از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
مورفوژنز روده انسان، ویژگی‌های کریپت-پرز ریزمعماری اپیتلیال سه‌بعدی و سازماندهی فضایی را ایجاد می‌کند. این ساختار منحصر به فرد برای حفظ هموستاز روده با محافظت از جایگاه سلول‌های بنیادی در کریپت پایه از آنتی‌ژن‌های میکروبی خارجی و متابولیت‌های آنها مورد نیاز است. علاوه بر این، پرزهای روده و مخاط ترشحی، سلول‌های اپیتلیال عملکردی متمایز را با یک مانع محافظ روی سطح مخاط روده نشان می‌دهند. بنابراین، بازآفرینی ساختارهای اپیتلیال سه‌بعدی برای ساخت مدل‌های روده در شرایط آزمایشگاهی بسیار مهم است. نکته قابل توجه این است که روده روی تراشه تقلیدکننده آلی می‌تواند مورفوژنز سه‌بعدی خودبه‌خودی اپیتلیوم روده را با عملکردهای فیزیولوژیکی و بیومکانیک بهبود یافته القا کند. در اینجا، ما یک پروتکل تکرارپذیر برای القای قوی مورفوژنز روده در روده روی یک تراشه میکروفلوئیدیک و همچنین در یک تراشه هیبریدی تعبیه شده در Transwell ارائه می‌دهیم. ما روش‌های دقیقی را برای ساخت دستگاه، کشت Caco-2 یا سلول‌های اپیتلیال ارگانوئید روده در تنظیمات مرسوم و همچنین روی یک پلتفرم میکروفلوئیدیک، القا، شرح می‌دهیم. مورفوژنز سه‌بعدی و توصیف اپیتلیوم سه‌بعدی ایجاد شده با استفاده از روش‌های تصویربرداری متعدد. این پروتکل با کنترل جریان مایع قاعده‌ای-جانبی به مدت ۵ روز، به بازسازی ریزساختار عملکردی روده دست می‌یابد. روش مورفوژنز آزمایشگاهی ما از تنش برشی و حرکت مکانیکی مرتبط با فیزیولوژی استفاده می‌کند و نیازی به مهندسی یا دستکاری سلولی پیچیده ندارد، که ممکن است از سایر تکنیک‌های موجود بهتر عمل کند. ما پیش‌بینی می‌کنیم که پروتکل پیشنهادی ما می‌تواند پیامدهای گسترده‌ای برای جامعه تحقیقات زیست‌پزشکی داشته باشد و روشی را برای بازسازی لایه‌های اپیتلیال روده سه‌بعدی در شرایط آزمایشگاهی برای کاربردهای زیست‌پزشکی، بالینی و دارویی ارائه دهد.
آزمایش‌ها نشان می‌دهند که سلول‌های اپیتلیال روده Caco-2 کشت‌شده در دستگاه‌های میکروفلوئیدیک روده روی تراشه1،2،3،4،5 یا دولایه6،7 می‌توانند بدون درک روشنی از مکانیسم اساسی، مورفوژنز سه‌بعدی خودبه‌خودی را در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) تجربه کنند. در مطالعه اخیر ما، دریافتیم که حذف آنتاگونیست‌های مورفوژن ترشح‌شده از پایه جانبی از دستگاه‌های کشت برای القای مورفوژنز اپیتلیال سه‌بعدی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) ضروری و کافی است، که توسط Caco-2 و ارگانوئیدهای روده‌ای مشتق‌شده از بیمار نشان داده شده است. سلول‌های اپیتلیال اعتبارسنجی شدند. در این مطالعه، ما به طور خاص بر تولید سلولی و توزیع غلظت یک آنتاگونیست قوی Wnt، Dickkopf-1 (DKK-1)، در دستگاه‌های میکروفلوئیدیک روده روی تراشه و اصلاح‌شده حاوی درج‌های Transwell، که "تراشه هیبریدی" نامیده می‌شوند، تمرکز کردیم. ما نشان می‌دهیم که افزودن آنتاگونیست‌های Wnt اگزوژن (مانند DKK-1، سرکوبگر Wnt 1، پروتئین مرتبط با فریزلد ترشح‌شده 1 یا Soggy-1) به روده روی تراشه، مورفوژنز را مهار می‌کند یا لایه اپیتلیال سه‌بعدی از پیش ساختار یافته را مختل می‌کند، که نشان می‌دهد استرس آنتاگونیستی در طول کشت مسئول مورفوژنز روده در شرایط آزمایشگاهی است. بنابراین، یک رویکرد عملی برای دستیابی به مورفوژنز قوی در سطح مشترک اپیتلیال، حذف یا حداقل حفظ سطح آنتاگونیست‌های Wnt در محفظه قاعده‌ای-جانبی با شستشوی فعال (به عنوان مثال، در پلتفرم‌های روده روی تراشه یا هیبرید روی تراشه) یا انتشار است. محیط‌های بازولترال (مثلاً از محفظه‌های Transwell به مخازن بزرگ بازولترال در چاه‌ها).
در این پروتکل، ما یک روش دقیق برای ساخت میکرودستگاه‌های روده روی تراشه و تراشه‌های هیبریدی قابل جایگذاری Transwell (مراحل 1-5) برای کشت سلول‌های اپیتلیال روده بر روی غشاهای متخلخل مبتنی بر پلی‌دی‌متیل‌سیلوکسان (PDMS) (مراحل 6A، 7A، 8، 9) یا غشاهای پلی‌استر Transwell inserts (مراحل 6B، 7B، 8، 9) و القای مورفوژنز سه‌بعدی در شرایط آزمایشگاهی (مرحله 10) ارائه می‌دهیم. ما همچنین ویژگی‌های سلولی و مولکولی نشان‌دهنده بافت‌زایی اختصاصی بافت و تمایز سلولی وابسته به دودمان را با اعمال روش‌های تصویربرداری متعدد شناسایی کردیم (مراحل 11-24). ما مورفوژنز را با استفاده از سلول‌های اپیتلیال روده انسان، مانند Caco-2 یا ارگانوئیدهای روده، در دو قالب کشت با جزئیات فنی شامل اصلاح سطح غشاهای متخلخل، ایجاد تک‌لایه‌های دوبعدی و بازتولید بیوشیمیایی و بیومکانیکی روده در شرایط آزمایشگاهی القا می‌کنیم. برای القای مورفوژنز سه‌بعدی از دوبعدی در تک‌لایه‌های اپیتلیال، ما آنتاگونیست‌های مورفوژن را در هر دو شکل کشت‌شده با جاری کردن محیط کشت به داخل بخش قاعده‌ای-جانبی کشت حذف کردیم. در نهایت، ما نمایشی از کاربرد یک لایه اپیتلیال سه‌بعدی قابل بازسازی ارائه می‌دهیم که می‌تواند برای مدل‌سازی رشد اپیتلیال وابسته به مورفوژن، کشت‌های مشترک طولی میزبان-میکروبیوم، عفونت پاتوژن، آسیب التهابی، اختلال عملکرد سد اپیتلیال و درمان‌های مبتنی بر پروبیوتیک استفاده شود.
