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La morphogenèse intestinale humaine établit les caractéristiques des cryptes et des villosités, ainsi que la microarchitecture épithéliale 3D et son organisation spatiale. Cette structure unique est essentielle au maintien de l'homéostasie intestinale, car elle protège le microenvironnement des cellules souches de la crypte basale contre les antigènes microbiens exogènes et leurs métabolites. De plus, les villosités intestinales et le mucus sécrété présentent des cellules épithéliales fonctionnellement différenciées, formant une barrière protectrice à la surface de la muqueuse intestinale. Par conséquent, la reconstitution de structures épithéliales 3D est cruciale pour la construction de modèles intestinaux in vitro. Notamment, le modèle d'intestin sur puce, mimétique organique, peut induire une morphogenèse 3D spontanée de l'épithélium intestinal, avec des fonctions physiologiques et une biomécanique améliorées. Nous présentons ici un protocole reproductible permettant d'induire de manière robuste la morphogenèse intestinale dans l'intestin, aussi bien sur une puce microfluidique que dans une puce hybride intégrant un système Transwell. Nous décrivons en détail les méthodes de fabrication du dispositif et de culture des cellules épithéliales Caco-2 ou d'organoïdes intestinaux. Ce protocole, appliqué aussi bien en conditions conventionnelles que sur une plateforme microfluidique, induit la morphogenèse 3D et caractérise les épithéliums 3D ainsi formés grâce à de multiples modalités d'imagerie. Il permet la régénération d'une microarchitecture intestinale fonctionnelle en contrôlant le flux de fluide basolatéral pendant 5 jours. Notre méthode de morphogenèse in vitro utilise des contraintes de cisaillement et des mouvements mécaniques physiologiquement pertinents et ne requiert aucune ingénierie ou manipulation cellulaire complexe, ce qui pourrait la rendre plus performante que les techniques existantes. Nous pensons que ce protocole pourrait avoir un impact considérable sur la communauté de la recherche biomédicale, en fournissant une méthode de régénération in vitro de couches épithéliales intestinales 3D pour des applications biomédicales, cliniques et pharmaceutiques.
Des expériences démontrent que les cellules épithéliales intestinales Caco-2 cultivées dans des dispositifs microfluidiques de type « intestin sur puce »^1,2,3,4,5 ou à double couche^6,7 peuvent subir une morphogenèse 3D spontanée in vitro, sans que le mécanisme sous-jacent soit clairement élucidé. Dans notre étude récente, nous avons constaté que l'élimination des antagonistes des morphogènes sécrétés par la membrane basolatérale des dispositifs de culture est nécessaire et suffisante pour induire une morphogenèse épithéliale 3D in vitro, ce qui a été démontré avec les cellules Caco-2 et des organoïdes intestinaux dérivés de patients. Les cellules épithéliales ont été validées. Dans cette étude, nous nous sommes spécifiquement intéressés à la production cellulaire et à la distribution de la concentration d'un puissant antagoniste de la voie Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), dans un modèle d'intestin sur puce et dans des dispositifs microfluidiques modifiés contenant des inserts Transwell, appelés « puce hybride ». Nous démontrons que l'ajout d'antagonistes exogènes de la voie Wnt (tels que DKK-1, le répresseur Wnt 1, la protéine apparentée à Frizzled sécrétée 1 ou Soggy-1) à l'intestin sur puce inhibe la morphogenèse ou perturbe la couche épithéliale 3D préstructurée, suggérant que le stress antagoniste pendant la culture est responsable de la morphogenèse intestinale in vitro. Par conséquent, une approche pratique pour obtenir une morphogenèse robuste à l'interface épithéliale consiste à éliminer ou à maintenir minimalement les niveaux d'antagonistes de la voie Wnt dans le compartiment basolatéral par rinçage actif (par exemple, dans les plateformes d'intestin sur puce ou hybrides sur puce) ou par diffusion. .Médias basolatéraux (par exemple, provenant d'inserts Transwell dans de grands réservoirs basolatéraux dans des puits).
Ce protocole décrit une méthode détaillée de fabrication de microdispositifs « intestin sur puce » et de puces hybrides insérables Transwell (étapes 1 à 5) pour la culture de cellules épithéliales intestinales sur des membranes poreuses à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) (étapes 6A, 7A, 8 et 9) ou sur des membranes en polyester d'inserts Transwell (étapes 6B, 7B, 8 et 9), et l'induction d'une morphogenèse 3D in vitro (étape 10). Nous avons également identifié des caractéristiques cellulaires et moléculaires indicatives d'une histogenèse spécifique du tissu et d'une différenciation cellulaire dépendante de la lignée, grâce à l'application de plusieurs modalités d'imagerie (étapes 11 à 24). Nous induisons la morphogenèse à l'aide de cellules épithéliales intestinales humaines, telles que les cellules Caco-2 ou des organoïdes intestinaux, dans deux formats de culture. Les détails techniques incluent la modification de surface des membranes poreuses, la création de monocouches 2D et la reproduction du microenvironnement biochimique et biomécanique intestinal. In vitro. Pour induire une morphogenèse 3D à partir de monocouches épithéliales 2D, nous avons éliminé les antagonistes des morphogènes dans les deux formes cultivées en faisant circuler le milieu dans le compartiment basolatéral de la culture. Enfin, nous présentons une illustration de l'utilité d'une couche épithéliale 3D régénérable qui peut être utilisée pour modéliser la croissance épithéliale dépendante des morphogènes, les co-cultures longitudinales hôte-microbiome, l'infection par des pathogènes, les lésions inflammatoires, le dysfonctionnement de la barrière épithéliale et les thérapies à base de probiotiques. Exemple. influences.
