Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript.
De morfogenese van de menselijke darm zorgt voor de vorming van crypt-villus-kenmerken met een 3D-epitheelmicroarchitectuur en ruimtelijke organisatie. Deze unieke structuur is nodig om de darmhomeostase te handhaven door de stamcelniche in de basale crypt te beschermen tegen exogene microbiële antigenen en hun metabolieten. Daarnaast bieden de darmvlokken en het slijm een ​​beschermende barrière aan functioneel gedifferentieerde epitheelcellen op het darmslijmvliesoppervlak. Het nabootsen van 3D-epitheelstructuren is daarom cruciaal voor de constructie van in vitro darmmodellen. Met name de organische nabootsende darm-op-een-chip kan spontane 3D-morfogenese van het darmepitheel induceren met verbeterde fysiologische functies en biomechanica. Hier presenteren we een reproduceerbaar protocol om op robuuste wijze darmmorfogenese te induceren in de darm op een microfluïdische chip en in een hybride chip met ingebedde Transwells. We beschrijven gedetailleerde methoden voor de fabricage van het apparaat, het kweken van Caco-2-cellen of intestinale organoïde epitheelcellen in conventionele omstandigheden en op een Een microfluïdisch platform, inductie van 3D-morfogenese en karakterisering van gevormde 3D-epitheelcellen met behulp van meerdere beeldvormingsmodaliteiten. Dit protocol maakt regeneratie van de functionele microarchitectuur van de darm mogelijk door de basolaterale vloeistofstroom gedurende 5 dagen te controleren. Onze in vitro morfogenese-methode maakt gebruik van fysiologisch relevante schuifspanning en mechanische beweging en vereist geen complexe celmanipulatie, waardoor deze mogelijk beter presteert dan andere bestaande technieken. We verwachten dat ons voorgestelde protocol brede implicaties kan hebben voor de biomedische onderzoeksgemeenschap, door een methode te bieden voor de regeneratie van 3D-darmepitheellagen in vitro voor biomedische, klinische en farmaceutische toepassingen.
Experimenten tonen aan dat intestinale epitheelcellen (Caco-2-cellen) gekweekt in darm-op-een-chip1,2,3,4,5 of dubbellaags microfluïdische apparaten6,7 spontaan 3D-morfogenese in vitro kunnen ondergaan, zonder dat het onderliggende mechanisme duidelijk is. In onze recente studie ontdekten we dat het verwijderen van basolateraal afgescheiden morfogene antagonisten uit kweekapparaten noodzakelijk en voldoende is om 3D-epitheelmorfogenese in vitro te induceren, wat is aangetoond met Caco-2-cellen en van patiënten afgeleide intestinale organoïden. Epitheelcellen werden gevalideerd. In deze studie richtten we ons specifiek op de celproductie en concentratieverdeling van een krachtige Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), in darm-op-een-chip- en gemodificeerde microfluïdische apparaten met Transwell-inserts, aangeduid als "Hybrid Chip". We tonen aan dat de toevoeging van exogene Wnt-antagonisten (zoals DKK-1, Wnt-repressor 1, secreted frizzled-related protein 1 of Soggy-1) aan de darm op de chip de morfogenese remt of de voorgestructureerde 3D-epitheellaag verstoort, wat suggereert dat antagonistische stress tijdens de kweek verantwoordelijk is voor de intestinale morfogenese in vitro. Daarom is een praktische benadering om robuuste morfogenese aan het epitheliale grensvlak te bereiken, het verwijderen of minimaal handhaven van de niveaus van Wnt-antagonisten in het basolaterale compartiment door actief spoelen (bijvoorbeeld in darm-op-een-chip- of hybrid-op-een-chip-platforms) of diffusie. Basolateraal medium (bijvoorbeeld uit Transwell-inserts) in grote basolaterale reservoirs in putten).
In dit protocol beschrijven we een gedetailleerde methode voor het fabriceren van darm-op-een-chip-microapparaten en Transwell-inzetbare hybride chips (stappen 1-5) om intestinale epitheelcellen te kweken op poreuze membranen op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) (stappen 6A, 7A, 8, 9) of polyestermembranen van Transwell-inserts (stappen 6B, 7B, 8, 9) en om in vitro 3D-morfogenese te induceren (stap 10). We hebben ook cellulaire en moleculaire kenmerken geïdentificeerd die wijzen op weefselspecifieke histogenese en lijn-afhankelijke cellulaire differentiatie door middel van meerdere beeldvormingsmodaliteiten (stappen 11-24). We induceren morfogenese met behulp van humane intestinale epitheelcellen, zoals Caco-2 of intestinale organoïden, in twee kweekformaten met technische details, waaronder oppervlaktemodificatie van poreuze membranen, het creëren van 2D-monolagen en de reproductie van de biomechanische microomgeving van de darm. in vitro. Om 3D-morfogenese te induceren vanuit 2D-epitheelmonolagen, verwijderden we morfogene antagonisten in beide kweekvormen door het medium in het basolaterale compartiment van de kweek te laten stromen. Ten slotte geven we een voorbeeld van het nut van een regenereerbare 3D-epitheellaag die kan worden gebruikt om morfogenetische epitheelgroei, longitudinale co-culturen van gastheer en microbioom, pathogene infecties, ontstekingsschade, disfunctie van de epitheliale barrière en op probiotica gebaseerde therapieën te modelleren. Voorbeeld.
