Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS အတွက် ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသော browser ကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ compatibility mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထိုအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် styles နှင့် JavaScript မပါဘဲ site ကို ပြသပါမည်။
လူ့အူလမ်းကြောင်း morphogenesis သည် 3D epithelial microarchitecture နှင့် spatial organization ၏ crypt-villus အင်္ဂါရပ်များကို တည်ဆောက်ပေးသည်။ ဤထူးခြားသောဖွဲ့စည်းပုံသည် basal crypt ရှိ stem cell niche ကို exogenous microbial antigens နှင့် ၎င်းတို့၏ metabolites များမှကာကွယ်ခြင်းဖြင့် အူလမ်းကြောင်း homeostasis ကိုထိန်းသိမ်းရန်လိုအပ်သည်။ ထို့အပြင်၊ အူလမ်းကြောင်း villi နှင့်ထုတ်လွှတ်သော mucosa သည် လုပ်ဆောင်ချက်အရ ကွဲပြားသော epithelial ဆဲလ်များကို အူလမ်းကြောင်း mucosal မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် အကာအကွယ်အတားအဆီးဖြင့် တင်ပြသည်။ ထို့ကြောင့်၊ in vitro အူလမ်းကြောင်းပုံစံများတည်ဆောက်ရန်အတွက် 3D epithelial ဖွဲ့စည်းပုံများကို ပြန်လည်ဖန်တီးခြင်းသည် အရေးကြီးပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ အော်ဂဲနစ် mimetic gut-on-a-chip သည် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်ချက်များနှင့် biomechanics များတိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် အူလမ်းကြောင်း epithelium ၏ spontaneous 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။ ဤနေရာတွင်၊ microfluidic chip တွင်နှင့် Transwell embedded hybrid chip တွင်အူလမ်းကြောင်း morphogenesis ကို ခိုင်မာစွာဖြစ်ပေါ်စေရန် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်သော protocol တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ပေးပါသည်။ ကိရိယာထုတ်လုပ်ခြင်း၊ ရိုးရာ setting များတွင်အပြင် microfluidic platform တွင် Caco-2 သို့မဟုတ် အူလမ်းကြောင်း organoid epithelial ဆဲလ်များကို မွေးမြူခြင်း၊ 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေခြင်းနှင့် ပုံရိပ်ဖော်ပုံစံအမျိုးမျိုးကို အသုံးပြု၍ တည်ရှိနေသော 3D epithelial ၏ လက္ခဏာရပ်ကို ဖော်ပြခြင်း။ ဤပရိုတိုကောသည် basolateral အရည်စီးဆင်းမှုကို ၅ ရက်ကြာ ထိန်းချုပ်ခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်နိုင်သော အူလမ်းကြောင်း အဏုဇီဝဖွဲ့စည်းပုံကို ပြန်လည်ထူထောင်ပေးသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ in vitro morphogenesis နည်းလမ်းသည် ဇီဝကမ္မဗေဒအရ သက်ဆိုင်ရာ shear stress နှင့် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ရွေ့လျားမှုကို အသုံးပြုပြီး ရှုပ်ထွေးသော ဆဲလ်အင်ဂျင်နီယာ သို့မဟုတ် ကိုင်တွယ်မှု မလိုအပ်ပါ၊ ၎င်းသည် အခြားရှိပြီးသားနည်းစနစ်များထက် သာလွန်နိုင်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ အဆိုပြုထားသော ပရိုတိုကောသည် ဇီဝဆေးပညာသုတေသနအသိုင်းအဝိုင်းအတွက် ကျယ်ပြန့်သော သက်ရောက်မှုများရှိနိုင်ပြီး ဇီဝဆေးပညာ၊ ဆေးခန်းနှင့် ဆေးဝါးအသုံးချမှုများအတွက် in vitro တွင် 3D အူလမ်းကြောင်း epithelial အလွှာများကို ပြန်လည်မွေးဖွားရန် နည်းလမ်းတစ်ခုကို ပံ့ပိုးပေးနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်မှန်းပါသည်။
စမ်းသပ်ချက်များအရ gut-on-a-chip1,2,3,4,5 သို့မဟုတ် bilayer microfluidic devices6,7 တွင် ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော အူလမ်းကြောင်း epithelial Caco-2 ဆဲလ်များသည် အခြေခံယန္တရားကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းနားမလည်ဘဲ in vitro တွင် spontaneous 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတွင်၊ culture devices များမှ basolaterally secreted morphogen antagonists များကို ဖယ်ရှားခြင်းသည် လိုအပ်ပြီး in vitro တွင် 3D epithelial morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေရန် လုံလောက်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၎င်းကို Caco-2 နှင့် လူနာမှရရှိသော အူလမ်းကြောင်း organoids များက သရုပ်ပြခဲ့သည်။ Epithelial ဆဲလ်များကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အူလမ်းကြောင်းပေါ်ရှိ ချစ်ပ်နှင့် Transwell ထည့်သွင်းမှုများပါရှိသော "Hybrid Chip" ဟုခေါ်သော ပြုပြင်ထားသော microfluidic ကိရိယာများတွင် အစွမ်းထက်သော Wnt antagonist Dickkopf-1 (DKK-1) ၏ ဆဲလ်ထုတ်လုပ်မှုနှင့် အာရုံစူးစိုက်မှုဖြန့်ဖြူးမှုကို အထူးအာရုံစိုက်ခဲ့သည်။ ချစ်ပ်အူလမ်းကြောင်းထဲသို့ exogenous Wnt antagonist များ (DKK-1၊ Wnt repressor 1၊ secreted frizzled-related protein 1၊ သို့မဟုတ် Soggy-1 ကဲ့သို့သော) ထည့်သွင်းခြင်းသည် morphogenesis ကို ဟန့်တားသည် သို့မဟုတ် ကြိုတင်ဖွဲ့စည်းထားသော 3D epithelial အလွှာကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပြီး ယဉ်ကျေးမှုအတွင်း antagonistic stress သည် in vitro တွင် အူလမ်းကြောင်း morphogenesis အတွက် တာဝန်ရှိကြောင်း အကြံပြုသည်။ ထို့ကြောင့်၊ epithelial interface တွင် ခိုင်မာသော morphogenesis ရရှိရန် လက်တွေ့ကျသော ချဉ်းကပ်မှုတစ်ခုမှာ basolateral compartment ရှိ Wnt antagonist များ၏ အဆင့်များကို active flushing (ဥပမာ၊ gut-on-a-chip သို့မဟုတ် hybrid-on-a-chip platforms များတွင်) သို့မဟုတ် ပျံ့နှံ့ခြင်းဖြင့် ဖယ်ရှားခြင်း သို့မဟုတ် အနည်းဆုံး ထိန်းသိမ်းခြင်းဖြစ်သည်။ Basolateral media (ဥပမာ၊ Transwell ထည့်သွင်းမှုများမှ basolateral reservoir ကြီးများထဲသို့ ရေတွင်းများ)။
ဤပရိုတိုကောတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် gut-on-a-chip microdevices များနှင့် Transwell-insertable hybrid chips (အဆင့် ၁-၅) များကို polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (အဆင့် ၆က၊ ၇က၊ ၈၊ ၉) သို့မဟုတ် polyester membranes များပေါ်တွင် အူလမ်းကြောင်း epithelial ဆဲလ်များကို မွေးမြူရန်နှင့် in vitro တွင် 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက် အသေးစိတ်နည်းလမ်းကို ပံ့ပိုးပေးပါသည် (အဆင့် ၁၀)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် တစ်ရှူး-သီးသန့် histogenesis နှင့် မျိုးရိုးပေါ်မူတည်သော ဆဲလ်ကွဲပြားမှုကို ညွှန်ပြသည့် ဆဲလ်နှင့် မော်လီကျူးအင်္ဂါရပ်များကိုလည်း မျိုးစုံပုံရိပ်ဖော်ပုံစံများကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ဖော်ထုတ်ခဲ့ပါသည် (အဆင့် ၁၁-၂၄)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် Caco-2 သို့မဟုတ် အူလမ်းကြောင်း organoids ကဲ့သို့သော လူ့အူလမ်းကြောင်း epithelial ဆဲလ်များကို အသုံးပြု၍ morphogenesis ကို မွေးမြူရန် နည်းပညာဆိုင်ရာအသေးစိတ်အချက်အလက်များဖြင့် ယဉ်ကျေးမှုပုံစံနှစ်မျိုးဖြင့် porous membranes များ၏ မျက်နှာပြင်ပြုပြင်ခြင်း၊ 2D monolayers များဖန်တီးခြင်းနှင့် အူလမ်းကြောင်းဇီဝဓာတုဗေဒနှင့် ဇီဝစက်ပိုင်းဆိုင်ရာ microenvironment ၏ မျိုးပွားခြင်းအပါအဝင် နည်းပညာဆိုင်ရာအသေးစိတ်အချက်အလက်များဖြင့် in vitro တွင် 2D မှ 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေရန် epithelial monolayers များတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ယဉ်ကျေးမှု၏ basolateral compartment ထဲသို့ medium ကိုစီးဆင်းစေခြင်းဖြင့် ယဉ်ကျေးမှုပုံစံနှစ်မျိုးလုံးရှိ morphogen antagonists များကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ morphogen-dependent epithelial growth၊ longitudinal host-microbiome co-cultures၊ pathogen infection၊ inflammatory injury၊ epithelial barrier dysfunction နှင့် probiotic-based therapies များကို ပုံစံပြုရန်အသုံးပြုနိုင်သည့် regenerable 3D epithelial layer ၏ အသုံးဝင်မှုကို ကိုယ်စားပြုပါသည်။ ဥပမာ။ influences။
