ຂອບໃຈທີ່ທ່ານເຂົ້າມາຢ້ຽມຊົມ Nature.com. ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບລຸ້ນທີ່ທ່ານກຳລັງໃຊ້ຢູ່ມີການຮອງຮັບ CSS ທີ່ຈຳກັດ. ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer). ໃນລະຫວ່າງນີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະໜັບສະໜູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບ ແລະ JavaScript.
ຮູບຮ່າງຂອງລຳໄສ້ຂອງມະນຸດສ້າງລັກສະນະຂອງ crypt-villus ຂອງໂຄງສ້າງຈຸນລະພາກ epithelial 3D ແລະການຈັດລະບຽບພື້ນທີ່. ໂຄງສ້າງທີ່ເປັນເອກະລັກນີ້ແມ່ນຈຳເປັນເພື່ອຮັກສາ homeostasis ຂອງລຳໄສ້ໂດຍການປົກປ້ອງຊ່ອງຈຸລັງລຳຕົ້ນໃນ crypt ພື້ນຖານຈາກ antigens ຈຸລິນຊີພາຍນອກ ແລະ metabolites ຂອງມັນ. ນອກຈາກນັ້ນ, villi ລຳໄສ້ ແລະ ນໍ້າເມືອກທີ່ປ່ອຍອອກມານຳສະເໜີຈຸລັງ epithelial ທີ່ແຕກຕ່າງກັນທາງດ້ານໜ້າທີ່ດ້ວຍສິ່ງກີດຂວາງປ້ອງກັນຢູ່ເທິງໜ້າຜິວເຍື່ອເມືອກຂອງລຳໄສ້. ດັ່ງນັ້ນ, ການສ້າງໂຄງສ້າງ epithelial 3D ຄືນໃໝ່ແມ່ນມີຄວາມສຳຄັນຫຼາຍສຳລັບການກໍ່ສ້າງແບບຈຳລອງລຳໄສ້ໃນຫຼອດທົດລອງ. ໂດຍສະເພາະ, ລຳໄສ້ທີ່ຄ້າຍຄືກັບອິນຊີໃນຊິບສາມາດກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ແບບ spontaneous ຂອງ epithelium ລຳໄສ້ດ້ວຍໜ້າທີ່ທາງສະລີລະວິທະຍາ ແລະ ຊີວະກົນຈັກທີ່ດີຂຶ້ນ. ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາສະໜອງໂປໂຕຄອນທີ່ສາມາດສືບພັນໄດ້ເພື່ອກະຕຸ້ນ morphogenesis ລຳໄສ້ຢ່າງແຂງແຮງໃນລຳໄສ້ໃນຊິບ microfluidic ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໃນຊິບປະສົມທີ່ຝັງຢູ່ໃນ Transwell. ພວກເຮົາອະທິບາຍວິທີການລະອຽດສຳລັບການຜະລິດອຸປະກອນ, ການເພາະເລี้ยง Caco-2 ຫຼື ຈຸລັງ epithelial organoid ລຳໄສ້ໃນສະຖານທີ່ທຳມະດາ ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໃນເວທີ microfluidic, ການກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D, ແລະ ການວິເຄາະລັກສະນະຂອງເນື້ອເຍື່ອລຳໄສ້ແບບ 3 ມິຕິໂດຍໃຊ້ຮູບແບບການຖ່າຍພາບຫຼາຍຮູບແບບ. ໂປໂຕຄອນນີ້ບັນລຸການຟື້ນຟູໂຄງສ້າງຈຸລະພາກຂອງລຳໄສ້ທີ່ເຮັດວຽກໄດ້ໂດຍການຄວບຄຸມການໄຫຼຂອງນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງເປັນເວລາ 5 ມື້. ວິທີການສ້າງຮູບຮ່າງໃນຫຼອດທົດລອງຂອງພວກເຮົາໃຊ້ຄວາມກົດດັນຕັດ ແລະ ການເຄື່ອນໄຫວກົນຈັກທີ່ກ່ຽວຂ້ອງທາງສະລີລະວິທະຍາ ແລະ ບໍ່ຕ້ອງການວິສະວະກຳຈຸລັງ ຫຼື ການໝູນໃຊ້ທີ່ສັບສົນ, ເຊິ່ງອາດຈະດີກວ່າເຕັກນິກອື່ນໆທີ່ມີຢູ່ແລ້ວ. ພວກເຮົາຄາດຄະເນວ່າໂປໂຕຄອນທີ່ພວກເຮົາສະເໜີສາມາດມີຜົນສະທ້ອນຢ່າງກວ້າງຂວາງຕໍ່ຊຸມຊົນຄົ້ນຄວ້າທາງການແພດ, ໂດຍສະໜອງວິທີການຟື້ນຟູຊັ້ນເນື້ອເຍື່ອລຳໄສ້ແບບ 3 ມິຕິໃນຫຼອດທົດລອງສຳລັບການນຳໃຊ້ທາງດ້ານຊີວະວິທະຍາ, ທາງດ້ານການແພດ, ແລະ ການຢາ.
ການທົດລອງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸລັງ Caco-2 epithelial ລຳໄສ້ທີ່เพาะเลี้ยงໃນອຸປະກອນ gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ຫຼື bilayer microfluidic 6,7 ສາມາດເກີດ morphogenesis 3D spontaneous ໃນ vitro ໂດຍບໍ່ມີຄວາມເຂົ້າໃຈຢ່າງຈະແຈ້ງກ່ຽວກັບກົນໄກທີ່ຕິດພັນ. ໃນການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຂອງພວກເຮົາ, ພວກເຮົາພົບວ່າການກຳຈັດຕົວຕ້ານ morphogen ທີ່ຫຼั่งອອກມາທາງ basolateral ອອກຈາກອຸປະກອນเพาะเลี้ยงແມ່ນມີຄວາມຈຳເປັນ ແລະ ພຽງພໍທີ່ຈະກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D epithelial ໃນ vitro, ເຊິ່ງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນໂດຍ Caco-2 ແລະ organoids ລຳໄສ້ທີ່ມາຈາກຄົນເຈັບ. ຈຸລັງ Epithelial ໄດ້ຮັບການຢັ້ງຢືນ. ໃນການສຶກສາຄັ້ງນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ການຜະລິດຈຸລັງ ແລະ ການແຈກຢາຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຕົວຕ້ານ Wnt ທີ່ມີປະສິດທິພາບ, Dickkopf-1 (DKK-1), ໃນອຸປະກອນ microfluidic ທີ່ຖືກດັດແປງໃນລຳໄສ້ທີ່ມີຕົວແຊກ Transwell, ເອີ້ນວ່າ "Hybrid Chip". ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການເພີ່ມຕົວຕ້ານ Wnt ຈາກພາຍນອກ (ເຊັ່ນ DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, ຫຼື Soggy-1) ໃສ່ລຳໄສ້ໃນຊິບຍັບຍັ້ງ morphogenesis ຫຼື ລົບກວນຊັ້ນ epithelial 3D ທີ່ມີໂຄງສ້າງລ່ວງໜ້າ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມກົດດັນຕົວຕ້ານໃນລະຫວ່າງການเพาะเลี้ยงແມ່ນສາເຫດຂອງ morphogenesis ລຳໄສ້ໃນ vitro. ດັ່ງນັ້ນ, ວິທີການປະຕິບັດເພື່ອບັນລຸ morphogenesis ທີ່ແຂງແຮງຢູ່ທີ່ໜ້າຕ່າງ epithelial ແມ່ນການກຳຈັດ ຫຼື ຮັກສາລະດັບຂອງຕົວຕ້ານ Wnt ໃນຊ່ອງ basolateral ໂດຍການລ້າງຢ່າງຫ້າວຫັນ (ເຊັ່ນ, ໃນເວທີ gut-on-a-chip ຫຼື hybrid-on-a-chip) ຫຼື ການແຜ່ກະຈາຍ. ສື່ Basolateral (ເຊັ່ນ, ຈາກ Transwell ໃສ່ໃນອ່າງເກັບນ້ຳ basolateral ຂະໜາດໃຫຍ່ໃນ ບໍ່ນ້ຳ).
ໃນໂປໂຕຄອນນີ້, ພວກເຮົາສະໜອງວິທີການລະອຽດສຳລັບການຜະລິດອຸປະກອນຈຸລະພາກໃນລຳໄສ້ ແລະ ຊິບປະສົມທີ່ສາມາດໃສ່ໄດ້ຜ່ານ Transwell (ຂັ້ນຕອນທີ 1-5) ເພື່ອเพาะเลี้ยงຈຸລັງ epithelial ລຳໄສ້ໃນເຍື່ອທີ່ມີຮູພຸນທີ່ອີງໃສ່ polydimethylsiloxane (PDMS) (ຂັ້ນຕອນທີ 6A, 7A, 8, 9) ຫຼື ເຍື່ອ polyester ຂອງ Transwell inserts (ຂັ້ນຕອນທີ 6B, 7B, 8, 9) ແລະ ກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ໃນ vitro (ຂັ້ນຕອນທີ 10). ພວກເຮົາຍັງໄດ້ລະບຸລັກສະນະຂອງຈຸລັງ ແລະ ໂມເລກຸນທີ່ຊີ້ບອກເຖິງ histogenesis ສະເພາະຂອງເນື້ອເຍື່ອ ແລະ ການຈຳແນກຈຸລັງທີ່ຂຶ້ນກັບເຊື້ອສາຍໂດຍການນຳໃຊ້ຮູບແບບການຖ່າຍພາບຫຼາຍຮູບແບບ (ຂັ້ນຕອນທີ 11-24). ພວກເຮົາກະຕຸ້ນ morphogenesis ໂດຍໃຊ້ຈຸລັງ epithelial ລຳໄສ້ຂອງມະນຸດ, ເຊັ່ນ Caco-2 ຫຼື organoids ລຳໄສ້, ໃນສອງຮູບແບບການเพาะเลี้ยงທີ່ມີລາຍລະອຽດດ້ານວິຊາການລວມທັງການດັດແປງພື້ນຜິວຂອງເຍື່ອທີ່ມີຮູພຸນ, ການສ້າງ monolayers 2D, ແລະ ຊີວະເຄມີລຳໄສ້ ແລະ ການສືບພັນຂອງສະພາບແວດລ້ອມຊີວະກົນຈັກ. ໃນ vitro. ເພື່ອກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ຈາກ 2D ຊັ້ນ epithelial monolayers, ພວກເຮົາໄດ້ກຳຈັດຕົວຕ້ານ morphogen ໃນທັງສອງຮູບແບບທີ່เพาะเลี้ยงໂດຍການໄຫຼຕົວກາງເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ basolateral ຂອງການเพาะเลี้ยง. ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາສະໜອງການສະແດງເຖິງຜົນປະໂຫຍດຂອງຊັ້ນ epithelial 3D ທີ່ສາມາດຟື້ນຟູໄດ້ ເຊິ່ງສາມາດນຳໃຊ້ເພື່ອສ້າງແບບຈຳລອງການເຕີບໂຕຂອງ epithelial ທີ່ຂຶ້ນກັບ morphogen, ການเพาะเลี้ยงຮ່ວມຂອງຈຸລິນຊີເຈົ້າພາບຕາມລວງຍາວ, ການຕິດເຊື້ອຂອງເຊື້ອພະຍາດ, ການບາດເຈັບຈາກການອັກເສບ, ຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງສິ່ງກີດຂວາງ epithelial, ແລະ ການປິ່ນປົວດ້ວຍໂປຣໄບໂອຕິກ ຕົວຢ່າງ. ອິດທິພົນ.
ໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາອາດຈະເປັນປະໂຫຍດຕໍ່ນັກວິທະຍາສາດຫຼາກຫຼາຍໃນດ້ານພື້ນຖານ (ເຊັ່ນ: ຊີວະວິທະຍາຂອງເຍື່ອເມືອກລຳໄສ້, ຊີວະວິທະຍາຂອງຈຸລັງລຳຕົ້ນ, ແລະ ຊີວະວິທະຍາການພັດທະນາ) ແລະ ການຄົ້ນຄວ້າປະຍຸກ (ເຊັ່ນ: ການທົດສອບຢາກ່ອນການທົດລອງທາງຄລີນິກ, ການສ້າງແບບຈຳລອງພະຍາດ, ວິສະວະກຳເນື້ອເຍື່ອ, ແລະ ພະຍາດກະເພາະອາຫານ). ເນື່ອງຈາກຄວາມສາມາດໃນການສືບພັນ ແລະ ຄວາມແຂງແຮງຂອງໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາເພື່ອກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ຂອງ epithelium ລຳໄສ້ໃນຫຼອດທົດລອງ, ພວກເຮົາຄາດຫວັງວ່າຍຸດທະສາດດ້ານວິຊາການຂອງພວກເຮົາສາມາດເຜີຍແຜ່ໃຫ້ກັບຜູ້ຊົມທີ່ສຶກສາການເຄື່ອນໄຫວຂອງສັນຍານຂອງຈຸລັງໃນລະຫວ່າງການພັດທະນາຂອງລຳໄສ້, ການຟື້ນຟູ ຫຼື homeostasis. ນອກຈາກນັ້ນ, ໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາແມ່ນເປັນປະໂຫຍດສຳລັບການສອບສວນການຕິດເຊື້ອພາຍໃຕ້ຕົວແທນຕິດເຊື້ອຕ່າງໆເຊັ່ນ: Norovirus 8, ໂຣກລະບົບຫາຍໃຈສ້ວຍແຫຼມຮຸນແຮງ Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ຫຼື Vibrio cholerae. ການວິເຄາະພະຍາດວິທະຍາ ແລະ ການເກີດພະຍາດກໍ່ເປັນປະໂຫຍດເຊັ່ນກັນ. ການນໍາໃຊ້ລະບົບຈຸລະພາກສະລີລະວິທະຍາຂອງລໍາໄສ້ໃນຊິບອາດຈະຊ່ວຍໃຫ້ມີການຮ່ວມມືກັນຕາມລວງຍາວ 10 ແລະ ການປະເມີນຕໍ່ມາຂອງການປ້ອງກັນຂອງເຈົ້າພາບ, ການຕອບສະໜອງຂອງພູມຕ້ານທານ ແລະ ການສ້ອມແປງການບາດເຈັບທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບເຊື້ອພະຍາດໃນລະບົບຍ່ອຍອາຫານ (GI) 11. ຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງລະບົບຍ່ອຍອາຫານອື່ນໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບໂຣກລໍາໄສ້ຮົ່ວ, ພະຍາດ celiac, ພະຍາດ Crohn, ພະຍາດ ulcerative colitis, pouchitis, ຫຼື ໂຣກລໍາໄສ້ລະຄາຍເຄືອງສາມາດຈໍາລອງໄດ້ເມື່ອຊັ້ນ epithelial ຂອງລໍາໄສ້ 3D ຖືກກະກຽມໂດຍໃຊ້ຊັ້ນ epithelial ຂອງລໍາໄສ້ 3D ຂອງຄົນເຈັບ, ພະຍາດເຫຼົ່ານີ້ລວມມີການຫົດຕົວຂອງ villous, ການຫົດຕົວຂອງ crypt, ຄວາມເສຍຫາຍຂອງເຍື່ອເມືອກ, ຫຼື ສິ່ງກີດຂວາງ epithelial ທີ່ບົກຜ່ອງ. Biopsy ຫຼື organoids ລໍາໄສ້ທີ່ມາຈາກ stem cell12,13. ເພື່ອສ້າງແບບຈໍາລອງທີ່ດີຂຶ້ນກ່ຽວກັບຄວາມສັບສົນທີ່ສູງຂຶ້ນຂອງສະພາບແວດລ້ອມຂອງພະຍາດ, ຜູ້ອ່ານອາດຈະພິຈາລະນາເພີ່ມປະເພດຈຸລັງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດ, ເຊັ່ນ: ຈຸລັງ mononuclear ເລືອດຂອງຄົນເຈັບ (PBMCs), ໃສ່ກັບແບບຈໍາລອງທີ່ມີ microarchitectures villus-crypt ລໍາໄສ້ 3D. ຈຸລັງພູມຕ້ານທານສະເພາະເນື້ອເຍື່ອ, 5.
ເນື່ອງຈາກໂຄງສ້າງຈຸນລະພາກຂອງເນື້ອເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງແບບ 3 ມິຕິສາມາດແກ້ໄຂ ແລະ ເບິ່ງພາບໄດ້ໂດຍບໍ່ຕ້ອງໃຊ້ຂະບວນການຕັດ, ຜູ້ຊົມທີ່ເຮັດວຽກກ່ຽວກັບ transcriptomics ທາງພື້ນທີ່ ແລະ ການຖ່າຍພາບທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງ ຫຼື ຄວາມລະອຽດສູງອາດຈະສົນໃຈໃນການສ້າງແຜນທີ່ການເຄື່ອນໄຫວທາງພື້ນທີ່ ແລະ ເວລາຂອງເຊື້ອພັນ ແລະ ໂປຣຕີນໃນຊ່ອງເນື້ອເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ. ສົນໃຈເຕັກໂນໂລຢີ. ການຕອບສະໜອງຕໍ່ການກະຕຸ້ນຂອງຈຸລິນຊີ ຫຼື ພູມຕ້ານທານ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ການສື່ສານລະຫວ່າງເຈົ້າພາບ ແລະ ຈຸລິນຊີຕາມລວງຍາວ 10, 14 ທີ່ປະສານງານ homeostasis ຂອງລຳໄສ້ສາມາດສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນຊັ້ນເຍື່ອເມືອກລຳໄສ້ແບບ 3 ມິຕິໂດຍການຮ່ວມລ້ຽງຊະນິດຈຸລິນຊີຕ່າງໆ, ຊຸມຊົນຈຸລິນຊີ ຫຼື ຈຸລິນຊີອາຈົມ, ໂດຍສະເພາະໃນລຳໄສ້ທີ່ຢູ່ໃນຊິບ. ໃນເວທີ. ວິທີການນີ້ແມ່ນໜ້າສົນໃຈໂດຍສະເພາະສຳລັບຜູ້ຊົມທີ່ສຶກສາກ່ຽວກັບພູມຕ້ານທານເຍື່ອເມືອກ, ພະຍາດກະເພາະອາຫານ, ຈຸລິນຊີຂອງມະນຸດ, ວິທະຍາສາດວັດທະນະທຳ ແລະ ຈຸລິນຊີວິທະຍາທາງດ້ານຄລີນິກທີ່ຊອກຫາການປູກຝັງຈຸລິນຊີໃນລຳໄສ້ທີ່ບໍ່ເຄີຍມີມາກ່ອນໃນຫ້ອງທົດລອງ. ຖ້າໂປໂຕຄອນ morphogenesis ໃນຫຼອດທົດລອງຂອງພວກເຮົາສາມາດປັບຕົວເຂົ້າກັບຮູບແບບການເພາະເລี้ยงທີ່ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້, ເຊັ່ນ: ການໃສ່ຫຼາຍຮູໃນແຜ່ນ 24, 96 ຫຼື 384 ຮູທີ່ເຕີມເຕັມຊ່ອງ basolateral ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ໂປໂຕຄອນຍັງສາມາດເຜີຍແຜ່ໃຫ້ກັບຜູ້ທີ່ພັດທະນາເວທີການກວດສອບ ຫຼື ການຢັ້ງຢືນຢາ, ຊີວະແພດ ຫຼື ປະສິດທິພາບສູງສຳລັບອຸດສາຫະກຳອາຫານ. ໃນຖານະເປັນຫຼັກຖານຂອງຫຼັກການ, ບໍ່ດົນມານີ້ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງລະບົບ morphogenesis ຫຼາຍຮູທີ່ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ເປັນຮູບແບບແຜ່ນ 24 ຮູ. ນອກຈາກນັ້ນ, ຜະລິດຕະພັນຫຼາຍອະໄວຍະວະໃນຊິບໄດ້ຖືກນຳມາຂາຍທາງການຄ້າ16,17,18. ດັ່ງນັ້ນ, ການຢັ້ງຢືນວິທີການ morphogenesis ໃນຫຼອດທົດລອງຂອງພວກເຮົາສາມາດເລັ່ງ ແລະ ມີທ່າແຮງທີ່ຈະຮັບຮອງເອົາໂດຍຫ້ອງທົດລອງຄົ້ນຄວ້າຫຼາຍແຫ່ງ, ອຸດສາຫະກຳ ຫຼື ລັດຖະບານ ແລະ ອົງການຄຸ້ມຄອງເພື່ອເຂົ້າໃຈການຂຽນໂປຣແກຣມໃໝ່ຂອງເຊວຂອງ morphogenesis ລຳໄສ້ໃນຫຼອດທົດລອງໃນລະດັບ transcriptomic ເພື່ອທົດສອບຢາ ຫຼື ການປິ່ນປົວດ້ວຍທາງຊີວະພາບ ການດູດຊຶມ ແລະ ການຂົນສົ່ງຢາທີ່ຖືກຄັດເລືອກໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ຕົວແທນລຳໄສ້ແບບ 3 ມິຕິ ຫຼື ການໃຊ້ແບບຈຳລອງອະໄວຍະວະທີ່ກຳນົດເອງ ຫຼື ແບບຈຳລອງອະໄວຍະວະໃນຊິບທາງການຄ້າເພື່ອປະເມີນຄວາມສາມາດໃນການຜະລິດຊ້ຳໄດ້ຂອງຂະບວນການສ້າງຮູບຮ່າງຂອງລຳໄສ້.
ຮູບແບບການທົດລອງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບມະນຸດຈຳນວນຈຳກັດໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອສຶກສາຮູບຮ່າງຂອງເນື້ອເຍື່ອລຳໄສ້, ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຍ້ອນການຂາດໂປໂຕຄອນທີ່ສາມາດນຳໃຊ້ໄດ້ເພື່ອກະຕຸ້ນຮູບຮ່າງ 3D ໃນຫຼອດທົດລອງ. ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ຄວາມຮູ້ໃນປະຈຸບັນສ່ວນໃຫຍ່ກ່ຽວກັບຮູບຮ່າງຂອງລຳໄສ້ແມ່ນອີງໃສ່ການສຶກສາສັດ (ເຊັ່ນ: zebrafish20, ໜູ21 ຫຼື ໄກ່22). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ພວກມັນໃຊ້ແຮງງານ ແລະ ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍຫຼາຍ, ສາມາດມີຄວາມສົງໄສດ້ານຈັນຍາບັນ, ແລະ ສິ່ງທີ່ສຳຄັນທີ່ສຸດ, ບໍ່ໄດ້ກຳນົດຂະບວນການພັດທະນາຂອງມະນຸດຢ່າງແນ່ນອນ. ຮູບແບບເຫຼົ່ານີ້ຍັງມີຂໍ້ຈຳກັດຫຼາຍໃນຄວາມສາມາດໃນການທົດສອບໃນລັກສະນະທີ່ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ຫຼາຍທາງ. ດັ່ງນັ້ນ, ໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາສຳລັບການຟື້ນຟູໂຄງສ້າງເນື້ອເຍື່ອ 3D ໃນຫຼອດທົດລອງມີປະສິດທິພາບດີກວ່າຮູບແບບສັດໃນຮ່າງກາຍ ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຮູບແບບການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ 2D ແບບຄົງທີ່ແບບດັ້ງເດີມອື່ນໆ. ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້, ການນໍາໃຊ້ໂຄງສ້າງເນື້ອເຍື່ອ 3D ຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາສາມາດກວດສອບການຕັ້ງຖິ່ນຖານທາງພື້ນທີ່ຂອງຈຸລັງທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນແກນ crypt-villus ໃນການຕອບສະໜອງຕໍ່ການກະຕຸ້ນຂອງເຍື່ອເມືອກ ຫຼື ພູມຕ້ານທານຕ່າງໆ. ຊັ້ນເນື້ອເຍື່ອ 3D ສາມາດສະໜອງພື້ນທີ່ເພື່ອສຶກສາວິທີທີ່ຈຸລັງຈຸລິນຊີແຂ່ງຂັນກັນເພື່ອສ້າງຊ່ອງວ່າງທາງພື້ນທີ່ ແລະ ວິວັດທະນາການທາງນິເວດວິທະຍາໃນການຕອບສະໜອງຕໍ່ປັດໄຈເຈົ້າພາບ (ເຊັ່ນ: ຊັ້ນໃນທຽບກັບຊັ້ນນອກຂອງນໍ້າເມືອກ, ການຫຼั่งຂອງ IgA ແລະ peptides ຕ້ານເຊື້ອຈຸລິນຊີ). ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ຮູບຮ່າງຂອງ epithelial 3D ສາມາດຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາເຂົ້າໃຈວ່າຈຸລິນຊີໃນລຳໄສ້ສ້າງໂຄງສ້າງຊຸມຊົນຂອງມັນແນວໃດ ແລະ ຜະລິດສານ metabolites ຂອງຈຸລິນຊີຮ່ວມກັນ (ເຊັ່ນ: ກົດໄຂມັນຕ່ອງໂສ້ສັ້ນ) ທີ່ສ້າງຮູບຮ່າງຂອງອົງກອນຈຸລັງ ແລະ niches ຂອງຈຸລັງລໍາຕົ້ນໃນ crypts ພື້ນຖານ. ລັກສະນະເຫຼົ່ານີ້ສາມາດສະແດງໃຫ້ເຫັນໄດ້ເມື່ອຊັ້ນ epithelial 3D ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນ vitro.
