Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew titfi l-modalità ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Il-morfoġenesi tal-imsaren umani tistabbilixxi l-karatteristiċi tal-kripto-villus tal-mikroarkitettura epiteljali 3D u l-organizzazzjoni spazjali. Din l-istruttura unika hija meħtieġa biex tinżamm l-omeostażi tal-imsaren billi tipproteġi n-niċċa taċ-ċelloli staminali fil-kripta bażali minn antiġeni mikrobjali eżoġeni u l-metaboliti tagħhom. Barra minn hekk, il-villi intestinali u l-mukus li jnixxi jippreżentaw ċelloli epiteljali funzjonalment differenzjati b'barriera protettiva fuq il-wiċċ tal-mukoża intestinali. Għalhekk, ir-rikreazzjoni tal-istrutturi epiteljali 3D hija kruċjali għall-kostruzzjoni ta' mudelli tal-imsaren in vitro. Notevolment, il-gut-on-a-chip mimetiku organiku jista' jikkaġuna morfoġenesi 3D spontanja tal-epitelju intestinali b'funzjonijiet fiżjoloġiċi u bijomekkanika mtejba. Hawnhekk, nipprovdu protokoll riproduċibbli biex nikkaġunaw b'mod robust il-morfoġenesi intestinali fl-imsaren fuq ċippa mikrofluwidika kif ukoll f'ċippa ibrida inkorporata Transwell. Niddeskrivu metodi dettaljati għall-fabbrikazzjoni tal-apparati, il-kultivazzjoni ta' ċelloli epiteljali organoidi intestinali Caco-2 jew f'ambjenti konvenzjonali kif ukoll fuq pjattaforma mikrofluwidika, l-induzzjoni tal-morfoġenesi 3D, u l-karatterizzazzjoni ta' epitelji 3D stabbiliti. bl-użu ta' modalitajiet multipli ta' immaġini. Dan il-protokoll jikseb riġenerazzjoni tal-mikroarkitettura funzjonali tal-imsaren billi jikkontrolla l-fluss tal-fluwidu bażolaterali għal 5 ijiem. Il-metodu tagħna ta' morfoġenesi in vitro juża stress shear fiżjoloġikament rilevanti u moviment mekkaniku u ma jeħtieġx inġinerija jew manipulazzjoni kumplessa taċ-ċelluli, li jistgħu jegħlbu tekniki eżistenti oħra. Aħna nipprevedu li l-protokoll propost tagħna jista' jkollu implikazzjonijiet wesgħin għall-komunità tar-riċerka bijomedika, billi jipprovdi metodu biex jiġu riġenerati saffi epiteljali intestinali 3D in vitro għal applikazzjonijiet bijomediċi, kliniċi u farmaċewtiċi.
Esperimenti juru li ċ-ċelloli epiteljali intestinali Caco-2 ikkultivati ​​f'apparati gut-on-a-chip1,2,3,4,5 jew mikrofluwidiċi b'saff doppju6,7 jistgħu jgħaddu minn morfoġenesi 3D spontanja in vitro mingħajr fehim ċar tal-mekkaniżmu sottostanti. Fl-istudju reċenti tagħna, sibna li t-tneħħija ta' antagonisti tal-morfoġenesi sekretati b'mod bażolaterali minn apparati tal-kultura hija meħtieġa u suffiċjenti biex tinduċi morfoġenesi epiteljali 3D in vitro, li ġiet murija minn Caco-2 u organojdi intestinali derivati ​​mill-pazjent. Iċ-ċelloli epiteljali ġew ivvalidati. F'dan l-istudju, iffukajna speċifikament fuq il-produzzjoni taċ-ċelloli u d-distribuzzjoni tal-konċentrazzjoni ta' antagonist Wnt qawwi, Dickkopf-1 (DKK-1), f'apparati gut-on-a-chip u mikrofluwidiċi modifikati li fihom inserzjonijiet Transwell, imsejħa "Hybrid Chip". Nuru li ż-żieda ta' antagonisti Wnt eżoġeni (bħal DKK-1, repressur Wnt 1, proteina frizzled-relatata sekreta 1, jew Soggy-1) mal-musrana on-chip tinibixxi l-morfoġenesi jew tfixkel is-saff epiteljali 3D prestrutturat, li jissuġġerixxi li l-istress antagonistiku waqt il-kultura huwa responsabbli għall-morfoġenesi intestinali in vitro. Għalhekk, approċċ prattiku biex tinkiseb morfoġenesi robusta fl-interfaċċja epiteljali huwa li jitneħħew jew jinżammu minimament il-livelli ta' antagonisti Wnt fil-kompartiment bażolaterali permezz ta' tlaħliħ attiv (eż., fi pjattaformi gut-on-a-chip jew hybrid-on-a-chip) jew diffużjoni. Mezzi bażolaterali (eż., minn inserzjonijiet Transwell f'riżervwari bażolaterali kbar fil-bjar).
F'dan il-protokoll, nipprovdu metodu dettaljat għall-fabbrikazzjoni ta' mikroapparati gut-on-a-chip u ċipep ibridi li jistgħu jiddaħħlu Transwell (passi 1-5) biex jikkultivaw ċelloli epiteljali intestinali fuq membrani porużi bbażati fuq polydimethylsiloxane (PDMS) (passi 6A, 7A, 8, 9) jew membrani tal-poliester ta' inserzjonijiet Transwell (passi 6B, 7B, 8, 9) u morfoġenesi 3D indotta in vitro (pass 10). Identifikajna wkoll karatteristiċi ċellulari u molekulari indikattivi ta' istoġenesi speċifika għat-tessut u differenzjazzjoni ċellulari dipendenti fuq il-linja billi applikajna modalitajiet multipli ta' immaġini (passi 11-24). Ninduċu l-morfoġenesi bl-użu ta' ċelloli epiteljali intestinali umani, bħal Caco-2 jew organoids intestinali, f'żewġ formati ta' kultura b'dettalji tekniċi inkluż modifikazzjoni tal-wiċċ ta' membrani porużi, ħolqien ta' monolayers 2D, u bijokimika intestinali u Riproduzzjoni tal-mikroambjent bijomekkaniku in vitro. Biex ninduċu l-morfoġenesi 3D minn monolayers epiteljali 2D, neħħejna antagonisti tal-morfoġeni fiż-żewġ ikkultivati. jifforma billi l-mezz jiċċirkola fil-kompartiment bażolaterali tal-kultura. Fl-aħħar nett, nipprovdu rappreżentazzjoni tal-utilità ta' saff epiteljali 3D riġenerabbli li jista' jintuża biex jimmudella t-tkabbir epiteljali dipendenti fuq il-morfoġenu, ko-kulturi lonġitudinali tal-mikrobijoma ospitanti, infezzjoni tal-patoġenu, korriment infjammatorju, disfunzjoni tal-barriera epiteljali, u terapiji bbażati fuq probijotiċi Eżempju.influwenzi.
