Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS uchun cheklangan qo'llab-quvvatlash mavjud. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz namoyish qilamiz.
Inson ichak morfogenezi 3D epitelial mikroarxitektura va fazoviy tashkilotning kript-villus xususiyatlarini o'rnatadi. Ushbu noyob tuzilma bazal kriptdagi ildiz hujayralari joyini ekzogen mikrobial antigenlar va ularning metabolitlaridan himoya qilish orqali ichak gomeostazini saqlab qolish uchun zarur. Bundan tashqari, ichak villi va ajratuvchi shilimshiq ichak shilliq qavati yuzasida himoya to'sig'i bilan funktsional jihatdan farqlangan epitelial hujayralarni taqdim etadi. Shuning uchun, 3D epitelial tuzilmalarni qayta yaratish in vitro ichak modellarini qurish uchun juda muhimdir. Shunisi e'tiborga loyiqki, organik mimetik ichak-chip ichak epiteliysining o'z-o'zidan 3D morfogenezini kuchaytirilgan fiziologik funktsiyalar va biomexanika bilan qo'zg'atishi mumkin. Bu yerda biz mikrofluidik chipda, shuningdek, Transwell o'rnatilgan gibrid chipda ichakda ichak morfogenezini mustahkam ravishda qo'zg'atish uchun takrorlanadigan protokolni taqdim etamiz. Biz qurilma ishlab chiqarish, Caco-2 yoki ichak organoid epitelial hujayralarini an'anaviy sharoitlarda, shuningdek, mikrofluidik platformada kultivatsiya qilish, 3D morfogenezni induktsiya qilish va bir nechta tasvirlash usullaridan foydalangan holda o'rnatilgan 3D epiteliylarni tavsiflashning batafsil usullarini tasvirlaymiz. Ushbu protokol 5 kun davomida bazolateral suyuqlik oqimini boshqarish orqali funktsional ichak mikroarxitekturasini tiklashga erishadi. Bizning in vitro morfogenez usulimiz fiziologik jihatdan tegishli siljish stressi va mexanik harakatdan foydalanadi va murakkab hujayra muhandisligi yoki manipulyatsiyasini talab qilmaydi, bu esa boshqa mavjud texnikalardan ustun bo'lishi mumkin. Biz taklif qilgan protokol biotibbiyot tadqiqotlari hamjamiyati uchun keng ta'sirga ega bo'lishi mumkinligini va biotibbiyot, klinik va farmatsevtik qo'llanmalar uchun in vitro 3D ichak epiteliy qatlamlarini tiklash usulini taqdim etishini tasavvur qilamiz.
Tajribalar shuni ko'rsatadiki, ichak epiteliysi Caco-2 hujayralari gut-on-a-chip1,2,3,4,5 yoki ikki qatlamli mikrofluidik qurilmalarda6,7 o'stirilgan, asosiy mexanizmni aniq tushunmasdan in vitro sharoitida o'z-o'zidan 3D morfogenezga duch kelishi mumkin. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotimizda biz bazolateral ravishda ajralib chiqadigan morfogen antagonistlarini madaniyat qurilmalaridan olib tashlash in vitro sharoitida 3D epitelial morfogenezni qo'zg'atish uchun zarur va etarli ekanligini aniqladik, bu Caco-2 va bemordan olingan ichak organoidlari tomonidan ko'rsatilgan. Epitelial hujayralar tekshirildi. Ushbu tadqiqotda biz kuchli Wnt antagonisti Dickkopf-1 (DKK-1) ning hujayra ishlab chiqarilishi va konsentratsiyasining taqsimlanishiga, xususan, "Gibrid Chip" deb nomlangan Transwell qo'shimchalarini o'z ichiga olgan gut-on-a-chip va modifikatsiyalangan mikrofluidik qurilmalarda e'tibor qaratdik. Biz ekzogen Wnt antagonistlarini (masalan, DKK-1, Wnt repressor 1, ajralib chiqqan jingalak bilan bog'liq oqsil 1 yoki Soggy-1) chipdagi ichakka qo'shish morfogenezni inhibe qilishini yoki oldindan tuzilgan 3D epitelial qatlamni buzishini ko'rsatamiz, bu esa madaniyat paytida antagonistik stress in vitro sharoitida ichak morfogenezi uchun javobgar ekanligini ko'rsatadi. Shuning uchun, epitelial interfeysda mustahkam morfogenezga erishishning amaliy yondashuvi faol yuvish (masalan, gut-on-a-chip yoki gibrid-on-a-chip platformalarida) yoki diffuziya orqali bazolateral bo'limdagi Wnt antagonistlari darajasini olib tashlash yoki minimal darajada ushlab turishdir. Bazolateral muhit (masalan, Transwell qo'shimchalaridan quduqlardagi katta bazolateral rezervuarlarga).
Ushbu protokolda biz ichak epiteliy hujayralarini polidimetilsiloksan (PDMS) asosidagi g'ovak membranalarda (6A, 7A, 8, 9 bosqichlar) yoki Transwell qo'shimchalarining poliester membranalarida (6B, 7B, 8, 9 bosqichlar) kultivatsiya qilish va in vitro 3D morfogenezni induktsiya qilish uchun ichak-chip mikroqurilmalari va Transwell-insertatsiya qilinadigan gibrid chiplarni (1-5 bosqichlar) ishlab chiqarishning batafsil usulini taqdim etamiz (10-bosqich). Shuningdek, biz bir nechta tasvirlash usullarini qo'llash orqali to'qimaga xos gistogenez va naslga bog'liq hujayra differentsiatsiyasini ko'rsatuvchi hujayra va molekulyar xususiyatlarni aniqladik (11-24 bosqichlar). Biz Caco-2 yoki ichak organoidlari kabi inson ichak epiteliy hujayralari yordamida morfogenezni ikkita madaniyat formatida, texnik tafsilotlar bilan, jumladan, g'ovak membranalarning sirt modifikatsiyasi, 2D monoqatlamlarni yaratish va ichak biokimyoviy va biomexanik mikro muhitni ko'paytirishni in vitro sharoitida induktsiya qilamiz. 2D epiteliy monoqatlamlaridan 3D morfogenezni induktsiya qilish uchun biz morfogen antagonistlarini olib tashladik. ikkala madaniyatlangan shakl ham muhitni madaniyatning bazolateral bo'limiga oqib o'tish orqali amalga oshiriladi. Va nihoyat, biz morfogenga bog'liq epitelial o'sishni, uzunlamasına xost-mikrobiom qo'shma madaniyatlarini, patogen infektsiyasini, yallig'lanish shikastlanishini, epitelial to'siq disfunktsiyasini va probiotiklarga asoslangan terapiyalarni modellashtirish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan qayta tiklanadigan 3D epitelial qatlamning foydaliligini taqdim etamiz. Misol. ta'sirlar.