Ons protocol kan nuttig zijn voor een breed scala aan wetenschappers in fundamenteel (bijv. darmmucosa-biologie, stamcelbiologie en ontwikkelingsbiologie) en toegepast onderzoek (bijv. preklinische geneesmiddelentests, ziektemodellering, weefseltechnologie en gastro-enterologie). Vanwege de reproduceerbaarheid en robuustheid van ons protocol voor het induceren van 3D-morfogenese van het darmepitheel in vitro, verwachten we dat onze technische strategie kan worden verspreid onder onderzoekers die de dynamiek van celsignalering tijdens darmontwikkeling, -regeneratie of -homeostase bestuderen. Daarnaast is ons protocol bruikbaar voor het onderzoeken van infecties veroorzaakt door verschillende infectieuze agentia zoals Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 of Vibrio cholerae. Het publiek dat zich bezighoudt met ziektepathologie en pathogenese is ook nuttig. Het gebruik van een microfysiologisch systeem voor de darm op een chip kan longitudinale co-cultuur mogelijk maken 10 en daaropvolgende beoordeling van de afweer van de gastheer, immuunreacties en herstel van pathogeen-gerelateerde schade in het maag-darmkanaal 11. Andere GI-aandoeningen die geassocieerd zijn met het lekkende darmsyndroom, coeliakie, de ziekte van Crohn, colitis ulcerosa, pouchitis of het prikkelbaredarmsyndroom kunnen worden gesimuleerd wanneer 3D-darmepitheellagen worden geprepareerd met behulp van de 3D-darmepitheellagen van de patiënt. Deze aandoeningen omvatten villusatrofie, verkorting van de crypten, mucosale schade of een verstoorde epitheliale barrière. Biopsie- of stamcel-afgeleide darmorganoïden12,13. Om de hogere complexiteit van de ziekteomgeving beter te modelleren, kunnen lezers overwegen om ziekterelevante celtypen, zoals perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van de patiënt, toe te voegen aan modellen die 3D-darmevill-crypt-microarchitecturen bevatten. Weefselspecifieke immuuncellen, 5.
Omdat de 3D-microstructuur van epitheelcellen kan worden gefixeerd en gevisualiseerd zonder het snijproces, kunnen onderzoekers die zich bezighouden met ruimtelijke transcriptomics en beeldvorming met hoge of superresolutie geïnteresseerd zijn in onze kartering van de spatiotemporele dynamiek van genen en eiwitten in epitheliale niches. Geïnteresseerd in technologie. Reactie op microbiële of immuunstimuli. Bovendien kan longitudinale wisselwerking tussen gastheer en microbioom 10, 14 die de darmhomeostase coördineert, worden vastgesteld in de 3D-darmmucosa door het co-cultiveren van verschillende microbiële soorten, microbiële gemeenschappen of fecale microbiota, met name in de darm-op-een-chip. in het platform. Deze aanpak is met name aantrekkelijk voor onderzoekers op het gebied van mucosale immunologie, gastro-enterologie, het menselijk microbioom, culturomics en klinische microbiologie die voorheen niet gekweekte darmmicrobiota in het laboratorium willen kweken. Als ons in vitro morfogenese-protocol kan worden aangepast aan schaalbare kweekformaten, zoals multiwell-inserts in 24-, 96- of 384-wells platen die de basolaterale compartimenten continu aanvullen, kan het protocol ook worden verspreid onder ontwikkelaars van farmaceutische, biomedische of high-throughput screening- of validatieplatforms voor de voedingsmiddelenindustrie. Als bewijs van het principe hebben we onlangs de haalbaarheid aangetoond van een multiplex high-throughput morfogenese-systeem dat schaalbaar is naar een 24-wells plaatformaat. Daarnaast zijn er meerdere organ-on-a-chip-producten op de markt gebracht16,17,18. Daarom kan de validatie van onze in vitro morfogenese-methode worden versneld en mogelijk worden overgenomen door vele onderzoekslaboratoria, de industrie of overheids- en regelgevende instanties om cellulaire processen te begrijpen. Het herprogrammeren van de darmmorfogenese in vitro op transcriptomisch niveau om geneesmiddelen of biofarmaceutica te testen. De absorptie en het transport van kandidaat-geneesmiddelen werden beoordeeld met behulp van 3D-darmsurrogaten of met behulp van op maat gemaakte of commerciële organ-on-a-chip-modellen om de reproduceerbaarheid van het darmmorfogenese-proces te evalueren.