Il-protokoll tagħna jista' jkun utli għal firxa wiesgħa ta' xjenzati fir-riċerka bażika (eż., bijoloġija tal-mukoża intestinali, bijoloġija taċ-ċelloli staminali, u bijoloġija tal-iżvilupp) u applikata (eż., ittestjar prekliniku tad-drogi, immudellar tal-mard, inġinerija tat-tessuti, u gastroenteroloġija) b'impatt wiesa'. Minħabba r-riproduċibbiltà u r-robustezza tal-protokoll tagħna biex ninduċu morfoġenesi 3D tal-epitelju intestinali in vitro, nimmaġinaw li l-istrateġija teknika tagħna tista' tinxtered lil udjenzi li jistudjaw id-dinamika tas-sinjalar taċ-ċelloli waqt l-iżvilupp intestinali, ir-riġenerazzjoni jew l-omeostażi. Barra minn hekk, il-protokoll tagħna huwa utli għall-interrogazzjoni ta' infezzjoni taħt diversi aġenti infettivi bħal Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 jew Vibrio cholerae. Udjenzi tal-patoloġija u l-patoġenesi tal-mard huma wkoll utli. L-użu ta' sistema ta' mikrofiżjoloġija tal-musrana on-chip jista' jippermetti ko-kultura lonġitudinali 10 u valutazzjoni sussegwenti tad-difiża tal-ospitant, ir-risponsi immuni u t-tiswija ta' ħsara relatata mal-patoġeni fit-tratt gastrointestinali (GI) 11. Disturbi GI oħra assoċjati mas-sindromu tal-musrana tnixxija, il-marda celiac, il-marda ta' Crohn, il-kolite ulċerattiva, il-poukite, jew is-sindromu tal-musrana irritabbli jistgħu jiġu simulati meta saffi epiteljali intestinali 3D jiġu ppreparati bl-użu tas-saffi epiteljali intestinali 3D tal-pazjent, dawn il-mard jinkludu atrofija villuża, tqassir tal-kripta, ħsara fil-mukoża, jew barriera epiteljali indebolita. Bijopsija jew organojdi intestinali derivati ​​minn ċelloli staminali 12,13. Biex jimmudellaw aħjar il-kumplessità ogħla tal-ambjent tal-marda, il-qarrejja jistgħu jikkunsidraw li jżidu tipi ta' ċelloli rilevanti għall-marda, bħal ċelloli mononukleari tad-demm periferali tal-pazjent (PBMCs), ma' mudelli li fihom mikroarkitetturi 3D tal-villus-kripta intestinali. ċelloli immuni speċifiċi għat-tessut, 5.
Peress li l-mikrostruttura epiteljali 3D tista' tiġi ffissata u viżwalizzata mingħajr il-proċess ta' sezzjoni, dawk li jaħdmu fuq transkriptomika spazjali u immaġini b'riżoluzzjoni għolja jew super-riżoluzzjoni jistgħu jkunu interessati fl-immappjar tagħna tad-dinamika spazjotemporali tal-ġeni u l-proteini fuq niċeċ epiteljali. Interessat fit-teknoloġija. Rispons għal stimuli mikrobjali jew immuni. Barra minn hekk, crosstalk lonġitudinali bejn l-ospitant u l-mikrobijoma 10, 14 li jikkoordinaw l-omeostażi tal-imsaren tista' tiġi stabbilita fis-saff mukosali intestinali 3D billi jiġu kkultivati ​​​​ko-speċi mikrobjali varji, komunitajiet mikrobjali jew mikrobijota fekali, speċjalment fil-gut-on-a-chip. fil-pjattaforma. Dan l-approċċ huwa partikolarment attraenti għal udjenzi li jistudjaw l-immunoloġija mukosali, il-gastroenteroloġija, il-mikrobijoma umana, il-kulturomika u l-mikrobijoloġija klinika li qed ifittxu li jikkultivaw mikrobijota tal-imsaren li qabel ma kinitx ikkultivata fil-laboratorju. Jekk il-protokoll tagħna ta' morfoġenesi in vitro jista' jiġi adattat għal formati ta' kultura skalabbli, bħal inserzjonijiet b'ħafna bjar fi pjanċi ta' 24, 96 jew 384 bjar li jimlew kontinwament il-kompartimenti bażolaterali, il-protokoll jista' wkoll jiġi mxerred lil dawk li qed jiżviluppaw pjattaformi farmaċewtiċi, bijomediċi jew ta' skrinjar jew validazzjoni b'rendiment għoli għall-industrija tal-ikel. Bħala prova tal-prinċipju, dan l-aħħar urejna l-fattibbiltà ta' sistema multiplex ta' morfoġenesi b'rendiment għoli skalabbli għal format ta' pjanċa ta' 24 bjar. Barra minn hekk, ġew kummerċjalizzati prodotti multipli ta' organi fuq ċippa16,17,18. Għalhekk, il-validazzjoni tal-metodu ta' morfoġenesi in vitro tagħna tista' tiġi aċċellerata u potenzjalment adottata minn ħafna laboratorji ta' riċerka, industrija jew aġenziji governattivi u regolatorji biex jifhmu r-riprogrammazzjoni ċellulari tal-morfoġenesi tal-imsaren in vitro fil-livell traskrittomiku biex jittestjaw drogi jew bijoterapewtiċi L-assorbiment u t-trasport tal-kandidati għall-mediċini ġew ivvalutati bl-użu ta' surrogati tal-imsaren 3D jew bl-użu ta' mudelli organ-on-a-chip apposta jew kummerċjali biex tiġi vvalutata r-riproduċibbiltà tal-proċess tal-morfoġenesi tal-imsaren.
Numru limitat ta' mudelli sperimentali rilevanti għall-bniedem intużaw biex jistudjaw il-morfoġenesi epiteljali intestinali, prinċipalment minħabba n-nuqqas ta' protokolli implimentabbli biex jinduċu l-morfoġenesi 3D in vitro. Fil-fatt, ħafna mill-għarfien attwali dwar il-morfoġenesi tal-musrana huwa bbażat fuq studji fuq l-annimali (eż., zebrafish20, ġrieden21 jew tiġieġ22). Madankollu, huma intensivi fix-xogħol u fl-ispejjeż, jistgħu jkunu etikament dubjużi, u l-aktar importanti, ma jiddeterminawx preċiżament il-proċessi tal-iżvilupp tal-bniedem. Dawn il-mudelli huma wkoll limitati ħafna fil-kapaċità tagħhom li jiġu ttestjati b'mod skalabbli b'ħafna modi. Għalhekk, il-protokoll tagħna għar-riġenerazzjoni ta' strutturi tat-tessuti 3D in vitro jegħleb il-mudelli tal-annimali in vivo kif ukoll mudelli tradizzjonali oħra statiċi ta' kultura taċ-ċelluli 2D. Kif deskritt qabel, l-użu ta' strutturi epiteljali 3D ippermettilna neżaminaw il-lokalizzazzjoni spazjali taċ-ċelluli differenzjati fl-assi crypt-villus b'reazzjoni għal diversi stimuli mukosali jew immuni. Saffi epiteljali 3D jistgħu jipprovdu spazju biex jiġi studjat kif iċ-ċelluli mikrobjali jikkompetu biex jiffurmaw niċeċ spazjali u evoluzzjoni ekoloġika b'reazzjoni għal fatturi ospitanti (eż., saffi tal-mukus ta' ġewwa kontra saffi ta' barra, sekrezzjoni ta' IgA u peptidi antimikrobiċi). Barra minn hekk, il-morfoloġija epiteljali 3D tista' tippermettilna nifhmu kif il-mikrobijota tal-imsaren tistruttura l-komunitajiet tagħha u tipproduċi b'mod sinerġiku metaboliti mikrobjali (eż., aċidi grassi b'katina qasira) li jsawru l-organizzazzjoni ċellulari u n-niċeċ taċ-ċelloli staminali fil-kripti bażali. Dawn il-karatteristiċi jistgħu jintwerew biss meta saffi epiteljali 3D jiġu stabbiliti in vitro.
Minbarra l-metodu tagħna li noħolqu strutturi epiteljali intestinali 3D, hemm diversi metodi in vitro. Il-kultura organojdi intestinali hija teknika avvanzata ta' inġinerija tat-tessuti bbażata fuq il-kultivazzjoni ta' ċelloli staminali intestinali taħt kundizzjonijiet morfogeniċi speċifiċi23,24,25. Madankollu, l-użu ta' mudelli organojdi 3D għall-analiżi tat-trasport jew ko-kulturi ta' mikrobijoma ospitanti ħafna drabi huwa ta' sfida għaliex il-lumen intestinali huwa magħluq ġewwa l-organojde u, għalhekk, l-introduzzjoni ta' komponenti luminali bħal ċelloli mikrobjali jew antiġeni eżoġeni hija limitata. L-aċċess għal-lumeni organojdi jista' jittejjeb bl-użu ta' mikroinjettur,26,27 iżda dan il-metodu huwa invażiv u jieħu ħafna xogħol u jeħtieġ għarfien speċjalizzat biex jitwettaq. Barra minn hekk, il-kulturi organojdi tradizzjonali miżmuma fi scaffolds tal-idroġel taħt kundizzjonijiet statiċi ma jirriflettux b'mod preċiż il-bijomekkanika attiva in vivo.