Bizning protokolimiz asosiy (masalan, ichak shilliq qavati biologiyasi, ildiz hujayralari biologiyasi va rivojlanish biologiyasi) va amaliy tadqiqotlar (masalan, klinikadan oldingi dori vositalarini sinash, kasalliklarni modellashtirish, to'qima muhandisligi va gastroenterologiya) sohasidagi keng ko'lamli olimlar uchun foydali bo'lishi mumkin. In vitro sharoitida ichak epiteliysining 3D morfogenezini keltirib chiqaradigan protokolimizning takrorlanishi va mustahkamligi tufayli biz texnik strategiyamizni ichak rivojlanishi, regeneratsiyasi yoki gomeostaz paytida hujayra signalizatsiyasi dinamikasini o'rganayotgan auditoriyaga tarqatish mumkinligini tasavvur qilamiz. Bundan tashqari, bizning protokolimiz Norovirus 8, Og'ir O'tkir Respirator Sindromi Koronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 yoki Vibrio cholerae kabi turli yuqumli agentlar ta'sirida infektsiyani tekshirish uchun foydalidir. Kasallik patologiyasi va patogenezi auditoriyasi ham foydalidir. Chipdagi ichak mikrofiziologiyasi tizimidan foydalanish uzunlamasına qo'shma madaniyat 10 va keyinchalik oshqozon-ichak traktida (OIT) xo'jayin himoyasi, immun javoblari va patogen bilan bog'liq shikastlanishni tiklashni baholash imkonini beradi 11. Oqayotgan ichak sindromi, çölyak kasalligi, Kron kasalligi, yarali kolit, puxit yoki irritabiy ichak sindromi bilan bog'liq boshqa OIT kasalliklari bemorning 3D ichak epiteliy qatlamlari yordamida 3D ichak epiteliy qatlamlari tayyorlanganda simulyatsiya qilinishi mumkin, bu kasalliklarga villus atrofiyasi, kript qisqarishi, shilliq qavatning shikastlanishi yoki epiteliy to'sig'ining buzilishi kiradi. Biopsiya yoki ildiz hujayralaridan olingan ichak organoidlari 12,13. Kasallik muhitining yuqori murakkabligini yaxshiroq modellashtirish uchun o'quvchilar 3D ichak villus-kript mikroarxitekturalarini o'z ichiga olgan modellarga bemorning periferik qon mononuklear hujayralari (PBMC) kabi kasallikka tegishli hujayra turlarini qo'shishni ko'rib chiqishlari mumkin. to'qimaga xos immun hujayralar, 5.
3D epitelial mikrotuzilmani kesish jarayonisiz fiksatsiya qilish va vizualizatsiya qilish mumkinligi sababli, fazoviy transkriptomika va yuqori aniqlikdagi yoki super aniqlikdagi tasvirlar ustida ishlaydigan tomoshabinlar epitelial nishlardagi genlar va oqsillarning fazoviy-vaqtinchalik dinamikasini xaritalashimizga qiziqishlari mumkin. Texnologiyaga qiziqish. Mikrobial yoki immun stimullarga javob. Bundan tashqari, ichak gomeostazini muvofiqlashtiradigan uzunlamasına xost-mikrobiom o'zaro ta'siri 10, 14 3D ichak shilliq qavatida turli mikrobial turlarni, mikrobial jamoalarni yoki najas mikrobiotalarini, ayniqsa ichak-on-a-chipda birgalikda kultivatsiya qilish orqali o'rnatilishi mumkin. platformada. Ushbu yondashuv, ayniqsa, laboratoriyada ilgari madaniyatsiz ichak mikrobiotasini o'stirishga intilayotgan shilliq qavat immunologiyasi, gastroenterologiya, inson mikrobiomi, kulturomika va klinik mikrobiologiyani o'rganayotgan auditoriyalar uchun jozibadordir. Agar bizning in vitro morfogenez protokolimiz 24, 96 yoki 384 quduq plastinkalaridagi ko'p quduqli qo'shimchalar kabi kengaytiriladigan madaniyat formatlariga moslashtirilsa, ular bazolateral bo'linmalarni doimiy ravishda to'ldiradi, bu protokol oziq-ovqat sanoati uchun farmatsevtika, biotibbiyot yoki yuqori o'tkazuvchanlikdagi skrining yoki tasdiqlash platformalarini ishlab chiqayotganlarga ham tarqatilishi mumkin. Printsipning isboti sifatida biz yaqinda 24 quduqli plastinka formatiga kengaytiriladigan multipleks yuqori o'tkazuvchanlikdagi morfogenez tizimining imkoniyatlarini namoyish etdik. Bundan tashqari, chipdagi bir nechta organli mahsulotlar tijoratlashtirildi16,17,18. Shuning uchun, bizning in vitro morfogenez usulimizni tasdiqlash tezlashtirilishi va ko'plab tadqiqot laboratoriyalari, sanoat yoki hukumat va tartibga solish organlari tomonidan dorilarni sinab ko'rish uchun transkriptomik darajada in vitro ichak morfogenezini hujayrali qayta dasturlashni tushunish uchun qo'llanilishi mumkin. yoki bioterapevtik vositalar Dori nomzodlarining so'rilishi va tashilishi ichak morfogenezi jarayonining takrorlanuvchanligini baholash uchun 3D ichak surrogatlari yoki maxsus yoki tijorat organ-on-a-chip modellari yordamida baholandi.
In vitro sharoitida 3D morfogenezni qo'zg'atish uchun amalga oshiriladigan protokollarning yo'qligi sababli, ichak epiteliysi morfogenezini o'rganish uchun cheklangan miqdordagi insonga tegishli eksperimental modellar qo'llanilgan. Darhaqiqat, ichak morfogenezi haqidagi mavjud bilimlarning aksariyati hayvonlarni o'rganishga asoslangan (masalan, zebrafish20, sichqonlar21 yoki tovuqlar22). Biroq, ular mehnat va xarajatlarni talab qiladi, axloqiy jihatdan shubhali bo'lishi mumkin va eng muhimi, inson rivojlanish jarayonlarini aniq aniqlamaydi. Bu modellar ko'p tomonlama miqyoslanadigan tarzda sinovdan o'tkazish qobiliyatida ham juda cheklangan. Shuning uchun, in vitro sharoitida 3D to'qima tuzilmalarini tiklash protokolimiz in vivo hayvon modellaridan, shuningdek, boshqa an'anaviy statik 2D hujayra madaniyati modellaridan ustun turadi. Avval aytib o'tilganidek, 3D epitelial tuzilmalardan foydalanish bizga turli shilliq qavat yoki immunitet stimullariga javoban kript-villus o'qida differentsiatsiyalangan hujayralarning fazoviy lokalizatsiyasini o'rganish imkonini berdi. 3D epitelial qatlamlar mikrobial hujayralar fazoviy nishlarni hosil qilish uchun qanday raqobatlashishini va mezbon omillarga (masalan, ichki va tashqi shilliq qavatlar, sekretsiyasi) javoban ekologik evolyutsiyani o'rganish uchun joy yaratishi mumkin. IgA va antimikrobiyal peptidlar). Bundan tashqari, 3D epitelial morfologiya bizga ichak mikrobiotasi o'z jamoalarini qanday tuzishini va bazal kriptlarda hujayra tuzilishini va ildiz hujayralari nishlarini shakllantiruvchi mikrobial metabolitlarni (masalan, qisqa zanjirli yog 'kislotalari) sinergik ravishda ishlab chiqarishini tushunishga imkon beradi. Bu xususiyatlar faqat 3D epitelial qatlamlar in vitro sharoitida o'rnatilganda namoyon bo'lishi mumkin.
3D ichak epiteliy tuzilmalarini yaratish usulimizdan tashqari, bir nechta in vitro usullar mavjud. Ichak organoid madaniyati - bu ma'lum morfogen sharoitlarda ichak ildiz hujayralarini yetishtirishga asoslangan zamonaviy to'qima muhandisligi texnikasi23,24,25. Biroq, transport tahlili yoki xost-mikrobiom qo'shma madaniyati uchun 3D organoid modellaridan foydalanish ko'pincha qiyinchilik tug'diradi, chunki ichak lümeni organoid ichida joylashgan va shuning uchun mikrobial hujayralar yoki ekzogen antigenlar kabi lümen komponentlarini kiritish cheklangan. Organoid lümenlariga kirishni mikroinjektor yordamida yaxshilash mumkin,26,27, ammo bu usul invaziv va mehnat talab qiladi va bajarish uchun maxsus bilimlarni talab qiladi. Bundan tashqari, statik sharoitlarda gidrogel iskalalarida saqlanadigan an'anaviy organoid madaniyatlari in vivo faol biomekanikani aniq aks ettirmaydi.
