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ヒト腸管形態形成は、3D上皮微細構造と空間的組織化の陰窩-絨毛の特徴を確立します。この独自の構造は、基底陰窩の幹細胞ニッチを外来微生物抗原とその代謝物から保護することにより、腸管恒常性を維持するために必要です。さらに、腸絨毛と分泌粘液は、腸粘膜表面に保護バリアを備えた機能的に分化した上皮細胞を提供します。したがって、3D上皮構造を再現することは、in vitro腸管モデルの構築に不可欠です。特に、有機模倣腸管オンチップは、強化された生理機能と生体力学を備えた腸管上皮の自発的な3D形態形成を誘導できます。ここでは、マイクロ流体チップ上およびトランスウェル埋め込みハイブリッドチップ上の腸管で腸管形態形成を強力に誘導するための再現可能なプロトコルを提供します。デバイス製造の詳細な方法について説明します。従来の環境およびマイクロ流体プラットフォーム上でのCaco-2細胞または腸管オルガノイド上皮細胞の培養、3D形態形成の誘導、および複数のイメージングモダリティを使用した確立された3D上皮の特性評価。このプロトコルは、5日間基底外側液流を制御することにより、機能的な腸管微細構造の再生を実現します。当社のin vitro形態形成法は、生理学的に関連するせん断応力と機械的運動を使用し、複雑な細胞工学や操作を必要としないため、他の既存の技術よりも優れている可能性があります。当社が提案するプロトコルは、生物医学研究コミュニティに幅広い影響を与え、生物医学、臨床、および製薬用途向けにin vitroで3D腸管上皮層を再生する方法を提供する可能性があると考えています。
実験では、腸管オンチップ1,2,3,4,5または二層マイクロ流体デバイス6,7で培養された腸管上皮Caco-2細胞が、その根本的なメカニズムが明確に理解されていないにもかかわらず、in vitroで自発的な3D形態形成を起こすことが示されています。最近の研究では、培養デバイスから基底外側に分泌される形態形成拮抗物質を除去することが、in vitroでの3D上皮形態形成を誘導するために必要かつ十分であることがわかり、これはCaco-2細胞および患者由来の腸管オルガノイドによって実証されています。上皮細胞は検証されました。この研究では、特に、腸管オンチップおよびトランスウェルインサートを含む改良型マイクロ流体デバイス（「ハイブリッドチップ」と呼ばれる）における強力なWntアンタゴニストであるDickkopf-1（DKK-1）の細胞産生と濃度分布に焦点を当てました。オンチップ腸管に外因性Wntアンタゴニスト（DKK-1、Wntリプレッサー1、分泌型フリズルド関連タンパク質1、またはSoggy-1など）を添加すると、形態形成が阻害されるか、事前に構造化された3D上皮層が破壊されることを示し、培養中の拮抗ストレスがin vitroでの腸管形態形成の原因であることを示唆しています。したがって、上皮界面で堅牢な形態形成を達成するための実際的なアプローチは、能動的な洗浄（例えば、腸管オンチップまたはハイブリッドオンチッププラットフォーム）または拡散。基底側培地（例：トランスウェルインサートからウェル内の大きな基底側リザーバーへ）。
このプロトコルでは、腸管オンチップマイクロデバイスおよびトランスウェル挿入型ハイブリッドチップの作製方法（ステップ1～5）を詳細に示し、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースの多孔質膜（ステップ6A、7A、8、9）またはトランスウェルインサートのポリエステル膜（ステップ6B、7B、8、9）上で腸管上皮細胞を培養し、in vitroで3D形態形成を誘導しました（ステップ10）。また、複数のイメージングモダリティを適用して、組織特異的な組織形成および系統依存的な細胞分化を示す細胞および分子の特徴を特定しました（ステップ11～24）。Caco-2細胞や腸管オルガノイドなどのヒト腸管上皮細胞を用いて、多孔質膜の表面修飾、2D単層の作成、腸管生化学的および生体力学的再現性などの技術的な詳細を含む2つの培養形式で形態形成を誘導しました。微小環境。in vitro。2D上皮単層から3D形態形成を誘導するために、培養液の基底外側区画に培地を流し込むことで、両方の培養形態から形態形成拮抗物質を除去しました。最後に、形態形成依存性上皮成長、長期的宿主-微生物叢共培養、病原体感染、炎症性損傷、上皮バリア機能不全、およびプロバイオティクスベースの治療のモデル化に使用できる再生可能な3D上皮層の有用性の例を示します。影響。
