نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
تُرسّخ عملية تكوين الأمعاء البشرية خصائص الخبايا والزغابات في البنية المجهرية ثلاثية الأبعاد للظهارة وتنظيمها المكاني. هذا التركيب الفريد ضروري للحفاظ على استتباب الأمعاء من خلال حماية بيئة الخلايا الجذعية في الخبايا القاعدية من المستضدات الميكروبية الخارجية ومستقلباتها. بالإضافة إلى ذلك، تُقدّم الزغابات المعوية والمخاط المُفرز خلايا ظهارية متمايزة وظيفيًا مع حاجز واقٍ على سطح الغشاء المخاطي المعوي. لذلك، يُعدّ إعادة تكوين البنى الظهارية ثلاثية الأبعاد أمرًا بالغ الأهمية لبناء نماذج الأمعاء في المختبر. والجدير بالذكر أن نموذج الأمعاء العضوية المُحاكية على رقاقة يُمكنه تحفيز التكوين التلقائي ثلاثي الأبعاد لظهارة الأمعاء مع تعزيز الوظائف الفسيولوجية والميكانيكا الحيوية. هنا، نُقدّم بروتوكولًا قابلًا للتكرار لتحفيز التكوين المعوي بقوة في الأمعاء على رقاقة ميكروفلويدية وكذلك في رقاقة هجينة مُدمجة في نظام ترانسويل. نصف بالتفصيل طرق تصنيع الجهاز، وزراعة... تُستخدم خلايا Caco-2 أو الخلايا الظهارية المعوية العضوية في البيئات التقليدية وعلى منصة الموائع الدقيقة، لتحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد، وتوصيف الظهارة ثلاثية الأبعاد المتكونة باستخدام تقنيات تصوير متعددة. يحقق هذا البروتوكول تجديد البنية المجهرية الوظيفية للأمعاء من خلال التحكم في تدفق السوائل القاعدية الجانبية لمدة 5 أيام. تعتمد طريقة التكوين المورفولوجي في المختبر على إجهاد القص والحركة الميكانيكية ذات الصلة الفيزيولوجية، ولا تتطلب هندسة أو معالجة معقدة للخلايا، مما قد يتفوق على التقنيات الأخرى الموجودة. نتوقع أن يكون لبروتوكولنا المقترح آثار واسعة النطاق على مجتمع البحث الطبي الحيوي، حيث يوفر طريقة لتجديد طبقات الظهارة المعوية ثلاثية الأبعاد في المختبر للتطبيقات الطبية الحيوية والسريرية والصيدلانية.
أظهرت التجارب أن خلايا Caco-2 الظهارية المعوية المزروعة في أجهزة محاكاة الأمعاء على رقاقة (gut-on-a-chip)¹،²،³،⁴،⁵ أو أجهزة الموائع الدقيقة ثنائية الطبقات⁶،⁷ يمكن أن تخضع لتكوين ثلاثي الأبعاد تلقائي في المختبر دون فهم واضح للآلية الكامنة وراء ذلك. في دراستنا الحديثة، وجدنا أن إزالة مضادات المورفوجين المفرزة من الجانب القاعدي الجانبي لأجهزة الزراعة ضرورية وكافية لتحفيز التكوين الظهاري ثلاثي الأبعاد في المختبر، وهو ما تم إثباته بواسطة خلايا Caco-2 والعضيات المعوية المشتقة من المرضى. تم التحقق من صحة الخلايا الظهارية. في هذه الدراسة، ركزنا تحديدًا على إنتاج الخلايا وتوزيع تركيز مضاد Wnt القوي، ديككوف-1 (DKK-1)، في نموذج الأمعاء على رقاقة وأجهزة الموائع الدقيقة المعدلة التي تحتوي على حشوات ترانسويل، والتي تُسمى "الرقاقة الهجينة". أظهرنا أن إضافة مضادات Wnt الخارجية (مثل DKK-1، ومثبط Wnt 1، والبروتين المرتبط بـ Frizzled المفرز 1، أو Soggy-1) إلى الأمعاء على الرقاقة تثبط التكوين المورفولوجي أو تعطل الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد المهيكلة مسبقًا، مما يشير إلى أن الإجهاد المضاد أثناء الزراعة مسؤول عن التكوين المورفولوجي المعوي في المختبر. لذلك، يتمثل أحد الأساليب العملية لتحقيق تكوين مورفولوجي قوي عند الواجهة الظهارية في إزالة أو الحفاظ على مستويات مضادات Wnt في الحجرة القاعدية الجانبية عن طريق الغسل النشط (على سبيل المثال، في نموذج الأمعاء على رقاقة أو الرقاقة الهجينة). المنصات) أو الانتشار. الوسائط القاعدية الجانبية (على سبيل المثال، من إدخالات Transwell في خزانات قاعدية جانبية كبيرة في الآبار).
في هذا البروتوكول، نقدم طريقة مفصلة لتصنيع أجهزة دقيقة تحاكي الأمعاء على رقاقة، ورقائق هجينة قابلة للإدخال في نظام Transwell (الخطوات 1-5) لزراعة خلايا ظهارية معوية على أغشية مسامية مصنوعة من متعدد ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) (الخطوات 6أ، 7أ، 8، 9) أو أغشية بوليستر لإدخالات Transwell (الخطوات 6ب، 7ب، 8، 9)، وتحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد في المختبر (الخطوة 10). كما حددنا السمات الخلوية والجزيئية الدالة على التكوين النسيجي الخاص بالأنسجة والتمايز الخلوي المعتمد على السلالة، وذلك بتطبيق طرائق تصوير متعددة (الخطوات 11-24). نحفز التكوين المورفولوجي باستخدام خلايا ظهارية معوية بشرية، مثل Caco-2 أو عضيات معوية، في شكلين من أشكال الزراعة، مع تفاصيل تقنية تشمل تعديل سطح الأغشية المسامية، وإنشاء طبقات أحادية ثنائية الأبعاد، والتحليل الكيميائي الحيوي المعوي، واستنساخ الخصائص الميكانيكية الحيوية. البيئة الدقيقة. في المختبر. لتحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد من طبقات أحادية من الخلايا الظهارية ثنائية الأبعاد، أزلنا مضادات المورفوجين في كلا الشكلين المزروعين عن طريق ضخ الوسط إلى الحجرة القاعدية الجانبية للمزرعة. وأخيرًا، نقدم مثالًا على فائدة طبقة ظهارية ثلاثية الأبعاد قابلة للتجديد يمكن استخدامها لنمذجة النمو الظهاري المعتمد على المورفوجين، والمزارع المشتركة الطولية بين المضيف والميكروبيوم، وعدوى مسببات الأمراض، والإصابة الالتهابية، واختلال وظيفة الحاجز الظهاري، والعلاجات القائمة على البروبيوتيك. مثال. التأثيرات.
