmodalitéiten. Dëst Protokoll erreecht d'Regeneratioun vun der funktioneller Darm-Mikroarchitektur andeems de basolaterale Flëssegkeetsfloss fir 5 Deeg kontrolléiert gëtt. Eis In-vitro-Morphogenese-Method benotzt physiologesch relevant Schéierspannung a mechanesch Bewegung a erfuerdert keng komplex Zell-Engineering oder Manipulatioun, déi aner existent Techniken iwwertreffe kéint. Mir stellen eis vir, datt eise proposéierte Protokoll breet Implikatioune fir d'biomedizinesch Fuerschungsgemeinschaft kéint hunn, andeems et eng Method ubitt fir 3D-Darm-Epithelschichten in vitro fir biomedizinesch, klinesch a pharmazeutesch Uwendungen ze regeneréieren.
Experimenter weisen datt intestinal epithel Caco-2 Zellen, déi a Gut-on-a-Chip1,2,3,4,5 oder Duebelschicht-Mikrofluidik-Geräter6,7 kultivéiert ginn, spontan 3D Morphogenese in vitro erliewen kënnen, ouni e kloert Verständnis vum zugrondleeënde Mechanismus. An eiser rezenter Studie hu mir festgestallt, datt d'Entfernung vu basolateral sekretéierte Morphogen-Antagonisten aus Kulturgeräter néideg an ausreechend ass, fir 3D epithelial Morphogenese in vitro ze induzéieren, wat duerch Caco-2 an intestinal Organoiden, déi vu Patienten ofgeleet sinn, demonstréiert gouf. Epithelzellen goufen validéiert. An dëser Studie hu mir eis speziell op d'Zellproduktioun an d'Konzentratiounsverdeelung vun engem potenten Wnt-Antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), a Gut-on-a-Chip an modifizéierte mikrofluideschen Apparater mat Transwell-Inserts konzentréiert, genannt "Hybrid Chip". Mir weisen datt d'Zousätzlech vun exogenen Wnt-Antagonisten (wéi DKK-1, Wnt-Repressor 1, sekretéiert frizzled-related protein 1 oder Soggy-1) an den On-Chip-Darm d'Morphogenese hemmt oder déi virstrukturéiert 3D-Epithelschicht stéiert, wat drop hiweist datt antagonistesche Stress während der Kultur fir d'Darmmorphogenese in vitro verantwortlech ass. Dofir ass e prakteschen Usaz fir eng robust Morphogenese op der epithelialer Grenzfläche z'erreechen, d'Niveaue vun Wnt-Antagonisten am basolaterale Kompartiment duerch aktiv Spullung (z.B. a Gut-on-a-Chip oder Hybrid-on-a-Chip Plattformen) oder Diffusioun ze läschen oder minimal z'erhalen. Basolateral Medien (z.B. vun Transwell-Inserts a grouss basolateral Reservoiren an Brunnen).
An dësem Protokoll bidden mir eng detailléiert Method fir d'Fabrikatioun vu Gut-on-a-Chip-Mikroapparater an Transwell-insertable Hybridchips (Schrëtt 1-5) fir Darmepithelzellen op Polydimethylsiloxan (PDMS)-baséierte poröse Membranen (Schrëtt 6A, 7A, 8, 9) oder Polyestermembranen vun Transwell-Inserts (Schrëtt 6B, 7B, 8, 9) ze kultivéieren an 3D-Morphogenese in vitro induzéiert ze hunn (Schrëtt 10). Mir hunn och zellulär a molekular Charakteristiken identifizéiert, déi op gewebespezifesch Histogenese an lineage-ofhängeg zellulär Differenzéierung hiweisen, andeems mir verschidde Bildgebungsmodalitéiten ugewannt hunn (Schrëtt 11-24). Mir induzéieren Morphogenese mat mënschlechen Darmepithelzellen, wéi Caco-2 oder Darmorganoiden, an zwou Kulturformater mat techneschen Detailer, dorënner d'Uewerflächenmodifikatioun vu poröse Membranen, d'Schafung vun 2D-Monoschichten, an intestinal biochemesch a reproduktiv Mikroumfeld in vitro. Fir 3D-Morphogenese aus 2D-Epithelmonoschichten ze induzéieren, hu mir Morphogen ewechgeholl. Antagonisten a béide kultivéierte Formen andeems de Medium an de basolaterale Kompartiment vun der Kultur fléisst. Schlussendlech bidden mir eng Duerstellung vun der Notzbarkeet vun enger regeneréierbarer 3D-Epithelschicht, déi benotzt ka ginn fir morphogenofhängegt Epithelwuesstum, longitudinal Wirt-Mikrobiom-Kokulturen, Pathogeninfektioun, entzündlech Verletzungen, Epithelbarrière-Dysfunktioun a probiotikabaséiert Therapien Beispill ze modelléieren.Aflëss.
Eist Protokoll kéint fir eng breet Palette vu Wëssenschaftler an der Basisfuerschung (z.B. Darmschleimhautbiologie, Stammzellbiologie an Entwécklungsbiologie) an an der ugewandter Fuerschung (z.B. präklinescher Medikamententester, Krankheetsmodelléierung, Tissue Engineering a Gastroenterologie) mat breeder Auswierkung nëtzlech sinn. Wéinst der Reproduzéierbarkeet a Robustheet vun eisem Protokoll fir d'3D-Morphogenese vum Darmepithel in vitro ze induzéieren, stellen mir eis vir, datt eis technesch Strategie un e Publikum verbreet ka ginn, dat d'Dynamik vun der Zellsignalgebung während der Darmentwécklung, Regeneratioun oder Homöostase studéiert. Zousätzlech ass eise Protokoll nëtzlech fir d'Ënnersichung vun Infektiounen ënner verschiddenen infektiösen Agenten wéi Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 oder Vibrio cholerae. Publikum vun der Krankheetspathologie a Pathogenese ass och nëtzlech. D'Benotzung vun engem On-Chip Darm-Mikrophysiologiesystem kann eng longitudinal Kokultur 10 an eng spéider Bewäertung vun der Wirtsverteidegung, Immunreaktiounen a pathogen-bezogener Verletzungsreparatur am Magen-Darm-Trakt (GI) 11 erlaben. Aner GI-Stéierungen, déi mam Leaky-Darm-Syndrom, Zöliakie, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Pouchitis oder Reizdarmsyndrom assoziéiert sinn, kënne simuléiert ginn, wann 3D-Darm-Epithelschichten mat den 3D-Darm-Epithelschichten vum Patient virbereet ginn. Dës Krankheeten enthalen villös Atrophie, Kryptenverkierzung, Schleimhautschued oder eng gestéiert Epithelbarriär. Biopsie oder Stammzellen-ofgeleet Darmorganoiden 12,13. Fir déi méi héich Komplexitéit vum Krankheetsëmfeld besser ze modelléieren, kënnen d'Lieser iwwerleeën, krankheetsrelevant Zelltypen, wéi peripher Bluttmononuklearzellen (PBMCs) vum Patient, zu Modeller mat 3D-Darmvillus-Krypten-Mikroarchitekturen bäizefügen. Gewebespezifesch Immunzellen, 5.
