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A morfogênese do intestino humano estabelece as características de cripta-vilosidade da microarquitetura epitelial 3D e sua organização espacial. Essa estrutura única é necessária para manter a homeostase intestinal, protegendo o nicho de células-tronco na cripta basal de antígenos microbianos exógenos e seus metabólitos. Além disso, as vilosidades intestinais e o muco secretor apresentam células epiteliais funcionalmente diferenciadas com uma barreira protetora na superfície da mucosa intestinal. Portanto, recriar estruturas epiteliais 3D é crucial para a construção de modelos intestinais in vitro. Notavelmente, o intestino em chip, um mimético orgânico, pode induzir a morfogênese 3D espontânea do epitélio intestinal com funções fisiológicas e biomecânica aprimoradas. Aqui, fornecemos um protocolo reprodutível para induzir de forma robusta a morfogênese intestinal em um chip microfluídico, bem como em um chip híbrido Transwell. Descrevemos métodos detalhados para a fabricação do dispositivo, o cultivo de células epiteliais Caco-2 ou organoides intestinais em ambientes convencionais, bem como em uma plataforma microfluídica, e a indução da morfogênese. Morfogênese 3D e caracterização de epitélios 3D estabelecidos usando múltiplas modalidades de imagem. Este protocolo permite a regeneração da microarquitetura intestinal funcional através do controle do fluxo de fluido basolateral por 5 dias. Nosso método de morfogênese in vitro emprega tensão de cisalhamento e movimento mecânico fisiologicamente relevantes e não requer engenharia ou manipulação celular complexas, o que pode apresentar desempenho superior a outras técnicas existentes. Prevemos que o protocolo proposto poderá ter amplas implicações para a comunidade de pesquisa biomédica, fornecendo um método para regenerar camadas epiteliais intestinais 3D in vitro para aplicações biomédicas, clínicas e farmacêuticas.
Experimentos demonstram que células epiteliais intestinais Caco-2 cultivadas em dispositivos microfluídicos do tipo intestino-em-um-chip1,2,3,4,5 ou bicamada6,7 podem sofrer morfogênese 3D espontânea in vitro, sem que o mecanismo subjacente seja totalmente compreendido. Em nosso estudo recente, descobrimos que a remoção de antagonistas de morfógenos secretados basolateralmente dos dispositivos de cultura é necessária e suficiente para induzir a morfogênese epitelial 3D in vitro, o que foi demonstrado por células Caco-2 e organoides intestinais derivados de pacientes. As células epiteliais foram validadas. Neste estudo, focamos especificamente na produção celular e na distribuição da concentração de um potente antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), em um sistema intestino-em-um-chip e em dispositivos microfluídicos modificados contendo insertos Transwell, denominados "Chip Híbrido". Demonstramos que a adição de antagonistas exógenos de Wnt (como DKK-1, repressor de Wnt 1, proteína 1 relacionada à frizzled secretada ou Soggy-1) ao intestino no chip inibe a morfogênese ou interrompe a camada epitelial 3D pré-estruturada, sugerindo que o estresse antagônico durante o cultivo é responsável pela morfogênese intestinal in vitro. Portanto, uma abordagem prática para alcançar uma morfogênese robusta na interface epitelial é remover ou manter minimamente os níveis de antagonistas de Wnt no compartimento basolateral por meio de lavagem ativa (por exemplo, em plataformas intestino-em-um-chip ou híbrido-em-um-chip) ou difusão. O meio basolateral (por exemplo, dos insertos Transwell para grandes compartimentos basolaterais) reservatórios em poços).
Neste protocolo, fornecemos um método detalhado para fabricar microdispositivos de intestino em chip e chips híbridos inseríveis em Transwell (etapas 1 a 5) para cultivar células epiteliais intestinais em membranas porosas à base de polidimetilsiloxano (PDMS) (etapas 6A, 7A, 8 e 9) ou membranas de poliéster de insertos Transwell (etapas 6B, 7B, 8 e 9) e induzir morfogênese 3D in vitro (etapa 10). Também identificamos características celulares e moleculares indicativas de histogênese tecido-específica e diferenciação celular dependente de linhagem, aplicando múltiplas modalidades de imagem (etapas 11 a 24). Induzimos a morfogênese usando células epiteliais intestinais humanas, como Caco-2 ou organoides intestinais, em dois formatos de cultura, com detalhes técnicos que incluem modificação da superfície de membranas porosas, criação de monocamadas 2D e reprodução do microambiente bioquímico e biomecânico intestinal in vitro. Para estudar a morfogênese a partir de monocamadas epiteliais 2D, removemos os antagonistas de morfógenos em ambas as formas cultivadas, fazendo fluir o meio para o compartimento basolateral da cultura. Finalmente, apresentamos uma representação da utilidade de uma camada epitelial 3D regenerável que pode ser usada para modelar o crescimento epitelial dependente de morfógenos, coculturas longitudinais hospedeiro-microbioma, infecção por patógenos, lesão inflamatória, disfunção da barreira epitelial e terapias baseadas em probióticos.