ນອກເໜືອໄປຈາກວິທີການຂອງພວກເຮົາໃນການສ້າງໂຄງສ້າງ epithelial ລຳໄສ້ແບບ 3 ມິຕິ, ຍັງມີວິທີການໃນຫຼອດທົດລອງຫຼາຍຢ່າງ. ການເພາະເລี้ยงອະໄວຍະວະລຳໄສ້ແມ່ນເຕັກນິກວິສະວະກຳເນື້ອເຍື່ອທີ່ທັນສະໄໝໂດຍອີງໃສ່ການປູກຝັງຈຸລັງລຳຕົ້ນຂອງລຳໄສ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ morphogen ສະເພາະ 23,24,25. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການນໍາໃຊ້ຮູບແບບອະໄວຍະວະ 3 ມິຕິສໍາລັບການວິເຄາະການຂົນສົ່ງ ຫຼື ການຮ່ວມວັດທະນະທໍາລະຫວ່າງເຈົ້າພາບ ແລະ ຈຸລິນຊີມັກຈະເປັນສິ່ງທ້າທາຍເພາະວ່າ lumen ຂອງລຳໄສ້ຖືກປິດລ້ອມຢູ່ພາຍໃນ organoid ແລະ ດັ່ງນັ້ນ, ການນໍາສະເຫນີອົງປະກອບ luminal ເຊັ່ນ: ຈຸລັງຈຸລິນຊີ ຫຼື ແອນຕິເຈນພາຍນອກແມ່ນມີຈໍາກັດ. ການເຂົ້າເຖິງ lumens organoid ສາມາດປັບປຸງໄດ້ໂດຍໃຊ້ microinjector, 26,27 ແຕ່ວິທີການນີ້ແມ່ນການຮຸກຮານ ແລະ ໃຊ້ແຮງງານຫຼາຍ ແລະ ຕ້ອງການຄວາມຮູ້ພິເສດເພື່ອປະຕິບັດ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ວັດທະນະທໍາ organoid ແບບດັ້ງເດີມທີ່ຮັກສາໄວ້ໃນ scaffolds hydrogel ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຄົງທີ່ບໍ່ໄດ້ສະທ້ອນເຖິງກົນໄກຊີວະພາບທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວຢ່າງຖືກຕ້ອງ.
ວິທີການອື່ນໆທີ່ກຸ່ມຄົ້ນຄວ້າຫຼາຍກຸ່ມນຳໃຊ້ໂຄງສ້າງໄຮໂດຣເຈວ 3D ທີ່ມີໂຄງສ້າງລ່ວງໜ້າເພື່ອຮຽນແບບໂຄງສ້າງ epithelial ລຳໄສ້ໂດຍການເພາະເລี้ยงຈຸລັງລຳໄສ້ຂອງມະນຸດທີ່ໂດດດ່ຽວຢູ່ເທິງໜ້າຜິວເຈວ. ຜະລິດໂຄງສ້າງໄຮໂດຣເຈວໂດຍໃຊ້ແມ່ພິມ 3D, ພິມດ້ວຍຈຸນລະພາກ, ຫຼືຜະລິດດ້ວຍຮູບແບບ lithographic. ວິທີການນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການຈັດລຽງທີ່ຈັດລຽງດ້ວຍຕົນເອງຂອງຈຸລັງ epithelial ທີ່ໂດດດ່ຽວໃນຫຼອດທົດລອງທີ່ມີການປັບປ່ຽນ morphogen ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງທາງສະລີລະວິທະຍາ, ສ້າງໂຄງສ້າງ epithelial ອັດຕາສ່ວນສູງ ແລະ crosstalk stroma-epithelial ໂດຍການລວມເອົາຈຸລັງ stromal ໃນໂຄງສ້າງ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ລັກສະນະຂອງໂຄງສ້າງລ່ວງໜ້າອາດຈະປ້ອງກັນການສະແດງຂອງຂະບວນການ morphogenetic ແບບ spontaneous ເອງ. ຮູບແບບເຫຼົ່ານີ້ຍັງບໍ່ໄດ້ໃຫ້ການໄຫຼວຽນຂອງ luminal ຫຼື interstitial ແບບເຄື່ອນໄຫວ, ຂາດຄວາມກົດດັນຂອງນ້ຳທີ່ຈຸລັງລຳໄສ້ຕ້ອງຜ່ານ morphogenesis ແລະໄດ້ຮັບການທຳງານທາງສະລີລະວິທະຍາ. ການສຶກສາອີກອັນໜຶ່ງທີ່ຜ່ານມາໄດ້ໃຊ້ໂຄງສ້າງໄຮໂດຣເຈວໃນເວທີ microfluidic ແລະໂຄງສ້າງ epithelial ລຳໄສ້ທີ່ມີຮູບແບບໂດຍໃຊ້ເຕັກນິກການແກະສະຫຼັກດ້ວຍເລເຊີ. organoids ລຳໄສ້ໜູປະຕິບັດຕາມຮູບແບບແກະສະຫຼັກເພື່ອສ້າງໂຄງສ້າງທໍ່ລຳໄສ້, ແລະກະແສນ້ຳພາຍໃນ luminal ສາມາດ recapitulated ໂດຍໃຊ້ ໂມດູນຈຸລະພາກການໄຫຼວຽນ. ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຮູບແບບນີ້ບໍ່ໄດ້ສະແດງຂະບວນການ morphogenetic ແບບ spontaneous ແລະ ບໍ່ລວມເອົາການເຄື່ອນໄຫວກົນຈັກຂອງລຳໄສ້. ເຕັກນິກການພິມ 3D ຈາກກຸ່ມດຽວກັນສາມາດສ້າງທໍ່ລຳໄສ້ຂະໜາດນ້ອຍທີ່ມີຂະບວນການ morphogenetic ແບບ spontaneous. ເຖິງວ່າຈະມີການຜະລິດທີ່ສັບສົນຂອງສ່ວນລຳໄສ້ທີ່ແຕກຕ່າງກັນພາຍໃນທໍ່, ຮູບແບບນີ້ຍັງຂາດການໄຫຼຂອງນ້ຳໃນ luminal ແລະ ການຜິດຮູບກົນຈັກ. ນອກຈາກນັ້ນ, ການເຮັດວຽກຂອງຮູບແບບອາດຈະມີຂໍ້ຈຳກັດ, ໂດຍສະເພາະຫຼັງຈາກຂະບວນການພິມຊີວະພາບສຳເລັດແລ້ວ, ເຊິ່ງລົບກວນເງື່ອນໄຂການທົດລອງ ຫຼື ການພົວພັນລະຫວ່າງຈຸລັງກັບຈຸລັງ. ແທນທີ່ຈະ, ໂປໂຕຄອນທີ່ພວກເຮົາສະເໜີໃຫ້ morphogenesis ລຳໄສ້ແບບ spontaneous, ຄວາມກົດດັນ shear ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງທາງສະລີລະວິທະຍາ, ຊີວະກົນຈັກທີ່ຄ້າຍຄືກັບການເຄື່ອນໄຫວຂອງລຳໄສ້, ການເຂົ້າເຖິງຊ່ອງ apical ແລະ basolateral ເອກະລາດ, ແລະ ການສ້າງສະພາບແວດລ້ອມທາງຊີວະພາບຈຸລະພາກທີ່ສັບສົນຂອງ modularity. ດັ່ງນັ້ນ, ໂປໂຕຄອນ morphogenesis 3D ໃນ vitro ຂອງພວກເຮົາອາດຈະໃຫ້ວິທີການເສີມເພື່ອເອົາຊະນະສິ່ງທ້າທາຍຂອງວິທີການທີ່ມີຢູ່.
ໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາແມ່ນສຸມໃສ່ການສ້າງຮູບຮ່າງຂອງ epithelial ແບບ 3 ມິຕິ, ໂດຍມີພຽງແຕ່ຈຸລັງ epithelial ໃນການເພາະເລี้ยงເທົ່ານັ້ນ ແລະ ບໍ່ມີຈຸລັງອ້ອມຂ້າງປະເພດອື່ນໆເຊັ່ນ: ຈຸລັງ mesenchymal, ຈຸລັງ endothelial, ແລະ ຈຸລັງພູມຕ້ານທານ. ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້, ຫຼັກຂອງໂປໂຕຄອນຂອງພວກເຮົາແມ່ນການກະຕຸ້ນການສ້າງຮູບຮ່າງຂອງ epithelial ໂດຍການກຳຈັດຕົວຍັບຍັ້ງ morphogen ທີ່ປ່ອຍອອກມາຢູ່ດ້ານ basolateral ຂອງສື່ທີ່ນຳສະເໜີ. ໃນຂະນະທີ່ຮູບແບບໂມດູນທີ່ແຂງແຮງຂອງລຳໄສ້ເທິງຊິບ ແລະ hybrid-on-a-chip ຂອງພວກເຮົາຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາສາມາດສ້າງຊັ້ນ epithelial 3 ມິຕິທີ່ເປັນຄື້ນ, ຄວາມສັບສົນທາງຊີວະພາບເພີ່ມເຕີມເຊັ່ນ: ການພົວພັນ epithelial-mesenchymal33,34, ການວາງຊັ້ນ extracellular Matrix (ECM) 35 ແລະ, ໃນຮູບແບບຂອງພວກເຮົາ, ລັກສະນະຂອງ crypt-villus ທີ່ສະແດງເຖິງຊ່ອງຈຸລັງລຳຕົ້ນໃນ crypts ພື້ນຖານຍັງຄົງຕ້ອງໄດ້ພິຈາລະນາຕື່ມອີກ. ຈຸລັງ stromal (ເຊັ່ນ: fibroblasts) ໃນ mesenchyme ມີບົດບາດສຳຄັນໃນການຜະລິດໂປຣຕີນ ECM ແລະ ການຄວບຄຸມການສ້າງຮູບຮ່າງຂອງລຳໄສ້ໃນຮ່າງກາຍ35,37,38. ການເພີ່ມ mesenchymal ຈຸລັງຕໍ່ຮູບແບບຂອງພວກເຮົາໄດ້ເສີມຂະຫຍາຍຂະບວນການ morphogenetic ແລະປະສິດທິພາບການຕິດຈຸລັງ. ຊັ້ນ endothelial (ເຊັ່ນ: capillaries ຫຼື lymphatics) ມີບົດບາດສຳຄັນໃນການຄວບຄຸມການຂົນສົ່ງໂມເລກຸນ 39 ແລະ ການຮັບສະໝັກຈຸລັງພູມຕ້ານທານ 40 ໃນສະພາບແວດລ້ອມຈຸລະພາກຂອງລຳໄສ້. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ອົງປະກອບຂອງເສັ້ນເລືອດທີ່ສາມາດເຊື່ອມຕໍ່ລະຫວ່າງຮູບແບບເນື້ອເຍື່ອແມ່ນສິ່ງທີ່ຈຳເປັນເມື່ອຮູບແບບເນື້ອເຍື່ອຖືກອອກແບບມາເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການພົວພັນຫຼາຍອະໄວຍະວະ. ດັ່ງນັ້ນ, ຈຸລັງ endothelial ອາດຈະຕ້ອງໄດ້ລວມເຂົ້າເພື່ອສ້າງແບບຈຳລອງລັກສະນະທາງສະລີລະວິທະຍາທີ່ຖືກຕ້ອງກວ່າດ້ວຍຄວາມລະອຽດລະດັບອະໄວຍະວະ. ຈຸລັງພູມຕ້ານທານທີ່ໄດ້ມາຈາກຄົນເຈັບຍັງມີຄວາມຈຳເປັນສຳລັບການສະແດງຄວາມຕອບສະໜອງຂອງພູມຕ້ານທານທີ່ມີມາແຕ່ກຳເນີດ, ການນຳສະເໜີ antigen, crosstalk ຂອງພູມຕ້ານທານທີ່ມີມາແຕ່ກຳເນີດ, ແລະ ພູມຕ້ານທານສະເພາະເນື້ອເຍື່ອໃນສະພາບການຂອງການລອກລຽນພະຍາດລຳໄສ້.
ການໃຊ້ຊິບປະສົມແມ່ນງ່າຍດາຍກວ່າການໃຊ້ gut-on-a-chip ເພາະວ່າການຕັ້ງຄ່າອຸປະກອນແມ່ນງ່າຍກວ່າ ແລະ ການໃຊ້ແຜ່ນໃສ່ Transwell ຊ່ວຍໃຫ້ສາມາດຂະຫຍາຍການເພາະເລี้ยงຂອງເນື້ອເຍື່ອລຳໄສ້ໄດ້. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ແຜ່ນໃສ່ Transwell ທີ່ມີຂາຍໃນທ້ອງຕະຫຼາດທີ່ມີເຍື່ອ polyester ບໍ່ມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນ ແລະ ບໍ່ສາມາດຈຳລອງການເຄື່ອນໄຫວຄ້າຍຄື peristaltic ໄດ້. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ຊ່ອງປາຍຂອງແຜ່ນໃສ່ Transwell ທີ່ວາງໄວ້ໃນຊິບປະສົມຍັງຄົງຢູ່ກັບທີ່ໂດຍບໍ່ມີຄວາມກົດດັນ shear ຢູ່ດ້ານປາຍ. ເຫັນໄດ້ຢ່າງຊັດເຈນວ່າຄຸນສົມບັດຄົງທີ່ໃນຊ່ອງປາຍບໍ່ຄ່ອຍຈະເຮັດໃຫ້ການຮ່ວມເພາະເລี้ยงຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣຍໃນໄລຍະຍາວໃນຊິບປະສົມ. ໃນຂະນະທີ່ພວກເຮົາສາມາດກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ໃນແຜ່ນໃສ່ Transwell ໄດ້ຢ່າງແຂງແຮງເມື່ອໃຊ້ຊິບປະສົມ, ການຂາດແຄນຊີວະກົນຈັກທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບສະລີລະວິທະຍາ ແລະ ການໄຫຼຂອງນ້ຳປາຍອາດຈະຈຳກັດຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງແພລດຟອມຊິບປະສົມສຳລັບການນຳໃຊ້ທີ່ມີທ່າແຮງ.