Bir nechta tadqiqot guruhlari tomonidan qo'llaniladigan boshqa yondashuvlar gel yuzasida izolyatsiya qilingan inson ichak hujayralarini kultivatsiya qilish orqali ichak epiteliy tuzilishini taqlid qilish uchun oldindan tuzilgan 3D gidrogel iskalalaridan foydalanadi. 3D bosilgan, mikro-frezalangan yoki litografik usulda tayyorlangan qoliplardan foydalangan holda gidrogel iskalalarini yasang. Bu usul izolyatsiya qilingan epiteliy hujayralarining in vitro fiziologik jihatdan tegishli morfogen gradientlari bilan o'z-o'zini tashkil etgan joylashuvini ko'rsatadi, iskala ichiga stromal hujayralarni qo'shish orqali yuqori aspekt nisbati epiteliy tuzilishini va stroma-epitelial o'zaro ta'sirini o'rnatadi. Biroq, oldindan tuzilgan iskalalarning tabiati o'z-o'zidan paydo bo'ladigan morfogenetik jarayonning o'zini namoyon qilishiga to'sqinlik qilishi mumkin. Bu modellar, shuningdek, dinamik luminal yoki interstitsial oqimni ta'minlamaydi, ichak hujayralari morfogenezdan o'tishi va fiziologik funktsiyani olishi uchun zarur bo'lgan suyuqlikni kesish stressidan mahrum. Yaqinda o'tkazilgan yana bir tadqiqotda mikrofluidik platformadagi gidrogel iskalalari va lazer bilan o'yish texnikasidan foydalangan holda naqshli ichak epiteliy tuzilmalari ishlatilgan. Sichqoncha ichak organoidlari ichak naychali tuzilmalarini hosil qilish uchun o'yilgan naqshlarga amal qiladi va intraluminal suyuqlik oqimi bo'lishi mumkin. mikrofluidika moduli yordamida takrorlangan. Biroq, bu model na o'z-o'zidan paydo bo'ladigan morfogenetik jarayonlarni namoyish etadi, na ichak mexanobiologik harakatlarini o'z ichiga oladi. Xuddi shu guruhdagi 3D bosib chiqarish texnikasi o'z-o'zidan paydo bo'ladigan morfogenetik jarayonlarga ega miniatyura ichak naychalarini yaratishga muvaffaq bo'ldi. Naycha ichidagi turli ichak segmentlarining murakkab ishlab chiqarilishiga qaramay, ushbu modelda luminal suyuqlik oqimi va mexanik deformatsiya ham yo'q. Bundan tashqari, modelning ishlashi cheklangan bo'lishi mumkin, ayniqsa bioprinting jarayoni tugagandan so'ng, eksperimental sharoitlarni buzish yoki hujayralararo o'zaro ta'sirlar. Buning o'rniga, bizning taklif qilingan protokolimiz ichakning o'z-o'zidan paydo bo'ladigan morfogenezini, fiziologik jihatdan tegishli siljish stressini, ichak harakatini taqlid qiluvchi biomekanikani, mustaqil apikal va bazolateral bo'linmalarning mavjudligini va modulli murakkab biologik mikro muhitlarni qayta yaratishni ta'minlaydi. Shuning uchun, bizning in vitro 3D morfogenez protokolimiz mavjud usullarning qiyinchiliklarini yengish uchun qo'shimcha yondashuvni taqdim etishi mumkin.
Bizning protokolimiz butunlay 3D epitelial morfogenezga qaratilgan bo'lib, madaniyatda faqat epitelial hujayralar mavjud va mezenximal hujayralar, endotelial hujayralar va immun hujayralari kabi boshqa atrofdagi hujayralar yo'q. Avval aytib o'tilganidek, protokolimizning asosiy qismi kiritilgan muhitning bazolateral tomonida ajralib chiqadigan morfogen ingibitorlarini olib tashlash orqali epitelial morfogenezni induktsiya qilishdir. Bizning ichak-chipdagi va gibrid-chipdagi mustahkam modulyarligimiz bizga to'lqinsimon 3D epitelial qatlamni qayta yaratishga imkon bersa-da, epitelial-mezenximal o'zaro ta'sirlar 33,34, hujayradan tashqari matritsa (ECM) cho'kishi 35 va bizning modelimizda bazal kriptlarda ildiz hujayralari nishlarini ko'rsatadigan kript-villus xususiyatlari kabi qo'shimcha biologik murakkabliklar bundan keyin ham ko'rib chiqilishi kerak. Mezenximadagi stromal hujayralar (masalan, fibroblastlar) ECM oqsillarini ishlab chiqarishda va in vivo ichak morfogenezini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi 35,37,38. Bizning modelimizga mezenximal hujayralarning qo'shilishi morfogenetik jarayonni va hujayrani kuchaytirdi biriktirish samaradorligi. Endotelial qatlam (ya'ni kapillyarlar yoki limfa tomirlari) ichak mikro muhitida molekulyar transportni39 va immun hujayralarini jalb qilishni40 tartibga solishda muhim rol o'ynaydi. Bundan tashqari, to'qima modellari ko'p organli o'zaro ta'sirlarni namoyish etish uchun mo'ljallanganida, to'qima modellari o'rtasida bog'lanishi mumkin bo'lgan qon tomir komponentlari zaruriy shart hisoblanadi. Shuning uchun, organ darajasidagi aniqlik bilan aniqroq fiziologik xususiyatlarni modellashtirish uchun endotelial hujayralarni kiritish kerak bo'lishi mumkin. Bemordan olingan immun hujayralari, shuningdek, ichak kasalligini taqlid qilish kontekstida tug'ma immun javoblarni, antigen taqdimotini, tug'ma adaptiv immun o'zaro ta'sirini va to'qimaga xos immunitetni namoyish etish uchun ham muhimdir.
Gibrid chiplardan foydalanish ichak-chipga qaraganda osonroq, chunki qurilma sozlamalari sodda va Transwell qo'shimchalaridan foydalanish ichak epiteliysining masshtablanadigan kulturasini olish imkonini beradi. Biroq, poliester membranalari bo'lgan tijoratda mavjud bo'lgan Transwell qo'shimchalari elastik emas va peristaltikka o'xshash harakatlarni simulyatsiya qila olmaydi. Bundan tashqari, gibrid chipga joylashtirilgan Transwell qo'shimchasining apikal bo'limi apikal tomonda siljish kuchlanishisiz harakatsiz qoldi. Shubhasiz, apikal bo'limdagi statik xususiyatlar kamdan-kam hollarda gibrid chiplarda uzoq muddatli bakteriyalarni birgalikda kulturalashga imkon beradi. Gibrid chiplardan foydalanganda Transwell qo'shimchalarida 3D morfogenezni kuchli ravishda qo'zg'ata olsak-da, fiziologik jihatdan tegishli biomexanika va apikal suyuqlik oqimining yetishmasligi gibrid chip platformalarining potentsial qo'llanilishi uchun imkoniyatlarini cheklashi mumkin.
Inson kript-villus o'qini gut-on-a-chip va gibrid-on-a-chip madaniyatlarida to'liq miqyosli rekonstruksiya qilish to'liq aniqlanmagan. Morfogenez epitelial monoqatlamdan boshlanganligi sababli, 3D mikroarxitekturalar in vivo sharoitida kriptlarga morfologik o'xshashlikni ta'minlamaydi. Mikromuhandislik qilingan 3D epiteliyda bazal kript domeni yaqinida ko'payuvchi hujayra populyatsiyasini tavsiflagan bo'lsak-da, kript va villus mintaqalari aniq chegaralanmagan edi. Chipdagi yuqori yuqori kanallar mikromuhandislik qilingan epiteliyning balandligining oshishiga olib kelsa-da, maksimal balandlik hali ham ~300–400 µm bilan cheklangan. Ingichka va yo'g'on ichaklardagi inson ichak kriptlarining haqiqiy chuqurligi mos ravishda ~135 µm va ~400 µm ni tashkil qiladi va ingichka ichak villuslarining balandligi ~600 µm ni tashkil qiladi41.