Approċċi oħra użati minn diversi gruppi ta' riċerka jużaw scaffolds tal-idroġel 3D prestrutturati biex jimitaw l-istruttura epiteljali tal-musrana billi jikkultivaw ċelloli intestinali umani iżolati fuq il-wiċċ tal-ġel. Iffabbrika scaffolds tal-idroġel bl-użu ta' forom stampati bi 3D, mikro-mħin, jew iffabbrikati litografikament. Dan il-metodu juri l-arranġament awto-organizzat ta' ċelloli epiteljali iżolati in vitro bi gradjenti morfoġenetiċi fiżjoloġikament rilevanti, u jistabbilixxi struttura epiteljali ta' proporzjon ta' aspett għoli u crosstalk stroma-epiteljali billi jinkludi ċelloli stromali fl-iscaffold. Madankollu, in-natura tal-iscaffolds prestrutturati tista' tipprevjeni l-wiri tal-proċess morfoġenetiku spontanju nnifsu. Dawn il-mudelli lanqas ma jipprovdu fluss luminari jew interstizjali dinamiku, billi m'għandhomx l-istress ta' shear tal-fluwidu li ċ-ċelloli intestinali jeħtieġu biex jgħaddu minn morfoġenesi u jiksbu funzjoni fiżjoloġika. Studju reċenti ieħor uża scaffolds tal-idroġel fi pjattaforma mikrofluwidika u strutturi epiteljali intestinali mmudellati bl-użu ta' tekniki ta' inċiżjoni bil-lejżer. L-organojdi intestinali tal-ġrieden isegwu mudelli mnaqqxa biex jiffurmaw strutturi tubulari intestinali, u l-fluss ta' fluwidu intraluminali jista' jiġi rikapitulat bl-użu ta' modulu ta' mikrofluwidika. Madankollu, dan il-mudell la ma jurix proċessi morfoġenetiċi spontanei u lanqas ma jinkludi movimenti mekkanobijoloġiċi tal-imsaren. Tekniki tal-istampar 3D mill-istess grupp irnexxielhom joħolqu tubi żgħar tal-imsaren bi proċessi morfoġenetiċi spontanei. Minkejja l-fabbrikazzjoni kumplessa ta' segmenti differenti tal-imsaren fit-tubu, dan il-mudell jonqsu wkoll il-fluss tal-fluwidu luminali u d-deformazzjoni mekkanika. Barra minn hekk, l-operabbiltà tal-mudell tista' tkun limitata, speċjalment wara li jitlesta l-proċess tal-bijostampar, u dan ifixkel il-kundizzjonijiet sperimentali jew l-interazzjonijiet bejn iċ-ċellula u ċ-ċellula. Minflok, il-protokoll propost tagħna jipprovdi morfoġenesi spontanja tal-imsaren, stress shear fiżjoloġikament rilevanti, bijomekkanika li timita l-motilità tal-imsaren, aċċessibilità ta' kompartimenti apiċi u bażolaterali indipendenti, u ħolqien mill-ġdid ta' mikroambjenti bijoloġiċi kumplessi ta' modularità. Għalhekk, il-protokoll tal-morfoġenesi 3D in vitro tagħna jista' jipprovdi approċċ komplementari biex jingħelbu l-isfidi tal-metodi eżistenti.
Il-protokoll tagħna huwa ffukat kompletament fuq il-morfoġenesi epiteljali 3D, b'ċelloli epiteljali biss fil-kultura u l-ebda tip ieħor ta' ċelloli tal-madwar bħal ċelloli mesenkimali, ċelloli endoteljali, u ċelloli immuni. Kif deskritt qabel, il-qalba tal-protokoll tagħna hija l-induzzjoni tal-morfoġenesi epiteljali billi jitneħħew l-inibituri tal-morfogen imnixxija fin-naħa bażolaterali tal-mezz introdott. Filwaqt li l-modularità robusta tal-gut-on-a-chip u l-hybrid-on-a-chip tagħna tippermettilna nirrikreaw is-saff epiteljali 3D ondulanti, kumplessitajiet bijoloġiċi addizzjonali bħal interazzjonijiet epiteljali-mesenkimali33,34, depożizzjoni tal-Matriċi extraċellulari (ECM)35 u, fil-mudell tagħna, karatteristiċi tal-kript-villus li jwasslu niċeċ taċ-ċelloli staminali fil-kripti bażali għad iridu jiġu kkunsidrati aktar. Iċ-ċelloli stromali (eż., fibroblasti) fil-mesenkima għandhom rwol ewlieni fil-produzzjoni tal-proteini ECM u r-regolazzjoni tal-morfoġenesi intestinali in vivo35,37,38. Iż-żieda ta' ċelloli mesenkimali mal-mudell tagħna tejbet il-proċess morfoġenetiku. u l-effiċjenza tat-twaħħil taċ-ċelluli. Is-saff endoteljali (jiġifieri, kapillari jew limfatiċi) għandu rwol importanti fir-regolazzjoni tat-trasport molekulari39 u r-reklutaġġ taċ-ċelluli immuni40 fil-mikroambjent tal-musrana. Barra minn hekk, il-komponenti tal-vaskulatura li jistgħu jiġu konnessi bejn mudelli ta' tessuti huma prerekwiżit meta l-mudelli ta' tessuti jkunu ddisinjati biex juru interazzjonijiet bejn diversi organi. Għalhekk, iċ-ċelluli endoteljali jistgħu jeħtieġu li jiġu inklużi biex jimmudellaw karatteristiċi fiżjoloġiċi aktar preċiżi b'riżoluzzjoni fil-livell tal-organu. Iċ-ċelluli immuni derivati ​​mill-pazjent huma wkoll essenzjali biex juru risponsi immuni innati, preżentazzjoni tal-antiġeni, crosstalk immuni adattiv innat, u immunità speċifika għat-tessut fil-kuntest tal-imitazzjoni ta' mard intestinali.
L-użu ta' ċipep ibridi huwa aktar sempliċi minn gut-on-a-chip għaliex is-setup tal-apparat huwa aktar sempliċi u l-użu ta' inserzjonijiet Transwell jippermetti kultura skalabbli tal-epitelju tal-musrana. Madankollu, inserzjonijiet Transwell disponibbli kummerċjalment b'membrani tal-poliester mhumiex elastiċi u ma jistgħux jissimulaw movimenti peristaltiċi. Barra minn hekk, il-kompartiment apikali tal-inserzjoni Transwell imqiegħda fiċ-ċippa ibrida baqgħet stazzjonarja mingħajr stress shear fuq in-naħa apikali. Jidher ċar li l-proprjetajiet statiċi fil-kompartiment apikali rarament jippermettu ko-kultura batterjali fit-tul f'ċipep ibridi. Filwaqt li nistgħu ninduċu b'mod robust morfoġenesi 3D f'inserzjonijiet Transwell meta nużaw ċipep ibridi, in-nuqqas ta' bijomekkanika fiżjoloġikament rilevanti u fluss ta' fluwidu apikali jista' jillimita l-fattibbiltà ta' pjattaformi ta' ċipep ibridi għal applikazzjonijiet potenzjali.
Ir-rikostruzzjonijiet fuq skala sħiħa tal-assi kripto-villus uman f'kulturi gut-on-a-chip u hybrid-on-a-chip għadhom ma ġewx stabbiliti għalkollox. Peress li l-morfoġenesi tibda minn saff monoepiteljali, il-mikroarkitetturi 3D mhux neċessarjament jipprovdu similarità morfoloġika mal-kripti in vivo. Għalkemm ikkaratterizzajna l-popolazzjoni taċ-ċelluli li qed jipproliferaw ħdejn id-dominju tal-kripta bażali fl-epitelju 3D mikroinġinerizzat, ir-reġjuni tal-kripta u tal-villi ma kinux demarkati b'mod ċar. Għalkemm il-kanali ta' fuq ogħla fuq iċ-ċippa jwasslu għal żieda fl-għoli tal-epitelju mikroinġinerizzat, l-għoli massimu għadu limitat għal ~300–400 µm. Il-fond attwali tal-kripti intestinali umani fl-imsaren iż-żgħar u l-kbar huwa ~135 µm u ~400 µm, rispettivament, u l-għoli tal-villi intestinali ż-żgħar huwa ~600 µm41.