Er is slechts een beperkt aantal voor de mens relevante experimentele modellen gebruikt om de morfogenese van het darmepitheel te bestuderen, voornamelijk vanwege het gebrek aan implementeerbare protocollen om 3D-morfogenese in vitro te induceren. Sterker nog, veel van de huidige kennis over darmmorfogenese is gebaseerd op dierstudies (bijvoorbeeld zebravis20, muizen21 of kippen22). Deze studies zijn echter arbeids- en kostenintensief, kunnen ethisch twijfelachtig zijn en, belangrijker nog, geven geen nauwkeurig beeld van menselijke ontwikkelingsprocessen. Deze modellen zijn bovendien zeer beperkt in hun vermogen om op meerdere manieren schaalbaar te worden getest. Daarom presteert ons protocol voor het regenereren van 3D-weefselstructuren in vitro beter dan in vivo diermodellen en andere traditionele statische 2D-celkweekmodellen. Zoals eerder beschreven, stelde het gebruik van 3D-epitheelstructuren ons in staat om de ruimtelijke lokalisatie van gedifferentieerde cellen in de crypt-villus-as te onderzoeken als reactie op verschillende mucosale of immuunstimuli. 3D-epitheellagen kunnen een ruimte bieden om te bestuderen hoe microbiële cellen concurreren om Het vormt ruimtelijke niches en ondergaat ecologische evolutie als reactie op gastheerfactoren (bijv. binnenste versus buitenste slijmlagen, secretie van IgA en antimicrobiële peptiden). Bovendien kan 3D-epitheelmorfologie ons inzicht geven in hoe de darmmicrobiota zijn gemeenschappen structureert en synergetisch microbiële metabolieten produceert (bijv. korteketen vetzuren) die de cellulaire organisatie en stamcelniches in de basale crypten vormgeven. Deze kenmerken kunnen alleen worden aangetoond wanneer 3D-epitheellagen in vitro worden gevormd.
Naast onze methode voor het creëren van 3D-structuren van darmepitheel, bestaan ​​er verschillende in vitro-methoden. De kweek van darmorganoïden is een geavanceerde weefseltechniek gebaseerd op de kweek van darmstamcellen onder specifieke morfogene omstandigheden23,24,25. Het gebruik van 3D-organoïdmodellen voor transportanalyse of co-culturen van gastheer en microbioom is echter vaak lastig, omdat het darmlumen zich binnen de organoïde bevindt en de introductie van luminale componenten zoals microbiële cellen of exogene antigenen daardoor beperkt is. Toegang tot de lumina van organoïden kan worden verbeterd met behulp van een micro-injector26,27, maar deze methode is invasief en arbeidsintensief en vereist specialistische kennis. Bovendien weerspiegelen traditionele organoïdculturen die in hydrogel-scaffolds onder statische omstandigheden worden onderhouden, de actieve in vivo biomechanica niet nauwkeurig.
Andere benaderingen, gebruikt door verschillende onderzoeksgroepen, maken gebruik van voorgestructureerde 3D-hydrogel-scaffolds om de structuur van het darmepitheel na te bootsen door geïsoleerde menselijke darmcellen op het geloppervlak te kweken. Hydrogel-scaffolds worden vervaardigd met behulp van 3D-geprinte, microgefreesde of lithografisch vervaardigde mallen. Deze methode toont de zelforganiserende rangschikking van geïsoleerde epitheelcellen in vitro met fysiologisch relevante morfogene gradiënten, waardoor een epitheelstructuur met een hoge aspectverhouding en stroma-epitheel-crosstalk tot stand komt door stromale cellen in de scaffold op te nemen. De aard van voorgestructureerde scaffolds kan echter de weergave van het spontane morfogenetische proces zelf belemmeren. Deze modellen bieden ook geen dynamische luminale of interstitiële stroming, waardoor de vloeistofschuifspanning ontbreekt die darmcellen nodig hebben voor morfogenese en het verkrijgen van fysiologische functies. Een andere recente studie gebruikte hydrogel-scaffolds in een microfluïdisch platform en bracht patronen aan in darmepitheelstructuren met behulp van laseretstechnieken. Muizen-darmorganoïden volgen Geëtste patronen vormen darmbuisstructuren en de intraluminale vloeistofstroom kan worden nagebootst met behulp van een microfluidica-module. Dit model vertoont echter geen spontane morfogenetische processen en omvat ook geen mechanobiologische bewegingen van de darm. 3D-printtechnieken van dezelfde onderzoeksgroep waren in staat om miniatuurdarmbuizen met spontane morfogenetische processen te creëren. Ondanks de complexe fabricage van verschillende darmsegmenten binnen de buis, ontbreekt het dit model ook aan luminale vloeistofstroom en mechanische vervorming. Bovendien kan de bruikbaarheid van het model beperkt zijn, vooral nadat het bioprintproces is voltooid, omdat dit de experimentele omstandigheden of cel-tot-celinteracties kan verstoren. Ons voorgestelde protocol biedt daarentegen spontane darmmorfogenese, fysiologisch relevante schuifspanning, biomechanica die de darmmotiliteit nabootst, toegankelijkheid van onafhankelijke apicale en basolaterale compartimenten en de nabootsing van complexe biologische micro-omgevingen met modulariteit. Daarom kan ons in vitro 3D-morfogeneseprotocol een complementaire benadering bieden om de uitdagingen van bestaande methoden te overwinnen.