قد يكون بروتوكولنا مفيدًا لمجموعة واسعة من العلماء في مجالات البحث الأساسي (مثل بيولوجيا الغشاء المخاطي المعوي، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، وبيولوجيا النمو) والتطبيقي (مثل اختبار الأدوية قبل السريري، ونمذجة الأمراض، وهندسة الأنسجة، وأمراض الجهاز الهضمي) مما يُحدث أثرًا واسع النطاق. نظرًا لإمكانية تكرار بروتوكولنا وقوته في تحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد لظهارة الأمعاء في المختبر، فإننا نتوقع إمكانية نشر استراتيجيتنا التقنية بين الباحثين الذين يدرسون ديناميكيات إشارات الخلايا أثناء نمو الأمعاء أو تجديدها أو استتبابها. إضافةً إلى ذلك، يُعد بروتوكولنا مفيدًا في دراسة العدوى في ظل عوامل مُعدية مختلفة مثل فيروس نوروفيروس 8، وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الالتهاب التنفسي الحاد الوخيم 2 (SARS-CoV-2)، والمطثية العسيرة، والسالمونيلا التيفية 9، أو ضمة الكوليرا. يُعدّ فهم علم أمراض الأمراض وآلياتها مفيدًا أيضًا. قد يسمح استخدام نظام محاكاة فيزيولوجيا الأمعاء الدقيقة على رقاقة بإجراء زراعة مشتركة طويلة الأمد (10) وتقييم لاحق للدفاعات المناعية، والاستجابات المناعية، وإصلاح الأضرار المرتبطة بمسببات الأمراض في الجهاز الهضمي (11). يمكن محاكاة اضطرابات الجهاز الهضمي الأخرى المرتبطة بمتلازمة الأمعاء المتسربة، ومرض السيلياك، وداء كرون، والتهاب القولون التقرحي، والتهاب الجيب، أو متلازمة القولون العصبي، عند تحضير طبقات ظهارية معوية ثلاثية الأبعاد باستخدام طبقات ظهارية معوية ثلاثية الأبعاد للمريض. تشمل هذه الأمراض ضمور الزغابات، وتقصير الخبايا، وتلف الغشاء المخاطي، أو ضعف الحاجز الظهاري. يمكن استخدام الخزعة أو العضيات المعوية المشتقة من الخلايا الجذعية (12، 13). لتحسين نمذجة التعقيد المتزايد لبيئة المرض، يمكن للقراء إضافة أنواع خلايا ذات صلة بالمرض، مثل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية للمريض، إلى النماذج التي تحتوي على زغابات خبايا معوية ثلاثية الأبعاد. البنى المجهرية. الخلايا المناعية الخاصة بالأنسجة، 5.
بما أن البنية المجهرية ثلاثية الأبعاد للظهارة قابلة للتثبيت والتصوير دون الحاجة إلى عملية التقطيع، فقد يهتم الباحثون في مجال علم النسخ المكاني والتصوير عالي الدقة أو فائق الدقة برسم خرائطنا للديناميكيات المكانية والزمانية للجينات والبروتينات في البيئات الظهارية. كما أن الاستجابة للمؤثرات الميكروبية أو المناعية مهمة أيضًا. علاوة على ذلك، يمكن إنشاء تفاعل طولي بين المضيف والميكروبيوم (10، 14) الذي ينسق استتباب الأمعاء في الطبقة المخاطية المعوية ثلاثية الأبعاد من خلال زراعة أنواع ميكروبية مختلفة، أو مجتمعات ميكروبية، أو ميكروبات برازية، خاصةً في نموذج الأمعاء على رقاقة. في هذه المنصة. يُعد هذا النهج جذابًا بشكل خاص للباحثين في علم المناعة المخاطية، وأمراض الجهاز الهضمي، والميكروبيوم البشري، وعلم زراعة الميكروبات، وعلم الأحياء الدقيقة السريري، الذين يسعون إلى زراعة ميكروبات الأمعاء التي لم تُزرع سابقًا في المختبر. إذا أمكن تكييف بروتوكول التكوين المورفولوجي في المختبر الخاص بنا مع تنسيقات زراعة قابلة للتطوير، مثل الحشوات متعددة الآبار في صفائح 24 أو 96 أو 384 بئرًا التي تُجدد باستمرار الحجرات القاعدية الجانبية، فيمكن أيضًا نشر البروتوكول إلى أولئك الذين يطورون منصات صيدلانية أو طبية حيوية أو منصات فحص أو تحقق عالية الإنتاجية لصناعة الأغذية. كإثبات للمبدأ، أثبتنا مؤخرًا جدوى نظام تكوين مورفولوجي متعدد عالي الإنتاجية قابل للتطوير إلى تنسيق صفيحة 24 بئرًا. بالإضافة إلى ذلك، تم تسويق العديد من منتجات الأعضاء على رقاقة 16،17،18. لذلك، يمكن تسريع التحقق من صحة طريقة التكوين المورفولوجي في المختبر الخاصة بنا، ومن المحتمل اعتمادها من قبل العديد من مختبرات الأبحاث والصناعة أو الهيئات الحكومية والتنظيمية لفهم إعادة برمجة الخلايا لتكوين الأمعاء في المختبر على مستوى النسخ لاختبار الأدوية أو العلاجات البيولوجية. تم تقييم امتصاص ونقل المرشحين للأدوية باستخدام بدائل الأمعاء ثلاثية الأبعاد أو باستخدام نماذج الأعضاء على رقاقة مخصصة أو تجارية لتقييم قابلية تكرار عملية تكوين الأمعاء.
استُخدم عدد محدود من النماذج التجريبية ذات الصلة بالإنسان لدراسة تشكّل الظهارة المعوية، ويعود ذلك أساسًا إلى نقص البروتوكولات القابلة للتطبيق لتحفيز التشكّل ثلاثي الأبعاد في المختبر. في الواقع، تستند معظم المعرفة الحالية حول تشكّل الأمعاء إلى دراسات حيوانية (مثل سمك الزيبرا، والفئران، والدجاج). ومع ذلك، فهي تتطلب جهدًا وتكلفة كبيرين، وقد تكون موضع تساؤل أخلاقي، والأهم من ذلك، أنها لا تحدد بدقة عمليات النمو البشري. كما أن هذه النماذج محدودة للغاية في قدرتها على أن تُختبر بطريقة قابلة للتطوير متعددة الجوانب. لذلك، يتفوق بروتوكولنا لتجديد هياكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد في المختبر على النماذج الحيوانية الحية، بالإضافة إلى نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد الثابتة التقليدية الأخرى. وكما ذُكر سابقًا، سمح لنا استخدام الهياكل الظهارية ثلاثية الأبعاد بفحص التموضع المكاني للخلايا المتمايزة في محور الخبايا والزغابات استجابةً لمختلف المحفزات المخاطية أو المناعية. تُتيح الطبقات الظهارية مجالًا لدراسة كيفية تنافس الخلايا الميكروبية لتشكيل بيئات مكانية وتطورها البيئي استجابةً لعوامل المضيف (مثل طبقات المخاط الداخلية والخارجية، وإفراز الغلوبولين المناعي A والببتيدات المضادة للميكروبات). علاوة على ذلك، يُمكننا فهم كيفية تنظيم الميكروبات المعوية لمجتمعاتها وإنتاجها التآزري للمستقلبات الميكروبية (مثل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة) التي تُشكل التنظيم الخلوي وبيئات الخلايا الجذعية في الخبايا القاعدية. ولا يُمكن إثبات هذه الخصائص إلا عند إنشاء طبقات ظهارية ثلاثية الأبعاد في المختبر.
إضافةً إلى طريقتنا في إنشاء تراكيب ظهارية معوية ثلاثية الأبعاد، توجد عدة طرق أخرى للزراعة في المختبر. تُعد زراعة العضيات المعوية تقنيةً متطورةً في هندسة الأنسجة، تعتمد على زراعة الخلايا الجذعية المعوية في ظل ظروف مورفوجينية محددة^23،24،25. مع ذلك، غالبًا ما يُمثل استخدام نماذج العضيات ثلاثية الأبعاد لتحليل النقل أو الزراعة المشتركة بين المضيف والميكروبيوم تحديًا، نظرًا لأن تجويف الأمعاء مُحاط بالعضية، وبالتالي، فإن إدخال مكونات التجويف، مثل الخلايا الميكروبية أو المستضدات الخارجية، يكون محدودًا. يُمكن تحسين الوصول إلى تجاويف العضيات باستخدام محقن دقيق^26،27، لكن هذه الطريقة جراحية وتتطلب جهدًا كبيرًا ومعرفةً متخصصةً لإجرائها. علاوةً على ذلك، فإن مزارع العضيات التقليدية المحفوظة في سقالات هيدروجيلية في ظل ظروف ثابتة لا تُعكس بدقة الميكانيكا الحيوية النشطة في الجسم الحي.