Notre protocole pourrait s'avérer utile à un large éventail de scientifiques, tant en recherche fondamentale (par exemple, biologie de la muqueuse intestinale, biologie des cellules souches et biologie du développement) qu'en recherche appliquée (par exemple, essais précliniques de médicaments, modélisation des maladies, ingénierie tissulaire et gastro-entérologie), avec un impact considérable. Grâce à sa reproductibilité et à sa robustesse pour induire la morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal in vitro, nous envisageons que notre stratégie technique puisse être diffusée auprès des chercheurs étudiant la dynamique de la signalisation cellulaire au cours du développement, de la régénération ou de l'homéostasie intestinale. De plus, notre protocole est utile pour étudier les infections causées par divers agents infectieux tels que le norovirus 8, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ou Vibrio cholerae. Les connaissances en pathologie et pathogénie des maladies sont également utiles. L'utilisation d'un système de microphysiologie intestinale sur puce permet une co-culture longitudinale¹⁰ et l'évaluation subséquente des défenses de l'hôte, des réponses immunitaires et de la réparation des lésions induites par les pathogènes dans le tractus gastro-intestinal (GI)¹¹. D'autres troubles GI associés au syndrome de l'intestin perméable, à la maladie cœliaque, à la maladie de Crohn, à la rectocolite hémorragique, à la pouchite ou au syndrome de l'intestin irritable peuvent être simulés lorsque des couches épithéliales intestinales 3D sont préparées à partir des couches épithéliales intestinales 3D du patient. Ces maladies incluent l'atrophie villositaire, le raccourcissement des cryptes, les lésions de la muqueuse ou l'altération de la barrière épithéliale. Des organoïdes intestinaux dérivés de biopsies ou de cellules souches^12,13 peuvent également être utilisés. Pour mieux modéliser la complexité accrue de l'environnement pathologique, il est possible d'ajouter des types cellulaires pertinents, tels que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) du patient, aux modèles contenant des microarchitectures 3D des villosités et des cryptes intestinales. cellules immunitaires spécifiques aux tissus, 5.
Puisque la microstructure épithéliale 3D peut être fixée et visualisée sans sectionnement, les chercheurs travaillant sur la transcriptomique spatiale et l'imagerie à haute ou super-résolution pourraient être intéressés par notre cartographie de la dynamique spatio-temporelle des gènes et des protéines dans les niches épithéliales. Ils s'intéressent également à la réponse aux stimuli microbiens ou immunitaires. De plus, le dialogue longitudinal hôte-microbiote^10,14, qui coordonne l'homéostasie intestinale, peut être établi dans la couche muqueuse intestinale 3D par la co-culture de diverses espèces microbiennes, communautés microbiennes ou du microbiote fécal, notamment dans le modèle « intestin sur puce ». Cette approche est particulièrement intéressante pour les chercheurs en immunologie des muqueuses, gastro-entérologie, microbiome humain, culturomique et microbiologie clinique qui souhaitent cultiver en laboratoire des microbiotes intestinaux jusqu'alors inexploités. Si notre protocole de morphogenèse in vitro peut être adapté à des formats de culture évolutifs, tels que des inserts multipuits pour plaques 24, 96 ou 384 puits permettant un renouvellement continu des compartiments basolatéraux, il pourra également être diffusé auprès des développeurs de plateformes pharmaceutiques, biomédicales ou de criblage ou validation à haut débit pour l'industrie agroalimentaire. À titre de preuve de concept, nous avons récemment démontré la faisabilité d'un système de morphogenèse multiplex à haut débit, adaptable au format plaque 24 puits. De plus, plusieurs dispositifs « organes sur puce » ont été commercialisés^16,17,18. Par conséquent, la validation de notre méthode de morphogenèse in vitro pourrait être accélérée et potentiellement adoptée par de nombreux laboratoires de recherche, entreprises, organismes gouvernementaux et de réglementation pour comprendre la reprogrammation cellulaire. de la morphogenèse intestinale in vitro au niveau transcriptomique pour tester des médicaments ou des produits biothérapeutiques. L'absorption et le transport des candidats médicaments ont été évalués à l'aide de substituts intestinaux 3D ou à l'aide de modèles d'organes sur puce personnalisés ou commerciaux pour évaluer la reproductibilité du processus de morphogenèse intestinale.
Un nombre limité de modèles expérimentaux pertinents pour l'humain ont été utilisés pour étudier la morphogenèse de l'épithélium intestinal, principalement en raison du manque de protocoles applicables pour induire une morphogenèse 3D in vitro. En effet, une grande partie des connaissances actuelles sur la morphogenèse intestinale repose sur des études animales (par exemple, le poisson-zèbre²⁰, la souris²¹ ou le poulet²²). Cependant, ces modèles sont coûteux et laborieux, peuvent soulever des questions éthiques et, surtout, ne permettent pas de déterminer précisément les processus de développement humain. De plus, leur capacité à être testés de manière multivariée et évolutive est très limitée. Par conséquent, notre protocole de régénération de structures tissulaires 3D in vitro surpasse les modèles animaux in vivo ainsi que les autres modèles de culture cellulaire statiques 2D traditionnels. Comme décrit précédemment, l'utilisation de structures épithéliales 3D nous a permis d'examiner la localisation spatiale des cellules différenciées dans l'axe crypte-villosité en réponse à divers stimuli muqueux ou immunitaires. Les couches épithéliales 3D peuvent fournir un espace pour L’étude de la compétition entre les cellules microbiennes pour former des niches spatiales et de l’évolution écologique en réponse aux facteurs de l’hôte (par exemple, les couches de mucus internes et externes, la sécrétion d’IgA et de peptides antimicrobiens) permet d’appréhender comment le microbiote intestinal structure ses communautés et produit en synergie des métabolites microbiens (par exemple, des acides gras à chaîne courte) qui modulent l’organisation cellulaire et les niches de cellules souches dans les cryptes basales. Ces caractéristiques ne peuvent être mises en évidence que lorsque des couches épithéliales 3D sont établies in vitro.
Outre notre méthode de création de structures épithéliales intestinales 3D, plusieurs méthodes in vitro existent. La culture d'organoïdes intestinaux est une technique de pointe en ingénierie tissulaire, basée sur la culture de cellules souches intestinales dans des conditions morphogènes spécifiques^23,24,25. Cependant, l'utilisation de modèles d'organoïdes 3D pour l'analyse du transport ou les co-cultures hôte-microbiote est souvent complexe, car la lumière intestinale est confinée à l'organoïde, limitant ainsi l'introduction de composants luminaux tels que des cellules microbiennes ou des antigènes exogènes. L'accès à la lumière des organoïdes peut être amélioré grâce à un micro-injecteur^26,27, mais cette méthode est invasive, laborieuse et requiert des compétences spécialisées. De plus, les cultures d'organoïdes traditionnelles, maintenues dans des matrices d'hydrogel en conditions statiques, ne reflètent pas fidèlement la biomécanique in vivo.