Mill-perspettiva tal-immaġini, l-immaġini in situ b'riżoluzzjoni superjuri ta' mikroarkitetturi 3D jistgħu jkunu limitati għall-imsaren fuq ċippa, peress li d-distanza tax-xogħol meħtieġa mil-lenti oġġettiva sas-saff epiteljali hija fl-ordni ta' ftit millimetri. Biex tingħeleb din il-problema, jista' jkun meħtieġ oġġettiv 'il bogħod. Barra minn hekk, it-tfassil ta' sezzjonijiet irqaq għall-preparazzjoni ta' kampjuni tal-immaġini huwa ta' sfida minħabba l-elastiċità għolja tal-PDMS. Barra minn hekk, peress li l-mikrofabbrikazzjoni saff b'saff tal-imsaren fuq ċippa tinvolvi adeżjoni permanenti bejn kull saff, huwa estremament ta' sfida li tiftaħ jew tneħħi s-saff ta' fuq biex teżamina l-istruttura tal-wiċċ tas-saff epiteljali. Pereżempju, bl-użu ta' mikroskopju elettroniku tal-iskannjar (SEM).
L-idrofobiċità tal-PDMS kienet fattur limitanti fi studji bbażati fuq il-mikrofluwidu li jittrattaw molekuli żgħar idrofobiċi, peress li l-PDMS jista' jassorbi b'mod mhux speċifiku molekuli idrofobiċi bħal dawn. Alternattivi għall-PDMS jistgħu jiġu kkunsidrati ma' materjali polimeriċi oħra. Alternattivament, il-modifika tal-wiċċ tal-PDMS (eż., kisi b'materjali lipofiliċi 42 jew poli(etilen glikol) 43) tista' tiġi kkunsidrata biex timminimizza l-assorbiment ta' molekuli idrofobiċi.
Fl-aħħar nett, il-metodu tagħna ma ġiex ikkaratterizzat sew f'termini ta' provvista ta' skrinjar b'rendiment għoli jew pjattaforma sperimentali "one-size-fits-all" faċli għall-utent. Il-protokoll attwali jeħtieġ pompa tas-siringa għal kull mikroapparat, li tieħu spazju f'inkubatur tas-CO2 u tipprevjeni esperimenti fuq skala kbira. Din il-limitazzjoni tista' titjieb b'mod sinifikanti bl-iskalabbiltà ta' formati ta' kultura innovattivi (eż., inserzjonijiet porużi ta' 24-bir, 96-bir, jew 384-bir li jippermettu riforniment u tneħħija kontinwa ta' mezzi bażolaterali).
Biex ninduċu l-morfoġenesi 3D tal-epitelju intestinali uman in vitro, użajna apparat intestinali b'ċippa mikrofluidika li fih żewġ mikrokanali paralleli u membrana poruża elastika bejniethom biex noħolqu interfaċċja lumen-kapillari. Nuru wkoll l-użu ta' apparat mikrofluidik b'kanal wieħed (ċippa ibrida) li jipprovdi fluss bażolaterali kontinwu taħt saffi epiteljali polarizzati mkabbra fuq inserzjonijiet Transwell. Fiż-żewġ pjattaformi, il-morfoġenesi ta' diversi ċelluli epiteljali intestinali umani tista' tiġi murija billi tiġi applikata manipulazzjoni direzzjonali tal-fluss biex jitneħħew antagonisti tal-morfoġenu mill-kompartiment bażolaterali. Il-proċedura sperimentali kollha (Figura 1) tikkonsisti f'ħames partijiet: (i) mikrofabbrikazzjoni taċ-ċippa tal-musrana jew iċ-ċippa ibrida li tista' tiddaħħal Transwell (passi 1-5; Kaxxa 1), (ii) preparazzjoni ta' ċelluli epiteljali intestinali (ċelluli Caco-2) jew organojdi intestinali umani; kaxxi 2-5), (iii) kultura ta' ċelloli epiteljali intestinali fuq ċipep intestinali jew ċipep ibridi (passi 6-9), (iv) induzzjoni ta' morfoġenesi 3D in vitro (pass 10) u (v)) biex tiġi kkaratterizzata l-mikrostruttura epiteljali 3D (passi 11-24). Fl-aħħar nett, ġie ddisinjat grupp ta' kontroll xieraq (diskuss aktar hawn taħt) biex jivvalida l-effettività tal-morfoġenesi in vitro billi jqabbel il-morfoġenesi epiteljali ma' kontrolli spazjali, temporali, kondizzjonali jew proċedurali.
Użajna żewġ pjattaformi ta' kultura differenti: gut-on-a-chip b'kanali dritti jew kanali konvoluti mhux lineari, jew ċipep ibridi li fihom inserzjonijiet Transwell (TW) f'apparat mikrofluwidiku, iffabbrikat kif deskritt fil-Kaxxa 1, u l-pass 1-5. "Fabbrikazzjoni tal-Apparat" turi l-passi ewlenin fil-manifattura ta' ċippa waħda jew ċippa ibrida. "Kultura taċ-Ċelloli Epiteljali Intestinali tal-Bniedem" tispjega s-sors taċ-ċellula (Caco-2 jew organojdi intestinali umani) u l-proċedura tal-kultura użata f'dan il-protokoll. "Morfoġenesi in vitro" turi l-passi ġenerali li fihom iċ-ċelloli epiteljali derivati ​​minn Caco-2 jew organojdi huma kkultivati ​​fuq ċippa intestinali jew fuq inserzjonijiet Transwell ta' ċippa ibrida, segwiti minn induzzjoni ta' morfoġenesi 3D u l-formazzjoni ta' struttura epiteljali kkaratterizzata. In-numru tal-pass tal-programm jew in-numru tal-kaxxa jintwera taħt kull vleġġa. L-applikazzjoni tipprovdi eżempji ta' kif saffi epiteljali intestinali stabbiliti jistgħu jintużaw, pereżempju, fil-karatterizzazzjoni tad-differenzjazzjoni taċ-ċelloli, studji tal-fiżjoloġija tal-imsaren, l-istabbiliment ta' ekosistemi tal-mikrobijoma ospitanti, u l-immudellar tal-mard. Immaġni ta' immunofluworexxenza f'"Ċellula "Differenzjazzjoni" li turi n-nuklei, l-F-actin u l-MUC2 espressi fis-saff epiteljali 3D Caco-2 iġġenerat fuq iċ-ċippa tal-musrana. Is-sinjalar tal-MUC2 huwa preżenti fiċ-ċelloli goblet u l-mukus imnixxi mill-uċuħ mukosali. Stampi fluworexxenti fil-Fiżjoloġija tal-Musrana juru mukus prodott bit-tbajja' għall-aċidu sjaliku u r-residwi tal-N-aċetilglukosamina bl-użu ta' agglutinina fluworexxenti tal-ġermi tal-qamħ. Iż-żewġ stampi li jikkoinċidu f'"Ko-Kulturi Ospitanti-Mikrobi" juru ko-kulturi rappreżentattivi tal-mikrobijoma ospitanti fl-imsaren fuq ċippa. Il-pannell tax-xellug juri l-ko-kultura ta' E. coli li tesprimi proteina fluworexxenti ħadra (GFP) b'ċelloli epiteljali 3D Caco-2 mikroinġinerija. Il-pannell tal-lemin juri l-lokalizzazzjoni tal-GFP E. coli kkultivata flimkien ma' ċelloli epiteljali 3D Caco-2, segwita minn tbajja' ta' immunofluworexxenza bl-F-actin (aħmar) u nuklei (blu). L-immudellar tal-mard juri musrana b'saħħitha kontra dik inixxi f'ċippijiet ta' infjammazzjoni tal-musrana taħt sfida fiżjoloġika b'antiġeni batteriċi (eż., lipopolisakkarid, LPS) u ċelloli immuni (eż., PBMC; aħdar). Iċ-ċelloli Caco-2 ġew ikkultivati ​​biex jiġi stabbilit saff epiteljali 3D. Bar tal-iskala, 50 µm. Stampi fir-ringiela t'isfel: “Differenzjazzjoni taċ-ċelloli” adattata bil-permess mir-referenza.2. Oxford University Press; Riprodott bil-permess mir-Ref.5. NAS; “Ko-Kultura bejn il-Mikrobi Ospitanti” adattata bil-permess mir-ref.3. NAS; “Immudellar tal-Mard” adattata bil-permess mir-referenza.5. NAS.