ການສ້າງໂຄງສ້າງໃໝ່ຢ່າງເຕັມທີ່ຂອງແກນ crypt-villus ຂອງມະນຸດໃນວັດທະນະທຳ gut-on-a-chip ແລະ hybrid-on-a-chip ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຮັບການສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນຢ່າງຄົບຖ້ວນ. ເນື່ອງຈາກ morphogenesis ເລີ່ມຕົ້ນຈາກຊັ້ນ epithelial monolayer, ໂຄງສ້າງຈຸລະພາກ 3D ບໍ່ຈຳເປັນຕ້ອງໃຫ້ຄວາມຄ້າຍຄືກັນທາງດ້ານຮູບຮ່າງກັບ crypts ໃນຮ່າງກາຍ. ເຖິງແມ່ນວ່າພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດລັກສະນະປະຊາກອນຈຸລັງທີ່ຂະຫຍາຍຕົວຢູ່ໃກ້ກັບໂດເມນ crypt basal ໃນ epithelium 3D ທີ່ຖືກວິສະວະກຳຈຸລະພາກ, ພາກພື້ນ crypt ແລະ villous ບໍ່ໄດ້ຖືກກຳນົດຢ່າງຈະແຈ້ງ. ເຖິງແມ່ນວ່າຊ່ອງທາງເທິງທີ່ສູງຂຶ້ນໃນຊິບເຮັດໃຫ້ຄວາມສູງຂອງ epithelium ທີ່ຖືກວິສະວະກຳຈຸລະພາກເພີ່ມຂຶ້ນ, ແຕ່ຄວາມສູງສູງສຸດຍັງຖືກຈຳກັດຢູ່ທີ່ ~300–400 µm. ຄວາມເລິກຕົວຈິງຂອງ crypts ລຳໄສ້ຂອງມະນຸດໃນລຳໄສ້ນ້ອຍ ແລະ ລຳໄສ້ໃຫຍ່ແມ່ນ ~135 µm ແລະ ~400 µm, ຕາມລຳດັບ, ແລະ ຄວາມສູງຂອງ villi ລຳໄສ້ນ້ອຍແມ່ນ ~600 µm41.
ຈາກທັດສະນະຂອງການຖ່າຍພາບ, ການຖ່າຍພາບຄວາມລະອຽດສູງໃນສະຖານທີ່ຂອງໂຄງສ້າງຈຸລະພາກ 3D ອາດຈະຖືກຈຳກັດຢູ່ໃນລຳໄສ້ໃນຊິບ, ເນື່ອງຈາກໄລຍະການເຮັດວຽກທີ່ຕ້ອງການຈາກເລນວັດຖຸໄປຫາຊັ້ນ epithelial ແມ່ນຢູ່ໃນລະດັບສອງສາມມິນລີແມັດ. ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫານີ້, ອາດຈະຕ້ອງການວັດຖຸທີ່ຢູ່ໄກ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ການເຮັດພາກສ່ວນບາງໆສຳລັບການກະກຽມຕົວຢ່າງການຖ່າຍພາບແມ່ນເປັນສິ່ງທ້າທາຍເນື່ອງຈາກຄວາມຍືດຫຍຸ່ນສູງຂອງ PDMS. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ເນື່ອງຈາກການຜະລິດຈຸລະພາກຂອງລຳໄສ້ໃນຊິບກ່ຽວຂ້ອງກັບການຍຶດຕິດຖາວອນລະຫວ່າງແຕ່ລະຊັ້ນ, ມັນເປັນສິ່ງທ້າທາຍທີ່ສຸດທີ່ຈະເປີດ ຫຼື ເອົາຊັ້ນເທິງອອກເພື່ອກວດສອບໂຄງສ້າງພື້ນຜິວຂອງຊັ້ນ epithelial. ຕົວຢ່າງ, ໂດຍການໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດອີເລັກຕຣອນສະແກນ (SEM).
ຄວາມບໍ່ລະລາຍນ້ຳຂອງ PDMS ເປັນປັດໄຈຈຳກັດໃນການສຶກສາທີ່ອີງໃສ່ຈຸລະພາກທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບໂມເລກຸນຂະໜາດນ້ອຍທີ່ບໍ່ລະລາຍນ້ຳ, ເນື່ອງຈາກ PDMS ສາມາດດູດຊຶມໂມເລກຸນທີ່ບໍ່ລະລາຍນ້ຳດັ່ງກ່າວໄດ້ຢ່າງບໍ່ສະເພາະເຈາະຈົງ. ທາງເລືອກອື່ນນອກຈາກ PDMS ອາດຈະຖືກພິຈາລະນາດ້ວຍວັດສະດຸໂພລີເມີອື່ນໆ. ອີກທາງເລືອກໜຶ່ງ, ການດັດແປງພື້ນຜິວຂອງ PDMS (ເຊັ່ນ: ການເຄືອບດ້ວຍວັດສະດຸ lipophilic 42 ຫຼື poly(ethylene glycol) 43) ສາມາດຖືກພິຈາລະນາເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການດູດຊຶມຂອງໂມເລກຸນທີ່ບໍ່ລະລາຍນ້ຳ.
ສຸດທ້າຍ, ວິທີການຂອງພວກເຮົາຍັງບໍ່ທັນໄດ້ມີລັກສະນະດີໃນແງ່ຂອງການສະໜອງການກວດຄັດກອງທີ່ມີປະສິດທິພາບສູງ ຫຼື ແພລດຟອມການທົດລອງທີ່ເປັນມິດກັບຜູ້ໃຊ້ "ຂະໜາດດຽວເໝາະກັບທຸກຄົນ". ໂປໂຕຄອນໃນປະຈຸບັນຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີປໍ້າສີດຢາຕໍ່ອຸປະກອນຂະໜາດນ້ອຍ, ເຊິ່ງໃຊ້ພື້ນທີ່ໃນຕູ້ອົບ CO2 ແລະ ປ້ອງກັນການທົດລອງຂະໜາດໃຫຍ່. ຂໍ້ຈຳກັດນີ້ສາມາດປັບປຸງໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍການຂະຫຍາຍຂອງຮູບແບບການເພາະເລี้ยงທີ່ມີນະວັດຕະກໍາ (ເຊັ່ນ: 24-ຫຼຸມ, 96-ຫຼຸມ, ຫຼື 384-ຫຼຸມ, ເຊິ່ງຊ່ວຍໃຫ້ສາມາດເຕີມເຕັມ ແລະ ກຳຈັດສື່ກາງດ້ານຂ້າງໄດ້ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ).
ເພື່ອກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ຂອງ epithelium ລຳໄສ້ຂອງມະນຸດໃນ vitro, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ອຸປະກອນລຳໄສ້ microfluidic chip ທີ່ປະກອບດ້ວຍ microchannels ຂະໜານສອງອັນ ແລະ ເຍື່ອຫຸ້ມທີ່ມີຮູພຸນຍືດຫຍຸ່ນຢູ່ລະຫວ່າງເພື່ອສ້າງອິນເຕີເຟດ lumen-capillary. ພວກເຮົາຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການນຳໃຊ້ອຸປະກອນ microfluidic ຊ່ອງທາງດຽວ (ຊິບປະສົມ) ທີ່ໃຫ້ການໄຫຼຂອງ basolateral ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງພາຍໃຕ້ຊັ້ນ epithelial ທີ່ມີຂົ້ວທີ່ປູກຢູ່ໃນແຜ່ນ Transwell. ໃນທັງສອງແພລດຟອມ, morphogenesis ຂອງຈຸລັງ epithelial ລຳໄສ້ຂອງມະນຸດຕ່າງໆສາມາດສະແດງໃຫ້ເຫັນໄດ້ໂດຍການນຳໃຊ້ການຈັດການທິດທາງຂອງການໄຫຼເພື່ອກຳຈັດຕົວຕ້ານ morphogen ອອກຈາກຊ່ອງ basolateral. ຂັ້ນຕອນການທົດລອງທັງໝົດ (ຮູບທີ 1) ປະກອບດ້ວຍຫ້າສ່ວນ: (i) ການຜະລິດ microfabric ຂອງຊິບລຳໄສ້ ຫຼື ຊິບປະສົມທີ່ສາມາດໃສ່ໄດ້ Transwell (ຂັ້ນຕອນທີ 1-5; ກ່ອງທີ 1), (ii) ການກະກຽມຈຸລັງ epithelial ລຳໄສ້ (ຈຸລັງ Caco-2) ຫຼື organoids ລຳໄສ້ຂອງມະນຸດ; ກ່ອງ 2-5), (iii) ການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ epithelial ໃນລຳໄສ້ໃນຊິບລຳໄສ້ ຫຼື ຊິບປະສົມ (ຂັ້ນຕອນທີ 6-9), (iv) ການກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ໃນຫຼອດທົດລອງ (ຂັ້ນຕອນທີ 10) ແລະ (v)) ເພື່ອອະທິບາຍລັກສະນະຂອງໂຄງສ້າງຈຸນລະພາກຂອງ epithelial 3D (ຂັ້ນຕອນທີ 11-24). ສຸດທ້າຍ, ກຸ່ມຄວບຄຸມທີ່ເໝາະສົມ (ໄດ້ປຶກສາຫາລືຕື່ມອີກຂ້າງລຸ່ມນີ້) ໄດ້ຖືກອອກແບບມາເພື່ອກວດສອບປະສິດທິພາບຂອງ morphogenesis ໃນຫຼອດທົດລອງໂດຍການປຽບທຽບ morphogenesis ຂອງ epithelial ກັບການຄວບຄຸມທາງພື້ນທີ່, ເວລາ, ເງື່ອນໄຂ, ຫຼື ຂັ້ນຕອນ.
ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ສອງແພລດຟອມການເພາະເລี้ยงທີ່ແຕກຕ່າງກັນຄື: ລຳໄສ້ເທິງຊິບທີ່ມີຊ່ອງທາງຊື່ ຫຼື ຊ່ອງທາງທີ່ບໍ່ເປັນເສັ້ນຊື່, ຫຼື ຊິບປະສົມທີ່ມີຊ່ອງໃສ່ Transwell (TW) ໃນອຸປະກອນ microfluidic, ຜະລິດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນກ່ອງທີ 1, ແລະຂັ້ນຕອນທີ 1 -5. “ການຜະລິດອຸປະກອນ” ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂັ້ນຕອນຫຼັກໃນການສ້າງຊິບດຽວ ຫຼື ຊິບປະສົມ. “ການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ Epithelial ລຳໄສ້ຂອງມະນຸດ” ອະທິບາຍແຫຼ່ງຈຸລັງ (Caco-2 ຫຼື organoids ລຳໄສ້ຂອງມະນຸດ) ແລະຂັ້ນຕອນການເພາະເລี้ยงທີ່ໃຊ້ໃນໂປໂຕຄອນນີ້. “ການສ້າງຮູບຮ່າງໃນຫຼອດທົດລອງ” ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂັ້ນຕອນໂດຍລວມທີ່ Caco-2 ຫຼື ຈຸລັງ epithelial ທີ່ມາຈາກ organoid ຖືກເພາະເລี้ยงຢູ່ໃນຊິບລຳໄສ້ ຫຼື ໃນຊ່ອງໃສ່ Transwell ຂອງຊິບປະສົມ, ຕາມດ້ວຍການກະຕຸ້ນການສ້າງຮູບຮ່າງ 3D ແລະ ການສ້າງໂຄງສ້າງ epithelial ທີ່ມີລັກສະນະ. ໝາຍເລກຂັ້ນຕອນຂອງໂປຣແກຣມ ຫຼື ໝາຍເລກກ່ອງຖືກສະແດງຢູ່ລຸ່ມລູກສອນແຕ່ລະອັນ. ແອັບພລິເຄຊັນໃຫ້ຕົວຢ່າງກ່ຽວກັບວິທີການທີ່ຊັ້ນ epithelial ລຳໄສ້ທີ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນສາມາດນຳໃຊ້ໄດ້, ຕົວຢ່າງ, ໃນລັກສະນະການຈຳແນກຈຸລັງ, ການສຶກສາສະລີລະວິທະຍາລຳໄສ້, ການສ້າງລະບົບນິເວດຂອງຈຸລິນຊີເຈົ້າພາບ, ແລະ ພະຍາດຕ່າງໆ. ຮູບແບບຈຳລອງ. ຮູບພາບການຟລູອໍເຣສເຊັນຂອງພູມຕ້ານທານໃນ “ການຈຳແນກຈຸລັງ” ສະແດງໃຫ້ເຫັນນິວເຄຼຍສ໌, F-actin ແລະ MUC2 ທີ່ສະແດງອອກໃນຊັ້ນ epithelial Caco-2 3D ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໃນຊິບລຳໄສ້. ສັນຍານ MUC2 ມີຢູ່ໃນຈຸລັງ goblet ແລະນໍ້າເມືອກທີ່ຫຼั่งອອກມາຈາກໜ້າຜິວເຍື່ອເມືອກ. ຮູບພາບການຟລູອໍເຣສເຊັນໃນ Gut Physiology ສະແດງໃຫ້ເຫັນນໍ້າເມືອກທີ່ຜະລິດໂດຍການຍ້ອມສີສຳລັບກົດ sialic ແລະ N-acetylglucosamine ໂດຍໃຊ້ agglutinin germ wheat fluorescent. ຮູບພາບສອງຮູບທີ່ຊ້ອນກັນໃນ “Host-Microbe Co-Cultures” ສະແດງໃຫ້ເຫັນຕົວແທນຂອງການຮ່ວມວັດທະນະທຳ host-microbiome ໃນລຳໄສ້ໃນຊິບ. ແຜງດ້ານຊ້າຍສະແດງໃຫ້ເຫັນການຮ່ວມວັດທະນະທຳຂອງໂປຣຕີນ fluorescent ສີຂຽວ (GFP) ທີ່ສະແດງອອກໂດຍ E. coli ກັບຈຸລັງ epithelial Caco-2 3D ທີ່ຖືກວິສະວະກຳດ້ວຍຈຸນລະພາກ. ແຜງດ້ານຂວາສະແດງໃຫ້ເຫັນສະຖານທີ່ຂອງ GFP E. coli ຮ່ວມກັນປູກຝັງກັບຈຸລັງ epithelial Caco-2 3D, ຕາມດ້ວຍການຍ້ອມສີ immunofluorescence ດ້ວຍ F-actin (ສີແດງ) ແລະນິວເຄຼຍສ໌ (ສີຟ້າ). ຮູບແບບພະຍາດສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງລຳໄສ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີທຽບກັບລຳໄສ້ທີ່ຮົ່ວໄຫຼໃນ ຊິບການອັກເສບຂອງລຳໄສ້ພາຍໃຕ້ສິ່ງທ້າທາຍທາງສະລີລະວິທະຍາກັບແອນຕິເຈນຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣຍ (ເຊັ່ນ: lipopolysaccharide, LPS) ແລະຈຸລັງພູມຕ້ານທານ (ເຊັ່ນ: PBMC; ສີຂຽວ). ຈຸລັງ Caco-2 ໄດ້ຖືກเพาะเลี้ยงເພື່ອສ້າງຊັ້ນ epithelial 3D. ແຖບຂະໜາດ, 50 µm. ຮູບພາບໃນແຖວລຸ່ມ: “ການຈຳແນກຈຸລັງ” ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.2. ສຳນັກພິມມະຫາວິທະຍາໄລ Oxford; ຜະລິດຄືນໃໝ່ດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.5. NAS; “ການเพาะเลี้ยงຮ່ວມລະຫວ່າງເຈົ້າພາບ-ຈຸລິນຊີ” ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.3. NAS; “ການສ້າງແບບຈຳລອງພະຍາດ” ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.5. NAS.