私たちのプロトコルは、基礎研究（腸粘膜生物学、幹細胞生物学、発生生物学など）および応用研究（前臨床薬物試験、疾患モデリング、組織工学、消化器病学など）の幅広い科学者にとって有用であり、大きな影響を与える可能性があります。試験管内で腸上皮の3D形態形成を誘導する私たちのプロトコルは再現性と堅牢性を備えているため、腸の発達、再生、または恒常性における細胞シグナル伝達のダイナミクスを研究している人々に私たちの技術戦略を普及させることができると考えています。さらに、私たちのプロトコルは、ノロウイルス8、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）、クロストリジウム・ディフィシル、サルモネラ・チフィムリウム9、ビブリオ・コレラなどのさまざまな感染性病原体による感染を調べるのに役立ちます。疾患の病理学および病因に関する知識も有用です。オンチップ腸管マイクロ生理学システムの使用により、長期的な共培養10と、その後の消化管における宿主防御、免疫応答、および病原体関連損傷修復の評価11が可能になります。リーキーガット症候群、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、パウチ炎、または過敏性腸症候群に関連するその他の消化管疾患は、患者の3D腸管上皮層を使用して3D腸管上皮層を準備することでシミュレートできます。これらの疾患には、絨毛萎縮、陰窩短縮、粘膜損傷、または上皮バリア機能障害が含まれます。生検または幹細胞由来の腸管オルガノイド12,13。疾患環境のより複雑な様相をより適切にモデル化するために、読者は、患者の末梢血単核細胞（PBMC）などの疾患関連細胞型を、 3D腸絨毛陰窩微細構造。組織特異的免疫細胞、5。
3D上皮微細構造は切片化処理なしで固定および可視化できるため、空間トランスクリプトミクスや高解像度または超解像度イメージングに取り組む閲覧者は、上皮ニッチ上の遺伝子とタンパク質の時空間ダイナミクスのマッピングに興味を持つかもしれません。技術に興味があります。微生物または免疫刺激への応答。さらに、腸内恒常性を調整する縦断的な宿主-マイクロバイオームクロストーク10、14は、特に腸チップにおいて、さまざまな微生物種、微生物群集、または糞便微生物叢を共培養することにより、3D腸粘膜層で確立できます。プラットフォーム上で。このアプローチは、粘膜免疫学、消化器病学、ヒトマイクロバイオーム、カルチュロミクス、臨床微生物学を研究し、これまで培養されていなかった腸内細菌叢を実験室で培養しようとしている研究者にとって特に魅力的です。当社のin vitro形態形成プロトコルが、基底外側コンパートメントを継続的に補充する24、96、または384ウェルプレートのマルチウェルインサートなどのスケーラブルな培養フォーマットに適合できる場合、このプロトコルは、医薬品、生物医学、または食品業界向けのハイスループットスクリーニングまたは検証プラットフォームを開発している人々にも普及させることができます。原理実証として、最近、24ウェルプレートフォーマットに拡張可能なマルチプレックスハイスループット形態形成システムの実現可能性を実証しました。さらに、複数のオルガンオンチップ製品が商品化されています16、17、18。したがって、当社のin vitro形態形成方法の検証は加速され、多くの研究室、産業界、または政府および規制機関は、医薬品またはバイオ医薬品をテストするために、転写レベルでの試験管内腸形態形成の細胞再プログラミングを理解する。医薬品候補の吸収と輸送は、3D腸管代替物またはカスタムまたは市販のオルガンオンチップモデルを使用して評価され、腸形態形成プロセスの再現性が評価された。
腸管上皮形態形成の研究には、ヒトに関連する実験モデルが限られており、これは主に、in vitroで3D形態形成を誘導するための実行可能なプロトコルが不足しているためです。実際、腸管形態形成に関する現在の知識の多くは、動物実験（例：ゼブラフィッシュ20、マウス21、ニワトリ22）に基づいています。しかし、これらの動物実験は労力とコストがかかり、倫理的に問題となる可能性があり、最も重要なことに、ヒトの発生プロセスを正確に決定するものではありません。これらのモデルは、多方向スケーラブルな方法でテストする能力も非常に限られています。したがって、in vitroで3D組織構造を再生するための私たちのプロトコルは、in vivo動物モデルや他の従来の静的2D細胞培養モデルよりも優れています。前述のように、3D上皮構造を利用することで、さまざまな粘膜刺激または免疫刺激に対する陰窩-絨毛軸における分化細胞の空間的局在を調べることができました。3D上皮層は、微生物細胞が宿主因子（例えば、内側と外側の粘液層、IgAや抗菌ペプチドの分泌）に応じて空間的ニッチを形成するためにどのように競合し、生態学的進化を起こすかを研究します。さらに、3D上皮形態学により、腸内細菌叢がどのようにコミュニティを構築し、基底陰窩の細胞組織や幹細胞ニッチを形成する微生物代謝産物（例えば、短鎖脂肪酸）を相乗的に生成するかを理解することができます。これらの特徴は、3D上皮層が試験管内で確立された場合にのみ実証できます。
3D腸管上皮構造を作成する当社の方法に加えて、いくつかのin vitro法があります。腸管オルガノイド培養は、特定のモルフォゲン条件下で腸管幹細胞を培養することに基づく最先端の組織工学技術です23,24,25。しかし、輸送解析や宿主と微生物叢の共培養に3Dオルガノイドモデルを使用することは、腸管腔がオルガノイド内に閉じ込められているため、微生物細胞や外来抗原などの管腔成分の導入が制限されるため、しばしば困難です。マイクロインジェクターを使用することでオルガノイド管腔へのアクセスを改善できますが、26,27 この方法は侵襲的で手間がかかり、実施には専門知識が必要です。さらに、静的条件下でハイドロゲル足場内で維持される従来のオルガノイド培養は、生体内での活発な生体力学を正確に反映していません。