پروتکل ما می‌تواند برای طیف وسیعی از دانشمندان در تحقیقات پایه (مثلاً زیست‌شناسی مخاط روده، زیست‌شناسی سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی) و کاربردی (مثلاً آزمایش داروهای پیش‌بالینی، مدل‌سازی بیماری، مهندسی بافت و گوارش‌شناسی) با تأثیر گسترده مفید باشد. به دلیل تکرارپذیری و استحکام پروتکل ما در القای ریخت‌زایی سه‌بعدی اپیتلیوم روده در شرایط آزمایشگاهی، پیش‌بینی می‌کنیم که استراتژی فنی ما بتواند در اختیار مخاطبانی که دینامیک سیگنال‌دهی سلولی را در طول تکوین، بازسازی یا هموستاز روده مطالعه می‌کنند، قرار گیرد. علاوه بر این، پروتکل ما برای بررسی عفونت تحت عوامل عفونی مختلف مانند نوروویروس ۸، کروناویروس سندرم حاد تنفسی ۲ (SARS-CoV-2)، کلستریدیوم دیفیسیل، سالمونلا تیفی موریوم ۹ یا ویبریو کلرا مفید است. مخاطبان آسیب‌شناسی و پاتوژنز بیماری نیز مفید هستند. استفاده از یک سیستم میکروفیزیولوژی روده روی تراشه ممکن است امکان کشت همزمان طولی 10 و ارزیابی بعدی دفاع میزبان، پاسخ‌های ایمنی و ترمیم آسیب‌های مرتبط با پاتوژن در دستگاه گوارش (GI) 11 را فراهم کند. سایر اختلالات دستگاه گوارش مرتبط با سندرم روده نشت‌کننده، بیماری سلیاک، بیماری کرون، کولیت اولسراتیو، التهاب کیسه یا سندرم روده تحریک‌پذیر را می‌توان با تهیه لایه‌های اپیتلیال روده سه‌بعدی با استفاده از لایه‌های اپیتلیال روده سه‌بعدی بیمار شبیه‌سازی کرد. این بیماری‌ها شامل آتروفی پرزها، کوتاه شدن کریپت‌ها، آسیب مخاطی یا اختلال در سد اپیتلیال هستند. بیوپسی یا ارگانوئیدهای روده‌ای مشتق از سلول‌های بنیادی 12،13. برای مدل‌سازی بهتر پیچیدگی بالاتر محیط بیماری، خوانندگان می‌توانند اضافه کردن انواع سلول‌های مرتبط با بیماری، مانند سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی بیمار (PBMCs)، را به مدل‌های حاوی ریزساختارهای کریپت-پرزهای روده سه‌بعدی در نظر بگیرند. سلول‌های ایمنی اختصاصی بافت، ۵.
از آنجایی که ریزساختار اپیتلیال سه‌بعدی می‌تواند بدون فرآیند برش ثابت و قابل مشاهده باشد، بینندگانی که روی ترانسکریپتومیکس فضایی و تصویربرداری با وضوح بالا یا فوق وضوح کار می‌کنند، ممکن است به نقشه‌برداری ما از دینامیک فضایی-زمانی ژن‌ها و پروتئین‌ها در جایگاه‌های اپیتلیال علاقه‌مند باشند. علاقه‌مند به فناوری. پاسخ به محرک‌های میکروبی یا ایمنی. علاوه بر این، تداخل طولی میزبان-میکروبیوم 10، 14 که هموستاز روده را هماهنگ می‌کنند، می‌توانند در لایه مخاطی روده سه‌بعدی با کشت همزمان گونه‌های مختلف میکروبی، جوامع میکروبی یا میکروبیوتای مدفوع، به ویژه در روده-روی-یک-تراشه، ایجاد شوند. در پلتفرم. این رویکرد به ویژه برای مخاطبانی که در زمینه‌های ایمونولوژی مخاطی، گوارش‌شناسی، میکروبیوم انسانی، کالتورومیکس و میکروبیولوژی بالینی مطالعه می‌کنند و به دنبال کشت میکروبیوتای روده‌ای کشت‌نشده قبلی در آزمایشگاه هستند، جذاب است. اگر پروتکل ریخت‌زایی آزمایشگاهی ما بتواند با قالب‌های کشت مقیاس‌پذیر، مانند درج‌های چند چاهکی در پلیت‌های 24، 96 یا 384 چاهکی که به طور مداوم محفظه‌های قاعده‌ای-جانبی را پر می‌کنند، تطبیق داده شود، این پروتکل همچنین می‌تواند برای کسانی که در حال توسعه پلتفرم‌های دارویی، زیست‌پزشکی یا غربالگری یا اعتبارسنجی با توان بالا برای صنعت مواد غذایی هستند، منتشر شود. به عنوان یک اثبات اصل، ما اخیراً امکان‌سنجی یک سیستم ریخت‌زایی با توان بالا چندگانه را که قابل مقیاس‌پذیری با قالب پلیت 24 چاهکی است، نشان داده‌ایم. علاوه بر این، محصولات متعدد اندام روی تراشه تجاری‌سازی شده‌اند16،17،18. بنابراین، اعتبارسنجی روش ریخت‌زایی آزمایشگاهی ما می‌تواند توسط بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، صنعت یا دولت و سازمان‌های نظارتی تسریع و به طور بالقوه پذیرفته شود تا برنامه‌ریزی مجدد سلولی ریخت‌زایی روده در شرایط آزمایشگاهی را درک کنند. سطح رونویسی برای آزمایش داروها یا زیست‌درمانی‌ها. جذب و انتقال کاندیداهای دارویی با استفاده از جایگزین‌های سه‌بعدی روده یا با استفاده از مدل‌های سفارشی یا تجاری اندام روی تراشه برای ارزیابی تکرارپذیری فرآیند مورفوژنز روده ارزیابی شد.
تعداد محدودی از مدل‌های تجربی مرتبط با انسان برای مطالعه مورفوژنز اپیتلیال روده استفاده شده‌اند، که عمدتاً به دلیل فقدان پروتکل‌های قابل اجرا برای القای مورفوژنز سه‌بعدی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) است. در واقع، بسیاری از دانش فعلی در مورد مورفوژنز روده مبتنی بر مطالعات حیوانی (به عنوان مثال، گورخرماهی20، موش21 یا مرغ22) است. با این حال، آنها پرزحمت و پرهزینه هستند، می‌توانند از نظر اخلاقی مورد سوال باشند و مهمتر از همه، فرآیندهای رشد انسان را به طور دقیق تعیین نمی‌کنند. این مدل‌ها همچنین در توانایی خود برای آزمایش به شیوه‌ای چندوجهی مقیاس‌پذیر بسیار محدود هستند. بنابراین، پروتکل ما برای بازسازی ساختارهای بافت سه‌بعدی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) از مدل‌های حیوانی در شرایط درون‌تنی (in vivo) و همچنین سایر مدل‌های سنتی کشت سلولی دوبعدی استاتیک بهتر عمل می‌کند. همانطور که قبلاً توضیح داده شد، استفاده از ساختارهای اپیتلیال سه‌بعدی به ما این امکان را داد تا محلی‌سازی فضایی سلول‌های تمایز یافته در محور کریپت-ویلی را در پاسخ به محرک‌های مختلف مخاطی یا ایمنی بررسی کنیم. لایه‌های اپیتلیال سه‌بعدی می‌توانند فضایی را برای مطالعه چگونگی رقابت سلول‌های میکروبی برای تشکیل جایگاه‌های فضایی و تکامل اکولوژیکی فراهم کنند. در پاسخ به عوامل میزبان (مثلاً لایه‌های مخاطی داخلی در مقابل خارجی، ترشح IgA و پپتیدهای ضدمیکروبی). علاوه بر این، مورفولوژی اپیتلیال سه‌بعدی می‌تواند به ما این امکان را بدهد که بفهمیم چگونه میکروبیوتای روده جوامع خود را تشکیل می‌دهد و به طور هم افزایی متابولیت‌های میکروبی (مثلاً اسیدهای چرب با زنجیره کوتاه) را تولید می‌کند که سازماندهی سلولی و جایگاه سلول‌های بنیادی را در کریپت‌های پایه شکل می‌دهند. این ویژگی‌ها فقط زمانی قابل اثبات هستند که لایه‌های اپیتلیال سه‌بعدی در شرایط آزمایشگاهی ایجاد شوند.
علاوه بر روش ما برای ایجاد ساختارهای اپیتلیال روده‌ای سه‌بعدی، چندین روش آزمایشگاهی (in vitro) نیز وجود دارد. کشت ارگانوئید روده‌ای یک تکنیک پیشرفته مهندسی بافت است که مبتنی بر کشت سلول‌های بنیادی روده‌ای تحت شرایط خاص مورفوژن است23،24،25. با این حال، استفاده از مدل‌های ارگانوئیدی سه‌بعدی برای تجزیه و تحلیل انتقال یا کشت‌های مشترک میزبان-میکروبیوم اغلب چالش برانگیز است زیرا لومن روده در داخل ارگانوئید محصور شده است و بنابراین، معرفی اجزای لومن مانند سلول‌های میکروبی یا آنتی‌ژن‌های اگزوژن محدود است. دسترسی به لومن‌های ارگانوئید را می‌توان با استفاده از یک میکرواینجکتور بهبود بخشید26،27 اما این روش تهاجمی و پرزحمت است و برای انجام آن به دانش تخصصی نیاز است. علاوه بر این، کشت‌های ارگانوئیدی سنتی که در داربست‌های هیدروژلی تحت شرایط ایستا نگهداری می‌شوند، بیومکانیک فعال درون‌تنی را به طور دقیق منعکس نمی‌کنند.