تستخدم العديد من المجموعات البحثية مناهج أخرى تعتمد على هياكل هيدروجيلية ثلاثية الأبعاد مُجهزة مسبقًا لمحاكاة بنية الظهارة المعوية، وذلك عن طريق زراعة خلايا معوية بشرية معزولة على سطح الهلام. تُصنع هذه الهياكل باستخدام قوالب مطبوعة ثلاثية الأبعاد، أو مصنعة بتقنية الطحن الدقيق، أو بتقنية الطباعة الحجرية. تُظهر هذه الطريقة الترتيب الذاتي للخلايا الظهارية المعزولة في المختبر مع تدرجات مورفوجينية ذات صلة فسيولوجية، مما يُنشئ بنية ظهارية ذات نسبة أبعاد عالية وتفاعلًا بين الخلايا اللحمية والظهارية من خلال تضمين الخلايا اللحمية في الهيكل. مع ذلك، قد تمنع طبيعة الهياكل المُجهزة مسبقًا ظهور عملية التكوين المورفولوجي التلقائية نفسها. كما أن هذه النماذج لا تُوفر تدفقًا ديناميكيًا في تجويف الأمعاء أو في السائل الخلالي، وتفتقر إلى إجهاد القص السائل الذي تحتاجه الخلايا المعوية للخضوع لعملية التكوين المورفولوجي واكتساب وظيفة فسيولوجية. استخدمت دراسة حديثة أخرى هياكل هيدروجيلية في منصة ميكروفلويدية، ونمطت هياكل ظهارية معوية باستخدام تقنيات الحفر بالليزر. تتبع العضيات المعوية للفئران أنماطًا محفورة لتشكيل هياكل أنبوبية معوية، ويمكن محاكاة تدفق السوائل داخل التجويف باستخدام وحدة الموائع الدقيقة. ومع ذلك، لا يُظهر هذا النموذج عمليات التكوين المورفولوجي التلقائية ولا يتضمن حركات ميكانيكية حيوية للأمعاء. تمكنت تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد من نفس المجموعة من إنشاء أنابيب معوية مصغرة مع عمليات تكوين مورفولوجي تلقائية. على الرغم من التصنيع المعقد لقطاعات الأمعاء المختلفة داخل الأنبوب، يفتقر هذا النموذج أيضًا إلى تدفق السوائل داخل التجويف والتشوه الميكانيكي. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون قابلية تشغيل النموذج محدودة، خاصة بعد اكتمال عملية الطباعة الحيوية، مما يؤدي إلى اضطراب الظروف التجريبية أو التفاعلات بين الخلايا. بدلاً من ذلك، يوفر البروتوكول المقترح لدينا تكوينًا مورفولوجيًا تلقائيًا للأمعاء، وإجهاد قص ذي صلة فسيولوجية، وميكانيكا حيوية تحاكي حركة الأمعاء، وإمكانية الوصول إلى حجرات قِمّية وقاعدية جانبية مستقلة، وإعادة إنشاء بيئات دقيقة بيولوجية معقدة. المعيارية. لذلك، قد يوفر بروتوكول التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد في المختبر نهجًا تكميليًا للتغلب على تحديات الطرق الحالية.
يركز بروتوكولنا بالكامل على التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد للظهارة، حيث لا تُزرع إلا الخلايا الظهارية دون أي أنواع أخرى من الخلايا المحيطة، مثل الخلايا اللحمية المتوسطة والخلايا البطانية والخلايا المناعية. وكما ذُكر سابقًا، فإن جوهر بروتوكولنا هو تحفيز التكوين المورفولوجي للظهارة عن طريق إزالة مثبطات المورفوجين المُفرزة على الجانب القاعدي الجانبي للوسط المُدخل. وبينما تسمح لنا المرونة العالية لنموذجنا "الأمعاء على رقاقة" و"النموذج الهجين على رقاقة" بإعادة إنشاء الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد المتموجة، إلا أن هناك تعقيدات بيولوجية إضافية، مثل التفاعلات بين الخلايا الظهارية واللحمية المتوسطة^33،34، وترسب المادة الخلوية خارج الخلية³⁵، وفي نموذجنا، خصائص الخبايا والزغابات التي تُوفر بيئات مناسبة للخلايا الجذعية في الخبايا القاعدية، لا تزال بحاجة إلى مزيد من الدراسة. تلعب الخلايا السدوية (مثل الخلايا الليفية) في اللحمة المتوسطة دورًا رئيسيًا في إنتاج بروتينات المادة الخلوية خارج الخلية وتنظيم الأمعاء. التشكّل المورفولوجي في الجسم الحي^35،37،38. أدى إضافة الخلايا اللحمية المتوسطة إلى نموذجنا إلى تعزيز عملية التشكّل المورفولوجي وكفاءة التصاق الخلايا. تلعب الطبقة البطانية (أي الشعيرات الدموية أو الأوعية اللمفاوية) دورًا هامًا في تنظيم النقل الجزيئي³⁹ وتجنيد الخلايا المناعية⁴⁰ في البيئة الدقيقة للأمعاء. علاوة على ذلك، تُعد مكونات الأوعية الدموية التي يمكن ربطها بين نماذج الأنسجة شرطًا أساسيًا عند تصميم نماذج الأنسجة لإظهار التفاعلات بين أعضاء متعددة. لذلك، قد يكون من الضروري تضمين الخلايا البطانية لنمذجة السمات الفيزيولوجية بدقة أكبر على مستوى العضو. كما أن الخلايا المناعية المشتقة من المريض ضرورية لعرض الاستجابات المناعية الفطرية، وعرض المستضدات، والتواصل المناعي الفطري التكيفي، والمناعة الخاصة بالأنسجة في سياق محاكاة أمراض الأمعاء.
يُعدّ استخدام الرقائق الهجينة أسهل من استخدام تقنية "الأمعاء على رقاقة" نظرًا لبساطة تركيب الجهاز، ولأن استخدام حشوات ترانسويل يسمح بزراعة ظهارة الأمعاء على نطاق واسع. مع ذلك، فإن حشوات ترانسويل المتوفرة تجاريًا والمزودة بأغشية بوليستر غير مرنة، ولا يمكنها محاكاة الحركات التمعجية. علاوة على ذلك، يبقى الجزء القمي من حشوة ترانسويل الموضوعة في الرقاقة الهجينة ثابتًا دون أي إجهاد قص على الجانب القمي. من الواضح أن الخصائص الثابتة في الجزء القمي نادرًا ما تُمكّن من زراعة البكتيريا المشتركة على المدى الطويل في الرقائق الهجينة. على الرغم من قدرتنا على تحفيز التشكّل ثلاثي الأبعاد في حشوات ترانسويل عند استخدام الرقائق الهجينة، إلا أن نقص الخصائص الميكانيكية الحيوية ذات الصلة الفيزيولوجية وتدفق السوائل القمي قد يحدّ من جدوى منصات الرقائق الهجينة للتطبيقات المحتملة.