Well d'3D-Epithelmikrostruktur ouni de Sektiounsprozess fixéiert a visualiséiert ka ginn, kéinte Betrachter, déi un der raimlecher Transkriptomik an der Bildgebung mat héijer oder superopléisender Opléisung schaffen, un eiser Kartierung vun der raimlecher a zäitlecher Dynamik vu Genen a Proteinen op epithelnischen Interesse hunn. Interesséiert un Technologie. Äntwert op mikrobiell oder immun Stimuli. Ausserdeem kann e longitudinalen Host-Mikrobiom-Kräizgespréich 10, 14, deen d'Darm-Homöostase koordinéiert, an der 3D-Darmschleimhautschicht etabléiert ginn, andeems verschidde mikrobiell Aarten, mikrobiell Gemeinschaften oder fekal Mikrobiota zesumme kultivéiert ginn, besonnesch am Gut-on-a-Chip. an der Plattform. Dësen Usaz ass besonnesch attraktiv fir Publikum, dat sech mat der Schleimhautimmunologie, Gastroenterologie, dem mënschleche Mikrobiom, der Kulturomik an der klinescher Mikrobiologie beschäftegt a virdru net kultivéiert Darm-Mikrobiota am Laboratoire kultivéiere wëll. Wann eist In-vitro-Morphogenese-Protokoll u skalierbar Kulturformater ugepasst ka ginn, wéi z. B. Multiwell-Inserts a 24-, 96- oder 384-Well-Platten, déi basolateral Kompartimenter kontinuéierlech opfëllen, kann de Protokoll och un déi verbreet ginn, déi pharmazeutesch, biomedizinesch oder High-Throughput-Screening- oder Validatiounsplattforme fir d'Liewensmëttelindustrie entwéckelen. Als Beweis vum Prinzip hu mir viru kuerzem d'Machbarkeet vun engem Multiplex-High-Throughput-Morphogenese-System demonstréiert, dat op e 24-Well-Platteformat skalierbar ass. Zousätzlech goufen verschidde Organ-on-a-Chip-Produkter kommerzialiséiert16,17,18. Dofir kann d'Validatioun vun eiser In-vitro-Morphogenese-Method beschleunegt a potenziell vu ville Fuerschungslaboratoiren, der Industrie oder Regierungs- a Reguléierungsagenturen ugeholl ginn, fir d'zellulär Reprogramméierung vun der In-vitro-Darm-Morphogenese um transkriptomeschen Niveau ze verstoen, fir Medikamenter oder Biotherapeutika ze testen. D'Absorptioun an Den Transport vu Medikamentenkandidaten gouf mat Hëllef vu 3D-Darm-Surrogaten oder mat Hëllef vu personaliséierten oder kommerziellen Organ-op-e-Chip-Modeller bewäert, fir d'Reproduzéierbarkeet vum Darmmorphogeneseprozess ze bewäerten.
Eng limitéiert Zuel vu mënsche-relevante experimentelle Modeller goufe benotzt fir d'Darm-Epithel-Morphogenese ze studéieren, haaptsächlech wéinst dem Manktem u implementéierbare Protokoller fir 3D-Morphogenese in vitro ze induzéieren. Tatsächlech baséiert e groussen Deel vum aktuellen Wëssen iwwer d'Darm-Morphogenese op Déierstudien (z.B. Zebrafësch20, Mais21 oder Hénger22). Wéi och ëmmer, si si aarbechts- a käschteintensiv, kënnen ethesch fragwürdeg sinn, an am wichtegsten, bestëmmen net präzis mënschlech Entwécklungsprozesser. Dës Modeller sinn och ganz limitéiert wat hir Fäegkeet ugeet, op eng skalierbar Manéier getest ze ginn. Dofir iwwertrëfft eise Protokoll fir d'Regeneratioun vun 3D-Gewebestrukturen in vitro in vivo Déiermodeller souwéi aner traditionell statesch 2D-Zellkulturmodeller. Wéi virdru beschriwwen, huet d'Benotzung vun 3D-Epithelstrukturen eis erlaabt, d'raimlech Lokaliséierung vun differenzéierten Zellen an der Krypt-Villus-Achs als Äntwert op verschidde Schleimhaut- oder Immunstimuli z'ënnersichen. 3D-Epithelschichten kënnen e Raum bidden fir ze studéieren, wéi mikrobiell Zellen konkurréiere fir raimlech Nischen ze bilden an d'ökologesch Evolutioun als Äntwert op Wirtfaktoren (z.B. bannenzeg versus baussenzeg Schleimschichten, Sekretioun vun IgA an antimikrobiell Peptiden). Ausserdeem kann eis déi 3D-Epithelmorphologie erlaben ze verstoen, wéi d'Darm-Mikrobiota hir Gemeinschaften strukturéiert a synergistesch mikrobiell Metabolitte produzéiert (z. B. Kuerzketteg-Fettsäuren), déi d'zellulär Organisatioun an d'Stammzellnischen an de Basalkrypten formen. Dës Eegeschafte kënnen nëmme demonstréiert ginn, wann 3D-Epithelschichten in vitro etabléiert ginn.
Nieft eiser Method fir 3D-Darm-Epithelstrukturen ze kreéieren, gëtt et och verschidde In-vitro-Methoden. D'Intestinal Organoidkultur ass eng modern Tissue Engineering-Technik, déi op der Kultivatioun vun Darmstammzellen ënner spezifesche Morphogenbedingungen baséiert23,24,25. Wéi och ëmmer, d'Benotzung vun 3D-Organoidmodeller fir Transportanalyse oder Host-Mikrobiom-Kokulturen ass dacks eng Erausfuerderung, well den Darmlumen am Organoid agespaart ass an dofir d'Aféierung vu luminalen Komponenten wéi mikrobiell Zellen oder exogenen Antigenen limitéiert ass. Den Zougang zu Organoidlumen kann mat engem Mikroinjektor verbessert ginn,26,27 awer dës Method ass invasiv an arbeitsintensiv a erfuerdert spezialiséiert Wëssen fir se auszeféieren. Ausserdeem reflektéieren traditionell Organoidkulturen, déi an Hydrogel-Gerüster ënner statesche Bedingungen gehale ginn, net genee déi aktiv In-vivo-Biomechanik.