Tasvirlash nuqtai nazaridan, 3D mikroarxitekturalarning in situ super aniqlikdagi tasviri chipdagi ichak bilan cheklanishi mumkin, chunki obyektiv linzadan epitelial qatlamgacha bo'lgan ish masofasi bir necha millimetr atrofida. Bu muammoni hal qilish uchun uzoqdagi obyektiv talab qilinishi mumkin. Bundan tashqari, PDMS ning yuqori elastikligi tufayli tasvir namunalarini tayyorlash uchun yupqa bo'laklar yasash qiyin. Bundan tashqari, chipdagi ichakning qatlamma-qavat mikrofabrikatsiyasi har bir qatlam o'rtasida doimiy yopishishni o'z ichiga olganligi sababli, epitelial qatlamning sirt tuzilishini tekshirish uchun yuqori qatlamni ochish yoki olib tashlash juda qiyin. Masalan, skanerlovchi elektron mikroskop (SEM) yordamida.
PDMS ning gidrofobikligi gidrofob kichik molekulalar bilan bog'liq mikrofluidik asosidagi tadqiqotlarda cheklovchi omil bo'lib kelgan, chunki PDMS bunday gidrofob molekulalarni nospesifik adsorbsiyalashi mumkin. PDMS ga alternativalarni boshqa polimer materiallar bilan ko'rib chiqish mumkin. Shu bilan bir qatorda, gidrofob molekulalarning adsorbsiyasini minimallashtirish uchun PDMS ning sirt modifikatsiyasini (masalan, lipofil materiallar 42 yoki poli (etilen glikol) 43 bilan qoplash) ko'rib chiqish mumkin.
Nihoyat, bizning usulimiz yuqori o'tkazuvchanlikdagi skrining yoki "barchaga mos keladigan" foydalanuvchilar uchun qulay eksperimental platformani taqdim etish nuqtai nazaridan yaxshi tavsiflanmagan. Amaldagi protokol har bir mikroqurilma uchun shprits nasosini talab qiladi, bu CO2 inkubatorida joy egallaydi va keng ko'lamli tajribalarning oldini oladi. Bu cheklovni innovatsion madaniyat formatlarining (masalan, bazolateral muhitni doimiy ravishda to'ldirish va olib tashlash imkonini beruvchi 24-quduqli, 96-quduqli yoki 384-quduqli g'ovakli qo'shimchalar) masshtablash imkoniyati orqali sezilarli darajada yaxshilash mumkin.
In vitro sharoitida inson ichak epiteliysining 3D morfogenezini qo'zg'atish uchun biz ikkita parallel mikrokanal va ular orasida elastik g'ovak membrana bo'lgan mikrofluidik chipli ichak moslamasidan foydalandik, bu esa lümen-kapillyar interfeysni yaratishga yordam berdi. Shuningdek, biz Transwell qo'shimchalarida o'stirilgan qutblangan epitelial qatlamlar ostida uzluksiz bazolateral oqimni ta'minlaydigan bitta kanalli mikrofluidik qurilmadan (gibrid chip) foydalanishni namoyish etamiz. Ikkala platformada ham turli xil inson ichak epiteliy hujayralarining morfogenezini morfogen antagonistlarini bazolateral bo'linmadan olib tashlash uchun oqimning yo'naltirilgan manipulyatsiyasini qo'llash orqali namoyish etish mumkin. Butun eksperimental protsedura (1-rasm) besh qismdan iborat: (i) ichak chipini yoki Transwell qo'shiladigan gibrid chipini mikrofabrikatsiya qilish (1-5 bosqichlar; 1-quti), (ii) ichak epiteliy hujayralarini (Caco-2 hujayralari) yoki inson ichak organoidlarini tayyorlash; 2-5-qutilar), (iii) ichak epiteliy hujayralarini ichak chiplari yoki gibrid chiplarda kultivatsiya qilish (6-9-bosqichlar), (iv) 3D epiteliy mikrotuzilmasini tavsiflash uchun in vitro sharoitida 3D morfogenezni induksiya qilish (10-bosqich) va (v)). Nihoyat, epitelial morfogenezni fazoviy, vaqtinchalik, shartli yoki protsedurali nazorat bilan taqqoslash orqali in vitro morfogenezning samaradorligini tasdiqlash uchun tegishli nazorat guruhi (quyida batafsilroq muhokama qilinadi) ishlab chiqildi.
Biz ikkita turli xil madaniyat platformasidan foydalandik: to'g'ri kanalli yoki chiziqli bo'lmagan konvolyut kanalli ichak-chip yoki 1-qutida tasvirlanganidek ishlab chiqarilgan mikrofluidik qurilmada Transwell (TW) qo'shimchalarini o'z ichiga olgan gibrid chiplar va 1-5-bosqich. “Qurilma ishlab chiqarish” bitta chip yoki gibrid chip tayyorlashning asosiy bosqichlarini ko'rsatadi. “Inson ichak epiteliy hujayralarini kultivatsiya qilish” ushbu protokolda ishlatiladigan hujayra manbasini (Caco-2 yoki inson ichak organoidlari) va madaniyat jarayonini tushuntiradi. “In vitro morfogenezi” Caco-2 yoki organoiddan olingan epitelial hujayralar ichak chipida yoki gibrid chipning Transwell qo'shimchalarida kultivatsiya qilinadigan umumiy bosqichlarni ko'rsatadi, so'ngra 3D morfogenez induksiyasi va xarakterli epitelial struktura hosil bo'ladi. Dastur bosqichi raqami yoki quti raqami har bir strelka ostida ko'rsatiladi. Ilovada o'rnatilgan ichak epiteliy qatlamlaridan qanday foydalanish mumkinligi haqida misollar keltirilgan, masalan, hujayra differentsiatsiyasini tavsiflashda, ichak fiziologiyasini o'rganishda, xost-mikrobiom ekotizimlarini yaratishda va kasalliklarni modellashtirishda. “Hujayra”dagi immunofluoresensiya tasvirlari. "Differensiatsiya" ichak chipida hosil bo'lgan 3D Caco-2 epitelial qatlamida ifodalangan yadrolar, F-aktin va MUC2 ni ko'rsatadi. MUC2 signalizatsiyasi qadah hujayralarida va shilliq qavat yuzalaridan ajralib chiqadigan shilimshiqda mavjud. Gut Physiology jurnalidagi lyuminestsent tasvirlar lyuminestsent bug'doy urug'i agglyutininidan foydalanib, sial kislotasi va N-atsetilglyukozamin qoldiqlarini bo'yash orqali hosil bo'lgan shilimshiqni ko'rsatadi. "Xost-Mikrob qo'shma madaniyatlari" jurnalidagi ikkita bir-biriga mos keladigan tasvirlar chipdagi ichakdagi vakillik qiluvchi xost-mikrobiom qo'shma madaniyatlarini ko'rsatadi. Chap panelda mikroinjeneriya qilingan 3D Caco-2 epitelial hujayralari bilan yashil lyuminestsent oqsilni (GFP) ifodalovchi E. coli qo'shma madaniyati ko'rsatilgan. O'ng panelda 3D Caco-2 epitelial hujayralari bilan qo'shma madaniyatlangan GFP E. coli lokalizatsiyasi, so'ngra F-aktin (qizil) va yadrolar (ko'k) bilan immunofloresans bo'yalishi ko'rsatilgan. Kasalliklarni modellashtirish bakterial antigenlar (masalan, lipopolisaxarid,) bilan fiziologik qiyinchilik ostida ichak yallig'lanishi chiplarida sog'lom va oqayotgan ichakni ko'rsatadi. LPS) va immun hujayralari (masalan, PBMC; yashil). Caco-2 hujayralari 3D epitelial qatlam hosil qilish uchun kultivatsiya qilindi. Masshtab chizig'i, 50 µm. Pastki qatordagi rasmlar: “Hujayralarning differentsiatsiyasi” ma'lumotnomadan ruxsat bilan moslashtirilgan.2. Oxford University Press; 5-havoladan ruxsat bilan qayta nashr etilgan. NAS; “Xost-Mikrob qo'shma madaniyati” 3-havoladan ruxsat bilan moslashtirilgan. NAS; “Kasallik modellashtirish” ma'lumotnomadan ruxsat bilan moslashtirilgan.5. NAS.