لم يتم بعدُ إنشاء نماذج كاملة لمحور الخبايا والزغابات المعوية البشرية في مزارع الأمعاء على رقاقة ومزارع الخلايا الهجينة على رقاقة. ولأن عملية التكوين تبدأ من طبقة ظهارية أحادية، فإن البنى المجهرية ثلاثية الأبعاد لا توفر بالضرورة تشابهًا شكليًا مع الخبايا في الجسم الحي. على الرغم من أننا قمنا بتوصيف مجموعة الخلايا المتكاثرة بالقرب من منطقة الخبايا القاعدية في الظهارة ثلاثية الأبعاد المُهندسة مجهريًا، إلا أن منطقتي الخبايا والزغابات لم تكونا محددتين بوضوح. وعلى الرغم من أن القنوات العلوية الأعلى على الرقاقة تؤدي إلى زيادة ارتفاع الظهارة المُهندسة مجهريًا، إلا أن أقصى ارتفاع لا يزال محدودًا إلى حوالي 300-400 ميكرومتر. يبلغ العمق الفعلي لخبايا الأمعاء البشرية في الأمعاء الدقيقة والغليظة حوالي 135 ميكرومتر و400 ميكرومتر على التوالي، ويبلغ ارتفاع زغابات الأمعاء الدقيقة حوالي 600 ميكرومتر.
من منظور التصوير، قد يقتصر التصوير فائق الدقة في الموقع للهياكل الدقيقة ثلاثية الأبعاد على نموذج الأمعاء على رقاقة، نظرًا لأن المسافة المطلوبة بين العدسة الشيئية والطبقة الظهارية لا تتجاوز بضعة ملليمترات. وللتغلب على هذه المشكلة، قد يلزم استخدام عدسة شيئية بعيدة. علاوة على ذلك، يُعدّ تحضير مقاطع رقيقة لتصوير العينات أمرًا صعبًا نظرًا لمرونة مادة PDMS العالية. كما أن تصنيع نموذج الأمعاء على رقاقة طبقةً تلو الأخرى يتطلب التصاقًا دائمًا بين كل طبقة، مما يجعل فتح الطبقة العلوية أو إزالتها لفحص بنية سطح الطبقة الظهارية أمرًا بالغ الصعوبة، على سبيل المثال باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
تُعدّ خاصية كراهية الماء في مادة PDMS عاملاً مُحدداً في الدراسات القائمة على تقنية الموائع الدقيقة والتي تتناول الجزيئات الصغيرة الكارهة للماء، حيث يمكن لـ PDMS امتصاص هذه الجزيئات بشكل غير انتقائي. ويمكن النظر في بدائل لـ PDMS باستخدام مواد بوليمرية أخرى. كما يمكن النظر في تعديل سطح PDMS (مثل طلائه بمواد محبة للدهون 42 أو بولي (إيثيلين جليكول) 43) لتقليل امتصاص الجزيئات الكارهة للماء.
أخيرًا، لم يتم توصيف طريقتنا بشكل كافٍ من حيث توفير فحص عالي الإنتاجية أو منصة تجريبية سهلة الاستخدام تناسب جميع الاحتياجات. يتطلب البروتوكول الحالي مضخة حقن لكل جهاز دقيق، مما يشغل حيزًا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ويحول دون إجراء تجارب واسعة النطاق. يمكن التغلب على هذا القيد بشكل كبير من خلال قابلية التوسع في أشكال الاستزراع المبتكرة (مثل الحشوات المسامية ذات 24 أو 96 أو 384 بئرًا التي تسمح بالتجديد المستمر وإزالة الوسط القاعدي الجانبي).
لتحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد لظهارة الأمعاء البشرية في المختبر، استخدمنا جهازًا معويًا على شكل شريحة ميكروفلويدية يحتوي على قناتين ميكرويتين متوازيتين وغشاء مرن مسامي بينهما لإنشاء واجهة بين تجويف القناة والشعيرات الدموية. كما نوضح استخدام جهاز ميكروفلويدي أحادي القناة (شريحة هجينة) يوفر تدفقًا قاعديًا جانبيًا مستمرًا أسفل طبقات ظهارية مستقطبة مزروعة على حوامل ترانسويل. في كلا النظامين، يمكن إثبات التكوين المورفولوجي لخلايا ظهارية معوية بشرية مختلفة من خلال تطبيق تحكم اتجاهي في التدفق لإزالة مثبطات المورفوجين من الحجرة القاعدية الجانبية. يتكون الإجراء التجريبي بأكمله (الشكل 1) من خمسة أجزاء: (1) التصنيع الدقيق لشريحة الأمعاء أو الشريحة الهجينة القابلة للإدخال في ترانسويل (الخطوات 1-5؛ المربع 1)، (2) تحضير خلايا ظهارية معوية (خلايا Caco-2) أو عضيات معوية بشرية؛ (المربعات 2-5)، (ثالثًا) زراعة خلايا الظهارة المعوية على رقائق معوية أو رقائق هجينة (الخطوات 6-9)، (رابعًا) تحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد في المختبر (الخطوة 10)، و(خامسًا) لتوصيف البنية المجهرية الظهارية ثلاثية الأبعاد (الخطوات 11-24). أخيرًا، تم تصميم مجموعة تحكم مناسبة (سيتم مناقشتها لاحقًا) للتحقق من فعالية التكوين المورفولوجي في المختبر من خلال مقارنة التكوين المورفولوجي الظهاري بالضوابط المكانية أو الزمنية أو المشروطة أو الإجرائية.
استخدمنا منصتين مختلفتين لزراعة الخلايا: شريحة معوية ذات قنوات مستقيمة أو قنوات ملتوية غير خطية، أو شرائح هجينة تحتوي على حشوات ترانسويل (TW) في جهاز مائع دقيق، تم تصنيعه كما هو موضح في المربع 1، والخطوات من 1 إلى 5. يوضح قسم "تصنيع الجهاز" الخطوات الرئيسية في صنع شريحة واحدة أو شريحة هجينة. يشرح قسم "زراعة خلايا الظهارة المعوية البشرية" مصدر الخلايا (Caco-2 أو عضيات معوية بشرية) وإجراءات الزراعة المستخدمة في هذا البروتوكول. يوضح قسم "التكوين المورفولوجي في المختبر" الخطوات العامة التي يتم فيها زراعة خلايا Caco-2 أو الخلايا الظهارية المشتقة من العضيات على شريحة معوية أو على حشوات ترانسويل لشريحة هجينة، متبوعًا بتحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد وتكوين بنية ظهارية مميزة. يظهر رقم خطوة البرنامج أو رقم المربع أسفل كل سهم. يقدم التطبيق أمثلة على كيفية استخدام طبقات الظهارة المعوية الراسخة، على سبيل المثال، في توصيف تمايز الخلايا، ودراسات فسيولوجيا الأمعاء، وإنشاء النظم البيئية المضيفة-الميكروبية، ونمذجة الأمراض. تُظهر صور التألق المناعي في قسم "تمايز الخلايا" النوى، وF-actin، وMUC2 المُعبَّر عنها في الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد Caco-2 المُنشأة على شريحة الأمعاء. توجد إشارات MUC2 في الخلايا الكأسية والمخاط المُفرز من الأسطح المخاطية. تُظهر الصور الفلورية في قسم "فسيولوجيا الأمعاء" المخاط الناتج عن التلوين لحمض السياليك وبقايا N-أسيتيل جلوكوزامين باستخدام مُلصق جنين القمح الفلوري. تُظهر الصورتان المتداخلتان في قسم "المزارع المشتركة للمضيف والميكروبات" مزارعًا مشتركة نموذجية للمضيف والميكروبيوم في الأمعاء على شريحة. تُظهر اللوحة اليسرى المزرعة المشتركة لبكتيريا الإشريكية القولونية المُعبِّرة عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) مع خلايا Caco-2 الظهارية ثلاثية الأبعاد المُهندسة مجهريًا. تُظهر اللوحة اليمنى تموضع بكتيريا الإشريكية القولونية GFP المزروعة مع خلايا Caco-2 الظهارية ثلاثية الأبعاد. تم فحص الخلايا، متبوعًا بتلوين مناعي فلوري باستخدام الأكتين F (أحمر) والنوى (أزرق). يوضح نموذج المرض الأمعاء السليمة مقابل الأمعاء المتسربة في رقائق التهاب الأمعاء تحت تحدٍ فسيولوجي بمستضدات بكتيرية (مثل عديد السكاريد الشحمي، LPS) وخلايا مناعية (مثل PBMC؛ أخضر). تمت زراعة خلايا Caco-2 لإنشاء طبقة ظهارية ثلاثية الأبعاد. مقياس الرسم، 50 ميكرومتر. الصور في الصف السفلي: "تمايز الخلايا" مقتبسة بإذن من المرجع 2. مطبعة جامعة أكسفورد؛ معاد إنتاجها بإذن من المرجع 5. الأكاديمية الوطنية للعلوم؛ "الزراعة المشتركة للمضيف والميكروب" مقتبسة بإذن من المرجع 3. الأكاديمية الوطنية للعلوم؛ "نمذجة المرض" مقتبسة بإذن من المرجع 5. الأكاديمية الوطنية للعلوم.