ທັງຊິບ gut-on-chip ແລະ ຊິບປະສົມໄດ້ຖືກຜະລິດໂດຍໃຊ້ແບບຈຳລອງ PDMS ທີ່ຖືກຖອດອອກຈາກແມ່ພິມຊິລິໂຄນໂດຍການພິມດ້ວຍແສງອ່ອນ 1,44 ແລະ ມີຮູບແບບດ້ວຍ SU-8. ການອອກແບບຂອງຊ່ອງຈຸລະພາກໃນແຕ່ລະຊິບແມ່ນຖືກກຳນົດໂດຍການພິຈາລະນາ hydrodynamics ເຊັ່ນ: ຄວາມກົດດັນ shear ແລະ ຄວາມກົດດັນ hydrodynamic 1,4,12. ການອອກແບບ gut-on-a-chip ຕົ້ນສະບັບ (Extended Data Fig. 1a), ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍສອງຊ່ອງຈຸລະພາກຊື່ຂະໜານທີ່ວາງຢູ່ຂ້າງໆກັນ, ໄດ້ພັດທະນາໄປສູ່ gut-on-a-chip ທີ່ສັບສົນ (Extended Data Fig. 1b) ທີ່ປະກອບມີຊ່ອງຈຸລະພາກໂຄ້ງຄູ່ໜຶ່ງເພື່ອກະຕຸ້ນໃຫ້ເກີດເວລາທີ່ຢູ່ອາໄສຂອງນ້ຳທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ, ຮູບແບບການໄຫຼທີ່ບໍ່ເປັນເສັ້ນຊື່, ແລະ ການຜິດຮູບຫຼາຍແກນຂອງຈຸລັງທີ່เพาะเลี้ยง (ຮູບທີ 2a–f) 12. ເມື່ອຊີວະກົນຈັກຂອງລຳໄສ້ທີ່ສັບສົນຫຼາຍຂຶ້ນຕ້ອງໄດ້ຮັບການສ້າງໃໝ່, gut-on-a-chip ທີ່ສັບສົນສາມາດເລືອກໄດ້. ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ Gut-Chip ທີ່ສັບສົນຍັງກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ຢ່າງແຂງແຮງໃນໄລຍະເວລາທີ່ຄ້າຍຄືກັນທີ່ມີລະດັບການເຕີບໂຕຂອງ epithelial ທີ່ຄ້າຍຄືກັນເມື່ອທຽບກັບ Gut-Chip ຕົ້ນສະບັບ, ໂດຍບໍ່ຄໍານຶງເຖິງປະເພດຂອງຈຸລັງທີ່เพาะเลี้ยง. ດັ່ງນັ້ນ, ເພື່ອກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D, ການອອກແບບ gut ເສັ້ນຊື່ ແລະ ສະລັບສັບຊ້ອນໃນຊິບແມ່ນສາມາດແລກປ່ຽນກັນໄດ້. ສຳເນົາ PDMS ທີ່ຮັກສາໄວ້ໃນແມ່ພິມຊິລິໂຄນທີ່ມີຮູບແບບ SU-8 ໃຫ້ລັກສະນະທາງລົບຫຼັງຈາກການຖອດແມ່ພິມ (ຮູບທີ 2a). ເພື່ອຜະລິດ gut ໃນຊິບ, ຊັ້ນ PDMS ເທິງທີ່ກຽມໄວ້ໄດ້ຖືກຜູກມັດຕາມລໍາດັບກັບຟິມ PDMS ທີ່ມີຮູພຸນ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນຈັດລຽງກັບຊັ້ນ PDMS ລຸ່ມໂດຍການຜູກມັດທີ່ບໍ່ສາມາດປ່ຽນແປງໄດ້ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງຮັກສາ corona (ຮູບທີ 2b–f). ເພື່ອຜະລິດຊິບປະສົມ, ສຳເນົາ PDMS ທີ່ຮັກສາໄວ້ໄດ້ຖືກຜູກມັດກັບແຜ່ນສະໄລ້ແກ້ວເພື່ອສ້າງອຸປະກອນ microfluidic ຊ່ອງທາງດຽວທີ່ສາມາດຮອງຮັບການໃສ່ Transwell (ຮູບທີ 2h ແລະ ຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກຮູບທີ 2). ຂະບວນການຜູກມັດແມ່ນປະຕິບັດໂດຍການປິ່ນປົວພື້ນຜິວຂອງສຳເນົາ PDMS ແລະ ແກ້ວດ້ວຍ plasma ອົກຊີເຈນ ຫຼື ການປິ່ນປົວດ້ວຍ corona. ຫຼັງຈາກການຂ້າເຊື້ອຂອງອຸປະກອນ microfabricated ທີ່ຕິດກັບທໍ່ຊິລິໂຄນ, ການຕັ້ງຄ່າອຸປະກອນແມ່ນພ້ອມທີ່ຈະປະຕິບັດ morphogenesis 3D ຂອງ epithelium ລຳໄສ້ (ຮູບທີ 2g).
ກ, ຮູບແຕ້ມແຜນວາດຂອງການກະກຽມຊິ້ນສ່ວນ PDMS ຈາກແມ່ພິມຊິລິໂຄນທີ່ມີລວດລາຍ SU-8. ສານລະລາຍ PDMS ທີ່ຍັງບໍ່ໄດ້ປຸງແຕ່ງໄດ້ຖືກຖອກໃສ່ແມ່ພິມຊິລິໂຄນ (ຊ້າຍ), ປຸງແຕ່ງທີ່ 60 °C (ກາງ) ແລະ ຖອດອອກ (ຂວາ). PDMS ທີ່ຖືກຖອດອອກໄດ້ຖືກຕັດເປັນຕ່ອນໆ ແລະ ທຳຄວາມສະອາດເພື່ອການນຳໃຊ້ຕໍ່ໄປ.ຂ, ຮູບຖ່າຍຂອງແມ່ພິມຊິລິໂຄນທີ່ໃຊ້ເພື່ອກະກຽມຊັ້ນເທິງຂອງ PDMS.ຄ, ຮູບຖ່າຍຂອງແມ່ພິມຊິລິໂຄນທີ່ໃຊ້ເພື່ອຜະລິດເຍື່ອທີ່ມີຮູພຸນ PDMS.ງ, ຊຸດຮູບຖ່າຍຂອງສ່ວນປະກອບ PDMS ເທິງ ແລະ ລຸ່ມ ແລະ ອຸປະກອນລຳໄສ້ທີ່ປະກອບຢູ່ໃນຊິບ.ຈ, ແຜນວາດຂອງການຈັດລຽນຂອງສ່ວນປະກອບ PDMS ເທິງ, ເຍື່ອ, ແລະ ລຸ່ມ. ແຕ່ລະຊັ້ນຖືກຜູກມັດຢ່າງບໍ່ສາມາດປ່ຽນແປງໄດ້ໂດຍການປິ່ນປົວດ້ວຍ plasma ຫຼື corona.ສ, ແຜນວາດຂອງອຸປະກອນລຳໄສ້ທີ່ຜະລິດຢູ່ເທິງຊິບທີ່ມີຊ່ອງຈຸລະພາກທີ່ຊ້ອນກັນ ແລະ ຫ້ອງສູນຍາກາດ.ກ, ການຕິດຕັ້ງລຳໄສ້ທີ່ຜະລິດຢູ່ເທິງຊິບສຳລັບການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ microfluidic.ລຳໄສ້ທີ່ຜະລິດຢູ່ເທິງຊິບທີ່ປະກອບດ້ວຍທໍ່ຊິລິໂຄນ ແລະ ເຂັມສັກຢາຖືກວາງໄວ້ເທິງແຜ່ນປົກ. ອຸປະກອນຊິບຖືກວາງໄວ້ເທິງ ຝາປິດຂອງຈານ Petri ຂະໜາດ 150 ມມ ສຳລັບການປຸງແຕ່ງ. ສານຍຶດຕິດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປິດທໍ່ຊິລິໂຄນ.h, ພາບຖ່າຍພາບຂອງການຜະລິດຊິບປະສົມ ແລະ morphogenesis 3D ໂດຍໃຊ້ຊິບປະສົມ. ຊິ້ນສ່ວນ Transwell ທີ່ກະກຽມເປັນອິດສະຫຼະເພື່ອเพาะเลี้ยงຈຸລັງ epithelial ລຳໄສ້ຊັ້ນດຽວ 2D ໄດ້ຖືກໃສ່ເຂົ້າໄປໃນຊິບປະສົມເພື່ອກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ຂອງລຳໄສ້. ສື່ກາງຖືກກະຈາຍຜ່ານຊ່ອງຈຸລະພາກພາຍໃຕ້ຊັ້ນຈຸລັງທີ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນແຜ່ນ Transwell. ແຖບມາດຕາສ່ວນ, 1 ຊມ.h ພິມຄືນດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.4. Elsevier.
ໃນໂປໂຕຄອນນີ້, ສາຍເຊວ Caco-2 ແລະ ອໍແກນິກອອຍລຳໄສ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແຫຼ່ງ epithelial (ຮູບທີ 3a). ເຊວທັງສອງຊະນິດໄດ້ຖືກเพาะเลี้ยงຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະ (ກ່ອງທີ 2 ແລະ ກ່ອງທີ 5) ແລະ ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປູກຝັງຊ່ອງຈຸລະພາກທີ່ເຄືອບດ້ວຍ ECM ຂອງລໍາໄສ້ໃນຊິບ ຫຼື ໄສ້ Transwell. ເມື່ອເຊວໄຫຼມາລວມກັນ (ກວມເອົາ >95% ໃນຂວດ), ເຊວ Caco-2 ທີ່เพาะเลี้ยงເປັນປະຈໍາ (ລະຫວ່າງທາງ 10 ແລະ 50) ໃນຂວດ T ຈະຖືກເກັບກ່ຽວເພື່ອກະກຽມການລະງັບເຊວທີ່ແຍກອອກຈາກກັນໂດຍນໍ້າ trypsinization (ກ່ອງທີ 2). ອໍແກນິກອອຍລຳໄສ້ຂອງມະນຸດຈາກການກວດເນື້ອເຍື່ອລຳໄສ້ ຫຼື ການຜ່າຕັດໄດ້ຖືກเพาะเลี้ยงໃນໂດມ Matrigel scaffold ໃນແຜ່ນ 24-well ເພື່ອຮອງຮັບສະພາບແວດລ້ອມໂຄງສ້າງຈຸລະພາກ. ສື່ກາງທີ່ມີ morphogens ທີ່ສຳຄັນ (ເຊັ່ນ Wnt, R-spondin, ແລະ Noggin) ແລະ ປັດໄຈການເຕີບໂຕທີ່ກະກຽມຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນກ່ອງທີ 3 ໄດ້ຖືກເສີມທຸກໆມື້ຈົນກວ່າອໍແກນິກອອຍຈະເຕີບໂຕເຖິງ ~500 µm ໃນເສັ້ນຜ່າສູນກາງ. ອໍແກນິກອອຍທີ່ເຕີບໃຫຍ່ເຕັມທີ່ຈະຖືກເກັບກ່ຽວ ແລະ ແຍກອອກເປັນອັນດຽວ. ຈຸລັງສຳລັບການຫວ່ານເມັດເຂົ້າໄປໃນລຳໄສ້ ຫຼື ຈຸລັງ Transwell ທີ່ໃສ່ຊິບ (ກ່ອງທີ 5). ດັ່ງທີ່ພວກເຮົາໄດ້ລາຍງານມາກ່ອນໜ້ານີ້, ມັນສາມາດຈຳແນກໄດ້ຕາມປະເພດພະຍາດ 12,13 (ເຊັ່ນ: ພະຍາດລຳໄສ້ອັກເສບເປັນແຜ, ພະຍາດ Crohn, ມະເຮັງລຳໄສ້ໃຫຍ່ ແລະ ຮູທະວານ, ຫຼື ຜູ້ໃຫ້ອາຫານປົກກະຕິ), ບໍລິເວນທີ່ເປັນຕຸ່ມ (ເຊັ່ນ: ຕຸ່ມ ທຽບກັບ ບໍລິເວນທີ່ບໍ່ມີຕຸ່ມ) ແລະ ບໍລິເວນລະບົບຍ່ອຍອາຫານໃນລະບົບຍ່ອຍອາຫານ (ເຊັ່ນ: duodenum, jejunum, ileum, cecum, ລຳໄສ້ໃຫຍ່, ຫຼື rectum). ພວກເຮົາສະໜອງໂປໂຕຄອນທີ່ດີທີ່ສຸດໃນກ່ອງທີ 5 ສຳລັບການເພາະເລี้ยงອະໄວຍະວະລຳໄສ້ໃຫຍ່ (coloids) ທີ່ປົກກະຕິແລ້ວຕ້ອງການຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ morphogens ສູງກວ່າອະໄວຍະວະລຳໄສ້ນ້ອຍ.
