Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর সীমিত সমর্থন রয়েছে। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি হালনাগাদ ব্রাউজার ব্যবহার করার (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড বন্ধ করার) পরামর্শ দিচ্ছি। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি প্রদর্শন করব।
মানব অন্ত্রের গঠনপ্রক্রিয়া ত্রিমাত্রিক এপিথেলিয়াল মাইক্রোআর্কিটেকচার এবং স্থানিক বিন্যাসের ক্রিপ্ট-ভিলাস বৈশিষ্ট্য স্থাপন করে। এই অনন্য কাঠামোটি বেসাল ক্রিপ্টে থাকা স্টেম সেল নিচকে বাহ্যিক জীবাণু অ্যান্টিজেন এবং তাদের মেটাবোলাইট থেকে রক্ষা করে অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখার জন্য অপরিহার্য। এছাড়াও, অন্ত্রের ভিলাই এবং নিঃসৃত মিউকাস কার্যকরীভাবে পৃথকীকৃত এপিথেলিয়াল কোষগুলোকে অন্ত্রের মিউকোসাল পৃষ্ঠে একটি প্রতিরক্ষামূলক বাধা প্রদান করে। অতএব, ইন ভিট্রো অন্ত্র মডেল তৈরির জন্য ত্রিমাত্রিক এপিথেলিয়াল কাঠামো পুনর্নির্মাণ করা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। উল্লেখযোগ্যভাবে, জৈব অনুকরণকারী ‘গাট-অন-এ-চিপ’ উন্নত শারীরবৃত্তীয় কার্যকারিতা এবং বায়োমেকানিক্স সহ অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের স্বতঃস্ফূর্ত ত্রিমাত্রিক গঠনপ্রক্রিয়াকে প্ররোচিত করতে পারে। এখানে, আমরা একটি মাইক্রোফ্লুইডিক চিপে এবং একটি ট্রান্সওয়েল এমবেডেড হাইব্রিড চিপে অন্ত্রের গঠনপ্রক্রিয়াকে দৃঢ়ভাবে প্ররোচিত করার জন্য একটি পুনরুৎপাদনযোগ্য প্রোটোকল প্রদান করছি। আমরা ডিভাইস তৈরি, প্রচলিত পরিবেশে এবং একটি মাইক্রোফ্লুইডিক প্ল্যাটফর্মে ক্যাকো-২ বা অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড এপিথেলিয়াল কোষের কালচার, ত্রিমাত্রিক গঠনপ্রক্রিয়া প্ররোচিতকরণ এবং এর বিস্তারিত পদ্ধতি বর্ণনা করেছি। একাধিক ইমেজিং পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রতিষ্ঠিত ত্রিমাত্রিক এপিথেলিয়ার বৈশিষ্ট্য নিরূপণ। এই প্রোটোকলটি ৫ দিন ধরে বেসোলেটারাল তরল প্রবাহ নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে কার্যকরী অন্ত্রের মাইক্রোআর্কিটেকচারের পুনর্জন্ম ঘটায়। আমাদের ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিস পদ্ধতিটি শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক শিয়ার স্ট্রেস এবং যান্ত্রিক গতি ব্যবহার করে এবং এর জন্য জটিল সেল ইঞ্জিনিয়ারিং বা ম্যানিপুলেশনের প্রয়োজন হয় না, যা অন্যান্য বিদ্যমান কৌশলকে ছাড়িয়ে যেতে পারে। আমরা আশা করি যে আমাদের প্রস্তাবিত প্রোটোকলটি বায়োমেডিকেল গবেষণা সম্প্রদায়ের জন্য ব্যাপক প্রভাব ফেলতে পারে, যা বায়োমেডিকেল, ক্লিনিকাল এবং ফার্মাসিউটিক্যাল প্রয়োগের জন্য ইন ভিট্রোতে ত্রিমাত্রিক অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তর পুনর্জন্মের একটি পদ্ধতি প্রদান করবে।
পরীক্ষায় দেখা গেছে যে গাট-অন-এ-চিপ¹,²,³,⁴,⁵ অথবা দ্বিস্তরীয় মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইসে⁶,⁷ কালচার করা অন্ত্রের এপিথেলিয়াল ক্যাকো-২ কোষগুলি ইন ভিট্রোতে স্বতঃস্ফূর্তভাবে ত্রিমাত্রিক রূপ পরিবর্তন করতে পারে, যদিও এর অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়া সম্পর্কে স্পষ্ট ধারণা নেই। আমাদের সাম্প্রতিক গবেষণায় আমরা দেখেছি যে, ইন ভিট্রোতে ত্রিমাত্রিক এপিথেলিয়াল রূপ পরিবর্তন ঘটানোর জন্য কালচার ডিভাইস থেকে বেসোলেটারালি নিঃসৃত মরফোজেন অ্যান্টাগনিস্ট অপসারণ করাই যথেষ্ট এবং প্রয়োজনীয়, যা ক্যাকো-২ এবং রোগীর অন্ত্র থেকে প্রাপ্ত অর্গ্যানয়েডের মাধ্যমে প্রদর্শিত হয়েছে। এপিথেলিয়াল কোষগুলো যাচাই করা হয়েছিল। এই গবেষণায়, আমরা বিশেষভাবে "গাট-অন-এ-চিপ" এবং ট্রান্সওয়েল ইনসার্টযুক্ত পরিবর্তিত মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইস, যাকে "হাইব্রিড চিপ" বলা হয়, সেগুলিতে একটি শক্তিশালী Wnt অ্যান্টাগনিস্ট, ডিককফ-১ (DKK-1)-এর কোষ উৎপাদন এবং ঘনত্বের বণ্টনের উপর মনোযোগ দিয়েছি। আমরা দেখিয়েছি যে অন-চিপ অন্ত্রে বহিরাগত Wnt অ্যান্টাগনিস্ট (যেমন DKK-1, Wnt রিপ্রেসর 1, সিক্রেটেড ফ্রিজল্ড-রিলেটেড প্রোটিন 1, বা সগি-1) যোগ করলে তা মরফোজেনেসিসকে বাধা দেয় বা পূর্ব-গঠিত 3D এপিথেলিয়াল স্তরকে ব্যাহত করে, যা ইঙ্গিত দেয় যে কালচারের সময়কার অ্যান্টাগনিস্টিক স্ট্রেস ইন ভিট্রো অন্ত্রের মরফোজেনেসিসের জন্য দায়ী। অতএব, এপিথেলিয়াল ইন্টারফেসে শক্তিশালী মরফোজেনেসিস অর্জনের একটি বাস্তবসম্মত উপায় হলো সক্রিয় ফ্লাশিং (যেমন, গাট-অন-এ-চিপ বা হাইব্রিড-অন-এ-চিপ প্ল্যাটফর্মে) বা ডিফিউশনের মাধ্যমে বেসোলেটারাল কম্পার্টমেন্ট থেকে Wnt অ্যান্টাগনিস্টের মাত্রা অপসারণ করা বা ন্যূনতম পর্যায়ে বজায় রাখা। বেসোলেটারাল মিডিয়া (যেমন, ট্রান্সওয়েল ইনসার্ট থেকে বড় কূপের বেসোলেটারাল জলাধার)।
এই প্রোটোকলে, আমরা গাট-অন-এ-চিপ মাইক্রোডিভাইস এবং ট্রান্সওয়েল-সন্নিবেশযোগ্য হাইব্রিড চিপ (ধাপ ১-৫) তৈরির একটি বিশদ পদ্ধতি প্রদান করেছি, যার মাধ্যমে পলিডাইমিথাইলসিলোক্সেন (PDMS)-ভিত্তিক ছিদ্রযুক্ত মেমব্রেনে (ধাপ ৬এ, ৭এ, ৮, ৯) অথবা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টের পলিয়েস্টার মেমব্রেনে (ধাপ ৬বি, ৭বি, ৮, ৯) অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষ কালচার করা হয় এবং ইন ভিট্রোতে ত্রিমাত্রিক (3D) মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করা হয় (ধাপ ১০)। আমরা একাধিক ইমেজিং পদ্ধতি প্রয়োগ করে টিস্যু-নির্দিষ্ট হিস্টোজেনেসিস এবং বংশ-নির্ভর কোষীয় পার্থক্যের নির্দেশক কোষীয় ও আণবিক বৈশিষ্ট্যগুলোও শনাক্ত করেছি (ধাপ ১১-২৪)। আমরা মানুষের অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষ, যেমন Caco-2 বা অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড ব্যবহার করে দুটি কালচার ফরম্যাটে মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করি, যার প্রযুক্তিগত বিবরণের মধ্যে রয়েছে ছিদ্রযুক্ত মেমব্রেনের পৃষ্ঠ পরিবর্তন, দ্বিমাত্রিক (2D) মনোলেয়ার তৈরি এবং অন্ত্রের জৈব-রাসায়নিক ও জৈব-যান্ত্রিক মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের পুনরুৎপাদন। দ্বিমাত্রিক এপিথেলিয়াল কোষ থেকে ত্রিমাত্রিক (3D) মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করার জন্য... মনোলেয়ারের ক্ষেত্রে, আমরা কালচারের বেসোলেটারাল কম্পার্টমেন্টে মিডিয়াম প্রবাহিত করে উভয় কালচারকৃত ফর্ম থেকে মরফোজেন অ্যান্টাগনিস্ট অপসারণ করেছি। পরিশেষে, আমরা একটি পুনরুজ্জীবনযোগ্য 3D এপিথেলিয়াল স্তরের উপযোগিতার একটি উপস্থাপনা প্রদান করি যা মরফোজেন-নির্ভর এপিথেলিয়াল বৃদ্ধি, অনুদৈর্ঘ্য হোস্ট-মাইক্রোবায়োম কো-কালচার, প্যাথোজেন সংক্রমণ, প্রদাহজনিত আঘাত, এপিথেলিয়াল বাধা অকার্যকারিতা এবং প্রোবায়োটিক-ভিত্তিক থেরাপির মডেল হিসেবে ব্যবহার করা যেতে পারে। উদাহরণ। প্রভাব।