تم تصنيع كل من رقائق الأمعاء على رقاقة والرقائق الهجينة باستخدام نسخ من مادة PDMS تم فكها من قوالب السيليكون بواسطة الطباعة الحجرية اللينة¹،⁴⁴ ونُقشت باستخدام مادة SU-8. يُحدد تصميم القنوات الدقيقة في كل رقاقة من خلال مراعاة الديناميكا المائية مثل إجهاد القص والضغط الهيدروديناميكي¹،⁴،¹². تطور تصميم رقاقة الأمعاء على رقاقة الأصلي (الشكل 1أ من البيانات الإضافية)، والذي كان يتكون من قناتين دقيقتين مستقيمتين متوازيتين متجاورتين، إلى رقاقة أمعاء على رقاقة معقدة (الشكل 1ب من البيانات الإضافية) تتضمن زوجًا من القنوات الدقيقة المنحنية لتحفيز زيادة زمن بقاء السائل، وأنماط تدفق غير خطية، وتشوه متعدد المحاور للخلايا المزروعة (الشكل 2أ-و)¹². عند الحاجة إلى إعادة إنشاء ميكانيكا حيوية أكثر تعقيدًا للأمعاء، يمكن اختيار رقائق الأمعاء على رقاقة المعقدة. لقد أثبتنا أن رقاقة الأمعاء الملتوية تحفز أيضًا بقوة ثلاثية الأبعاد تُلاحظ عملية التشكّل المورفولوجي في إطار زمني مماثل وبدرجة نمو ظهاري مماثلة مقارنةً بشريحة الأمعاء الأصلية، بغض النظر عن نوع الخلايا المزروعة. لذلك، لتحفيز التشكّل المورفولوجي ثلاثي الأبعاد، يمكن استبدال تصميمات الأمعاء الخطية والمعقدة على الشريحة. وقد وفرت نسخ PDMS المعالجة على قوالب السيليكون ذات أنماط SU-8 ميزات سلبية بعد إزالة القالب (الشكل 2أ). ولتصنيع الأمعاء على شريحة، تم ربط طبقة PDMS العلوية المُجهزة تباعًا بغشاء PDMS مسامي، ثم تمت محاذاتها مع طبقة PDMS السفلية عن طريق الربط غير القابل للعكس باستخدام معالج كورونا (الشكل 2ب-و). ولتصنيع الشرائح الهجينة، تم ربط نسخ PDMS المعالجة بشرائح زجاجية لإنشاء أجهزة ميكروفلويدية أحادية القناة يمكنها استيعاب حشوات Transwell (الشكل 2ح والشكل 2 من البيانات الإضافية). تتم عملية الربط عن طريق معالجة أسطح نسخة PDMS والزجاج ببلازما الأكسجين أو معالجة كورونا. بعد تعقيم... تم ربط الجهاز المصنّع بتقنية التصنيع الدقيق بأنبوب السيليكون، وكان إعداد الجهاز جاهزًا لإجراء عملية التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد للظهارة المعوية (الشكل 2g).
أ- رسم تخطيطي لتحضير أجزاء PDMS من قوالب سيليكون منقوشة بنمط SU-8. تم سكب محلول PDMS غير المعالج على قالب سيليكون (يسار)، ثم معالجته عند 60 درجة مئوية (وسط)، ثم إخراجه من القالب (يمين). تم تقطيع PDMS المفصول إلى قطع وتنظيفه لاستخدامه لاحقًا. ب- صورة لقالب السيليكون المستخدم لتحضير الطبقة العلوية من PDMS. ج- صورة لقالب السيليكون المستخدم لتصنيع غشاء PDMS المسامي. د- سلسلة من الصور لمكونات PDMS العلوية والسفلية وجهاز الأمعاء المدمج على الشريحة. هـ- رسم تخطيطي لمحاذاة مكونات PDMS العلوية والغشاء والسفلية. يتم ربط كل طبقة بشكل دائم عن طريق معالجة البلازما أو الكورونا. و- رسم تخطيطي لجهاز الأمعاء المدمج على الشريحة المصنّع مع قنوات دقيقة ملتفة متراكبة وغرف تفريغ. ز- إعداد جهاز الأمعاء المدمج على الشريحة لزراعة الخلايا الميكروفلويدية. تم تجميع جهاز الأمعاء المدمج على الشريحة مع أنبوب سيليكون و وُضِعَت المحقنة على غطاء زجاجي. وُضِعَ جهاز الشريحة على غطاء طبق بتري قطره 150 مم للمعالجة. استُخدِمَ المُرَبِّط لإغلاق أنبوب السيليكون. لقطات مرئية لتصنيع الشريحة الهجينة والتكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد باستخدام الشرائح الهجينة. أُدخِلَتْ حوامل ترانسويل، المُعَدَّة بشكل مستقل لزراعة طبقات أحادية ثنائية الأبعاد من خلايا الظهارة المعوية، في الشريحة الهجينة لتحفيز التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد للأمعاء. يُروى الوسط عبر قنوات دقيقة أسفل طبقة الخلايا المُنشأة على حامل ترانسويل. مقياس الرسم: 1 سم. أُعيدَ طبعه بإذن من المرجع 4، دار النشر إلسيفير.
في هذا البروتوكول، استُخدم خط خلايا Caco-2 والعضيات المعوية كمصادر للخلايا الظهارية (الشكل 3أ). زُرعت كلا النوعين من الخلايا بشكل مستقل (المربع 2 والمربع 5) واستُخدمت لزرع القنوات الدقيقة المغلفة بالمادة الخلوية خارج الخلية في الأمعاء المزروعة على رقاقة أو في حشوات Transwell. عندما تصل الخلايا إلى مرحلة التكاثر الكامل (>95% تغطية في القوارير)، تُحصد خلايا Caco-2 المزروعة بشكل روتيني (بين الجيلين 10 و50) في قوارير T لتحضير معلقات الخلايا المفككة باستخدام سائل التريبسين (المربع 2). زُرعت العضيات المعوية البشرية المأخوذة من خزعات الأمعاء أو عمليات الاستئصال الجراحية في قباب سقالات ماتريجيل في أطباق ذات 24 بئراً لدعم البيئة الدقيقة الهيكلية. أُضيف وسط يحتوي على عوامل تشكيل أساسية (مثل Wnt وR-spondin وNoggin) وعوامل نمو مُحضرة كما هو موضح في المربع 3 كل يومين حتى نمت العضيات إلى حوالي 500 يبلغ قطرها ميكرومترًا. تُحصد العضيات الناضجة بالكامل وتُفصل إلى خلايا مفردة لزراعتها على أمعاء أو على أغشية ترانسويل على شريحة (المربع 5). وكما ذكرنا سابقًا، يمكن التمييز بينها وفقًا لنوع المرض^12،13 (مثل التهاب القولون التقرحي، وداء كرون، وسرطان القولون والمستقيم، أو متبرع سليم)، وموقع الآفة (مثل الآفة مقابل المنطقة غير المصابة)، وموقعها في الجهاز الهضمي (مثل الاثني عشر، والصائم، واللفائفي، والأعور، والقولون، أو المستقيم). نقدم في المربع 5 بروتوكولًا مُحسَّنًا لزراعة عضيات القولون (الكولويدات) التي تتطلب عادةً تركيزات أعلى من المورفوجينات مقارنةً بعضيات الأمعاء الدقيقة.