ກ, ຂະບວນການເຮັດວຽກສຳລັບການກະຕຸ້ນການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງລຳໄສ້ໃນຊິບລຳໄສ້. ຈຸລັງເນື້ອເຍື່ອລຳໄສ້ຂອງມະນຸດ Caco-2 ແລະ ອະໄວຍະວະລຳໄສ້ຖືກນຳໃຊ້ໃນໂປໂຕຄອນນີ້ເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງ 3 ມິຕິ. ຈຸລັງເນື້ອເຍື່ອທີ່ໂດດດ່ຽວໄດ້ຖືກຫວ່ານເມັດໃນອຸປະກອນລຳໄສ້ທີ່ກຽມໄວ້ເທິງຊິບ (ການກະກຽມຊິບ). ເມື່ອຈຸລັງຖືກຫວ່ານເມັດ (ຫວ່ານເມັດ) ແລະ ຕິດ (ຕິດ) ກັບເຍື່ອຫຸ້ມຮູ PDMS ໃນມື້ທີ 0 (D0), ການໄຫຼຂອງປາຍ (AP) ຈະເລີ່ມຕົ້ນ ແລະ ຮັກສາໄວ້ເປັນເວລາ 2 ມື້ທຳອິດ (ການໄຫຼ, AP, D0-D2). ການໄຫຼຂອງພື້ນຖານ (BL) ຍັງເລີ່ມຕົ້ນພ້ອມກັບການເຄື່ອນໄຫວຍືດແບບວົງຈອນ (ການຍືດ, ການໄຫຼ, AP ແລະ BL) ເມື່ອມີການສ້າງຊັ້ນ monolayer 2D ທີ່ສົມບູນ. ການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງ 3 ມິຕິຂອງລຳໄສ້ເກີດຂຶ້ນຢ່າງເປັນທຳມະຊາດຫຼັງຈາກ 5 ມື້ຂອງການເພາະເລี้ยงຈຸລະພາກ (ການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງ, D5). ຮູບພາບທີ່ກົງກັນຂ້າມຂອງໄລຍະສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບຮ່າງທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງຈຸລັງ Caco-2 ໃນແຕ່ລະຂັ້ນຕອນການທົດລອງ ຫຼື ຈຸດເວລາ (ກຣາຟແຖບ, 100 µm). ແຜນວາດສີ່ແຜນວາດທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບນ້ຳທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງລຳໄສ້. morphogenesis (ຂວາເທິງ). ລູກສອນປະໃນແຜນວາດສະແດງເຖິງທິດທາງຂອງການໄຫຼຂອງນ້ຳ.b, ຮູບພາບ SEM ສະແດງໃຫ້ເຫັນ topology ພື້ນຜິວຂອງ epithelium Caco-2 3D ທີ່ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ (ຊ້າຍ). inset ທີ່ເນັ້ນໃສ່ພື້ນທີ່ຂະຫຍາຍ (ກ່ອງປະສີຂາວ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນ microvilli ທີ່ຟື້ນຟູຢູ່ໃນຊັ້ນ Caco-2 3D (ຂວາ).c, ມຸມມອງທາງໜ້າອອກຕາມແນວນອນຂອງ Caco-2 3D ທີ່ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ, claudin (ZO-1, ສີແດງ) ແລະເຍື່ອຂອບແປງຕໍ່ເນື່ອງທີ່ມີປ້າຍ F-actin (ສີຂຽວ) ແລະນິວເຄຼຍ (ສີຟ້າ) ການເບິ່ງເຫັນ confocal Immunofluorescence ຂອງຈຸລັງ epithelial ໃນ chips ລຳໄສ້.ລູກສອນຊີ້ໄປທີ່ແຜນວາດກາງຊີ້ບອກສະຖານທີ່ຂອງລະນາບໂຟກັສສຳລັບແຕ່ລະມຸມມອງ confocal.d, ໄລຍະເວລາຂອງການປ່ຽນແປງທາງດ້ານຮູບຮ່າງໃນ organoids ທີ່ປູກໃນ chip ທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍກ້ອງຈຸລະທັດ contrast ໃນມື້ທີ 3, 7, 9, 11, ແລະ 13. inset (ຂວາເທິງ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຂະຫຍາຍສູງຂອງຮູບພາບທີ່ສະໜອງໃຫ້.e, ຮູບຖ່າຍ DIC ຂອງ epithelium organoid 3D ທີ່ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ. ໃນລຳໄສ້ທີ່ຖ່າຍໃນມື້ທີ 7.f, ຮູບພາບ immunofluorescence ທີ່ວາງຊ້ອນກັນສະແດງໃຫ້ເຫັນເຄື່ອງໝາຍສຳລັບຈຸລັງລຳຕົ້ນ (LGR5; ສີມ່ວງແດງ), ຈຸລັງ goblet (MUC2; ສີຂຽວ), F-actin (ສີເທົາ) ແລະ ນິວເຄຼຍ (ສີຟ້າອ່ອນ) ທີ່ເຕີບໃຫຍ່ຢູ່ໃນຊິບລຳໄສ້ເປັນເວລາ 3 ມື້, ຕາມລຳດັບ (ຊ້າຍ) ແລະ organoids 13 ມື້ (ກາງ) ໃນຊັ້ນ epithelial. ເບິ່ງເພີ່ມເຕີມໃນຮູບທີ 3, ເຊິ່ງເນັ້ນໃສ່ສັນຍານ LGR5 ໂດຍບໍ່ມີການສົ່ງສັນຍານ MUC2. ຮູບພາບ fluorescence ທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນໂຄງສ້າງຈຸລະພາກຂອງ epithelial (ຂວາ) ຂອງ epithelium organoid 3D ທີ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນລຳໄສ້ໃນຊິບໂດຍການຍ້ອມສີເຍື່ອຫຸ້ມ plasma ດ້ວຍສີຍ້ອມ CellMask (ຂວາ) ໃນມື້ທີ 13 ຂອງການເພາະເລี้ยง. ແຖບຂະໜາດແມ່ນ 50 μm ເວັ້ນເສຍແຕ່ຈະມີການລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ.b ພິມຄືນດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.2. Oxford University Press; c ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.2. Oxford University Press; e ແລະ f ດັດແປງດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.12 ພາຍໃຕ້ໃບອະນຸຍາດ Creative Commons CC BY 4.0.
ໃນລຳໄສ້ເທິງຊິບ, ມັນຈຳເປັນຕ້ອງດັດແປງໜ້າດິນທີ່ບໍ່ຊຸ່ມນ້ຳຂອງເຍື່ອ PDMS ທີ່ມີຮູພຸນ ສຳລັບການເຄືອບ ECM ທີ່ປະສົບຜົນສຳເລັດ. ໃນໂປໂຕຄອນນີ້, ພວກເຮົາໃຊ້ສອງວິທີທີ່ແຕກຕ່າງກັນເພື່ອດັດແປງຄວາມບໍ່ຊຸ່ມນ້ຳຂອງເຍື່ອ PDMS. ສຳລັບການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ Caco-2, ການກະຕຸ້ນໜ້າດິນໂດຍການປິ່ນປົວດ້ວຍ UV/ໂອໂຊນພຽງຢ່າງດຽວແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະຫຼຸດຜ່ອນຄວາມບໍ່ຊຸ່ມນ້ຳຂອງໜ້າດິນ PDMS, ເຄືອບ ECM ແລະຕິດຈຸລັງ Caco-2 ໃສ່ເຍື່ອ PDMS. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການເພາະເລี้ยงຈຸລະພາກຂອງເນື້ອເຍື່ອ organoid ຕ້ອງການການທຳງານຂອງໜ້າດິນທີ່ອີງໃສ່ສານເຄມີເພື່ອໃຫ້ບັນລຸການວາງໂປຣຕີນ ECM ທີ່ມີປະສິດທິພາບໂດຍການໃຊ້ polyethyleneimine (PEI) ແລະ glutaraldehyde ຕາມລຳດັບກັບຊ່ອງຈຸລະພາກ PDMS. ຫຼັງຈາກການດັດແປງໜ້າດິນ, ໂປຣຕີນ ECM ໄດ້ຖືກຝາກໄວ້ເພື່ອປົກຄຸມໜ້າດິນ PDMS ທີ່ເຮັດໜ້າທີ່ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນນຳເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງຈຸລະພາກ organoid ທີ່ໂດດດ່ຽວ. ຫຼັງຈາກຕິດຈຸລັງແລ້ວ, ການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ microfluidic ເລີ່ມຕົ້ນໂດຍການໃສ່ພຽງແຕ່ສື່ກາງເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງຈຸລະພາກເທິງຈົນກວ່າຈຸລັງຈະປະກອບເປັນຊັ້ນດຽວທີ່ສົມບູນ, ໃນຂະນະທີ່ຊ່ອງຈຸລະພາກລຸ່ມຮັກສາສະພາບຄົງທີ່. ວິທີການທີ່ດີທີ່ສຸດສຳລັບການກະຕຸ້ນໜ້າດິນ ແລະ ການເຄືອບ ECM ນີ້ຊ່ວຍໃຫ້ການຕິດຂອງຊ່ອງຈຸລະພາກ organoid. ເພື່ອກະຕຸ້ນ morphogenesis 3D ເທິງໜ້າດິນ PDMS.
ການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ Transwell ຍັງຕ້ອງການການເຄືອບ ECM ກ່ອນການຫວ່ານເມັດເຊວ; ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ Transwell ບໍ່ຕ້ອງການຂັ້ນຕອນການປຸງແຕ່ງທີ່ສັບສົນເພື່ອກະຕຸ້ນພື້ນຜິວຂອງແຜ່ນທີ່ມີຮູພຸນ. ສຳລັບການປູກເຊວ Caco-2 ໃນແຜ່ນ Transwell, ການເຄືອບ ECM ໃນແຜ່ນທີ່ມີຮູພຸນຈະເລັ່ງການຕິດຂອງເຊວ Caco-2 ທີ່ແຍກອອກຈາກກັນ (<1 ຊົ່ວໂມງ) ແລະ ການສ້າງສິ່ງກີດຂວາງທີ່ແໜ້ນໜາ (<1-2 ມື້). ເພື່ອເພາະເລี้ยงອະໄວຍະວະໃນແຜ່ນ Transwell, ອະໄວຍະວະທີ່ໂດດດ່ຽວຈະຖືກຫວ່ານເມັດເຊວໃສ່ແຜ່ນທີ່ເຄືອບ ECM, ຕິດກັບໜ້າຜິວເຍື່ອ (<3 ຊົ່ວໂມງ) ແລະ ຮັກສາໄວ້ຈົນກວ່າອະໄວຍະວະຈະປະກອບເປັນຊັ້ນດຽວທີ່ສົມບູນດ້ວຍຄວາມສົມບູນຂອງສິ່ງກີດຂວາງ. ການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ Transwell ແມ່ນປະຕິບັດໃນແຜ່ນ 24 ຫຼຸມໂດຍບໍ່ຕ້ອງໃຊ້ຊິບປະສົມ.