D'autres approches, employées par plusieurs groupes de recherche, utilisent des échafaudages d'hydrogel 3D préstructurés pour imiter la structure épithéliale intestinale en cultivant des cellules intestinales humaines isolées à la surface du gel. Ces échafaudages sont fabriqués à l'aide de moules imprimés en 3D, micro-usinés ou lithographiés. Cette méthode met en évidence l'auto-organisation in vitro de cellules épithéliales isolées avec des gradients de morphogènes physiologiquement pertinents, établissant une structure épithéliale à rapport d'aspect élevé et une interaction stroma-épithélium grâce à l'inclusion de cellules stromales dans l'échafaudage. Cependant, la nature préstructurée des échafaudages peut empêcher l'observation du processus morphogénétique spontané. Ces modèles ne permettent pas non plus de reproduire un flux luminal ou interstitiel dynamique, et sont dépourvus des contraintes de cisaillement nécessaires à la morphogenèse et à l'acquisition de la fonction physiologique des cellules intestinales. Une autre étude récente a utilisé des échafaudages d'hydrogel sur une plateforme microfluidique et a structuré l'épithélium intestinal par gravure laser. Les organoïdes suivent des motifs gravés pour former des structures tubulaires intestinales, et le flux de fluide intraluminal peut être reproduit à l'aide d'un module microfluidique. Cependant, ce modèle ne présente ni processus morphogénétiques spontanés ni mouvements mécanobiologiques intestinaux. Des techniques d'impression 3D développées par la même équipe ont permis de créer des tubes intestinaux miniatures avec des processus morphogénétiques spontanés. Malgré la fabrication complexe des différents segments intestinaux au sein du tube, ce modèle est également dépourvu de flux de fluide luminal et de déformation mécanique. De plus, son opérabilité peut être limitée, notamment après la fin du processus de bio-impression, en raison de la perturbation des conditions expérimentales ou des interactions intercellulaires. En revanche, notre protocole proposé offre une morphogenèse intestinale spontanée, un stress de cisaillement physiologiquement pertinent, une biomécanique mimant la motilité intestinale, l'accessibilité de compartiments apicaux et basolatéraux indépendants, et la recréation de microenvironnements biologiques complexes et modulaires. Par conséquent, notre protocole de morphogenèse 3D in vitro pourrait constituer une approche complémentaire permettant de surmonter les limitations des méthodes existantes.
Notre protocole est entièrement axé sur la morphogenèse épithéliale 3D, avec uniquement des cellules épithéliales en culture et aucun autre type cellulaire environnant, comme les cellules mésenchymateuses, endothéliales ou immunitaires. Comme décrit précédemment, le cœur de notre protocole est l'induction de la morphogenèse épithéliale par élimination des inhibiteurs de morphogènes sécrétés du côté basolatéral du milieu introduit. Bien que la modularité robuste de nos modèles « intestin sur puce » et « hybride sur puce » nous permette de recréer la couche épithéliale 3D ondulée, d'autres complexités biologiques, telles que les interactions épithélio-mésenchymateuses^33,34, le dépôt de matrice extracellulaire (MEC)³⁵ et, dans notre modèle, les caractéristiques des cryptes et des villosités qui abritent des niches de cellules souches dans les cryptes basales, restent à approfondir. Les cellules stromales (par exemple, les fibroblastes) du mésenchyme jouent un rôle clé dans la production de protéines de la MEC et la régulation de la morphogenèse intestinale. L’ajout de cellules mésenchymateuses à notre modèle a amélioré le processus morphogénétique et l’efficacité d’adhérence cellulaire (voir in vivo35,37,38). La couche endothéliale (capillaires ou vaisseaux lymphatiques) joue un rôle important dans la régulation du transport moléculaire³⁹ et le recrutement des cellules immunitaires⁴⁰ dans le microenvironnement intestinal. De plus, la présence de composants vasculaires connectables entre les modèles tissulaires est indispensable à la conception de modèles tissulaires visant à démontrer les interactions multi-organes. Par conséquent, l’inclusion de cellules endothéliales pourrait s’avérer nécessaire pour modéliser plus précisément les caractéristiques physiologiques à l’échelle de l’organe. Les cellules immunitaires dérivées du patient sont également essentielles pour reproduire les réponses immunitaires innées, la présentation des antigènes, le dialogue immunitaire inné-adaptatif et l’immunité spécifique des tissus dans le contexte de la simulation des maladies intestinales.
L'utilisation de puces hybrides est plus simple que celle des systèmes « intestin sur puce » car la configuration du dispositif est plus simple et l'utilisation d'inserts Transwell permet une culture à grande échelle de l'épithélium intestinal. Cependant, les inserts Transwell disponibles dans le commerce, dotés de membranes en polyester, ne sont pas élastiques et ne peuvent pas simuler les mouvements péristaltiques. De plus, le compartiment apical de l'insert Transwell placé dans la puce hybride reste immobile, sans contrainte de cisaillement du côté apical. De toute évidence, les propriétés statiques du compartiment apical permettent rarement une co-culture bactérienne à long terme dans les puces hybrides. Bien que nous puissions induire une morphogenèse 3D robuste dans les inserts Transwell grâce à l'utilisation de puces hybrides, le manque de biomécanique physiologiquement pertinente et de flux de fluide apical peut limiter la faisabilité des plateformes de puces hybrides pour des applications potentielles.
La reconstruction à grande échelle de l'axe crypte-villosité humaine dans des cultures « intestin sur puce » et « hybride sur puce » n'est pas encore totalement aboutie. La morphogenèse débutant à partir d'une monocouche épithéliale, les microarchitectures 3D ne présentent pas nécessairement une similarité morphologique avec les cryptes in vivo. Bien que nous ayons caractérisé la population cellulaire en prolifération près du domaine basal de la crypte dans l'épithélium 3D micro-ingénierisé, les régions cryptiques et villosités n'étaient pas clairement délimitées. Si des canaux supérieurs plus hauts sur la puce permettent d'accroître la hauteur de l'épithélium micro-ingénierisé, cette hauteur maximale reste limitée à environ 300–400 µm. La profondeur réelle des cryptes intestinales humaines est d'environ 135 µm dans l'intestin grêle et d'environ 400 µm dans le côlon, et la hauteur des villosités de l'intestin grêle est d'environ 600 µm⁴¹.