আমাদের প্রোটোকলটি মৌলিক (যেমন, অন্ত্রের মিউকোসাল বায়োলজি, স্টেম সেল বায়োলজি, এবং ডেভেলপমেন্টাল বায়োলজি) এবং ফলিত গবেষণার (যেমন, প্রি-ক্লিনিক্যাল ড্রাগ টেস্টিং, ডিজিজ মডেলিং, টিস্যু ইঞ্জিনিয়ারিং, এবং গ্যাস্ট্রোএন্টারোলজি) ক্ষেত্রে বিস্তৃত বিজ্ঞানীদের জন্য উপযোগী হতে পারে। ইন ভিট্রোতে অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের 3D মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করার জন্য আমাদের প্রোটোকলের পুনরুৎপাদনযোগ্যতা এবং দৃঢ়তার কারণে, আমরা আশা করি যে আমাদের প্রযুক্তিগত কৌশলটি অন্ত্রের বিকাশ, পুনর্জন্ম বা হোমিওস্ট্যাসিসের সময় সেল সিগন্যালিং-এর গতিশীলতা অধ্যয়নকারী গবেষকদের কাছে ছড়িয়ে দেওয়া যেতে পারে। এছাড়াও, আমাদের প্রোটোকলটি নোরোভাইরাস ৮, সিভিয়ার অ্যাকিউট রেসপিরেটরি সিন্ড্রোম করোনাভাইরাস ২ (SARS-CoV-2), ক্লোস্ট্রিডিয়াম ডিফিসিল, সালমোনেলা টাইফিমুরিয়াম ৯ বা ভিব্রিও কলেরি-র মতো বিভিন্ন সংক্রামক জীবাণুর দ্বারা সৃষ্ট সংক্রমণ পরীক্ষা করার জন্য উপযোগী। রোগের প্যাথলজি এবং প্যাথোজেনেসিসের শ্রোতারাও উপযোগী। একটি অন-চিপ গাট মাইক্রোফিজিওলজি সিস্টেমের ব্যবহার অনুদৈর্ঘ্য সহ-সংস্কৃতি 10 এবং পরবর্তীকালে গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল (জিআই) ট্র্যাক্টে হোস্ট প্রতিরক্ষা, ইমিউন প্রতিক্রিয়া এবং রোগজীবাণু-সম্পর্কিত আঘাত মেরামতের মূল্যায়ন 11 করার সুযোগ দিতে পারে। লিকি গাট সিন্ড্রোম, সিলিয়াক ডিজিজ, ক্রোন'স ডিজিজ, আলসারেটিভ কোলাইটিস, পাউচাইটিস, বা ইরিটেবল বাওয়েল সিন্ড্রোমের সাথে সম্পর্কিত অন্যান্য জিআই ব্যাধিগুলি অনুকরণ করা যেতে পারে যখন রোগীর 3D অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তর ব্যবহার করে 3D অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তর প্রস্তুত করা হয়, এই রোগগুলির মধ্যে রয়েছে ভিলাস অ্যাট্রোফি, ক্রিপ্ট ছোট হয়ে যাওয়া, মিউকোসাল ক্ষতি, বা ক্ষতিগ্রস্ত এপিথেলিয়াল বাধা। বায়োপসি বা স্টেম সেল থেকে প্রাপ্ত অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড 12,13। রোগের পরিবেশের উচ্চতর জটিলতাকে আরও ভালভাবে মডেল করার জন্য, পাঠকরা 3D অন্ত্রের ভিলাস-ক্রিপ্ট মাইক্রোআর্কিটেকচার ধারণকারী মডেলগুলিতে রোগ-সম্পর্কিত কোষের প্রকার, যেমন রোগীর পেরিফেরাল রক্ত ​​​​মনোনিউক্লিয়ার কোষ (PBMCs), টিস্যু-নির্দিষ্ট ইমিউন কোষ, 5 যোগ করার কথা বিবেচনা করতে পারেন।
যেহেতু সেকশনিং প্রক্রিয়া ছাড়াই 3D এপিথেলিয়াল মাইক্রোস্ট্রাকচার স্থির এবং দৃশ্যমান করা যায়, তাই যারা স্পেশিয়াল ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স এবং উচ্চ-রেজোলিউশন বা সুপার-রেজোলিউশন ইমেজিং নিয়ে কাজ করেন, তারা এপিথেলিয়াল নিশে জিন এবং প্রোটিনের স্থানকালিক গতিশীলতার আমাদের ম্যাপিং-এ আগ্রহী হতে পারেন। প্রযুক্তিতে আগ্রহী। মাইক্রোবিয়াল বা ইমিউন উদ্দীপনার প্রতি প্রতিক্রিয়া। অধিকন্তু, বিভিন্ন মাইক্রোবিয়াল প্রজাতি, মাইক্রোবিয়াল কমিউনিটি বা ফেকাল মাইক্রোবায়োটার সহ-চাষের মাধ্যমে, বিশেষ করে গাট-অন-এ-চিপ-এ, 3D অন্ত্রের মিউকোসাল স্তরে অনুদৈর্ঘ্য হোস্ট-মাইক্রোবায়োম ক্রসটক 10, 14 স্থাপন করা যেতে পারে যা অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিসকে সমন্বয় করে। এই পদ্ধতিটি বিশেষত মিউকোসাল ইমিউনোলজি, গ্যাস্ট্রোএন্টারোলজি, হিউম্যান মাইক্রোবায়োম, কালচারোমিক্স এবং ক্লিনিক্যাল মাইক্রোবায়োলজি নিয়ে অধ্যয়নরত শ্রোতাদের কাছে আকর্ষণীয়, যারা পরীক্ষাগারে পূর্বে অকালচারকৃত অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা চাষ করতে চান। যদি আমাদের ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিস প্রোটোকলটি স্কেলেবল কালচার ফরম্যাটের সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়া যায়, যেমন ২৪, ৯৬ বা ৩৮৪ ওয়েল প্লেটে মাল্টিওয়েল ইনসার্ট যা ক্রমাগত বেসোলেটারাল কম্পার্টমেন্টগুলি পূরণ করে, তবে এই প্রোটোকলটি ফার্মাসিউটিক্যাল, বায়োমেডিকেল অথবা খাদ্য শিল্পের জন্য হাই-থ্রুপুট স্ক্রিনিং বা ভ্যালিডেশন প্ল্যাটফর্ম তৈরিকারীদের কাছেও ছড়িয়ে দেওয়া যেতে পারে। একটি প্রুফ-অফ-প্রিন্সিপল হিসাবে, আমরা সম্প্রতি একটি মাল্টিপ্লেক্স হাই-থ্রুপুট মরফোজেনেসিস সিস্টেমের সম্ভাব্যতা প্রদর্শন করেছি যা একটি ২৪-ওয়েল প্লেট ফরম্যাটে স্কেলেবল। এছাড়াও, একাধিক অর্গান-অন-এ-চিপ পণ্য বাণিজ্যিকীকরণ করা হয়েছে¹⁶,¹⁷,¹⁸। অতএব, আমাদের ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিস পদ্ধতির বৈধতা ত্বরান্বিত করা যেতে পারে এবং সম্ভাব্যভাবে অনেক গবেষণা পরীক্ষাগার, শিল্প বা সরকার এবং নিয়ন্ত্রক সংস্থাগুলি দ্বারা গৃহীত হতে পারে ট্রান্সক্রিপ্টোমিক স্তরে ইন ভিট্রো অন্ত্রের মরফোজেনেসিসের সেলুলার রিপ্রোগ্রামিং বোঝার জন্য। ওষুধ বা বায়োথেরাপিউটিকস পরীক্ষার স্তর: অন্ত্রের অঙ্গসংস্থান প্রক্রিয়ার পুনরুৎপাদনযোগ্যতা মূল্যায়ন করার জন্য, পরীক্ষামূলক ওষুধের শোষণ এবং পরিবহন ত্রিমাত্রিক (3D) অন্ত্রের বিকল্প মডেল অথবা বিশেষভাবে তৈরি বা বাণিজ্যিক অর্গান-অন-এ-চিপ মডেল ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।
অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষের গঠন প্রক্রিয়া অধ্যয়নের জন্য সীমিত সংখ্যক মানব-প্রাসঙ্গিক পরীক্ষামূলক মডেল ব্যবহৃত হয়েছে, যার প্রধান কারণ হলো ইন ভিট্রোতে ত্রিমাত্রিক (3D) গঠন প্রক্রিয়া প্ররোচিত করার জন্য বাস্তবায়নযোগ্য প্রোটোকলের অভাব। প্রকৃতপক্ষে, অন্ত্রের গঠন প্রক্রিয়া সম্পর্কে বর্তমান জ্ঞানের বেশিরভাগই প্রাণী গবেষণার উপর ভিত্তি করে তৈরি (যেমন, জেব্রাফিশ২০, ইঁদুর২১ বা মুরগি২২)। তবে, এগুলো শ্রম- এবং ব্যয়বহুল, নৈতিকভাবে প্রশ্নবিদ্ধ হতে পারে, এবং সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণভাবে, এগুলো মানুষের বিকাশ প্রক্রিয়াকে সঠিকভাবে নির্ধারণ করে না। এই মডেলগুলো বহু-মুখী পরিমাপযোগ্য পদ্ধতিতে পরীক্ষা করার ক্ষমতার দিক থেকেও খুব সীমিত। অতএব, ইন ভিট্রোতে ত্রিমাত্রিক (3D) টিস্যু কাঠামো পুনরুৎপাদনের জন্য আমাদের প্রোটোকলটি ইন ভিভো প্রাণী মডেলের পাশাপাশি অন্যান্য ঐতিহ্যবাহী স্থির দ্বিমাত্রিক (2D) কোষ কালচার মডেলকেও ছাড়িয়ে যায়। পূর্বে যেমন বর্ণনা করা হয়েছে, ত্রিমাত্রিক (3D) এপিথেলিয়াল কাঠামো ব্যবহার করে আমরা বিভিন্ন মিউকোসাল বা ইমিউন উদ্দীপনার প্রতিক্রিয়ায় ক্রিপ্ট-ভিলাস অক্ষে বিভেদিত কোষের স্থানিক অবস্থান পরীক্ষা করতে পেরেছি। ত্রিমাত্রিক (3D) এপিথেলিয়াল স্তরগুলো এই ক্ষেত্র প্রদান করতে পারে যেখানে অধ্যয়ন করা যায় কীভাবে অণুজীব কোষগুলো স্থানিক স্থান (spatial niche) গঠনের জন্য প্রতিযোগিতা করে এবং পোষক উপাদানের (যেমন, অভ্যন্তরীণ) প্রতিক্রিয়ায় পরিবেশগত বিবর্তন ঘটে। বাইরের মিউকাস স্তরের তুলনায়, IgA এবং অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল পেপটাইডের নিঃসরণ)। অধিকন্তু, ত্রিমাত্রিক এপিথেলিয়াল মরফোলজি আমাদের বুঝতে সাহায্য করে যে, অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা কীভাবে তার কমিউনিটিগুলোকে গঠন করে এবং সমন্বিতভাবে মাইক্রোবিয়াল মেটাবোলাইট (যেমন, শর্ট-চেইন ফ্যাটি অ্যাসিড) উৎপাদন করে, যা বেসাল ক্রিপ্টগুলিতে কোষীয় সংগঠন এবং স্টেম সেল নিচকে আকার দেয়। এই বৈশিষ্ট্যগুলি কেবল তখনই প্রদর্শন করা সম্ভব যখন ইন ভিট্রোতে ত্রিমাত্রিক এপিথেলিয়াল স্তর স্থাপন করা হয়।