いくつかの研究グループが採用している他のアプローチでは、ゲル表面上で単離したヒト腸細胞を培養することで腸上皮構造を模倣するために、あらかじめ構造化された3Dハイドロゲル足場を利用しています。ハイドロゲル足場は、3Dプリント、マイクロフライス加工、またはリソグラフィーで作製した型を使用して作製します。この方法は、生理学的に関連するモルフォゲン勾配を用いて、単離した上皮細胞がin vitroで自己組織化配列することを示し、足場に間質細胞を含めることで、高アスペクト比の上皮構造と間質-上皮クロストークを確立します。しかし、あらかじめ構造化された足場の性質上、自発的な形態形成プロセス自体の表示が妨げられる可能性があります。これらのモデルはまた、動的な管腔内または間質流を提供しないため、腸細胞が形態形成を起こし生理機能を獲得するために必要な流体せん断応力が欠如しています。別の最近の研究では、マイクロ流体プラットフォームでハイドロゲル足場を使用し、腸上皮構造をパターン化しました。レーザーエッチング技術。マウス腸管オルガノイドはエッチングされたパターンに従って腸管構造を形成し、管腔内流体の流れはマイクロ流体モジュールを使用して再現できます。しかし、このモデルは自発的な形態形成プロセスも腸のメカノバイオロジー運動も示しません。同じグループの3Dプリンティング技術は、自発的な形態形成プロセスを持つミニチュア腸管を作成することができました。管内のさまざまな腸セグメントの複雑な製造にもかかわらず、このモデルも管腔内流体の流れと機械的変形を欠いています。さらに、特にバイオプリンティングプロセスが完了した後、実験条件や細胞間相互作用を乱すと、モデルの操作性が制限される可能性があります。代わりに、我々が提案するプロトコルは、自発的な腸の形態形成、生理学的に関連するせん断応力、腸の運動を模倣するバイオメカニクス、独立した頂端側および基底外側コンパートメントへのアクセス、複雑な生物学的微小環境の再現を提供します。モジュール性。したがって、我々のin vitro 3D形態形成プロトコルは、既存の方法の課題を克服するための補完的なアプローチを提供する可能性がある。
私たちのプロトコルは、培養上皮細胞のみで、間葉系細胞、内皮細胞、免疫細胞などの他の種類の周囲細胞を含まない、3D上皮形態形成に完全に焦点を当てています。前述のように、私たちのプロトコルの核心は、導入培地の基底外側で分泌される形態形成阻害物質を除去することによって上皮形態形成を誘導することです。私たちの腸管オンチップおよびハイブリッドオンチップの堅牢なモジュール性により、波打つ3D上皮層を再現できますが、上皮間葉相互作用33,34、細胞外マトリックス（ECM）沈着35、および私たちのモデルでは基底陰窩に幹細胞ニッチをもたらす陰窩絨毛の特徴などの追加の生物学的複雑性については、さらに検討する必要があります。間葉系の間質細胞（線維芽細胞など）は、ECMタンパク質の産生と腸管形態形成の調節において重要な役割を果たします。 vivo35,37,38。モデルに間葉系細胞を追加することで、形態形成プロセスと細胞接着効率が向上しました。内皮層（すなわち、毛細血管またはリンパ管）は、腸内微小環境における分子輸送39および免疫細胞の動員40の調節において重要な役割を果たします。さらに、組織モデルを多臓器相互作用を示すように設計する場合、組織モデル間で接続できる血管系コンポーネントが必須です。したがって、臓器レベルの解像度でより正確な生理学的特徴をモデル化するために、内皮細胞を含める必要があるかもしれません。患者由来の免疫細胞は、腸疾患を模倣する文脈において、自然免疫応答、抗原提示、自然適応免疫クロストーク、および組織特異的免疫を示すためにも不可欠です。
ハイブリッドチップの使用は、デバイスのセットアップが簡単で、トランスウェルインサートを使用することで腸上皮のスケーラブルな培養が可能になるため、ガットオンアチップよりも簡単です。しかし、市販のポリエステル膜付きトランスウェルインサートは弾性がなく、蠕動運動のような動きをシミュレートできません。さらに、ハイブリッドチップに配置されたトランスウェルインサートの頂端コンパートメントは、頂端側にせん断応力がかからず静止したままでした。明らかに、頂端コンパートメントの静的な特性により、ハイブリッドチップでの長期的な細菌共培養はほとんど不可能です。ハイブリッドチップを使用すると、トランスウェルインサートで3D形態形成を確実に誘導できますが、生理学的に関連する生体力学と頂端流体の流れが不足しているため、ハイブリッドチッププラットフォームの潜在的な用途の実現可能性が制限される可能性があります。
腸管オンチップおよびハイブリッドオンチップ培養におけるヒトの陰窩-絨毛軸の本格的な再構築は、まだ完全には確立されていません。形態形成は上皮単層から始まるため、3D 微細構造は必ずしも生体内の陰窩と形態的に類似しているとは限りません。マイクロエンジニアリングされた 3D 上皮の基底陰窩領域付近の増殖細胞集団を特徴付けましたが、陰窩領域と絨毛領域は明確に区別されませんでした。チップ上の上部チャネルが高くなると、マイクロエンジニアリングされた上皮の高さは増加しますが、最大高さは依然として約 300～400 µm に制限されます。ヒトの小腸および大腸の腸陰窩の実際の深さはそれぞれ約 135 µm および約 400 µm であり、小腸絨毛の高さは約 600 µm です 41。