Du point de vue de l'imagerie, l'imagerie in situ à super-résolution de microarchitectures 3D pourrait être limitée à l'intestin sur puce, car la distance de travail requise entre l'objectif et la couche épithéliale est de l'ordre de quelques millimètres. Pour pallier ce problème, un objectif distant pourrait être nécessaire. De plus, la préparation d'échantillons pour l'imagerie, nécessitant des coupes fines, est complexe en raison de la grande élasticité du PDMS. Par ailleurs, la microfabrication couche par couche de l'intestin sur puce impliquant une adhésion permanente entre chaque couche, il est extrêmement difficile d'ouvrir ou de retirer la couche supérieure pour examiner la structure de surface de la couche épithéliale, par exemple à l'aide d'un microscope électronique à balayage (MEB).
L'hydrophobie du PDMS constitue un facteur limitant dans les études microfluidiques portant sur les petites molécules hydrophobes, car le PDMS peut adsorber de manière non spécifique ces molécules. Des alternatives au PDMS, telles que d'autres matériaux polymères, peuvent être envisagées. Une autre possibilité consiste à modifier la surface du PDMS (par exemple, par revêtement avec des matériaux lipophiles⁴² ou du poly(éthylène glycol)⁴³) afin de minimiser l'adsorption des molécules hydrophobes.
Enfin, notre méthode n'a pas été suffisamment caractérisée en termes de capacité à fournir un criblage à haut débit ou une plateforme expérimentale conviviale et universelle. Le protocole actuel nécessite une pompe à seringue par microdispositif, ce qui occupe de l'espace dans un incubateur à CO2 et empêche les expériences à grande échelle. Cette limitation peut être considérablement améliorée grâce à l'adaptabilité de formats de culture innovants (par exemple, des inserts poreux à 24, 96 ou 384 puits permettant le renouvellement et l'élimination continus du milieu basolatéral).
Pour induire la morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal humain in vitro, nous avons utilisé un dispositif microfluidique intestinal sur puce contenant deux microcanaux parallèles et une membrane poreuse élastique entre eux afin de créer une interface lumière-capillaire. Nous démontrons également l'utilisation d'un dispositif microfluidique à canal unique (une puce hybride) qui fournit un flux basolatéral continu sous des couches épithéliales polarisées cultivées sur des inserts Transwell. Dans les deux plateformes, la morphogenèse de diverses cellules épithéliales intestinales humaines peut être démontrée en appliquant une manipulation directionnelle du flux pour éliminer les antagonistes des morphogènes du compartiment basolatéral. La procédure expérimentale complète (Figure 1) se compose de cinq parties : (i) microfabrication de la puce intestinale ou de la puce hybride insérable Transwell (étapes 1 à 5 ; Encadré 1), (ii) préparation de cellules épithéliales intestinales (cellules Caco-2) ou d'organoïdes intestinaux humains ; (i) boîtes 2-5), (iii) culture de cellules épithéliales intestinales sur des puces intestinales ou des puces hybrides (étapes 6-9), (iv) induction de la morphogenèse 3D in vitro (étape 10) et (v) ) pour caractériser la microstructure épithéliale 3D (étapes 11-24). Enfin, un groupe témoin approprié (discuté plus loin) a été conçu pour valider l'efficacité de la morphogenèse in vitro en comparant la morphogenèse épithéliale à des témoins spatiaux, temporels, conditionnels ou procéduraux.
Nous avons utilisé deux plateformes de culture différentes : des puces « intestin sur puce » avec des canaux rectilignes ou des canaux convolutés non linéaires, ou des puces hybrides contenant des inserts Transwell (TW) dans un dispositif microfluidique, fabriquées comme décrit dans l’encadré 1 et les étapes 1 à 5 de la section « Fabrication du dispositif ». Cette section présente les principales étapes de fabrication d’une puce simple ou d’une puce hybride. La section « Culture de cellules épithéliales intestinales humaines » explique la source cellulaire (Caco-2 ou organoïdes intestinaux humains) et la procédure de culture utilisées dans ce protocole. La section « Morphogenèse in vitro » décrit les étapes générales de culture des cellules épithéliales Caco-2 ou dérivées d’organoïdes sur une puce intestinale ou sur des inserts Transwell d’une puce hybride, suivies de l’induction de la morphogenèse 3D et de la formation d’une structure épithéliale caractérisée. Le numéro d’étape ou d’encadré du programme est affiché sous chaque flèche. L’application fournit des exemples d’utilisation des couches épithéliales intestinales établies, notamment pour la caractérisation de la différenciation cellulaire, les études de physiologie intestinale et l’établissement de… Écosystèmes hôte-microbiote et modélisation des maladies. Les images d'immunofluorescence de la section « Différenciation cellulaire » montrent les noyaux, l'actine F et la MUC2 exprimée dans la couche épithéliale 3D de Caco-2 générée sur la puce intestinale. La signalisation MUC2 est présente dans les cellules caliciformes et le mucus sécrété par les surfaces muqueuses. Les images de fluorescence de la section « Physiologie intestinale » montrent le mucus produit par coloration des résidus d'acide sialique et de N-acétylglucosamine à l'aide de l'agglutinine de germe de blé fluorescente. Les deux images superposées de la section « Co-cultures hôte-microbiote » présentent des exemples de co-cultures hôte-microbiote dans l'intestin sur puce. Le panneau de gauche montre la co-culture d'E. coli exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) avec des cellules épithéliales 3D de Caco-2 micro-ingénierées. Le panneau de droite montre la localisation d'E. coli GFP co-cultivée avec des cellules épithéliales 3D de Caco-2, suivie d'une immunofluorescence. Coloration à l'actine F (rouge) et aux noyaux (bleu). La modélisation de la maladie illustre un intestin sain versus un intestin perméable dans des puces d'inflammation intestinale soumises à une stimulation physiologique par des antigènes bactériens (par exemple, le lipopolysaccharide, LPS) et des cellules immunitaires (par exemple, les PBMC ; vert). Des cellules Caco-2 ont été cultivées pour établir une couche épithéliale 3D. Échelle : 50 µm. Images de la rangée inférieure : « Différenciation des cellules », adaptée avec l'autorisation de la référence 2, Oxford University Press ; reproduite avec l'autorisation de la référence 5, NAS ; « Co-culture hôte-microbe », adaptée avec l'autorisation de la référence 3, NAS ; « Modélisation de la maladie », adaptée avec l'autorisation de la référence 5, NAS.