Ons protocol is volledig gericht op 3D epitheliale morfogenese, met alleen epitheelcellen in kweek en geen andere typen omringende cellen zoals mesenchymcellen, endotheelcellen en immuuncellen. Zoals eerder beschreven, is de kern van ons protocol de inductie van epitheliale morfogenese door het verwijderen van morfogene remmers die worden afgescheiden aan de basolaterale zijde van het geïntroduceerde medium. Hoewel de robuuste modulariteit van onze darm-op-een-chip en hybride-op-een-chip ons in staat stelt de golvende 3D epitheellaag na te bootsen, moeten aanvullende biologische complexiteiten zoals epitheel-mesenchymale interacties33,34, extracellulaire matrix (ECM)-afzetting35 en, in ons model, crypt-villus-kenmerken die stamcelniches in basale crypten overbrengen, nog verder worden onderzocht. Stromale cellen (bijv. fibroblasten) in het mesenchym spelen een sleutelrol in de productie van ECM-eiwitten en de regulatie van intestinale morfogenese in vivo35,37,38. De toevoeging van mesenchymale cellen aan ons model verbeterde het morfogenetische proces en de efficiëntie van celhechting. De endotheellaag (d.w.z. capillairen of lymfevaten) speelt een belangrijke rol bij de regulatie van moleculair transport39 en de rekrutering van immuuncellen40 in de darmmicroomgeving. Bovendien zijn vasculaire componenten die tussen weefselmodellen kunnen worden verbonden een voorwaarde wanneer weefselmodellen worden ontworpen om interacties tussen meerdere organen te demonstreren. Daarom moeten endotheelcellen mogelijk worden opgenomen om nauwkeurigere fysiologische kenmerken met resolutie op orgaanniveau te modelleren. Van patiënten afgeleide immuuncellen zijn ook essentieel voor het tonen van aangeboren immuunreacties, antigeenpresentatie, aangeboren-adaptieve immuuncrosstalk en weefselspecifieke immuniteit in de context van het nabootsen van darmziekten.
Het gebruik van hybride chips is eenvoudiger dan darm-op-een-chip, omdat de apparaatconfiguratie eenvoudiger is en het gebruik van Transwell-inserts schaalbare kweek van darmepitheel mogelijk maakt. Commercieel verkrijgbare Transwell-inserts met polyestermembranen zijn echter niet elastisch en kunnen geen peristaltische bewegingen simuleren. Bovendien bleef het apicale compartiment van de Transwell-insert in de hybride chip stationair, zonder schuifspanning aan de apicale zijde. De statische eigenschappen in het apicale compartiment maken langdurige bacteriële co-kweek in hybride chips dan ook zelden mogelijk. Hoewel we met behulp van hybride chips robuuste 3D-morfogenese in Transwell-inserts kunnen induceren, kan het gebrek aan fysiologisch relevante biomechanica en apicale vloeistofstroom de toepasbaarheid van hybride chipplatformen voor potentiële toepassingen beperken.
Volledige reconstructies van de menselijke crypt-villus-as in darm-op-een-chip- en hybride-op-een-chip-culturen zijn nog niet volledig tot stand gebracht. Omdat morfogenese begint vanuit een epitheliale monolaag, bieden 3D-microarchitecturen niet noodzakelijkerwijs morfologische gelijkenis met crypten in vivo. Hoewel we de prolifererende celpopulatie nabij het basale cryptdomein in het micro-geëngineerde 3D-epitheel hebben gekarakteriseerd, waren de crypt- en villusregio's niet duidelijk afgebakend. Hoewel hogere bovenste kanalen op de chip leiden tot een grotere hoogte van het micro-geëngineerde epitheel, blijft de maximale hoogte beperkt tot ~300-400 µm. De werkelijke diepte van menselijke darmcrypten in de dunne en dikke darm is respectievelijk ~135 µm en ~400 µm, en de hoogte van de villi in de dunne darm is ~600 µm41.
Vanuit beeldvormingsperspectief kan in situ superresolutie-beeldvorming van 3D-microarchitecturen beperkt zijn tot de darm op een chip, aangezien de vereiste werkafstand van de objectieflens tot de epitheellaag in de orde van enkele millimeters ligt. Om dit probleem te ondervangen, kan een objectief met een grotere afstand nodig zijn. Bovendien is het maken van dunne coupes voor beeldvormingsdoeleinden lastig vanwege de hoge elasticiteit van PDMS. Omdat de laag-voor-laag microfabricage van de darm op een chip permanente hechting tussen elke laag vereist, is het bovendien extreem moeilijk om de bovenste laag te openen of te verwijderen om de oppervlaktestructuur van de epitheellaag te onderzoeken. Bijvoorbeeld met behulp van een scanningelektronenmicroscoop (SEM).