イメージングの観点から、3D 微細構造のその場超解像イメージングは​​、チップ上の腸管に限定される可能性があります。これは、対物レンズから上皮層までの必要な作動距離が数ミリメートル程度であるためです。この問題を克服するには、遠距離の対物レンズが必要になる場合があります。さらに、PDMS の弾性が高いため、イメージング用の薄切片の作成は困難です。また、チップ上の腸管の層ごとの微細加工では、各層間に永久的な接着が生じるため、上層を開いて除去し、上皮層の表面構造を調べることは非常に困難です。例えば、走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用することで可能です。
PDMSの疎水性は、疎水性小分子を扱うマイクロ流体ベースの研究において制限要因となってきた。これは、PDMSがそのような疎水性分子を非特異的に吸着する可能性があるためである。PDMSの代替として、他の高分子材料が検討される。あるいは、疎水性分子の吸着を最小限に抑えるために、PDMSの表面修飾（例えば、親油性材料42またはポリエチレングリコール43によるコーティング）が検討される。
最後に、私たちの方法は、ハイスループットスクリーニングや「万能」なユーザーフレンドリーな実験プラットフォームを提供するという点では十分に特性評価されていません。現在のプロトコルでは、マイクロデバイスごとにシリンジポンプが必要であり、CO2インキュベーター内のスペースを占有し、大規模な実験を妨げています。この制限は、革新的な培養フォーマット（例えば、基底側培地の連続的な補充と除去を可能にする24ウェル、96ウェル、または384ウェルの多孔質インサート）のスケーラビリティによって大幅に改善できます。
ヒト腸管上皮の 3D 形態形成を体外で誘導するために、2 つの平行なマイクロチャネルと、その間に腔毛細管界面を作成するための弾性多孔質膜を含むマイクロ流体チップ腸デバイスを使用しました。また、Transwell インサート上で成長した極性上皮層の下に連続的な基底外側流を提供する単一チャネル マイクロ流体デバイス (ハイブリッド チップ) の使用も実証しました。どちらのプラットフォームでも、流れの方向性操作を適用して基底外側コンパートメントから形態形成拮抗物質を除去することにより、さまざまなヒト腸管上皮細胞の形態形成を実証できます。実験手順全体 (図 1) は、次の 5 つの部分から構成されています。(i) 腸管チップまたは Transwell 挿入可能なハイブリッド チップの微細加工 (ステップ 1-5、ボックス 1)、(ii) 腸管上皮細胞 (Caco-2 細胞) またはヒト腸管オルガノイドの準備、 （ボックス2～5）、（iii）腸チップまたはハイブリッドチップ上での腸上皮細胞の培養（ステップ6～9）、（iv）in vitroでの3D形態形成の誘導（ステップ10）、および（v））3D上皮微細構造の特徴付け（ステップ11～24）。最後に、適切な対照群（後述）を設計し、上皮形態形成を空間的、時間的、条件的、または手順的対照と比較することにより、in vitro形態形成の有効性を検証しました。
我々は、直線チャネルまたは非線形曲がりチャネルを備えた腸管オンチップ、あるいはボックス 1 で説明されているように製造されたマイクロ流体デバイス内の Transwell (TW) インサートを含むハイブリッドチップという 2 種類の異なる培養プラットフォームを使用しました。ステップ 1 ～ 5「デバイスの製造」では、シングルチップまたはハイブリッドチップを作成する主なステップを示しています。「ヒト腸管上皮細胞の培養」では、このプロトコルで使用される細胞源 (Caco-2 またはヒト腸管オルガノイド) と培養手順について説明しています。「in vitro 形態形成」では、Caco-2 またはオルガノイド由来の上皮細胞を腸管チップまたはハイブリッドチップの Transwell インサート上で培養し、続いて 3D 形態形成を誘導して特徴付けられた上皮構造を形成する全体的なステップを示しています。プログラムのステップ番号またはボックス番号は、各矢印の下に表示されます。このアプリケーションは、確立された腸管上皮層を、たとえば細胞分化特性評価、腸管生理学研究、宿主-微生物叢生態系と疾患モデリング。「細胞分化」の免疫蛍光画像は、腸チップ上に生成された3D Caco-2上皮層で発現した核、F-アクチン、MUC2を示しています。MUC2シグナル伝達は、杯細胞と粘膜表面から分泌される粘液に存在します。「腸生理学」の蛍光画像は、蛍光小麦胚芽凝集素を使用してシアル酸とN-アセチルグルコサミン残基を染色して生成された粘液を示しています。「宿主-微生物共培養」の2つの重なり合う画像は、チップ上の腸における代表的な宿主-微生物叢共培養を示しています。左のパネルは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する大腸菌とマイクロエンジニアリングされた3D Caco-2上皮細胞の共培養を示しています。右のパネルは、3D Caco-2上皮細胞と共培養されたGFP大腸菌の局在を示し、続いてF-アクチン（赤）と核（青）の免疫蛍光染色。疾患モデルは、細菌抗原（例：リポ多糖、LPS）と免疫細胞（例：PBMC；緑）による生理的刺激を受けた腸炎症チップにおける、健康な腸とリーキーガットを示しています。Caco-2細胞を培養して3D上皮層を形成しました。スケールバー、50 µm。下段の画像：「細胞の分化」は参考文献2. Oxford University Pressより許可を得て改変。参考文献5. NASより許可を得て複製。「宿主-微生物共培養」は参考文献3. NASより許可を得て改変。「疾患モデル」は参考文献5. NASより許可を得て改変。