ການສ້າງຮູບຮ່າງ 3D ໃນຫຼອດທົດລອງສາມາດເລີ່ມຕົ້ນໄດ້ໂດຍການໃຊ້ການໄຫຼຂອງນ້ຳໄປສູ່ດ້ານລຸ່ມຂອງຊັ້ນ epithelial ທີ່ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ. ໃນລຳໄສ້ເທິງຊິບ, ການສ້າງຮູບຮ່າງ epithelial ໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນເມື່ອສື່ກາງຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ microchannels ເທິງ ແລະ ລຸ່ມ (ຮູບທີ 3a). ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້, ມັນເປັນສິ່ງສຳຄັນທີ່ຈະແນະນຳການໄຫຼຂອງນ້ຳໃນຊ່ອງລຸ່ມ (ດ້ານລຸ່ມ) ສຳລັບການກຳຈັດຕົວຍັບຍັ້ງ morphogen ທີ່ປ່ອຍອອກມາທາງທິດທາງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ. ເພື່ອໃຫ້ສານອາຫານ ແລະ serum ພຽງພໍແກ່ຈຸລັງທີ່ຜູກມັດຢູ່ເທິງເຍື່ອຫຸ້ມທີ່ມີຮູພຸນ ແລະ ສ້າງຄວາມກົດດັນຂອງ luminal shear, ພວກເຮົາມັກຈະໃຊ້ການໄຫຼຄູ່ໃນລຳໄສ້ເທິງຊິບ. ໃນຊິບປະສົມ, ຊິ້ນສ່ວນ Transwell ທີ່ມີຊັ້ນ epithelial monolayers ໄດ້ຖືກໃສ່ເຂົ້າໄປໃນຊິບປະສົມ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສື່ກາງໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ພາຍໃຕ້ດ້ານລຸ່ມຂອງຊິ້ນສ່ວນ Transwell ທີ່ມີຮູພຸນຜ່ານຊ່ອງ microchannel. ການສ້າງຮູບຮ່າງລຳໄສ້ເກີດຂຶ້ນ 3-5 ມື້ຫຼັງຈາກເລີ່ມຕົ້ນການໄຫຼຂອງ basolateral ໃນທັງສອງແພລດຟອມການເພາະເລี้ยง.
ລັກສະນະທາງດ້ານຮູບຮ່າງຂອງຊັ້ນ epithelial 3D ທີ່ຖືກວິສະວະກຳດ້ວຍຈຸນລະພາກສາມາດວິເຄາະໄດ້ໂດຍການໃຊ້ຮູບແບບການຖ່າຍພາບຕ່າງໆ, ລວມທັງກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ມີຄວາມຄົມຊັດຂອງໄລຍະ, ກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ມີຄວາມຄົມຊັດຂອງການແຊກແຊງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (DIC), SEM, ຫຼືກ້ອງຈຸລະທັດ confocal immunofluorescence (ຮູບທີ 3 ແລະ 4). ການຖ່າຍພາບທີ່ມີຄວາມຄົມຊັດຂອງໄລຍະ ຫຼື DIC ສາມາດປະຕິບັດໄດ້ງ່າຍໄດ້ທຸກເວລາໃນລະຫວ່າງການเพาะเลี้ยงເພື່ອຕິດຕາມກວດກາຮູບຮ່າງ ແລະ ການຍື່ນອອກມາຂອງຊັ້ນ epithelial 3D. ເນື່ອງຈາກຄວາມໂປ່ງໃສທາງດ້ານແສງຂອງ PDMS ແລະ ຟິມ polyester, ທັງແພລດຟອມ gut-on-a-chip ແລະ hybrid chip ສາມາດສະໜອງການຖ່າຍພາບໃນສະຖານທີ່ແບບເວລາຈິງໂດຍບໍ່ຕ້ອງມີການຕັດ ຫຼື ການຖອດອຸປະກອນອອກ. ເມື່ອປະຕິບັດການຖ່າຍພາບ immunofluorescence (ຮູບທີ 1, 3c, f ແລະ 4b, c), ຈຸລັງມັກຈະຖືກແກ້ໄຂດ້ວຍ paraformaldehyde (PFA) 4% (wt/vol), ຕາມດ້ວຍ Triton X-100 ແລະ 2% (wt/vol)) bovine serum albumin (BSA), ຕາມລຳດັບ. ຂຶ້ນກັບປະເພດຂອງຈຸລັງ, fixatives ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ສາມາດນຳໃຊ້ສານດູດຊຶມ ແລະ ຕົວແທນສະກັດກັ້ນໄດ້. ພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນທີ່ແນໃສ່ຕົວໝາຍຂອງຈຸລັງ ຫຼື ພາກພື້ນທີ່ຂຶ້ນກັບເຊື້ອສາຍແມ່ນໃຊ້ເພື່ອເນັ້ນໃສ່ຈຸລັງທີ່ຖືກກັກຂັງຢູ່ໃນສະຖານທີ່ເທິງຊິບ, ຕາມດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງພ້ອມກັບສີຍ້ອມຕ້ານທີ່ແນໃສ່ນິວເຄຼຍສ (ເຊັ່ນ: 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) ຫຼື F-actin (ເຊັ່ນ: phalloidin ທີ່ຕິດສະຫຼາກ fluorescent). ການຖ່າຍພາບສົດໂດຍອີງໃສ່ການ fluorescence ຍັງສາມາດປະຕິບັດໃນສະຖານທີ່ເພື່ອກວດຫາການຜະລິດນໍ້າເມືອກ (ຮູບທີ 1, “ການຈຳແນກຈຸລັງ” ແລະ “ສະລີລະວິທະຍາລຳໄສ້”), ການລວມຕົວຂອງຈຸລັງຈຸລິນຊີແບບສຸ່ມ (ຮູບທີ 1, “ການລ້ຽງຮ່ວມລະຫວ່າງເຈົ້າພາບ ແລະ ຈຸລິນຊີ”), ການຮັບສະໝັກຈຸລັງພູມຕ້ານທານ (ຮູບທີ 1, 'ການສ້າງແບບຈຳລອງພະຍາດ') ຫຼື ຮູບຊົງຂອງຮູບຮ່າງ epithelial 3D (ຮູບທີ 3c, f ແລະ 4b, c). ເມື່ອດັດແປງລຳໄສ້ໃນຊິບເພື່ອແຍກຊັ້ນເທິງອອກຈາກຊັ້ນ microchannel ລຸ່ມ, ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນຂໍ້ອ້າງອີງ. ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບທີ 2, 3D ຮູບຮ່າງຂອງເນື້ອເຍື່ອຫຸ້ມເຊລ ເຊັ່ນດຽວກັນກັບ microvilli ຢູ່ແຄມຂອງແປງປາຍສາມາດເບິ່ງເຫັນໄດ້ໂດຍ SEM (ຮູບທີ 3b). ການສະແດງອອກຂອງເຄື່ອງໝາຍການຈຳແນກສາມາດປະເມີນໄດ້ໂດຍການເຮັດ PCR5 ແບບປະລິມານ ຫຼື sequencing RNA ຈຸລັງດ່ຽວ. ໃນກໍລະນີນີ້, ຊັ້ນ 3D ຂອງຈຸລັງເນື້ອເຍື່ອຫຸ້ມເຊລທີ່ປູກໃນຊິບລຳໄສ້ ຫຼື ຊິບປະສົມຈະຖືກເກັບກ່ຽວໂດຍ trypsinization ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນນຳໃຊ້ສຳລັບການວິເຄາະໂມເລກຸນ ຫຼື ພັນທຸກຳ.
ກ, ຂັ້ນຕອນການເຮັດວຽກສຳລັບການກະຕຸ້ນການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງລຳໄສ້ໃນຊິບປະສົມ. Caco-2 ແລະ organoids ລຳໄສ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນໂປໂຕຄອນນີ້ເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງ 3D ໃນແພລດຟອມຊິບປະສົມ. ຈຸລັງ epithelial ທີ່ແຍກອອກຈາກກັນໄດ້ຖືກຫວ່ານເມັດໃນແຜ່ນ Transwell ທີ່ກຽມໄວ້ (ການກະກຽມ TW; ເບິ່ງຮູບຂ້າງລຸ່ມນີ້). ເມື່ອຈຸລັງໄດ້ຖືກຫວ່ານເມັດ (ຫວ່ານເມັດ) ແລະຕິດກັບເຍື່ອ polyester ໃນແຜ່ນ Transwell, ຈຸລັງທັງໝົດໄດ້ຖືກเพาะเลี้ยงພາຍໃຕ້ສະພາບຄົງທີ່ (ການเพาะเลี้ยง TW). ຫຼັງຈາກ 7 ມື້, ແຜ່ນ Transwell ດຽວທີ່ມີຊັ້ນດຽວຂອງຈຸລັງ epithelial 2D ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັບຊິບປະສົມເພື່ອແນະນໍາການໄຫຼ basolateral (Flow, BL), ເຊິ່ງໃນທີ່ສຸດໄດ້ນໍາໄປສູ່ການສ້າງຊັ້ນ epithelial 3D (morphogenesis). ຮູບຖ່າຍຈຸລະພາກທີ່ກົງກັນຂ້າມກັບໄລຍະທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນລັກສະນະທາງດ້ານຮູບຮ່າງຂອງຈຸລັງ epithelial ອະໄວຍະວະຂອງມະນຸດທີ່ໄດ້ມາຈາກລໍາໄສ້ໃຫຍ່ຂອງຜູ້ໃຫ້ປົກກະຕິ (ສາຍ C103) ໃນແຕ່ລະຂັ້ນຕອນການທົດລອງ ຫຼື ຈຸດເວລາ. ແຜນວາດໃນຊັ້ນເທິງສະແດງໃຫ້ເຫັນການຕັ້ງຄ່າການທົດລອງສໍາລັບແຕ່ລະຂັ້ນຕອນ. ຂ, ຊິບປະສົມ (ແຜນວາດຊ້າຍ) ສາມາດນໍາໄປສູ່ການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງ 3D ຂອງຈຸລັງ epithelial organoid. ດ້ວຍມຸມມອງກ້ອງຈຸລະທັດ confocal ຈາກເທິງລົງລຸ່ມທີ່ຖ່າຍຢູ່ຕຳແໜ່ງ Z ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ເທິງ, ກາງ, ແລະລຸ່ມ; ເບິ່ງແຜນວາດເບື້ອງຂວາ ແລະ ເສັ້ນປະທີ່ສອດຄ້ອງກັນ). ສະແດງໃຫ້ເຫັນລັກສະນະທາງດ້ານຮູບຮ່າງທີ່ຊັດເຈນ.F-actin (ສີຟ້າອ່ອນ), ນິວເຄຼຍສ (ສີເທົາ).c, ຮູບຖ່າຍຈຸລະທັດ confocal ທີ່ມີການເຍືອງແສງ (ມຸມມອງມຸມ 3D) ຂອງຈຸລັງ epithelial ທີ່ໄດ້ມາຈາກ organoid ທີ່เพาะเลี้ยงໃນ Transwell ຄົງທີ່ (TW; ຮູບໃສ່ພາຍໃນກ່ອງປະສີຂາວ) ທຽບກັບຊິບປະສົມ (ຮູບເຕັມທີ່ໃຫຍ່ທີ່ສຸດ) ປຽບທຽບຮູບຮ່າງ 2D ທຽບກັບ 3D, ຕາມລຳດັບ. ມຸມມອງຕັດຂວາງແນວຕັ້ງ 2D ຄູ່ໜຶ່ງ (ຮູບໃສ່ຢູ່ມຸມຂວາເທິງ; “XZ”) ຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນລັກສະນະ 2D ແລະ 3D. ແຖບມາດຕາສ່ວນ, 100 µm.c ພິມຄືນໃໝ່ດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເອກະສານອ້າງອີງ.4. Elsevier.
ການຄວບຄຸມສາມາດກະກຽມໄດ້ໂດຍການເພາະເລี้ยงຈຸລັງດຽວກັນ (Caco-2 ຫຼື ຈຸລັງ epithelial organoid ລຳໄສ້) ໃຫ້ເປັນຊັ້ນ monolayer ສອງມິຕິພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂການເພາະເລี้ยงແບບຄົງທີ່ແບບທຳມະດາ. ໂດຍສະເພາະ, ການຫຼຸດລົງຂອງສານອາຫານອາດຈະເກີດຂຶ້ນຍ້ອນຄວາມຈຸປະລິມານທີ່ຈຳກັດຂອງຊ່ອງທາງຈຸລະພາກ (ເຊັ່ນ ~4 µL ໃນຊ່ອງທາງດ້ານເທິງໃນການອອກແບບ gut-chip ຕົ້ນສະບັບ). ດັ່ງນັ້ນ, ຮູບຮ່າງຂອງ epithelial ກ່ອນ ແລະ ຫຼັງການນຳໃຊ້ກະແສ basolateral ຍັງສາມາດປຽບທຽບໄດ້.
ຂະບວນການພິມດ້ວຍແຜ່ນອ່ອນຄວນໄດ້ຮັບການປະຕິບັດຢູ່ໃນຫ້ອງທີ່ສະອາດ. ສຳລັບແຕ່ລະຊັ້ນໃນຊິບ (ຊັ້ນເທິງ ແລະ ຊັ້ນລຸ່ມ ແລະ ເຍື່ອ) ແລະ ຊິບປະສົມ, ໂຟໂຕມາສທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ ແລະ ຜະລິດຢູ່ໃນແຜ່ນຊິລິໂຄນແຍກຕ່າງຫາກ ເພາະວ່າຄວາມສູງຂອງຊ່ອງຈຸລະພາກແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ. ຄວາມສູງເປົ້າໝາຍຂອງຊ່ອງຈຸລະພາກເທິງ ແລະ ລຸ່ມຂອງລຳໄສ້ໃນຊິບແມ່ນ 500 µm ແລະ 200 µm ຕາມລໍາດັບ. ຄວາມສູງເປົ້າໝາຍຂອງຊ່ອງຂອງຊິບປະສົມແມ່ນ 200 µm.