De hydrofobiciteit van PDMS is een beperkende factor gebleken in microfluïdische studies met hydrofobe kleine moleculen, omdat PDMS dergelijke hydrofobe moleculen niet-specifiek kan adsorberen. Alternatieven voor PDMS kunnen worden overwogen met andere polymere materialen. Als alternatief kan oppervlaktemodificatie van PDMS (bijvoorbeeld coating met lipofiele materialen 42 of poly(ethyleenglycol) 43) worden overwogen om de adsorptie van hydrofobe moleculen te minimaliseren.
Tot slot is onze methode nog niet goed gekarakteriseerd wat betreft het bieden van een high-throughput screening- of een gebruiksvriendelijk experimenteel platform dat voor iedereen geschikt is. Het huidige protocol vereist een spuitpomp per microapparaat, wat ruimte inneemt in een CO2-incubator en grootschalige experimenten verhindert. Deze beperking kan aanzienlijk worden verbeterd door de schaalbaarheid van innovatieve kweekformaten (bijvoorbeeld poreuze inserts met 24, 96 of 384 putjes die continue aanvulling en verwijdering van basolateraal medium mogelijk maken).
Om in vitro 3D-morfogenese van menselijk darmepitheel te induceren, gebruikten we een microfluïdisch chip-intestinaal apparaat met twee parallelle microkanalen en een elastisch poreus membraan ertussen om een ​​lumen-capillair grensvlak te creëren. We demonstreren ook het gebruik van een microfluïdisch apparaat met één kanaal (een hybride chip) dat zorgt voor een continue basolaterale stroming onder gepolariseerde epitheellagen die op Transwell-inserts zijn gekweekt. In beide platforms kan morfogenese van verschillende menselijke darmepitheelcellen worden aangetoond door gerichte manipulatie van de stroming om morfogene antagonisten uit het basolaterale compartiment te verwijderen. De gehele experimentele procedure (Figuur 1) bestaat uit vijf onderdelen: (i) microfabricage van de darmchip of Transwell-inzetbare hybride chip (stappen 1-5; Box 1), (ii) preparatie van darmepitheelcellen (Caco-2-cellen) of menselijke darmorganoïden; (iii) kweek van intestinale epitheelcellen op intestinale chips of hybride chips (stappen 6-9), (iv) inductie van 3D-morfogenese in vitro (stap 10) en (v) om de 3D-epitheelmicrostructuur te karakteriseren (stappen 11-24). Ten slotte werd een geschikte controlegroep (hieronder verder besproken) ontworpen om de effectiviteit van in vitro-morfogenese te valideren door epitheliale morfogenese te vergelijken met ruimtelijke, temporele, conditionele of procedurele controles.
We gebruikten twee verschillende kweekplatformen: een darm-op-een-chip met rechte kanalen of niet-lineaire, kronkelende kanalen, of hybride chips met Transwell (TW)-inserts in een microfluïdisch apparaat, vervaardigd zoals beschreven in Box 1 en stap 1-5. "Apparaatfabricage" toont de belangrijkste stappen in het maken van een enkele chip of een hybride chip. "Kweek van menselijke darmepitheelcellen" legt de celbron (Caco-2 of menselijke darmorganoïden) en de kweekprocedure uit die in dit protocol worden gebruikt. "In vitro morfogenese" toont de algemene stappen waarin Caco-2 of van organoïden afgeleide epitheelcellen worden gekweekt op een darmchip of op Transwell-inserts van een hybride chip, gevolgd door inductie van 3D-morfogenese en de vorming van een gekarakteriseerde epitheelstructuur. Het programmastapnummer of boxnummer wordt onder elke pijl weergegeven. De applicatie geeft voorbeelden van hoe gevestigde darmepitheellagen kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld voor de karakterisering van celdifferentiatie, darmfysiologiestudies en het vaststellen van gastheer-microbioomrelaties. ecosystemen en ziektemodellering. Immunofluorescentiebeelden in "Celdifferentiatie" tonen kernen, F-actine en MUC2 die tot expressie komen in de 3D Caco-2 epitheellaag die op de darmchip is gegenereerd. MUC2-signalering is aanwezig in slijmproducerende cellen en slijm dat wordt afgescheiden door slijmvliesoppervlakken. Fluorescentiebeelden in "Darmfysiologie" tonen slijm dat wordt geproduceerd door kleuring voor sialinezuur- en N-acetylglucosamineresiduen met behulp van fluorescerend tarwekiemagglutinine. De twee overlappende beelden in "Gastheer-Microbe Co-culturen" tonen representatieve gastheer-microbioom co-culturen in de darm op een chip. Het linkerpaneel toont de co-cultuur van E. coli die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengt met micro-geëngineerde 3D Caco-2 epitheelcellen. Het rechterpaneel toont de lokalisatie van GFP E. coli in co-cultuur met 3D Caco-2 epitheelcellen, gevolgd door immunofluorescentiekleuring met F-actine (rood). en kernen (blauw). Ziektemodellering illustreert een gezonde versus een lekkende darm in darmontstekingschips onder fysiologische belasting met bacteriële antigenen (bijv. lipopolysaccharide, LPS) en immuuncellen (bijv. PBMC; groen). Caco-2-cellen werden gekweekt om een ​​3D-epitheellaag te vormen. Schaalbalk, 50 µm. Afbeeldingen in de onderste rij: "Differentiatie van cellen" aangepast met toestemming van referentie 2. Oxford University Press; Gereproduceerd met toestemming van referentie 5. NAS; "Gastheer-microbe co-cultuur" aangepast met toestemming van referentie 3. NAS; "Ziektemodellering" aangepast met toestemming van referentie 5. NAS.