腸管オンチップとハイブリッドチップはどちらも、ソフトリソグラフィー1,44によってシリコンモールドから脱型されたPDMSレプリカを用いて作製され、SU-8でパターン形成されました。各チップのマイクロチャネルの設計は、せん断応力や流体圧力などの流体力学を考慮して決定されます1,4,12。2つの並置された平行な直線マイクロチャネルから構成される元の腸管オンチップ設計（拡張データ図1a）は、流体滞留時間の増加、非線形流動パターン、培養細胞の多軸変形を誘発する一対の湾曲マイクロチャネルを含む複雑な腸管オンチップ（拡張データ図1b）へと進化しました（図2a～f）12。より複雑な腸管生体力学を再現する必要がある場合は、複雑な腸管オンチップを選択できます。我々は、複雑な腸管チップも同様の時間枠で同様の効果で3D形態形成を強く誘発することを実証しました。培養細胞の種類に関わらず、元のGut-Chipと比較して上皮成長の程度が異なります。したがって、3D形態形成を誘導するために、直線状および複雑なオンチップ腸管設計は互換性があります。SU-8パターン付きシリコンモールド上で硬化させたPDMSレプリカは、脱型後にネガティブな特徴を示しました（図2a）。チップ上に腸管を作製するために、準備した上部PDMS層を多孔質PDMSフィルムに順次接合し、コロナ処理装置を使用して不可逆接合により下部PDMS層と位置合わせしました（図2b～f）。ハイブリッドチップを作製するために、硬化させたPDMSレプリカをガラススライドに接合し、Transwellインサートを収容できるシングルチャネルマイクロ流体デバイスを作成しました（図2hおよび拡張データ図2）。接合プロセスは、PDMSレプリカとガラスの表面を酸素プラズマまたはコロナ処理で処理することによって実行されます。シリコンチューブに取り付けられたマイクロ加工デバイスを滅菌した後、デバイスセットアップは3Dを実行する準備が整いました。腸上皮の形態形成（図2g）。
a、SU-8パターンシリコンモールドからのPDMS部品の作製方法の概略図。未硬化PDMS溶液をシリコンモールドに注ぎ（左）、60℃で硬化させ（中央）、脱型した（右）。脱型したPDMSは切断し、洗浄して再利用した。b、PDMS上層を作製するために使用したシリコンモールドの写真。c、PDMS多孔質膜を作製するために使用したシリコンモールドの写真。d、上部および下部PDMS部品と組み立てられたオンチップ腸管デバイスの一連の写真。e、上部、膜、および下部PDMS部品の位置合わせの概略図。各層はプラズマまたはコロナ処理によって不可逆的に接合されている。f、重ね合わせた複雑なマイクロチャネルと真空チャンバーを備えた、作製されたガットオンチップデバイスの概略図。g、マイクロ流体細胞培養のためのガットオンチップのセットアップ。シリコンで組み立てられたガットオンチップ。チューブとシリンジをカバースリップ上に置いた。チップデバイスを150 mmペトリ皿の蓋の上に置いて処理した。バインダーを使用してシリコンチューブを閉じた。h、ハイブリッドチップの作製とハイブリッドチップを使用した3D形態形成の視覚的スナップショット。腸上皮細胞の2D単層を培養するために個別に準備されたトランスウェルインサートをハイブリッドチップに挿入して、腸の3D形態形成を誘導した。培地は、トランスウェルインサート上に形成された細胞層の下のマイクロチャネルを通して灌流される。スケールバー、1 cm。h 参考文献4より許可を得て転載。Elsevier。
このプロトコルでは、Caco-2細胞株と腸オルガノイドを上皮源として使用しました（図3a）。両方のタイプの細胞を個別に培養し（ボックス2とボックス5）、オンチップ腸管またはトランスウェルインサートのECMコーティングされたマイクロチャネルに播種しました。細胞がコンフルエント（フラスコ内の被覆率が95%以上）になったら、Tフラスコでルーチン培養したCaco-2細胞（継代10～50）を回収し、トリプシン処理液で解離細胞懸濁液を調製します（ボックス2）。腸生検または外科的切除から得られたヒト腸オルガノイドは、構造的微小環境をサポートするために、24ウェルプレートのマトリゲル足場ドームで培養しました。ボックス3に記載されているように調製した必須モルフォゲン（Wnt、R-スポンジン、ノギンなど）および成長因子を含む培地を、オルガノイドが成長するまで2日おきに補充しました。直径約500 µm。完全に成長したオルガノイドを採取し、単一細胞に解離して、チップ上の腸管またはトランスウェルインサートに播種します（ボックス5）。以前に報告したように、疾患の種類12,13（例：潰瘍性大腸炎、クローン病、大腸がん、または正常ドナー）、病変部位（例：病変部と非病変部）、および消化管内の位置（例：十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、または直腸）に応じて区別できます。ボックス5では、小腸オルガノイドよりも通常高濃度の形態形成因子を必要とする結腸オルガノイド（コロイド）の培養のための最適化されたプロトコルを提供します。