رویکردهای دیگری که توسط چندین گروه تحقیقاتی به کار گرفته شده‌اند، از داربست‌های هیدروژلی سه‌بعدی پیش‌ساخته برای تقلید از ساختار اپیتلیال روده با کشت سلول‌های روده‌ای جدا شده انسان روی سطح ژل استفاده می‌کنند. داربست‌های هیدروژلی را با استفاده از قالب‌های چاپ سه‌بعدی، میکروآسیاب شده یا لیتوگرافی شده می‌سازند. این روش، آرایش خودسازمان‌یافته سلول‌های اپیتلیال جدا شده را در شرایط آزمایشگاهی با گرادیان‌های مورفوژن مرتبط از نظر فیزیولوژیکی نشان می‌دهد و با گنجاندن سلول‌های استرومایی در داربست، ساختار اپیتلیال با نسبت ابعاد بالا و تداخل استروما-اپیتلیال ایجاد می‌کند. با این حال، ماهیت داربست‌های پیش‌ساخته ممکن است از نمایش خود فرآیند مورفوژنتیک خودبه‌خودی جلوگیری کند. این مدل‌ها همچنین جریان لومینال یا بینابینی پویا را فراهم نمی‌کنند و فاقد تنش برشی سیال هستند که سلول‌های روده برای انجام مورفوژنز و به دست آوردن عملکرد فیزیولوژیکی به آن نیاز دارند. مطالعه اخیر دیگری از داربست‌های هیدروژلی در یک پلتفرم میکروفلوئیدیک استفاده کرد و ساختارهای اپیتلیال روده‌ای الگوبرداری شده را با استفاده از تکنیک‌های حکاکی لیزری ایجاد کرد. ارگانوئیدهای روده‌ای موش از الگوهای حکاکی شده برای تشکیل ساختارهای لوله‌ای روده‌ای پیروی می‌کنند و جریان سیال داخل لومینال می‌تواند با استفاده از یک ماژول میکروفلوئیدیک، خلاصه‌سازی شده است. با این حال، این مدل نه فرآیندهای مورفوژنتیک خودبه‌خودی را نشان می‌دهد و نه شامل حرکات مکانوبیولوژیکی روده است. تکنیک‌های چاپ سه‌بعدی از همان گروه توانستند لوله‌های روده‌ای مینیاتوری با فرآیندهای مورفوژنتیک خودبه‌خودی ایجاد کنند. با وجود ساخت پیچیده بخش‌های مختلف روده در داخل لوله، این مدل همچنین فاقد جریان سیال لومینال و تغییر شکل مکانیکی است. علاوه بر این، قابلیت عملکرد مدل ممکن است محدود باشد، به خصوص پس از تکمیل فرآیند چاپ زیستی، که شرایط آزمایشگاهی یا تعاملات سلول به سلول را مختل می‌کند. در عوض، پروتکل پیشنهادی ما مورفوژنز خودبه‌خودی روده، تنش برشی مرتبط با فیزیولوژیکی، بیومکانیکی که حرکت روده را تقلید می‌کند، دسترسی به بخش‌های مستقل رأسی و قاعده‌ای-جانبی و بازآفرینی ریزمحیط‌های بیولوژیکی پیچیده مدولار را فراهم می‌کند. بنابراین، پروتکل مورفوژنز سه‌بعدی آزمایشگاهی ما ممکن است یک رویکرد مکمل برای غلبه بر چالش‌های روش‌های موجود ارائه دهد.
پروتکل ما کاملاً بر مورفوژنز اپیتلیال سه‌بعدی متمرکز است، که فقط سلول‌های اپیتلیال در کشت قرار دارند و هیچ نوع سلول اطراف دیگری مانند سلول‌های مزانشیمی، سلول‌های اندوتلیال و سلول‌های ایمنی در آن وجود ندارد. همانطور که قبلاً توضیح داده شد، هسته پروتکل ما القای مورفوژنز اپیتلیال با حذف مهارکننده‌های مورفوژن ترشح شده در سمت قاعده‌ای-جانبی محیط معرفی شده است. در حالی که مدولار بودن قوی روده-روی-تراشه و هیبرید-روی-تراشه ما به ما امکان می‌دهد تا لایه اپیتلیال سه‌بعدی مواج را بازسازی کنیم، پیچیدگی‌های بیولوژیکی اضافی مانند برهمکنش‌های اپیتلیال-مزانشیمی33،34، رسوب ماتریکس خارج سلولی (ECM)35 و در مدل ما، ویژگی‌های کریپت-پرز که حامل نیچ‌های سلول‌های بنیادی در کریپت‌های قاعده‌ای هستند، همچنان باید بیشتر مورد توجه قرار گیرند. سلول‌های استرومایی (به عنوان مثال، فیبروبلاست‌ها) در مزانشیم نقش کلیدی در تولید پروتئین‌های ECM و تنظیم مورفوژنز روده در داخل بدن دارند35،37،38. افزودن سلول‌های مزانشیمی به مدل ما، فرآیند مورفوژنتیک و کارایی اتصال سلولی را افزایش داد. لایه اندوتلیال (یعنی مویرگ‌ها یا مجاری لنفاوی) نقش مهمی در تنظیم انتقال مولکولی39 و جذب سلول‌های ایمنی40 در ریزمحیط روده ایفا می‌کند. علاوه بر این، اجزای عروقی که می‌توانند بین مدل‌های بافتی متصل شوند، پیش‌نیاز طراحی مدل‌های بافتی برای نشان دادن تعاملات چند اندامی هستند. بنابراین، ممکن است لازم باشد سلول‌های اندوتلیال برای مدل‌سازی ویژگی‌های فیزیولوژیکی دقیق‌تر با وضوح در سطح اندام گنجانده شوند. سلول‌های ایمنی مشتق از بیمار نیز برای نمایش پاسخ‌های ایمنی ذاتی، ارائه آنتی‌ژن، تداخل ایمنی تطبیقی ​​ذاتی و ایمنی اختصاصی بافت در زمینه تقلید بیماری روده ضروری هستند.
استفاده از تراشه‌های هیبریدی نسبت به روده روی تراشه ساده‌تر است زیرا راه‌اندازی دستگاه ساده‌تر است و استفاده از درج‌های Transwell امکان کشت مقیاس‌پذیر اپیتلیوم روده را فراهم می‌کند. با این حال، درج‌های Transwell موجود در بازار با غشاهای پلی‌استر الاستیک نیستند و نمی‌توانند حرکات پریستالتیک مانند را شبیه‌سازی کنند. علاوه بر این، بخش رأسی درج Transwell که در تراشه هیبریدی قرار داده شده بود، بدون هیچ تنش برشی در سمت رأسی، ثابت ماند. واضح است که خواص استاتیک در بخش رأسی به ندرت امکان کشت مشترک باکتریایی طولانی مدت را در تراشه‌های هیبریدی فراهم می‌کند. در حالی که می‌توانیم هنگام استفاده از تراشه‌های هیبریدی، مورفوژنز سه‌بعدی را به طور قوی در درج‌های Transwell القا کنیم، کمبود بیومکانیک فیزیولوژیکی مرتبط و جریان سیال رأسی ممکن است امکان‌سنجی پلتفرم‌های تراشه هیبریدی را برای کاربردهای بالقوه محدود کند.
بازسازی‌های کامل محور کریپت-پرزهای روده انسان در کشت‌های gut-on-a-chip و hybrid-on-a-chip به طور کامل انجام نشده است. از آنجایی که مورفوژنز از یک تک لایه اپیتلیال شروع می‌شود، ریزساختارهای سه‌بعدی لزوماً شباهت مورفولوژیکی با کریپت‌ها در داخل بدن را فراهم نمی‌کنند. اگرچه ما جمعیت سلولی در حال تکثیر را در نزدیکی دامنه کریپت پایه در اپیتلیوم سه‌بعدی میکرومهندسی شده مشخص کردیم، اما نواحی کریپت و پرزها به وضوح مشخص نشده بودند. اگرچه کانال‌های بالایی بالاتر روی تراشه منجر به افزایش ارتفاع اپیتلیوم میکرومهندسی شده می‌شود، حداکثر ارتفاع هنوز به حدود 300 تا 400 میکرومتر محدود می‌شود. عمق واقعی کریپت‌های روده انسان در روده کوچک و بزرگ به ترتیب حدود 135 میکرومتر و حدود 400 میکرومتر است و ارتفاع پرزهای روده کوچک حدود 600 میکرومتر است41.