Chipdagi ichak va gibrid chiplar yumshoq litografiya1,44 yordamida kremniy qoliplaridan demontaj qilingan va SU-8 bilan naqshlangan PDMS replikalari yordamida ishlab chiqarilgan. Har bir chipdagi mikrokanallarning dizayni siljish kuchlanishi va gidrodinamik bosim1,4,12 kabi gidrodinamikani hisobga olgan holda aniqlanadi. Ikkita yonma-yon joylashgan parallel tekis mikrokanallardan tashkil topgan asl ich-chipdagi dizayn (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1a-rasm) murakkab ich-chipdagi chipga (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1b-rasm) aylandi, bu suyuqlikning ko'payish vaqtini, chiziqli bo'lmagan oqim naqshlarini va madaniy hujayralarning ko'p o'qli deformatsiyasini keltirib chiqarish uchun bir juft egri mikrokanallarni o'z ichiga oladi (2a–f-rasm). 12. Murakkabroq ichak biomexanikasini qayta yaratish kerak bo'lganda, murakkab ich-chipdagi chiplarni tanlash mumkin. Biz shuni ko'rsatdikki, ixcham ich-chip ham xuddi shunday vaqt oralig'ida epitelial o'sish darajasi bilan 3D morfogenezni kuchli ravishda qo'zg'atadi. Gut-Chip, madaniyatlangan hujayra turidan qat'i nazar. Shuning uchun, 3D morfogenezni qo'zg'atish uchun chiziqli va murakkab chipdagi ichak dizaynlari bir-birining o'rnini bosadi. SU-8 naqshlari bilan kremniy qoliplarida davolangan PDMS replikalari demontajdan keyin salbiy xususiyatlarni ta'minladi (2a-rasm). Chipda ichakni tayyorlash uchun tayyorlangan yuqori PDMS qatlami ketma-ket g'ovakli PDMS plyonkasiga bog'landi va keyin korona ishlov beruvchi yordamida qaytarib bo'lmaydigan bog'lanish orqali pastki PDMS qatlami bilan tekislandi (2b-f-rasm). Gibrid chiplarni tayyorlash uchun davolangan PDMS replikalari Transwell qo'shimchalarini joylashtira oladigan bitta kanalli mikrofluidik qurilmalarni yaratish uchun shisha slaydlarga bog'landi (2h-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 2-rasm). Bog'lash jarayoni PDMS replikasi va oynasining sirtlarini kislorod plazmasi yoki korona ishlovi bilan ishlov berish orqali amalga oshiriladi. Silikon naychaga biriktirilgan mikrofabrikatsiya qilingan qurilmani sterilizatsiya qilgandan so'ng, qurilma sozlamalari ichak epiteliysining 3D morfogenezini bajarishga tayyor edi (2g-rasm).
a, SU-8 naqshli kremniy qoliplaridan PDMS qismlarini tayyorlashning sxematik illyustratsiyasi. Qottirilmagan PDMS eritmasi kremniy qolipga quyildi (chapda), 60 °C da qotib qoldi (o'rtada) va demontaj qilindi (o'ngda). Demontaj qilingan PDMS bo'laklarga bo'lindi va keyingi foydalanish uchun tozalandi.b, PDMS yuqori qatlamini tayyorlash uchun ishlatiladigan kremniy qolipining fotosurati.c, PDMS g'ovakli membranasini tayyorlash uchun ishlatiladigan kremniy qolipining fotosurati.d, Yuqori va pastki PDMS komponentlari va yig'ilgan chipli ichak qurilmasining bir qator fotosuratlari.e, Yuqori, membrana va pastki PDMS komponentlarining hizalanishining sxemasi. Har bir qatlam plazma yoki korona bilan ishlov berish orqali qaytarib bo'lmaydigan tarzda bog'langan.f, Qoplangan burama mikrokanallar va vakuum kameralari bilan tayyorlangan chipli ichak qurilmasining sxemasi.g, Mikrofluidik hujayra kulturasi uchun chipli ichakni o'rnatish. Silikon naycha va shprits bilan yig'ilgan chipli tayyorlangan ichak qopqoq ustiga qo'yildi. Chip qurilmasi qopqog'iga qo'yildi. Qayta ishlash uchun 150 mm Petri idishi. Bog'lovchi silikon naychani yopish uchun ishlatiladi.h, Gibrid chiplar ishlab chiqarish va gibrid chiplar yordamida 3D morfogenezning vizual suratlari. Ichak epiteliy hujayralarining 2D monoqatlamlarini gibrid chipga mustaqil ravishda yetishtirish uchun tayyorlangan Transwell qo'shimchalari ichak 3D morfogenezini qo'zg'atish uchun kiritildi. Muhit Transwell qo'shimchasida o'rnatilgan hujayra qatlami ostidagi mikrokanallar orqali perfuz qilinadi. Masshtab chizig'i, 1 sm.h Malumotnomadan ruxsat bilan qayta bosilgan.4. Elsevier.
Ushbu protokolda Caco-2 hujayra liniyasi va ichak organoidlari epitelial manbalar sifatida ishlatilgan (3a-rasm). Ikkala turdagi hujayralar ham mustaqil ravishda o'stirildi (2-quti va 5-quti) va chip ichidagi ichak yoki Transwell qo'shimchalarining ECM bilan qoplangan mikrokanallarini ekish uchun ishlatilgan. Hujayralar birlashganda (flakonlarda >95% qoplama), T-flakonlardagi muntazam ravishda o'stirilgan Caco-2 hujayralari (10 va 50-yo'laklar oralig'ida) tripsinizatsiya suyuqligi yordamida dissotsiatsiyalangan hujayra suspenziyalarini tayyorlash uchun yig'ib olinadi (2-quti). Ichak biopsiyalari yoki jarrohlik rezektsiyalaridan olingan inson ichak organoidlari strukturaviy mikro muhitni qo'llab-quvvatlash uchun 24 teshikli plastinkalardagi Matrigel iskala gumbazlarida o'stirildi. 3-qutida tasvirlanganidek tayyorlangan muhim morfogenlar (masalan, Wnt, R-spondin va Noggin) va o'sish omillarini o'z ichiga olgan muhit organoidlar diametri ~500 µm gacha o'sguncha har ikki kunda qo'shildi. To'liq o'sgan organoidlar yig'ib olinadi va dissotsiatsiyalanadi. ichak yoki chipdagi Transwell qo'shimchalariga ekish uchun bitta hujayralarga (5-quti). Avval xabar berganimizdek, uni kasallik turiga qarab farqlash mumkin12,13 (masalan, yarali kolit, Kron kasalligi, yo'g'on ichak saratoni yoki normal donor), shikastlanish joyiga (masalan, shikastlanish yoki shikastlanmagan sohaga) va traktdagi oshqozon-ichak joylashuviga (masalan, o'n ikki barmoqli ichak, jejunum, ileum, ko'richak, yo'g'on ichak yoki to'g'ri ichak) qarab. Biz 5-qutida odatda ingichka ichak organoidlariga qaraganda yuqori konsentratsiyali morfogenlarni talab qiladigan yo'g'on ichak organoidlarini (koloidlarni) kultivatsiya qilish uchun optimallashtirilgan protokolni taqdim etamiz.