a、腸チップにおける腸管形態形成誘導のワークフロー。このプロトコルでは、3D形態形成を実証するために、Caco-2ヒト腸管上皮細胞と腸管オルガノイドを使用します。単離した上皮細胞を、準備した腸管オンチップデバイスに播種します（チップ準備）。細胞を播種し（播種）、0日目（D0）にPDMS多孔質膜に接着させると、頂端側（AP）の流れが開始され、最初の2日間維持されます（流れ、AP、D0-D2）。完全な2D単層が形成されると、周期的な伸展運動とともに基底側（BL）の流れも開始されます（伸展、流れ、APおよびBL）。腸管の3D形態形成は、マイクロ流体培養5日後に自然に発生しました（形態形成、D5）。位相差画像は、各実験ステップまたは時点におけるCaco-2細胞の代表的な形態を示しています（棒グラフ、100）。 µm）。対応する腸管形態形成のカスケードを示す4つの模式図（右上）。模式図の破線の矢印は流体の流れの方向を表します。b、確立された3D Caco-2上皮の表面トポロジーを示すSEM画像（左）。拡大領域（白い破線のボックス）を強調した挿入図は、3D Caco-2層上に再生された微絨毛を示しています（右）。c、確立されたCaco-2 3Dの水平正面図、クローディン（ZO-1、赤）、F-アクチン（緑）と核（青）で標識された連続ブラシ境界膜、腸チップ上の上皮細胞の免疫蛍光共焦点可視化。中央の模式図を指す矢印は、各共焦点ビューの焦点面の位置を示します。d、3日目、7日目、9日目、11日目、13日目に位相差顕微鏡で得られたチップ上で培養されたオルガノイドの形態変化の時間経過。挿入図（右上）は、提供された画像の高倍率を示しています。e、7日目に採取した切片上の腸管に確立されたオルガノイド3D上皮のDIC顕微鏡写真。f、腸管チップ上でそれぞれ3日間培養された幹細胞（LGR5；マゼンタ）、杯細胞（MUC2；緑）、Fアクチン（灰色）、核（シアン）のマーカーを示す重ね合わせ免疫蛍光画像（左）と、上皮層上の13日目（中央）のオルガノイド。MUC2シグナル伝達なしでLGR5シグナル伝達を強調した拡張データ図3も参照してください。培養13日目にCellMask色素（右）で形質膜を染色することにより、チップ上の腸管に確立された3Dオルガノイド上皮の上皮微細構造（右）を示す蛍光画像。特に明記されていない限り、スケールバーは50μmです。b 参考文献から許可を得て転載。2. Oxford University Press; c 参考文献2より許可を得て改変。オックスフォード大学出版局。eおよびfは参考文献12より許可を得て改変。クリエイティブ・コモンズ・ライセンスCC BY 4.0に基づく。
腸管オンチップでは、ECMコーティングを成功させるためにPDMS多孔質膜の疎水性表面を改質する必要があります。このプロトコルでは、PDMS膜の疎水性を改質するために2つの異なる方法を適用します。Caco-2細胞の培養では、UV/オゾン処理による表面活性化のみでPDMS表面の疎水性を低下させ、ECMをコーティングし、Caco-2細胞をPDMS膜に付着させるのに十分でした。しかし、オルガノイド上皮のマイクロ流体培養では、ポリエチレンイミン（PEI）とグルタルアルデヒドをPDMSマイクロチャネルに順次適用することで、ECMタンパク質の効率的な沈着を実現するために、化学ベースの表面機能化が必要です。表面改質後、ECMタンパク質が機能化されたPDMS表面を覆うように沈着し、単離されたオルガノイド上皮に導入されました。細胞が付着した後、細胞が完全な単層を形成するまで上部マイクロチャネルに培地のみを灌流し、下部マイクロチャネルは静的状態を維持することで、マイクロ流体細胞培養が開始されます。この最適化された表面活性化法は、また、ECMコーティングにより、オルガノイド上皮の付着が可能になり、PDMS表面上で3D形態形成を誘導することができる。
Transwell培養では、細胞播種前にECMコーティングが必要ですが、Transwell培養では、多孔質インサートの表面を活性化するための複雑な前処理ステップは必要ありません。Transwellインサート上でCaco-2細胞を培養する場合、多孔質インサートにECMコーティングを施すことで、解離したCaco-2細胞の付着（1時間未満）とタイトジャンクションバリアの形成（1～2日未満）が促進されます。Transwellインサート上でオルガノイドを培養するには、単離したオルガノイドをECMコーティングされたインサート上に播種し、膜表面に付着させ（3時間未満）、オルガノイドがバリアの完全性を備えた完全な単層を形成するまで維持します。Transwell培養は、ハイブリッドチップを使用せずに24ウェルプレートで行われます。