ວາງແຜ່ນຊິລິໂຄນຂະໜາດ 3 ນິ້ວໃສ່ໃນຖ້ວຍທີ່ມີອາເຊໂຕນ. ຄ່ອຍໆໝຸນແຜ່ນປະມານ 30 ວິນາທີ, ຈາກນັ້ນໃຫ້ແຫ້ງແຜ່ນ. ຍ້າຍແຜ່ນໃສ່ແຜ່ນທີ່ມີ IPA, ຈາກນັ້ນໝຸນແຜ່ນປະມານ 30 ວິນາທີເພື່ອເຮັດຄວາມສະອາດ.
ນ້ຳຢາປີຣານຍາ (ສ່ວນປະສົມຂອງໄຮໂດຣເຈນເປີອອກໄຊ ແລະ ກົດຊູນຟູຣິກເຂັ້ມຂຸ້ນ, 1:3 (vol/vol)) ສາມາດນຳໃຊ້ເພື່ອເພີ່ມການກຳຈັດສິ່ງເສດເຫຼືອອິນຊີອອກຈາກໜ້າດິນຂອງແຜ່ນຊິລິໂຄນໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບສູງສຸດ.
ນ້ຳຢາປາ Piranha ມີສານກັດກ່ອນຫຼາຍ ແລະ ສ້າງຄວາມຮ້ອນ. ຈຳເປັນຕ້ອງມີມາດຕະການຄວາມປອດໄພເພີ່ມເຕີມ. ສຳລັບການກຳຈັດສິ່ງເສດເຫຼືອ, ປ່ອຍໃຫ້ນ້ຳຢາເຢັນລົງ ແລະ ໂອນໄປໃສ່ຖັງຂີ້ເຫຍື້ອທີ່ສະອາດ ແລະ ແຫ້ງ. ໃຊ້ຖັງສຳຮອງ ແລະ ຕິດສະຫຼາກໃສ່ຖັງຂີ້ເຫຍື້ອຢ່າງຖືກຕ້ອງ. ກະລຸນາປະຕິບັດຕາມຄຳແນະນຳດ້ານຄວາມປອດໄພຂອງສະຖານທີ່ສຳລັບຂັ້ນຕອນລະອຽດເພີ່ມເຕີມ.
ເຮັດໃຫ້ແຜ່ນເວເຟີແຫ້ງໂດຍການວາງມັນໃສ່ຈານຮ້ອນ 200°C ເປັນເວລາ 10 ນາທີ. ຫຼັງຈາກເຮັດໃຫ້ແຫ້ງແລ້ວ, ແຜ່ນເວເຟີຖືກສັ່ນຫ້າເທື່ອໃນອາກາດເພື່ອໃຫ້ເຢັນລົງ.
ຖອກໂຟໂຕຣີຊິດ SU-8 2100 ປະມານ 10 ກຣາມ ລົງໃສ່ກາງຂອງແຜ່ນຊິລິໂຄນທີ່ເຮັດຄວາມສະອາດແລ້ວ. ໃຊ້ຄີບເພື່ອກະຈາຍໂຟໂຕຣີຊິດໃຫ້ທົ່ວແຜ່ນ. ບາງຄັ້ງວາງແຜ່ນໃສ່ແຜ່ນຄວາມຮ້ອນທີ່ມີອຸນຫະພູມ 65°C ເພື່ອເຮັດໃຫ້ໂຟໂຕຣີຊິດບໍ່ໜຽວ ແລະ ກະຈາຍງ່າຍຂຶ້ນ. ຢ່າວາງແຜ່ນໃສ່ແຜ່ນຄວາມຮ້ອນໂດຍກົງ.
SU-8 ໄດ້ຖືກແຈກຢາຍຢ່າງເທົ່າທຽມກັນຢູ່ເທິງແຜ່ນເວເຟີໂດຍການແລ່ນເຄືອບການໝຸນ. ຕັ້ງຄ່າການໝຸນເຂົ້າຂອງ SU-8 ເປັນເວລາ 5–10 ວິນາທີເພື່ອແຜ່ລາມທີ່ 500 rpm ດ້ວຍຄວາມໄວ 100 rpm/ວິນາທີ. ຕັ້ງຄ່າການໝຸນຫຼັກໃຫ້ມີຄວາມໜາ 200 µm ທີ່ 1,500 rpm, ຫຼືບັນລຸຄວາມໜາ 250 µm (ເຮັດໃຫ້ຄວາມສູງ 500 µm ສຳລັບຊັ້ນເທິງຂອງລຳໄສ້ໃນຊິບ; ເບິ່ງ "ຂັ້ນຕອນທີ່ສຳຄັນ" ຂ້າງລຸ່ມນີ້) ຕັ້ງໄວ້ທີ່ຄວາມເລັ່ງ 300 rpm/ວິນາທີ 30 ວິນາທີທີ່ 1,200 rpm.
ຄວາມໄວໃນການໝຸນຫຼັກສາມາດປັບໄດ້ຕາມຄວາມໜາຂອງເປົ້າໝາຍຂອງຮູບແບບ SU-8 ເທິງແຜ່ນຊິລິໂຄນ.
ເພື່ອສ້າງຮູບແບບ SU-8 ທີ່ມີຄວາມສູງ 500 µm ສຳລັບຊັ້ນເທິງຂອງໄສ້ເທິງຊິບ, ຂັ້ນຕອນການເຄືອບແບບໝຸນ ແລະ ຂັ້ນຕອນການອົບອ່ອນຂອງກ່ອງນີ້ (ຂັ້ນຕອນທີ 7 ແລະ 8) ໄດ້ຖືກເຮັດຊ້ຳຕາມລຳດັບ (ເບິ່ງຂັ້ນຕອນທີ 9) ເພື່ອຜະລິດສອງຊັ້ນຂອງຊັ້ນໜາ 250 µm ຂອງ SU-8, ເຊິ່ງສາມາດວາງຊັ້ນ ແລະ ເຊື່ອມຕໍ່ກັນໄດ້ໂດຍການຮັບແສງ UV ໃນຂັ້ນຕອນທີ 12 ຂອງກ່ອງນີ້, ເຮັດໃຫ້ຊັ້ນສູງ 500 µm.
ອົບເວເຟີທີ່ເຄືອບດ້ວຍ SU-8 ອ່ອນໆໂດຍການວາງເວເຟີຢ່າງລະມັດລະວັງໃສ່ຈານຮ້ອນທີ່ອຸນຫະພູມ 65°C ເປັນເວລາ 5 ນາທີ, ຈາກນັ້ນປັບການຕັ້ງຄ່າເປັນ 95°C ແລະ ອົບຕໍ່ອີກ 40 ນາທີ.
ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຄວາມສູງ 500 μm ຂອງຮູບແບບ SU-8 ໃນຊ່ອງໄມໂຄຣດ້ານເທິງ, ໃຫ້ເຮັດຊ້ຳຂັ້ນຕອນທີ 7 ແລະ 8 ເພື່ອສ້າງສອງຊັ້ນ SU-8 ໜາ 250 μm.
ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງຈັດລຽນໜ້າກາກ UV, ໃຫ້ທົດສອບໂຄມໄຟຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດເພື່ອຄິດໄລ່ເວລາການສຳຜັດກັບແຜ່ນເວເຟີ. (ເວລາການສຳຜັດ, ms) = (ປະລິມານການສຳຜັດ, mJ/cm2)/(ພະລັງງານໂຄມໄຟ, mW/cm2).
ຫຼັງຈາກກຳນົດເວລາການສຳຜັດກັບແສງແລ້ວ, ໃຫ້ວາງໂຟໂຕມາສໃສ່ຕົວຍຶດໜ້າກາກຂອງເຄື່ອງຈັດລຽນໜ້າກາກ UV ແລະ ວາງໂຟໂຕມາສໃສ່ແຜ່ນເວເຟີທີ່ເຄືອບ SU-8.
ວາງໜ້າຜິວທີ່ພິມອອກມາຂອງໂຟໂຕມາສໂດຍກົງໃສ່ດ້ານທີ່ເຄືອບ SU-8 ຂອງແຜ່ນຊິລິໂຄນເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການກະຈາຍຂອງ UV.
ເປີດແຜ່ນເວເຟີທີ່ເຄືອບດ້ວຍ SU-8 ແລະໂຟໂຕມາສໃນແນວຕັ້ງໃຫ້ໄດ້ຮັບແສງ UV 260 mJ/cm2 ຕາມເວລາທີ່ໄດ້ຮັບກຳນົດໄວ້ (ເບິ່ງຂັ້ນຕອນທີ 10 ຂອງກ່ອງນີ້).
ຫຼັງຈາກການສຳຜັດກັບ UV, ແຜ່ນຊິລິໂຄນທີ່ເຄືອບດ້ວຍ SU-8 ໄດ້ຖືກອົບທີ່ອຸນຫະພູມ 65°C ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ແລະ 95°C ເປັນເວລາ 15 ນາທີໃນແຕ່ລະແຜ່ນຮ້ອນເພື່ອປະດິດຮູບແບບທີ່ມີຄວາມສູງ 200 μm. ຂະຫຍາຍເວລາຫຼັງການອົບທີ່ອຸນຫະພູມ 95°C ເປັນ 30 ນາທີເພື່ອປະດິດຮູບແບບທີ່ມີຄວາມສູງ 500 µm.
ຜົງຟູຈະຖືກຖອກລົງໃນຖ້ວຍແກ້ວ, ແລະແຜ່ນເວເຟີທີ່ອົບແລ້ວຈະຖືກວາງລົງໃນຖ້ວຍ. ປະລິມານຂອງຜົງຟູ SU-8 ອາດແຕກຕ່າງກັນໄປຕາມຂະໜາດຂອງແຜ່ນແກ້ວ. ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າໃຊ້ຜົງຟູ SU-8 ພຽງພໍທີ່ຈະເອົາ SU-8 ທີ່ຍັງບໍ່ໄດ້ເປີດເຜີຍອອກໝົດ. ຕົວຢ່າງ, ເມື່ອໃຊ້ຖ້ວຍແກ້ວທີ່ມີເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 150 ມມ ທີ່ມີຄວາມຈຸ 1 ລິດ, ໃຫ້ໃຊ້ຜົງຟູ SU-8 ປະມານ 300 ມລ. ພັດທະນາແມ່ພິມເປັນເວລາ 25 ນາທີ ດ້ວຍການໝຸນເບົາໆເປັນບາງຄັ້ງຄາວ.
ລ້າງເຊື້ອລາທີ່ພັດທະນາແລ້ວດ້ວຍສານພັດທະນາໃໝ່ປະມານ 10 ມລ ຕາມດ້ວຍ IPA ໂດຍການສີດສານລະລາຍໂດຍໃຊ້ pipette.
ວາງແຜ່ນເວເຟີໃສ່ເຄື່ອງເຮັດຄວາມສະອາດພລາສມາ ແລະ ປ່ອຍໃຫ້ພລາສມາອົກຊີເຈນ (ອາຍແກັສບັນຍາກາດ, ຄວາມດັນເປົ້າໝາຍ 1 × 10−5 Torr, ພະລັງງານ 125 W) ເປັນເວລາ 1.5 ນາທີ.
ວາງແຜ່ນເວເຟີໃນເຄື່ອງດູດຄວາມຊຸ່ມສູນຍາກາດທີ່ມີແຜ່ນເລື່ອນແກ້ວຢູ່ພາຍໃນ. ແຜ່ນເວເຟີ ແລະ ແຜ່ນເລື່ອນສາມາດວາງຄຽງຄູ່ກັນໄດ້. ຖ້າເຄື່ອງດູດຄວາມຊຸ່ມສູນຍາກາດຖືກແບ່ງອອກເປັນຫຼາຍຊັ້ນດ້ວຍແຜ່ນ, ໃຫ້ວາງແຜ່ນເລື່ອນໄວ້ໃນຫ້ອງລຸ່ມ ແລະ ແຜ່ນເວເຟີໄວ້ໃນຫ້ອງເທິງ. ຢອດສານລະລາຍ trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane 100 μL ລົງໃນແຜ່ນເລື່ອນແກ້ວ ແລະ ໃຊ້ສູນຍາກາດເພື່ອເຮັດ silanization.
ລະລາຍແກ້ວ Caco-2 ທີ່ແຊ່ແຂງໃນອ່າງນ້ຳອຸນຫະພູມ 37°C, ຈາກນັ້ນຍ້າຍຈຸລັງທີ່ລະລາຍແລ້ວໃສ່ຂວດ T75 ທີ່ມີສານອາຫານ Caco-2 ທີ່ອຸ່ນໄວ້ກ່ອນແລ້ວອຸນຫະພູມ 37°C ຈຳນວນ 15 ມລ.
ເພື່ອຖ່າຍທອດຈຸລັງ Caco-2 ທີ່ ~90% confluency, ກ່ອນອື່ນໝົດໃຫ້ອຸ່ນສານ Caco-2, PBS, ແລະ 0.25% trypsin/1 mM EDTA ໃນອ່າງນໍ້າທີ່ມີອຸນຫະພູມ 37°C.
ດູດເອົາສານອາຫານໂດຍການດູດດ້ວຍສູນຍາກາດ. ລ້າງຈຸລັງສອງຄັ້ງດ້ວຍ PBS ອຸ່ນ 5 ມລ ໂດຍການດູດດ້ວຍສູນຍາກາດຊ້ຳໆ ແລະ ຕື່ມ PBS ໃໝ່.