Nosso protocolo pode ser útil para uma ampla gama de cientistas em pesquisa básica (por exemplo, biologia da mucosa intestinal, biologia de células-tronco e biologia do desenvolvimento) e aplicada (por exemplo, testes pré-clínicos de medicamentos, modelagem de doenças, engenharia de tecidos e gastroenterologia), com amplo impacto. Devido à reprodutibilidade e robustez do nosso protocolo para induzir a morfogênese 3D do epitélio intestinal in vitro, prevemos que nossa estratégia técnica possa ser disseminada para públicos que estudam a dinâmica da sinalização celular durante o desenvolvimento, regeneração ou homeostase intestinal. Além disso, nosso protocolo é útil para investigar infecções por diversos agentes infecciosos, como Norovírus 8, Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ou Vibrio cholerae. O estudo da patologia e patogênese de doenças também é útil. O uso de um sistema de microfisiologia intestinal em chip pode permitir o cocultivo longitudinal¹⁰ e a subsequente avaliação da defesa do hospedeiro, das respostas imunes e do reparo de lesões relacionadas a patógenos no trato gastrointestinal (GI)¹¹. Outros distúrbios gastrointestinais associados à síndrome do intestino permeável, doença celíaca, doença de Crohn, colite ulcerativa, pouchite ou síndrome do intestino irritável podem ser simulados quando camadas epiteliais intestinais 3D são preparadas usando as camadas epiteliais intestinais 3D do paciente. Essas doenças incluem atrofia vilositária, encurtamento das criptas, danos à mucosa ou comprometimento da barreira epitelial. Organoides intestinais derivados de biópsia ou células-tronco^12,13. Para melhor modelar a maior complexidade do ambiente da doença, os leitores podem considerar a adição de tipos celulares relevantes para a doença, como células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) do paciente, a modelos contendo microarquiteturas 3D de vilosidades e criptas intestinais. células imunes específicas do tecido,⁵.
Como a microestrutura epitelial 3D pode ser fixada e visualizada sem o processo de seccionamento, pesquisadores que trabalham com transcriptômica espacial e imagens de alta ou super-resolução podem se interessar pelo nosso mapeamento da dinâmica espaço-temporal de genes e proteínas em nichos epiteliais. Além disso, a comunicação longitudinal entre hospedeiro e microbioma, que coordena a homeostase intestinal, pode ser estabelecida na camada mucosa intestinal 3D por meio do cultivo conjunto de diversas espécies microbianas, comunidades microbianas ou microbiota fecal, especialmente no intestino-em-um-chip. na plataforma. Essa abordagem é particularmente atraente para públicos que estudam imunologia da mucosa, gastroenterologia, microbioma humano, culturomia e microbiologia clínica, buscando cultivar microbiota intestinal previamente não cultivada em laboratório. Se nosso protocolo de morfogênese in vitro puder ser adaptado a formatos de cultura escaláveis, como insertos de múltiplos poços em placas de 24, 96 ou 384 poços que reabastecem continuamente os compartimentos basolaterais, o protocolo também poderá ser disseminado para aqueles que desenvolvem plataformas farmacêuticas, biomédicas ou de triagem ou validação de alto rendimento para a indústria alimentícia. Como prova de princípio, demonstramos recentemente a viabilidade de um sistema multiplex de morfogênese de alto rendimento escalável para um formato de placa de 24 poços. Além disso, vários produtos de órgãos em chip foram comercializados16,17,18. Portanto, a validação de nosso método de morfogênese in vitro pode ser acelerada e potencialmente adotada por muitos laboratórios de pesquisa, indústria ou agências governamentais e regulatórias para entender a reprogramação celular do intestino in vitro. A morfogênese em nível transcriptômico foi utilizada para testar fármacos ou biofármacos. A absorção e o transporte de candidatos a fármacos foram avaliados utilizando modelos intestinais tridimensionais ou modelos de órgãos em chip personalizados ou comerciais, a fim de avaliar a reprodutibilidade do processo de morfogênese intestinal.
Um número limitado de modelos experimentais relevantes para humanos tem sido usado para estudar a morfogênese do epitélio intestinal, principalmente devido à falta de protocolos implementáveis ​​para induzir a morfogênese 3D in vitro. De fato, grande parte do conhecimento atual sobre a morfogênese intestinal é baseado em estudos com animais (por exemplo, peixe-zebra20, camundongos21 ou galinhas22). No entanto, esses estudos são trabalhosos e dispendiosos, podem ser eticamente questionáveis ​​e, mais importante, não determinam com precisão os processos de desenvolvimento humano. Esses modelos também são muito limitados em sua capacidade de serem testados de maneira escalável e multidirecional. Portanto, nosso protocolo para regenerar estruturas de tecido 3D in vitro supera os modelos animais in vivo, bem como outros modelos tradicionais de cultura de células 2D estáticas. Como descrito anteriormente, a utilização de estruturas epiteliais 3D nos permitiu examinar a localização espacial de células diferenciadas no eixo cripta-vilosidade em resposta a vários estímulos mucosos ou imunológicos. Camadas epiteliais 3D podem fornecer um espaço para estudar como as células microbianas competem para formar nichos espaciais e a evolução ecológica em A resposta a fatores do hospedeiro (por exemplo, camadas de muco internas versus externas, secreção de IgA e peptídeos antimicrobianos) é um fator importante. Além disso, a morfologia epitelial tridimensional permite compreender como a microbiota intestinal estrutura suas comunidades e produz sinergicamente metabólitos microbianos (por exemplo, ácidos graxos de cadeia curta) que moldam a organização celular e os nichos de células-tronco nas criptas basais. Essas características só podem ser demonstradas quando camadas epiteliais tridimensionais são estabelecidas in vitro.
Além do nosso método de criação de estruturas epiteliais intestinais 3D, existem diversos métodos in vitro. O cultivo de organoides intestinais é uma técnica de engenharia de tecidos de última geração, baseada no cultivo de células-tronco intestinais sob condições específicas de morfógenos23,24,25. No entanto, o uso de modelos de organoides 3D para análise de transporte ou coculturas hospedeiro-microbioma é frequentemente desafiador, pois o lúmen intestinal está contido dentro do organoide e, portanto, a introdução de componentes luminais, como células microbianas ou antígenos exógenos, é limitada. O acesso ao lúmen do organoide pode ser melhorado com o uso de um microinjetor26,27, mas esse método é invasivo, trabalhoso e requer conhecimento especializado para sua execução. Além disso, os cultivos tradicionais de organoides mantidos em suportes de hidrogel sob condições estáticas não refletem com precisão a biomecânica in vivo ativa.