培養上皮の基底外側面に流体流を適用することで、in vitroでの3D形態形成を開始できます。チップ上の腸では、培地を上下のマイクロチャネルに灌流すると上皮形態形成が始まりました（図3a）。前述のように、方向性のある分泌型形態形成阻害物質を継続的に除去するためには、下部（基底外側）コンパートメントに流体流を導入することが重要です。多孔質膜に結合した細胞に十分な栄養素と血清を提供し、管腔せん断応力を発生させるために、通常、チップ上の腸では二重流を適用します。ハイブリッドチップでは、上皮単層を含むトランスウェルインサートをハイブリッドチップに挿入しました。次に、マイクロチャネルを通して多孔質トランスウェルインサートの基底外側面に培地を適用しました。両方の培養プラットフォームで基底外側流を開始してから3～5日後に腸の形態形成が起こりました。
マイクロエンジニアリングされた 3D 上皮層の形態学的特徴は、位相差顕微鏡、微分干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡、SEM、または免疫蛍光共焦点顕微鏡 (図 3 および 4) など、さまざまなイメージング モダリティを適用して分析できます。位相差または DIC イメージングは​​、培養中のいつでも簡単に実行でき、3D 上皮層の形状と突出を監視できます。PDMS およびポリエステル フィルムの光学的透明性により、gut-on-a-chip プラットフォームとハイブリッド チップ プラットフォームの両方で、デバイスの切断や分解を必要とせずにリアルタイムの in situ イメージングを提供できます。免疫蛍光イメージング (図 1、3c、f および 4b、c) を実行する場合、細胞は通常、4% (wt/vol) パラホルムアルデヒド (PFA) で固定され、続いて Triton X-100 および 2% (wt/vol) ウシ血清アルブミン (BSA) で固定されます。細胞の種類に応じて、異なる固定剤、透過促進剤およびブロッキング剤を使用することができます。系統依存的な細胞または領域マーカーを標的とする一次抗体を使用して、チップ上に固定された細胞を強調し、続いて二次抗体と、核（例：4′,6-ジアミジノ-2-フェニレンインドール、DAPI）またはF-アクチン（例：蛍光標識ファロイジン）を標的とする対比染色色素を使用します。蛍光ベースのライブイメージングは​​、粘液産生（図1、「細胞分化」および「腸生理学」）、微生物細胞のランダムなコロニー形成（図1、「宿主-微生物共培養」）、免疫細胞の動員（図1、「疾患モデリング」）、または3D上皮形態の輪郭（図3c、fおよび4b、c）を検出するために、その場で実行することもできます。チップ上の腸を改変して上層を下部のマイクロチャネル層から分離する場合、図2に示すように、3D上皮形態と頂端刷子縁の微絨毛はSEMで可視化できる（図3b）。分化マーカーの発現は、定量的PCR5またはシングルセルRNAシーケンスによって評価できる。この場合、腸チップまたはハイブリッドチップで培養された上皮細胞の3D層はトリプシン処理によって採取され、その後、分子または遺伝子解析に使用される。
a、ハイブリッドチップでの腸管形態形成誘導のワークフロー。このプロトコルでは、Caco-2細胞と腸管オルガノイドを使用して、ハイブリッドチッププラットフォームでの3D形態形成を実証します。解離した上皮細胞を準備したトランスウェルインサート（TW prep、下図参照）に播種しました。細胞を播種（播種）し、トランスウェルインサート内のポリエステル膜に付着させた後、すべての細胞を静的条件下で培養しました（TW culture）。7日後、2D単層の上皮細胞を含む単一のトランスウェルインサートをハイブリッドチップに組み込み、基底外側流（Flow、BL）を導入し、最終的に3D上皮層（形態形成）を生成しました。位相差顕微鏡写真には、各実験ステップまたは時点における正常ドナー（C103株）上行結腸由来のヒト臓器上皮細胞の形態学的特徴が示されています。上層の模式図は、各ステップの実験構成を示しています。b、ハイブリッドチップ（左の模式図）は、オルガノイド上皮細胞の 3D 形態形成を、異なる Z 位置 (上、中、下。右の模式図と対応する点線を参照) で撮影したトップダウン共焦点顕微鏡画像で示します。明らかな形態学的特徴を示しました。F-アクチン (シアン)、核 (灰色)。c、静的 Transwell (TW; 白い破線枠内の挿入図) とハイブリッド チップ (最大のフルショット) で培養したオルガノイド由来上皮細胞の蛍光共焦点顕微鏡画像 (3D 斜めビュー) で、それぞれ 2D 形態と 3D 形態を比較しています。2D 垂直断面ビューのペア (右上隅の挿入図; 「XZ」) も、2D と 3D の特徴を示しています。スケール バー、100 µm。c 参考文献より許可を得て転載。4. Elsevier。
対照群は、同じ細胞（Caco-2細胞または腸管オルガノイド上皮細胞）を従来の静的培養条件下で二次元単層に培養することによって作製できます。特に、マイクロチャネルの容量が限られているため（元の腸管チップ設計では上部チャネルで約4 µL）、栄養枯渇が生じる可能性があります。したがって、基底側流適用前後の上皮形態を比較することもできます。
ソフトリソグラフィープロセスはクリーンルームで行う必要があります。チップ上の各層（上層、下層、メンブレン）およびハイブリッドチップでは、マイクロチャネルの高さが異なるため、異なるフォトマスクが使用され、別々のシリコンウェハ上に作製されました。チップ上の腸管の上部および下部のマイクロチャネルの目標高さは、それぞれ500 µmと200 µmです。ハイブリッドチップのチャネルの目標高さは200 µmです。