Zowel gut-on-a-chip als hybride chips werden vervaardigd met behulp van PDMS-replica's die door middel van softlithografie uit siliciummallen werden ontvormd1,44 en gepatroond met SU-8. Het ontwerp van de microkanalen in elke chip wordt bepaald door rekening te houden met hydrodynamica zoals schuifspanning en hydrodynamische druk1,4,12. Het oorspronkelijke gut-on-a-chip-ontwerp (Extended Data Fig. 1a), dat bestond uit twee naast elkaar geplaatste parallelle rechte microkanalen, is geëvolueerd naar een complexe gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) die een paar gebogen microkanalen bevat om een ​​verhoogde verblijftijd van vloeistof, niet-lineaire stromingspatronen en multiaxiale vervorming van gekweekte cellen te induceren (Fig. 2a-f) 12. Wanneer complexere darmbiomechanica moet worden nagebootst, kunnen complexe gut-on-a-chips worden gekozen. We hebben aangetoond dat de geplooide Gut-Chip ook sterk 3D-morfogenese induceert in een vergelijkbaar tijdsbestek met een vergelijkbare mate van epitheliale groei in vergelijking met de originele Gut-Chip, ongeacht het gekweekte celtype. Om 3D-morfogenese te induceren, zijn lineaire en complexe darmontwerpen op de chip dus uitwisselbaar. PDMS-replica's, uitgehard op siliconen mallen met SU-8-patronen, leverden negatieve kenmerken op na het ontvormen (Fig. 2a). Om de darm op een chip te fabriceren, werd de voorbereide bovenste PDMS-laag achtereenvolgens verbonden met een poreuze PDMS-film en vervolgens uitgelijnd met de onderste PDMS-laag door middel van irreversibele hechting met behulp van een coronabehandelingsapparaat (Fig. 2b-f). Om hybride chips te fabriceren, werden uitgeharde PDMS-replica's verbonden met glazen objectglaasjes om microfluïdische apparaten met één kanaal te creëren die Transwell-inserts konden bevatten (Fig. 2h en Extended Data Fig. 2). Het hechtingsproces wordt uitgevoerd door de oppervlakken van de PDMS-replica en het glas te behandelen met zuurstofplasma of coronabehandeling. Na sterilisatie van het microgefabriceerde apparaat dat aan de siliconenbuis was bevestigd, was de apparaatopstelling klaar om 3D-morfogenese van de darm uit te voeren. epitheel (Figuur 2g).
a, Schematische illustratie van de bereiding van PDMS-onderdelen uit SU-8-gepatroneerde siliconen mallen. De niet-uitgeharde PDMS-oplossing werd op een siliconen mal gegoten (links), uitgehard bij 60 °C (midden) en ontvormd (rechts). De ontvormde PDMS werd in stukken gesneden en gereinigd voor verder gebruik. b, Foto van de siliconen mal die werd gebruikt om de bovenste PDMS-laag te bereiden. c, Foto van de siliconen mal die werd gebruikt om het poreuze PDMS-membraan te vervaardigen. d, Een reeks foto's van de bovenste en onderste PDMS-componenten en het geassembleerde darm-op-een-chip-apparaat. e, Schematische weergave van de uitlijning van de bovenste, membraan- en onderste PDMS-componenten. Elke laag is onomkeerbaar verbonden door plasma- of coronabehandeling. f, Schematische weergave van het gefabriceerde darm-op-een-chip-apparaat met daarop gesuperponeerde geplooide microkanalen en vacuümkamers. g, Opstelling van darm-op-een-chip voor microfluïdische celkweek. De gefabriceerde darm-op-een-chip, geassembleerd met een siliconenbuis en spuit, werd op een dekglaasje geplaatst. Het apparaat werd op het deksel van een petrischaal van 150 mm geplaatst voor verwerking. De bindmiddel wordt gebruikt om de siliconenbuis te sluiten. h, Visuele momentopnamen van de fabricage van hybride chips en 3D-morfogenese met behulp van hybride chips. Transwell-inserts, onafhankelijk geprepareerd voor de kweek van 2D-monolagen van intestinale epitheelcellen, werden in de hybride chip geplaatst om intestinale 3D-morfogenese te induceren. Het medium wordt door microkanalen onder de cellaag op de Transwell-insert gepompt. Schaalbalk, 1 cm. h Overgenomen met toestemming van referentie 4. Elsevier.