Outras abordagens empregadas por diversos grupos de pesquisa utilizam estruturas de hidrogel 3D pré-fabricadas para mimetizar a estrutura do epitélio intestinal, cultivando células intestinais humanas isoladas na superfície do gel. Essas estruturas de hidrogel são fabricadas utilizando moldes impressos em 3D, micromecanizados ou fabricados por litografia. Este método demonstra o arranjo auto-organizado de células epiteliais isoladas in vitro com gradientes de morfógenos fisiologicamente relevantes, estabelecendo uma estrutura epitelial de alta relação de aspecto e comunicação entre estroma e epitélio pela inclusão de células estromais na estrutura. No entanto, a natureza das estruturas pré-fabricadas pode impedir a manifestação do próprio processo morfogenético espontâneo. Esses modelos também não fornecem fluxo luminal ou intersticial dinâmico, carecendo da tensão de cisalhamento do fluido necessária para que as células intestinais sofram morfogênese e adquiram função fisiológica. Outro estudo recente utilizou estruturas de hidrogel em uma plataforma microfluídica e padronizou estruturas epiteliais intestinais utilizando técnicas de gravação a laser. Organoides intestinais de camundongos seguem os padrões gravados para formar o intestino. Estruturas tubulares e fluxo de fluido intraluminal podem ser reproduzidos usando um módulo de microfluídica. No entanto, esse modelo não exibe processos morfogenéticos espontâneos nem inclui movimentos mecanobiológicos intestinais. Técnicas de impressão 3D do mesmo grupo conseguiram criar tubos intestinais em miniatura com processos morfogenéticos espontâneos. Apesar da complexa fabricação de diferentes segmentos intestinais dentro do tubo, esse modelo também carece de fluxo de fluido luminal e deformação mecânica. Além disso, a operabilidade do modelo pode ser limitada, especialmente após a conclusão do processo de bioimpressão, perturbando as condições experimentais ou as interações célula-célula. Em vez disso, nosso protocolo proposto fornece morfogênese intestinal espontânea, tensão de cisalhamento fisiologicamente relevante, biomecânica que mimetiza a motilidade intestinal, acessibilidade a compartimentos apicais e basolaterais independentes e recriação de microambientes biológicos complexos de modularidade. Portanto, nosso protocolo de morfogênese 3D in vitro pode fornecer uma abordagem complementar para superar os desafios dos métodos existentes.
Nosso protocolo é inteiramente focado na morfogênese epitelial 3D, com apenas células epiteliais em cultura e nenhum outro tipo de célula circundante, como células mesenquimais, células endoteliais e células imunes. Como descrito anteriormente, o núcleo do nosso protocolo é a indução da morfogênese epitelial pela remoção de inibidores de morfógenos secretados no lado basolateral do meio introduzido. Embora a robusta modularidade do nosso intestino-em-um-chip e híbrido-em-um-chip nos permita recriar a camada epitelial 3D ondulante, complexidades biológicas adicionais, como interações epitélio-mesenquimais33,34, deposição de matriz extracelular (MEC)35 e, em nosso modelo, características de cripta-vilosidade que transmitem nichos de células-tronco nas criptas basais, ainda precisam ser consideradas. Células estromais (por exemplo, fibroblastos) no mesênquima desempenham um papel fundamental na produção de proteínas da MEC e na regulação da morfogênese intestinal in vivo35,37,38. A adição de A inclusão de células mesenquimais em nosso modelo aprimorou o processo morfogenético e a eficiência de adesão celular. A camada endotelial (ou seja, capilares ou vasos linfáticos) desempenha um papel importante na regulação do transporte molecular39 e no recrutamento de células imunes40 no microambiente intestinal. Além disso, componentes vasculares que podem ser conectados entre modelos de tecido são um pré-requisito quando esses modelos são projetados para demonstrar interações multiorgânicas. Portanto, a inclusão de células endoteliais pode ser necessária para modelar características fisiológicas mais precisas com resolução em nível de órgão. Células imunes derivadas de pacientes também são essenciais para exibir respostas imunes inatas, apresentação de antígenos, interação entre imunidade inata e adaptativa e imunidade tecido-específica no contexto da simulação de doenças intestinais.
O uso de chips híbridos é mais simples do que o de intestino-em-um-chip, pois a configuração do dispositivo é mais fácil e o uso de insertos Transwell permite o cultivo escalável do epitélio intestinal. No entanto, os insertos Transwell disponíveis comercialmente com membranas de poliéster não são elásticos e não conseguem simular movimentos peristálticos. Além disso, o compartimento apical do inserto Transwell colocado no chip híbrido permaneceu estacionário, sem tensão de cisalhamento na região apical. Claramente, as propriedades estáticas do compartimento apical raramente permitem o co-cultivo bacteriano a longo prazo em chips híbridos. Embora possamos induzir de forma robusta a morfogênese 3D em insertos Transwell ao usar chips híbridos, a falta de biomecânica fisiologicamente relevante e de fluxo de fluido apical pode limitar a viabilidade das plataformas de chips híbridos para aplicações potenciais.
Reconstruções em escala real do eixo cripta-vilosidade humana em culturas de intestino-em-um-chip e híbrido-em-um-chip ainda não foram totalmente estabelecidas. Como a morfogênese começa a partir de uma monocamada epitelial, as microarquiteturas 3D não necessariamente fornecem similaridade morfológica às criptas in vivo. Embora tenhamos caracterizado a população de células proliferantes próxima ao domínio basal da cripta no epitélio 3D microengenheirado, as regiões da cripta e da vilosidade não foram claramente demarcadas. Embora canais superiores mais altos no chip levem a um aumento na altura do epitélio microengenheirado, a altura máxima ainda é limitada a ~300–400 µm. A profundidade real das criptas intestinais humanas no intestino delgado e grosso é de ~135 µm e ~400 µm, respectivamente, e a altura das vilosidades do intestino delgado é de ~600 µm41.