3インチのシリコンウェハをアセトンを入れた皿に置きます。皿を30秒間優しく回し、ウェハを自然乾燥させます。ウェハをIPAを入れた皿に移し、皿を30秒間回転させて洗浄します。
シリコンウェーハ表面から有機残留物を最大限に除去するために、ピラニア溶液（過酸化水素と濃硫酸の混合液、1:3（体積比））をオプションとして使用することができる。
ピラニア溶液は非常に腐食性が高く、発熱します。追加の安全対策が必要です。廃棄する際は、溶液を冷ましてから清潔で乾燥した廃棄容器に移してください。二次容器を使用し、廃棄容器には適切なラベルを貼ってください。より詳細な手順については、施設の安全ガイドラインに従ってください。
ウェハを200℃のホットプレート上に10分間置いて脱水する。脱水後、ウェハを空気中で5回振って冷却する。
洗浄済みのシリコンウェハの中央に、約10gのフォトレジストSU-8 2100を注ぎます。ピンセットを使用して、フォトレジストをウェハ上に均一に広げます。フォトレジストの粘着性を下げて広げやすくするために、時々ウェハを65℃のホットプレートに置きます。ウェハをホットプレートに直接置かないでください。
SU-8 はスピンコーティングによってウェハ上に均一に分布されます。SU-8 の入射回転を 5〜10 秒間プログラムし、100 rpm/s の加速度で 500 rpm で伝播させます。200 µm の厚さのパターニングの場合はメインスピンを 1,500 rpm に設定するか、1,200 rpm で 30 秒間 300 rpm/s の加速度で 250 µm の厚さ (チップ上のガットの上層の高さが 500 µm になります。下記の「重要な手順」を参照) を実現します。
主回転速度は、シリコンウェハ上のSU-8パターンの目標厚さに応じて調整できる。
チップ上の腸管の上層部用に高さ500µmのSU-8パターンを作製するために、このボックスのスピンコーティングとソフトベークのステップ（ステップ7と8）を順次繰り返し（ステップ9を参照）、厚さ250µmのSU-8層を2層作製し、このボックスのステップ12でUV露光により積層および接合することで、高さ500µmの層を作製した。
SU-8コーティングされたウェハを、65℃のホットプレート上に注意深く置いて5分間ソフトベークし、その後設定温度を95℃に切り替えてさらに40分間インキュベートします。
上部マイクロチャネルに高さ500μmのSU-8パターンを形成するには、手順7と8を繰り返して、厚さ250μmのSU-8層を2層形成する。
UVマスクアライナーを使用して、メーカーの指示に従ってランプテストを実行し、ウェーハの露光時間を計算します。（露光時間、ms）＝（露光量、mJ/cm2）／（ランプ出力、mW/cm2）。
露光時間を決定した後、フォトマスクをUVマスクアライナーのマスクホルダーにセットし、SU-8コーティングされたウェハ上にフォトマスクを配置します。
フォトマスクの印刷面をシリコンウェハのSU-8コーティング面に直接配置することで、紫外線の分散を最小限に抑えることができます。
SU-8コーティングされたウェハとフォトマスクを垂直に立て、所定の露光時間（このボックスのステップ10を参照）の間、260 mJ/cm2の紫外線に照射します。
UV照射後、SU-8コーティングされたシリコンウェハを各ホットプレート上で65℃で5分間、95℃で15分間焼成し、高さ200μmのパターンを作製した。95℃での焼成時間を30分に延長して、高さ500μmのパターンを作製した。
現像液をガラス皿に注ぎ、焼き上げたウエハを皿に置きます。SU-8現像液の量は、ガラス皿のサイズによって異なる場合があります。未露光のSU-8を完全に除去するために、十分な量のSU-8現像液を使用してください。たとえば、直径150mm、容量1Lのガラス皿を使用する場合は、約300mLのSU-8現像液を使用します。型を25分間現像し、時々軽く回転させます。
現像したカビを、ピペットを使って溶液を噴霧し、約10mLの新しい現像液で洗い流した後、IPAで洗い流します。
ウェーハをプラズマクリーナーに入れ、酸素プラズマ（大気圧ガス、目標圧力1×10⁻⁵ Torr、電力125 W）に1.5分間曝露する。
ガラススライドを内蔵した真空デシケーターにウェハーを置きます。ウェハーとスライドは並べて置くことができます。真空デシケーターがプレートで複数の層に分かれている場合は、スライドを下のチャンバーに、ウェハーを上のチャンバーに置きます。ガラススライドにトリクロロ(1H, 1H, 2H, 2H-パーフルオロオクチル)シラン溶液100 μLを滴下し、真空をかけてシラン化します。
凍結保存したCaco-2細胞の入ったバイアルを37℃の温水浴で解凍し、解凍した細胞を37℃に予熱した15mLのCaco-2培地が入ったT75フラスコに移す。
約90%のコンフルエンスに達したCaco-2細胞を継代培養するには、まずCaco-2培地、PBS、および0.25%トリプシン/1 mM EDTAを37℃のウォーターバスで温めます。
真空吸引により培地を吸引除去する。真空吸引を繰り返し、新しいPBSを加えることにより、5 mLの温かいPBSで細胞を2回洗浄する。