Aner Approchen, déi vu verschiddene Fuerschungsgruppen agesat ginn, benotzen virstrukturéiert 3D-Hydrogel-Gerüster, fir d'Darm-Epithelstruktur ze imitéieren, andeems isoléiert mënschlech Darmzellen op der Geloberfläche kultivéiert ginn. Fabrizéiert Hydrogel-Gerüster mat 3D-gedréckten, mikrogefrästen oder lithographesch fabrizéierte Formen. Dës Method weist déi selbstorganiséiert Uerdnung vun isoléierten Epithelzellen in vitro mat physiologesch relevante Morphogengradienten, wouduerch eng epithelstruktur mat engem héijen Aspektverhältnis an e Stroma-Epithel-Kräizsproch etabléiert gëtt, andeems Stromazellen am Gerüst abegraff sinn. Wéi och ëmmer, d'Natur vun de virstrukturéierte Gerüster kann d'Affichage vum spontane morphogenetische Prozess selwer verhënneren. Dës Modeller bidden och keen dynamesche luminalen oder interstitiellen Floss, well se net déi Flëssegkeetsschéierspannung hunn, déi Darmzellen brauchen, fir Morphogenese ze maachen a physiologesch Funktioun ze kréien. Eng aner rezent Studie huet Hydrogel-Gerüster an enger mikrofluidescher Plattform benotzt a gemustert Darm-Epithelstrukturen mat Laserätztechniken. Maus-Darmorganoiden verfollegen geätzten Musteren, fir Darm-Tubularstrukturen ze bilden, an den intraluminalen Flëssegkeetsfloss kann mat engem ... rekapituléiert ginn. Mikrofluidikmodul. Dëst Modell weist awer weder spontan morphogenetesch Prozesser nach enthält mechanobiologesch Beweegunge vum Darm. 3D-Drécktechniken aus der selwechter Grupp konnten Miniatur-Darmröhrchen mat spontane morphogenetischen Prozesser erstellen. Trotz der komplexer Fabrikatioun vun ënnerschiddleche Darmsegmenter am Röhrchen feelt dësem Modell och u luminalem Flëssegkeetsfloss a mechanescher Deformatioun. Zousätzlech kann d'Operabilitéit vum Modell limitéiert sinn, besonnesch nodeems de Bioprintprozess ofgeschloss ass, wat d'experimentell Konditiounen oder Zell-zu-Zell-Interaktiounen stéiert. Amplaz bitt eise proposéierte Protokoll spontan Darmmorphogenese, physiologesch relevant Schéierspannung, Biomechanik déi d'Darmmotilitéit imitéiert, Zougänglechkeet vun onofhängege apikalen a basolaterale Kompartimenter, an d'Nei-Schafung vu komplexe biologesche Mikroumfeld mat Modularitéit. Dofir kann eise Protokoll fir In-vitro-3D-Morphogenese eng komplementär Approche ubidden fir d'Erausfuerderunge vun existente Methoden ze iwwerwannen.
Eist Protokoll konzentréiert sech ganz op 3D-Epithelmorphogenese, mat nëmmen Epithelzellen an der Kultur a kengen aneren Aarte vun Ëmgéigendzellen wéi Mesenchymzellen, Endothelzellen an Immunzellen. Wéi virdru beschriwwen, ass de Kär vun eisem Protokoll d'Induktioun vun der Epithelmorphogenese andeems Morphogeninhibitoren ewechgeholl ginn, déi op der basolateraler Säit vum agefouerte Medium ausgeschott ginn. Wärend déi robust Modularitéit vun eisem Gut-on-a-Chip an Hybrid-on-a-Chip eis erlaabt, déi unduléierend 3D-Epithelschicht nei ze kreéieren, mussen zousätzlech biologesch Komplexitéiten wéi Epithel-Mesenchymal-Interaktiounen33,34, extrazellulär Matrix (ECM)-Oflagerung35 an, an eisem Modell, Krypt-Villus-Charakteristiken, déi Stammzellnischen a basale Krypten vermëttelen, weider berécksiichtegt ginn. Stromalzellen (z.B. Fibroblasten) am Mesenchym spillen eng Schlësselroll bei der Produktioun vun ECM-Proteinen an der Reguléierung vun der Darmmorphogenese in vivo35,37,38. D'Zousätzlech vu mesenchymalen Zellen An eisem Modell gouf de morphogenetesche Prozess an d'Effizienz vun der Zellanhängung verbessert. D'Endothelschicht (dh Kapillaren oder Lymphfässer) spillt eng wichteg Roll bei der Reguléierung vum molekulare Transport39 an der Immunzellrekrutéierung40 am Darm-Mikroëmfeld. Ausserdeem sinn d'Gefäskomponenten, déi tëscht Tissuemodeller verbonne kënne ginn, eng Viraussetzung, wann Tissuemodeller entwéckelt ginn, fir Interaktiounen tëscht verschiddene Organer ze demonstréieren. Dofir mussen Endothelzellen eventuell abegraff ginn, fir méi genee physiologesch Charakteristiken mat enger Opléisung op Organniveau ze modelléieren. Vum Patient ofgeleet Immunzellen sinn och essentiell fir d'Weissung vun ugebuerene Immunantworten, Antigenpresentatioun, ugebuerene adaptiven Immunkreuzgespréich a gewebespezifesch Immunitéit am Kontext vun der Imitatioun vun Darmkrankheeten.
D'Benotzung vun Hybridchips ass méi einfach wéi Gut-on-a-Chip, well den Opbau vum Apparat méi einfach ass an d'Benotzung vun Transwell-Inserts eng skalierbar Kultur vum Darmepithel erméiglecht. Wéi och ëmmer, kommerziell verfügbar Transwell-Inserts mat Polyestermembranen sinn net elastesch a kënnen keng peristaltesch-ähnlech Beweegunge simuléieren. Ausserdeem ass den apikalen Kompartiment vum Transwell-Insert, deen am Hybridchip placéiert ass, stationär bliwwen, ouni Schéierspannung op der apikaler Säit. Et ass kloer, datt déi statesch Eegeschaften am apikalen Kompartiment selten eng laangfristeg bakteriell Kokultur an Hybridchips erméiglechen. Wärend mir 3D-Morphogenese an Transwell-Inserts robust induzéiere kënnen, wa mir Hybridchips benotzen, kann de Mangel u physiologesch relevanter Biomechanik an apikaler Flëssegkeetsfloss d'Machbarkeet vun Hybridchipplattforme fir potenziell Uwendungen limitéieren.
Vollstänneg Rekonstruktioune vun der mënschlecher Krypta-Villus-Achs a Gut-on-a-Chip- a Hybrid-on-a-Chip-Kulturen sinn nach net vollstänneg etabléiert. Well d'Morphogenese vun enger epithelialer Monolayer ufänkt, bidden 3D-Mikroarchitekturen net onbedéngt eng morphologesch Ähnlechkeet mat Krypten in vivo. Och wann mir déi proliferéierend Zellpopulatioun no beim basalen Krypta-Domän am mikromanipuléierten 3D-Epithel charakteriséiert hunn, waren d'Krypta- a Villusregiounen net kloer ofgegrenzt. Och wann méi héich iewescht Kanäl um Chip zu enger erhéichter Héicht vum mikromanipuléierten Epithel féieren, ass déi maximal Héicht ëmmer nach op ~300–400 µm limitéiert. Déi tatsächlech Déift vun de mënschlechen Darmkrypten am Dünndarm an Déckdarm ass ~135 µm respektiv ~400 µm, an d'Héicht vun den Dünndarmvilli ass ~600 µm41.
Aus engem Bildgebungsstandpunkt kann d'In-situ-Superopléisungsbildgebung vun 3D-Mikroarchitekturen op den Darm op engem Chip limitéiert sinn, well déi erfuerderlech Aarbechtsdistanz vun der Objektivlëns bis zur Epithelschicht an der Gréisstenuerdnung vu puer Millimeter ass. Fir dëst Problem ze léisen, kann en distanzéierten Objektiv erfuerderlech sinn. Ausserdeem ass d'Fabrikatioun vun dënne Schnëtter fir d'Virbereedung vun der Bildgebungsprobe eng Erausfuerderung wéinst der héijer Elastizitéit vum PDMS. Well d'Schicht-fir-Schicht-Mikrofabrikatioun vum Darm op engem Chip eng permanent Adhäsioun tëscht all Schicht involvéiert, ass et extrem schwiereg, déi iewescht Schicht opzemaachen oder ze entfernen, fir d'Uewerflächenstruktur vun der Epithelschicht z'ënnersichen. Zum Beispill mat Hëllef vun engem Rasterelektronemikroskop (SEM).