Do ponto de vista da imagem, a obtenção de imagens de super-resolução in situ de microarquiteturas 3D pode ser limitada ao intestino em chip, visto que a distância de trabalho necessária entre a lente objetiva e a camada epitelial é da ordem de alguns milímetros. Para superar esse problema, pode ser necessária uma objetiva de longo alcance. Além disso, a preparação de cortes finos para obtenção de imagens é desafiadora devido à alta elasticidade do PDMS. Ademais, como a microfabricação camada por camada do intestino em chip envolve adesão permanente entre cada camada, é extremamente difícil abrir ou remover a camada superior para examinar a estrutura da superfície da camada epitelial, por exemplo, utilizando um microscópio eletrônico de varredura (MEV).
A hidrofobicidade do PDMS tem sido um fator limitante em estudos microfluídicos que lidam com pequenas moléculas hidrofóbicas, uma vez que o PDMS pode adsorver essas moléculas de forma não específica. Alternativas ao PDMS podem ser consideradas com outros materiais poliméricos. Alternativamente, a modificação da superfície do PDMS (por exemplo, revestimento com materiais lipofílicos 42 ou poli(etileno glicol) 43) pode ser considerada para minimizar a adsorção de moléculas hidrofóbicas.
Por fim, nosso método não foi bem caracterizado em termos de fornecer uma triagem de alto rendimento ou uma plataforma experimental amigável e universal. O protocolo atual requer uma bomba de seringa por microdispositivo, o que ocupa espaço em uma incubadora de CO2 e impede experimentos em larga escala. Essa limitação pode ser significativamente atenuada pela escalabilidade de formatos de cultura inovadores (por exemplo, insertos porosos de 24, 96 ou 384 poços que permitem a reposição e remoção contínuas do meio basolateral).
Para induzir a morfogênese 3D do epitélio intestinal humano in vitro, utilizamos um dispositivo intestinal em chip microfluídico contendo dois microcanais paralelos e uma membrana porosa elástica entre eles para criar uma interface lúmen-capilar. Também demonstramos o uso de um dispositivo microfluídico de canal único (um chip híbrido) que fornece fluxo basolateral contínuo sob camadas epiteliais polarizadas cultivadas em insertos Transwell. Em ambas as plataformas, a morfogênese de várias células epiteliais intestinais humanas pode ser demonstrada aplicando-se manipulação direcional do fluxo para remover antagonistas de morfógenos do compartimento basolateral. O procedimento experimental completo (Figura 1) consiste em cinco partes: (i) microfabricação do chip intestinal ou do chip híbrido inserível em Transwell (etapas 1-5; Quadro 1), (ii) preparação de células epiteliais intestinais (células Caco-2) ou organoides intestinais humanos; caixas 2-5), (iii) cultura de células epiteliais intestinais em chips intestinais ou chips híbridos (etapas 6-9), (iv) indução de morfogênese 3D in vitro (etapa 10) e (v) caracterização da microestrutura epitelial 3D (etapas 11-24). Finalmente, um grupo de controle apropriado (discutido mais adiante) foi projetado para validar a eficácia da morfogênese in vitro, comparando a morfogênese epitelial com controles espaciais, temporais, condicionais ou procedimentais.
Utilizamos duas plataformas de cultura diferentes: intestino-em-um-chip com canais retos ou canais convolutos não lineares, ou chips híbridos contendo insertos Transwell (TW) em um dispositivo microfluídico, fabricados conforme descrito no Quadro 1 e nas etapas 1 a 5. "Fabricação do Dispositivo" mostra as principais etapas na fabricação de um chip único ou de um chip híbrido. "Cultivo de Células Epiteliais Intestinais Humanas" explica a fonte celular (Caco-2 ou organoides intestinais humanos) e o procedimento de cultura utilizado neste protocolo. "Morfogênese in vitro" mostra as etapas gerais em que células epiteliais derivadas de Caco-2 ou organoides são cultivadas em um chip intestinal ou em insertos Transwell de um chip híbrido, seguidas pela indução da morfogênese 3D e a formação de uma estrutura epitelial caracterizada. O número da etapa ou do quadro do programa é exibido abaixo de cada seta. A aplicação fornece exemplos de como camadas epiteliais intestinais estabelecidas podem ser utilizadas, por exemplo, na caracterização da diferenciação celular, em estudos de fisiologia intestinal, no estabelecimento de ecossistemas hospedeiro-microbioma e em doenças. Modelagem. Imagens de imunofluorescência em “Diferenciação Celular” mostrando núcleos, F-actina e MUC2 expressos na camada epitelial 3D de Caco-2 gerada no chip intestinal. A sinalização de MUC2 está presente em células caliciformes e no muco secretado pelas superfícies mucosas. Imagens fluorescentes em “Fisiologia Intestinal” mostram o muco produzido pela coloração para resíduos de ácido siálico e N-acetilglicosamina usando aglutinina fluorescente de gérmen de trigo. As duas imagens sobrepostas em “Co-culturas Hospedeiro-Micróbio” mostram co-culturas representativas de hospedeiro-microbioma no intestino em um chip. O painel esquerdo mostra a co-cultura de E. coli expressando proteína fluorescente verde (GFP) com células epiteliais 3D de Caco-2 microengenheiradas. O painel direito mostra a localização de E. coli GFP co-cultivada com células epiteliais 3D de Caco-2, seguida por coloração de imunofluorescência com F-actina (vermelho) e núcleos (azul). Doença A modelagem ilustra o intestino saudável versus o intestino permeável em chips de inflamação intestinal sob desafio fisiológico com antígenos bacterianos (por exemplo, lipopolissacarídeo, LPS) e células imunes (por exemplo, PBMC; verde). Células Caco-2 foram cultivadas para estabelecer uma camada epitelial 3D. Barra de escala, 50 µm. Imagens na linha inferior: “Diferenciação de células” adaptada com permissão da referência 2. Oxford University Press; Reproduzida com permissão da Ref. 5. NAS; “Co-cultura hospedeiro-micróbio” adaptada com permissão da Ref. 3. NAS; “Modelagem de doenças” adaptada com permissão da referência 5. NAS.