از دیدگاه تصویربرداری، تصویربرداری درجا با وضوح فوق‌العاده از ریزساختارهای سه‌بعدی ممکن است به روده روی تراشه محدود شود، زیرا فاصله کاری مورد نیاز از لنز شیئی تا لایه اپیتلیال در حدود چند میلی‌متر است. برای غلبه بر این مشکل، ممکن است به یک عدسی شیئی دور نیاز باشد. علاوه بر این، تهیه مقاطع نازک برای تهیه نمونه تصویربرداری به دلیل خاصیت ارتجاعی بالای PDMS چالش برانگیز است. علاوه بر این، از آنجایی که ریزساخت لایه به لایه روده روی تراشه شامل چسبندگی دائمی بین هر لایه است، باز کردن یا برداشتن لایه بالایی برای بررسی ساختار سطحی لایه اپیتلیال بسیار چالش برانگیز است. به عنوان مثال، با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM).
آبگریزی PDMS یک عامل محدودکننده در مطالعات مبتنی بر میکروفلوئیدیک بوده است که با مولکول‌های کوچک آبگریز سروکار دارند، زیرا PDMS می‌تواند به طور غیر اختصاصی چنین مولکول‌های آبگریزی را جذب کند. جایگزین‌هایی برای PDMS ممکن است با سایر مواد پلیمری در نظر گرفته شود. به عنوان یک جایگزین، اصلاح سطح PDMS (مثلاً پوشش با مواد لیپوفیلیک 42 یا پلی (اتیلن گلیکول) 43) می‌تواند برای به حداقل رساندن جذب مولکول‌های آبگریز در نظر گرفته شود.
در نهایت، روش ما از نظر ارائه یک غربالگری با توان عملیاتی بالا یا پلتفرم آزمایشی کاربرپسند «یک‌سایز برای همه» به خوبی توصیف نشده است. پروتکل فعلی به یک پمپ سرنگی برای هر میکرودستگاه نیاز دارد که فضای انکوباتور CO2 را اشغال می‌کند و از آزمایش‌های در مقیاس بزرگ جلوگیری می‌کند. این محدودیت را می‌توان با مقیاس‌پذیری قالب‌های کشت نوآورانه (مثلاً درج‌های متخلخل ۲۴ چاهکی، ۹۶ چاهکی یا ۳۸۴ چاهکی که امکان پر کردن و حذف مداوم محیط‌های پایه جانبی را فراهم می‌کنند) به طور قابل توجهی بهبود بخشید.
برای القای مورفوژنز سه‌بعدی اپیتلیوم روده انسان در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، ما از یک دستگاه روده‌ای تراشه‌ای میکروفلوئیدیک حاوی دو میکروکانال موازی و یک غشای متخلخل الاستیک در بین آنها برای ایجاد یک رابط لومن-مویرگی استفاده کردیم. ما همچنین استفاده از یک دستگاه میکروفلوئیدیک تک کاناله (یک تراشه هیبریدی) را نشان می‌دهیم که جریان بازولترال پیوسته را در زیر لایه‌های اپیتلیال قطبی شده رشد یافته روی درج‌های Transwell فراهم می‌کند. در هر دو پلتفرم، مورفوژنز سلول‌های مختلف اپیتلیال روده انسان را می‌توان با اعمال دستکاری جهت‌دار جریان برای حذف آنتاگونیست‌های مورفوژن از محفظه بازولترال نشان داد. کل روش تجربی (شکل 1) شامل پنج بخش است: (i) ریزساخت تراشه روده یا تراشه هیبریدی قابل درج Transwell (مراحل 1-5؛ کادر 1)، (ii) آماده‌سازی سلول‌های اپیتلیال روده (سلول‌های Caco-2) یا ارگانوئیدهای روده انسان؛ کادرهای 2-5)، (iii) کشت سلول‌های اپیتلیال روده روی تراشه‌های روده‌ای یا تراشه‌های هیبریدی (مراحل 6-9)، (iv) القای مورفوژنز سه‌بعدی در شرایط آزمایشگاهی (مرحله 10) و (v) ) برای توصیف ریزساختار سه‌بعدی اپیتلیال (مراحل 11-24). در نهایت، یک گروه کنترل مناسب (که در ادامه بیشتر مورد بحث قرار می‌گیرد) برای تأیید اثربخشی مورفوژنز آزمایشگاهی با مقایسه مورفوژنز اپیتلیال با کنترل‌های مکانی، زمانی، شرطی یا رویه‌ای طراحی شد.
ما از دو پلتفرم کشت مختلف استفاده کردیم: روده روی تراشه با کانال‌های مستقیم یا کانال‌های پیچ‌خورده غیرخطی، یا تراشه‌های هیبریدی حاوی درج‌های Transwell (TW) در یک دستگاه میکروفلوئیدیک، که مطابق با توضیحات کادر 1 و مراحل 1 تا 5 ساخته شده‌اند. "ساخت دستگاه" مراحل اصلی ساخت یک تراشه واحد یا یک تراشه هیبریدی را نشان می‌دهد. "کشت سلول‌های اپیتلیال روده انسان" منبع سلولی (Caco-2 یا ارگانوئیدهای روده انسان) و روش کشت مورد استفاده در این پروتکل را توضیح می‌دهد. "مورفوژنز آزمایشگاهی" مراحل کلی کشت Caco-2 یا سلول‌های اپیتلیال مشتق از ارگانوئید را روی یک تراشه روده یا روی درج‌های Transwell یک تراشه هیبریدی نشان می‌دهد و به دنبال آن القای مورفوژنز سه‌بعدی و تشکیل یک ساختار اپیتلیال مشخص شده انجام می‌شود. شماره مرحله برنامه یا شماره کادر در زیر هر فلش نمایش داده شده است. این برنامه نمونه‌هایی از چگونگی استفاده از لایه‌های اپیتلیال روده ایجاد شده را ارائه می‌دهد، به عنوان مثال، در توصیف تمایز سلولی، مطالعات فیزیولوژی روده، ایجاد اکوسیستم‌های میزبان-میکروبیوم و بیماری. مدل‌سازی. تصاویر ایمونوفلورسانس در «تمایز سلولی» هسته‌ها، F-اکتین و MUC2 بیان‌شده در لایه اپیتلیال سه‌بعدی Caco-2 تولید شده روی تراشه روده را نشان می‌دهند. سیگنالینگ MUC2 در سلول‌های جامی و مخاط ترشح‌شده از سطوح مخاطی وجود دارد. تصاویر فلورسنت در «فیزیولوژی روده» مخاط تولید شده توسط رنگ‌آمیزی برای اسید سیالیک و باقیمانده‌های N-استیل گلوکزامین با استفاده از آگلوتینین جوانه گندم فلورسنت را نشان می‌دهند. دو تصویر همپوشانی در «هم‌کشت‌های میزبان-میکروب» نشان‌دهنده هم‌کشتی‌های نمونه میزبان-میکروبیوم در روده روی یک تراشه هستند. پنل سمت چپ، هم‌کشتی E. coli بیان‌کننده پروتئین فلورسنت سبز (GFP) را با سلول‌های اپیتلیال سه‌بعدی Caco-2 میکرومهندسی‌شده نشان می‌دهد. پنل سمت راست، محلی‌سازی GFP E. coli کشت‌شده با سلول‌های اپیتلیال سه‌بعدی Caco-2 را نشان می‌دهد و به دنبال آن رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس با F-اکتین (قرمز) و هسته‌ها (آبی) انجام می‌شود. مدل‌سازی بیماری، روده سالم را در مقابل روده نشت‌کننده نشان می‌دهد. در تراشه‌های التهاب روده تحت چالش فیزیولوژیکی با آنتی‌ژن‌های باکتریایی (مثلاً لیپوپلی‌ساکارید، LPS) و سلول‌های ایمنی (مثلاً PBMC؛ سبز). سلول‌های Caco-2 برای ایجاد یک لایه اپیتلیال سه‌بعدی کشت داده شدند. نوار مقیاس، ۵۰ میکرومتر. تصاویر در ردیف پایین: «تمایز سلول‌ها» با اجازه از مرجع اقتباس شده است. ۲. انتشارات دانشگاه آکسفورد؛ با اجازه از مرجع ۵. NAS؛ «هم‌کشتی میزبان-میکروب» با اجازه از مرجع ۳. NAS؛ «مدل‌سازی بیماری» با اجازه از مرجع ۵. NAS اقتباس شده است.