D'Hydrophobizitéit vu PDMS war e limitéierende Faktor a mikrofluidesche Studien, déi sech mat hydrophobe klenge Moleküle beschäftegen, well PDMS sou hydrophobe Moleküle net spezifesch adsorbéiere kann. Alternativen zu PDMS kënne mat anere polymere Materialien berécksiichtegt ginn. Alternativ kann eng Uewerflächenmodifikatioun vu PDMS (z. Beschichtung mat lipophilen Materialien 42 oder Poly(ethylenglykol) 43) berécksiichtegt ginn, fir d'Adsorptioun vun hydrophobe Moleküle ze minimiséieren.
Schlussendlech ass eis Method net gutt charakteriséiert wat d'Bereetstellung vun enger High-Throughput-Screening oder enger "One-Size-Fits-All"-userfrëndlecher Experimentell Plattform ugeet. Deen aktuelle Protokoll erfuerdert eng Sprëtzepompel pro Mikrogerät, wat Plaz an engem CO2-Inkubator anhëlt a grouss Experimenter verhënnert. Dës Limitatioun kann duerch d'Skalierbarkeet vun innovativen Kulturformater (z. B. poréis Inserts mat 24, 96 oder 384 Wells, déi eng kontinuéierlech Erfëllung an d'Entfernung vu basolateralen Medien erlaben) däitlech verbessert ginn.
Fir d'3D-Morphogenese vum mënschlechen Darmepithel in vitro ze induzéieren, hu mir en Darmgerät mat engem Mikrofluidikchip benotzt, deen zwou parallel Mikrokanäl an eng elastesch poréis Membran dertëschent enthält, fir eng Lumen-Kapillar-Grenzfläche ze kreéieren. Mir demonstréieren och d'Benotzung vun engem Eenkanal-Mikrofluidikumgerät (engem Hybridchip), deen e kontinuéierleche basolaterale Floss ënner polariséierten Epithelschichten, déi op Transwell-Inserts gewuess sinn, suergt. Op béide Plattforme kann d'Morphogenese vu verschiddene mënschlechen Darmepithelzellen demonstréiert ginn, andeems eng direktional Manipulatioun vum Floss ugewannt gëtt, fir Morphogenantagonisten aus dem basolaterale Kompartiment ze entfernen. Déi ganz experimentell Prozedur (Figur 1) besteet aus fënnef Deeler: (i) Mikrofabrikatioun vum Darmchip oder dem Transwell-insertablen Hybridchip (Schrëtt 1-5; Këscht 1), (ii) Virbereedung vun Darmepithelzellen (Caco-2 Zellen) oder mënschlechen Darmorganoiden; Këschten 2-5), (iii) Kultur vun Darmepithelzellen op Darmchips oder Hybridchips (Schrëtt 6-9), (iv) Induktioun vun 3D-Morphogenese in vitro (Schrëtt 10) an (v)) fir d'3D-Epithelmikrostruktur ze charakteriséieren (Schrëtt 11-24). Schlussendlech gouf eng passend Kontrollgrupp (déi weider ënnen diskutéiert gëtt) entwéckelt fir d'Effektivitéit vun der In-vitro-Morphogenese ze validéieren andeems d'Epithelmorphogenese mat raimlechen, zäitlechen, bedingten oder prozeduralen Kontrollen verglach gouf.
Mir hunn zwou verschidde Kulturplattforme benotzt: Darm-op-e-Chip mat geraden Kanäl oder netlinearen gewéckelte Kanäl, oder Hybridchips mat Transwell (TW)-Inserts an engem mikrofluideschen Apparat, fabrizéiert wéi an der Këscht 1 beschriwwen, a Schrëtt 1-5. „Apparatfabrikatioun“ weist déi wichtegst Schrëtt bei der Herstellung vun engem eenzege Chip oder engem Hybridchip. „Kultur vun mënschlechen Darmepithelzellen“ erkläert d'Zellquell (Caco-2 oder mënschlech Darmorganoiden) an d'Kulturprozedur, déi an dësem Protokoll benotzt gëtt. „In vitro Morphogenese“ weist déi allgemeng Schrëtt, an deenen Caco-2 oder Organoid-ofgeleet Epithelzellen op engem Darmchip oder op Transwell-Inserts vun engem Hybridchip kultivéiert ginn, gefollegt vun der Induktioun vun der 3D-Morphogenese an der Bildung vun enger charakteriséierter Epithelstruktur. D'Programmschrëttnummer oder d'Këschtnummer gëtt ënner all Pfeil ugewisen. D'Applikatioun bitt Beispiller dofir, wéi etabléiert Darmepithelschichten zum Beispill an der Zelldifferenzéierungscharakteriséierung, Darmphysiologiestudien, der Etabléierung vun Host-Mikrobiom-Ökosystemer a Krankheetsmodelléierung benotzt kënne ginn. Immunofluoreszenz Biller an "Cell Differentiation" weisen Zellkären, F-Aktin a MUC2, déi an der 3D Caco-2 Epithelschicht expriméiert sinn, déi um Darmchip generéiert gëtt. D'MUC2-Signalgebung ass a Becherzellen a Schleim präsent, deen aus Schleimhautuewerflächen ausgeschott gëtt. Fluoreszent Biller an Gut Physiology weisen Schleim, deen duerch d'Färbung vu Sialinsäure- a N-Acetylglucosaminreschter mat fluoreszentem Weesskeim-Agglutinin produzéiert gëtt. Déi zwou iwwerlappend Biller an "Host-Microbe Co-Cultures" weisen representativ Host-Mikrobiom-Kokulturen am Darm op engem Chip. De lénkse Panel weist d'Kokultur vun E. coli, déi gréngt fluoreszent Protein (GFP) mat mikromanipuléierten 3D Caco-2 Epithelzellen expriméiert. De rietse Panel weist d'Lokaliséierung vu GFP E. coli, déi mat 3D Caco-2 Epithelzellen zesumme kultivéiert gouf, gefollegt vun der Immunofluoreszenzfärbung mat F-Aktin (rout) a Zellkären (blo). Krankheetsmodelléierung illustréiert gesond versus leckend Darm a Darmentzündungschips ënner physiologescher Erausfuerderung mat bakteriellen Antigenen (z.B. Lipopolysaccharid, LPS) an Immunzellen (z.B. PBMC; gréng).Caco-2 Zellen goufen kultivéiert fir eng 3D Epithelschicht ze etabléieren. Skala Balken, 50 µm.Biller an der ënneschter Zeil: "Differenzéierung vun Zellen" adaptéiert mat Erlaabnes vun der Referenz.2. Oxford University Press; Reproduzéiert mat Erlaabnes vun Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" adaptéiert mat Erlaabnes vun der Referenz.3. NAS; "Disease Modeling" adaptéiert mat Erlaabnes vun der Referenz.5. NAS.