আমাদের ত্রিমাত্রিক (3D) অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কাঠামো তৈরির পদ্ধতি ছাড়াও, বেশ কিছু ইন ভিট্রো (in vitro) পদ্ধতি রয়েছে। অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড কালচার হলো একটি অত্যাধুনিক টিস্যু ইঞ্জিনিয়ারিং কৌশল যা নির্দিষ্ট মরফোজেন অবস্থার অধীনে অন্ত্রের স্টেম সেল চাষের উপর ভিত্তি করে তৈরি। তবে, ট্রান্সপোর্ট বিশ্লেষণ বা হোস্ট-মাইক্রোবায়োম সহ-কালচারের জন্য ত্রিমাত্রিক অর্গ্যানয়েড মডেলের ব্যবহার প্রায়শই চ্যালেঞ্জিং হয়, কারণ অন্ত্রের লুমেন অর্গ্যানয়েডের মধ্যে আবদ্ধ থাকে এবং তাই, মাইক্রোবিয়াল কোষ বা বহিরাগত অ্যান্টিজেনের মতো লুমেনীয় উপাদানগুলির প্রবেশ সীমিত হয়ে পড়ে। একটি মাইক্রোইনজেক্টর ব্যবহার করে অর্গ্যানয়েড লুমেনে প্রবেশাধিকার উন্নত করা যেতে পারে, কিন্তু এই পদ্ধতিটি আক্রমণাত্মক এবং শ্রম-নিবিড় এবং এটি সম্পাদনের জন্য বিশেষ জ্ঞানের প্রয়োজন। অধিকন্তু, স্থির অবস্থায় হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ডে রক্ষণাবেক্ষণ করা ঐতিহ্যবাহী অর্গ্যানয়েড কালচারগুলি সক্রিয় ইন ভিভো বায়োমেকানিক্সকে সঠিকভাবে প্রতিফলিত করে না।
বিভিন্ন গবেষণা দল দ্বারা ব্যবহৃত অন্যান্য পদ্ধতিগুলো জেলের পৃষ্ঠে বিচ্ছিন্ন মানব অন্ত্রের কোষ কালচার করে অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কাঠামোর অনুকরণে পূর্ব-কাঠামোযুক্ত ৩ডি হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ড ব্যবহার করে। ৩ডি-প্রিন্টেড, মাইক্রো-মিলড, বা লিথোগ্রাফিকভাবে নির্মিত ছাঁচ ব্যবহার করে হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ড তৈরি করা হয়। এই পদ্ধতিটি শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক মরফোজেন গ্রেডিয়েন্ট সহ ইন ভিট্রোতে বিচ্ছিন্ন এপিথেলিয়াল কোষের স্ব-সংগঠিত বিন্যাস দেখায়, যা স্ক্যাফোল্ডে স্ট্রোমাল কোষ অন্তর্ভুক্ত করার মাধ্যমে একটি উচ্চ অ্যাসপেক্ট রেশিও এপিথেলিয়াল কাঠামো এবং স্ট্রোমা-এপিথেলিয়াল ক্রসটক স্থাপন করে। তবে, পূর্ব-কাঠামোযুক্ত স্ক্যাফোল্ডের প্রকৃতি স্বতঃস্ফূর্ত মরফোজেনেটিক প্রক্রিয়াটির প্রদর্শনে বাধা দিতে পারে। এই মডেলগুলো গতিশীল লুমিনাল বা ইন্টারস্টিশিয়াল প্রবাহও সরবরাহ করে না, এবং অন্ত্রের কোষের মরফোজেনেসিস ও শারীরবৃত্তীয় কার্যকারিতা অর্জনের জন্য প্রয়োজনীয় ফ্লুইড শিয়ার স্ট্রেসের অভাব থাকে। সাম্প্রতিক আরেকটি গবেষণায় একটি মাইক্রোফ্লুইডিক প্ল্যাটফর্মে হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ড ব্যবহার করা হয়েছে এবং লেজার-এচিং কৌশল ব্যবহার করে অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কাঠামোর প্যাটার্ন তৈরি করা হয়েছে। ইঁদুরের অন্ত্রের অর্গ্যানয়েডগুলো এচ করা প্যাটার্ন অনুসরণ করে অন্ত্রের নলাকার কাঠামো তৈরি করে, এবং একটি মাইক্রোফ্লুইডিক্স ব্যবহার করে ইন্ট্রালুমিনাল ফ্লুইড প্রবাহ পুনরায় তৈরি করা যায়। তবে, এই মডেলটিতে স্বতঃস্ফূর্ত রূপসৃষ্টিকারী প্রক্রিয়া দেখা যায় না এবং এতে অন্ত্রের যান্ত্রিক-জৈবিক নড়াচড়াও অন্তর্ভুক্ত নেই। একই দলের থ্রিডি প্রিন্টিং কৌশল ব্যবহার করে স্বতঃস্ফূর্ত রূপসৃষ্টিকারী প্রক্রিয়াসহ ক্ষুদ্র অন্ত্রনালী তৈরি করা সম্ভব হয়েছিল। নালীর মধ্যে অন্ত্রের বিভিন্ন অংশের জটিল গঠন সত্ত্বেও, এই মডেলেও অভ্যন্তরীণ তরল প্রবাহ এবং যান্ত্রিক বিকৃতির অভাব রয়েছে। উপরন্তু, মডেলটির কার্যকারিতা সীমিত হতে পারে, বিশেষ করে বায়োপ্রিন্টিং প্রক্রিয়া সম্পন্ন হওয়ার পরে, যা পরীক্ষামূলক পরিস্থিতি বা কোষ-থেকে-কোষ মিথস্ক্রিয়াকে ব্যাহত করে। এর পরিবর্তে, আমাদের প্রস্তাবিত প্রোটোকলটি স্বতঃস্ফূর্ত অন্ত্রের রূপসৃষ্টি, শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক শিয়ার স্ট্রেস, অন্ত্রের সচলতার অনুকরণকারী বায়োমেকানিক্স, স্বাধীন অ্যাপিকাল এবং বেসোলেটারাল প্রকোষ্ঠের প্রবেশগম্যতা এবং মডিউলারিটির জটিল জৈবিক ক্ষুদ্র পরিবেশের পুনঃসৃষ্টি প্রদান করে। অতএব, আমাদের ইন ভিট্রো থ্রিডি রূপসৃষ্টি প্রোটোকলটি বিদ্যমান পদ্ধতিগুলোর প্রতিবন্ধকতা কাটিয়ে ওঠার জন্য একটি পরিপূরক পন্থা প্রদান করতে পারে।
আমাদের প্রোটোকলটি সম্পূর্ণরূপে ত্রিমাত্রিক (3D) এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিসের উপর কেন্দ্রীভূত, যেখানে কালচারে শুধুমাত্র এপিথেলিয়াল কোষ থাকে এবং মেসেনকাইমাল কোষ, এন্ডোথেলিয়াল কোষ এবং ইমিউন কোষের মতো অন্য কোনও ধরণের পার্শ্ববর্তী কোষ থাকে না। পূর্বে যেমন বর্ণনা করা হয়েছে, আমাদের প্রোটোকলের মূল ভিত্তি হলো প্রবর্তিত মিডিয়ামের বেসোলেটারাল দিক থেকে নিঃসৃত মরফোজেন ইনহিবিটর অপসারণের মাধ্যমে এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিসকে প্ররোচিত করা। যদিও আমাদের গাট-অন-এ-চিপ এবং হাইব্রিড-অন-এ-চিপের শক্তিশালী মডুলারিটি আমাদেরকে ঢেউ খেলানো ত্রিমাত্রিক (3D) এপিথেলিয়াল স্তর পুনরায় তৈরি করতে সক্ষম করে, তবুও অতিরিক্ত জৈবিক জটিলতা যেমন এপিথেলিয়াল-মেসেনকাইমাল মিথস্ক্রিয়া³³,³⁴, এক্সট্রাসেলুলার ম্যাট্রিক্স (ECM) জমা হওয়া³⁵ এবং, আমাদের মডেলে, ক্রিপ্ট-ভিলাস বৈশিষ্ট্য যা বেসাল ক্রিপ্টে স্টেম সেল নিচ বহন করে, সেগুলোকে আরও বিবেচনা করা বাকি রয়েছে। মেসেনকাইমের স্ট্রোমাল কোষ (যেমন, ফাইব্রোব্লাস্ট) ইন ভিভোতে ECM প্রোটিন উৎপাদন এবং অন্ত্রের মরফোজেনেসিস নিয়ন্ত্রণে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে³⁵,³⁷,³⁸। আমাদের মডেলে মেসেনকাইমাল কোষের সংযোজন বৃদ্ধি করেছে। রূপগত প্রক্রিয়া এবং কোষ সংযুক্তি দক্ষতা। অন্ত্রের মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে আণবিক পরিবহন³⁹ এবং ইমিউন কোষ সংগ্রহ⁴⁰ নিয়ন্ত্রণে এন্ডোথেলিয়াল স্তর (অর্থাৎ, কৈশিক বা লসিকা) একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। অধিকন্তু, যখন বহু-অঙ্গ মিথস্ক্রিয়া প্রদর্শনের জন্য টিস্যু মডেল ডিজাইন করা হয়, তখন টিস্যু মডেলগুলির মধ্যে সংযোগ স্থাপনযোগ্য ভাস্কুলার উপাদান একটি পূর্বশর্ত। অতএব, অঙ্গ-স্তরের রেজোলিউশন সহ আরও সঠিক শারীরবৃত্তীয় বৈশিষ্ট্য মডেল করার জন্য এন্ডোথেলিয়াল কোষ অন্তর্ভুক্ত করার প্রয়োজন হতে পারে। অন্ত্রের রোগের অনুকরণের প্রেক্ষাপটে সহজাত প্রতিরোধ প্রতিক্রিয়া, অ্যান্টিজেন উপস্থাপন, সহজাত অভিযোজিত প্রতিরোধ ক্রসটক এবং টিস্যু-নির্দিষ্ট অনাক্রম্যতা প্রদর্শনের জন্য রোগী-থেকে-প্রাপ্ত প্রতিরোধ কোষও অপরিহার্য।
গাট-অন-এ-চিপের তুলনায় হাইব্রিড চিপের ব্যবহার বেশি সরল, কারণ এর ডিভাইস সেটআপ আরও সহজ এবং ট্রান্সওয়েল ইনসার্টের ব্যবহার অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের স্কেলেবল কালচারের সুযোগ করে দেয়। তবে, পলিয়েস্টার মেমব্রেনযুক্ত বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ ট্রান্সওয়েল ইনসার্টগুলো স্থিতিস্থাপক নয় এবং পেরিস্টালটিক-সদৃশ নড়াচড়ার অনুকরণ করতে পারে না। অধিকন্তু, হাইব্রিড চিপে স্থাপিত ট্রান্সওয়েল ইনসার্টের এপিকাল কম্পার্টমেন্টটি স্থির থাকে এবং এর এপিকাল দিকে কোনো শিয়ার স্ট্রেস থাকে না। স্পষ্টতই, এপিকাল কম্পার্টমেন্টের এই স্থির বৈশিষ্ট্যগুলো হাইব্রিড চিপে দীর্ঘমেয়াদী ব্যাকটেরিয়াল কো-কালচারকে খুব কমই সম্ভব করে তোলে। যদিও হাইব্রিড চিপ ব্যবহার করে আমরা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে দৃঢ়ভাবে 3D মরফোজেনেসিস ঘটাতে পারি, শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক বায়োমেকানিক্স এবং এপিকাল ফ্লুইড ফ্লো-এর অভাব সম্ভাব্য প্রয়োগের জন্য হাইব্রিড চিপ প্ল্যাটফর্মের কার্যকারিতাকে সীমিত করতে পারে।