Les puces « intestin sur puce » et les puces hybrides ont été fabriquées à partir de répliques en PDMS démoulées de moules en silicium par lithographie douce^1,44 et structurées avec du SU-8. La conception des microcanaux de chaque puce est déterminée en tenant compte de l'hydrodynamique, notamment des contraintes de cisaillement et de la pression hydrodynamique^1,4,12. La conception originale de l'intestin sur puce (Fig. 1a des données complémentaires), composée de deux microcanaux rectilignes parallèles juxtaposés, a évolué vers un intestin sur puce complexe (Fig. 1b des données complémentaires) incluant une paire de microcanaux courbes. Ceci permet d'induire un temps de séjour du fluide accru, des écoulements non linéaires et une déformation multiaxiale des cellules en culture (Fig. 2a–f)¹². Lorsque la biomécanique intestinale doit être reproduite de manière plus complexe, des intestins sur puce complexes peuvent être utilisés. Nous avons démontré que l'intestin sur puce complexe induit également une forte morphogenèse 3D. Dans un délai similaire et avec un degré de croissance épithéliale comparable à celui de la puce intestinale originale, quel que soit le type cellulaire cultivé, les modèles d'intestin sur puce, linéaires ou complexes, sont interchangeables pour induire une morphogenèse 3D. Les répliques en PDMS polymérisées sur des moules en silicone à motifs SU-8 présentent des reliefs après démoulage (Fig. 2a). Pour fabriquer l'intestin sur puce, la couche supérieure de PDMS préparée est collée successivement à un film de PDMS poreux, puis alignée avec la couche inférieure par collage irréversible à l'aide d'un appareil de traitement corona (Fig. 2b–f). Pour fabriquer des puces hybrides, les répliques en PDMS polymérisées sont collées sur des lames de verre afin de créer des dispositifs microfluidiques monocanal pouvant accueillir des inserts Transwell (Fig. 2h et Fig. 2 des données supplémentaires). Le collage est réalisé par traitement des surfaces de la réplique en PDMS et du verre au plasma d'oxygène ou par traitement corona. Après stérilisation du dispositif microfabriqué fixé au tube en silicone, le dispositif est assemblé. était prêt à effectuer la morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal (Figure 2g).
a) Illustration schématique de la préparation des pièces en PDMS à partir de moules en silicone à motifs SU-8. La solution de PDMS non polymérisée a été coulée sur un moule en silicone (à gauche), polymérisée à 60 °C (au centre) puis démoulée (à droite). Le PDMS démoulé a été découpé en morceaux et nettoyé pour une utilisation ultérieure. b) Photographie du moule en silicone utilisé pour préparer la couche supérieure de PDMS. c) Photographie du moule en silicone utilisé pour fabriquer la membrane poreuse en PDMS. d) Série de photographies des composants supérieurs et inférieurs en PDMS et du dispositif intestinal sur puce assemblé. e) Schéma de l'alignement des composants supérieurs, de la membrane et inférieurs en PDMS. Chaque couche est liée de manière irréversible par traitement plasma ou corona. f) Schéma du dispositif « intestin sur puce » fabriqué, avec des microcanaux convolutés superposés et des chambres à vide. g) Configuration du dispositif « intestin sur puce » pour la culture cellulaire microfluidique. L'intestin sur puce fabriqué, assemblé avec un tube en silicone et une seringue, a été placé sur… Une lamelle couvre-objet. Le dispositif à puce a été placé sur le couvercle d'une boîte de Petri de 150 mm pour traitement. Le liant est utilisé pour fermer le tube en silicone. h, Images de la fabrication de la puce hybride et de la morphogenèse 3D à l'aide de puces hybrides. Des inserts Transwell, préparés indépendamment pour la culture de monocouches 2D de cellules épithéliales intestinales, ont été insérés dans la puce hybride pour induire la morphogenèse intestinale 3D. Le milieu est perfusé à travers des microcanaux situés sous la couche cellulaire établie sur l'insert Transwell. Échelle : 1 cm. h Reproduit avec l'autorisation de la référence 4. Elsevier.
Dans ce protocole, la lignée cellulaire Caco-2 et des organoïdes intestinaux ont été utilisés comme sources épithéliales (Fig. 3a). Les deux types de cellules ont été cultivés indépendamment (Encadrés 2 et 5) et utilisés pour ensemencer les microcanaux recouverts de matrice extracellulaire (MEC) d'intestin sur puce ou d'inserts Transwell. Lorsque les cellules sont confluentes (> 95 % de couverture dans les flacons), les cellules Caco-2 cultivées de façon routinière (entre les passages 10 et 50) dans des flacons T sont récoltées pour préparer des suspensions cellulaires dissociées par trypsination (encadré 2). Les organoïdes intestinaux humains, issus de biopsies intestinales ou de résections chirurgicales, ont été cultivés dans des dômes de Matrigel dans des plaques 24 puits afin de soutenir le microenvironnement structural. Le milieu contenant des morphogènes essentiels (tels que Wnt, R-spondine et Noggin) et des facteurs de croissance, préparé comme décrit dans l'encadré 3, a été renouvelé tous les deux jours jusqu'à ce que les organoïdes atteignent une taille d'environ 500 µm. Les organoïdes matures sont récoltés et dissociés en cellules uniques pour être ensemencés sur des inserts intestinaux ou Transwell sur puce (Encadré 5). Comme nous l'avons précédemment rapporté, ils peuvent être différenciés selon le type de maladie^12,13 (par exemple, rectocolite hémorragique, maladie de Crohn, cancer colorectal ou donneur sain), la localisation de la lésion (par exemple, zone lésée ou non lésée) et la partie du tube digestif (par exemple, duodénum, ​​jéjunum, iléon, cæcum, côlon ou rectum). Nous proposons dans l'Encadré 5 un protocole optimisé pour la culture d'organoïdes coliques (coloides), qui nécessitent généralement des concentrations de morphogènes plus élevées que les organoïdes de l'intestin grêle.