Souwuel Darm-op-Chip- wéi och Hybridchips goufen mat PDMS-Repliken hiergestallt, déi duerch mëll Lithographie1,44 aus Siliziumformen entformt a mat SU-8 gemustert goufen. Den Design vun de Mikrokanäl an all Chip gëtt bestëmmt andeems Hydrodynamik wéi Schéierspannung an hydrodynameschen Drock1,4,12 berécksiichtegt gëtt. Den ursprénglechen Darm-op-Chip-Design (Extended Data Fig. 1a), deen aus zwee niewentenee placéierte parallele riichte Mikrokanäl bestoung, huet sech zu engem komplexen Darm-op-Chip (Extended Data Fig. 1b) entwéckelt, deen e puer gekrëmmte Mikrokanäl enthält fir eng erhéicht Flëssegkeetsopenthaltszäit, netlinear Flossmuster an multiaxial Deformatioun vun kultivéierten Zellen ze induzéieren (Fig. 2a-f)12. Wann méi komplex Darmbiomechanik nei erstallt muss ginn, kann komplex Darm-op-Chips gewielt ginn. Mir hunn demonstréiert, datt de verwéckelte Gut-Chip och staark 3D-Morphogenese an engem ähnlechen Zäitraum mat engem ähnlechen Grad vun Epithelwuesstum am Verglach zum Original induzéiert. Gut-Chip, onofhängeg vum kultivéierten Zelltyp. Dofir sinn linear an komplex On-Chip-Darmdesignen austauschbar fir 3D-Morphogenese ze induzéieren. PDMS-Repliken, déi op Siliziumformen mat SU-8-Mustere gehärtet goufen, haten no der Entformung negativ Eegeschafte (Fig. 2a). Fir den Darm op engem Chip ze fabrizéieren, gouf déi virbereet iewescht PDMS-Schicht sequentiell un e porösen PDMS-Film gebonnen an dann duerch irreversibel Bindung mat engem Koronabehandlungsapparat mat der ënneschter PDMS-Schicht ausgeriicht (Fig. 2b-f). Fir Hybridchips ze fabrizéieren, goufen gehärte PDMS-Repliken un Objektträger gebonnen, fir Eenkanal-Mikrofluidik-Apparater ze kreéieren, déi Transwell-Inserts ophuele konnten (Fig. 2h an Extended Data Fig. 2). De Bindungsprozess gëtt duerchgefouert, andeems d'Uewerfläche vun der PDMS-Replika a Glas mat Sauerstoffplasma oder Koronabehandlung behandelt ginn. No der Sterilisatioun vum mikrofabrizéierten Apparat, deen un der Silikonröhre befestegt war, war den Apparat prett fir d'3D-Morphogenese vum Darmepithel duerchzeféieren (Figur 2g).
a, Schematesch Illustratioun vun der Virbereedung vun PDMS-Deeler aus SU-8 gemusterte Siliziumformen. Déi net gehärtet PDMS-Léisung gouf an eng Siliziumform gegoss (lénks), bei 60 °C (Mëtt) gehärtet an aus der Form erausgeholl (riets). Déi aus der Form erausgeholl PDMS gouf a Stécker geschnidden a fir weider Benotzung gebotzt. b, Foto vun der Siliziumform, déi benotzt gouf fir d'PDMS-Uewerschicht ze preparéieren. c, Foto vun der Siliziumform, déi benotzt gouf fir d'PDMS-porös Membran ze fabrizéieren. d, Eng Serie vu Fotoe vun den ieweschten an ënneschten PDMS-Komponenten an dem zesummegesaten On-Chip-Darm-Apparat. e, Schematesch Illustratioun vun der Ausriichtung vun den ieweschten, Membran- an ënneschten PDMS-Komponenten. All Schicht ass irreversibel duerch Plasma- oder Koronabehandlung gebonnen. f, Schematesch Illustratioun vum fabrizéierten Darm-op-e-Chip-Apparat mat iwwerlagerten gewéckelte Mikrokanäl a Vakuumkammeren. g, Opstellung vum Darm-op-e-Chip fir mikrofluidesch Zellkultur. Den fabrizéierten Darm-op-e-Chip, deen mat engem Silikonschlauch an enger Sprëtz zesummegesat war, gouf op en Deckglas geluecht. Den Chip-Apparat gouf op der Deckel vun enger 150 mm Petrischüssel fir d'Veraarbechtung. De Bindemittel gëtt benotzt fir d'Silikonschlauch zouzemaachen.h, Visuell Schnappschëss vun der Hybridchipfabrikatioun an der 3D-Morphogenese mat Hybridchips. Transwell-Inserts, déi onofhängeg virbereet goufen fir 2D-Monoschichten vun intestinalen Epithelzellen ze kultivéieren, goufen an den Hybridchip agefouert fir intestinal 3D-Morphogenese ze induzéieren. De Medium gëtt duerch Mikrokanäl ënner der Zellschicht perfuséiert, déi um Transwell-Insert etabléiert ass. Skala-Balke, 1 cm.h Nei gedréckt mat Erlaabnes vun der Referenz.4. Elsevier.
An dësem Protokoll goufen d'Caco-2 Zelllinn an d'Darmorganoiden als Epithelquellen benotzt (Fig. 3a). Béid Zelltypen goufen onofhängeg kultivéiert (Box 2 a Box 5) a benotzt fir d'ECM-beschichtete Mikrokanäl vun On-Chip-Darm- oder Transwell-Inserts ze säen. Wann d'Zellen konfluent sinn (>95% Ofdeckung an de Kolben), ginn routineméisseg kultivéiert Caco-2 Zellen (tëscht de Passagen 10 an 50) an T-Kolben geernt fir dissoziéiert Zellsuspensiounen duerch Trypsiniséierungsflëssegkeet ze preparéieren (Box 2). Mënschlech Darmorganoiden aus Darmbiopsien oder chirurgesche Resektiounen goufen a Matrigel-Scaffold-Kuppelen a 24-Well-Platten kultivéiert fir d'strukturell Mikroumfeld z'ënnerstëtzen. E Medium mat essentiellen Morphogenen (wéi Wnt, R-Spondin an Noggin) a Wuestumsfaktoren, déi wéi an der Box 3 beschriwwen preparéiert goufen, gouf all zweeten Dag ergänzt, bis d'Organoiden op ~500 µm Duerchmiesser gewuess sinn. Voll ausgewuessen Organoiden ginn geernt an an eenzel Zellen dissoziéiert fir ... Aussaat op Darm oder Transwell-Inserts op engem Chip (Box 5). Wéi mir virdru bericht hunn, kann et no Krankheetstyp12,13 (z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Darmkriibs oder normalen Donor), Läsiounsplaz (z.B. Läsioun versus net-lesionéiert Regioun) a gastrointestinaler Lag am Trakt (z.B. Duodenum, Jejunum, Ileum, Cekum, Colon oder Rektum) ënnerscheet ginn. Mir bidden en optiméierte Protokoll a Box 5 fir d'Kultivatioun vun koloneschen Organoiden (Koloiden), déi typescherweis méi héich Konzentratioune vu Morphogenen erfuerderen wéi Dünndarmorganoiden.