ကျွန်ုပ်တို့၏ ပရိုတိုကောသည် အခြေခံ (ဥပမာ၊ အူလမ်းကြောင်း အမြှေးပါးဇီဝဗေဒ၊ ပင်မဆဲလ်ဇီဝဗေဒနှင့် ဖွံ့ဖြိုးမှုဇီဝဗေဒ) နှင့် အသုံးချသုတေသန (ဥပမာ၊ ဆေးခန်းမတိုင်မီ ဆေးဝါးစမ်းသပ်ခြင်း၊ ရောဂါပုံစံငယ်ပြုလုပ်ခြင်း၊ တစ်ရှူးအင်ဂျင်နီယာနှင့် အစာအိမ်နှင့်အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာရောဂါဗေဒ) တွင် ကျယ်ပြန့်သောသက်ရောက်မှုရှိသော သိပ္ပံပညာရှင်အမျိုးမျိုးအတွက် အသုံးဝင်နိုင်ပါသည်။ in vitro တွင် အူလမ်းကြောင်း အပေါ်ယံလွှာ၏ 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေရန် ကျွန်ုပ်တို့၏ ပရိုတိုကော၏ ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှုနှင့် ခိုင်မာမှုကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ နည်းပညာဆိုင်ရာ မဟာဗျူဟာကို အူလမ်းကြောင်းဖွံ့ဖြိုးမှု၊ ပြန်လည်ထူထောင်ခြင်း သို့မဟုတ် homeostasis အတွင်း ဆဲလ်အချက်ပြမှု၏ ဒိုင်းနမစ်ကို လေ့လာနေသော ပရိသတ်များထံ ဖြန့်ဝေနိုင်မည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်မှန်းပါသည်။ ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ ပရိုတိုကောသည် Norovirus 8၊ ပြင်းထန်သော အသက်ရှူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ရောဂါလက္ခဏာစု Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)၊ Clostridium difficile၊ Salmonella Typhimurium 9 သို့မဟုတ် Vibrio cholerae ကဲ့သို့သော ကူးစက်တတ်သော အေးဂျင့်အမျိုးမျိုးအောက်တွင် ရောဂါကူးစက်မှုကို မေးမြန်းရာတွင် အသုံးဝင်ပါသည်။ ရောဂါဗေဒနှင့် ရောဂါဖြစ်စဉ်များ၏ ပရိသတ်များသည်လည်း အသုံးဝင်ပါသည်။ on-chip အူလမ်းကြောင်း အဏုဇီဝဗေဒစနစ်ကို အသုံးပြုခြင်းသည် longitudinal co-culture 10 နှင့် host defense၊ immune responses နှင့် pathogen-related injury repair တို့ကို နောက်ဆက်တွဲ အကဲဖြတ်ခြင်းကို ခွင့်ပြုနိုင်သည် 11။ leaky gut syndrome၊ celiac disease၊ Crohn's disease၊ ulcerative colitis၊ pouchitis သို့မဟုတ် irritable bowel syndrome နှင့် ဆက်စပ်နေသော အခြား GI ရောဂါများကို လူနာ၏ 3D အူလမ်းကြောင်း epithelial layers များကို အသုံးပြု၍ 3D အူလမ်းကြောင်း epithelial layers များကို ပြင်ဆင်သောအခါ simulate လုပ်နိုင်သည်၊ ဤရောဂါများတွင် villous atrophy၊ crypt shortening၊ mucosal damage သို့မဟုတ် impaired epithelial barrier တို့ ပါဝင်သည်။ Biopsy သို့မဟုတ် stem cell-derived intestinal organoids12,13။ ရောဂါပတ်ဝန်းကျင်၏ မြင့်မားသော ရှုပ်ထွေးမှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ ပုံစံထုတ်ရန်အတွက် စာဖတ်သူများသည် 3D အူလမ်းကြောင်း villus-crypt microarchitectures ပါ၀င်သော ပုံစံများတွင် လူနာ၏ peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) ကဲ့သို့သော ရောဂါနှင့်သက်ဆိုင်သော ဆဲလ်အမျိုးအစားများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားနိုင်သည်။ တစ်ရှူး-သီးသန့် immune cells, 5။
3D epithelial microstructure ကို sectioning လုပ်ငန်းစဉ်မပါဘဲ ပြုပြင်ပြီး မြင်ယောင်နိုင်သောကြောင့်၊ spatial transcriptomics နှင့် high-resolution သို့မဟုတ် super-resolution imaging တွင် အလုပ်လုပ်နေသော ကြည့်ရှုသူများသည် epithelial niches များပေါ်ရှိ မျိုးဗီဇများနှင့် ပရိုတိန်းများ၏ spatiotemporal dynamics ၏ ကျွန်ုပ်တို့၏ မြေပုံရေးဆွဲခြင်းကို စိတ်ဝင်စားနိုင်ပါသည်။ နည်းပညာကို စိတ်ဝင်စားသည်။ microbial သို့မဟုတ် immune stimuli များအပေါ် တုံ့ပြန်မှု။ ထို့အပြင်၊ အူလမ်းကြောင်း homeostasis ကို ညှိနှိုင်းပေးသည့် longitudinal host-microbiome crosstalk 10၊ 14 ကို 3D အူလမ်းကြောင်း mucosal အလွှာတွင် အထူးသဖြင့် gut-on-a-chip တွင် မတူညီသော microbial မျိုးစိတ်များ၊ microbial အသိုင်းအဝိုင်းများ သို့မဟုတ် fecal microbiota များကို ပူးတွဲမွေးမြူခြင်းဖြင့် တည်ထောင်နိုင်သည်။ ပလက်ဖောင်းထဲမှာ။ ဒီချဉ်းကပ်မှုဟာ mucosal immunology၊ gastroenterology၊ human microbiome၊ culturomics နဲ့ clinical microbiology တွေကို လေ့လာနေတဲ့ ပရိသတ်အတွက် အထူးဆွဲဆောင်မှုရှိပါတယ်။ ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ in vitro morphogenesis protocol ကို basolateral compartments တွေကို အဆက်မပြတ်ဖြည့်ဆည်းပေးတဲ့ 24, 96 ဒါမှမဟုတ် 384 well plates တွေမှာ multiwell inserts တွေလိုမျိုး scalable culture formats တွေနဲ့ လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် လုပ်နိုင်မယ်ဆိုရင်၊ ဒီ protocol ကို ဆေးဝါး၊ ဇီဝဆေးပညာ ဒါမှမဟုတ် အစားအသောက်လုပ်ငန်းအတွက် high-throughput screening ဒါမှမဟုတ် validation platforms တွေ တီထွင်နေသူတွေဆီလည်း ဖြန့်ဝေနိုင်ပါတယ်။ principle of proof-of-principle အနေနဲ့၊ မကြာသေးခင်က ကျွန်ုပ်တို့ဟာ 24-well plate format အထိ scalable multiplex high-throughput morphogenesis system ရဲ့ ဖြစ်နိုင်ခြေကို သရုပ်ပြခဲ့ပါတယ်။ ထို့အပြင်၊ multiple organ-on-a-chip ထုတ်ကုန်တွေကို စီးပွားဖြစ်ထုတ်လုပ်ခဲ့ပါတယ်16,17,18။ ဒါကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ in vitro morphogenesis နည်းလမ်းရဲ့ validation ကို အရှိန်မြှင့်နိုင်ပြီး သုတေသနဓာတ်ခွဲခန်းတွေ၊ စက်မှုလုပ်ငန်း ဒါမှမဟုတ် အစိုးရနဲ့ စည်းမျဉ်းထိန်းသိမ်းရေးအေဂျင်စီတွေက ဆေးဝါးတွေကို စမ်းသပ်ဖို့ transcriptomic level မှာ in vitro gut morphogenesis ရဲ့ cellular reprogramming ကို နားလည်ဖို့ အလားအလာရှိရှိ လက်ခံအသုံးပြုနိုင်ပါတယ်။ ဇီဝကုထုံးများ အူလမ်းကြောင်း morphogenesis လုပ်ငန်းစဉ်၏ မျိုးပွားနိုင်စွမ်းကို အကဲဖြတ်ရန် ဆေးဝါးကိုယ်စားလှယ်လောင်းများ၏ စုပ်ယူမှုနှင့် သယ်ယူပို့ဆောင်မှုကို 3D အူအစားထိုးပစ္စည်းများကို အသုံးပြု၍ သို့မဟုတ် စိတ်ကြိုက် သို့မဟုတ် စီးပွားဖြစ် ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါပေါ်တွင် ချစ်ပ်မော်ဒယ်များကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။
အူလမ်းကြောင်း epithelial morphogenesis ကိုလေ့လာရန် လူသားနှင့်သက်ဆိုင်သော စမ်းသပ်ပုံစံငယ်အချို့ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ အဓိကအားဖြင့် in vitro တွင် 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေရန် အကောင်အထည်ဖော်နိုင်သော protocol များမရှိခြင်းကြောင့်ဖြစ်သည်။ အမှန်မှာ၊ အူလမ်းကြောင်း morphogenesis အကြောင်း လက်ရှိဗဟုသုတအများစုသည် တိရစ္ဆာန်လေ့လာမှုများ (ဥပမာ zebrafish20၊ ကြွက်21 သို့မဟုတ် ကြက်22) ကို အခြေခံထားသည်။ သို့သော်၊ ၎င်းတို့သည် လုပ်အားနှင့် ကုန်ကျစရိတ်များစွာသုံးစွဲရပြီး ကျင့်ဝတ်အရ မေးခွန်းထုတ်စရာဖြစ်နိုင်ပြီး အရေးကြီးဆုံးမှာ လူသားဖွံ့ဖြိုးမှုလုပ်ငန်းစဉ်များကို တိကျစွာဆုံးဖြတ်ခြင်းမဟုတ်ပါ။ ဤပုံစံငယ်များသည် နည်းလမ်းပေါင်းစုံဖြင့် စမ်းသပ်နိုင်စွမ်းတွင်လည်း အလွန်ကန့်သတ်ထားသည်။ ထို့ကြောင့်၊ in vitro တွင် 3D တစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံများကို ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏ protocol သည် in vivo တိရစ္ဆာန်ပုံစံများအပြင် အခြားရိုးရာ static 2D ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုပုံစံများထက် သာလွန်ကောင်းမွန်ပါသည်။ ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ 3D epithelial ဖွဲ့စည်းပုံများကို အသုံးပြုခြင်းသည် mucosal သို့မဟုတ် ကိုယ်ခံအားလှုံ့ဆော်မှုအမျိုးမျိုးကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် crypt-villus ဝင်ရိုးရှိ ကွဲပြားသောဆဲလ်များ၏ spatial localization ကို စစ်ဆေးရန် ကျွန်ုပ်တို့အား ခွင့်ပြုခဲ့သည်။ 3D epithelial အလွှာများသည် host factors (ဥပမာ အတွင်းပိုင်းနှင့် အပြင်ပိုင်း အချွဲအလွှာများ၊ IgA နှင့် အဏုဇီဝပိုးများ peptides ထုတ်လွှတ်မှု)။ ထို့အပြင်၊ 3D epithelial morphology သည် အူလမ်းကြောင်း အဏုဇီဝပိုးမွှားများသည် ၎င်း၏ အသိုက်အဝန်းများကို မည်သို့ဖွဲ့စည်းပြီး basal crypts များတွင် ဆဲလ်အဖွဲ့အစည်းနှင့် ပင်မဆဲလ် niches များကို ပုံဖော်ပေးသည့် အဏုဇီဝဇီဝဖြစ်စဉ်များ (ဥပမာ၊ short-chain fatty acids) ကို မည်သို့ synergistically ထုတ်လုပ်သည်ကို နားလည်ရန် ကျွန်ုပ်တို့အား ခွင့်ပြုနိုင်သည်။ ဤအင်္ဂါရပ်များကို 3D epithelial အလွှာများကို in vitro တွင် တည်ဆောက်သည့်အခါတွင်သာ သရုပ်ပြနိုင်သည်။