Tanto os chips de intestino em chip quanto os chips híbridos foram fabricados usando réplicas de PDMS desmoldadas de moldes de silício por litografia suave1,44 e padronizadas com SU-8. O design dos microcanais em cada chip é determinado considerando a hidrodinâmica, como tensão de cisalhamento e pressão hidrodinâmica1,4,12. O design original do intestino em chip (Figura Suplementar 1a), que consistia em dois microcanais retos paralelos justapostos, evoluiu para um intestino em chip complexo (Figura Suplementar 1b) que inclui um par de microcanais curvos para induzir maior tempo de residência do fluido, padrões de fluxo não lineares e deformação multiaxial de células cultivadas (Figura 2a–f)12. Quando é necessário recriar uma biomecânica intestinal mais complexa, podem ser escolhidos intestinos em chip complexos. Demonstramos que o Gut-Chip convoluto também induz fortemente a morfogênese 3D em um período de tempo semelhante, com um grau similar de epitelização. O crescimento foi comparado ao do Gut-Chip original, independentemente do tipo de célula cultivada. Portanto, para induzir a morfogênese 3D, designs lineares e complexos de intestino em chip são intercambiáveis. Réplicas de PDMS curadas em moldes de silício com padrões de SU-8 forneceram características negativas após a desmoldagem (Fig. 2a). Para fabricar o intestino em um chip, a camada superior de PDMS preparada foi sequencialmente ligada a um filme poroso de PDMS e, em seguida, alinhada com a camada inferior de PDMS por ligação irreversível usando um tratamento corona (Fig. 2b–f). Para fabricar chips híbridos, réplicas de PDMS curadas foram ligadas a lâminas de vidro para criar dispositivos microfluídicos de canal único que pudessem acomodar insertos Transwell (Fig. 2h e Fig. 2 dos Dados Estendidos). O processo de ligação é realizado tratando as superfícies da réplica de PDMS e do vidro com plasma de oxigênio ou tratamento corona. Após a esterilização do dispositivo microfabricado acoplado ao tubo de silicone, a configuração do dispositivo estava pronta para realizar a morfogênese 3D do epitélio intestinal. (Figura 2g).
a, Ilustração esquemática da preparação de peças de PDMS a partir de moldes de silício com padrão SU-8. A solução de PDMS não curada foi vertida sobre um molde de silício (esquerda), curada a 60 °C (centro) e desmoldada (direita). O PDMS desmoldado foi cortado em pedaços e limpo para uso posterior. b, Fotografia do molde de silício usado para preparar a camada superior de PDMS. c, Fotografia do molde de silício usado para fabricar a membrana porosa de PDMS. d, Série de fotografias dos componentes de PDMS superior e inferior e do dispositivo intestinal em chip montado. e, Esquema do alinhamento dos componentes de PDMS superior, membrana e inferior. Cada camada é unida irreversivelmente por tratamento com plasma ou corona. f, Esquema do dispositivo intestino-em-um-chip fabricado com microcanais convolutos sobrepostos e câmaras de vácuo. g, Configuração do intestino-em-um-chip para cultura celular microfluídica. O intestino-em-um-chip fabricado, montado com um tubo de silicone e uma seringa, foi colocado sobre uma lamínula. O chip O dispositivo foi colocado na tampa de uma placa de Petri de 150 mm para processamento. O aglutinante é usado para fechar o tubo de silicone. h, Imagens da fabricação do chip híbrido e da morfogênese 3D usando chips híbridos. Inserções Transwell preparadas independentemente para cultivar monocamadas 2D de células epiteliais intestinais foram inseridas no chip híbrido para induzir a morfogênese intestinal 3D. O meio é perfundido através de microcanais sob a camada celular estabelecida na inserção Transwell. Barra de escala, 1 cm. h Reproduzido com permissão da referência 4. Elsevier.
Neste protocolo, a linhagem celular Caco-2 e organoides intestinais foram utilizados como fontes epiteliais (Fig. 3a). Ambos os tipos de células foram cultivados independentemente (Quadro 2 e Quadro 5) e utilizados para semear os microcanais revestidos com matriz extracelular (MEC) do intestino em chip ou insertos Transwell. Quando as células atingem a confluência (>95% de cobertura nos frascos), as células Caco-2 cultivadas rotineiramente (entre as passagens 10 e 50) em frascos T são coletadas para preparar suspensões de células dissociadas por meio de tripsinização (Quadro 2). Organoides intestinais humanos, obtidos por biópsias intestinais ou ressecções cirúrgicas, foram cultivados em domos de Matrigel em placas de 24 poços para suportar o microambiente estrutural. O meio contendo morfógenos essenciais (como Wnt, R-spondina e Noggin) e fatores de crescimento, preparado conforme descrito no Quadro 3, foi suplementado a cada dois dias até que os organoides atingissem ~500 µm de diâmetro. diâmetro. Organoides totalmente desenvolvidos são colhidos e dissociados em células individuais para semeadura em inserções intestinais ou Transwell em um chip (Quadro 5). Como relatamos anteriormente, eles podem ser diferenciados de acordo com o tipo de doença12,13 (por exemplo, colite ulcerativa, doença de Crohn, câncer colorretal ou doador normal), local da lesão (por exemplo, área lesionada versus área não lesionada) e localização gastrointestinal no trato (por exemplo, duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon ou reto). Fornecemos um protocolo otimizado no Quadro 5 para o cultivo de organoides colônicos (colóides) que normalmente requerem concentrações mais altas de morfógenos do que organoides do intestino delgado.