a, Workflow fir d'Induktioun vun der Darmmorphogenese am Darmchip. Caco-2 mënschlecht Darmepithel an Darmorganoiden ginn an dësem Protokoll benotzt fir 3D-Morphogenese ze demonstréieren. Déi isoléiert Epithelzellen goufen am virbereeten Darm-op-Chip-Apparat ausgesaat (Chip-Virbereedung). Soubal d'Zellen ausgesaat (gesaat) an un d'PDMS-porös Membran um Dag 0 (D0) befestegt (attached) sinn, gëtt den apikalen (AP) Floss initiéiert an déi éischt 2 Deeg erhale gelooss (Floss, AP, D0-D2). De basolateralen (BL) Floss gëtt och zesumme mat zyklischen Dehnungsbewegungen (Stretch, Floss, AP a BL) initiéiert, wann eng komplett 2D-Monoschicht geformt gëtt. Déi intestinal 3D-Morphogenese ass spontan no 5 Deeg mikrofluidescher Kultur (Morphogenese, D5) geschitt. Phasenkontrastbiller weisen déi representativ Morphologie vu Caco-2-Zellen op all experimentellen Schrëtt oder Zäitpunkt (Balkendiagramm, 100 µm). Véier schematesch Diagrammer, déi déi entspriechend Kaskaden vun der Darmmorphogenese illustréieren (uewe riets). Déi gestrichelt D'Pfeiler am Schema representéieren d'Richtung vum Flëssegkeetsfloss.b, SEM-Bild, dat d'Uewerflächentopologie vum etabléierten 3D Caco-2 Epithel weist (lénks). Den Asaz, deen de vergréisserte Beräich ervirhiewt (wäiss gestrichelte Këscht), weist déi regeneréiert Mikrovilli op der 3D Caco-2 Schicht (riets).c, Horizontal Frontal Vue vun etabléierten Caco-2 3D, Claudin (ZO-1, rout) a kontinuéierleche Pinselrandmembranen, déi F-Aktin (gréng) a Kären (blo) markéiert sinn. Immunofluoreszenz-konfokal Visualiséierung vun Epithelzellen op Darmchips. Pfeiler, déi op de mëttleren Schema weisen, weisen d'Plaz vun der Brennfläch fir all konfokal Vue un.d, Zäitverlaf vu morphologesche Verännerungen an Organoiden, déi op engem Chip kultivéiert goufen, déi duerch Phasenkontrastmikroskopie un den Deeg 3, 7, 9, 11 an 13 kritt goufen. Den Asaz (uewe riets) weist déi héich Vergréisserung vum geliwwerte Bild.e, DIC-Fotomikrographie vum organoiden 3D Epithel, deen am Darm etabléiert gouf, op enger Scheif, déi um Dag 7 geholl gouf.f, Iwwerlagert Immunofluoreszenzbiller weist Markéierer fir Stammzellen (LGR5; Magenta), Becherzellen (MUC2; gréng), F-Aktin (gro) an Zellkären (cyan), déi 3 Deeg laang op Darmchips gewuess sinn, respektiv (lénks) an 13-Deeg (mëtt) Organoiden op der Epithelschicht. Kuckt och Extended Data Figur 3, déi d'LGR5-Signalgebung ouni MUC2-Signalgebung ervirhieft. Fluoreszenzbiller, déi d'Epithelmikrostruktur (riets) vum 3D-Organoidepithel weisen, deen am Darm op engem Chip etabléiert gouf, andeems d'Plasmamembran mam CellMask-Faarfstoff (riets) um 13. Dag vun der Kultur gefierft gouf. D'Skala-Balk ass 50 μm, ausser et ass anescht uginn. b Nei gedréckt mat Erlaabnes vun der Referenz. 2. Oxford University Press; c Adaptéiert mat Erlaabnes vun der Referenz. 2. Oxford University Press; e an f adaptéiert mat Erlaabnes duerch Referenz. 12 Ënner Creative Commons Lizenz CC BY 4.0.
Am Darm op engem Chip ass et néideg, d'hydrophob Uewerfläch vun der poröser PDMS-Membran fir eng erfollegräich ECM-Beschichtung ze modifizéieren. An dësem Protokoll benotze mir zwou verschidde Methoden fir d'Hydrophobizitéit vun PDMS-Membranen ze modifizéieren. Fir Caco-2-Zellen ze kultivéieren, war d'Uewerflächenaktivéierung duerch UV/Ozonbehandlung eleng genuch fir d'Hydrophobizitéit vun der PDMS-Uewerfläch ze reduzéieren, d'ECM ze beschichten an d'Caco-2-Zellen un d'PDMS-Membran ze befestigen. Wéi och ëmmer, eng mikrofluidesch Kultur vum organoiden Epithel erfuerdert eng chemesch baséiert Uewerflächenfunktionaliséierung fir eng effizient Oflagerung vun ECM-Proteinen z'erreechen andeems Polyethylenimin (PEI) a Glutaraldehyd sequentiell op PDMS-Mikrokanäl ugewannt ginn. No der Uewerflächenmodifikatioun goufen ECM-Proteinen ofgesat fir déi funktionaliséiert PDMS-Uewerfläch ze bedecken an dann an den isoléierten organoiden Epithel agefouert. Nodeems d'Zellen ugehaange sinn, fänkt d'mikrofluidesch Zellkultur un andeems nëmmen de Medium an den ieweschte Mikrokanal perfuséiert gëtt, bis d'Zellen eng komplett Monoschicht bilden, während den ënneschte Mikrokanal statesch Konditiounen hält. Dës optiméiert Method fir d'Uewerflächenaktivéierung an d'ECM-Beschichtung erméiglecht d'Uschloss vun Organoiden. Epithel fir 3D-Morphogenese op der PDMS-Uewerfläch ze induzéieren.
Transwell-Kulturen erfuerderen och eng ECM-Beschichtung virum Aussaat vun Zellen; Transwell-Kulturen erfuerderen awer keng komplex Virbehandlungsschrëtt fir d'Uewerfläch vu porösen Inserts z'aktivéieren. Fir Caco-2-Zellen op Transwell-Inserts ze wuessen, beschleunegt d'ECM-Beschichtung op porösen Inserts d'Uschlëss vun dissoziéierten Caco-2-Zellen (<1 Stonn) an d'Bildung vun enger Tight-Junction-Barrière (<1-2 Deeg). Fir Organoiden op Transwell-Inserts ze kultivéieren, ginn isoléiert Organoiden op ECM-beschichteten Inserts ausgesaat, un d'Membranuewerfläch befestegt (<3 Stonnen) a behalen, bis d'Organoiden eng komplett Monolayer mat Barrièreintegritéit bilden. Transwell-Kulturen ginn a 24-Well-Platten ouni d'Benotzung vun Hybridchips duerchgefouert.
In vitro 3D Morphogenese kann initiéiert ginn andeems e Flëssegkeetsfloss op de basolateralen Aspekt vun enger etabléierter Epithelschicht ugewannt gëtt. Am Darm op engem Chip huet d'Epithelmorphogenese ugefaang wéi de Medium an den ieweschten an ënneschten Mikrokanäl perfuséiert gouf (Fig. 3a). Wéi virdru beschriwwen, ass et entscheedend e Flëssegkeetsfloss am ënneschten (basolateralen) Kompartiment anzeféieren fir d'kontinuéierlech Entfernung vun direktional sekretéierte Morphogeninhibitoren. Fir genuch Nährstoffer a Serum un d'Zellen ze liwweren, déi op porös Membranen gebonne sinn, a fir luminal Schéierspannung ze generéieren, applizéiere mir typescherweis en Duebelfloss am Darm op engem Chip. An Hybridchips goufen Transwell-Inserts mat epitheliale Monoschichten an d'Hybridchips agefouert. Duerno gouf de Medium ënner der basolateraler Säit vum porösen Transwell-Insert duerch de Mikrokanal ugewannt. D'Intestinalmorphogenese ass 3-5 Deeg nom Ufank vum basolateralen Floss an deenen zwou Kulturplattforme geschitt.