3D အူလမ်းကြောင်း epithelial ဖွဲ့စည်းပုံများကို ဖန်တီးသည့် ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်းအပြင်၊ in vitro နည်းလမ်းများစွာရှိပါသည်။ အူလမ်းကြောင်း organoid ယဉ်ကျေးမှုသည် သတ်မှတ်ထားသော morphogen အခြေအနေများအောက်တွင် အူလမ်းကြောင်းပင်မဆဲလ်များ မွေးမြူခြင်းအပေါ် အခြေခံသည့် အဆင့်မြင့်တစ်ရှူးအင်ဂျင်နီယာနည်းပညာတစ်ခုဖြစ်သည်23,24,25။ သို့သော်၊ transport analysis သို့မဟုတ် host-microbiome co-cultures အတွက် 3D organoid မော်ဒယ်များကို အသုံးပြုခြင်းသည် အူလမ်းကြောင်း lumen သည် organoid တွင် ပိတ်မိနေပြီး ထို့ကြောင့် microbial ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် exogenous antigens ကဲ့သို့သော luminal အစိတ်အပိုင်းများကို မိတ်ဆက်ခြင်းသည် အကန့်အသတ်ရှိသောကြောင့် မကြာခဏစိန်ခေါ်မှုများပါသည်။ organoid lumens များသို့ဝင်ရောက်ခွင့်ကို microinjector26,27 ကို အသုံးပြု၍ တိုးတက်ကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်နိုင်သော်လည်း ဤနည်းလမ်းသည် ကျူးကျော်ဝင်ရောက်ပြီး လုပ်အားများစွာအသုံးပြုရပြီး လုပ်ဆောင်ရန် အထူးပြုအသိပညာလိုအပ်သည်။ ထို့အပြင်၊ static အခြေအနေများအောက်တွင် hydrogel scaffolds များတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော ရိုးရာ organoid ယဉ်ကျေးမှုများသည် in vivo biomechanics တွင် တက်ကြွသော အခြေအနေကို တိကျစွာထင်ဟပ်ခြင်းမရှိပါ။
သုတေသနအဖွဲ့များစွာမှ အသုံးပြုသော အခြားချဉ်းကပ်မှုများသည် ဂျယ်မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် သီးခြားလူသားအူလမ်းကြောင်းဆဲလ်များကို မွေးမြူခြင်းဖြင့် အူလမ်းကြောင်း epithelial ဖွဲ့စည်းပုံကို တုပရန် ကြိုတင်ဖွဲ့စည်းထားသော 3D hydrogel scaffolds များကို အသုံးပြုသည်။ 3D-printed၊ micro-milled သို့မဟုတ် lithographically fabricated မှိုများကို အသုံးပြု၍ hydrogel scaffolds များကို ဖန်တီးသည်။ ဤနည်းလမ်းသည် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ သက်ဆိုင်ရာ morphogen gradients များဖြင့် in vitro တွင် သီးခြား epithelial ဆဲလ်များ၏ ကိုယ်တိုင်စီစဉ်ထားသော အစီအစဉ်ကို ပြသပြီး scaffold တွင် stromal ဆဲလ်များပါဝင်ခြင်းဖြင့် မြင့်မားသော aspect ratio epithelial ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် stroma-epithelial crosstalk ကို ထူထောင်သည်။ သို့သော်၊ ကြိုတင်ဖွဲ့စည်းထားသော scaffolds များ၏ သဘောသဘာဝသည် spontaneous morphogenetic လုပ်ငန်းစဉ်ကိုယ်တိုင်၏ ပြသမှုကို တားဆီးနိုင်သည်။ ဤမော်ဒယ်များသည် အူလမ်းကြောင်းဆဲလ်များ morphogenesis ကို ဖြတ်သန်းပြီး ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ရရှိရန် လိုအပ်သော အရည် shear stress ချို့တဲ့ပြီး dynamic luminal သို့မဟုတ် interstitial flow ကိုလည်း မပေးဆောင်ပါ။ နောက်ထပ် မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတစ်ခုတွင် microfluidic platform တွင် hydrogel scaffolds များနှင့် laser-etching နည်းစနစ်များကို အသုံးပြု၍ ပုံစံချထားသော အူလမ်းကြောင်း epithelial ဖွဲ့စည်းပုံများတွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Mouse အူလမ်းကြောင်း organoids များသည် အူလမ်းကြောင်း tubular ဖွဲ့စည်းပုံများကို ဖွဲ့စည်းရန် ထွင်းထားသောပုံစံများကို လိုက်နာကြပြီး intraluminal အရည်စီးဆင်းမှုကို အသုံးပြု၍ ပြန်လည်စုစည်းနိုင်သည်။ microfluidics module။ သို့သော်၊ ဤမော်ဒယ်သည် spontaneous morphogenetic လုပ်ငန်းစဉ်များကို မပြသသကဲ့သို့ အူလမ်းကြောင်း စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုပ်ရှားမှုများလည်း မပါဝင်ပါ။ တူညီသောအုပ်စုမှ 3D printing နည်းပညာများသည် spontaneous morphogenetic လုပ်ငန်းစဉ်များဖြင့် သေးငယ်သော အူပြွန်များကို ဖန်တီးနိုင်ခဲ့သည်။ ပြွန်အတွင်း မတူညီသော အူလမ်းကြောင်း အပိုင်းအစများကို ရှုပ်ထွေးစွာ ဖန်တီးထားသော်လည်း၊ ဤမော်ဒယ်တွင် luminal fluid flow နှင့် mechanical deformation လည်း မရှိပါ။ ထို့အပြင်၊ မော်ဒယ်လည်ပတ်နိုင်စွမ်းသည် အထူးသဖြင့် bioprinting လုပ်ငန်းစဉ် ပြီးဆုံးပြီးနောက်၊ စမ်းသပ်မှုအခြေအနေများ သို့မဟုတ် ဆဲလ်မှဆဲလ် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို နှောင့်ယှက်ပြီးနောက် အကန့်အသတ်ရှိနိုင်သည်။ ယင်းအစား၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ အဆိုပြုထားသော protocol သည် spontaneous gut morphogenesis၊ ဇီဝကမ္မဗေဒအရ သက်ဆိုင်ရာ shear stress၊ gut motility ကို တုပသော biomechanics၊ လွတ်လပ်သော apical နှင့် basolateral compartments များ၏ accessibility နှင့် modularity ၏ ရှုပ်ထွေးသော ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ microenvironments များကို ပြန်လည်ဖန်တီးပေးပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ in vitro 3D morphogenesis protocol သည် ရှိပြီးသားနည်းလမ်းများ၏ စိန်ခေါ်မှုများကို ကျော်လွှားရန် ဖြည့်စွက်ချဉ်းကပ်မှုတစ်ခုကို ပေးစွမ်းနိုင်သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ပရိုတိုကောသည် 3D epithelial morphogenesis ပေါ်တွင် အပြည့်အဝအာရုံစိုက်ထားပြီး၊ epithelial ဆဲလ်များကိုသာ ပြုစုပျိုးထောင်ပြီး mesenchymal ဆဲလ်များ၊ endothelial ဆဲလ်များနှင့် immune ဆဲလ်များကဲ့သို့သော အခြားပတ်ဝန်းကျင်ဆဲလ်အမျိုးအစားများ မရှိပါ။ ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ပရိုတိုကော၏ အဓိကအချက်မှာ မိတ်ဆက်ထားသော medium ၏ basolateral ဘက်တွင် ထုတ်လွှတ်ထားသော morphogen inhibitors များကို ဖယ်ရှားခြင်းဖြင့် epithelial morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ gut-on-a-chip နှင့် hybrid-on-a-chip ၏ ခိုင်မာသော modularity သည် undulating 3D epithelial layer ကို ပြန်လည်ဖန်တီးနိုင်စေသော်လည်း၊ epithelial-mesenchymal interactions33,34၊ extracellular Matrix (ECM) deposition35 နှင့် ကျွန်ုပ်တို့၏မော်ဒယ်တွင် basal crypts ရှိ stem cell niches များကို ပို့ဆောင်ပေးသော crypt-villus အင်္ဂါရပ်များကဲ့သို့သော နောက်ထပ်ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာရှုပ်ထွေးမှုများကို နောက်ထပ်စဉ်းစားရန်ကျန်ရှိနေသေးသည်။ mesenchyme ရှိ Stromal ဆဲလ်များ (ဥပမာ၊ fibroblasts) သည် ECM ပရိုတင်းများထုတ်လုပ်မှုနှင့် vivo တွင် အူလမ်းကြောင်း morphogenesis ကို ထိန်းညှိရာတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်35,37,38။ mesenchymal ထည့်သွင်းခြင်း ကျွန်ုပ်တို့၏မော်ဒယ်သို့ဆဲလ်များသည် morphogenetic လုပ်ငန်းစဉ်နှင့်ဆဲလ်ချိတ်ဆက်မှုထိရောက်မှုကိုမြှင့်တင်ပေးခဲ့သည်။ endothelial အလွှာ (ဆိုလိုသည်မှာ capillaries သို့မဟုတ် lymphatics) သည်အူလမ်းကြောင်း microenvironment တွင် molecular transport39 နှင့် immune cell recruitment40 ကိုထိန်းညှိရာတွင်အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်သည်။ ထို့အပြင်၊ တစ်ရှူးမော်ဒယ်များကို multi-organ interactions ကိုသရုပ်ပြရန်ဒီဇိုင်းထုတ်သောအခါတွင်တစ်ရှူးမော်ဒယ်များအကြားချိတ်ဆက်နိုင်သော vasculature အစိတ်အပိုင်းများသည်ကြိုတင်လိုအပ်ချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ အင်္ဂါအဆင့် resolution ဖြင့်ပိုမိုတိကျသောဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာအင်္ဂါရပ်များကိုပုံစံပြုရန် endothelial ဆဲလ်များကိုထည့်သွင်းရန်လိုအပ်နိုင်သည်။ လူနာမှဆင်းသက်လာသော immune ဆဲလ်များသည်အူလမ်းကြောင်းရောဂါကိုတုပခြင်းဆိုင်ရာအခြေအနေတွင် innate immune responses၊ antigen presentation၊ innate adaptive immune crosstalk နှင့် tissue-specific immune ကိုပြသရန်အတွက်လည်းအရေးကြီးပါသည်။
hybrid chips များအသုံးပြုမှုသည် gut-on-a-chip ထက်ပိုမိုရိုးရှင်းပါသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် device setup သည်ပိုမိုရိုးရှင်းပြီး Transwell inserts များကိုအသုံးပြုခြင်းသည် gut epithelium ၏ scalable culture ကိုခွင့်ပြုသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ သို့သော်၊ polyester membranes ပါရှိသောစီးပွားဖြစ်ရရှိနိုင်သော Transwell inserts များသည် elastic မဟုတ်ပြီး peristaltic ကဲ့သို့သောလှုပ်ရှားမှုများကိုတုပ၍မရပါ။ ထို့အပြင်၊ hybrid chip တွင်ထားရှိသော Transwell insert ၏ apical compartment သည် apical ဘက်ခြမ်းတွင် shear stress မရှိဘဲ တည်ငြိမ်နေခဲ့သည်။ apical compartment ရှိ static properties များသည် hybrid chips များတွင်ရေရှည်ဘက်တီးရီးယား co-culture ကိုရှားရှားပါးပါးသာဖြစ်စေသည်။ hybrid chips များကိုအသုံးပြုသောအခါ Transwell inserts များတွင် 3D morphogenesis ကိုကျွန်ုပ်တို့ခိုင်မာစွာဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သော်လည်း၊ ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့်သက်ဆိုင်သော biomechanics နှင့် apical fluid flow ရှားပါးမှုသည် အလားအလာရှိသော application များအတွက် hybrid chip platform များ၏ဖြစ်နိုင်ခြေကိုကန့်သတ်နိုင်သည်။