a) Protocole d'induction de la morphogenèse intestinale sur puce. Ce protocole utilise l'épithélium intestinal humain Caco-2 et des organoïdes intestinaux pour démontrer la morphogenèse 3D. Les cellules épithéliales isolées sont ensemencées dans le dispositif « intestin sur puce » préparé (préparation de la puce). Une fois les cellules ensemencées et fixées à la membrane poreuse en PDMS au jour 0 (J0), un flux apical est initié et maintenu pendant les deux premiers jours (flux AP, J0-J2). Un flux basolatéral est également initié, accompagné de mouvements d'étirement cycliques (étirement, flux AP et BL), lorsqu'une monocouche 2D complète est formée. La morphogenèse intestinale 3D survient spontanément après 5 jours de culture microfluidique (morphogenèse, J5). Les images en contraste de phase montrent la morphologie représentative des cellules Caco-2 à chaque étape expérimentale (histogramme, 100). µm). Quatre schémas illustrant les cascades correspondantes de la morphogenèse intestinale (en haut à droite). Les flèches en pointillés sur le schéma représentent la direction du flux de fluide. b, Image MEB montrant la topologie de surface de l'épithélium 3D Caco-2 établi (à gauche). L'encart mettant en évidence la zone agrandie (encadré blanc en pointillés) montre les microvillosités régénérées sur la couche 3D Caco-2 (à droite). c, Vue frontale horizontale de la couche 3D Caco-2 établie, de la claudine (ZO-1, rouge) et des membranes à bordure en brosse continue marquées F-actine (vert) et noyaux (bleu). Visualisation par immunofluorescence confocale des cellules épithéliales sur des puces intestinales. Les flèches pointant vers le schéma central indiquent l'emplacement du plan focal pour chaque vue confocale. d, Évolution temporelle des changements morphologiques dans les organoïdes cultivés sur une puce, obtenue par microscopie à contraste de phase aux jours 3, 7, 9, 11 et 12. 13. L'encart (en haut à droite) montre un fort grossissement de l'image fournie. e, Photomicrographie DIC de l'épithélium 3D d'un organoïde établi dans l'intestin sur une coupe prélevée au jour 7. f, Images d'immunofluorescence superposées montrant les marqueurs des cellules souches (LGR5 ; magenta), des cellules caliciformes (MUC2 ; vert), de l'actine F (gris) et des noyaux (cyan) cultivés sur des puces intestinales pendant 3 jours, respectivement (à gauche) et des organoïdes de 13 jours (au milieu) sur la couche épithéliale. Voir également la figure 3 des données étendues, qui met en évidence la signalisation LGR5 sans signalisation MUC2. Images de fluorescence montrant la microstructure épithéliale (à droite) de l'épithélium 3D d'un organoïde établi dans l'intestin sur une puce par coloration de la membrane plasmique avec le colorant CellMask (à droite) au jour 13 de culture. La barre d'échelle est de 50 μm, sauf indication contraire. b Reproduit avec l'autorisation de la référence 2. Oxford University Press ; c Adapté avec l'autorisation de la référence 2. Oxford University Press ; e et f adaptés avec l'autorisation de la référence 12 Sous licence Creative Commons CC BY 4.0.
Dans le système « intestin sur puce », il est nécessaire de modifier la surface hydrophobe de la membrane poreuse en PDMS pour un revêtement efficace de la matrice extracellulaire (MEC). Dans ce protocole, nous appliquons deux méthodes différentes pour modifier l'hydrophobicité des membranes en PDMS. Pour la culture de cellules Caco-2, l'activation de surface par traitement UV/ozone seul a suffi à réduire l'hydrophobicité de la surface du PDMS, à revêtir la MEC et à fixer les cellules Caco-2 à la membrane. Cependant, la culture microfluidique d'épithélium organoïde nécessite une fonctionnalisation chimique de surface pour obtenir un dépôt efficace de protéines de la MEC, par application séquentielle de polyéthylèneimine (PEI) et de glutaraldéhyde sur les microcanaux en PDMS. Après modification de surface, les protéines de la MEC ont été déposées pour recouvrir la surface du PDMS fonctionnalisée, puis introduites dans l'épithélium organoïde isolé. Une fois les cellules fixées, la culture cellulaire microfluidique débute par la perfusion du milieu uniquement dans le microcanal supérieur jusqu'à la formation d'une monocouche cellulaire complète, tandis que le microcanal inférieur maintient des conditions statiques. Cette méthode optimisée d'activation de surface et Le revêtement ECM permet la fixation de l'épithélium organoïde pour induire une morphogenèse 3D sur la surface PDMS.
Les cultures Transwell nécessitent également un revêtement de matrice extracellulaire (MEC) avant l'ensemencement cellulaire ; cependant, elles ne requièrent pas d'étapes de prétraitement complexes pour activer la surface des inserts poreux. Pour la culture de cellules Caco-2 sur inserts Transwell, le revêtement de MEC accélère l'adhérence des cellules Caco-2 dissociées (moins d'une heure) et la formation de jonctions serrées (moins d'un à deux jours). Pour la culture d'organoïdes sur inserts Transwell, les organoïdes isolés sont ensemencés sur les inserts revêtus de MEC, adhèrent à la surface de la membrane (moins de trois heures) et sont maintenus en culture jusqu'à la formation d'une monocouche complète et intègre. Les cultures Transwell sont réalisées dans des plaques 24 puits, sans utilisation de puces hybrides.