a, Ichak chipida ichak morfogenezini induktsiya qilish uchun ish jarayoni. Ushbu protokolda 3D morfogenezni namoyish qilish uchun Caco-2 inson ichak epiteliyasi va ichak organoidlari qo'llaniladi. Izolyatsiya qilingan epitelial hujayralar tayyorlangan ichak-chip qurilmasiga (chip tayyorlash) ekilgan. Hujayralar 0-kuni (D0) PDMS g'ovak membranasiga ekilgandan (ekilgandan) va biriktirilgandan (biriktirilgandan) so'ng, apikal (AP) oqim boshlanadi va dastlabki 2 kun davomida saqlanadi (oqim, AP, D0-D2). To'liq 2D monoqatlam hosil bo'lganda, bazolateral (BL) oqim ham tsiklik cho'zilish harakatlari (cho'zilish, oqim, AP va BL) bilan birga boshlanadi. Ichak 3D morfogenezi 5 kunlik mikrofluidik madaniyatdan so'ng o'z-o'zidan paydo bo'ldi (morfogenez, D5). Faza kontrastli tasvirlar har bir eksperimental bosqichda yoki vaqt nuqtasida Caco-2 hujayralarining vakillik morfologiyasini ko'rsatadi (ustunli grafik, 100 µm). Ichak morfogenezining mos keladigan kaskadlarini ko'rsatuvchi to'rtta sxematik diagramma (yuqorida) o'ngda). Sxemadagi punktir strelkalar suyuqlik oqimining yo'nalishini ifodalaydi.b, SEM tasviri o'rnatilgan 3D Caco-2 epiteliysining sirt topologiyasini ko'rsatadi (chapda). Kattalashtirilgan maydonni ajratib ko'rsatuvchi qo'shimcha rasmda (oq punktir katakcha) 3D Caco-2 qatlamidagi regeneratsiyalangan mikrovorsinkalar ko'rsatilgan (o'ngda).c, O'rnatilgan Caco-2 3D, klaudin (ZO-1, qizil) va F-aktin (yashil) va yadrolar (ko'k) bilan belgilangan uzluksiz cho'tka chegara membranalarining gorizontal frontal ko'rinishi. Ichak chiplaridagi epitelial hujayralarning immunofloresans konfokal vizualizatsiyasi. O'rta sxemaga ishora qiluvchi strelkalar har bir konfokal ko'rinish uchun fokus tekisligining joylashuvini ko'rsatadi.d, 3, 7, 9, 11 va 13-kunlarda fazali kontrastli mikroskopiya orqali olingan chipda o'stirilgan organoidlardagi morfologik o'zgarishlarning vaqt yo'nalishi. Qo'shimcha rasmda (yuqori o'ngda) taqdim etilgan tasvirning yuqori kattalashtirilishi ko'rsatilgan.e, 7-kuni olingan kesmada ichakda joylashgan organoid 3D epiteliyning DIC fotomikrografi.f, Epitelial qatlamda mos ravishda 3 kun (chapda) va 13 kunlik (o'rtada) organoidlar davomida ichak chiplarida o'stirilgan ildiz hujayralari (LGR5; binafsha), qadah hujayralari (MUC2; yashil), F-aktin (kulrang) va yadrolar (ko'k) uchun markerlarni ko'rsatuvchi ustki qatlamli immunofloresans tasvirlari. Shuningdek, MUC2 signalizatsiyasisiz LGR5 signalizatsiyasini ta'kidlaydigan kengaytirilgan ma'lumotlar 3-rasmga qarang. Kultivatsiyaning 13-kunida plazma membranasini CellMask bo'yog'i (o'ngda) bilan bo'yash orqali ichakda o'rnatilgan 3D organoid epiteliyning epitelial mikrotuzilishini (o'ngda) ko'rsatuvchi lyuminestsent tasvirlar. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, masshtab chizig'i 50 mkm.b Malumotnoma ruxsati bilan qayta nashr etilgan.2. Oxford University Press; c Malumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan.2. Oxford University Press; e va f ma'lumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan.12 Creative Commons litsenziyasi CC BY 4.0 ostida.
Chipdagi ichakda, muvaffaqiyatli ECM qoplamasi uchun PDMS g'ovakli membranasining hidrofobik yuzasini o'zgartirish kerak. Ushbu protokolda biz PDMS membranalarining hidrofobikligini o'zgartirish uchun ikki xil usulni qo'llaymiz. Caco-2 hujayralarini kultivatsiya qilish uchun faqat UV/ozon bilan ishlov berish orqali sirtni faollashtirish PDMS yuzasining hidrofobikligini kamaytirish, ECMni qoplash va Caco-2 hujayralarini PDMS membranasiga biriktirish uchun etarli edi. Biroq, organoid epiteliyning mikrofluidik kultivatsiyasi polietilenimin (PEI) va glutaraldegidni PDMS mikrokanallariga ketma-ket qo'llash orqali ECM oqsillarini samarali cho'ktirishga erishish uchun kimyoviy asosli sirt funksionalizatsiyasini talab qiladi. Sirt modifikatsiyasidan so'ng, ECM oqsillari funktsionalizatsiyalangan PDMS yuzasini qoplash uchun cho'ktirildi va keyin izolyatsiya qilingan organoid epiteliyga kiritildi. Hujayralar biriktirilgandan so'ng, mikrofluidik hujayra kulturasi faqat muhitni yuqori mikrokanalga perfuziya qilishdan boshlanadi, hujayralar to'liq monoqatlam hosil qilguncha, pastki mikrokanal esa statik sharoitlarni saqlab qoladi. Sirtni faollashtirish va ECM qoplamasi uchun bu optimallashtirilgan usul organoid epiteliyning biriktirilishini induktsiya qilish imkonini beradi. PDMS yuzasida 3D morfogenez.
Transwell kulturalari hujayra ekishdan oldin ECM qoplamasini ham talab qiladi; ammo, Transwell kulturalari g'ovak qo'shimchalar yuzasini faollashtirish uchun murakkab oldindan ishlov berish bosqichlarini talab qilmaydi. Transwell qo'shimchalarida Caco-2 hujayralarini o'stirish uchun g'ovak qo'shimchalarga ECM qoplamasi dissotsiatsiyalangan Caco-2 hujayralarining birikishini (<1 soat) va zich birikma to'sig'ining hosil bo'lishini (<1-2 kun) tezlashtiradi. Transwell qo'shimchalarida organoidlarni o'stirish uchun izolyatsiya qilingan organoidlar ECM bilan qoplangan qo'shimchalarga ekiladi, membrana yuzasiga biriktiriladi (<3 soat) va organoidlar to'siq yaxlitligiga ega to'liq monoqatlam hosil bo'lguncha saqlanadi. Transwell kulturalari gibrid chiplardan foydalanmasdan 24 quduqli plastinkalarda amalga oshiriladi.