গাট-অন-এ-চিপ এবং হাইব্রিড-অন-এ-চিপ কালচারে মানব ক্রিপ্ট-ভিলাস অক্ষের পূর্ণাঙ্গ পুনর্গঠন এখনও সম্পূর্ণরূপে প্রতিষ্ঠিত হয়নি। যেহেতু অঙ্গসংস্থান একটি এপিথেলিয়াল মনোলেয়ার থেকে শুরু হয়, তাই 3D মাইক্রোআর্কিটেকচারগুলো ইন ভিভো ক্রিপ্টগুলোর সাথে অগত্যা রূপগত সাদৃশ্য প্রদান করে না। যদিও আমরা মাইক্রোইঞ্জিনিয়ার্ড 3D এপিথেলিয়ামে বেসাল ক্রিপ্ট ডোমেইনের কাছাকাছি বিভাজিত কোষের জনসংখ্যাকে চিহ্নিত করেছি, ক্রিপ্ট এবং ভিলাস অঞ্চলগুলো স্পষ্টভাবে চিহ্নিত করা যায়নি। যদিও চিপের উপরের চ্যানেলগুলো মাইক্রোইঞ্জিনিয়ার্ড এপিথেলিয়ামের উচ্চতা বৃদ্ধি করে, সর্বোচ্চ উচ্চতা এখনও ~300-400 µm-এর মধ্যে সীমাবদ্ধ। ক্ষুদ্রান্ত্র এবং বৃহদন্ত্রে মানব অন্ত্রের ক্রিপ্টগুলোর প্রকৃত গভীরতা যথাক্রমে ~135 µm এবং ~400 µm, এবং ক্ষুদ্রান্ত্রের ভিলাসের উচ্চতা ~600 µm।
ইমেজিংয়ের দৃষ্টিকোণ থেকে, ত্রিমাত্রিক মাইক্রোআর্কিটেকচারের ইন সিটু সুপার-রেজোলিউশন ইমেজিং ‘গাট অন এ চিপ’-এর মধ্যেই সীমাবদ্ধ থাকতে পারে, কারণ অবজেক্টিভ লেন্স থেকে এপিথেলিয়াল স্তর পর্যন্ত প্রয়োজনীয় ওয়ার্কিং ডিসটেন্স কয়েক মিলিমিটারের মতো হয়ে থাকে। এই সমস্যাটি কাটিয়ে ওঠার জন্য একটি দূরবর্তী অবজেক্টিভের প্রয়োজন হতে পারে। অধিকন্তু, পিডিএমএস-এর উচ্চ স্থিতিস্থাপকতার কারণে ইমেজিং স্পেসিমেন প্রস্তুতির জন্য পাতলা সেকশন তৈরি করা বেশ কঠিন। এছাড়াও, যেহেতু ‘গাট অন এ চিপ’-এর স্তর-পর-স্তর মাইক্রোফ্যাব্রিকেশনে প্রতিটি স্তরের মধ্যে স্থায়ী আসঞ্জন জড়িত থাকে, তাই এপিথেলিয়াল স্তরের পৃষ্ঠ কাঠামো পরীক্ষা করার জন্য উপরের স্তরটি খোলা বা অপসারণ করা অত্যন্ত কঠিন। উদাহরণস্বরূপ, একটি স্ক্যানিং ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (SEM) ব্যবহার করে এটি করা যায়।
হাইড্রোফোবিক ক্ষুদ্র অণু নিয়ে কাজ করা মাইক্রোফ্লুইডিক-ভিত্তিক গবেষণায় PDMS-এর হাইড্রোফোবিসিটি একটি সীমাবদ্ধতা হয়ে দাঁড়িয়েছে, কারণ PDMS অনির্দিষ্টভাবে এই ধরনের হাইড্রোফোবিক অণু শোষণ করতে পারে। PDMS-এর বিকল্প হিসেবে অন্যান্য পলিমারিক পদার্থ বিবেচনা করা যেতে পারে। বিকল্পভাবে, হাইড্রোফোবিক অণুর শোষণ কমানোর জন্য PDMS-এর পৃষ্ঠতল পরিবর্তন (যেমন, লাইপোফিলিক পদার্থ 42 বা পলি(ইথিলিন গ্লাইকোল) 43 দিয়ে প্রলেপ দেওয়া) বিবেচনা করা যেতে পারে।
অবশেষে, একটি উচ্চ-ক্ষমতাসম্পন্ন স্ক্রিনিং বা সকলের জন্য প্রযোজ্য একটি ব্যবহার-বান্ধব পরীক্ষামূলক প্ল্যাটফর্ম প্রদানের ক্ষেত্রে আমাদের পদ্ধতিটি এখনও ভালোভাবে বৈশিষ্ট্যমণ্ডিত হয়নি। বর্তমান প্রোটোকল অনুযায়ী প্রতিটি মাইক্রোডিভাইসের জন্য একটি করে সিরিঞ্জ পাম্পের প্রয়োজন হয়, যা একটি CO2 ইনকিউবেটরে জায়গা দখল করে এবং বৃহৎ পরিসরের পরীক্ষা-নিরীক্ষায় বাধা সৃষ্টি করে। উদ্ভাবনী কালচার ফরম্যাটের (যেমন, ২৪-ওয়েল, ৯৬-ওয়েল, বা ৩৮৪-ওয়েল ছিদ্রযুক্ত ইনসার্ট যা বেসোলেটারাল মিডিয়ার অবিচ্ছিন্ন প্রতিস্থাপন এবং অপসারণের সুযোগ দেয়) প্রসারণযোগ্যতার মাধ্যমে এই সীমাবদ্ধতা উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করা যেতে পারে।
ইন ভিট্রোতে মানব অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের ত্রিমাত্রিক রূপায়ণ (3D morphogenesis) প্ররোচিত করার জন্য, আমরা একটি মাইক্রোফ্লুইডিক চিপ ইন্টেস্টাইনাল ডিভাইস ব্যবহার করেছি, যাতে দুটি সমান্তরাল মাইক্রোচ্যানেল এবং মাঝখানে একটি লুমেন-ক্যাপিলারি ইন্টারফেস তৈরির জন্য একটি স্থিতিস্থাপক ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লি রয়েছে। আমরা একটি একক-চ্যানেল মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইসের (একটি হাইব্রিড চিপ) ব্যবহারও প্রদর্শন করেছি, যা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে জন্মানো পোলারাইজড এপিথেলিয়াল স্তরের নিচে অবিচ্ছিন্ন বেসোলেটারাল প্রবাহ সরবরাহ করে। উভয় প্ল্যাটফর্মেই, বেসোলেটারাল কম্পার্টমেন্ট থেকে মরফোজেন অ্যান্টাগনিস্টদের অপসারণ করার জন্য প্রবাহের দিকনির্দেশক ম্যানিপুলেশন প্রয়োগ করে বিভিন্ন মানব অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষের রূপায়ণ প্রদর্শন করা যেতে পারে। সম্পূর্ণ পরীক্ষামূলক পদ্ধতিটি (চিত্র ১) পাঁচটি অংশ নিয়ে গঠিত: (i) গাট চিপ বা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টেবল হাইব্রিড চিপের মাইক্রোফ্যাব্রিকেশন (ধাপ ১-৫; বক্স ১), (ii) অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষ (ক্যাকো-২ কোষ) বা মানব অন্ত্রের অর্গ্যানয়েডের প্রস্তুতি; (বক্স ২-৫), (iii) ইন্টেস্টাইনাল চিপ বা হাইব্রিড চিপে ইন্টেস্টাইনাল এপিথেলিয়াল কোষের কালচার (ধাপ ৬-৯), (iv) ইন ভিট্রোতে ৩ডি মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করা (ধাপ ১০) এবং (v) ৩ডি এপিথেলিয়াল মাইক্রোস্ট্রাকচারের বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করা (ধাপ ১১-২৪)। পরিশেষে, স্থানিক, কালিক, শর্তাধীন বা পদ্ধতিগত নিয়ন্ত্রণের সাথে এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিসের তুলনা করে ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিসের কার্যকারিতা যাচাই করার জন্য একটি উপযুক্ত নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠী (যা নীচে আরও আলোচনা করা হয়েছে) তৈরি করা হয়েছিল।
আমরা দুটি ভিন্ন কালচার প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করেছি: সোজা চ্যানেল বা অরৈখিক প্যাঁচানো চ্যানেলযুক্ত গাট-অন-এ-চিপ, অথবা একটি মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইসে ট্রান্সওয়েল (TW) ইনসার্টযুক্ত হাইব্রিড চিপ, যা বক্স ১ এবং ধাপ ১-৫-এ বর্ণিত পদ্ধতিতে তৈরি করা হয়েছে। “ডিভাইস ফ্যাব্রিকেশন” একটি একক চিপ বা একটি হাইব্রিড চিপ তৈরির প্রধান ধাপগুলো দেখায়। “মানব অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষের কালচার” এই প্রোটোকলে ব্যবহৃত কোষের উৎস (Caco-2 বা মানব অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড) এবং কালচার পদ্ধতি ব্যাখ্যা করে। “ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিস” সেই সামগ্রিক ধাপগুলো দেখায় যেখানে Caco-2 বা অর্গ্যানয়েড থেকে প্রাপ্ত এপিথেলিয়াল কোষগুলোকে একটি ইন্টেস্টাইনাল চিপে বা একটি হাইব্রিড চিপের ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে কালচার করা হয়, যার পরে 3D মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করা হয় এবং একটি বৈশিষ্ট্যপূর্ণ এপিথেলিয়াল কাঠামো গঠিত হয়। প্রতিটি তীরের নিচে প্রোগ্রামের ধাপ নম্বর বা বক্স নম্বর দেখানো হয়েছে। অ্যাপ্লিকেশনটি উদাহরণসহ দেখায় যে কীভাবে প্রতিষ্ঠিত অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তরগুলো ব্যবহার করা যেতে পারে, যেমন—কোষ বিভেদনের