a) Fluxograma para a indução da morfogênese intestinal no chip intestinal. Epitélio intestinal humano Caco-2 e organoides intestinais são usados ​​neste protocolo para demonstrar a morfogênese 3D. As células epiteliais isoladas foram semeadas no dispositivo intestino-em-um-chip preparado (preparação do chip). Uma vez que as células são semeadas (semeadas) e fixadas (fixadas) à membrana porosa de PDMS no dia 0 (D0), o fluxo apical (AP) é iniciado e mantido durante os primeiros 2 dias (fluxo, AP, D0-D2). O fluxo basolateral (BL) também é iniciado juntamente com movimentos de estiramento cíclicos (estiramento, fluxo, AP e BL) quando uma monocamada 2D completa é formada. A morfogênese intestinal 3D ocorreu espontaneamente após 5 dias de cultura microfluídica (morfogênese, D5). Imagens de contraste de fase mostram a morfologia representativa das células Caco-2 em cada etapa experimental ou ponto de tempo (gráfico de barras, 100 µm). Quatro diagramas esquemáticos. a) Ilustração das cascatas correspondentes da morfogênese intestinal (canto superior direito). As setas tracejadas no esquema representam a direção do fluxo de fluido. b) Imagem de MEV mostrando a topologia da superfície do epitélio Caco-2 3D estabelecido (esquerda). O detalhe destacando a área ampliada (caixa tracejada branca) mostra as microvilosidades regeneradas na camada Caco-2 3D (direita). c) Vista frontal horizontal do Caco-2 3D estabelecido, claudina (ZO-1, vermelho) e membranas contínuas da borda em escova marcadas com F-actina (verde) e núcleos (azul). Visualização confocal por imunofluorescência de células epiteliais em chips intestinais. As setas apontando para o esquema central indicam a localização do plano focal para cada visualização confocal. d) Curso temporal das alterações morfológicas em organoides cultivados em um chip, obtido por microscopia de contraste de fase nos dias 3, 7, 9, 11 e 13. O detalhe (canto superior direito) mostra a alta magnificação da imagem fornecida. e, Fotomicrografia DIC do epitélio 3D de organoide estabelecido no intestino em uma fatia obtida no dia 7. f, Imagens de imunofluorescência sobrepostas mostrando marcadores para células-tronco (LGR5; magenta), células caliciformes (MUC2; verde), F-actina (cinza) e núcleos (ciano) cultivados em chips intestinais por 3 dias, respectivamente (esquerda) e organoides de 13 dias (centro) na camada epitelial. Veja também a Figura Suplementar 3, que destaca a sinalização de LGR5 sem a sinalização de MUC2. Imagens de fluorescência mostrando a microestrutura epitelial (direita) do epitélio 3D de organoide estabelecido no intestino em um chip por meio da coloração da membrana plasmática com o corante CellMask (direita) no dia 13 de cultura. A barra de escala é de 50 μm, salvo indicação em contrário. b Reproduzido com permissão da referência 2. Oxford University Press; c Adaptado com permissão da referência 2. Oxford University Press; e e f adaptados com permissão por referência.12 Sob licença Creative Commons CC BY 4.0.
No sistema "intestino em chip", é necessário modificar a superfície hidrofóbica da membrana porosa de PDMS para um revestimento bem-sucedido da matriz extracelular (MEC). Neste protocolo, aplicamos dois métodos diferentes para modificar a hidrofobicidade das membranas de PDMS. Para o cultivo de células Caco-2, a ativação da superfície por tratamento com UV/ozônio foi suficiente para reduzir a hidrofobicidade da superfície do PDMS, revestir a MEC e permitir a adesão das células Caco-2 à membrana de PDMS. No entanto, o cultivo microfluídico de epitélio organoide requer funcionalização química da superfície para alcançar a deposição eficiente de proteínas da MEC, aplicando sequencialmente polietilenimina (PEI) e glutaraldeído aos microcanais de PDMS. Após a modificação da superfície, as proteínas da MEC foram depositadas para cobrir a superfície funcionalizada do PDMS e, em seguida, introduzidas no epitélio organoide isolado. Após a adesão das células, o cultivo celular microfluídico inicia-se com a perfusão apenas do meio no microcanal superior até que as células formem uma monocamada completa, enquanto o microcanal inferior mantém condições estáticas. Este método otimizado para ativação da superfície O revestimento com matriz extracelular (ECM) permite a fixação do epitélio organoide para induzir a morfogênese 3D na superfície do PDMS.
As culturas Transwell também requerem revestimento com matriz extracelular (MEC) antes do semeio celular; no entanto, não necessitam de etapas complexas de pré-tratamento para ativar a superfície dos insertos porosos. Para o cultivo de células Caco-2 em insertos Transwell, o revestimento com MEC nos insertos porosos acelera a adesão de células Caco-2 dissociadas (<1 hora) e a formação da barreira de junções estreitas (<1-2 dias). Para o cultivo de organoides em insertos Transwell, os organoides isolados são semeados em insertos revestidos com MEC, aderidos à superfície da membrana (<3 horas) e mantidos até que formem uma monocamada completa com integridade da barreira. As culturas Transwell são realizadas em placas de 24 poços sem o uso de chips híbridos.
A morfogênese 3D in vitro pode ser iniciada pela aplicação de fluxo de fluido na face basolateral de uma camada epitelial estabelecida. No intestino em chip, a morfogênese epitelial começou quando o meio foi perfundido nos microcanais superior e inferior (Fig. 3a). Como descrito anteriormente, é crucial introduzir fluxo de fluido no compartimento inferior (basolateral) para a remoção contínua de inibidores de morfógenos secretados direcionais. Para fornecer nutrientes e soro suficientes às células ligadas às membranas porosas e gerar tensão de cisalhamento luminal, geralmente aplicamos fluxo duplo no intestino em chip. Em chips híbridos, insertos Transwell contendo monocamadas epiteliais foram inseridos nos chips híbridos. Em seguida, o meio foi aplicado sob a face basolateral do inserto Transwell poroso através do microcanal. A morfogênese intestinal ocorreu de 3 a 5 dias após o início do fluxo basolateral em ambas as plataformas de cultura.