In dit protocol werden de Caco-2-cellijn en intestinale organoïden gebruikt als epitheliale bronnen (Fig. 3a). Beide celtypen werden onafhankelijk gekweekt (Box 2 en Box 5) en gebruikt om de met ECM gecoate microkanalen van on-chip darm- of Transwell-inserts te bezaaien. Wanneer de cellen confluent zijn (>95% bedekking in kweekflessen), worden routinematig gekweekte Caco-2-cellen (tussen passage 10 en 50) in T-flessen geoogst om gedissocieerde celsuspensies te bereiden met trypsinisatievloeistof (Box 2). Menselijke intestinale organoïden uit intestinale biopsieën of chirurgische resecties werden gekweekt in Matrigel-scaffoldkoepels in 24-wells platen om de structurele microomgeving te ondersteunen. Medium met essentiële morfogenen (zoals Wnt, R-spondin en Noggin) en groeifactoren, bereid zoals beschreven in Box 3, werd om de twee dagen aangevuld totdat de organoïden een diameter van ongeveer 500 µm bereikten. Volledig gegroeide organoïden werden vervolgens gebruikt. Organoïden worden geoogst en gedissocieerd tot afzonderlijke cellen om te worden uitgezaaid op darm- of Transwell-inserts op een chip (Box 5). Zoals we eerder hebben gerapporteerd, kan er onderscheid worden gemaakt op basis van het type ziekte12,13 (bijv. colitis ulcerosa, de ziekte van Crohn, colorectale kanker of een normale donor), de locatie van de laesie (bijv. laesie versus niet-laesiegebied) en de gastro-intestinale locatie in het traject (bijv. duodenum, jejunum, ileum, blindedarm, dikke darm of rectum). We bieden in Box 5 een geoptimaliseerd protocol voor het kweken van colon-organoïden (coloïden), die doorgaans hogere concentraties morfogenen vereisen dan dunnedarm-organoïden.
a, Werkstroom voor de inductie van darmmorfogenese in de darmchip. Caco-2 humane darmepitheelcellen en darmorganoïden worden in dit protocol gebruikt om 3D-morfogenese aan te tonen. De geïsoleerde epitheelcellen werden gezaaid in het voorbereide darm-op-een-chip-apparaat (chipvoorbereiding). Zodra de cellen op dag 0 (D0) zijn gezaaid (gezaaid) en aan het poreuze PDMS-membraan zijn gehecht (gehecht), wordt apicale (AP) stroming geïnitieerd en gedurende de eerste 2 dagen gehandhaafd (stroming, AP, D0-D2). Basolaterale (BL) stroming wordt ook geïnitieerd, samen met cyclische rekbewegingen (rek, stroming, AP en BL), wanneer een complete 2D-monolaag is gevormd. Darm-3D-morfogenese trad spontaan op na 5 dagen microfluïdische kweek (morfogenese, D5). Fasecontrastbeelden tonen de representatieve morfologie van Caco-2-cellen bij elke experimentele stap of tijdstip (staafdiagram, 100 µm). Vier schematische Diagrammen die de corresponderende cascades van darmmorfogenese illustreren (rechtsboven). De stippellijnen in het schema geven de richting van de vloeistofstroom weer. b, SEM-afbeelding die de oppervlaktetopologie van het gevormde 3D Caco-2-epitheel toont (links). De inzet, die het vergrote gebied markeert (witte stippellijn), toont de geregenereerde microvilli op de 3D Caco-2-laag (rechts). c, Horizontaal frontaal aanzicht van gevormde Caco-2 3D, claudine (ZO-1, rood) en continue borstelrandmembranen gelabeld met F-actine (groen) en kernen (blauw). Immunofluorescentie confocale visualisatie van epitheelcellen op darmchips. Pijlen die naar het middelste schema wijzen, geven de locatie van het focusvlak voor elke confocale weergave aan. d, Tijdsverloop van morfologische veranderingen in organoïden gekweekt op een chip, verkregen met fasecontrastmicroscopie op dag 3, 7, 9, 11 en 13. De inzet (rechtsboven) toont de hoge vergroting van de Afbeelding e, DIC-fotomicrograaf van een 3D-epitheelorganoïde gevormd in de darm op een plakje genomen op dag 7. f, Overlappende immunofluorescentiebeelden die markers tonen voor stamcellen (LGR5; magenta), slijmproducerende cellen (MUC2; groen), F-actine (grijs) en kernen (cyaan) gekweekt op darmchips gedurende respectievelijk 3 dagen (links) en 13 dagen (midden) organoïden op de epitheellaag. Zie ook Extended Data Figuur 3, die LGR5-signalering zonder MUC2-signalering benadrukt. Fluorescentiebeelden die de epitheliale microstructuur (rechts) tonen van een 3D-epitheelorganoïde gevormd in de darm op een chip door kleuring van het plasmamembraan met CellMask-kleurstof (rechts) op dag 13 van de kweek. Schaalbalk is 50 μm, tenzij anders vermeld. b Overgenomen met toestemming van referentie 2. Oxford University Press; c Bewerkt met toestemming van referentie 2. Oxford University Press; e en f aangepast met toestemming door middel van verwijzing.12 Onder Creative Commons-licentie CC BY 4.0.