In vitro 3D morfogenez suyuqlik oqimini o'rnatilgan epitelial qatlamning bazolateral tomoniga qo'llash orqali boshlanishi mumkin. Chipdagi ichakda epitelial morfogenez muhit yuqori va pastki mikrokanallarga perfuz qilinganda boshlangan (3a-rasm). Avval aytib o'tilganidek, yo'naltirilgan ajratilgan morfogen ingibitorlarini uzluksiz olib tashlash uchun pastki (bazolateral) bo'limga suyuqlik oqimini kiritish juda muhimdir. G'ovak membranalarga bog'langan hujayralarga yetarli miqdorda ozuqa moddalari va zardob bilan ta'minlash va luminal siljish stressini yaratish uchun biz odatda chipdagi ichakda ikki tomonlama oqimni qo'llaymiz. Gibrid chiplarda epitelial monoqatlamlarni o'z ichiga olgan Transwell qo'shimchalari gibrid chiplarga kiritildi. Keyin muhit g'ovak Transwell qo'shimchasining bazolateral tomoni ostiga mikrokanal orqali qo'llanildi. Ichak morfogenezi ikkala madaniyat platformasida ham bazolateral oqim boshlanganidan 3-5 kun o'tgach sodir bo'ldi.
Mikromuhandislik asosida yaratilgan 3D epitelial qatlamlarning morfologik xususiyatlarini turli xil tasvirlash usullarini, jumladan, fazali kontrastli mikroskopiya, differentsial interferensiyali kontrast (DIC) mikroskopiya, SEM yoki immunofloresansli konfokal mikroskopiyani qo'llash orqali tahlil qilish mumkin (3 va 4-rasmlar). Fazali kontrastli yoki DIC tasvirlash 3D epitelial qatlamlarning shakli va chiqib turishini kuzatish uchun madaniyat paytida istalgan vaqtda osongina bajarilishi mumkin. PDMS va poliester plyonkalarning optik shaffofligi tufayli, ham ichak-chip, ham gibrid chip platformalari qurilmani kesish yoki demontaj qilish zaruratisiz real vaqt rejimida joyida tasvirlashni ta'minlashi mumkin. Immunofloresansli tasvirlashda (1, 3c, f va 4b, c-rasmlar) hujayralar odatda 4% (og'irlik/vol) paraformaldegid (PFA) bilan fiksatsiya qilinadi, so'ngra Triton X-100 va 2% (og'irlik/vol)) sigir zardobidagi albumin (BSA) bilan navbat bilan fiksatsiya qilinadi. Hujayra turiga qarab, turli fiksatorlar, o'tkazuvchanlik kuchaytirgichlari va bloklovchi vositalar bo'lishi mumkin. ishlatilgan. Chiziqqa bog'liq hujayra yoki mintaqa markerlarini nishonga oluvchi birlamchi antitelalar chipda in situ immobilizatsiya qilingan hujayralarni ajratib ko'rsatish uchun ishlatiladi, so'ngra ikkilamchi antitelalar yadroga (masalan, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) yoki F-aktinga (masalan, floresan bilan belgilangan falloidin) qarshi bo'yoq bilan birga qo'llaniladi. Flüoresans asosidagi jonli tasvirlash shilimshiq ishlab chiqarishni (1-rasm, "Hujayra differentsiatsiyasi" va "Ichak fiziologiyasi"), mikrobial hujayralarning tasodifiy kolonizatsiyasini (1-rasm, "Xost-mikrob qo'shma madaniyati"), immun hujayralarining jalb qilinishini (1-rasm, "Kasallik modellashtirish") yoki 3D epitelial morfologiyaning konturlarini (3c, f va 4b, c-rasmlar) aniqlash uchun in situ rejimida ham amalga oshirilishi mumkin. Chipdagi ichakni yuqori qatlamni pastki mikrokanal qatlamidan ajratish uchun o'zgartirganda, ma'lumotnomada tasvirlanganidek. 2-rasmda ko'rsatilganidek, 3D epitelial morfologiya, shuningdek, apikal cho'tka chegarasidagi mikrovorsinkalar. SEM yordamida vizualizatsiya qilinishi mumkin (3b-rasm). Differentsiatsiya markerlarining ifodasini miqdoriy PCR5 yoki bitta hujayrali RNK ketma-ketligini bajarish orqali baholash mumkin. Bu holda, ichak chiplarida yoki gibrid chiplarda o'stirilgan epitelial hujayralarning 3D qatlamlari tripsinizatsiya orqali yig'ib olinadi va keyin molekulyar yoki genetik tahlil uchun ishlatiladi.
a, Gibrid chipda ichak morfogenezini induktsiya qilish uchun ish jarayoni. Ushbu protokolda gibrid chip platformasida 3D morfogenezni namoyish qilish uchun Caco-2 va ichak organoidlari qo'llaniladi. Dissotsiatsiyalangan epitelial hujayralar tayyorlangan Transwell qo'shimchalariga ekildi (TW tayyorlovi; quyidagi rasmga qarang). Transwell qo'shimchalarida hujayralar ekilgandan (ekilgandan) va poliester membranalariga biriktirilgandan so'ng, barcha hujayralar statik sharoitlarda ekildi (TW madaniyati). 7 kundan so'ng, epitelial hujayralarning 2D monoqatlamini o'z ichiga olgan bitta Transwell qo'shimchasi bazolateral oqimni (Flow, BL) kiritish uchun gibrid chipga birlashtirildi, bu oxir-oqibat 3D epitelial qatlam hosil bo'lishiga olib keldi (morfogenez). Har bir eksperimental bosqichda yoki vaqt nuqtasida normal donordan (C103 chizig'i) ko'tariluvchi yo'g'on ichakdan olingan inson organ epitelial hujayralarining morfologik xususiyatlarini ko'rsatadigan fazali kontrastli mikrograflar. Yuqori qatlamlardagi sxemalar har bir bosqich uchun eksperimental konfiguratsiyani ko'rsatadi. b, Gibrid chiplar (chap sxema) turli Z nuqtalarida olingan yuqoridan pastga konfokal mikroskopiya ko'rinishlari bilan organoid epitelial hujayralarning 3D morfogeneziga olib kelishi mumkin. pozitsiyalar (yuqori, o'rta va pastki; o'ng sxematik va mos keladigan nuqtali chiziqlarga qarang). aniq morfologik xususiyatlarni ko'rsatdi. F-aktin (ko'k), yadro (kulrang).c, statik Transwell (TW; oq chiziqli quti ichidagi ichki qism) va gibrid chip (eng katta to'liq kadr) da o'stirilgan organoidlardan olingan epitelial hujayralarning lyuminestsent konfokal mikrograflari (3D burchakli ko'rinish), mos ravishda 2D va 3D morfologiyasini taqqoslaydi. Ikki o'lchamli vertikal kesishgan ko'rinishlar juftligi (yuqori o'ng burchakdagi ichki qism; "XZ") ham 2D ​​va 3D xususiyatlarini ko'rsatadi. Masshtab paneli, 100 µm.c Malumotnomadan ruxsat bilan qayta nashr etilgan.4. Elsevier.
Nazorat hujayralarini an'anaviy statik madaniyat sharoitida bir xil hujayralarni (Caco-2 yoki ichak organoid epiteliy hujayralari) ikki o'lchovli monoqatlamlarga kultivatsiya qilish orqali tayyorlash mumkin. Shunisi e'tiborga loyiqki, mikrokanallarning cheklangan hajm sig'imi tufayli ozuqa moddalarining kamayishiga olib kelishi mumkin (ya'ni, asl ichak chipi dizaynidagi yuqori kanalda ~4 µL). Shuning uchun, bazolateral oqimni qo'llashdan oldin va keyin epitelial morfologiyani ham taqqoslash mumkin.
Yumshoq litografiya jarayoni toza xonada bajarilishi kerak. Chipdagi har bir qatlam (yuqori va pastki qatlamlar va membranalar) va gibrid chiplar uchun turli xil fotoniqoblar ishlatilgan va alohida kremniy plitalarida tayyorlangan, chunki mikrokanallarning balandliklari har xil edi. Chipdagi ichakning yuqori va pastki mikrokanallarining maqsadli balandliklari mos ravishda 500 µm va 200 µm ni tashkil qiladi. Gibrid chipning kanalning maqsadli balandligi 200 µm ni tashkil qiladi.