Kemm iċ-ċipep gut-on-chip kif ukoll dawk ibridi ġew iffabbrikati bl-użu ta' repliki tal-PDMS li tneħħew minn forom tas-silikon permezz ta' litografija ratba1,44 u ġew immudellati b'SU-8. Id-disinn tal-mikrokanali f'kull ċippa huwa determinat billi tiġi kkunsidrata l-idrodinamika bħall-istress shear u l-pressjoni idrodinamika1,4,12. Id-disinn oriġinali gut-on-a-chip (Data Estiża Fig. 1a), li kien jikkonsisti f'żewġ mikrokanali dritti paralleli mqiegħda ħdejn xulxin, evolva f'gut-on-a-chip kumpless (Data Estiża Fig. 1b) li jinkludi par ta' mikrokanali mgħawġa biex jinduċi ħin ta' residenza tal-fluwidu akbar, mudelli ta' fluss mhux lineari, u deformazzjoni multiaxial ta' ċelloli kkultivati ​​(Fig. 2a–f) 12. Meta jkun hemm bżonn li tinħoloq bijomekkanika tal-imsaren aktar kumplessa, jistgħu jintgħażlu gut-on-a-chips kumplessi. Aħna wrejna li l-Gut-Chip ikkumplikat jinduċi wkoll b'mod qawwi morfoġenesi 3D f'perjodu ta' żmien simili b'grad simili ta' tkabbir epiteljali meta mqabbel mal-oriġinali. Ċippa tal-imsaren, irrispettivament mit-tip ta' ċellula kkultivata. Għalhekk, biex tinduċi morfoġenesi 3D, disinji lineari u kumplessi tal-imsaren on-chip huma interkambjabbli. Repliki tal-PDMS imfejqa fuq forom tas-silikon b'mudelli SU-8 ipprovdew karatteristiċi negattivi wara t-tneħħija tal-iffurmar (Fig. 2a). Biex jiġi fabbrikat l-imsaren fuq ċippa, is-saff ta' fuq tal-PDMS ippreparat ġie mwaħħal sekwenzjalment ma' film poruż tal-PDMS u mbagħad allinjat mas-saff t'isfel tal-PDMS permezz ta' twaħħil irriversibbli bl-użu ta' trattattur tal-korona (Fig. 2b–f). Biex jiġu fabbrikati ċipep ibridi, repliki tal-PDMS imfejqa ġew imwaħħla ma' slajds tal-ħġieġ biex jinħolqu apparati mikrofluwidiċi b'kanal wieħed li jistgħu jakkomodaw inserzjonijiet Transwell (Fig. 2h u Dejta Estiża Fig. 2). Il-proċess ta' twaħħil jitwettaq billi jiġu ttrattati l-uċuħ tar-replika tal-PDMS u l-ħġieġ bi plażma tal-ossiġnu jew trattament bil-korona. Wara l-isterilizzazzjoni tal-apparat mikrofabbrikat imwaħħal mat-tubu tas-silikon, is-setup tal-apparat kien lest biex iwettaq morfoġenesi 3D tal-epitelju intestinali (Figura 2g).
a, Illustrazzjoni skematika tat-tħejjija ta' partijiet PDMS minn forom tas-silikon b'disinn SU-8. Is-soluzzjoni PDMS mhux vulkanizzata tferrgħet fuq moffa tas-silikon (xellug), vulkanizzata f'60 °C (nofs) u tneħħiet mill-moffa (lemin). Il-PDMS imneħħi mill-moffa nqata' f'biċċiet u tnaddaf għal użu ulterjuri. b, Ritratt tal-moffa tas-silikon użata biex tipprepara s-saff ta' fuq tal-PDMS. ċ, Ritratt tal-moffa tas-silikon użata biex tiġi fabbrikata l-membrana poruża tal-PDMS. d, Serje ta' ritratti tal-komponenti PDMS ta' fuq u t'isfel u l-apparat intestinali on-chip immuntat. e, Skematika tal-allinjament tal-komponenti PDMS ta' fuq, tal-membrana u t'isfel. Kull saff huwa magħqud b'mod irriversibbli permezz ta' trattament bil-plażma jew bil-korona. f, Skematika tal-apparat gut-on-a-chip iffabbrikat b'mikrokanali konvoluti superimposti u kmamar tal-vakwu. g, Twaqqif ta' gut-on-a-chip għal kultura ta' ċelluli mikrofluwidiċi. L-gut-on-a-chip iffabbrikat immuntat b'tubu tas-silikon u siringa tqiegħed fuq coverslip. L-apparat taċ-ċippa tqiegħed fuq l-għatu ta' dixx Petri ta' 150 mm għall-ipproċessar. Il-legatur jintuża biex jagħlaq it-tubu tas-silikon. h, Ritratti viżwali tal-fabbrikazzjoni taċ-ċippa ibrida u l-morfoġenesi 3D bl-użu ta' ċippijiet ibridi. Inserzjonijiet Transwell ippreparati b'mod indipendenti biex jikkultivaw monolayers 2D ta' ċelloli epiteljali intestinali ġew imdaħħla fiċ-ċippa ibrida biex jinduċu morfoġenesi 3D intestinali. Il-mezz huwa perfuż permezz ta' mikrokanali taħt is-saff taċ-ċelloli stabbilit fuq l-inserzjoni Transwell. Bar tal-iskala, 1 ċm. h Stampat mill-ġdid bil-permess mir-referenza. 4. Elsevier.
F'dan il-protokoll, il-linja taċ-ċelluli Caco-2 u l-organojdi intestinali ntużaw bħala sorsi epiteljali (Fig. 3a). Iż-żewġ tipi ta' ċelluli ġew ikkultivati ​​b'mod indipendenti (Kaxxa 2 u Kaxxa 5) u ntużaw biex jinżergħu l-mikrokanali miksija bl-ECM tal-imsaren on-chip jew inserzjonijiet Transwell. Meta ċ-ċelluli jkunu konfluwenti (kopertura ta' >95% fil-fliexken), iċ-ċelluli Caco-2 ikkultivati ​​b'mod rutinarju (bejn il-passaġġi 10 u 50) fi fliexken T jinġabru biex jiġu ppreparati sospensjonijiet ta' ċelluli dissoċjati permezz ta' fluwidu tat-tripsinizzazzjoni (kaxxa 2). Organojdi intestinali umani minn bijopsiji intestinali jew resezzjonijiet kirurġiċi ġew ikkultivati ​​f'koppli tal-scaffold Matrigel fi pjanċi ta' 24-well biex jappoġġjaw il-mikroambjent strutturali. Mezz li fih morfoġeni essenzjali (bħal Wnt, R-spondin, u Noggin) u fatturi tat-tkabbir ippreparati kif deskritt fil-Kaxxa 3 ġie supplimentat kull jumejn sakemm l-organojdi kibru għal ~500 µm fid-dijametru. Organojdi mkabbra għalkollox jinġabru u jinġabru f'ċelluli singoli għaż-żrigħ fuqhom. Inserzjonijiet tal-imsaren jew Transwell fuq ċippa (Kaxxa 5). Kif irrappurtajna qabel, jista' jiġi differenzjat skont it-tip ta' marda12,13 (eż. kolite ulċerattiva, marda ta' Crohn, kanċer kolorektali, jew donatur normali), is-sit tal-leżjoni (eż., leżjoni kontra żona mhux leża) u l-post gastrointestinali fil-passaġġ (eż., duodenu, jeġunu, ileum, ċekum, kolon, jew rettum). Aħna nipprovdu protokoll ottimizzat fil-Kaxxa 5 għall-kultivazzjoni ta' organojdi koloniċi (kolojdi) li tipikament jeħtieġu konċentrazzjonijiet ogħla ta' morfoġeni minn organojdi intestinali żgħar.