gut-on-a-chip နှင့် hybrid-on-a-chip ယဉ်ကျေးမှုများတွင် human crypt-villus axis ၏ အပြည့်အဝပြန်လည်တည်ဆောက်မှုများကို အပြည့်အဝမတည်ဆောက်ရသေးပါ။ morphogenesis သည် epithelial monolayer မှစတင်သောကြောင့်၊ 3D microarchitectures များသည် in vivo crypts နှင့် morphological similarity ကို မပေးစွမ်းနိုင်ပါ။ microengineered 3D epithelium ရှိ basal crypt domain အနီးတွင် proliferating cell population ကို ကျွန်ုပ်တို့ သွင်ပြင်လက္ခဏာပြသော်လည်း၊ crypt နှင့် villous ဒေသများကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း ပိုင်းခြားထားခြင်းမရှိပါ။ chip ရှိ အပေါ်ပိုင်း channel များ မြင့်မားခြင်းကြောင့် microengineered epithelium ၏ အမြင့် တိုးလာသော်လည်း၊ အများဆုံး အမြင့်မှာ ~300–400 µm အထိ ကန့်သတ်ထားဆဲဖြစ်သည်။ အူသိမ်နှင့် အူမကြီးရှိ လူ့အူသိမ် crypts များ၏ တကယ့်အနက်မှာ ~135 µm နှင့် ~400 µm အသီးသီးဖြစ်ပြီး၊ အူသိမ် villi ၏ အမြင့်မှာ ~600 µm41 ဖြစ်သည်။
ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းရှုထောင့်မှကြည့်လျှင် 3D မိုက်ခရိုဗိသုကာများ၏ in situ super-resolution ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းကို ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းအတွင်းသာ ကန့်သတ်ထားနိုင်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် objective lens မှ epithelial layer အထိ လိုအပ်သော အလုပ်လုပ်သည့်အကွာအဝေးသည် မီလီမီတာအနည်းငယ်ခန့်ရှိသည်။ ဤပြဿနာကို ကျော်လွှားရန်အတွက် ဝေးလံသော objective တစ်ခု လိုအပ်နိုင်သည်။ ထို့အပြင်၊ ပုံရိပ်ဖော်နမူနာပြင်ဆင်မှုအတွက် ပါးလွှာသောအပိုင်းများပြုလုပ်ခြင်းသည် PDMS ၏ မြင့်မားသော elasticity ကြောင့် စိန်ခေါ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။ ထို့အပြင်၊ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်း၏ အလွှာလိုက် microfabrication တွင် အလွှာတစ်ခုစီကြားတွင် အမြဲတမ်းကပ်ငြိမှုပါဝင်သောကြောင့် epithelial layer ၏ မျက်နှာပြင်ဖွဲ့စည်းပုံကို စစ်ဆေးရန် အပေါ်ယံအလွှာကို ဖွင့်ရန် သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားရန် အလွန်စိန်ခေါ်မှုရှိသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ scanning electron microscope (SEM) ကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့်။
PDMS ၏ hydrophobicity သည် hydrophobic မော်လီကျူးငယ်များကို ကိုင်တွယ်ဖြေရှင်းသည့် microfluidic-based လေ့လာမှုများတွင် အကန့်အသတ်ဖြစ်စေသောအချက်တစ်ခုဖြစ်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် PDMS သည် ထိုကဲ့သို့သော hydrophobic မော်လီကျူးများကို အတိအကျမစုပ်ယူနိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။ PDMS အတွက် အခြားရွေးချယ်စရာများကို အခြားပိုလီမာပစ္စည်းများဖြင့် ထည့်သွင်းစဉ်းစားနိုင်သည်။ တနည်းအားဖြင့် PDMS ၏ မျက်နှာပြင်ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်း (ဥပမာ၊ lipophilic ပစ္စည်းများ 42 သို့မဟုတ် poly(ethylene glycol) 43 ဖြင့် အပေါ်ယံလွှာ) သည် hydrophobic မော်လီကျူးများ စုပ်ယူမှုကို လျှော့ချရန် ထည့်သွင်းစဉ်းစားနိုင်သည်။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့၊ ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့နည်းလမ်းဟာ မြင့်မားတဲ့ throughput စစ်ဆေးခြင်း ဒါမှမဟုတ် “one-size-fits-all” အသုံးပြုသူ-လွယ်ကူတဲ့ စမ်းသပ်ပလက်ဖောင်းကို ပေးအပ်ရာမှာ ကောင်းစွာ သွင်ပြင်လက္ခဏာ မပြသေးပါဘူး။ လက်ရှိပရိုတိုကောဟာ CO2 incubator မှာ နေရာယူထားပြီး ကြီးမားတဲ့ စမ်းသပ်မှုတွေကို တားဆီးပေးတဲ့ microdevice တစ်ခုစီအတွက် ဆေးထိုးအပ်ပန့်တစ်ခု လိုအပ်ပါတယ်။ ဒီကန့်သတ်ချက်ကို ဆန်းသစ်တဲ့ culture formats တွေရဲ့ တိုးချဲ့နိုင်မှု (ဥပမာ၊ basolateral media တွေကို စဉ်ဆက်မပြတ် ပြန်လည်ဖြည့်တင်းပြီး ဖယ်ရှားခွင့်ပြုတဲ့ 24-well၊ 96-well ဒါမှမဟုတ် 384-well porous insert တွေ) အားဖြင့် သိသိသာသာ တိုးတက်ကောင်းမွန်အောင် လုပ်ဆောင်နိုင်ပါတယ်။
in vitro တွင် လူ့အူလမ်းကြောင်း epithelium ၏ 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် lumen-capillary interface ကိုဖန်တီးရန် parallel microchannels နှစ်ခုနှင့် elastic porous membrane တစ်ခုကြားတွင်ပါ ၀ င်သော microfluidic chip အူလမ်းကြောင်းကိရိယာကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ Transwell inserts များပေါ်တွင်ကြီးထွားသော polarized epithelial layers များအောက်တွင် basolateral flow ကိုစဉ်ဆက်မပြတ်ပေးစွမ်းသည့် single-channel microfluidic device (hybrid chip) ကိုအသုံးပြုခြင်းကိုကျွန်ုပ်တို့သရုပ်ပြသည်။ platform နှစ်ခုလုံးတွင်၊ basolateral compartment မှ morphogen antagonists များကိုဖယ်ရှားရန်စီးဆင်းမှု၏ directional manipulation ကို အသုံးပြု၍ မတူညီသောလူ့အူလမ်းကြောင်း epithelial ဆဲလ်များ၏ morphogenesis ကိုသရုပ်ပြနိုင်သည်။ စမ်းသပ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုလုံး (ပုံ ၁) တွင်အပိုင်းငါးပိုင်းပါဝင်သည်- (i) gut chip သို့မဟုတ် Transwell insertable hybrid chip ၏ microfabrication (အဆင့် ၁-၅၊ Box ၁)၊ (ii) အူလမ်းကြောင်း epithelial ဆဲလ်များ (Caco-2 ဆဲလ်များ) သို့မဟုတ်လူ့အူလမ်းကြောင်း organoids များကိုပြင်ဆင်ခြင်း။ လေးထောင့်ကွက် ၂-၅)၊ (iii) အူလမ်းကြောင်း epithelial ဆဲလ်များကို အူလမ်းကြောင်းချစ်ပ်များ သို့မဟုတ် hybrid chips များပေါ်တွင် မွေးမြူခြင်း (အဆင့် ၆-၉)၊ (iv) in vitro တွင် 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေခြင်း (အဆင့် ၁၀) နှင့် (v) ) 3D epithelial microstructure ကို သွင်ပြင်လက္ခဏာဖော်ပြရန် (အဆင့် ၁၁-၂၄)။ နောက်ဆုံးတွင်၊ epithelial morphogenesis ကို spatial၊ temporal၊ conditional သို့မဟုတ် procedural controls များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းဖြင့် in vitro morphogenesis ၏ ထိရောက်မှုကို အတည်ပြုရန် သင့်လျော်သော control group (အောက်တွင် ဆက်လက်ဆွေးနွေးထားသည်) ကို ဒီဇိုင်းထုတ်ခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ယဉ်ကျေးမှုပလက်ဖောင်းနှစ်ခုကို အသုံးပြုခဲ့သည်- ဖြောင့်တန်းသောလမ်းကြောင်းများပါသည့် gut-on-a-chip သို့မဟုတ် nonlinear convoluted channels များ သို့မဟုတ် microfluidic device တွင် Transwell (TW) ထည့်သွင်းမှုများပါရှိသော hybrid chips များကို Box 1 တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ပြုလုပ်ထားပြီး အဆင့် 1 -5 တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ပြုလုပ်ထားသည်။ “Device Fabrication” သည် single chip သို့မဟုတ် hybrid chip ပြုလုပ်ရာတွင် အဓိကအဆင့်များကို ပြသထားသည်။ “Culture of Human Intestinal Epithelial Cells” သည် ဆဲလ်ရင်းမြစ် (Caco-2 သို့မဟုတ် human intestinal organoids) နှင့် ဤပရိုတိုကောတွင် အသုံးပြုသည့် ယဉ်ကျေးမှုလုပ်ငန်းစဉ်ကို ရှင်းပြသည်။ “In vitro morphogenesis” သည် Caco-2 သို့မဟုတ် organoid မှဆင်းသက်လာသော epithelial ဆဲလ်များကို အူလမ်းကြောင်း chip သို့မဟုတ် hybrid chip ၏ Transwell ထည့်သွင်းမှုများတွင် မွေးမြူသည့် အလုံးစုံအဆင့်များကို ပြသထားပြီး 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ထူးခြားသော epithelial ဖွဲ့စည်းပုံကို ဖွဲ့စည်းသည်။ ပရိုဂရမ်အဆင့်နံပါတ် သို့မဟုတ် box နံပါတ်ကို မြားတစ်ခုစီအောက်တွင် ပြသထားသည်။ အပလီကေးရှင်းသည် တည်ထောင်ထားသော အူလမ်းကြောင်း epithelial အလွှာများကို မည်သို့အသုံးပြုနိုင်ပုံ ဥပမာများကို ပေးသည်၊ ဥပမာအားဖြင့် ဆဲလ်ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း၊ အူဇီဝကမ္မဗေဒလေ့လာမှုများ၊ host-microbiome ဂေဟစနစ်များတည်ထောင်ခြင်းနှင့် ရောဂါများတွင်။ မော်ဒယ်လ်။ “ဆဲလ်ကွဲပြားမှု” ရှိ Immunofluorescence ပုံများသည် အူလမ်းကြောင်းချစ်ပ်ပေါ်တွင် ထုတ်လုပ်ထားသော 3D Caco-2 epithelial အလွှာတွင် nuclei၊ F-actin နှင့် MUC2 တို့ကို ပြသထားသည်။ MUC2 အချက်ပြမှုသည် goblet ဆဲလ်များနှင့် mucosal မျက်နှာပြင်များမှ ထုတ်လွှတ်သော mucus တွင် ရှိနေသည်။ Gut Physiology ရှိ fluorescent ပုံများသည် fluorescent wheat germ agglutinin ကို အသုံးပြု၍ sialic acid နှင့် N-acetylglucosamine residues များအတွက် staining ဖြင့် ထုတ်လုပ်ထားသော mucus ကို ပြသထားသည်။ “Host-Microbe Co-Cultures” ရှိ ထပ်နေသော ပုံနှစ်ပုံသည် ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းရှိ ကိုယ်စားပြု host-microbiome co-cultures များကို ပြသထားသည်။ ဘယ်ဘက် panel သည် microengineered 3D Caco-2 epithelial ဆဲလ်များနှင့်အတူ E. coli ဖော်ပြသော အစိမ်းရောင် fluorescent protein (GFP) ၏ co-culture ကို ပြသထားသည်။ ညာဘက် panel သည် 3D Caco-2 epithelial ဆဲလ်များနှင့် co-culture လုပ်ထားသော GFP E. coli ၏ localization ကို ပြသထားပြီး F-actin (အနီရောင်) နှင့် nuclei (အပြာရောင်) ဖြင့် immunofluorescence staining ပြုလုပ်သည်။ ရောဂါမော်ဒယ်လ်သည် ကျန်းမာသော အူလမ်းကြောင်းနှင့် ယိုစိမ့်နေသော အူလမ်းကြောင်းကို ပြသသည်။ ဘက်တီးရီးယား အင်တီဂျင်များ (ဥပမာ၊ lipopolysaccharide၊ LPS) နှင့် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များ (ဥပမာ၊ PBMC၊ အစိမ်းရောင်) တို့ဖြင့် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ စိန်ခေါ်မှုအောက်တွင် အူလမ်းကြောင်း ရောင်ရမ်းမှု ချစ်ပ်များ ရှိနေသည်။ Caco-2 ဆဲလ်များကို 3D epithelial အလွှာတစ်ခု တည်ထောင်ရန် မွေးမြူခဲ့သည်။ စကေးဘား၊ 50 µm။ အောက်ဆုံးတန်းရှိ ရုပ်ပုံများ- ကိုးကားချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြုပြင်ထားသော “ဆဲလ်များ၏ ကွဲပြားခြင်း”။၂။ Oxford University Press; ကိုးကားချက် ၅ မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ထားသည်။ NAS; “Host-Microbe Co-Culture” ကို ကိုးကားချက် ၃ မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြုပြင်ထားသည်။ NAS; “Disease Modeling” ကို ကိုးကားချက် ၅ မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြုပြင်ထားသည်။ NAS။
gut-on-chip နှင့် hybrid chip နှစ်မျိုးလုံးကို ဆီလီကွန်မှိုများမှ ပျော့ပျောင်းသော lithography1,44 ဖြင့် ဖြုတ်ပြီး SU-8 ဖြင့် ပုံစံချထားသော PDMS မိတ္တူများကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ထားသည်။ ချစ်ပ်တစ်ခုစီရှိ microchannels များ၏ ဒီဇိုင်းကို shear stress နှင့် hydrodynamic pressure1,4,12 ကဲ့သို့သော hydrodynamics များကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်သည်။ မူရင်း gut-on-a-chip ဒီဇိုင်း (Extended Data Fig. 1a) သည် juxtaposed parallel straight microchannels နှစ်ခုပါဝင်သည့် ရှုပ်ထွေးသော gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲလာပြီး curved microchannels တစ်စုံပါဝင်သည့် ရှုပ်ထွေးသော gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲလာပြီး fluid residence time၊ nonlinear flow patterns နှင့် cultured cells များ၏ multiaxial deformation တို့ကို တိုးမြှင့်ဖြစ်ပေါ်စေသည် (ပုံ 2a–f)12။ ပိုမိုရှုပ်ထွေးသော gut biomechanics များကို ပြန်လည်ဖန်တီးရန် လိုအပ်သည့်အခါ complex gut-on-a-chips များကို ရွေးချယ်နိုင်သည်။ convoluted Gut-Chip သည် epithelial ကြီးထွားမှုအဆင့်တူသော အလားတူအချိန်ဘောင်တွင် 3D morphogenesis ကိုလည်း အားကောင်းစွာ လှုံ့ဆော်ပေးကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြခဲ့ပြီးဖြစ်သည်။ မူရင်း Gut-Chip၊ ပျိုးထောင်ထားသောဆဲလ်အမျိုးအစားမည်သို့ပင်ရှိစေကာမူ။ ထို့ကြောင့်၊ 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက်၊ linear နှင့်ရှုပ်ထွေးသော on-chip gut ဒီဇိုင်းများကိုလဲလှယ်နိုင်သည်။ SU-8 ပုံစံများပါသော ဆီလီကွန်မှိုများပေါ်တွင် ကုသထားသော PDMS မိတ္တူများသည် ဖြုတ်ပြီးနောက် အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သောအင်္ဂါရပ်များကို ပေးစွမ်းခဲ့သည် (ပုံ ၂က)။ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ gut ကို ထုတ်လုပ်ရန်အတွက်၊ ပြင်ဆင်ထားသော အပေါ်ပိုင်း PDMS အလွှာကို porous PDMS ဖလင်နှင့် အစဉ်လိုက်ချိတ်ဆက်ပြီးနောက် corona treater ကို အသုံးပြု၍ မပြောင်းလဲနိုင်သော ချည်နှောင်မှုဖြင့် အောက်ပိုင်း PDMS အလွှာနှင့် ချိန်ညှိခဲ့သည် (ပုံ ၂ခ-စ)။ hybrid ချစ်ပ်များ ထုတ်လုပ်ရန်အတွက်၊ ကုသထားသော PDMS မိတ္တူများကို ဖန်ဆလိုက်များနှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး Transwell ထည့်သွင်းမှုများကို ထားရှိနိုင်သည့် single-channel microfluidic ကိရိယာများကို ဖန်တီးခဲ့သည် (ပုံ ၂ဇ နှင့် Extended Data ပုံ ၂)။ ချိတ်ဆက်မှုလုပ်ငန်းစဉ်ကို PDMS မိတ္တူနှင့် ဖန်၏မျက်နှာပြင်များကို အောက်ဆီဂျင်ပလာစမာ သို့မဟုတ် corona ကုသမှုဖြင့် ကုသခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်သည်။ ဆီလီကွန်ပြွန်နှင့် တွဲထားသော microfabricated device ကို ပိုးသတ်ပြီးနောက်၊ device setup သည် အူလမ်းကြောင်း epithelium ၏ 3D morphogenesis ကို လုပ်ဆောင်ရန် အသင့်ဖြစ်နေပြီ (ပုံ ၂ဆ)။
a, SU-8 ပုံစံ ဆီလီကွန်မှိုများမှ PDMS အစိတ်အပိုင်းများ ပြင်ဆင်ခြင်း၏ ပုံကြမ်းသရုပ်ဖော်ပုံ။ မကုသရသေးသော PDMS အရည်ကို ဆီလီကွန်မှိုပေါ်သို့ လောင်းထည့်ကာ (ဘယ်ဘက်) 60 °C (အလယ်) တွင် ကုသပြီး ပုံကြမ်းဖြုတ် (ညာဘက်)။ ပုံကြမ်းဖြုတ်ထားသော PDMS ကို အပိုင်းပိုင်းဖြတ်၍ နောက်ထပ်အသုံးပြုရန် သန့်စင်သည်။b, PDMS အပေါ်လွှာကို ပြင်ဆင်ရန်အသုံးပြုသော ဆီလီကွန်မှို၏ ဓာတ်ပုံ။c, PDMS porous membrane ကို ပြုလုပ်ရန်အသုံးပြုသော ဆီလီကွန်မှို၏ ဓာတ်ပုံ။d, အပေါ်နှင့်အောက် PDMS အစိတ်အပိုင်းများနှင့် စုစည်းထားသော ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းကိရိယာ၏ ဓာတ်ပုံစီးရီး။e, အပေါ်၊ အမြှေးပါးနှင့် အောက် PDMS အစိတ်အပိုင်းများ၏ ချိန်ညှိမှုပုံကြမ်း။ အလွှာတစ်ခုစီကို plasma သို့မဟုတ် corona ကုသမှုဖြင့် မပြောင်းလဲနိုင်စွာ ချိတ်ဆက်ထားသည်။f, အပေါ်ယံလွှာပေါ်တွင် တည်ဆောက်ထားသော gut-on-a-chip ကိရိယာ၏ ပုံကြမ်း။g, microfluidic ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုအတွက် gut-on-a-chip တပ်ဆင်ခြင်း။ ဆီလီကွန်ပြွန်နှင့် ဆေးထိုးအပ်ဖြင့် စုစည်းထားသော ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ ပြုလုပ်ထားသော gut ကို အဖုံးပေါ်တွင် ထားရှိသည်။ ချစ်ပ်ကိရိယာကို ပေါ်တွင် ထားရှိသည်။ ၁၅၀ မီလီမီတာ Petri ပန်းကန်လုံး၏ အဖုံးကို ပြုပြင်ရန်အတွက် အသုံးပြုသည်။ binder ကို ဆီလီကွန်ပြွန်ကို ပိတ်ရန် အသုံးပြုသည်။h၊ hybrid chips များကို အသုံးပြု၍ hybrid chips များ ထုတ်လုပ်ခြင်းနှင့် 3D morphogenesis ၏ မြင်ကွင်းဓာတ်ပုံများ။ အူလမ်းကြောင်း epithelial ဆဲလ်များ၏ 2D monolayers များကို hybrid chip ထဲသို့ ထည့်သွင်း၍ အူလမ်းကြောင်း 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ Transwell insert တွင် တည်ဆောက်ထားသော ဆဲလ်အလွှာအောက်ရှိ microchannels များမှတစ်ဆင့် medium ကို ပျံ့နှံ့စေသည်။ Scale bar၊ 1 cm.h ကိုးကားချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြန်လည်ရိုက်နှိပ်ထားသည်။၄။ Elsevier။