বৈশিষ্ট্য নিরূপণ, অন্ত্রের শারীরবৃত্তীয় গবেষণা, হোস্ট-মাইক্রোবায়োম ইকোসিস্টেম প্রতিষ্ঠা এবং রোগ মডেলিং-এ। ইমিউনোফ্লুরেসেন্স চিত্র “কোষ বিভেদন” অংশে অন্ত্রের চিপে তৈরি করা ৩ডি ক্যাকো-২ এপিথেলিয়াল স্তরে নিউক্লিয়াস, এফ-অ্যাকটিন এবং MUC2-এর প্রকাশ দেখানো হয়েছে। গবলেট কোষ এবং মিউকোসাল পৃষ্ঠ থেকে নিঃসৃত মিউকাসে MUC2 সিগন্যালিং উপস্থিত থাকে। “অন্ত্রের শারীরবিদ্যা” অংশে ফ্লুরোসেন্ট ছবিগুলোতে ফ্লুরোসেন্ট হুইট জার্ম অ্যাগ্লুটিনিন ব্যবহার করে সায়ালিক অ্যাসিড এবং এন-অ্যাসিটাইলগ্লুকোসামিন রেসিডিউ-এর জন্য স্টেইনিং করে উৎপাদিত মিউকাস দেখানো হয়েছে। “হোস্ট-মাইক্রোব কো-কালচার” অংশে দুটি ওভারল্যাপিং ছবি একটি চিপের অন্ত্রে প্রতিনিধিত্বমূলক হোস্ট-মাইক্রোবায়োম কো-কালচার প্রদর্শন করে। বাম প্যানেলটি মাইক্রোইঞ্জিনিয়ার্ড ৩ডি ক্যাকো-২ এপিথেলিয়াল কোষের সাথে সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) প্রকাশকারী ই. কোলাই-এর কো-কালচার দেখায়। ডান প্যানেলটি ৩ডি ক্যাকো-২ এপিথেলিয়াল কোষের সাথে কো-কালচার করা GFP ই. কোলাই-এর অবস্থান দেখায়, যার পরে এফ-অ্যাকটিন (লাল) এবং নিউক্লিয়াস (নীল) দিয়ে ইমিউনোফ্লুরোসেন্স স্টেইনিং করা হয়েছে। রোগ মডেলিং অন্ত্রের প্রদাহ চিপে ব্যাকটেরিয়াল অ্যান্টিজেন দ্বারা শারীরবৃত্তীয় চ্যালেঞ্জের অধীনে সুস্থ বনাম লিকি গাট চিত্রিত করে। (যেমন, লাইপোপলিস্যাকারাইড, LPS) এবং রোগ প্রতিরোধকারী কোষ (যেমন, PBMC; সবুজ)। একটি ত্রিমাত্রিক উপকলা স্তর তৈরির জন্য Caco-2 কোষ কালচার করা হয়েছিল। স্কেল বার, ৫০ µm। নিচের সারির ছবিগুলো: “কোষের বিভেদন” রেফারেন্স ২. অক্সফোর্ড ইউনিভার্সিটি প্রেস থেকে অনুমতি নিয়ে গৃহীত; রেফারেন্স ৫. NAS থেকে অনুমতি নিয়ে পুনরুৎপাদিত; “হোস্ট-মাইক্রোব সহ-কালচার” রেফারেন্স ৩. NAS থেকে অনুমতি নিয়ে গৃহীত; “রোগ মডেলিং” রেফারেন্স ৫. NAS থেকে অনুমতি নিয়ে গৃহীত।
সফট লিথোগ্রাফি¹,⁴⁴ ব্যবহার করে সিলিকন ছাঁচ থেকে ডিমোল্ড করা পিডিএমএস রেপ্লিকা ব্যবহার করে গাট-অন-চিপ এবং হাইব্রিড উভয় চিপই তৈরি করা হয়েছিল এবং এসইউ-৮ দিয়ে প্যাটার্ন করা হয়েছিল। প্রতিটি চিপের মাইক্রোচ্যানেলের নকশা শিয়ার স্ট্রেস এবং হাইড্রোডাইনামিক চাপের মতো হাইড্রোডাইনামিকস বিবেচনা করে নির্ধারণ করা হয়¹,⁴,¹²। মূল গাট-অন-এ-চিপ নকশা (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র ১ক), যা দুটি পাশাপাশি অবস্থিত সমান্তরাল সরল মাইক্রোচ্যানেল নিয়ে গঠিত ছিল, তা একটি জটিল গাট-অন-এ-চিপে (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র ১খ) রূপান্তরিত হয়েছে, যাতে বর্ধিত তরল অবস্থানকাল, অরৈখিক প্রবাহের ধরণ এবং কালচার করা কোষের বহু-অক্ষীয় বিকৃতি প্ররোচিত করার জন্য একজোড়া বাঁকা মাইক্রোচ্যানেল অন্তর্ভুক্ত রয়েছে (চিত্র ২ক-চ)¹²। যখন আরও জটিল অন্ত্রের বায়োমেকানিক্স পুনরায় তৈরি করার প্রয়োজন হয়, তখন জটিল গাট-অন-এ-চিপ বেছে নেওয়া যেতে পারে। আমরা দেখিয়েছি যে জটিল গাট-চিপও একই সময়ের মধ্যে এবং একই মাত্রার এপিথেলিয়াল বৃদ্ধির সাথে ৩ডি মরফোজেনেসিসকে জোরালোভাবে প্ররোচিত করে। কালচার করা কোষের ধরন নির্বিশেষে মূল গাট-চিপ। অতএব, 3D মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করার জন্য, রৈখিক এবং জটিল অন-চিপ অন্ত্রের নকশাগুলি বিনিময়যোগ্য। SU-8 প্যাটার্ন সহ সিলিকন ছাঁচে কিউর করা PDMS রেপ্লিকাগুলি ডিমোল্ডিং করার পরে নেতিবাচক বৈশিষ্ট্য প্রদান করে (চিত্র 2a)। একটি চিপে অন্ত্র তৈরি করার জন্য, প্রস্তুত উপরের PDMS স্তরটি ক্রমানুসারে একটি ছিদ্রযুক্ত PDMS ফিল্মের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং তারপরে একটি করোনা ট্রিটার ব্যবহার করে অপরিবর্তনীয় বন্ধনের মাধ্যমে নীচের PDMS স্তরের সাথে সারিবদ্ধ করা হয়েছিল (চিত্র 2b–f)। হাইব্রিড চিপ তৈরি করার জন্য, কিউর করা PDMS রেপ্লিকাগুলিকে কাচের স্লাইডের সাথে সংযুক্ত করে একক-চ্যানেল মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইস তৈরি করা হয়েছিল যা ট্রান্সওয়েল ইনসার্ট ধারণ করতে পারে (চিত্র 2h এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 2)। বন্ধন প্রক্রিয়াটি PDMS রেপ্লিকা এবং কাচের পৃষ্ঠকে অক্সিজেন প্লাজমা বা করোনা ট্রিটমেন্ট দিয়ে ট্রিট করে সম্পন্ন করা হয়। সিলিকন টিউবের সাথে সংযুক্ত মাইক্রোফ্যাব্রিকেটেড ডিভাইসটি জীবাণুমুক্ত করার পরে, ডিভাইস সেটআপটি অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের 3D মরফোজেনেসিস সম্পাদনের জন্য প্রস্তুত ছিল (চিত্র ২ গ্রাম)।
ক, SU-8 প্যাটার্নযুক্ত সিলিকন ছাঁচ থেকে PDMS অংশ তৈরির পরিকল্পিত চিত্র। অ-শক্ত PDMS দ্রবণ একটি সিলিকন ছাঁচে ঢালা হয়েছিল (বামে), ৬০ °C তাপমাত্রায় শক্ত করা হয়েছিল (মাঝে) এবং ছাঁচ থেকে বের করা হয়েছিল (ডানে)। ছাঁচ থেকে বের করা PDMS টুকরো টুকরো করে কাটা হয়েছিল এবং পরবর্তী ব্যবহারের জন্য পরিষ্কার করা হয়েছিল। খ, PDMS উপরের স্তর তৈরির জন্য ব্যবহৃত সিলিকন ছাঁচের ছবি। গ, PDMS ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লি তৈরির জন্য ব্যবহৃত সিলিকন ছাঁচের ছবি। ঘ, উপরের এবং নীচের PDMS উপাদান এবং একত্রিত অন-চিপ অন্ত্রের ডিভাইসের একাধিক ছবি। ঙ, উপরের, ঝিল্লি এবং নীচের PDMS উপাদানগুলির বিন্যাসের পরিকল্পিত চিত্র। প্রতিটি স্তর প্লাজমা বা করোনা প্রক্রিয়ার মাধ্যমে অপরিবর্তনীয়ভাবে সংযুক্ত করা হয়। চ, উপরিপাতিত জটিল মাইক্রোচ্যানেল এবং ভ্যাকুয়াম চেম্বার সহ নির্মিত গাট-অন-এ-চিপ ডিভাইসের পরিকল্পিত চিত্র। ছ, মাইক্রোফ্লুইডিক কোষ কালচারের জন্য গাট-অন-এ-চিপের সেটআপ। একটি সিলিকন টিউব এবং সিরিঞ্জ দিয়ে একত্রিত নির্মিত গাট-অন-এ-চিপটি একটিতে স্থাপন করা হয়েছিল। কভারস্লিপ। প্রক্রিয়াকরণের জন্য চিপ ডিভাইসটি একটি ১৫০ মিমি পেট্রি ডিশের ঢাকনার উপর রাখা হয়েছিল। সিলিকন টিউবটি বন্ধ করার জন্য বাইন্ডার ব্যবহার করা হয়। হাইব্রিড চিপ তৈরি এবং হাইব্রিড চিপ ব্যবহার করে ৩ডি মরফোজেনেসিসের ভিজ্যুয়াল স্ন্যাপশট। অন্ত্রের ৩ডি মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করার জন্য, অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষের ২ডি মনোলেয়ার কালচার করার জন্য আলাদাভাবে প্রস্তুত করা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টগুলো হাইব্রিড চিপের মধ্যে প্রবেশ করানো হয়েছিল। ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে স্থাপিত কোষ স্তরের নীচে মাইক্রোচ্যানেলের মাধ্যমে মিডিয়াম প্রবাহিত করা হয়। স্কেল বার, ১ সেমি। রেফারেন্স ৪ থেকে অনুমতি নিয়ে পুনঃমুদ্রিত। এলসেভিয়ার।