a, Fluss tax-xogħol għall-induzzjoni tal-morfoġenesi tal-musrana fiċ-ċippa tal-musrana. L-epitelju intestinali uman Caco-2 u l-organojdi intestinali jintużaw f'dan il-protokoll biex juru l-morfoġenesi 3D. Iċ-ċelloli epiteljali iżolati ġew miżrugħa fl-apparat gut-on-a-chip ippreparat (preparazzjoni taċ-ċippa). Ladarba ċ-ċelloli jkunu miżrugħa u mwaħħla mal-membrana poruża PDMS fil-jum 0 (D0), il-fluss apikali (AP) jinbeda u jinżamm għall-ewwel jumejn (fluss, AP, D0-D2). Il-fluss bażolaterali (BL) jinbeda wkoll flimkien ma' movimenti ċikliċi ta' tiġbid (tiġbid, fluss, AP u BL) meta jiġi ffurmat monolayer 2D komplut. Il-morfoġenesi intestinali 3D seħħet spontanjament wara 5 ijiem ta' kultura mikrofluwidika (morfoġenesi, D5). L-immaġini ta' kuntrast tal-fażi juru morfoloġija rappreżentattiva taċ-ċelloli Caco-2 f'kull pass sperimentali jew punt ta' żmien (graff bil-vireg, 100 µm). Erba' dijagrammi skematiċi li juru l-kaskati korrispondenti tal-morfoġenesi tal-musrana (fuq il-lemin). Il-vleġeġ imqattgħin Fl-iskema tirrappreżenta d-direzzjoni tal-fluss tal-fluwidu.b, Immaġni SEM li turi t-topoloġija tal-wiċċ tal-epitelju 3D Caco-2 stabbilit (xellug).L-inserzjoni li tenfasizza ż-żona ingrandita (kaxxa bajda bit-tikek) turi l-mikrovilli riġenerati fuq is-saff 3D Caco-2 (lemin).c, Veduta frontali orizzontali ta' Caco-2 3D stabbilit, claudin (ZO-1, aħmar) u membrani kontinwi tal-fruntiera tal-pinzell immarkati F-actin (aħdar) u nuklei (blu) Viżwalizzazzjoni konfokali ta' immunofluworexxenza taċ-ċelloli epiteljali fuq ċipep intestinali.Il-vleġeġ li jippuntaw lejn l-iskema tan-nofs jindikaw il-post tal-pjan fokali għal kull veduta konfokali.d, Kors taż-żmien tal-bidliet morfoloġiċi f'organojdi kkultivati ​​fuq ċippa miksuba permezz ta' mikroskopija ta' kuntrast tal-fażi fil-jiem 3, 7, 9, 11, u 13.L-inserzjoni (fuq il-lemin) turi l-ingrandiment għoli tal-immaġni pprovduta.e, Fotomikrografu DIC ta' epitelju 3D organoid stabbilit fl-imsaren fuq porzjon meħud fil-jum 7.f, Sovrappost Immaġnijiet ta' immunofluworexxenza li juru markaturi għal ċelloli staminali (LGR5; maġenta), ċelloli goblet (MUC2; aħdar), F-actin (griż) u nuklei (ċjan) imkabbra fuq ċipep tal-imsaren għal 3 ijiem, rispettivament (Xellug) u organojdi ta' 13-il jum (nofs) fuq is-saff epiteljali. Ara wkoll il-Figura 3 tad-Data Estiża, li tenfasizza s-sinjalar LGR5 mingħajr is-sinjalar MUC2. Immaġnijiet ta' fluworexxenza li juru l-mikrostruttura epiteljali (lemin) tal-epitelju organojde 3D stabbilit fl-imsaren fuq ċippa billi tittebba' l-membrana tal-plażma biż-żebgħa CellMask (lemin) fil-jum 13 tal-kultura. L-iskala hija 50 μm sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor. b Stampat mill-ġdid bil-permess mir-referenza. 2. Oxford University Press; c Adattat bil-permess mir-Referenza. 2. Oxford University Press; e u f adattati bil-permess mir-referenza. 12 Taħt il-Liċenzja Creative Commons CC BY 4.0.
Fl-imsaren fuq ċippa, huwa meħtieġ li jiġi modifikat il-wiċċ idrofobiku tal-membrana poruża tal-PDMS għal kisi ECM b'suċċess. F'dan il-protokoll, napplikaw żewġ metodi differenti biex nimmodifikaw l-idrofobiċità tal-membrani PDMS. Għall-kultivazzjoni taċ-ċelloli Caco-2, l-attivazzjoni tal-wiċċ permezz ta' trattament UV/ożonu waħedha kienet biżżejjed biex tnaqqas l-idrofobiċità tal-wiċċ tal-PDMS, tiksi l-ECM u twaħħal iċ-ċelloli Caco-2 mal-membrana PDMS. Madankollu, il-kultura mikrofluwidika tal-epitelju organoid teħtieġ funzjonalizzazzjoni tal-wiċċ ibbażata fuq il-kimiċi biex tinkiseb depożizzjoni effiċjenti tal-proteini ECM billi tapplika sekwenzjalment polyethyleneimine (PEI) u glutaraldehyde mal-mikrokanali PDMS. Wara l-modifika tal-wiċċ, il-proteini ECM ġew depożitati biex ikopru l-wiċċ funzjonalizzat tal-PDMS u mbagħad introdotti fl-epitelju organoid iżolat. Wara li ċ-ċelloli jkunu mwaħħla, il-kultura taċ-ċelloli mikrofluwidiċi tibda billi tipperfużjoni biss il-mezz fil-mikrokanal ta' fuq sakemm iċ-ċelloli jiffurmaw monolayer komplut, filwaqt li l-mikrokanal t'isfel iżomm kundizzjonijiet statiċi. Dan il-metodu ottimizzat għall-attivazzjoni tal-wiċċ u l-kisi ECM jippermetti t-twaħħil ta' organoidi epitelju biex jinduċi morfoġenesi 3D fuq il-wiċċ tal-PDMS.
Il-kulturi Transwell jeħtieġu wkoll kisi tal-ECM qabel iż-żrigħ taċ-ċelloli; madankollu, il-kulturi Transwell ma jeħtiġux passi kumplessi ta' pretrattament biex jattivaw il-wiċċ tal-inserzjonijiet porużi. Għat-tkabbir taċ-ċelloli Caco-2 fuq inserzjonijiet Transwell, il-kisi tal-ECM fuq inserzjonijiet porużi jaċċelera t-twaħħil taċ-ċelloli Caco-2 dissoċjati (<1 siegħa) u l-formazzjoni ta' barriera ta' ġunzjoni stretta (<1-2 ijiem). Biex jiġu kkultivati ​​organojdi fuq inserzjonijiet Transwell, organojdi iżolati jinżergħu fuq inserzjonijiet miksija bl-ECM, jitwaħħlu mal-wiċċ tal-membrana (<3 sigħat) u jinżammu sakemm l-organojdi jiffurmaw monolayer komplut b'integrità tal-barriera. Il-kulturi Transwell jitwettqu fi pjanċi ta' 24-well mingħajr l-użu ta' ċipep ibridi.