ဤပရိုတိုကောတွင်၊ Caco-2 ဆဲလ်လိုင်းနှင့် အူလမ်းကြောင်း organoids များကို epithelial အရင်းအမြစ်များအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ 3a)။ ဆဲလ်အမျိုးအစားနှစ်မျိုးလုံးကို သီးခြားစီမွေးမြူခဲ့သည် (Box 2 နှင့် Box 5) နှင့် on-chip gut သို့မဟုတ် Transwell insert များ၏ ECM-coated microchannels များကို seed လုပ်ရန်အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဆဲလ်များသည် confluent ဖြစ်သောအခါ (flasks များတွင် >95% coverage)၊ T-flasks ရှိ ပုံမှန်မွေးမြူထားသော Caco-2 ဆဲလ်များ (passages 10 နှင့် 50 ကြား) ကို trypsinization fluid ဖြင့် ကွဲထွက်နေသော ဆဲလ်ဆိုင်းထိန်းစနစ်များကို ပြင်ဆင်ရန် စုဆောင်းသည် (box 2)။ အူလမ်းကြောင်း biopsies သို့မဟုတ် ခွဲစိတ်ဖြတ်တောက်မှုများမှ လူ့အူလမ်းကြောင်း organoids များကို Matrigel scaffold domes များတွင် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ microenvironment ကို ထောက်ပံ့ရန် 24-well plates များရှိ မွေးမြူခဲ့သည်။ မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော morphogens (Wnt၊ R-spondin နှင့် Noggin ကဲ့သို့) နှင့် Box 3 တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ပြင်ဆင်ထားသော growth factors များပါ၀င်သော medium ကို organoids များ အချင်း 500 µm အထိ ကြီးထွားလာသည်အထိ တစ်ရက်ခြားတစ်ကြိမ် ဖြည့်စွက်ခဲ့သည်။ အပြည့်အဝကြီးထွားလာသော organoids များကို စုဆောင်းပြီး single များအဖြစ် ခွဲထုတ်သည် အူလမ်းကြောင်းပေါ်တွင် စိုက်ရန်ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ Transwell ထည့်သွင်းမှုများ (Box 5)။ ကျွန်ုပ်တို့ယခင်က ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ ၎င်းကို ရောဂါအမျိုးအစား 12,13 (ဥပမာ ulcerative colitis၊ Crohn's ရောဂါ၊ အူမကြီးကင်ဆာ သို့မဟုတ် ပုံမှန်အလှူရှင်)၊ အနာနေရာ (ဥပမာ၊ အနာနှင့် အနာမရှိသောနေရာ) နှင့် လမ်းကြောင်းရှိ အစာအိမ်နှင့်အူလမ်းကြောင်းတည်နေရာ (ဥပမာ၊ duodenum၊ jejunum၊ ileum၊ cecum၊ colon သို့မဟုတ် rectum) အရ ခွဲခြားနိုင်သည်။ အူသိမ် organoids များထက် morphogens များ ပိုမိုပါဝင်မှု လိုအပ်သည့် အူမကြီး organoids (coloids) များကို မွေးမြူရန်အတွက် Box 5 တွင် အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသော protocol ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပေးထားပါသည်။
(က)၊ အူချစ်ပ်တွင် အူလမ်းကြောင်း morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက် လုပ်ငန်းစဉ်။ Caco-2 လူ့အူလမ်းကြောင်း epithelium နှင့် အူလမ်းကြောင်း organoids များကို 3D morphogenesis ကို သရုပ်ပြရန် ဤပရိုတိုကောတွင် အသုံးပြုသည်။ သီးခြား epithelial ဆဲလ်များကို ပြင်ဆင်ထားသော အူလမ်းကြောင်းပေါ်ရှိ ချစ်ပ်ကိရိယာ (ချစ်ပ်ပြင်ဆင်မှု) တွင် စိုက်ထည့်ခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို 0 ရက် (D0) တွင် PDMS porous membrane နှင့် စိုက်ပြီးသည်နှင့် apical (AP) စီးဆင်းမှုကို ပထမ 2 ရက် (စီးဆင်းမှု၊ AP၊ D0-D2) အတွက် စတင်ပြီး ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ပြီးပြည့်စုံသော 2D monolayer ဖွဲ့စည်းသောအခါ Basolateral (BL) စီးဆင်းမှုကိုလည်း cyclic stretching motions (stretch၊ flow၊ AP နှင့် BL) နှင့်အတူ စတင်သည်။ microfluidic culture (morphogenesis၊ D5) 5 ရက်အကြာတွင် အူလမ်းကြောင်း 3D morphogenesis သည် အလိုအလျောက်ဖြစ်ပေါ်သည်။ phase contrast images များသည် စမ်းသပ်မှုအဆင့် သို့မဟုတ် အချိန်အမှတ်တစ်ခုစီတွင် Caco-2 ဆဲလ်များ၏ ကိုယ်စားပြု morphology ကိုပြသသည် (bar graph၊ 100 µm)။ အူလမ်းကြောင်း၏ သက်ဆိုင်ရာ cascade များကို သရုပ်ဖော်သည့် schematic diagram လေးခု morphogenesis (ညာဘက်အပေါ်ထောင့်)။ ပုံကြမ်းရှိ အစက်ချမြှားများသည် အရည်စီးဆင်းမှု၏ ဦးတည်ရာကို ကိုယ်စားပြုသည်။b၊ တည်ထောင်ပြီးသော 3D Caco-2 epithelium ၏ မျက်နှာပြင် topology ကိုပြသသော SEM ပုံ (ဘယ်ဘက်)။ ချဲ့ထားသောဧရိယာကို မီးမောင်းထိုးပြထားသော inset (အဖြူရောင် အစက်ချမြှား) သည် 3D Caco-2 အလွှာ (ညာဘက်) ရှိ ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ထားသော microvilli ကို ပြသသည်။c၊ တည်ထောင်ပြီးသော Caco-2 3D ၏ အလျားလိုက် ရှေ့မျက်နှာစာ၊ claudin (ZO-1၊ အနီရောင်) နှင့် F-actin (အစိမ်းရောင်) နှင့် nuclei (အပြာရောင်) ဟု အညွှန်းတပ်ထားသော စဉ်ဆက်မပြတ် brush border အမြှေးပါးများ၏ အလျားလိုက် ရှေ့မျက်နှာစာ အူလမ်းကြောင်းချစ်ပ်များပေါ်ရှိ epithelial ဆဲလ်များ၏ Immunofluorescence confocal visualization။ အလယ်ပုံကြမ်းသို့ ညွှန်ပြနေသော မြှားများသည် confocal view တစ်ခုစီအတွက် focal plane ၏ တည်နေရာကို ညွှန်ပြသည်။d၊ ၃၊ ၇၊ ၉၊ ၁၁ နှင့် ၁၃ ရက်များတွင် phase contrast microscopy ဖြင့် ရရှိသော ချစ်ပ်ပေါ်တွင် ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော organoids များတွင် morphological ပြောင်းလဲမှုများ၏ အချိန်ကာလ။ inset (ညာဘက်အပေါ်ထောင့်) သည် ပေးထားသောပုံ၏ မြင့်မားသော ချဲ့ထွင်မှုကို ပြသသည်။e၊ တည်ထောင်ပြီးသော organoid 3D epithelium ၏ DIC photomicrograph ၇ ရက်မြောက်နေ့တွင် ရိုက်ကူးထားသော အချပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းတွင်။f၊ ပင်မဆဲလ်များ (LGR5; magenta)၊ goblet ဆဲလ်များ (MUC2; အစိမ်းရောင်)၊ F-actin (မီးခိုးရောင်) နှင့် nuclei (cyan) အတွက် markers များကို ပြသသည့် overlaid immunofluorescence ပုံများသည် အူလမ်းကြောင်းချစ်ပ်များပေါ်တွင် ၃ ရက်ကြာ ကြီးထွားစေပြီး epithelial အလွှာပေါ်ရှိ ၁၃ ရက်ကြာ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ၁၃ ရက်ကြာ (အလယ်) organoids များကို အသီးသီးပြသသည်။ MUC2 signaling မပါဘဲ LGR5 signaling ကို မီးမောင်းထိုးပြသည့် Extended Data Figure 3 ကိုလည်းကြည့်ပါ။ ၁၃ ရက်မြောက်နေ့တွင် plasma membrane ကို CellMask dye (ညာဘက်) ဖြင့် ဆိုးဆေးဖြင့် ဆိုးခြင်းဖြင့် ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းတွင် တည်ဆောက်ထားသော 3D organoid epithelium ၏ epithelial microstructure (ညာဘက်) ကိုပြသသည့် fluorescence ပုံများ။ အခြားနည်းဖြင့် မဖော်ပြထားပါက စကေးဘားသည် 50 μm ဖြစ်သည်။b ကိုးကားချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြန်လည်ရိုက်နှိပ်ထားသည်။၂။ Oxford University Press; c ကိုးကားချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြုပြင်ထားသည်။၂။ Oxford University Press; e နှင့် f ကိုးကားချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြုပြင်ထားသည်။၁၂ Creative Commons လိုင်စင်အောက်တွင် CC BY 4.0။
ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းတွင်၊ ECM အလွှာကို အောင်မြင်စွာဖုံးအုပ်နိုင်ရန်အတွက် PDMS အပေါက်များသော အမြှေးပါး၏ hydrophobic မျက်နှာပြင်ကို ပြုပြင်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ ဤပရိုတိုကောတွင်၊ PDMS အမြှေးပါးများ၏ hydrophobicity ကို ပြုပြင်ရန် နည်းလမ်းနှစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ အသုံးပြုပါသည်။ Caco-2 ဆဲလ်များကို မွေးမြူရန်အတွက်၊ UV/ozone ကုသမှုဖြင့် မျက်နှာပြင် activation တစ်ခုတည်းသည် PDMS မျက်နှာပြင်၏ hydrophobicity ကို လျှော့ချရန်၊ ECM ကို ဖုံးအုပ်ရန်နှင့် Caco-2 ဆဲလ်များကို PDMS အမြှေးပါးနှင့် ချိတ်ဆက်ရန် လုံလောက်ပါသည်။ သို့သော်၊ organoid epithelium ၏ microfluidic ယဉ်ကျေးမှုသည် polyethyleneimine (PEI) နှင့် glutaraldehyde ကို PDMS microchannels များသို့ အဆက်မပြတ်အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ECM ပရိုတင်းများ၏ ထိရောက်သော စုပုံမှုကို ရရှိရန် ဓာတုဗေဒအခြေခံ မျက်နှာပြင်လုပ်ဆောင်ချက် လိုအပ်ပါသည်။ မျက်နှာပြင်ပြုပြင်မွမ်းမံပြီးနောက်၊ ECM ပရိုတင်းများကို လုပ်ဆောင်နိုင်သော PDMS မျက်နှာပြင်ကို ဖုံးအုပ်ရန် အပ်နှံပြီးနောက် သီးခြား organoid epithelium ထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို ချိတ်ဆက်ပြီးနောက်၊ microfluidic ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုသည် ဆဲလ်များသည် monolayer အပြည့်အစုံဖွဲ့စည်းသည်အထိ အပေါ်ပိုင်း microchannel ထဲသို့ medium ကိုသာ ထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် စတင်ပြီး အောက်ပိုင်း microchannel သည် static condition များကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ မျက်နှာပြင် activation နှင့် ECM အလွှာအတွက် ဤအကောင်းဆုံးနည်းလမ်းသည် organoid epithelium ကို ချိတ်ဆက်နိုင်စေပါသည်။ PDMS မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် 3D morphogenesis ကိုဖြစ်ပေါ်စေရန်။