أ- سير العمل لتحفيز تشكل الأمعاء في شريحة الأمعاء. تُستخدم خلايا Caco-2 الظهارية المعوية البشرية والعضيات المعوية في هذا البروتوكول لإظهار التشكل ثلاثي الأبعاد. زُرعت الخلايا الظهارية المعزولة في جهاز "الأمعاء على شريحة" المُجهز (تحضير الشريحة). بمجرد زرع الخلايا (الزرع) والتصاقها (الالتصاق) بالغشاء المسامي PDMS في اليوم 0 (D0)، يبدأ التدفق القمي (AP) ويستمر لمدة يومين (التدفق، AP، D0-D2). يبدأ أيضًا التدفق القاعدي الجانبي (BL) مع حركات التمدد الدورية (التمدد، التدفق، AP وBL) عند تكوين طبقة أحادية ثنائية الأبعاد كاملة. حدث التشكل ثلاثي الأبعاد للأمعاء تلقائيًا بعد 5 أيام من الزراعة الميكروفلويدية (التشكل، D5). تُظهر صور التباين الطوري مورفولوجيا نموذجية لخلايا Caco-2 في كل خطوة تجريبية أو نقطة زمنية (الشريط). الرسم البياني (100 ميكرومتر). أربعة مخططات توضيحية تُبين المراحل المتتالية لتكوين الأمعاء (أعلى اليمين). تشير الأسهم المتقطعة في المخطط إلى اتجاه تدفق السوائل. ب، صورة مجهرية إلكترونية ماسحة تُظهر تضاريس سطح ظهارة Caco-2 ثلاثية الأبعاد المُنشأة (يسار). يُظهر الجزء المُكبّر (المربع الأبيض المتقطع) الزغيبات المُتجددة على طبقة Caco-2 ثلاثية الأبعاد (يمين). ج، منظر أمامي أفقي لظهارة Caco-2 ثلاثية الأبعاد المُنشأة، مع كلودين (ZO-1، أحمر) وأغشية حافة الفرشاة المُتصلة المُوسومة بالأكتين F (أخضر) والنوى (أزرق). تصوير مناعي فلوري متحد البؤر للخلايا الظهارية على رقائق معوية. تُشير الأسهم المُتجهة إلى المخطط الأوسط إلى موقع مستوى التركيز البؤري لكل منظر متحد البؤر. د، التسلسل الزمني للتغيرات المورفولوجية في العضيات المزروعة على رقاقة، تم الحصول عليه بواسطة مجهر التباين الطوري في اليوم الثالث. 7، 9، 11، و13. تُظهر الصورة المُكبّرة (أعلى اليمين) الصورة المُقدّمة. هـ، صورة مجهرية ضوئية بتقنية التباين التفاضلي التداخلي (DIC) لظهارة عضوية ثلاثية الأبعاد مُنشأة في الأمعاء على شريحة مأخوذة في اليوم السابع. و، صور تألق مناعي مُركّبة تُظهر علامات الخلايا الجذعية (LGR5؛ أرجواني)، والخلايا الكأسية (MUC2؛ أخضر)، وF-actin (رمادي)، والنوى (سماوي) التي نُمت على رقائق الأمعاء لمدة 3 أيام (يسار) و13 يومًا (وسط) على الطبقة الظهارية. انظر أيضًا الشكل 3 من البيانات الإضافية، الذي يُسلّط الضوء على إشارات LGR5 بدون إشارات MUC2. صور تألق تُظهر البنية المجهرية الظهارية (يمين) لظهارة عضوية ثلاثية الأبعاد مُنشأة في الأمعاء على شريحة عن طريق تلوين الغشاء البلازمي بصبغة CellMask (يمين) في اليوم 13 من الزراعة. مقياس الرسم 50 ميكرومتر ما لم يُذكر خلاف ذلك. ب. مُعاد طبعه بإذن من المرجع 2. مطبعة جامعة أكسفورد؛ جـ مقتبس بإذن من المرجع 2. مطبعة جامعة أكسفورد؛ هـ و و مقتبسان بإذن من المرجع 12 بموجب ترخيص المشاع الإبداعي CC BY 4.0.
في نموذج الأمعاء على رقاقة، من الضروري تعديل السطح الكاره للماء لغشاء PDMS المسامي لضمان تغطية ناجحة للمصفوفة خارج الخلوية (ECM). في هذا البروتوكول، نطبق طريقتين مختلفتين لتعديل كراهية الماء لأغشية PDMS. لزراعة خلايا Caco-2، كان تنشيط السطح بواسطة معالجة الأشعة فوق البنفسجية/الأوزون كافيًا لتقليل كراهية الماء لسطح PDMS، وتغطية المصفوفة خارج الخلوية، وربط خلايا Caco-2 بغشاء PDMS. مع ذلك، تتطلب زراعة الظهارة العضوية في نظام الموائع الدقيقة معالجة سطحية كيميائية لتحقيق ترسيب فعال لبروتينات المصفوفة خارج الخلوية من خلال تطبيق البولي إيثيلين إيمين (PEI) والجلوتارالدهيد بالتتابع على القنوات الدقيقة PDMS. بعد تعديل السطح، تم ترسيب بروتينات المصفوفة خارج الخلوية لتغطية سطح PDMS المُعدَّل، ثم تم إدخالها إلى الظهارة العضوية المعزولة. بعد التصاق الخلايا، تبدأ زراعة الخلايا في نظام الموائع الدقيقة بضخ الوسط فقط في القناة الدقيقة العلوية حتى تُشكِّل الخلايا طبقة أحادية كاملة، بينما تبقى القناة الدقيقة السفلية ثابتة. الظروف. هذه الطريقة المُحسَّنة لتنشيط السطح وطلاء المصفوفة خارج الخلوية تُمكِّن من ربط الظهارة العضوية لتحفيز التكوين ثلاثي الأبعاد على سطح PDMS.
تتطلب مزارع ترانسويل أيضًا طلاءً بالمادة الخلوية خارج الخلية قبل زرع الخلايا؛ ومع ذلك، لا تتطلب هذه المزارع خطوات معالجة مسبقة معقدة لتنشيط سطح الأغشية المسامية. لزراعة خلايا Caco-2 على أغشية ترانسويل، يُسرّع طلاء المادة الخلوية خارج الخلية على الأغشية المسامية من التصاق خلايا Caco-2 المفصولة (أقل من ساعة) وتكوين حاجز الوصلات المحكمة (أقل من يوم إلى يومين). لزراعة العضيات على أغشية ترانسويل، تُزرع العضيات المعزولة على أغشية مطلية بالمادة الخلوية خارج الخلية، وتُلصق بسطح الغشاء (أقل من 3 ساعات)، وتُحفظ حتى تُشكّل طبقة أحادية كاملة ذات حاجز متماسك. تُجرى مزارع ترانسويل في أطباق ذات 24 بئرًا دون استخدام رقائق هجينة.