هر دو تراشه روده روی تراشه و تراشه‌های هیبریدی با استفاده از کپی‌های PDMS ساخته شدند که با استفاده از لیتوگرافی نرم از قالب‌های سیلیکونی جدا شده و با SU-8 الگوبرداری شدند. طراحی میکروکانال‌ها در هر تراشه با در نظر گرفتن هیدرودینامیک‌هایی مانند تنش برشی و فشار هیدرودینامیکی تعیین می‌شود. طرح اولیه روده روی تراشه (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a)، که شامل دو میکروکانال مستقیم موازی در کنار هم بود، به یک روده روی تراشه پیچیده تبدیل شده است (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1b) که شامل یک جفت میکروکانال منحنی برای القای افزایش زمان اقامت سیال، الگوهای جریان غیرخطی و تغییر شکل چند محوری سلول‌های کشت شده است (شکل 2a-f). 12. هنگامی که بیومکانیک روده پیچیده‌تر نیاز به بازسازی دارد، می‌توان روده روی تراشه‌های پیچیده را انتخاب کرد. ما نشان داده‌ایم که روده روی تراشه پیچیده نیز به شدت باعث مورفوژنز سه‌بعدی در یک بازه زمانی مشابه با درجه مشابهی از رشد اپیتلیال می‌شود. در مقایسه با Gut-Chip اصلی، صرف نظر از نوع سلول کشت شده. بنابراین، برای القای مورفوژنز سه بعدی، طرح‌های خطی و پیچیده روده روی تراشه قابل تعویض هستند. کپی‌های PDMS که روی قالب‌های سیلیکونی با الگوهای SU-8 پخته شده‌اند، پس از قالب‌گیری مجدد، ویژگی‌های منفی ارائه می‌دهند (شکل 2a). برای ساخت روده روی تراشه، لایه بالایی PDMS آماده شده به صورت متوالی به یک فیلم PDMS متخلخل متصل شد و سپس با استفاده از یک دستگاه کرونا، با لایه پایینی PDMS از طریق اتصال برگشت‌ناپذیر هم‌تراز شد (شکل 2b-f). برای ساخت تراشه‌های هیبریدی، کپی‌های PDMS پخته شده به اسلایدهای شیشه‌ای متصل شدند تا دستگاه‌های میکروفلوئیدیک تک کاناله‌ای ایجاد شوند که بتوانند درج‌های Transwell را در خود جای دهند (شکل 2h و داده‌های گسترده شکل 2). فرآیند اتصال با تیمار سطوح کپی PDMS و شیشه با پلاسمای اکسیژن یا درمان کرونا انجام می‌شود. پس از استریل کردن دستگاه میکروساخته متصل به لوله سیلیکونی، دستگاه آماده انجام مورفوژنز سه بعدی روده بود. اپیتلیوم (شکل 2g).
الف) تصویر شماتیک از آماده‌سازی قطعات PDMS از قالب‌های سیلیکونی طرح‌دار SU-8. محلول PDMS پخت نشده روی یک قالب سیلیکونی (چپ) ریخته شد، در دمای 60 درجه سانتیگراد (وسط) پخت و از قالب خارج شد (راست). PDMS از قالب خارج شده به قطعات برش داده شد و برای استفاده بیشتر تمیز شد. ب) عکس قالب سیلیکونی مورد استفاده برای آماده‌سازی لایه بالایی PDMS. ج) عکس قالب سیلیکونی مورد استفاده برای ساخت غشای متخلخل PDMS. د) مجموعه‌ای از عکس‌ها از اجزای PDMS بالایی و پایینی و دستگاه روده‌ای مونتاژ شده روی تراشه. ه) شماتیک از تراز اجزای PDMS بالایی، غشایی و پایینی. هر لایه به طور برگشت‌ناپذیر توسط عملیات پلاسما یا کرونا به هم متصل شده است. و) شماتیک دستگاه روده روی تراشه ساخته شده با میکروکانال‌های پیچیده و محفظه‌های خلاء. ز) راه‌اندازی روده روی تراشه برای کشت سلولی میکروفلوئیدیک. روده ساخته شده روی تراشه‌ای که با یک لوله سیلیکونی و سرنگ مونتاژ شده است، قرار داده شد. روی یک لامل. دستگاه تراشه برای پردازش روی درب یک ظرف پتری ۱۵۰ میلی‌متری قرار داده شد. از چسب برای بستن لوله سیلیکونی استفاده می‌شود.h، تصاویر بصری از ساخت تراشه هیبریدی و مورفوژنز سه‌بعدی با استفاده از تراشه‌های هیبریدی. درج‌های Transwell که به طور مستقل برای کشت تک لایه‌های دوبعدی سلول‌های اپیتلیال روده تهیه شده بودند، برای القای مورفوژنز سه‌بعدی روده، در تراشه هیبریدی قرار داده شدند. محیط کشت از طریق میکروکانال‌های زیر لایه سلولی ایجاد شده روی درج Transwell پرفیوژن می‌شود. نوار مقیاس، ۱ سانتی‌متر.h با اجازه از مرجع تجدید چاپ شده است.۴. Elsevier.
در این پروتکل، رده سلولی Caco-2 و ارگانوئیدهای روده‌ای به عنوان منابع اپیتلیال استفاده شدند (شکل 3a). هر دو نوع سلول به طور مستقل کشت داده شدند (کادر 2 و کادر 5) و برای کاشت میکروکانال‌های پوشش داده شده با ECM در داخل تراشه‌های روده یا Transwell استفاده شدند. هنگامی که سلول‌ها به هم پیوسته هستند (پوشش بیش از 95٪ در فلاسک‌ها)، سلول‌های Caco-2 کشت داده شده به طور معمول (بین پاساژهای 10 و 50) در فلاسک‌های T برای تهیه سوسپانسیون‌های سلولی جدا شده توسط مایع تریپسینیزاسیون برداشت می‌شوند (کادر 2). ارگانوئیدهای روده‌ای انسان از بیوپسی‌های روده یا برداشت‌های جراحی در گنبدهای داربستی ماتریژل در صفحات 24 چاهکی کشت داده شدند تا از ریزمحیط ساختاری پشتیبانی کنند. محیط کشت حاوی مورفوژن‌های ضروری (مانند Wnt، R-اسپوندین و ناگین) و فاکتورهای رشد تهیه شده طبق توضیحات کادر 3، یک روز در میان اضافه شد تا ارگانوئیدها به قطر حدود 500 میکرومتر رشد کنند. ارگانوئیدهای رشد یافته برداشت شده و برای کاشت روی روده یا درج‌های Transwell روی تراشه (کادر 5) به سلول‌های منفرد تفکیک می‌شوند. همانطور که قبلاً گزارش داده‌ایم، می‌توان آن را بر اساس نوع بیماری12،13 (مثلاً کولیت اولسراتیو، بیماری کرون، سرطان کولورکتال یا اهداکننده طبیعی)، محل ضایعه (مثلاً ناحیه ضایعه‌دار در مقابل ناحیه بدون ضایعه) و محل دستگاه گوارش در دستگاه گوارش (مثلاً دوازدهه، ژژنوم، ایلئوم، سکوم، روده بزرگ یا رکتوم) تفکیک کرد. ما در کادر 5 یک پروتکل بهینه برای کشت ارگانوئیدهای کولون (کولوئیدها) ارائه می‌دهیم که معمولاً به غلظت‌های بالاتری از مورفوژن‌ها نسبت به ارگانوئیدهای روده کوچک نیاز دارند.