Transwell ယဉ်ကျေးမှုများသည် ဆဲလ်များ စိုက်ပျိုးခြင်းမပြုမီ ECM အပေါ်ယံလွှာ လိုအပ်ပါသည်။ သို့သော် Transwell ယဉ်ကျေးမှုများသည် porous insert များ၏ မျက်နှာပြင်ကို အသက်ဝင်စေရန် ရှုပ်ထွေးသော ကြိုတင်ကုသမှု အဆင့်များ မလိုအပ်ပါ။ Transwell insert များပေါ်တွင် Caco-2 ဆဲလ်များ ကြီးထွားစေရန်အတွက် porous insert များပေါ်တွင် ECM အပေါ်ယံလွှာသည် ကွဲကွာနေသော Caco-2 ဆဲလ်များ တွယ်ကပ်ခြင်း (<1 နာရီ) နှင့် tight junction barrier ဖွဲ့စည်းခြင်း (<1-2 ရက်) ကို အရှိန်မြှင့်ပေးသည်။ Transwell insert များပေါ်တွင် organoids များကို မွေးမြူရန်အတွက် သီးခြား organoids များကို ECM အပေါ်ယံလွှာပေါ်တွင် စေ့ထည့်ကာ membrane မျက်နှာပြင်နှင့် တွယ်ကပ်ခြင်း (<3 နာရီ) နှင့် organoids များသည် barrier integrity ပါဝင်သော monolayer ပြီးပြည့်စုံသည်အထိ ထိန်းသိမ်းထားသည်။ Transwell ယဉ်ကျေးမှုများကို hybrid chips များ အသုံးမပြုဘဲ 24-well plates များတွင် လုပ်ဆောင်သည်။
In vitro 3D morphogenesis ကို တည်ထောင်ထားသော epithelial အလွှာ၏ basolateral ရှုထောင့်သို့ အရည်စီးဆင်းမှုကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် စတင်နိုင်သည်။ chip ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းတွင်၊ epithelial morphogenesis သည် အပေါ်နှင့်အောက် microchannels များထဲသို့ medium ကို perfus လုပ်သောအခါ စတင်ခဲ့သည် (ပုံ 3a)။ ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ ဦးတည်ချက်ထုတ်လွှတ်သော morphogen inhibitors များကို စဉ်ဆက်မပြတ်ဖယ်ရှားရန်အတွက် inferior (basolateral) compartment တွင် အရည်စီးဆင်းမှုကို ထည့်သွင်းရန် အရေးကြီးပါသည်။ porous membranes များပေါ်တွင် ချည်နှောင်ထားသော ဆဲလ်များသို့ လုံလောက်သော အာဟာရဓာတ်များနှင့် serum များ ပံ့ပိုးပေးရန်နှင့် luminal shear stress ကိုထုတ်ပေးရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် chip ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းတွင် dual flow ကို ပုံမှန်အားဖြင့် အသုံးပြုလေ့ရှိသည်။ hybrid chips များတွင် epithelial monolayers များပါရှိသော Transwell inserts များကို hybrid chips များထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ထို့နောက်၊ medium ကို microchannel မှတစ်ဆင့် porous Transwell insert ၏ basolateral ဘက်အောက်တွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ culture platform နှစ်ခုလုံးတွင် basolateral flow စတင်ပြီးနောက် ၃-၅ ရက်အကြာတွင် Intestinal morphogenesis ဖြစ်ပေါ်ခဲ့သည်။
microengineered 3D epithelial layers များ၏ morphological features များကို phase contrast microscopy၊ differential interference contrast (DIC) microscopy၊ SEM သို့မဟုတ် immunofluorescence confocal microscopy (ပုံ ၃ နှင့် ၄) အပါအဝင် imaging modalities အမျိုးမျိုးကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်ပါသည်။ 3D epithelial layers များ၏ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် protrusion ကို စောင့်ကြည့်ရန် phase contrast သို့မဟုတ် DIC imaging ကို culture လုပ်နေစဉ်အတွင်း မည်သည့်အချိန်တွင်မဆို အလွယ်တကူ လုပ်ဆောင်နိုင်ပါသည်။ PDMS နှင့် polyester films များ၏ optical transparency ကြောင့် gut-on-a-chip နှင့် hybrid chip platforms နှစ်ခုစလုံးသည် device ကို sectioning သို့မဟုတ် disassembly မလိုအပ်ဘဲ real-time in situ imaging ကို ပေးစွမ်းနိုင်ပါသည်။ Immunofluorescence imaging လုပ်ဆောင်သည့်အခါ (ပုံ ၁၊ ၃ဂ၊ f နှင့် ၄ခ၊ ဂ)၊ ဆဲလ်များကို 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) ဖြင့် ပုံမှန်အားဖြင့် ပြုပြင်ထားပြီး Triton X-100 နှင့် 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA) တို့က အစဉ်လိုက် ပြုပြင်ထားသည်။ ဆဲလ်အမျိုးအစားပေါ် မူတည်၍ fixatives အမျိုးမျိုး၊ permeabilizers နှင့် blocking agents များကို အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။ မျိုးရိုးပေါ်မူတည်သော ဆဲလ် သို့မဟုတ် ဒေသအမှတ်အသားများကို ပစ်မှတ်ထားသော မူလပဋိပစ္စည်းများကို ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ နေရာတွင် မလှုပ်ရှားနိုင်သော ဆဲလ်များကို မီးမောင်းထိုးပြရန် အသုံးပြုပြီး၊ နျူကလိယ (ဥပမာ 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) သို့မဟုတ် F-actin (ဥပမာ fluorescently labeled phalloidin) ကို ပစ်မှတ်ထားသော counterstain dye နှင့်အတူ ဒုတိယပဋိပစ္စည်းများကို အသုံးပြုပါသည်။ Fluorescence-based live imaging ကို mucus ထုတ်လုပ်မှုကို (ပုံ ၁၊ “ဆဲလ်ကွဲပြားမှု” နှင့် “အူလမ်းကြောင်းဇီဝကမ္မဗေဒ”)၊ microbial ဆဲလ်များ၏ ကျပန်းကိုလိုနီပြုခြင်း (ပုံ ၁၊ “Host-microbe co-culture”)၊ ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များစုဆောင်းခြင်း (ပုံ ၁၊ 'ရောဂါပုံစံထုတ်ခြင်း') သို့မဟုတ် 3D epithelial morphology ၏ ပုံသဏ္ဍာန်များ (ပုံ ၃c၊ f နှင့် ၄b၊ c) တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း အပေါ်ယံအလွှာကို အောက်ပိုင်း microchannel အလွှာမှ ခွဲထုတ်ရန် ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်းကို ပြုပြင်မွမ်းမံသောအခါ၊ ကိုးကားချက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း။ ပုံ ၂ တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ 3D epithelial morphology အပြင် apical brush border ရှိ microvilli ကိုလည်း SEM ဖြင့် မြင်ယောင်နိုင်သည် (ပုံ ၃ခ)။ differentiation markers များ၏ expression ကို quantitative PCR5 သို့မဟုတ် single-cell RNA sequencing ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် အကဲဖြတ်နိုင်သည်။ ဤကိစ္စတွင်၊ gut chips သို့မဟုတ် hybrid chips တွင် ကြီးထွားလာသော epithelial cells များ၏ 3D layers များကို trypsinization ဖြင့် စုဆောင်းပြီးနောက် molecular သို့မဟုတ် genetic analysis အတွက် အသုံးပြုသည်။
a၊ hybrid chip တွင် အူလမ်းကြောင်း morphogenesis ကို induction အတွက် workflow။ Caco-2 နှင့် အူလမ်းကြောင်း organoids များကို hybrid chip platform တွင် 3D morphogenesis ကို သရုပ်ပြရန် ဤ protocol တွင် အသုံးပြုသည်။ ကွဲထွက်နေသော epithelial ဆဲလ်များကို ပြင်ဆင်ထားသော Transwell inserts (TW prep; အောက်ဖော်ပြပါပုံကိုကြည့်ပါ) တွင် seed လုပ်ထားသည်။ ဆဲလ်များကို seed လုပ်ပြီးနောက် (seed လုပ်) Transwell inserts ရှိ polyester membranes များနှင့် တွဲပြီးသည်နှင့် ဆဲလ်အားလုံးကို static condition အောက်တွင် မွေးမြူခဲ့သည် (TW culture)။ ၇ ရက်အကြာတွင် epithelial ဆဲလ်များ၏ 2D monolayer ပါ၀င်သည့် Transwell insert တစ်ခုကို hybrid chip ထဲသို့ ပေါင်းစပ်ပြီး basolateral flow (Flow, BL) ကို မိတ်ဆက်ပေးခဲ့ပြီး နောက်ဆုံးတွင် 3D epithelial layer (morphogenesis) ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ ပုံမှန် donor (C103 line) မှ ဆင်းသက်လာသော ascending colon မှ ရရှိသော လူ့အင်္ဂါ epithelial ဆဲလ်များ၏ morphological features များကို ပြသသည့် phase contrast micrographs များသည် စမ်းသပ်မှုအဆင့် သို့မဟုတ် အချိန်အချက်တိုင်းတွင် ရှိသည်။ အပေါ်ဆုံးအလွှာများရှိ schematics များသည် အဆင့်တစ်ခုစီအတွက် စမ်းသပ်မှု configuration ကို ဖော်ပြသည်။b၊ Hybrid chips (ဘယ်ဘက် schematic) သည် organoid epithelial ဆဲလ်များ၏ 3D morphogenesis ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ Z အနေအထားအမျိုးမျိုး (အပေါ်၊ အလယ်နှင့် အောက်) တွင် ရိုက်ယူထားသော top-down confocal microscopy မြင်ကွင်းများဖြင့်။ ထင်ရှားသော morphological လက္ခဏာများကို ပြသခဲ့သည်။ F-actin (cyan)၊ nucleus (မီးခိုးရောင်)။c၊ static Transwell (TW; အဖြူရောင် dashed box အတွင်း ထည့်သွင်းထားသော) တွင် ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော organoid မှဆင်းသက်လာသော epithelial ဆဲလ်များ၏ Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) နှင့် hybrid chip (အကြီးဆုံး full shot) တို့သည် 2D နှင့် 3D morphology ကို အသီးသီး နှိုင်းယှဉ်ထားသည်။ 2D vertical cross-cut မြင်ကွင်းတစ်စုံ (အပေါ်ညာဘက်ထောင့်ရှိ ထည့်သွင်းထားသော၊ “XZ”) သည်လည်း 2D နှင့် 3D အင်္ဂါရပ်များကို ပြသထားသည်။ Scale bar၊ 100 µm။c ကိုးကားချက်မှ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ပြန်လည်ရိုက်နှိပ်ထားသည်။၄။ Elsevier။