يمكن بدء التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد في المختبر بتطبيق تدفق سائل على الجانب القاعدي الجانبي لطبقة ظهارية قائمة. في نموذج الأمعاء على رقاقة، بدأ التكوين المورفولوجي الظهاري عند ضخ الوسط في القنوات الدقيقة العلوية والسفلية (الشكل 3أ). وكما ذُكر سابقًا، من الضروري إدخال تدفق سائل في الحجرة السفلية (القاعدية الجانبية) لإزالة مثبطات المورفوجين المفرزة بشكل مستمر. ولتوفير مغذيات ومصل كافيين للخلايا المرتبطة بالأغشية المسامية وتوليد إجهاد قص تجويفي، نطبق عادةً تدفقًا مزدوجًا في نموذج الأمعاء على رقاقة. في الرقائق الهجينة، تم إدخال حوامل ترانسويل التي تحتوي على طبقات أحادية من الخلايا الظهارية في الرقائق الهجينة. ثم تم تطبيق الوسط تحت الجانب القاعدي الجانبي لحوامل ترانسويل المسامية عبر القناة الدقيقة. حدث التكوين المورفولوجي المعوي بعد 3-5 أيام من بدء التدفق القاعدي الجانبي في كلا منصتي الاستزراع.
يمكن تحليل الخصائص المورفولوجية للطبقات الظهارية ثلاثية الأبعاد المصنعة بتقنية الميكروية باستخدام تقنيات تصوير متنوعة، بما في ذلك مجهر التباين الطوري، ومجهر التباين التفاضلي التداخلي (DIC)، والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، أو مجهر التألق المناعي متحد البؤر (الشكلان 3 و4). يُمكن إجراء تصوير التباين الطوري أو DIC بسهولة في أي وقت أثناء الزراعة لمراقبة شكل وبروز الطبقات الظهارية ثلاثية الأبعاد. بفضل الشفافية البصرية لأغشية PDMS والبوليستر، توفر كل من منصات "الأمعاء على رقاقة" ومنصات الرقاقة الهجينة تصويرًا موضعيًا فوريًا دون الحاجة إلى تقطيع الجهاز أو تفكيكه. عند إجراء تصوير التألق المناعي (الأشكال 1، 3ج، و و4ب، ج)، تُثبّت الخلايا عادةً باستخدام بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4% (وزن/حجم)، ثم تريتون X-100، وأخيرًا ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 2% (وزن/حجم). يعتمد ذلك على نوع الخلية. يمكن استخدام أنواع مختلفة من المثبتات، والمُنفذات، وعوامل الحجب. تُستخدم الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف علامات الخلايا أو المناطق المعتمدة على السلالة لإبراز الخلايا المثبتة في مكانها على الشريحة، متبوعة بأجسام مضادة ثانوية مع صبغة مضادة تستهدف إما النواة (مثل 4'،6-ثنائي أميدينو-2-فينيلين إندول، DAPI) أو الأكتين F (مثل الفالويدين الموسوم بالفلورة). يمكن أيضًا إجراء التصوير الحي القائم على الفلورة في الموقع للكشف عن إنتاج المخاط (الشكل 1، "تمايز الخلايا" و"فسيولوجيا الأمعاء")، والاستعمار العشوائي للخلايا الميكروبية (الشكل 1، "الزراعة المشتركة بين المضيف والميكروب")، وتجنيد الخلايا المناعية (الشكل 1، "نمذجة المرض") أو ملامح الشكل الظهاري ثلاثي الأبعاد (الشكل 3 ج، و و 4 ب، ج). عند تعديل الأمعاء على الشريحة لفصل الطبقة العليا عن كما هو موضح في المرجع، يمكن تصوير الطبقة السفلية للقناة الدقيقة، كما هو مبين في الشكل 2، باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (الشكل 3ب). ويمكن تقييم التعبير عن علامات التمايز عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أو تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية. في هذه الحالة، تُجمع الطبقات ثلاثية الأبعاد من الخلايا الظهارية المزروعة في رقائق الأمعاء أو الرقائق الهجينة بواسطة التريبسين، ثم تُستخدم في التحليل الجزيئي أو الجيني.
أ- سير العمل لتحفيز التكوين المورفولوجي المعوي في شريحة هجينة. تُستخدم خلايا Caco-2 والعضيات المعوية في هذا البروتوكول لتوضيح التكوين المورفولوجي ثلاثي الأبعاد في منصة شريحة هجينة. زُرعت الخلايا الظهارية المفككة في حشوات Transwell المُجهزة (TW prep؛ انظر الشكل أدناه). بمجرد زرع الخلايا والتصاقها بأغشية البوليستر في حشوات Transwell، تم استزراع جميع الخلايا في ظروف ثابتة (TW culture). بعد 7 أيام، تم دمج حشوة Transwell واحدة تحتوي على طبقة أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا الظهارية في شريحة هجينة لإدخال تدفق قاعدي جانبي (Flow, BL)، مما أدى في النهاية إلى تكوين طبقة ظهارية ثلاثية الأبعاد (التكوين المورفولوجي). تُظهر الصور المجهرية ذات التباين الطوري السمات المورفولوجية للخلايا الظهارية لأعضاء بشرية مشتقة من القولون الصاعد لمتبرع سليم (خط C103) في كل خطوة تجريبية أو نقطة زمنية. توضح المخططات في الطبقات العلوية التكوين التجريبي لكل خطوة. ب- الشرائح الهجينة يمكن أن يؤدي الرسم التخطيطي الأيسر إلى تكوين ثلاثي الأبعاد للخلايا الظهارية العضوية باستخدام صور مجهرية بؤرية من أعلى إلى أسفل مأخوذة من مواضع Z مختلفة (أعلى، وسط، وأسفل؛ انظر الرسم التخطيطي الأيمن والخطوط المنقطة المقابلة). أظهرت خصائص مورفولوجية واضحة. أكتين F (سماوي)، نواة (رمادي). ج، صور مجهرية بؤرية فلورية (عرض ثلاثي الأبعاد بزاوية) للخلايا الظهارية المشتقة من العضوية المزروعة في Transwell ثابت (TW؛ إطار داخلي داخل مربع أبيض متقطع) مقابل شريحة هجينة (أكبر لقطة كاملة) تقارن بين المورفولوجيا ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد، على التوالي. زوج من المناظر المقطعية الرأسية ثنائية الأبعاد (إطار داخلي في الزاوية العلوية اليمنى؛ "XZ") يظهر أيضًا ميزات ثنائية وثلاثية الأبعاد. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. ج أعيد طبعه بإذن من المرجع 4. Elsevier.
يمكن تحضير عينات التحكم عن طريق زراعة نفس الخلايا (Caco-2 أو خلايا طلائية عضوية معوية) في طبقات أحادية ثنائية الأبعاد في ظل ظروف زراعة ثابتة تقليدية. تجدر الإشارة إلى أن استنفاد المغذيات قد ينتج عن السعة الحجمية المحدودة للقنوات الدقيقة (أي حوالي 4 ميكرولتر في القناة العلوية في تصميم شريحة الأمعاء الأصلي). لذلك، يمكن أيضًا مقارنة مورفولوجيا الظهارة قبل وبعد تطبيق التدفق القاعدي الجانبي.
يجب إجراء عملية الطباعة الحجرية اللينة في غرفة نظيفة. لكل طبقة على الشريحة (الطبقات العلوية والسفلية والأغشية) والشرائح الهجينة، تم استخدام أقنعة ضوئية مختلفة وتصنيعها على رقائق سيليكون منفصلة نظرًا لاختلاف ارتفاعات القنوات الدقيقة. يبلغ الارتفاع المستهدف للقنوات الدقيقة العلوية والسفلية للشريحة 500 ميكرومتر و200 ميكرومتر على التوالي. أما الارتفاع المستهدف للقناة في الشريحة الهجينة فهو 200 ميكرومتر.