এই প্রোটোকলে, এপিথেলিয়াল উৎস হিসেবে Caco-2 সেল লাইন এবং ইন্টেস্টাইনাল অর্গ্যানয়েড ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 3a)। উভয় প্রকার কোষ আলাদাভাবে কালচার করা হয়েছিল (বক্স 2 এবং বক্স 5) এবং অন-চিপ গাট বা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টের ECM-কোটেড মাইক্রোচ্যানেলে সিড করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। যখন কোষগুলো কনফ্লুয়েন্ট হয় (ফ্লাস্কে >95% কভারেজ), তখন ট্রিপসিনাইজেশন ফ্লুইড ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন কোষ সাসপেনশন প্রস্তুত করার জন্য টি-ফ্লাস্কে নিয়মিত কালচার করা Caco-2 কোষ (প্যাসেজ 10 থেকে 50-এর মধ্যে) সংগ্রহ করা হয় (বক্স 2)। ইন্টেস্টাইনাল বায়োপসি বা সার্জিক্যাল রিসেকশন থেকে প্রাপ্ত মানব ইন্টেস্টাইনাল অর্গ্যানয়েডগুলোকে কাঠামোগত মাইক্রোএনভায়রনমেন্টকে সমর্থন করার জন্য 24-ওয়েল প্লেটে ম্যাট্রিজেল স্ক্যাফোল্ড ডোমে কালচার করা হয়েছিল। বক্স 3-এ বর্ণিত পদ্ধতিতে প্রস্তুত করা প্রয়োজনীয় মরফোজেন (যেমন Wnt, R-spondin, এবং Noggin) এবং গ্রোথ ফ্যাক্টরযুক্ত মিডিয়াম একদিন পরপর যোগ করা হয়েছিল, যতক্ষণ না অর্গ্যানয়েডগুলো প্রায় 500 µm ব্যাসে বৃদ্ধি পায়। সম্পূর্ণরূপে বর্ধিত অর্গ্যানয়েডগুলো অন্ত্রে বা চিপের ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে সিডিং করার জন্য (বক্স ৫) এগুলোকে সংগ্রহ করে একক কোষে বিভক্ত করা হয়। যেমনটি আমরা পূর্বে রিপোর্ট করেছি, এটিকে রোগের ধরণ¹²,¹³ (যেমন আলসারেটিভ কোলাইটিস, ক্রোন'স ডিজিজ, কোলোরেক্টাল ক্যান্সার, বা স্বাভাবিক দাতা), ক্ষতস্থান (যেমন, ক্ষতযুক্ত বনাম ক্ষতবিহীন এলাকা) এবং পরিপাকনালীর অবস্থান (যেমন, ডিওডেনাম, জেজুনাম, ইলিয়াম, সিকাম, কোলন, বা রেকটাম) অনুসারে আলাদা করা যেতে পারে। আমরা বক্স ৫-এ কোলনিক অর্গ্যানয়েড (কোলয়েড) কালচার করার জন্য একটি অপ্টিমাইজড প্রোটোকল প্রদান করেছি, যেগুলোর জন্য সাধারণত ক্ষুদ্রান্ত্রের অর্গ্যানয়েডের তুলনায় মরফোজেনের উচ্চতর ঘনত্বের প্রয়োজন হয়।
ক, গাট চিপে অন্ত্রের অঙ্গসংস্থান (gut morphogenesis) প্রবর্তনের কার্যপ্রবাহ। এই প্রোটোকলে ত্রিমাত্রিক (3D) অঙ্গসংস্থান প্রদর্শনের জন্য Caco-2 মানব অন্ত্রের এপিথেলিয়াম এবং অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড ব্যবহার করা হয়। বিচ্ছিন্ন এপিথেলিয়াল কোষগুলোকে প্রস্তুতকৃত গাট-অন-এ-চিপ ডিভাইসে (চিপ প্রস্তুতি) স্থাপন করা হয়েছিল। ০ দিনে (D0) কোষগুলো PDMS ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লিতে স্থাপন (seed) এবং সংযুক্ত (attach) হওয়ার পর, অ্যাপিকাল (AP) প্রবাহ শুরু করা হয় এবং প্রথম ২ দিন ধরে তা বজায় রাখা হয় (প্রবাহ, AP, D0-D2)। যখন একটি সম্পূর্ণ দ্বিমাত্রিক (2D) মনোলিয়ার গঠিত হয়, তখন চক্রাকার প্রসারণ গতির (প্রসারণ, প্রবাহ, AP এবং BL) সাথে বেসোলেটারাল (BL) প্রবাহও শুরু করা হয়। মাইক্রোফ্লুইডিক কালচারের ৫ দিন পর অন্ত্রের ত্রিমাত্রিক (3D) অঙ্গসংস্থান স্বতঃস্ফূর্তভাবে ঘটে (অঙ্গসংস্থান, D5)। ফেজ কনট্রাস্ট চিত্রগুলো প্রতিটি পরীক্ষামূলক ধাপ বা সময় বিন্দুতে Caco-2 কোষের প্রতিনিধিত্বমূলক অঙ্গসংস্থান দেখায় (বার গ্রাফ, ১০০ µm)। সংশ্লিষ্ট ক্যাসকেডগুলো চিত্রিত করার জন্য চারটি পরিকল্পিত ডায়াগ্রাম। অন্ত্রের অঙ্গসংস্থানবিদ্যা (উপরের ডানদিকে)। নকশাচিত্রে ড্যাশযুক্ত তীরচিহ্নগুলি তরল প্রবাহের দিক নির্দেশ করে। খ, প্রতিষ্ঠিত ৩ডি ক্যাকো-২ এপিথেলিয়ামের পৃষ্ঠীয় টপোলজি প্রদর্শনকারী এসইএম চিত্র (বামদিকে)। বিবর্ধিত এলাকাকে (সাদা ড্যাশযুক্ত বাক্স) হাইলাইট করা ইনসেটটি ৩ডি ক্যাকো-২ স্তরের উপর পুনরুজ্জীবিত মাইক্রোভিলি প্রদর্শন করে (ডানদিকে)। গ, প্রতিষ্ঠিত ক্যাকো-২ ৩ডি-এর অনুভূমিক সম্মুখ দৃশ্য, ক্লাউডিন (জেডও-১, লাল) এবং অবিচ্ছিন্ন ব্রাশ বর্ডার মেমব্রেন, যেখানে এফ-অ্যাকটিন (সবুজ) এবং নিউক্লিয়াস (নীল) লেবেল করা আছে। অন্ত্রের চিপে থাকা এপিথেলিয়াল কোষের ইমিউনোফ্লুরেসেন্স কনফোকাল ভিজ্যুয়ালাইজেশন। মাঝের নকশাচিত্রের দিকে নির্দেশকারী তীরচিহ্নগুলি প্রতিটি কনফোকাল দৃশ্যের জন্য ফোকাল প্লেনের অবস্থান নির্দেশ করে। ঘ, একটি চিপে কালচার করা অর্গ্যানয়েডের আকারগত পরিবর্তনের সময়ক্রম, যা ৩, ৭, ৯, ১১ এবং ১৩ তম দিনে ফেজ কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি দ্বারা প্রাপ্ত। ইনসেটটি (উপরের ডানদিকে) প্রদত্ত চিত্রটির উচ্চ বিবর্ধন প্রদর্শন করে। ঙ, অর্গ্যানয়েডের ডিআইসি ফটোমাইক্রোগ্রাফ। ৭ম দিনে নেওয়া স্লাইসের উপর অন্ত্রে প্রতিষ্ঠিত ৩ডি এপিথেলিয়াম। f, ওভারলে করা ইমিউনোফ্লুরেসেন্স চিত্র যা যথাক্রমে ৩ দিন ধরে অন্ত্রের চিপে জন্মানো স্টেম সেল (LGR5; ম্যাজেন্টা), গবলেট সেল (MUC2; সবুজ), এফ-অ্যাকটিন (ধূসর) এবং নিউক্লিয়াস (সায়ান)-এর মার্কার দেখাচ্ছে (বাম) এবং এপিথেলিয়াল স্তরের উপর ১৩-দিনের (মধ্য) অর্গ্যানয়েড। এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র ৩-ও দেখুন, যা MUC2 সিগন্যালিং ছাড়া LGR5 সিগন্যালিংকে তুলে ধরে। ফ্লুরেসেন্স চিত্র যা কালচারের ১৩তম দিনে CellMask ডাই (ডান) দিয়ে প্লাজমা মেমব্রেন স্টেইন করে একটি চিপের উপর অন্ত্রে প্রতিষ্ঠিত ৩ডি অর্গ্যানয়েড এপিথেলিয়ামের এপিথেলিয়াল মাইক্রোস্ট্রাকচার (ডান) দেখাচ্ছে। অন্যথায় উল্লেখ না থাকলে স্কেল বার ৫০ μm। b রেফারেন্স ২ থেকে অনুমতি নিয়ে পুনঃমুদ্রিত। অক্সফোর্ড ইউনিভার্সিটি প্রেস; c রেফারেন্স ২ থেকে অনুমতি নিয়ে অভিযোজিত। অক্সফোর্ড ইউনিভার্সিটি প্রেস; e এবং f রেফারেন্স ১২ থেকে অনুমতি নিয়ে অভিযোজিত। ক্রিয়েটিভ কমন্স লাইসেন্স CC BY 4.0-এর অধীনে।
গাট অন এ চিপ (gut on a chip) পদ্ধতিতে, সফলভাবে ইসিএম (ECM) কোটিং করার জন্য পিডিএমএস (PDMS) ছিদ্রযুক্ত মেমব্রেনের হাইড্রোফোবিক পৃষ্ঠকে পরিবর্তন করা প্রয়োজন। এই প্রোটোকলে, আমরা পিডিএমএস মেমব্রেনের হাইড্রোফোবিসিটি পরিবর্তন করার জন্য দুটি ভিন্ন পদ্ধতি প্রয়োগ করি। ক্যাকো-২ (Caco-2) কোষ কালচার করার জন্য, শুধুমাত্র ইউভি/ওজোন (UV/ozone) ট্রিটমেন্টের মাধ্যমে পৃষ্ঠ সক্রিয়করণই পিডিএমএস পৃষ্ঠের হাইড্রোফোবিসিটি কমাতে, ইসিএম কোটিং করতে এবং ক্যাকো-২ কোষকে পিডিএমএস মেমব্রেনের সাথে সংযুক্ত করতে যথেষ্ট ছিল। তবে, অর্গ্যানয়েড এপিথেলিয়ামের মাইক্রোফ্লুইডিক কালচারের জন্য, পিডিএমএস মাইক্রোচ্যানেলে পর্যায়ক্রমে পলিইথিলিনইমাইন (PEI) এবং গ্লুটারালডিহাইড প্রয়োগ করে ইসিএম প্রোটিনের কার্যকর জমাট বাঁধার জন্য রাসায়নিক-ভিত্তিক পৃষ্ঠ কার্যকরী করার প্রয়োজন হয়। পৃষ্ঠ পরিবর্তনের পরে, কার্যকরী করা পিডিএমএস পৃষ্ঠকে আবৃত করার জন্য ইসিএম প্রোটিন জমা করা হয় এবং তারপর বিচ্ছিন্ন অর্গ্যানয়েড এপিথেলিয়ামে প্রবেশ করানো হয়। কোষগুলো সংযুক্ত হওয়ার পরে, উপরের মাইক্রোচ্যানেলে শুধুমাত্র মিডিয়াম পারফিউজ করে মাইক্রোফ্লুইডিক সেল কালচার শুরু করা হয় যতক্ষণ না কোষগুলো একটি সম্পূর্ণ মনোলিয়ার তৈরি করে, যখন নিচের মাইক্রোচ্যানেলটি স্থির অবস্থা বজায় রাখে। পৃষ্ঠ সক্রিয়করণ এবং ইসিএম কোটিং-এর জন্য এই অপ্টিমাইজড পদ্ধতিটি অর্গ্যানয়েড কোষের সংযুক্তি সক্ষম করে। পিডিএমএস পৃষ্ঠে ত্রিমাত্রিক রূপগঠন প্ররোচিত করার জন্য এপিথেলিয়াম।
ট্রান্সওয়েল কালচারের ক্ষেত্রেও কোষ রোপণের আগে ইসিএম (ECM) কোটিং প্রয়োজন হয়; তবে, ছিদ্রযুক্ত ইনসার্টের পৃষ্ঠকে সক্রিয় করার জন্য ট্রান্সওয়েল কালচারে কোনো জটিল প্রাক-প্রক্রিয়াকরণের প্রয়োজন হয় না। ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে ক্যাকো-২ (Caco-2) কোষ জন্মানোর জন্য, ছিদ্রযুক্ত ইনসার্টের উপর ইসিএম কোটিং বিচ্ছিন্ন ক্যাকো-২ কোষের সংযুক্তিকে (<১ ঘণ্টা) এবং টাইট জাংশন ব্যারিয়ার গঠনকে (<১-২ দিন) ত্বরান্বিত করে। ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে অর্গ্যানয়েড কালচার করার জন্য, বিচ্ছিন্ন অর্গ্যানয়েডগুলোকে ইসিএম-কোটেড ইনসার্টে রোপণ করা হয়, যা মেমব্রেনের পৃষ্ঠে সংযুক্ত হয় (<৩ ঘণ্টা) এবং অর্গ্যানয়েডগুলো ব্যারিয়ারের অখণ্ডতা সহ একটি সম্পূর্ণ মনোলিয়ার গঠন না করা পর্যন্ত রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়। হাইব্রিড চিপ ব্যবহার না করে ২৪-ওয়েল প্লেটে ট্রান্সওয়েল কালচার করা হয়।