ထိန်းချုပ်မှုများကို တူညီသောဆဲလ်များ (Caco-2 သို့မဟုတ် အူလမ်းကြောင်း organoid epithelial ဆဲလ်များ) ကို ရိုးရာ static culture အခြေအနေများအောက်တွင် two-dimensional monolayers များအဖြစ် မွေးမြူခြင်းဖြင့် ပြင်ဆင်နိုင်သည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ microchannels များ၏ ကန့်သတ်ချက်ရှိသော volume capacity (ဆိုလိုသည်မှာ မူရင်း gut-chip ဒီဇိုင်းပေါ်ရှိ top channel တွင် ~4 µL) ကြောင့် အာဟာရဓာတ် လျော့နည်းသွားခြင်း ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်သည်။ ထို့ကြောင့် basolateral flow ကို အသုံးမပြုမီနှင့် အသုံးမပြုမီနှင့် အသုံးမပြုပြီးနောက် epithelial morphology ကို နှိုင်းယှဉ်နိုင်သည်။
ပျော့ပျောင်းသော လစ်သိုဂရပ်ဖီ လုပ်ငန်းစဉ်ကို သန့်ရှင်းသော အခန်းတွင် လုပ်ဆောင်သင့်သည်။ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အလွှာတစ်ခုစီ (အပေါ်နှင့်အောက် အလွှာများနှင့် အမြှေးပါးများ) နှင့် hybrid ချစ်ပ်များအတွက်၊ မိုက်ခရိုချန်နယ်များ၏ အမြင့်များ မတူညီသောကြောင့် မတူညီသော photomasks များကို အသုံးပြု၍ သီးခြား ဆီလီကွန်ဝေဖာများတွင် ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်း၏ အပေါ်နှင့်အောက် မိုက်ခရိုချန်နယ်များ၏ ပစ်မှတ်အမြင့်များမှာ အသီးသီး 500 µm နှင့် 200 µm ဖြစ်သည်။ hybrid ချစ်ပ်၏ ချန်နယ်ပစ်မှတ်အမြင့်မှာ 200 µm ဖြစ်သည်။
၃ လက်မအရွယ် ဆီလီကွန်ဝေဖာကို အက်စီတုန်းပါဝင်သော ပန်းကန်လုံးထဲတွင် ထည့်ပါ။ ပန်းကန်ကို ၃၀ စက္ကန့်ခန့် ညင်သာစွာလှည့်ပြီး လေဖြင့်အခြောက်ခံပါ။ ဝေဖာကို IPA ပါသော ပန်းကန်ပြားပေါ်သို့ ရွှေ့ကာ သန့်ရှင်းရေးလုပ်ရန် ပန်းကန်ကို ၃၀ စက္ကန့်ခန့်လှည့်ပါ။
ဆီလီကွန်ဝေဖာမျက်နှာပြင်မှ အော်ဂဲနစ်အကြွင်းအကျန်များကို အများဆုံးဖယ်ရှားရန်အတွက် piranha ပျော်ရည် (ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ်နှင့် ပြင်းအားမြင့် ဆာလဖျူရစ်အက်ဆစ် ရောစပ်ထားသော၊ 1:3 (vol/vol)) ကို ရွေးချယ်အသုံးပြုနိုင်သည်။
ပီရန်ဟာငါးရဲ့အရည်ဟာ အလွန်အမင်း ချေးတက်ပြီး အပူထွက်စေပါတယ်။ နောက်ထပ်ဘေးကင်းရေးသတိပေးချက်တွေ လိုအပ်ပါတယ်။ အမှိုက်စွန့်ပစ်ဖို့အတွက် အရည်ကိုအေးအောင်ထားပြီး သန့်ရှင်းခြောက်သွေ့တဲ့ အမှိုက်ပုံးထဲကို လွှဲပြောင်းပါ။ ဒုတိယကွန်တိန်နာတွေကိုသုံးပြီး အမှိုက်ပုံးတွေကို သင့်တော်စွာ တံဆိပ်တပ်ပါ။ အသေးစိတ်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းတွေအတွက် စက်ရုံရဲ့ဘေးကင်းရေးလမ်းညွှန်ချက်တွေကို လိုက်နာပါ။
၂၀၀ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ် အပူပေးထားသော ပန်းကန်ပေါ်တွင် ၁၀ မိနစ်ခန့်တင်ခြင်းဖြင့် ဝေဖာများကို ရေဓာတ်ခန်းခြောက်အောင်ထားပါ။ ရေဓာတ်ခန်းခြောက်ပြီးနောက်၊ ဝေဖာကို လေထဲတွင် ငါးကြိမ်လှုပ်ခါပြီး အအေးခံပါ။
သန့်စင်ထားသော ဆီလီကွန်ဝေဖာ၏အလယ်ဗဟိုသို့ photoresist SU-8 2100 ၁၀ ဂရမ်ခန့် လောင်းထည့်ပါ။ photoresist ကို ဝေဖာပေါ်တွင် ညီညာစွာဖြန့်ရန် ညှပ်များကို အသုံးပြုပါ။ photoresist ကပ်စေးမှုနည်းစေပြီး ဖြန့်ရလွယ်ကူစေရန်အတွက် တစ်ခါတစ်ရံ ဝေဖာကို ၆၅°C အပူပြားပေါ်တွင် တင်ပါ။ ဝေဖာကို အပူပြားပေါ်တွင် တိုက်ရိုက်မတင်ပါနှင့်။
SU-8 ကို spin coating ဖြင့် wafer ပေါ်တွင် ညီညာစွာ ဖြန့်ဝေခဲ့သည်။ SU-8 ၏ ဝင်လာသော လည်ပတ်မှုကို 5–10 စက္ကန့်ကြာ ပရိုဂရမ်ရေးဆွဲပြီး 100 rpm/s အရှိန်ဖြင့် 500 rpm ဖြင့် ပျံ့နှံ့စေပါ။ အဓိက spin ကို 1,500 rpm တွင် 200 µm အထူ patterning အဖြစ် သတ်မှတ်ပါ၊ သို့မဟုတ် 250 µm အထူ (ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ gut ၏ အပေါ်ဆုံးအလွှာအတွက် 500 µm အမြင့်ပြုလုပ်ပါ။ အောက်ဖော်ပြပါ “အရေးကြီးသော အဆင့်များ” ကိုကြည့်ပါ) 1,200 rpm တွင် 30 စက္ကန့်ကြာ အရှိန်ဖြင့် 300 rpm/s အရှိန်ဖြင့် သတ်မှတ်ပါ။
ဆီလီကွန်ဝေဖာပေါ်ရှိ SU-8 ပုံစံ၏ ပစ်မှတ်အထူအလိုက် အဓိကလည်ပတ်နှုန်းကို ချိန်ညှိနိုင်သည်။
ချစ်ပ်ပေါ်ရှိ အူလမ်းကြောင်း၏ အပေါ်ဆုံးအလွှာအတွက် အမြင့် 500 µm ရှိသော SU-8 ပုံစံများကို ဖန်တီးရန်အတွက်၊ ဤ Box ၏ spin coating နှင့် soft bake အဆင့်များ (အဆင့် 7 နှင့် 8) ကို အဆက်မပြတ်ထပ်ခါတလဲလဲလုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး (အဆင့် 9 ကိုကြည့်ပါ) 250 µm ရှိသော SU-8 အလွှာနှစ်လွှာကို ထုတ်လုပ်ခဲ့ပြီး၊ ၎င်းကို ဤ box ၏ အဆင့် 12 တွင် UV ထိတွေ့မှုဖြင့် အလွှာလိုက်ထပ်ပြီး ချိတ်ဆက်နိုင်ပြီး အမြင့် 500 µm ရှိသော အလွှာတစ်ခုဖြစ်လာစေပါသည်။
SU-8 ဖြင့် အုပ်ထားသော ဝေဖာများကို အပူချိန် ၆၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၅ မိနစ်ခန့် ဂရုတစိုက်တင်ပြီးနောက် အပူချိန်ကို ၉၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်သို့ ပြောင်းကာ နောက်ထပ် ၄၀ မိနစ်ခန့် အပူပေးခြင်းဖြင့် နူးညံ့စွာဖုတ်ပါ။
အပေါ်ပိုင်း မိုက်ခရိုချန်နယ်တွင် SU-8 ပုံစံ၏ အမြင့် 500 μm ရရှိရန်၊ 250 μm အထူ SU-8 အလွှာနှစ်ခုကို ထုတ်လုပ်ရန် အဆင့် 7 နှင့် 8 ကို ပြန်လုပ်ပါ။
UV Mask Aligner ကို အသုံးပြု၍ wafer ၏ ထိတွေ့မှုအချိန်ကို တွက်ချက်ရန် ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း မီးခွက်စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်ပါ။ (ထိတွေ့မှုအချိန်၊ ms) = (ထိတွေ့မှုပမာဏ၊ mJ/cm2)/(မီးခွက်ပါဝါ၊ mW/cm2)။
ထိတွေ့ချိန်ကို ဆုံးဖြတ်ပြီးနောက်၊ UV မျက်နှာဖုံး ချိန်ညှိကိရိယာ၏ မျက်နှာဖုံးထည့်သည့်နေရာတွင် ဓာတ်ပုံမျက်နှာဖုံးကို တင်ပြီး SU-8 အုပ်ထားသော ဝေဖာပေါ်တွင် ဓာတ်ပုံမျက်နှာဖုံးကို တင်ပါ။
UV ပျံ့နှံ့မှုကို အနည်းဆုံးဖြစ်စေရန် photomask ၏ ပုံနှိပ်ထားသော မျက်နှာပြင်ကို silicon wafer ၏ SU-8 အုပ်ထားသော ဘက်ခြမ်းတွင် တိုက်ရိုက်ထားပါ။
ကြိုတင်သတ်မှတ်ထားသောထိတွေ့မှုအချိန်အတွက် SU-8 ဖြင့်အုပ်ထားသော wafer နှင့် photomask ကို UV အလင်း 260 mJ/cm2 နှင့် ဒေါင်လိုက်ထားလိုက်ပါ (ဤအကွက်၏ အဆင့် 10 ကိုကြည့်ပါ)။
UV ထိတွေ့ပြီးနောက်၊ SU-8 ဖြင့်အုပ်ထားသော ဆီလီကွန်ဝေဖာများကို 65°C တွင် 5 မိနစ်နှင့် 95°C တွင် 15 မိနစ်ဖုတ်ပြီး အမြင့် 200 μm ရှိသော ပုံစံများကို ဖန်တီးခဲ့သည်။ ဖုတ်ပြီးနောက်အချိန်ကို 95°C တွင် 30 မိနစ်အထိ တိုးပြီး အမြင့် 500 µm ရှိသော ပုံစံများကို ဖန်တီးခဲ့သည်။
ဖန်ခွက်ပန်းကန်ထဲသို့ ဆော့ဖ်ဝဲလ်ဖျော်စက်ကို လောင်းထည့်ပြီး ဖုတ်ထားသော ဝေဖာကို ပန်းကန်ထဲသို့ ထည့်သည်။ SU-8 ဆော့ဖ်ဝဲလ်ဖျော်စက်၏ ပမာဏသည် ဖန်ပန်းကန်၏ အရွယ်အစားပေါ် မူတည်၍ ကွဲပြားနိုင်သည်။ မမြင်ရသေးသော SU-8 ကို လုံးဝဖယ်ရှားရန် SU-8 ဆော့ဖ်ဝဲလ်ဖျော်စက်ကို လုံလောက်စွာ အသုံးပြုကြောင်း သေချာပါစေ။ ဥပမာအားဖြင့်၊ အချင်း ၁၅၀ မီလီမီတာရှိသော ၁ လီတာဆံ့ ဖန်ခွက်ပန်းကန်ကို အသုံးပြုသည့်အခါ SU-8 ဆော့ဖ်ဝဲလ်ဖျော်စက် ၃၀၀ မီလီလီတာခန့်ကို အသုံးပြုပါ။ မှိုကို ရံဖန်ရံခါ ညင်သာစွာလှည့်၍ ၂၅ မိနစ်ခန့် ဖျော်ပါ။
မှိုတက်ပြီးသား မှိုကို လတ်ဆတ်သော developer ၁၀ mL ခန့်ဖြင့် ဆေးကြောပြီးနောက် IPA ကို pipette အသုံးပြု၍ အရည်ဖြန်းခြင်းဖြင့် ဆေးကြောပါ။
ဝေဖာကို ပလာစမာသန့်စင်စက်ထဲတွင်ထည့်ပြီး အောက်ဆီဂျင်ပလာစမာ (လေထုဓာတ်ငွေ့၊ ပစ်မှတ်ဖိအား 1 × 10−5 Torr၊ ပါဝါ 125 W) နှင့် 1.5 မိနစ်ကြာ ထားပါ။
ဝေဖာကို ဖန်ချပ်တစ်ခုပါသော ဖုန်စုပ်စက်ထဲတွင် ထားပါ။ ဝေဖာများနှင့် ဆလိုက်များကို ဘေးချင်းယှဉ်ထားနိုင်သည်။ ဖုန်စုပ်စက်ကို ပန်းကန်ဖြင့် အလွှာများစွာ ပိုင်းခြားထားပါက ဆလိုက်များကို အောက်ခန်းတွင် ထားပြီး ဝေဖာများကို အပေါ်ခန်းတွင် ထားပါ။ ထရိုင်ကလိုရို (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane ပျော်ရည် 100 μL ကို ဖန်ချပ်ပေါ်တွင် ချပြီး silanization အတွက် ဖုန်စုပ်စက်ကို အသုံးပြုပါ။
၃၇°C ရှိ ရေချိုးကန်ထဲတွင် အေးခဲထားသော Caco-2 ဆဲလ်များ ပုလင်းတစ်လုံးကို အရည်ပျော်အောင်လုပ်ပါ၊ ထို့နောက် အရည်ပျော်သွားသော ဆဲလ်များကို ၃၇°C ရှိ ကြိုတင်နွှေးထားသော Caco-2 အလတ်စား ၁၅ mL ပါရှိသော T75 ပုလင်းထဲသို့ လွှဲပြောင်းထည့်ပါ။
Caco-2 ဆဲလ်များကို ~90% confluency တွင်ဖြတ်သန်းရန်အတွက်၊ ဦးစွာ 37°C ရေချိုးကန်တွင် Caco-2 medium၊ PBS နှင့် 0.25% trypsin/1 mM EDTA တို့ကို အပူပေးပါ။
အလယ်အလတ်ကို လေဟာနယ်မှ စုပ်ယူပါ။ ဆဲလ်များကို နွေးသော PBS ၅ မီလီလီတာဖြင့် နှစ်ကြိမ် ဆေးကြောပြီး အသစ်သော PBS ကို လေဟာနယ်မှ စုပ်ယူပါ။