Déi morphologesch Charakteristike vu mikromanipuléierten 3D-Epithelschichten kënnen analyséiert ginn andeems verschidde Bildgebungsmodalitéiten ugewannt ginn, dorënner Phasenkontrastmikroskopie, Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie, SEM oder Immunofluoreszenz-Konfokalmikroskopie (Figuren 3 an 4). Phasenkontrast- oder DIC-Bildgebung kann einfach zu all Moment während der Kultur duerchgefouert ginn, fir d'Form an d'Protrusioun vun 3D-Epithelschichten ze iwwerwaachen. Wéinst der optescher Transparenz vu PDMS- a Polyesterfilmer kënnen souwuel d'Gut-on-a-Chip- wéi och d'Hybrid-Chip-Plattforme Echtzäit-In-situ-Bildgebung ubidden, ouni datt den Apparat muss geschnidden oder demontéiert ginn. Beim Duerchféiere vun der Immunofluoreszenzbildgebung (Figuren 1, 3c, f an 4b, c) ginn d'Zellen typescherweis mat 4% (Gew./Vol.) Paraformaldehyd (PFA) fixéiert, gefollegt vun Triton X-100 an 2% (Gew./Vol.) Rinderseralbumin (BSA), an der Reiefolleg. Ofhängeg vum Zelltyp kënnen ënnerschiddlech Fixativen, Permeabilisatoren a Blockéierungsmëttel benotzt ginn. Primär Antikörper, déi gezielt sinn Lineage-ofhängeg Zell- oder Regiounsmarkéierer ginn benotzt fir Zellen ze markéieren, déi in situ um Chip immobiliséiert sinn, gefollegt vun sekundären Antikörper zesumme mat engem Géigefaarfstoff, deen entweder op den Zellkär (z.B. 4',6-Diamidino-2-phenylen) Indol, DAPI) oder F-Aktin (z.B. fluoreszent markéiert Phalloidin) geriicht ass. Fluoreszenzbaséiert Live-Bildgebung kann och in situ duerchgefouert ginn, fir d'Schleimproduktioun (Fig. 1, "Zelldifferenzéierung" an "Darmphysiologie"), d'zoufälleg Koloniséierung vu mikrobiellen Zellen (Fig. 1, "Host-Mikrobe Kokultur"), d'Rekrutéierung vun Immunzellen (Fig. 1, 'Krankheetsmodelléierung') oder d'Konturen vun der 3D-Epithelmorphologie (Fig. 3c,f a 4b,c) z'entdecken. Wann den Darm um Chip modifizéiert gëtt, fir déi iewescht Schicht vun der ënneschter Mikrokanalschicht ze trennen, wéi an der Ref. beschriwwen. Wéi an der Fig. 2 gewisen, kënnen déi 3D-Epithelmorphologie souwéi d'Mikrovilli um apikalen Pinselrand duerch SEM visualiséiert ginn. (Fig. 3b). D'Expressioun vun Differenzéierungsmarkéierer kann duerch quantitativ PCR5- oder Eenzelzell-RNA-Sequenzéierung beurteelt ginn. An dësem Fall ginn 3D-Schichten vun Epithelzellen, déi a Darmchips oder Hybridchips ugebaut ginn, duerch Trypsiniséierung geerntet an dann fir molekular oder genetesch Analysen benotzt.
a, Workflow fir d'Induktioun vun der intestinaler Morphogenese an engem Hybridchip. Caco-2 an intestinal Organoiden ginn an dësem Protokoll benotzt fir 3D Morphogenese an enger Hybridchipplattform ze demonstréieren. Dissoziéiert Epithelzellen goufen a virbereeten Transwell-Inserts ausgesaat (TW-Virbereedung; kuckt d'Figur hei ënnendrënner). Soubal d'Zellen ausgesaat (gesaat) an u Polyestermembranen an Transwell-Inserts befestegt waren, goufen all Zellen ënner statesche Konditiounen kultivéiert (TW-Kultur). No 7 Deeg gouf en eenzegen Transwell-Insert mat enger 2D-Monoschicht vun Epithelzellen an en Hybridchip integréiert fir e basolaterale Flow (Flow, BL) anzeféieren, wat schlussendlech zu der Generatioun vun enger 3D-Epithelschicht (Morphogenese) gefouert huet. Phasenkontrastmikroskopesch Fotoen, déi morphologesch Charakteristike vun mënschlechen Organepithelzellen weisen, déi aus dem normalen Donor (C103-Linn) opsteigende Colon bei all experimentellen Schrëtt oder Zäitpunkt ofgeleet sinn. D'Schemaen an den ieweschte Schichten illustréieren déi experimentell Konfiguratioun fir all Schrëtt. b, Hybridchips (lénks schematesch) kënnen zu enger 3D Morphogenese vun organoiden Epithelzellen féieren mat Top-Down-Konfokalmikroskopie-Vue vun ënnerschiddlechen Z-Positiounen (uewen, mëttler an ënnen; kuckt d'Schema riets an déi entspriechend gepunktete Linnen). huet offensichtlech morphologesch Charakteristiken gewisen. F-Aktin (Tyan), Zellkär (gro). c, Fluoreszenz-Konfokalmikroskopien (3D-Wénkel-Vue) vun organoid-ofgeleeten Epithelzellen, déi a stateschem Transwell (TW; Asaz an der wäisser gestrichelter Këscht) kultivéiert goufen, am Verglach zum Hybridchip (gréissten komplette Bild), deen 2D- a 3D-Morphologie verglach. E puer 2D-vertikal Kräizschnëtt-Vue (Asaz an der ieweschter rechter Ecke; "XZ") weisen och 2D- an 3D-Charakteristiken. Skala-Balke, 100 µm. c Nodréck mat Erlaabnes vun der Referenz. 4. Elsevier.
Kontrollen kënne virbereet ginn, andeems déiselwecht Zellen (Caco-2 oder intestinal organoid Epithelzellen) an zweedimensional Monoschichten ënner konventionelle statesche Kulturbedingungen kultivéiert ginn. Besonnesch Nährstoffmangel kann duerch déi limitéiert Volumenkapazitéit vun de Mikrokanäl entstoen (dh ~4 µL am ieweschte Kanal um ursprénglechen Darm-Chip-Design). Dofir kann d'Epithelmorphologie virun an no der Uwendung vum basolaterale Flux och verglach ginn.
De Prozess vun der mëller Lithographie soll an engem proppere Raum duerchgefouert ginn. Fir all Schicht um Chip (iewescht an ënnescht Schichten a Membranen) an Hybridchips goufen ënnerschiddlech Photomasken benotzt a op separaten Siliziumwaferen hiergestallt, well d'Héichte vun de Mikrokanäl ënnerschiddlech waren. D'Zilhéichte vun den ieweschten an ënneschte Mikrokanäl vum Darm um Chip sinn 500 µm respektiv 200 µm. D'Zilhéicht vum Kanal vum Hybridchip ass 200 µm.