الف) گردش کار برای القای مورفوژنز روده در تراشه روده. اپیتلیوم روده انسانی Caco-2 و ارگانوئیدهای روده در این پروتکل برای نشان دادن مورفوژنز سه بعدی استفاده می‌شوند. سلول‌های اپیتلیال جدا شده در دستگاه gut-on-a-chip آماده شده (آماده‌سازی تراشه) کاشته شدند. هنگامی که سلول‌ها در روز 0 (D0) کاشته شدند (seeded) و به غشای متخلخل PDMS متصل شدند (joint)، جریان رأسی (AP) آغاز شده و برای 2 روز اول (جریان، AP، D0-D2) حفظ می‌شود. جریان قاعده‌ای-جانبی (BL) نیز همراه با حرکات کششی چرخه‌ای (کشش، جریان، AP و BL) هنگامی که یک تک لایه کامل 2D تشکیل می‌شود، آغاز می‌شود. مورفوژنز سه بعدی روده به طور خود به خود پس از 5 روز کشت میکروفلوئیدیک رخ داد (مورفوژنز، D5). تصاویر کنتراست فاز، مورفولوژی نماینده سلول‌های Caco-2 را در هر مرحله یا نقطه زمانی آزمایش نشان می‌دهند (نمودار میله‌ای، 100 میکرومتر). چهار نمودار شماتیک که مراحل مربوطه را نشان می‌دهند آبشارهای مورفوژنز روده (بالا سمت راست). فلش‌های خط‌چین در شماتیک، جهت جریان سیال را نشان می‌دهند. ب، تصویر SEM که توپولوژی سطح اپیتلیوم سه‌بعدی Caco-2 تثبیت‌شده را نشان می‌دهد (چپ). تصویر داخل تصویر که ناحیه بزرگنمایی‌شده را برجسته می‌کند (کادر خط‌چین سفید) میکروویلی‌های بازسازی‌شده را روی لایه سه‌بعدی Caco-2 نشان می‌دهد (راست). ج، نمای افقی از Caco-2 تثبیت‌شده سه‌بعدی، کلودین (ZO-1، قرمز) و غشاهای حاشیه برس پیوسته با برچسب F-actin (سبز) و هسته‌ها (آبی). تجسم کانفوکال ایمونوفلورسانس از سلول‌های اپیتلیال روی تراشه‌های روده. فلش‌هایی که به شماتیک میانی اشاره دارند، محل صفحه کانونی را برای هر نمای کانفوکال نشان می‌دهند. د، سیر زمانی تغییرات مورفولوژیکی در ارگانوئیدهای کشت‌شده روی تراشه که توسط میکروسکوپ فاز کنتراست در روزهای 3، 7، 9، 11 و 13 به دست آمده است. تصویر داخل تصویر (بالا سمت راست) بزرگنمایی بالای تصویر ارائه شده را نشان می‌دهد. ه، DIC فتومیکروگراف اپیتلیوم سه بعدی ارگانوئید مستقر در روده روی برش گرفته شده در روز 7.f، تصاویر ایمونوفلورسانس روی هم قرار گرفته که نشانگرهای سلول‌های بنیادی (LGR5؛ سرخابی)، سلول‌های جامی (MUC2؛ سبز)، F-اکتین (خاکستری) و هسته‌ها (فیروزه‌ای) رشد یافته روی تراشه‌های روده به ترتیب به مدت 3 روز (چپ) و 13 روز (وسط) ارگانوئیدها روی لایه اپیتلیال را نشان می‌دهد. همچنین به شکل داده‌های توسعه‌یافته 3 مراجعه کنید که سیگنالینگ LGR5 را بدون سیگنالینگ MUC2 برجسته می‌کند. تصاویر فلورسانس ریزساختار اپیتلیال (راست) اپیتلیوم ارگانوئید سه بعدی مستقر در روده روی تراشه را با رنگ‌آمیزی غشای پلاسما با رنگ CellMask (راست) در روز 13 کشت نشان می‌دهد. نوار مقیاس 50 میکرومتر است، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد.b با اجازه از مرجع تجدید چاپ شده است.2. انتشارات دانشگاه آکسفورد؛c با اجازه از مرجع اقتباس شده است.2. انتشارات دانشگاه آکسفورد؛ ه و ف با اجازه مرجع اقتباس شده‌اند.۱۲ تحت مجوز کریتیو کامنز CC BY 4.0.
در روده روی تراشه، برای پوشش موفقیت‌آمیز ECM، اصلاح سطح آبگریز غشای متخلخل PDMS ضروری است. در این پروتکل، ما دو روش مختلف را برای اصلاح آبگریزی غشاهای PDMS اعمال می‌کنیم. برای کشت سلول‌های Caco-2، فعال‌سازی سطحی توسط تیمار UV/ازن به تنهایی برای کاهش آبگریزی سطح PDMS، پوشش ECM و اتصال سلول‌های Caco-2 به غشای PDMS کافی بود. با این حال، کشت میکروفلوئیدیک اپیتلیوم ارگانوئیدی نیاز به عامل‌دار کردن سطح مبتنی بر مواد شیمیایی دارد تا با اعمال متوالی پلی‌اتیلن‌ایمین (PEI) و گلوتارآلدئید به میکروکانال‌های PDMS، رسوب کارآمد پروتئین‌های ECM حاصل شود. پس از اصلاح سطح، پروتئین‌های ECM برای پوشاندن سطح PDMS عامل‌دار شده رسوب داده شدند و سپس به اپیتلیوم ارگانوئید جدا شده وارد شدند. پس از اتصال سلول‌ها، کشت سلولی میکروفلوئیدیک با تزریق فقط محیط کشت به میکروکانال بالایی شروع می‌شود تا زمانی که سلول‌ها یک تک لایه کامل تشکیل دهند، در حالی که میکروکانال پایینی شرایط ایستا را حفظ می‌کند. این روش بهینه برای فعال‌سازی سطحی و پوشش ECM، اتصال ارگانوئید را امکان‌پذیر می‌کند. اپیتلیوم برای القای ریخت‌زایی سه‌بعدی روی سطح PDMS.
کشت‌های Transwell همچنین قبل از کاشت سلول به پوشش ECM نیاز دارند؛ با این حال، کشت‌های Transwell نیازی به مراحل پیش‌تیمار پیچیده برای فعال کردن سطح درج‌های متخلخل ندارند. برای رشد سلول‌های Caco-2 روی درج‌های Transwell، پوشش ECM روی درج‌های متخلخل، اتصال سلول‌های Caco-2 جدا شده (کمتر از 1 ساعت) و تشکیل سد اتصال محکم (کمتر از 1-2 روز) را تسریع می‌کند. برای کشت ارگانوئیدها روی درج‌های Transwell، ارگانوئیدهای جدا شده روی درج‌های پوشش داده شده با ECM کاشته می‌شوند، به سطح غشاء متصل می‌شوند (کمتر از 3 ساعت) و تا زمانی که ارگانوئیدها یک تک لایه کامل با یکپارچگی سد تشکیل دهند، حفظ می‌شوند. کشت‌های Transwell در پلیت‌های 24 چاهکی بدون استفاده از تراشه‌های هیبریدی انجام می‌شوند.
مورفوژنز سه بعدی آزمایشگاهی را می‌توان با اعمال جریان سیال به سمت قاعده‌ای-جانبی یک لایه اپیتلیال تثبیت‌شده آغاز کرد. در روده روی تراشه، مورفوژنز اپیتلیال زمانی آغاز شد که محیط کشت به میکروکانال‌های بالایی و پایینی تزریق شد (شکل 3a). همانطور که قبلاً توضیح داده شد، ایجاد جریان سیال در محفظه تحتانی (قاعده‌ای-جانبی) برای حذف مداوم مهارکننده‌های مورفوژن ترشح‌شده جهت‌دار بسیار مهم است. برای فراهم کردن مواد مغذی و سرم کافی برای سلول‌های متصل به غشاهای متخلخل و ایجاد تنش برشی لومینال، معمولاً جریان دوگانه را در روده روی تراشه اعمال می‌کنیم. در تراشه‌های هیبریدی، درج‌های Transwell حاوی تک لایه‌های اپیتلیال در تراشه‌های هیبریدی قرار داده شدند. سپس، محیط کشت از طریق میکروکانال در زیر سمت قاعده‌ای-جانبی درج متخلخل Transwell اعمال شد. مورفوژنز روده 3-5 روز پس از شروع جریان قاعده‌ای-جانبی در هر دو پلتفرم کشت رخ داد.