একটি প্রতিষ্ঠিত এপিথেলিয়াল স্তরের বেসোলেটারাল দিকে তরল প্রবাহ প্রয়োগ করে ইন ভিট্রো ৩ডি মরফোজেনেসিস শুরু করা যেতে পারে। ‘গাট অন এ চিপ’-এ, উপরের এবং নিচের মাইক্রোচ্যানেলে মিডিয়াম পারফিউজ করার পর এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিস শুরু হয় (চিত্র ৩ক)। পূর্বে যেমন বর্ণনা করা হয়েছে, দিকনির্দেশিতভাবে নিঃসৃত মরফোজেন ইনহিবিটরগুলির ক্রমাগত অপসারণের জন্য নিম্ন (বেসোলেটারাল) প্রকোষ্ঠে তরল প্রবাহ চালু করা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লিতে আবদ্ধ কোষগুলিতে পর্যাপ্ত পুষ্টি ও সিরাম সরবরাহ করতে এবং লুমিনাল শিয়ার স্ট্রেস তৈরি করতে, আমরা সাধারণত ‘গাট অন এ চিপ’-এ দ্বৈত প্রবাহ প্রয়োগ করি। হাইব্রিড চিপগুলিতে, এপিথেলিয়াল মনোলেয়ারযুক্ত ট্রান্সওয়েল ইনসার্টগুলি হাইব্রিড চিপের মধ্যে প্রবেশ করানো হয়েছিল। তারপর, মাইক্রোচ্যানেলের মাধ্যমে ছিদ্রযুক্ত ট্রান্সওয়েল ইনসার্টের বেসোলেটারাল দিকের নিচে মিডিয়াম প্রয়োগ করা হয়েছিল। উভয় কালচার প্ল্যাটফর্মেই বেসোলেটারাল প্রবাহ শুরু করার ৩-৫ দিন পর অন্ত্রের মরফোজেনেসিস ঘটেছিল।
মাইক্রোইঞ্জিনিয়ার্ড ৩ডি এপিথেলিয়াল স্তরগুলির আকারগত বৈশিষ্ট্য বিভিন্ন ইমেজিং পদ্ধতি, যেমন ফেজ কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি, ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট (ডিআইসি) মাইক্রোস্কোপি, এসইএম, বা ইমিউনোফ্লুরেসেন্স কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি প্রয়োগ করে বিশ্লেষণ করা যেতে পারে (চিত্র ৩ এবং ৪)। ৩ডি এপিথেলিয়াল স্তরগুলির আকৃতি এবং প্রসারণ পর্যবেক্ষণ করার জন্য কালচার চলাকালীন যেকোনো সময় ফেজ কনট্রাস্ট বা ডিআইসি ইমেজিং সহজেই করা যেতে পারে। পিডিএমএস এবং পলিয়েস্টার ফিল্মের আলোকীয় স্বচ্ছতার কারণে, গাট-অন-এ-চিপ এবং হাইব্রিড চিপ উভয় প্ল্যাটফর্মই ডিভাইসটিকে খণ্ডিত বা বিচ্ছিন্ন করার প্রয়োজন ছাড়াই রিয়েল-টাইম ইন সিটু ইমেজিং প্রদান করতে পারে। ইমিউনোফ্লুরেসেন্স ইমেজিং করার সময় (চিত্র ১, ৩সি, এফ এবং ৪বি, সি), কোষগুলিকে সাধারণত ৪% (ওজন/আয়তন) প্যারাফর্মালডিহাইড (পিএফএ), এরপর ক্রমানুসারে ট্রাইটন এক্স-১০০ এবং ২% (ওজন/আয়তন) বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (বিএসএ) দিয়ে ফিক্স করা হয়। কোষের প্রকারভেদের উপর নির্ভর করে, বিভিন্ন ফিক্সেটিভ, পারমিয়েবিলাইজার এবং ব্লকিং এজেন্ট ব্যবহার করা হয়। এজেন্ট ব্যবহার করা যেতে পারে। চিপের উপর ইন সিটুতে স্থিরীকৃত কোষগুলোকে হাইলাইট করার জন্য বংশ-নির্ভর কোষ বা অঞ্চলের মার্কারকে লক্ষ্য করে প্রাইমারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়, এরপর নিউক্লিয়াস (যেমন, ৪′,৬-ডায়ামিডিনো-২-ফেনাইলিন) ইন্ডোল, ডিপিআই) অথবা এফ-অ্যাকটিন (যেমন, ফ্লুরোসেন্টভাবে লেবেলযুক্ত ফ্যালোইডিন) কে লক্ষ্য করে একটি কাউন্টারস্টেইন ডাই সহ সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়। মিউকাস উৎপাদন (চিত্র ১, “কোষ বিভেদন” এবং “অন্ত্রের শারীরবৃত্ত”), অণুজীব কোষের এলোমেলো উপনিবেশ স্থাপন (চিত্র ১, “আতিথেয়-অণুজীব সহ-চাষ”), রোগ প্রতিরোধক কোষের সমাবেশ (চিত্র ১, ‘রোগ মডেলিং’) অথবা ৩ডি এপিথেলিয়াল মরফোলজির রূপরেখা (চিত্র ৩সি,এফ এবং ৪বি,সি) শনাক্ত করার জন্য ইন সিটুতে ফ্লুরোসেন্স-ভিত্তিক লাইভ ইমেজিংও করা যেতে পারে। যখন চিপের উপর অন্ত্রকে পরিবর্তন করে উপরের স্তরকে নিচের মাইক্রোচ্যানেল স্তর থেকে আলাদা করা হয়, যেমনটি রেফারেন্সে বর্ণিত হয়েছে। চিত্র ২-এ যেমন দেখানো হয়েছে, ৩ডি এপিথেলিয়াল মরফোলজি এবং সেইসাথে এপিকাল ব্রাশ বর্ডারের মাইক্রোভিলি SEM দ্বারা দেখা যায় (চিত্র ৩খ)। কোয়ান্টিটেটিভ PCR5 অথবা সিঙ্গেল-সেল RNA সিকোয়েন্সিং করার মাধ্যমে ডিফারেন্সিয়েশন মার্কারের এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করা যায়। এক্ষেত্রে, গাট চিপস বা হাইব্রিড চিপসে জন্মানো এপিথেলিয়াল কোষের ত্রিমাত্রিক স্তর ট্রিপসিনাইজেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয় এবং তারপর আণবিক বা জেনেটিক বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়।
ক, একটি হাইব্রিড চিপে অন্ত্রের অঙ্গসংস্থান (মরফোজেনেসিস) প্রবর্তনের কার্যপ্রবাহ। এই প্রোটোকলে একটি হাইব্রিড চিপ প্ল্যাটফর্মে ত্রিমাত্রিক (3D) অঙ্গসংস্থান প্রদর্শনের জন্য Caco-2 এবং অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড ব্যবহার করা হয়। বিচ্ছিন্ন এপিথেলিয়াল কোষগুলিকে প্রস্তুত ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে (TW prep; নিচের চিত্র দেখুন) স্থাপন করা হয়েছিল। কোষগুলি স্থাপন (seeded) হয়ে ট্রান্সওয়েল ইনসার্টের পলিয়েস্টার মেমব্রেনে সংযুক্ত হওয়ার পর, সমস্ত কোষকে স্থির অবস্থায় (TW culture) কালচার করা হয়েছিল। ৭ দিন পর, এপিথেলিয়াল কোষের একটি দ্বিমাত্রিক (2D) একক স্তরযুক্ত একটি ট্রান্সওয়েল ইনসার্টকে একটি হাইব্রিড চিপে একীভূত করা হয়েছিল একটি বেসোলেটারাল প্রবাহ (Flow, BL) প্রবর্তন করার জন্য, যা শেষ পর্যন্ত একটি ত্রিমাত্রিক (3D) এপিথেলিয়াল স্তর (মরফোজেনেসিস) তৈরি করে। প্রতিটি পরীক্ষামূলক ধাপ বা সময় বিন্দুতে স্বাভাবিক দাতার (C103 লাইন) অ্যাসেন্ডিং কোলন থেকে প্রাপ্ত মানব অঙ্গের এপিথেলিয়াল কোষের অঙ্গসংস্থানিক বৈশিষ্ট্য প্রদর্শনকারী ফেজ কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ। উপরের স্তরের স্কিম্যাটিকগুলি প্রতিটি ধাপের জন্য পরীক্ষামূলক বিন্যাস চিত্রিত করে। খ, হাইব্রিড চিপ (বাম স্কিম্যাটিক) টপ-ডাউন কনফোকাল ইমেজিংয়ের মাধ্যমে অর্গ্যানয়েড এপিথেলিয়াল কোষের ত্রিমাত্রিক (3D) অঙ্গসংস্থান ঘটাতে পারে। বিভিন্ন Z অবস্থানে (উপরের, মাঝের এবং নিচের; ডানদিকের স্কিম্যাটিক এবং সংশ্লিষ্ট ডটেড লাইন দেখুন) নেওয়া মাইক্রোস্কোপি ভিউগুলো সুস্পষ্ট আকারগত বৈশিষ্ট্য দেখিয়েছে। এফ-অ্যাকটিন (সায়ান), নিউক্লিয়াস (ধূসর)। গ, স্ট্যাটিক ট্রান্সওয়েল (TW; সাদা ড্যাশযুক্ত বাক্সের ভেতরের ইনসেট) বনাম হাইব্রিড চিপে (সবচেয়ে বড় পূর্ণ শট) কালচার করা অর্গ্যানয়েড-উদ্ভূত এপিথেলিয়াল কোষের ফ্লুরোসেন্স কনফোকাল মাইক্রোগ্রাফ (ত্রিমাত্রিক কোণযুক্ত দৃশ্য), যা যথাক্রমে দ্বিমাত্রিক বনাম ত্রিমাত্রিক আকারবিদ্যার তুলনা করে। একজোড়া দ্বিমাত্রিক উল্লম্ব ক্রস-কাট ভিউ (উপরের ডান কোণার ইনসেট; “XZ”) দ্বিমাত্রিক এবং ত্রিমাত্রিক বৈশিষ্ট্যগুলোও দেখায়। স্কেল বার, ১০০ µm। গ, রেফারেন্স ৪ থেকে অনুমতি নিয়ে পুনঃমুদ্রিত। এলসেভিয়ার।