Il-morfoġenesi 3D in vitro tista' tinbeda billi jiġi applikat fluss ta' fluwidu fuq l-aspett bażolaterali ta' saff epiteljali stabbilit. Fl-imsaren fuq ċippa, il-morfoġenesi epiteljali bdiet meta l-mezz ġie perfuż fil-mikrokanali ta' fuq u ta' isfel (Fig. 3a). Kif deskritt qabel, huwa kritiku li jiġi introdott fluss ta' fluwidu fil-kompartiment inferjuri (bażolaterali) għat-tneħħija kontinwa ta' inibituri tal-morfoġenu sekretati direzzjonali. Biex nipprovdu nutrijenti u serum suffiċjenti liċ-ċelloli marbuta ma' membrani porużi u niġġeneraw stress ta' shear luminali, tipikament napplikaw fluss doppju fl-imsaren fuq ċippa. Fiċ-ċipep ibridi, inserzjonijiet Transwell li fihom saffi monoepiteljali ġew imdaħħla fiċ-ċipep ibridi. Imbagħad, il-mezz ġie applikat taħt in-naħa bażolaterali tal-inserzjoni poruża Transwell permezz tal-mikrokanal. Il-morfoġenesi intestinali seħħet 3-5 ijiem wara l-bidu tal-fluss bażolaterali fiż-żewġ pjattaformi tal-kultura.
Il-karatteristiċi morfoloġiċi tas-saffi epiteljali 3D mikroinġinerija jistgħu jiġu analizzati billi jiġu applikati diversi modalitajiet ta' immaġini, inkluż mikroskopija ta' kuntrast ta' fażi, mikroskopija ta' kuntrast ta' interferenza differenzjali (DIC), SEM, jew mikroskopija konfokali ta' immunofluworexxenza (Figuri 3 u 4). L-immaġini ta' kuntrast ta' fażi jew DIC jistgħu jsiru faċilment fi kwalunkwe ħin matul il-kultura biex jiġu mmonitorjati l-forma u l-protrużjoni tas-saffi epiteljali 3D. Minħabba t-trasparenza ottika tal-PDMS u l-films tal-poliester, kemm il-pjattaformi gut-on-a-chip kif ukoll dawk taċ-ċippa ibrida jistgħu jipprovdu immaġini in situ f'ħin reali mingħajr il-ħtieġa ta' sezzjoni jew żarmar tal-apparat. Meta titwettaq immaġini ta' immunofluworexxenza (Figuri 1, 3c, f u 4b, c), iċ-ċelloli tipikament jiġu ffissati b'4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), segwit minn Triton X-100 u 2% (wt/vol) albumina tas-serum bovin (BSA), f'din l-ordni. Skont it-tip ta' ċellula, jistgħu jintużaw fissattivi, permeabilizzaturi u aġenti ta' imblukkar differenti. Primarji Antikorpi li jimmiraw lejn markaturi taċ-ċelluli jew tar-reġjun dipendenti fuq il-linja jintużaw biex jenfasizzaw iċ-ċelluli immobilizzati in situ fuq iċ-ċippa, segwiti minn antikorpi sekondarji flimkien ma' żebgħa kontra t-tebgħa li timmira jew lejn in-nukleu (eż., 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) jew F-actin (eż., phalloidin immarkat b'mod fluworexxenti). Immaġini ħajjin ibbażati fuq il-fluworexxenza jistgħu jsiru wkoll in situ biex jinstabu l-produzzjoni tal-mukus (Fig. 1, "Differenzjazzjoni taċ-ċelluli" u "Fiżjoloġija tal-imsaren"), kolonizzazzjoni każwali ta' ċelluli mikrobjali (Fig. 1, "Ko-kultura bejn il-mikrobi ospitanti"), ir-reklutaġġ ta' ċelluli immuni (Fig. 1, 'Immudellar tal-Mard') jew il-kontorni tal-morfoloġija epiteljali 3D (Fig. 3c,f u 4b,c). Meta timmodifika l-imsaren fuq iċ-ċippa biex tissepara s-saff ta' fuq mis-saff t'isfel tal-mikrokanal, kif deskritt fir-ref. Kif muri fil-Fig. 2, il-morfoloġija epiteljali 3D kif ukoll il-mikrovilli fuq il-bordura apikali tal-pinzell jistgħu jiġu viżwalizzati permezz ta' SEM (Fig. 3b). L-espressjoni ta' markaturi ta' differenzjazzjoni tista' tiġi vvalutata billi titwettaq PCR5 kwantitattiva jew sekwenzar ta' RNA ta' ċellula waħda. F'dan il-każ, saffi 3D ta' ċelloli epiteljali mkabbra fi ċipep tal-imsaren jew ċipep ibridi jinġabru permezz ta' tripsinizzazzjoni u mbagħad jintużaw għal analiżi molekulari jew ġenetika.
a, Fluss tax-xogħol għall-induzzjoni tal-morfoġenesi intestinali f'ċippa ibrida. Caco-2 u organojdi intestinali jintużaw f'dan il-protokoll biex juru l-morfoġenesi 3D f'pjattaforma ta' ċippa ibrida. Ċelloli epiteljali dissoċjati ġew miżrugħa f'inserzjonijiet Transwell ippreparati (TW prep; ara l-figura hawn taħt). Ladarba ċ-ċelloli ġew miżrugħa (miżrugħa) u mwaħħla ma' membrani tal-poliester f'inserzjonijiet Transwell, iċ-ċelloli kollha ġew ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi (kultura TW). Wara 7 ijiem, inserzjoni Transwell waħda li fiha saff wieħed 2D ta' ċelloli epiteljali ġiet integrata f'ċippa ibrida biex tintroduċi fluss bażolaterali (Flow, BL), li fl-aħħar mill-aħħar wassal għall-ġenerazzjoni ta' saff epiteljali 3D (morfoġenesi). Mikrografi ta' kuntrast tal-fażi li juru karatteristiċi morfoloġiċi taċ-ċelloli epiteljali tal-organi umani derivati ​​minn kolon axxendenti ta' donatur normali (linja C103) f'kull pass sperimentali jew punt ta' żmien. L-iskemi fis-saffi ta' fuq juru l-konfigurazzjoni sperimentali għal kull pass. b, Ċipep ibridi (skema tax-xellug) jistgħu jwasslu għal morfoġenesi 3D ta' ċelloli epiteljali organojdi b'veduti ta' mikroskopija konfokali minn fuq għal isfel. Meħuda f'pożizzjonijiet Z differenti (ta' fuq, tan-nofs, u t'isfel; ara l-iskema tal-lemin u l-linji bit-tikek korrispondenti). urew karatteristiċi morfoloġiċi ovvji. F-actin (ċjan), nukleu (griż). c, Mikrografi konfokali tal-fluworexxenza (veduta angolata 3D) ta' ċelloli epiteljali derivati ​​minn organoids ikkultivati ​​fi Transwell statiku (TW; inserit f'kaxxa bajda bit-tikek) kontra ċippa ibrida (l-akbar xutt sħiħ) li jqabblu l-morfoloġija 2D ma' 3D, rispettivament. Par ta' veduti 2D vertikali b'qatgħa trasversali (inserit fir-rokna ta' fuq tal-lemin; "XZ") juru wkoll karatteristiċi 2D u 3D. Bar tal-iskala, 100 µm. c Stampat mill-ġdid bil-permess mir-referenza. 4. Elsevier.
Il-kontrolli jistgħu jiġu ppreparati billi jiġu kkultivati ​​l-istess ċelloli (Caco-2 jew ċelloli epiteljali organoidi intestinali) f'saffi monodimensjonali taħt kundizzjonijiet konvenzjonali ta' kultura statika. Notevolment, it-tnaqqis tan-nutrijenti jista' jirriżulta minħabba l-kapaċità limitata tal-volum tal-mikrokanali (jiġifieri ~4 µL fil-kanal ta' fuq fid-disinn oriġinali taċ-ċippa tal-imsaren). Għalhekk, il-morfoloġija epiteljali qabel u wara l-applikazzjoni tal-fluss bażolaterali tista' wkoll titqabbel.
Il-proċess tal-litografija ratba għandu jitwettaq f'kamra nadifa. Għal kull saff fuq iċ-ċippa (saffi ta' fuq u t'isfel u membrani) u ċipep ibridi, intużaw fotomaskri differenti u ġew iffabbrikati fuq wejfers tas-silikon separati minħabba li l-għoli tal-mikrokanali kien differenti. L-għoli fil-mira tal-mikrokanali ta' fuq u t'isfel tal-imsaren fuq iċ-ċippa huma 500 µm u 200 µm, rispettivament. L-għoli fil-mira tal-kanal taċ-ċippa ibrida huwa 200 µm.