La morphogenèse 3D in vitro peut être initiée par l'application d'un flux de fluide à la face basolatérale d'une couche épithéliale établie. Dans le modèle d'intestin sur puce, la morphogenèse épithéliale débute lors de la perfusion du milieu dans les microcanaux supérieur et inférieur (Fig. 3a). Comme décrit précédemment, il est crucial d'introduire un flux de fluide dans le compartiment inférieur (basolatéral) pour l'élimination continue des inhibiteurs de morphogènes sécrétés de manière directionnelle. Afin de fournir suffisamment de nutriments et de sérum aux cellules fixées sur des membranes poreuses et de générer une contrainte de cisaillement luminale, nous appliquons généralement un double flux dans le modèle d'intestin sur puce. Dans les puces hybrides, des inserts Transwell contenant des monocouches épithéliales sont insérés. Le milieu est ensuite appliqué sous la face basolatérale de l'insert Transwell poreux via le microcanal. La morphogenèse intestinale survient 3 à 5 jours après l'initiation du flux basolatéral dans les deux types de plateformes de culture.
Les caractéristiques morphologiques des couches épithéliales 3D micro-ingénierées peuvent être analysées par différentes techniques d'imagerie, notamment la microscopie à contraste de phase, la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC), la microscopie électronique à balayage (MEB) ou la microscopie confocale à immunofluorescence (figures 3 et 4). L'imagerie à contraste de phase ou DIC peut être facilement réalisée à tout moment de la culture pour observer la forme et la protrusion des couches épithéliales 3D. Grâce à la transparence optique des films de PDMS et de polyester, les plateformes « intestin sur puce » et les puces hybrides permettent une imagerie in situ en temps réel sans nécessiter de sectionnement ni de démontage du dispositif. Pour l'imagerie par immunofluorescence (figures 1, 3c, f et 4b, c), les cellules sont généralement fixées successivement avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (p/v), puis avec du Triton X-100 et de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 2 % (p/v). Selon le type cellulaire, différentes étapes sont nécessaires. Des fixateurs, des perméabilisants et des agents de blocage peuvent être utilisés. Des anticorps primaires ciblant des marqueurs cellulaires ou régionaux spécifiques de lignage sont utilisés pour mettre en évidence les cellules immobilisées in situ sur la puce, suivis d'anticorps secondaires et d'un colorant de contre-coloration ciblant soit le noyau (par exemple, le DAPI), soit l'actine F (par exemple, la phalloïdine marquée par fluorescence). L'imagerie en temps réel par fluorescence peut également être réalisée in situ pour détecter la production de mucus (Fig. 1, « Différenciation cellulaire » et « Physiologie intestinale »), la colonisation aléatoire par des cellules microbiennes (Fig. 1, « Co-culture hôte-microbe »), le recrutement de cellules immunitaires (Fig. 1, « Modélisation de la maladie ») ou les contours de la morphologie épithéliale 3D (Fig. 3c, f et 4b, c). Lors de la modification de l'intestin sur la puce pour séparer la couche supérieure de la couche inférieure de microcanaux, comme décrit dans Comme illustré sur la figure 2, la morphologie épithéliale 3D ainsi que les microvillosités de la bordure en brosse apicale peuvent être visualisées par MEB (figure 3b). L'expression des marqueurs de différenciation peut être évaluée par PCR quantitative ou par séquençage d'ARN unicellulaire. Dans ce cas, les couches 3D de cellules épithéliales cultivées sur des puces intestinales ou des puces hybrides sont récoltées par trypsination puis utilisées pour des analyses moléculaires ou génétiques.
a) Protocole d'induction de la morphogenèse intestinale sur une puce hybride. Ce protocole utilise des cellules Caco-2 et des organoïdes intestinaux pour démontrer la morphogenèse 3D sur une plateforme de puce hybride. Des cellules épithéliales dissociées sont ensemencées dans des inserts Transwell préparés (préparation TW ; voir figure ci-dessous). Une fois les cellules ensemencées et fixées aux membranes de polyester des inserts Transwell, elles sont cultivées en conditions statiques (culture TW). Après 7 jours, un insert Transwell contenant une monocouche 2D de cellules épithéliales est intégré à une puce hybride pour induire un flux basolatéral (Flux, BL), induisant ainsi la formation d'une couche épithéliale 3D (morphogenèse). Les micrographies en contraste de phase montrent les caractéristiques morphologiques des cellules épithéliales d'organes humains, dérivées du côlon ascendant d'un donneur sain (lignée C103), à chaque étape expérimentale. Les schémas des couches supérieures illustrent la configuration expérimentale de chaque étape. b) Les puces hybrides (schéma de gauche) peuvent permettre de Morphogenèse 3D de cellules épithéliales organoïdes, visualisée par microscopie confocale en incidence 3D à différentes positions Z (supérieure, médiane et inférieure ; voir schéma de droite et lignes pointillées correspondantes), révélant des caractéristiques morphologiques distinctes. Actine F (cyan), noyau (gris). c, Micrographies confocales de fluorescence (vue 3D oblique) de cellules épithéliales dérivées d'organoïdes cultivées dans un Transwell statique (TW ; encart blanc en pointillés) ou sur une puce hybride (image complète la plus large), comparant respectivement la morphologie 2D et 3D. Deux coupes verticales 2D (encart en haut à droite ; « XZ ») illustrent également les caractéristiques 2D et 3D. Échelle : 100 µm. c Reproduit avec l'autorisation de la référence 4. Elsevier.
Des témoins peuvent être préparés en cultivant les mêmes cellules (Caco-2 ou cellules épithéliales d'organoïdes intestinaux) en monocouches bidimensionnelles dans des conditions de culture statiques classiques. Il est à noter qu'une déplétion en nutriments peut survenir en raison du volume limité des microcanaux (environ 4 µL dans le canal supérieur du dispositif original de microcanaux). Par conséquent, la morphologie épithéliale avant et après application d'un flux basolatéral peut également être comparée.
Le procédé de lithographie douce doit être réalisé en salle blanche. Pour chaque couche de la puce (couches supérieure et inférieure, et membranes) et pour les puces hybrides, différents photomasques ont été utilisés et fabriqués sur des plaquettes de silicium distinctes, car les hauteurs des microcanaux étaient différentes. Les hauteurs cibles des microcanaux supérieur et inférieur de l'intérieur de la puce sont respectivement de 500 µm et 200 µm. La hauteur cible du canal de la puce hybride est de 200 µm.