Leet eng 3-Zoll Siliziumwafer an eng Schossel mat Aceton. Dréit d'Plack virsiichteg fir 30 Sekonnen, da léisst d'Wafer un der Loft dréchnen. Bréngt d'Wafer op eng Plack mat IPA, da dréit d'Plack fir 30 Sekonnen fir ze botzen.
Eng Piranha-Léisung (Mëschung aus Waasserstoffperoxid a konzentréierter Schwefelsäure, 1:3 (vol/vol)) kann optional benotzt ginn, fir d'Entfernung vun organesche Réckstänn vun der Uewerfläch vum Siliziumwafer ze maximéieren.
Piranha-Léisung ass extrem korrosiv a generéiert Hëtzt. Zousätzlech Sécherheetsmoossname si néideg. Fir d'Entsuerge vun Offall, loosst d'Léisung ofkille an iwwerdroe se an en propperen, dréchenen Offallbehälter. Benotzt zweet Behälter a markéiert d'Offallbehälter richteg. Follegt w.e.g. d'Sécherheetsrichtlinne vun der Ariichtung fir méi detailléiert Prozeduren.
D'Wafelen dehydréieren andeems se 10 Minutten op eng 200 °C waarm Plack geluecht ginn. Nom Dehydratioun gouf de Wafer fënnef Mol an der Loft gerëselt fir ofzekillen.
Gidd ongeféier 10 g Photoresist SU-8 2100 an d'Mëtt vum gereinegten Siliziumwafer. Benotzt eng Pinzette fir de Photoresist gläichméisseg op der Wafer ze verdeelen. Leet de Wafer heiansdo op eng 65°C waarm Plack, fir datt de Photoresist manner klebrig ass a méi einfach ze verdeelen ass. Leet de Wafer net direkt op déi waarm Plack.
SU-8 gouf gläichméisseg um Wafer verdeelt andeems Spin Coating gemaach gouf. Programméiert eng ukommende Rotatioun vum SU-8 fir 5-10 Sekonnen, fir sech mat 500 rpm an enger Beschleunigung vun 100 rpm/s auszebreeden. Setzt den Haaptspin fir eng Musterung mat enger Déckt vun 200 µm op 1.500 rpm, oder erreecht eng Déckt vun 250 µm (sou datt eng Héicht vun 500 µm fir déi iewescht Schicht vum Darm um Chip entstoe kann; kuckt "Kritesch Schrëtt" hei ënnendrënner) astellt eng Beschleunigung vun 300 rpm/s 30 Sekonnen bei 1.200 rpm.
D'Haaptdréigeschwindegkeet kann jee no der Zildicke vum SU-8-Muster op der Siliziumwafer ugepasst ginn.
Fir SU-8-Mustere mat enger Héicht vun 500 µm fir déi iewescht Schicht vum Darm um Chip ze fabrizéieren, goufen d'Spin-Beschichtungs- a Soft-Bake-Schrëtt vun dëser Box (Schrëtt 7 an 8) sequentiell widderholl (kuckt Schrëtt 9), fir zwou Schichten vun enger 250 µm décker Schicht SU-8 ze produzéieren, déi a Schrëtt 12 vun dëser Box duerch UV-Beliichtung geschicht a verbonne kënne ginn, sou datt eng Schicht vun 500 µm héich entsteet.
Bakt d'SU-8 beschichtete Waferen mëll andeems Dir se virsiichteg 5 Minutte bei 65 °C op eng waarm Plack leet, da wiesselt d'Astellung op 95 °C an inkubéiert se fir weider 40 Minutten.
Fir eng Héicht vun 500 μm vum SU-8-Muster am ieweschte Mikrokanal z'erreechen, widderhuelt d'Schrëtt 7 an 8 fir zwou 250 μm déck SU-8-Schichten ze generéieren.
Mat Hëllef vum UV-Mask Aligner, maacht en Lampentest no den Instruktioune vum Hiersteller fir d'Beliichtungszäit vum Wafer ze berechnen. (Beliichtungszäit, ms) = (Beliichtungsdosis, mJ/cm2)/(Lampenleistung, mW/cm2).
Nodeems Dir d'Beliichtungszäit bestëmmt hutt, leet d'Fotomask op den Maskenhalter vum UV-Maskenausrichter a placéiert d'Fotomask op de SU-8 beschichtete Wafer.
Leet déi gedréckte Uewerfläch vun der Photomask direkt op déi SU-8 beschichtete Säit vum Siliziumwafer, fir d'UV-Dispersioun ze minimiséieren.
Beliicht de SU-8 beschichtete Wafer a Photomask vertikal 260 mJ/cm2 UV-Liicht fir déi virbestëmmt Beliichtungszäit (kuckt Schrëtt 10 vun dëser Këscht).
No der UV-Beliichtung goufen SU-8-beschichtete Siliziumwaferen 5 Minutte bei 65 °C an 15 Minutte bei 95 °C op all waarmer Plack gebak, fir Mustere mat enger Héicht vun 200 μm ze fabrizéieren. D'Nofbakzäit bei 95 °C gouf op 30 Minutte verlängert, fir Mustere mat enger Héicht vun 500 µm ze fabrizéieren.
Den Entwéckler gëtt an eng Glasschossel gegoss, an de gebakene Wafer gëtt an d'Schossel geluecht. De Volume vum SU-8 Entwéckler kann jee no Gréisst vun der Glasplack variéieren. Benotzt genuch SU-8 Entwéckler, fir net exposéiert SU-8 komplett ze entfernen. Zum Beispill, wann Dir eng Glasschossel mat engem Duerchmiesser vun 150 mm an enger Kapazitéit vun 1 L benotzt, benotzt ~300 ml SU-8 Entwéckler. Entwéckelt d'Form 25 Minutten mat heiansdo sanfter Rotatioun.
Spült déi entwéckelt Schimmel mat ~10 ml frëschem Entwéckler, gefollegt vun IPA, andeems d'Léisung mat enger Pipett gesprëtzt gëtt.
Leet de Wafer an e Plasmareiniger a setzt en 1,5 Minutte laang Sauerstoffplasma (Atmosphäregas, Zildrock 1 × 10−5 Torr, Leeschtung 125 W) aus.
Leet de Wafer an en Vakuum-Exsikkator mat engem Glasträger dran. Waferen a Träger kënnen niewentenee placéiert ginn. Wann den Vakuum-Exsikkator duerch eng Plack a verschidde Schichten opgedeelt ass, leet d'Träger an déi ënnescht Kammer an d'Waferen an déi iewescht Kammer. Gitt 100 μL Trichlor(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl)silan-Léisung op en Glasträger a setzt Vakuum fir d'Silaniséierung an.
Tau e Fläschchen mat gefruerene Caco-2-Zellen an engem 37°C Waasserbad op, da transferéiert déi opgetaut Zellen an en T75-Flasch mat 15 ml 37°C virgewärmtem Caco-2-Medium.
Fir Caco-2-Zellen bei ~90% Konfluenz duerchzeloossen, muss als éischt Caco-2-Medium, PBS an 0,25% Trypsin/1 mM EDTA an engem Waasserbad bei 37°C erwiermt ginn.
Aspiréiert d'Medium duerch Vakuumaspiratioun. Wäscht d'Zellen zweemol mat 5 ml waarmem PBS andeems Dir d'Vakuumaspiratioun widderhëlt a frëschem PBS derbäisetzt.