প্রচলিত স্থির কালচার পরিস্থিতিতে একই কোষগুলোকে (ক্যাকো-২ বা অন্ত্রের অর্গ্যানয়েড এপিথেলিয়াল কোষ) দ্বি-মাত্রিক মনোলিয়ারে কালচার করে কন্ট্রোল প্রস্তুত করা যেতে পারে। উল্লেখ্য, মাইক্রোচ্যানেলগুলোর সীমিত আয়তন ক্ষমতার (অর্থাৎ মূল গাট-চিপ ডিজাইনের উপরের চ্যানেলে প্রায় ৪ µL) কারণে পুষ্টির ঘাটতি দেখা দিতে পারে। অতএব, বেসোলেটারাল প্রবাহ প্রয়োগের আগে ও পরের এপিথেলিয়াল মরফোলজির তুলনাও করা সম্ভব।
সফট লিথোগ্রাফি প্রক্রিয়াটি একটি ক্লিন রুমে সম্পাদন করা উচিত। চিপের প্রতিটি স্তরের (উপরের ও নিচের স্তর এবং মেমব্রেন) এবং হাইব্রিড চিপের জন্য ভিন্ন ভিন্ন ফটোমাস্ক ব্যবহার করা হয়েছিল এবং আলাদা সিলিকন ওয়েফারে তৈরি করা হয়েছিল, কারণ মাইক্রোচ্যানেলগুলোর উচ্চতা ভিন্ন ছিল। চিপের গাটের উপরের এবং নিচের মাইক্রোচ্যানেলগুলোর টার্গেট উচ্চতা যথাক্রমে ৫০০ µm এবং ২০০ µm। হাইব্রিড চিপের চ্যানেল টার্গেট উচ্চতা হলো ২০০ µm।
একটি পাত্রে অ্যাসিটোন নিয়ে তাতে ৩ ইঞ্চি সিলিকন ওয়েফার রাখুন। ৩০ সেকেন্ড ধরে প্লেটটি আলতোভাবে ঘোরান, তারপর ওয়েফারটি বাতাসে শুকিয়ে নিন। ওয়েফারটি আইপিএ (IPA) ভর্তি একটি প্লেটে স্থানান্তর করুন, তারপর পরিষ্কার করার জন্য প্লেটটি ৩০ সেকেন্ড ধরে ঘোরান।
সিলিকন ওয়েফার পৃষ্ঠ থেকে জৈব অবশেষ অপসারণ সর্বোচ্চ পর্যায়ে নিয়ে যাওয়ার জন্য, ঐচ্ছিকভাবে একটি পিরানহা দ্রবণ (হাইড্রোজেন পারক্সাইড এবং ঘন সালফিউরিক অ্যাসিডের ১:৩ (আয়তন/আয়তন) অনুপাতে মিশ্রণ) ব্যবহার করা যেতে পারে।
পিরানহা দ্রবণ অত্যন্ত ক্ষয়কারী এবং তাপ উৎপন্ন করে। অতিরিক্ত নিরাপত্তা সতর্কতা অবলম্বন করা প্রয়োজন। বর্জ্য নিষ্কাশনের জন্য, দ্রবণটিকে ঠান্ডা হতে দিন এবং একটি পরিষ্কার, শুকনো বর্জ্য পাত্রে স্থানান্তর করুন। দ্বিতীয় পাত্র ব্যবহার করুন এবং বর্জ্য পাত্রে সঠিকভাবে লেবেল লাগান। আরও বিস্তারিত পদ্ধতির জন্য অনুগ্রহ করে প্রতিষ্ঠানের নিরাপত্তা নির্দেশিকা অনুসরণ করুন।
ওয়েফারগুলোকে ২০০ °C তাপমাত্রার হট প্লেটে ১০ মিনিটের জন্য রেখে ডিহাইড্রেট করা হয়। ডিহাইড্রেশনের পর, ওয়েফারটিকে ঠান্ডা করার জন্য বাতাসে পাঁচবার ঝাঁকানো হয়।
পরিষ্কার করা সিলিকন ওয়েফারের কেন্দ্রে প্রায় ১০ গ্রাম ফটোরেজিস্ট SU-8 2100 ঢালুন। চিমটা ব্যবহার করে ওয়েফারের উপর ফটোরেজিস্টটি সমানভাবে ছড়িয়ে দিন। মাঝে মাঝে ওয়েফারটি ৬৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রার হট প্লেটে রাখুন, যাতে ফটোরেজিস্টটি কম আঠালো হয় এবং ছড়ানো সহজ হয়। ওয়েফারটি সরাসরি হট প্লেটের উপর রাখবেন না।
স্পিন কোটিং চালিয়ে ওয়েফারের উপর SU-8 সমানভাবে ছড়িয়ে দেওয়া হয়েছিল। SU-8-এর আগত ঘূর্ণনকে ৫-১০ সেকেন্ডের জন্য প্রোগ্রাম করুন, যা ৫০০ rpm গতিতে এবং ১০০ rpm/s ত্বরণে চলবে। ২০০ µm পুরুত্বের প্যাটার্নিংয়ের জন্য মূল স্পিনটি ১,৫০০ rpm-এ সেট করুন, অথবা ২৫০ µm পুরুত্ব অর্জন করুন (চিপের গাটের উপরের স্তরের জন্য ৫০০ µm উচ্চতা তৈরি করে; নিচে “গুরুত্বপূর্ণ পদক্ষেপ” দেখুন), যা ৩০০ rpm/s ত্বরণে ৩০ সেকেন্ডের জন্য ১,২০০ rpm-এ সেট করা থাকবে।
সিলিকন ওয়েফারে থাকা SU-8 প্যাটার্নের লক্ষ্যমাত্রার পুরুত্ব অনুযায়ী প্রধান ঘূর্ণন গতি সমন্বয় করা যেতে পারে।
চিপের গাটের উপরের স্তরের জন্য ৫০০ µm উচ্চতার SU-8 প্যাটার্ন তৈরি করতে, এই বক্সের স্পিন কোটিং এবং সফট বেক ধাপগুলো (ধাপ ৭ এবং ৮) ক্রমানুসারে পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল (ধাপ ৯ দেখুন) যাতে ২৫০ µm পুরু SU-8-এর দুটি স্তর তৈরি হয়, যেগুলোকে এই বক্সের ধাপ ১২-তে UV এক্সপোজারের মাধ্যমে স্তরবদ্ধ ও সংযুক্ত করে ৫০০ µm উচ্চতার একটি স্তর তৈরি করা যায়।
SU-8 প্রলেপযুক্ত ওয়েফারগুলো সাবধানে একটি হট প্লেটে ৬৫°C তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য রেখে সফট বেক করুন, তারপর তাপমাত্রা ৯৫°C-এ পরিবর্তন করে আরও ৪০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন।
উপরের মাইক্রোচ্যানেলে ৫০০ μm উচ্চতার SU-8 প্যাটার্ন তৈরি করতে, ২৫০ μm পুরু দুটি SU-8 স্তর তৈরি করার জন্য ৭ এবং ৮ নম্বর ধাপের পুনরাবৃত্তি করুন।
ইউভি মাস্ক অ্যালাইনার ব্যবহার করে, প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে একটি ল্যাম্প টেস্ট সম্পাদন করে ওয়েফারের এক্সপোজার টাইম গণনা করুন। (এক্সপোজার টাইম, মিলিসেকেন্ড) = (এক্সপোজার ডোজ, মিলিজুল/বর্গসেমি)/(ল্যাম্প পাওয়ার, মিলিওয়াট/বর্গসেমি)।
এক্সপোজার টাইম নির্ধারণ করার পর, ফটোমাস্কটি ইউভি মাস্ক অ্যালাইনারের মাস্ক হোল্ডারে রাখুন এবং এসইউ-৮ (SU-8) প্রলেপযুক্ত ওয়েফারটির উপর স্থাপন করুন।
UV রশ্মির বিচ্ছুরণ কমাতে ফটোমাস্কের প্রিন্ট করা পৃষ্ঠটি সরাসরি সিলিকন ওয়েফারের SU-8 প্রলেপযুক্ত দিকে রাখুন।
SU-8 প্রলেপযুক্ত ওয়েফার এবং ফটোমাস্কটিকে উল্লম্বভাবে ২৬০ mJ/cm² UV আলোতে পূর্বনির্ধারিত এক্সপোজার সময়ের জন্য উন্মুক্ত করুন (এই বক্সের ১০ নম্বর ধাপ দেখুন)।
UV রশ্মির সংস্পর্শে আনার পর, ২০০ μm উচ্চতার প্যাটার্ন তৈরি করার জন্য SU-8 প্রলেপযুক্ত সিলিকন ওয়েফারগুলোকে প্রতিটি হট প্লেটে প্রথমে ৬৫°C তাপমাত্রায় ৫ মিনিট এবং পরে ৯৫°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিট ধরে বেক করা হয়েছিল। ৫০০ µm উচ্চতার প্যাটার্ন তৈরি করার জন্য ৯৫°C তাপমাত্রায় বেক করার পরবর্তী সময় ৩০ মিনিট পর্যন্ত বাড়ানো হয়েছিল।
ডেভেলপার একটি কাচের পাত্রে ঢালা হয় এবং বেক করা ওয়েফারটি পাত্রে রাখা হয়। কাচের প্লেটের আকারের উপর নির্ভর করে SU-8 ডেভেলপারের পরিমাণ ভিন্ন হতে পারে। অব্যবহৃত SU-8 সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করার জন্য পর্যাপ্ত পরিমাণে SU-8 ডেভেলপার ব্যবহার করা নিশ্চিত করুন। উদাহরণস্বরূপ, ১ লিটার ধারণক্ষমতা সম্পন্ন ১৫০ মিমি ব্যাসের কাচের পাত্র ব্যবহার করার সময়, প্রায় ৩০০ মিলি SU-8 ডেভেলপার ব্যবহার করুন। মাঝে মাঝে আলতোভাবে ঘুরিয়ে ২৫ মিনিটের জন্য মোল্ডটি ডেভেলপ করুন।
একটি পিপেট ব্যবহার করে দ্রবণটি স্প্রে করে প্রায় ১০ মিলি তাজা ডেভেলপার এবং তারপরে আইপিএ দিয়ে ডেভেলপ করা মোল্ডটি ধুয়ে ফেলুন।
ওয়েফারটিকে একটি প্লাজমা ক্লিনারে রেখে ১.৫ মিনিটের জন্য অক্সিজেন প্লাজমার (বায়ুমণ্ডলীয় গ্যাস, টার্গেট প্রেশার ১ × ১০−৫ টর, পাওয়ার ১২৫ ওয়াট) সংস্পর্শে আনুন।
একটি গ্লাস স্লাইড সহ ওয়েফারটিকে একটি ভ্যাকুয়াম ডেসিকেটরে রাখুন। ওয়েফার এবং স্লাইড পাশাপাশি রাখা যেতে পারে। যদি ভ্যাকুয়াম ডেসিকেটরটি একটি প্লেট দ্বারা কয়েকটি স্তরে বিভক্ত থাকে, তবে স্লাইডগুলি নীচের প্রকোষ্ঠে এবং ওয়েফারগুলি উপরের প্রকোষ্ঠে রাখুন। একটি গ্লাস স্লাইডের উপর ১০০ μL ট্রাইক্লোরো(1H, 1H, 2H, 2H-পারফ্লুরোঅক্টাইল)সিলেন দ্রবণ ফোঁটা ফোঁটা করে ফেলুন এবং সিলেনাইজেশনের জন্য ভ্যাকুয়াম প্রয়োগ করুন।
একটি ৩৭°C ওয়াটার বাথে হিমায়িত Caco-2 কোষের ভায়াল গলিয়ে নিন, তারপর গলানো কোষগুলোকে একটি T75 ফ্লাস্কে স্থানান্তর করুন, যেটিতে ১৫ মিলি ৩৭°C তাপমাত্রায় আগে থেকে গরম করা Caco-2 মিডিয়াম রয়েছে।
প্রায় ৯০% ঘনত্বে থাকা Caco-2 কোষগুলিকে পাস করানোর জন্য, প্রথমে একটি ৩৭°C ওয়াটার বাথে Caco-2 মিডিয়াম, PBS এবং ০.২৫% ট্রিপসিন/১ mM EDTA গরম করুন।
ভ্যাকুয়াম অ্যাসপিরেশনের মাধ্যমে মিডিয়ামটি বের করে নিন। পুনরায় ভ্যাকুয়াম অ্যাসপিরেশন করে এবং নতুন PBS যোগ করে ৫ মিলি উষ্ণ PBS দিয়ে কোষগুলোকে দুইবার ধুয়ে নিন।