Poġġi wejfer tas-silikon ta' 3 pulzieri f'dixx bl-aċetun. Dawwar il-pjanċa bil-mod għal 30 sekonda, imbagħad nixxef il-wejfer bl-arja. Ittrasferixxi l-wejfer għal pjanċa bl-IPA, imbagħad dawwar il-pjanċa għal 30 sekonda biex tnaddafha.
Soluzzjoni ta' piranha (taħlita ta' perossidu tal-idroġenu u aċidu sulfuriku kkonċentrat, 1:3 (vol/vol)) tista' tintuża b'mod fakultattiv biex timmassimizza t-tneħħija ta' residwi organiċi mill-wiċċ tal-wejfer tas-silikon.
Is-soluzzjoni Piranha hija estremament korrużiva u tiġġenera s-sħana. Huma meħtieġa prekawzjonijiet addizzjonali ta' sigurtà. Għar-rimi tal-iskart, ħalli s-soluzzjoni tiksaħ u ittrasferiha għal kontenitur tal-iskart nadif u niexef. Uża kontenituri sekondarji u ttikkettja sew il-kontenituri tal-iskart. Jekk jogħġbok segwi l-linji gwida tas-sigurtà tal-faċilità għal proċeduri aktar dettaljati.
Iddeidrata l-wejfers billi tpoġġihom fuq hot plate ta' 200 °C għal 10 minuti. Wara d-deidratazzjoni, il-wejfer tħawwad ħames darbiet fl-arja biex jiksaħ.
Ferra ~10 g ta' fotoreżista SU-8 2100 fiċ-ċentru tal-wejfer tas-silikon imnaddaf. Uża pinzetta biex tifrex il-fotoreżista b'mod uniformi fuq il-wejfer. Kultant poġġi l-wejfer fuq hot plate ta' 65°C biex il-fotoreżista tkun inqas twaħħal u aktar faċli biex tifrex. Tpoġġix il-wejfer direttament fuq il-hot plate.
SU-8 ġie mqassam b'mod uniformi fuq il-wejfer billi ġie mħaddem il-kisi tal-ispin. Ipprogramma rotazzjoni dieħla tal-SU-8 għal 5–10 s biex tippropaga b'500 rpm b'aċċelerazzjoni ta' 100 rpm/s. Issettja l-ispin prinċipali għal patterning ta' ħxuna ta' 200 µm għal 1,500 rpm, jew ikseb ħxuna ta' 250 µm (tagħmel għoli ta' 500 µm għas-saff ta' fuq tal-imsaren fuq iċ-ċippa; ara "Passi kritiċi" hawn taħt) issettjat għal aċċelerazzjoni ta' 300 rpm/s 30 sekonda b'1,200 rpm.
Il-veloċità ewlenija tal-ispin tista' tiġi aġġustata skont il-ħxuna fil-mira tal-mudell SU-8 fuq il-wejfer tas-silikon.
Biex jiġu fabbrikati mudelli SU-8 ta' 500 µm għoli għas-saff ta' fuq tal-imsaren fuq iċ-ċippa, il-passi ta' spin coating u soft bake ta' din il-Kaxxa (passi 7 u 8) ġew ripetuti sekwenzjalment (ara l-pass 9) biex jipproduċu żewġ saffi ta' 250 µm. Saff ħoxnin ta' SU-8, li jista' jiġi f'saffi u magħqud permezz ta' espożizzjoni għall-UV fil-pass 12 ta' din il-kaxxa, u b'hekk isir saff ta' 500 µm għoli.
Aħmi l-wejfers miksija b'SU-8 billi tpoġġihom bir-reqqa fuq pjanċa sħuna f'65 °C għal 5 minuti, imbagħad ibdel is-setting għal 95 °C u inkuba għal 40 minuta oħra.
Biex tikseb għoli ta' 500 μm tal-mudell SU-8 fil-mikrokanal ta' fuq, irrepeti l-passi 7 u 8 biex tiġġenera żewġ saffi SU-8 ta' 250 μm ħxuna.
Bl-użu tal-UV Mask Aligner, wettaq test tal-lampa skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur biex tikkalkula l-ħin ta' espożizzjoni tal-wejfer. (ħin ta' espożizzjoni, ms) = (doża ta' espożizzjoni, mJ/cm2)/(qawwa tal-lampa, mW/cm2).
Wara li tiddetermina l-ħin tal-espożizzjoni, poġġi l-fotomaskra fuq id-detentur tal-maskra tal-allinjatur tal-maskra UV u poġġi l-fotomaskra fuq il-wejfer miksi bis-SU-8.
Poġġi l-wiċċ stampat tal-fotomaskra direttament fuq in-naħa miksija bis-SU-8 tal-wejfer tas-silikon biex timminimizza t-tixrid tal-UV.
Esponi l-wejfer miksi b'SU-8 u l-fotomaskra vertikalment għal 260 mJ/cm2 ta' dawl UV għall-ħin ta' espożizzjoni predeterminat (ara l-pass 10 ta' din il-kaxxa).
Wara l-espożizzjoni għall-UV, wejfers tas-silikon miksija b'SU-8 ġew moħmija f'65°C għal 5 minuti u 95°C għal 15-il minuta fuq kull hot plate biex jiġu fabbrikati mudelli b'għoli ta' 200 μm. Estendi l-ħin ta' wara l-ħami f'95°C għal 30 minuta biex jiġu fabbrikati mudelli b'għoli ta' 500 µm.
L-iżviluppatur jitferra' ġo dixx tal-ħġieġ, u l-wejfer moħmi jitqiegħed fid-dixx. Il-volum tal-iżviluppatur SU-8 jista' jvarja skont id-daqs tal-pjanċa tal-ħġieġ. Kun żgur li tuża biżżejjed żviluppatur SU-8 biex tneħħi kompletament l-SU-8 mhux espost. Pereżempju, meta tuża dixx tal-ħġieġ b'dijametru ta' 150 mm b'kapaċità ta' 1 L, uża ~300 mL ta' żviluppatur SU-8. Żviluppa l-moffa għal 25 minuta b'rotazzjoni ġentili okkażjonali.
Laħlaħ il-moffa żviluppata b'madwar 10 mL ta' żviluppatur frisk segwit minn IPA billi tisprejja s-soluzzjoni bl-użu ta' pipetta.
Poġġi l-wejfer f'apparat tat-tindif tal-plażma u esponih għall-plażma tal-ossiġnu (gass atmosferiku, pressjoni fil-mira 1 × 10−5 Torr, qawwa 125 W) għal 1.5 minuti.
Poġġi l-wejfer f'dessikatur tal-vakwu b'pjastra tal-ħġieġ ġewwa. Il-wejfers u l-pjastri jistgħu jitqiegħdu ħdejn xulxin. Jekk id-dessikatur tal-vakwu huwa maqsum f'diversi saffi permezz ta' pjanċa, poġġi l-pjastri fil-kompartiment t'isfel u l-wejfers fil-kompartiment ta' fuq. Qattar 100 μL ta' soluzzjoni ta' trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane fuq pjastra tal-ħġieġ u applika vakwu għas-silanizzazzjoni.
Dewweb kunjett ta' ċelluli Caco-2 ffriżati f'banju tal-ilma ta' 37°C, imbagħad ittrasferixxi ċ-ċelluli mdewba għal flixkun T75 li fih 15 mL ta' mezz Caco-2 imsaħħan minn qabel f'37°C.
Biex tgħaddi ċ-ċelloli Caco-2 b'konfluwenza ta' ~90%, l-ewwel saħħan il-mezz Caco-2, PBS, u 0.25% trypsin/1 mM EDTA f'banju tal-ilma ta' 37°C.
Aspira l-mezz permezz ta' aspirazzjoni bil-vakwu. Aħsel iċ-ċelloli darbtejn b'5 mL ta' PBS sħun billi tirrepeti l-aspirazzjoni bil-vakwu u żżid PBS frisk.