Déposez une plaquette de silicium de 7,6 cm (3 pouces) dans un récipient contenant de l'acétone. Agitez doucement la plaquette pendant 30 secondes, puis laissez-la sécher à l'air libre. Transférez la plaquette sur une plaque contenant de l'IPA, puis faites tourner la plaque pendant 30 secondes pour la nettoyer.
Une solution piranha (mélange de peroxyde d'hydrogène et d'acide sulfurique concentré, 1:3 (vol/vol)) peut être utilisée en option pour maximiser l'élimination des résidus organiques de la surface de la plaquette de silicium.
La solution piranha est extrêmement corrosive et dégage de la chaleur. Des précautions de sécurité supplémentaires sont nécessaires. Pour l'élimination des déchets, laissez la solution refroidir et transférez-la dans un conteneur à déchets propre et sec. Utilisez des conteneurs secondaires et étiquetez correctement les conteneurs à déchets. Veuillez suivre les consignes de sécurité de l'établissement pour connaître les procédures détaillées.
Déshydrater les plaquettes en les plaçant sur une plaque chauffante à 200 °C pendant 10 min. Après déshydratation, la plaquette a été secouée cinq fois à l'air libre pour la refroidir.
Déposez environ 10 g de résine photosensible SU-8 2100 au centre de la plaquette de silicium nettoyée. Étalez la résine uniformément sur la plaquette à l'aide d'une pince. Placez occasionnellement la plaquette sur une plaque chauffante à 65 °C pour fluidifier la résine et faciliter son étalement. Ne placez pas la plaquette directement sur la plaque chauffante.
Le SU-8 a été réparti uniformément sur la plaquette par enduction centrifuge. Programmez une rotation entrante du SU-8 pendant 5 à 10 s à 500 tr/min avec une accélération de 100 tr/min/s. Réglez la rotation principale pour une structuration d'une épaisseur de 200 µm à 1 500 tr/min, ou pour obtenir une épaisseur de 250 µm (soit une hauteur de 500 µm pour la couche supérieure du substrat sur la puce ; voir « Étapes critiques » ci-dessous) à une accélération de 300 tr/min/s pendant 30 secondes à 1 200 tr/min.
La vitesse de rotation principale peut être ajustée en fonction de l'épaisseur cible du motif SU-8 sur la plaquette de silicium.
Pour fabriquer des motifs SU-8 de 500 µm de hauteur pour la couche supérieure de l'intestin sur la puce, les étapes de revêtement par centrifugation et de cuisson douce de cette boîte (étapes 7 et 8) ont été répétées séquentiellement (voir étape 9) pour produire deux couches de 250 µm d'épaisseur de SU-8, qui peuvent être superposées et jointes par exposition UV à l'étape 12 de cette boîte, formant une couche de 500 µm de hauteur.
Cuisez les plaquettes recouvertes de SU-8 en les plaçant soigneusement sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 5 min, puis réglez la température à 95 °C et laissez incuber pendant 40 min supplémentaires.
Pour obtenir une hauteur de 500 μm du motif SU-8 dans le microcanal supérieur, répétez les étapes 7 et 8 pour générer deux couches SU-8 de 250 μm d'épaisseur.
À l'aide de l'aligneur de masque UV, effectuez un test de lampe conformément aux instructions du fabricant pour calculer le temps d'exposition de la plaquette. (temps d'exposition, ms) = (dose d'exposition, mJ/cm2)/(puissance de la lampe, mW/cm2).
Après avoir déterminé le temps d'exposition, placez le photomask sur le porte-masque de l'aligneur de masques UV et placez le photomask sur la plaquette revêtue de SU-8.
Placez la surface imprimée du photomask directement sur le côté recouvert de SU-8 de la plaquette de silicium afin de minimiser la dispersion des UV.
Exposez la plaquette recouverte de SU-8 et le photomask verticalement à 260 mJ/cm2 de lumière UV pendant la durée d'exposition prédéterminée (voir l'étape 10 de cet encadré).
Après exposition aux UV, les plaquettes de silicium recouvertes de SU-8 ont été cuites à 65 °C pendant 5 min et à 95 °C pendant 15 min sur chaque plaque chauffante pour fabriquer des motifs d'une hauteur de 200 µm. Prolongez le temps de post-cuisson à 95 °C à 30 min pour fabriquer des motifs d'une hauteur de 500 µm.
Versez le révélateur dans un plat en verre, puis placez-y la plaquette cuite. La quantité de révélateur SU-8 nécessaire peut varier selon la taille du plat. Veillez à utiliser suffisamment de révélateur pour éliminer complètement le SU-8 non exposé. Par exemple, pour un plat en verre de 150 mm de diamètre et d'une capacité de 1 L, utilisez environ 300 ml de révélateur SU-8. Laissez développer pendant 25 minutes en effectuant de délicates rotations de temps en temps.
Rincer le moule développé avec environ 10 mL de révélateur frais, puis avec de l'IPA en pulvérisant la solution à l'aide d'une pipette.
Placer la plaquette dans un nettoyeur plasma et l'exposer à un plasma d'oxygène (gaz atmosphérique, pression cible 1 × 10−5 Torr, puissance 125 W) pendant 1,5 min.
Placer la plaquette dans un dessiccateur sous vide contenant une lame de verre. Les plaquettes et les lames peuvent être placées côte à côte. Si le dessiccateur sous vide est divisé en plusieurs compartiments par une plaque, placer les lames dans le compartiment inférieur et les plaquettes dans le compartiment supérieur. Déposer 100 μL de solution de trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane sur une lame de verre et appliquer le vide pour la silanisation.
Décongeler un flacon de cellules Caco-2 congelées dans un bain-marie à 37 °C, puis transférer les cellules décongelées dans un flacon T75 contenant 15 mL de milieu Caco-2 préchauffé à 37 °C.
Pour faire passer les cellules Caco-2 à une confluence d'environ 90 %, réchauffez d'abord le milieu Caco-2, le PBS et 0,25 % de trypsine/1 mM d'EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
Aspirer le milieu par aspiration sous vide. Laver les cellules deux fois avec 5 mL de PBS tiède en répétant l'aspiration sous vide et en ajoutant du PBS frais.