ویژگی‌های مورفولوژیکی لایه‌های اپیتلیال سه‌بعدی میکرومهندسی‌شده را می‌توان با استفاده از روش‌های مختلف تصویربرداری، از جمله میکروسکوپ فاز کنتراست، میکروسکوپ کنتراست تداخلی تفاضلی (DIC)، SEM یا میکروسکوپ کانفوکال ایمونوفلورسانس (شکل‌های 3 و 4) تجزیه و تحلیل کرد. تصویربرداری فاز کنتراست یا DIC را می‌توان به راحتی در هر زمانی در طول کشت انجام داد تا شکل و بیرون‌زدگی لایه‌های اپیتلیال سه‌بعدی را رصد کرد. با توجه به شفافیت نوری PDMS و فیلم‌های پلی‌استر، هر دو پلتفرم gut-on-a-chip و تراشه هیبریدی می‌توانند تصویربرداری درجا را به صورت بلادرنگ و بدون نیاز به برش یا جداسازی دستگاه فراهم کنند. هنگام انجام تصویربرداری ایمونوفلورسانس (شکل‌های 1، 3c، f و 4b، c)، سلول‌ها معمولاً به ترتیب با 4٪ (وزنی/حجمی) پارافرمالدهید (PFA)، و پس از آن Triton X-100 و 2٪ (وزنی/حجمی) آلبومین سرم گاوی (BSA) تثبیت می‌شوند. بسته به نوع سلول، تثبیت‌کننده‌های مختلف، نفوذپذیرکننده‌ها و عوامل مسدودکننده می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. آنتی‌بادی‌های اولیه که نشانگرهای سلولی یا ناحیه‌ای وابسته به دودمان را هدف قرار می‌دهند، برای برجسته کردن سلول‌های تثبیت‌شده در محل روی تراشه استفاده می‌شوند و به دنبال آن آنتی‌بادی‌های ثانویه به همراه یک رنگ ضدرنگ که هسته (مثلاً 4′،6-دی‌آمیدینو-2-فنیلن) ایندول، DAPI) یا F-اکتین (مثلاً فالوئیدین نشاندار شده با فلورسانس) را هدف قرار می‌دهد، استفاده می‌شوند. تصویربرداری زنده مبتنی بر فلورسانس همچنین می‌تواند در محل برای تشخیص تولید مخاط (شکل 1، "تمایز سلولی" و "فیزیولوژی روده")، کلونیزاسیون تصادفی سلول‌های میکروبی (شکل 1، "هم‌کشتی میزبان-میکروب")، جذب سلول‌های ایمنی (شکل 1، "مدل‌سازی بیماری") یا خطوط مورفولوژی اپیتلیال سه‌بعدی (شکل 3c، f و 4b، c) انجام شود. هنگام اصلاح روده روی تراشه برای جدا کردن لایه بالایی از لایه میکروکانال پایینی، همانطور که در مرجع توضیح داده شده است. همانطور که در شکل نشان داده شده است. همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، مورفولوژی اپیتلیال سه‌بعدی و همچنین میکروویلی‌های روی حاشیه رأسی را می‌توان با SEM مشاهده کرد (شکل 3b). بیان نشانگرهای تمایز را می‌توان با انجام PCR5 کمی یا تعیین توالی RNA تک سلولی ارزیابی کرد. در این حالت، لایه‌های سه‌بعدی سلول‌های اپیتلیال رشد یافته در تراشه‌های روده یا تراشه‌های هیبریدی با تریپسینیزاسیون برداشت می‌شوند و سپس برای تجزیه و تحلیل مولکولی یا ژنتیکی استفاده می‌شوند.
الف) گردش کار برای القای مورفوژنز روده در یک تراشه هیبریدی. Caco-2 و ارگانوئیدهای روده در این پروتکل برای نشان دادن مورفوژنز سه بعدی در یک پلتفرم تراشه هیبریدی استفاده می‌شوند. سلول‌های اپیتلیال جدا شده در درج‌های Transwell آماده شده (آماده‌سازی TW؛ شکل زیر را ببینید) کاشته شدند. پس از کاشت سلول‌ها (بذرپاشی) و اتصال به غشاهای پلی‌استر در درج‌های Transwell، همه سلول‌ها تحت شرایط ایستا (کشت TW) کشت داده شدند. پس از 7 روز، یک درج Transwell حاوی یک تک لایه دو بعدی از سلول‌های اپیتلیال در یک تراشه هیبریدی ادغام شد تا یک جریان قاعده‌ای-جانبی (Flow، BL) ایجاد شود که در نهایت منجر به تولید یک لایه اپیتلیال سه بعدی (مورفوژنز) شد. میکروگراف‌های کنتراست فازی، ویژگی‌های مورفولوژیکی سلول‌های اپیتلیال اندام انسانی مشتق شده از کولون صعودی اهداکننده طبیعی (رده C103) را در هر مرحله یا نقطه زمانی آزمایش نشان می‌دهند. طرحواره‌های موجود در لایه‌های بالایی، پیکربندی آزمایش را برای هر مرحله نشان می‌دهند. ب) تراشه‌های هیبریدی (طرحواره سمت چپ) می‌توانند منجر به مورفوژنز سه بعدی شوند. سلول‌های اپیتلیال ارگانوئیدی با نماهای میکروسکوپی کانفوکال از بالا به پایین که در موقعیت‌های مختلف Z (بالا، وسط و پایین؛ به طرحواره سمت راست و خطوط نقطه‌چین مربوطه مراجعه کنید) گرفته شده‌اند، ویژگی‌های مورفولوژیکی واضحی را نشان دادند. F-اکتین (فیروزه‌ای)، هسته (خاکستری).c، میکروگراف‌های کانفوکال فلورسانس (نمای زاویه‌دار سه‌بعدی) از سلول‌های اپیتلیال مشتق از ارگانوئید کشت‌شده در Transwell استاتیک (TW؛ تصویر داخل کادر سفید خط‌چین) در مقابل تراشه هیبریدی (بزرگترین نمای کامل) که به ترتیب مورفولوژی دوبعدی و سه‌بعدی را مقایسه می‌کنند. یک جفت نمای متقاطع عمودی دوبعدی (تصویر داخل گوشه بالا سمت راست؛ "XZ") نیز ویژگی‌های دوبعدی و سه‌بعدی را نشان می‌دهند. نوار مقیاس، 100 میکرومتر.c با اجازه از مرجع تجدید چاپ شده است.4. الزویر.
کنترل‌ها را می‌توان با کشت همان سلول‌ها (Caco-2 یا سلول‌های اپیتلیال ارگانوئید روده) در تک‌لایه‌های دوبعدی تحت شرایط کشت استاتیک مرسوم تهیه کرد. نکته قابل توجه این است که به دلیل ظرفیت حجمی محدود میکروکانال‌ها (یعنی حدود ۴ میکرولیتر در کانال بالایی روی طرح اصلی تراشه روده)، ممکن است تخلیه مواد مغذی رخ دهد. بنابراین، مورفولوژی اپیتلیال قبل و بعد از اعمال جریان بازولترال نیز قابل مقایسه است.
فرآیند لیتوگرافی نرم باید در یک اتاق تمیز انجام شود. برای هر لایه روی تراشه (لایه‌های بالایی و پایینی و غشاها) و تراشه‌های هیبریدی، از ماسک‌های نوری مختلف استفاده شده و روی ویفرهای سیلیکونی جداگانه ساخته شده‌اند زیرا ارتفاع میکروکانال‌ها متفاوت است. ارتفاع هدف میکروکانال‌های بالایی و پایینی روده روی تراشه به ترتیب ۵۰۰ میکرومتر و ۲۰۰ میکرومتر است. ارتفاع هدف کانال تراشه هیبریدی ۲۰۰ میکرومتر است.
یک ویفر سیلیکونی 8 سانتی‌متری را در ظرفی حاوی استون قرار دهید. بشقاب را به مدت 30 ثانیه به آرامی بچرخانید، سپس ویفر را در معرض هوا خشک کنید. ویفر را به بشقابی حاوی IPA منتقل کنید، سپس بشقاب را به مدت 30 ثانیه بچرخانید تا تمیز شود.