ضع رقاقة سيليكون بحجم 3 بوصات في طبق يحتوي على الأسيتون. قم بتدوير الطبق برفق لمدة 30 ثانية، ثم اترك الرقاقة تجف في الهواء. انقل الرقاقة إلى طبق يحتوي على كحول الأيزوبروبيل، ثم قم بتدوير الطبق لمدة 30 ثانية لتنظيفه.
يمكن استخدام محلول البيرانا (مزيج من بيروكسيد الهيدروجين وحمض الكبريتيك المركز، 1:3 (حجم/حجم)) اختيارياً لزيادة إزالة البقايا العضوية من سطح رقاقة السيليكون إلى أقصى حد.
محلول البيرانا شديد التآكل ويولد حرارة. لذا، يلزم اتخاذ احتياطات سلامة إضافية. للتخلص من النفايات، اترك المحلول ليبرد ثم انقله إلى حاوية نفايات نظيفة وجافة. استخدم حاويات ثانوية وضع عليها ملصقات واضحة. يرجى اتباع إرشادات السلامة الخاصة بالمنشأة للاطلاع على إجراءات أكثر تفصيلاً.
قم بتجفيف الرقائق عن طريق وضعها على صفيحة تسخين بدرجة حرارة 200 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد التجفيف، تم رج الرقاقة خمس مرات في الهواء لتبريدها.
صبّ حوالي 10 غرامات من مادة SU-8 2100 المقاومة للضوء في منتصف رقاقة السيليكون النظيفة. استخدم ملقطًا لتوزيع المادة بالتساوي على الرقاقة. ضع الرقاقة من حين لآخر على صفيحة تسخين بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لتقليل لزوجة المادة وتسهيل توزيعها. لا تضع الرقاقة مباشرةً على صفيحة التسخين.
تم توزيع مادة SU-8 بالتساوي على الرقاقة باستخدام تقنية الطلاء الدوراني. برمج دوران مادة SU-8 الداخل لمدة 5-10 ثوانٍ للانتشار بسرعة 500 دورة في الدقيقة بتسارع 100 دورة في الدقيقة/ثانية. اضبط الدوران الرئيسي لتشكيل نمط بسمك 200 ميكرومتر بسرعة 1500 دورة في الدقيقة، أو حقق سمكًا قدره 250 ميكرومتر (مما يجعل ارتفاع الطبقة العلوية من القناة على الشريحة 500 ميكرومتر؛ انظر "الخطوات الحاسمة" أدناه) مضبوطًا على تسارع 300 دورة في الدقيقة/ثانية لمدة 30 ثانية بسرعة 1200 دورة في الدقيقة.
يمكن تعديل سرعة الدوران الرئيسية وفقًا للسمك المستهدف لنمط SU-8 على رقاقة السيليكون.
لتصنيع أنماط SU-8 بارتفاع 500 ميكرومتر للطبقة العلوية من الأمعاء على الشريحة، تم تكرار خطوات الطلاء بالدوران والخبز الناعم لهذا الصندوق (الخطوتين 7 و8) بالتتابع (انظر الخطوة 9) لإنتاج طبقتين من SU-8 بسمك 250 ميكرومتر، والتي يمكن وضعها وربطها عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية في الخطوة 12 من هذا الصندوق، مما يجعل الطبقة بارتفاع 500 ميكرومتر.
قم بخبز رقائق السيليكون المطلية بـ SU-8 بشكل خفيف عن طريق وضع الرقائق بعناية على صفيحة ساخنة عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم قم بتغيير الإعداد إلى 95 درجة مئوية واحضنها لمدة 40 دقيقة إضافية.
لتحقيق ارتفاع 500 ميكرومتر لنمط SU-8 في القناة الدقيقة العلوية، كرر الخطوتين 7 و 8 لتوليد طبقتين من SU-8 بسمك 250 ميكرومتر.
باستخدام جهاز محاذاة قناع الأشعة فوق البنفسجية، قم بإجراء اختبار المصباح وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لحساب وقت تعرض الرقاقة. (وقت التعرض، مللي ثانية) = (جرعة التعرض، مللي جول/سم2)/(طاقة المصباح، مللي واط/سم2).
بعد تحديد وقت التعريض، ضع قناع الصور على حامل القناع الخاص بجهاز محاذاة قناع الأشعة فوق البنفسجية وضع قناع الصور على الرقاقة المطلية بمادة SU-8.
ضع السطح المطبوع للقناع الضوئي مباشرة على الجانب المطلي بمادة SU-8 من رقاقة السيليكون لتقليل تشتت الأشعة فوق البنفسجية.
قم بتعريض الرقاقة المطلية بـ SU-8 والقناع الضوئي عموديًا إلى 260 مللي جول / سم2 من ضوء الأشعة فوق البنفسجية لفترة التعرض المحددة مسبقًا (انظر الخطوة 10 من هذا المربع).
بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، تم خبز رقائق السيليكون المطلية بـ SU-8 عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على كل لوحة تسخين لتصنيع أنماط بارتفاع 200 ميكرومتر. قم بتمديد وقت الخبز اللاحق عند درجة حرارة 95 درجة مئوية إلى 30 دقيقة لتصنيع أنماط بارتفاع 500 ميكرومتر.
يُسكب المُظهِر في طبق زجاجي، ثم توضع رقاقة الويفر المخبوزة فيه. قد يختلف حجم مُظهِر SU-8 حسب حجم الطبق الزجاجي. تأكد من استخدام كمية كافية من مُظهِر SU-8 لإزالة طبقة SU-8 غير المُعرَّضة للضوء تمامًا. على سبيل المثال، عند استخدام طبق زجاجي بقطر 150 مم وسعة 1 لتر، استخدم حوالي 300 مل من مُظهِر SU-8. قم بتظهير القالب لمدة 25 دقيقة مع تدويره برفق من حين لآخر.
اشطف القالب المُطور بحوالي 10 مل من المُطور الطازج متبوعًا بالكحول الأيزوبروبيلي عن طريق رش المحلول باستخدام ماصة.
ضع الرقاقة في جهاز تنظيف البلازما وعرّضها لبلازما الأكسجين (غاز جوي، ضغط الهدف 1 × 10−5 تور، طاقة 125 واط) لمدة 1.5 دقيقة.
ضع الرقاقة في مجفف فراغي مع شريحة زجاجية بداخله. يمكن وضع الرقاقات والشرائح جنبًا إلى جنب. إذا كان المجفف الفراغي مقسمًا إلى عدة طبقات بواسطة صفيحة، فضع الشرائح في الحجرة السفلية والرقاقات في الحجرة العلوية. ضع 100 ميكرولتر من محلول ثلاثي كلورو (1H، 1H، 2H، 2H-بيرفلوروكتيل) سيلان على شريحة زجاجية، ثم قم بتطبيق الفراغ لإجراء عملية السيلنة.
قم بإذابة قارورة من خلايا Caco-2 المجمدة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم انقل الخلايا المذابة إلى قارورة T75 تحتوي على 15 مل من وسط Caco-2 المسخن مسبقًا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
لتمرير خلايا Caco-2 عند حوالي 90٪ من التكاثر، قم أولاً بتدفئة وسط Caco-2، ومحلول ملحي فوسفاتي، و0.25٪ تريبسين/1 مليمول EDTA في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
قم بسحب الوسط عن طريق الشفط الفراغي. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 5 مل من محلول الفوسفات الملحي الدافئ عن طريق تكرار الشفط الفراغي وإضافة محلول الفوسفات الملحي الطازج.