As características morfológicas das camadas epiteliais 3D microfabricadas podem ser analisadas aplicando-se diversas modalidades de imagem, incluindo microscopia de contraste de fase, microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC), microscopia eletrônica de varredura (MEV) ou microscopia confocal de imunofluorescência (Figuras 3 e 4). A imagem por contraste de fase ou DIC pode ser facilmente realizada a qualquer momento durante o cultivo para monitorar a forma e a protrusão das camadas epiteliais 3D. Devido à transparência óptica dos filmes de PDMS e poliéster, tanto a plataforma intestino-em-um-chip quanto a plataforma de chip híbrido podem fornecer imagens in situ em tempo real sem a necessidade de seccionamento ou desmontagem do dispositivo. Ao realizar imagens de imunofluorescência (Figuras 1, 3c, f e 4b, c), as células são tipicamente fixadas com 4% (p/v) de paraformaldeído (PFA), seguido por Triton X-100 e 2% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA), nessa ordem. Dependendo do tipo celular, diferentes Podem ser utilizados fixadores, permeabilizantes e agentes bloqueadores. Anticorpos primários direcionados a marcadores celulares ou regionais dependentes da linhagem são usados ​​para destacar as células imobilizadas in situ no chip, seguidos por anticorpos secundários juntamente com um corante de contracoloração direcionado ao núcleo (por exemplo, 4′,6-diamidino-2-fenileno indol, DAPI) ou à actina F (por exemplo, faloidina marcada fluorescentemente). Imagens de células vivas baseadas em fluorescência também podem ser realizadas in situ para detectar a produção de muco (Fig. 1, “Diferenciação celular” e “Fisiologia intestinal”), a colonização aleatória de células microbianas (Fig. 1, “Cocultura hospedeiro-micróbio”), o recrutamento de células imunes (Fig. 1, “Modelagem de doenças”) ou os contornos da morfologia epitelial 3D (Fig. 3c,f e 4b,c). Ao modificar o intestino no chip para separar a camada superior da camada inferior do microcanal, conforme descrito na ref. Como mostrado em Na Figura 2, a morfologia epitelial 3D, bem como as microvilosidades na borda em escova apical, podem ser visualizadas por MEV (Figura 3b). A expressão de marcadores de diferenciação pode ser avaliada por meio de PCR quantitativo5 ou sequenciamento de RNA de célula única. Nesse caso, camadas 3D de células epiteliais cultivadas em chips intestinais ou chips híbridos são coletadas por tripsinização e, em seguida, utilizadas para análise molecular ou genética.
a) Fluxograma para a indução da morfogênese intestinal em um chip híbrido. Células Caco-2 e organoides intestinais são utilizadas neste protocolo para demonstrar a morfogênese 3D em uma plataforma de chip híbrido. Células epiteliais dissociadas foram semeadas em insertos Transwell preparados (preparação TW; veja a figura abaixo). Após o semeio e a adesão das células às membranas de poliéster nos insertos Transwell, todas as células foram cultivadas em condições estáticas (cultura TW). Após 7 dias, um único inserto Transwell contendo uma monocamada 2D de células epiteliais foi integrado a um chip híbrido para introduzir um fluxo basolateral (Fluxo, BL), o que levou à geração de uma camada epitelial 3D (morfogênese). Micrografias de contraste de fase mostrando características morfológicas de células epiteliais de órgãos humanos derivadas do cólon ascendente de um doador normal (linhagem C103) em cada etapa experimental ou ponto de tempo. Os esquemas nas camadas superiores ilustram a configuração experimental para cada etapa. b) Chips híbridos (esquema à esquerda) podem levar à morfogênese 3D de Células epiteliais organoides com vistas de microscopia confocal de cima para baixo, obtidas em diferentes posições Z (superior, intermediária e inferior; veja o esquema à direita e as linhas pontilhadas correspondentes), mostraram características morfológicas óbvias. F-actina (ciano), núcleo (cinza). c, Micrografias de fluorescência confocal (vista angulada 3D) de células epiteliais derivadas de organoides cultivadas em Transwell estático (TW; detalhe dentro da caixa tracejada branca) versus chip híbrido (maior imagem completa) comparando a morfologia 2D versus 3D, respectivamente. Um par de vistas de corte transversal vertical 2D (detalhe no canto superior direito; “XZ”) também mostra características 2D e 3D. Barra de escala, 100 µm. c Reproduzido com permissão da referência 4. Elsevier.
Os controles podem ser preparados cultivando as mesmas células (Caco-2 ou células epiteliais de organoides intestinais) em monocamadas bidimensionais sob condições convencionais de cultura estática. Notavelmente, pode ocorrer depleção de nutrientes devido à capacidade volumétrica limitada dos microcanais (ou seja, ~4 µL no canal superior do projeto original do chip intestinal). Portanto, a morfologia epitelial antes e depois da aplicação do fluxo basolateral também pode ser comparada.
O processo de litografia suave deve ser realizado em uma sala limpa. Para cada camada no chip (camadas superior e inferior e membranas) e nos chips híbridos, diferentes fotomáscaras foram utilizadas e fabricadas em wafers de silício separados, pois as alturas dos microcanais eram diferentes. As alturas alvo dos microcanais superior e inferior do chip são de 500 µm e 200 µm, respectivamente. A altura alvo do canal no chip híbrido é de 200 µm.
Coloque uma lâmina de silício de 7,6 cm (3 polegadas) em um recipiente com acetona. Agite suavemente o recipiente por 30 segundos e deixe a lâmina secar ao ar. Transfira a lâmina para um recipiente com álcool isopropílico (IPA) e gire o recipiente por 30 segundos para limpar.