می‌توان به صورت اختیاری از محلول پیرانا (مخلوطی از پراکسید هیدروژن و اسید سولفوریک غلیظ، ۱:۳ (حجم/حجم)) برای به حداکثر رساندن حذف بقایای آلی از سطح ویفر سیلیکونی استفاده کرد.
محلول پیرانا بسیار خورنده است و گرما تولید می‌کند. اقدامات احتیاطی ایمنی بیشتری لازم است. برای دفع زباله، اجازه دهید محلول خنک شود و سپس آن را به یک ظرف زباله تمیز و خشک منتقل کنید. از ظروف ثانویه استفاده کنید و ظروف زباله را به درستی برچسب گذاری کنید. لطفاً برای مراحل دقیق‌تر، دستورالعمل‌های ایمنی مرکز را دنبال کنید.
ویفرها را با قرار دادن روی یک صفحه داغ با دمای ۲۰۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه، آبگیری کنید. پس از آبگیری، ویفر پنج بار در هوا تکان داده شد تا خنک شود.
حدود ۱۰ گرم از ماده‌ی مقاوم در برابر نور SU-8 2100 را روی مرکز ویفر سیلیکونی تمیز شده بریزید. با استفاده از موچین، ماده‌ی مقاوم در برابر نور را به طور یکنواخت روی ویفر پخش کنید. گاهی اوقات ویفر را روی یک صفحه داغ با دمای ۶۵ درجه سانتیگراد قرار دهید تا ماده‌ی مقاوم در برابر نور چسبندگی کمتری داشته باشد و راحت‌تر پخش شود. ویفر را مستقیماً روی صفحه داغ قرار ندهید.
SU-8 با اجرای پوشش چرخشی به طور یکنواخت روی ویفر توزیع شد. چرخش ورودی SU-8 را به مدت 5 تا 10 ثانیه برنامه‌ریزی کنید تا با سرعت 500 دور در دقیقه و شتاب 100 دور در دقیقه در ثانیه منتشر شود. چرخش اصلی را برای الگوسازی با ضخامت 200 میکرومتر در 1500 دور در دقیقه تنظیم کنید، یا به ضخامت 250 میکرومتر (ایجاد ارتفاع 500 میکرومتر برای لایه بالایی روده روی تراشه؛ به "مراحل بحرانی" در زیر مراجعه کنید) با شتاب 300 دور در دقیقه در 1200 دور در دقیقه به مدت 30 ثانیه تنظیم کنید.
سرعت چرخش اصلی را می‌توان با توجه به ضخامت هدف الگوی SU-8 روی ویفر سیلیکونی تنظیم کرد.
برای ساخت الگوهای SU-8 با ارتفاع ۵۰۰ میکرومتر برای لایه بالایی روده روی تراشه، مراحل پوشش‌دهی چرخشی و پخت نرم این جعبه (مراحل ۷ و ۸) به ترتیب تکرار شدند (به مرحله ۹ مراجعه کنید) تا دو لایه ۲۵۰ میکرومتری از SU-8 تولید شود که می‌توان آن را با قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش در مرحله ۱۲ این جعبه لایه‌بندی و به هم متصل کرد و یک لایه با ارتفاع ۵۰۰ میکرومتر ایجاد کرد.
ویفرهای روکش‌دار SU-8 را با قرار دادن دقیق ویفرها روی صفحه داغ در دمای ۶۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه، به صورت نرم بپزید، سپس تنظیمات را به ۹۵ درجه سانتیگراد تغییر دهید و به مدت ۴۰ دقیقه دیگر انکوبه کنید.
برای رسیدن به ارتفاع ۵۰۰ میکرومتری الگوی SU-8 در میکروکانال بالایی، مراحل ۷ و ۸ را تکرار کنید تا دو لایه SU-8 با ضخامت ۲۵۰ میکرومتر ایجاد شود.
با استفاده از دستگاه تنظیم ماسک UV، طبق دستورالعمل سازنده، آزمایش لامپ را انجام دهید تا زمان نوردهی ویفر محاسبه شود. (زمان نوردهی، میلی‌ثانیه) = (دوز نوردهی، میلی‌ژول بر سانتی‌متر مربع) / (توان لامپ، میلی‌وات بر سانتی‌متر مربع).
پس از تعیین زمان نوردهی، ماسک نوری را روی نگهدارنده ماسک ترازکننده ماسک UV قرار دهید و ماسک نوری را روی ویفر روکش‌دار SU-8 قرار دهید.
سطح چاپ شده ماسک نوری را مستقیماً روی سمت روکش شده با SU-8 ویفر سیلیکونی قرار دهید تا پراکندگی اشعه ماوراء بنفش به حداقل برسد.
ویفر و ماسک نوری پوشش داده شده با SU-8 را به صورت عمودی در معرض نور فرابنفش با شدت 260 میلی ژول بر سانتی متر مربع و به مدت زمان از پیش تعیین شده قرار دهید (به مرحله 10 این کادر مراجعه کنید).
پس از قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش، ویفرهای سیلیکونی پوشش داده شده با SU-8 به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد و به مدت 15 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد روی هر صفحه داغ پخته شدند تا الگوهایی با ارتفاع 200 میکرومتر ساخته شوند. برای ساخت الگوهایی با ارتفاع 500 میکرومتر، زمان پس از پخت در دمای 95 درجه سانتیگراد را به 30 دقیقه افزایش دهید.
محلول ظهور در یک ظرف شیشه‌ای ریخته می‌شود و ویفر پخته شده در ظرف قرار داده می‌شود. حجم محلول ظهور SU-8 ممکن است بسته به اندازه صفحه شیشه‌ای متفاوت باشد. مطمئن شوید که از محلول ظهور SU-8 به اندازه کافی استفاده می‌کنید تا SU-8 که در معرض نور قرار نگرفته است را به طور کامل از بین ببرید. به عنوان مثال، هنگام استفاده از یک ظرف شیشه‌ای با قطر ۱۵۰ میلی‌متر و ظرفیت ۱ لیتر، از حدود ۳۰۰ میلی‌لیتر محلول ظهور SU-8 استفاده کنید. قالب را به مدت ۲۵ دقیقه با چرخش ملایم و گاه به گاه، در قالب قرار دهید.
قالب توسعه‌یافته را با حدود ۱۰ میلی‌لیتر محلول توسعه‌دهنده تازه بشویید و به دنبال آن با استفاده از پیپت، محلول IPA را روی آن اسپری کنید.
ویفر را در یک پاک‌کننده پلاسما قرار دهید و به مدت ۱.۵ دقیقه در معرض پلاسمای اکسیژن (گاز اتمسفری، فشار هدف ۱ × ۱۰−۵ تور، توان ۱۲۵ وات) قرار دهید.
ویفر را در یک دسیکاتور خلاء با یک اسلاید شیشه‌ای در داخل آن قرار دهید. ویفرها و اسلایدها را می‌توان کنار هم قرار داد. اگر دسیکاتور خلاء توسط یک صفحه به چند لایه تقسیم شده است، اسلایدها را در محفظه پایین و ویفرها را در محفظه بالا قرار دهید. 100 میکرولیتر محلول تری کلرو(1H, 1H, 2H, 2H-پرفلوئوروکتیل) سیلان را روی یک اسلاید شیشه‌ای بریزید و برای سیلانیزاسیون خلاء اعمال کنید.
یک ویال از سلول‌های منجمد Caco-2 را در حمام آب 37 درجه سانتیگراد ذوب کنید، سپس سلول‌های ذوب شده را به یک فلاسک T75 حاوی 15 میلی‌لیتر محیط کشت Caco-2 از قبل گرم شده در دمای 37 درجه سانتیگراد منتقل کنید.
برای عبور سلول‌های Caco-2 با تراکم تقریبی ۹۰٪، ابتدا محیط Caco-2، PBS و ۰.۲۵٪ تریپسین/۱ میلی‌مولار EDTA را در حمام آب ۳۷ درجه سانتیگراد گرم کنید.
محیط کشت را با مکش خلاء آسپیره کنید. سلول‌ها را دو بار با 5 میلی‌لیتر PBS گرم با تکرار مکش خلاء و اضافه کردن PBS تازه بشویید.