3 dyuymli kremniy plastinkani asetonli idishga soling. Plastinkani 30 soniya davomida muloyimlik bilan aylantiring, so'ngra plastinkani havoda quriting. Plastinkani IPAli plastinkaga o'tkazing, so'ngra tozalash uchun plastinkani 30 soniya aylantiring.
Kremniy plastinka yuzasidan organik qoldiqlarni maksimal darajada olib tashlash uchun ixtiyoriy ravishda piranya eritmasidan (vodorod peroksid va konsentrlangan sulfat kislota aralashmasi, 1:3 (vol/vol)) foydalanish mumkin.
Piranya eritmasi juda korroziyali va issiqlik hosil qiladi. Qo'shimcha xavfsizlik choralari zarur. Chiqindilarni yo'q qilish uchun eritmaning sovishini kuting va toza, quruq chiqindi idishiga soling. Ikkilamchi idishlardan foydalaning va chiqindi idishlarini to'g'ri yorliqlang. Batafsilroq protseduralar uchun iltimos, muassasaning xavfsizlik ko'rsatmalariga amal qiling.
Gofretlarni 200 °C haroratda qizdirilgan plitaga 10 daqiqaga qo'yib, suvsizlantiring. Suvsizlantirilgandan so'ng, gofret sovutish uchun havoda besh marta chayqatildi.
Tozalangan kremniy plastinkaning o'rtasiga ~10 g fotorezist SU-8 2100 ni quying. Fotorezistni plastinka ustiga tekis yoyish uchun pinsetdan foydalaning. Fotorezistni yopishqoqroq qilish va yoyishni osonlashtirish uchun plastinkani vaqti-vaqti bilan 65°C haroratli issiq plastinkaga qo'ying. Plitani to'g'ridan-to'g'ri issiq plastinkaga qo'ymang.
SU-8 plastinada aylanish qoplamasini ishga tushirish orqali teng taqsimlandi. SU-8 ning kirish aylanishini 5-10 soniya davomida 500 rpm tezlikda 100 rpm/s tezlanish bilan yoyish uchun dasturlang. Asosiy aylanishni 1500 rpm tezlikda 200 µm qalinlikdagi naqshga sozlang yoki 1200 rpm tezlikda 300 rpm tezlikda 30 soniyada 250 µm qalinlikka erishing (chipdagi ichakning yuqori qatlami uchun 500 µm balandlik hosil qiling; quyidagi "Muhim bosqichlar" ga qarang).
Asosiy aylanish tezligi kremniy plastinkasidagi SU-8 naqshining maqsadli qalinligiga qarab sozlanishi mumkin.
Chipdagi ichakning yuqori qatlami uchun 500 µm balandlikdagi SU-8 naqshlarini yaratish uchun ushbu qutining aylanish qoplamasi va yumshoq pishirish bosqichlari (7 va 8-bosqichlar) ketma-ket takrorlandi (9-bosqichga qarang), 250 µm qalinlikdagi ikkita qatlam hosil qilish uchun. Ushbu qutining 12-bosqichida qatlamlar bilan qoplanishi va UV nurlari bilan birlashtirilishi mumkin bo'lgan SU-8 qalin qatlami, bu esa 500 µm balandlikdagi qatlam hosil qiladi.
SU-8 qoplamali gofretlarni yumshoq qilib pishiring, gofretlarni ehtiyotkorlik bilan 65 °C da 5 daqiqa davomida issiq likopchaga qo'ying, so'ngra sozlamani 95 °C ga o'tkazing va yana 40 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
Yuqori mikrokanalda SU-8 naqshining 500 mkm balandligiga erishish uchun, qalinligi 250 mkm bo'lgan ikkita SU-8 qatlamini hosil qilish uchun 7 va 8-bosqichlarni takrorlang.
UV niqob tekislagichidan foydalanib, plastinkaning ta'sir qilish vaqtini hisoblash uchun ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq chiroq sinovini o'tkazing. (ta'sir qilish vaqti, ms) = (ta'sir qilish dozasi, mJ/sm2)/(chiroq quvvati, mVt/sm2).
Ta'sir qilish vaqtini aniqlagandan so'ng, fotoniqobni UV niqob tekislagichining niqob ushlagichiga qo'ying va fotoniqobni SU-8 bilan qoplangan plastinka ustiga qo'ying.
Fotoniqobning bosilgan yuzasini ultrabinafsha nurlarining tarqalishini minimallashtirish uchun to'g'ridan-to'g'ri kremniy plastinkasining SU-8 bilan qoplangan tomoniga qo'ying.
SU-8 bilan qoplangan plastinka va fotoniqobni oldindan belgilangan ta'sir qilish vaqti uchun vertikal ravishda 260 mJ/sm2 UV nuriga qo'ying (ushbu katakchaning 10-bosqichiga qarang).
UB nurlari ta'siridan so'ng, SU-8 bilan qoplangan kremniy plitalari har bir qizdiruvchi plastinkada 65°C da 5 daqiqa va 95°C da 15 daqiqa davomida pishirildi, bu esa 200 µm balandlikdagi naqshlarni yaratishga imkon berdi. 500 µm balandlikdagi naqshlarni yaratish uchun pishirishdan keyingi vaqtni 95°C da 30 daqiqagacha uzaytiring.
Ishlab chiqaruvchi shisha idishga quyiladi va pishirilgan vafli idishga joylashtiriladi. SU-8 ishlab chiqaruvchisining hajmi shisha plastinkaning o'lchamiga qarab farq qilishi mumkin. Ochilmagan SU-8 ni butunlay olib tashlash uchun yetarli miqdorda SU-8 ishlab chiqaruvchisidan foydalanganingizga ishonch hosil qiling. Masalan, 1 litr sig'imli 150 mm diametrli shisha idishdan foydalanganda ~300 ml SU-8 ishlab chiqaruvchisidan foydalaning. Qolipni vaqti-vaqti bilan yumshoq aylantirib, 25 daqiqa davomida ishlab chiqing.
Tayyorlangan qolipni ~10 ml yangi ishlab chiqaruvchi bilan yuving, so'ngra eritmani pipetka yordamida purkash orqali IPA qo'shing.
Plastinkani plazma tozalagichga joylashtiring va kislorod plazmasiga (atmosfera gazi, maqsadli bosim 1 × 10−5 Torr, quvvat 125 Vt) 1,5 daqiqa davomida ta'sir qiling.
Plastinkani vakuumli eksikatorga joylashtiring, ichida shisha slayd bo'lishi kerak. Plastinkalar va slaydlarni yonma-yon qo'yish mumkin. Agar vakuumli eksikator plastinka bilan bir necha qatlamlarga bo'lingan bo'lsa, slaydlarni pastki kameraga, plastinalarni esa yuqori kameraga joylashtiring. Shisha slaydga 100 mkl trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silan eritmasini tomizing va silanizatsiya uchun vakuum qo'llang.
Muzlatilgan Caco-2 hujayralari solingan flakonni 37°C suv hammomida eriting, so'ngra eritilgan hujayralarni 15 ml 37°C oldindan qizdirilgan Caco-2 muhiti solingan T75 kolbasiga o'tkazing.
Caco-2 hujayralarini ~90% qo'shilish nuqtasida o'tkazish uchun avval 37°C suv hammomida Caco-2 muhitini, PBS va 0,25% tripsin/1 mM EDTA ni qizdiring.
Vakuum aspiratsiyasi orqali muhitni so'rib oling. Vakuum aspiratsiyasini takrorlash va yangi PBS qo'shish orqali hujayralarni ikki marta 5 ml iliq PBS bilan yuving.