Opcionalmente, pode-se utilizar uma solução de piranha (mistura de peróxido de hidrogênio e ácido sulfúrico concentrado, 1:3 (v/v)) para maximizar a remoção de resíduos orgânicos da superfície da lâmina de silício.
A solução de piranha é extremamente corrosiva e gera calor. Precauções de segurança adicionais são necessárias. Para o descarte de resíduos, deixe a solução esfriar e transfira para um recipiente de lixo limpo e seco. Utilize recipientes secundários e identifique-os adequadamente. Consulte as diretrizes de segurança da instalação para obter procedimentos mais detalhados.
Desidrate os wafers colocando-os em uma placa aquecedora a 200 °C por 10 minutos. Após a desidratação, os wafers foram agitados cinco vezes ao ar livre para esfriar.
Despeje aproximadamente 10 g de fotorresina SU-8 2100 no centro da lâmina de silício limpa. Use uma pinça para espalhar a fotorresina uniformemente sobre a lâmina. Ocasionalmente, coloque a lâmina sobre uma placa aquecida a 65 °C para tornar a fotorresina menos pegajosa e mais fácil de espalhar. Não coloque a lâmina diretamente sobre a placa aquecida.
A camada de SU-8 foi distribuída uniformemente sobre o wafer por meio de revestimento por rotação. Programe uma rotação de entrada do SU-8 por 5 a 10 segundos para que se propague a 500 rpm com uma aceleração de 100 rpm/s. Ajuste a rotação principal para padronização com espessura de 200 µm a 1.500 rpm, ou para obter uma espessura de 250 µm (resultando em uma altura de 500 µm para a camada superior do núcleo no chip; veja "Etapas críticas" abaixo) com uma aceleração de 300 rpm/s por 30 segundos a 1.200 rpm.
A velocidade de rotação principal pode ser ajustada de acordo com a espessura desejada do padrão SU-8 na pastilha de silício.
Para fabricar padrões de SU-8 com 500 µm de altura para a camada superior do intestino no chip, as etapas de revestimento por rotação e pré-cozimento deste procedimento (etapas 7 e 8) foram repetidas sequencialmente (ver etapa 9) para produzir duas camadas de SU-8 com 250 µm de espessura, que podem ser sobrepostas e unidas por exposição UV na etapa 12 deste procedimento, formando uma camada com 500 µm de altura.
Pré-aqueça as lâminas revestidas com SU-8, colocando-as cuidadosamente em uma placa aquecedora a 65 °C por 5 minutos, depois mude a temperatura para 95 °C e deixe em incubação por mais 40 minutos.
Para obter uma altura de 500 μm do padrão SU-8 no microcanal superior, repita os passos 7 e 8 para gerar duas camadas de SU-8 com 250 μm de espessura.
Utilizando o alinhador de máscaras UV, realize um teste de lâmpada de acordo com as instruções do fabricante para calcular o tempo de exposição do wafer. (tempo de exposição, ms) = (dose de exposição, mJ/cm2)/(potência da lâmpada, mW/cm2).
Após determinar o tempo de exposição, coloque a fotomáscara no suporte de máscaras do alinhador de máscaras UV e, em seguida, posicione-a sobre o wafer revestido com SU-8.
Coloque a superfície impressa da fotomáscara diretamente sobre o lado revestido com SU-8 da lâmina de silício para minimizar a dispersão dos raios UV.
Exponha a pastilha revestida com SU-8 e a fotomáscara verticalmente a 260 mJ/cm2 de luz UV durante o tempo de exposição predeterminado (consulte a etapa 10 desta caixa).
Após a exposição à radiação UV, as lâminas de silício revestidas com SU-8 foram aquecidas a 65 °C por 5 minutos e a 95 °C por 15 minutos em cada placa aquecida para fabricar padrões com uma altura de 200 μm. O tempo de pós-aquecimento a 95 °C foi estendido para 30 minutos para fabricar padrões com uma altura de 500 µm.
O revelador é vertido em uma placa de vidro e o wafer assado é colocado na placa. O volume de revelador SU-8 pode variar dependendo do tamanho da placa de vidro. Certifique-se de usar revelador SU-8 suficiente para remover completamente o SU-8 não exposto. Por exemplo, ao usar uma placa de vidro de 150 mm de diâmetro com capacidade para 1 L, use aproximadamente 300 mL de revelador SU-8. Deixe o molde revelar por 25 minutos, com rotações suaves ocasionais.
Enxágue o molde revelado com aproximadamente 10 mL de revelador fresco, seguido de IPA, pulverizando a solução com uma pipeta.
Coloque o wafer em um limpador de plasma e exponha-o ao plasma de oxigênio (gás atmosférico, pressão alvo de 1 × 10−5 Torr, potência de 125 W) por 1,5 min.
Coloque o wafer em um dessecador a vácuo com uma lâmina de vidro dentro. Os wafers e as lâminas podem ser colocados lado a lado. Se o dessecador a vácuo for dividido em várias camadas por uma placa, coloque as lâminas na câmara inferior e os wafers na câmara superior. Aplique 100 μL de solução de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano em uma lâmina de vidro e aplique vácuo para silanização.
Descongele um frasco de células Caco-2 congeladas em banho-maria a 37°C e, em seguida, transfira as células descongeladas para um frasco T75 contendo 15 mL de meio Caco-2 pré-aquecido a 37°C.
Para cultivar células Caco-2 com aproximadamente 90% de confluência, primeiro aqueça o meio Caco-2, PBS e 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA em banho-maria a 37°C.
Aspire o meio por aspiração a vácuo. Lave as células duas vezes com 5 mL de PBS morno, repetindo a aspiração a vácuo e adicionando PBS fresco.