Bij een darm-op-een-chip-model is het noodzakelijk om het hydrofobe oppervlak van het poreuze PDMS-membraan aan te passen voor een succesvolle ECM-coating. In dit protocol passen we twee verschillende methoden toe om de hydrofobiciteit van PDMS-membranen te modificeren. Voor het kweken van Caco-2-cellen was oppervlakteactivering door UV/ozonbehandeling alleen voldoende om de hydrofobiciteit van het PDMS-oppervlak te verminderen, de ECM aan te brengen en Caco-2-cellen aan het PDMS-membraan te hechten. Microfluïdische kweek van organoïde-epitheel vereist echter chemische oppervlaktefunctionalering om een ​​efficiënte afzetting van ECM-eiwitten te bereiken door achtereenvolgens polyethyleenimine (PEI) en glutaraldehyde aan te brengen op PDMS-microkanalen. Na oppervlaktemodificatie werden ECM-eiwitten afgezet om het gefunctionaliseerde PDMS-oppervlak te bedekken en vervolgens geïntroduceerd in het geïsoleerde organoïde-epitheel. Nadat de cellen zijn gehecht, start de microfluïdische celkweek door alleen het medium in het bovenste microkanaal te perfuseren totdat de cellen een complete monolaag vormen, terwijl het onderste microkanaal statische omstandigheden handhaaft. Een geoptimaliseerde methode voor oppervlakteactivering en ECM-coating maakt de hechting van organoïde-epitheel mogelijk om 3D-morfogenese op het PDMS-oppervlak te induceren.
Transwell-culturen vereisen ook een ECM-coating vóór het zaaien van de cellen; Transwell-culturen vereisen echter geen complexe voorbehandelingsstappen om het oppervlak van de poreuze inserts te activeren. Voor het kweken van Caco-2-cellen op Transwell-inserts versnelt een ECM-coating op de poreuze inserts de hechting van gedissocieerde Caco-2-cellen (<1 uur) en de vorming van een tight junction-barrière (<1-2 dagen). Om organoïden op Transwell-inserts te kweken, worden geïsoleerde organoïden gezaaid op met ECM gecoate inserts, gehecht aan het membraanoppervlak (<3 uur) en onderhouden totdat de organoïden een complete monolaag met een intacte barrière vormen. Transwell-culturen worden uitgevoerd in 24-wells platen zonder gebruik van hybride chips.
In vitro 3D-morfogenese kan worden geïnitieerd door vloeistofstroming toe te passen op de basolaterale zijde van een reeds gevormde epitheellaag. In de darm op een chip begon de epitheliale morfogenese toen het medium in de bovenste en onderste microkanalen werd gepompt (Fig. 3a). Zoals eerder beschreven, is het cruciaal om vloeistofstroming in het onderste (basolaterale) compartiment te introduceren voor de continue verwijdering van directioneel afgescheiden morfogene remmers. Om voldoende voedingsstoffen en serum te leveren aan cellen die gebonden zijn aan poreuze membranen en om luminale schuifspanning te genereren, passen we in de darm op een chip doorgaans een dubbele stroming toe. In hybride chips werden Transwell-inserts met epitheliale monolagen in de hybride chips geplaatst. Vervolgens werd het medium onder de basolaterale zijde van de poreuze Transwell-insert aangebracht via het microkanaal. Darmmorfogenese vond 3-5 dagen na het starten van de basolaterale stroming plaats in beide kweekplatformen.
De morfologische kenmerken van micro-geëngineerde 3D-epitheellagen kunnen worden geanalyseerd met behulp van verschillende beeldvormingsmodaliteiten, waaronder fasecontrastmicroscopie, differentieel interferentiecontrast (DIC)-microscopie, SEM of immunofluorescentie-confocale microscopie (figuren 3 en 4). Fasecontrast- of DIC-beeldvorming kan eenvoudig op elk moment tijdens de kweek worden uitgevoerd om de vorm en uitstulping van 3D-epitheellagen te volgen. Dankzij de optische transparantie van PDMS- en polyesterfilms kunnen zowel de darm-op-een-chip- als de hybride chip-platforms realtime in situ-beeldvorming bieden zonder dat het apparaat hoeft te worden doorgesneden of gedemonteerd. Bij het uitvoeren van immunofluorescentiebeeldvorming (figuren 1, 3c, f en 4b, c) worden cellen doorgaans gefixeerd met 4% (gew./vol.) paraformaldehyde (PFA), gevolgd door Triton X-100 en 2% (gew./vol.) bovine serumalbumine (BSA), in die volgorde. Afhankelijk van het celtype worden verschillende Fixeermiddelen, permeabilisatoren en blokkerende middelen kunnen worden gebruikt. Primaire antilichamen gericht op lijn-afhankelijke cel- of regiomarkers worden gebruikt om cellen te markeren die in situ op de chip zijn geïmmobiliseerd, gevolgd door secundaire antilichamen samen met een tegenkleurstof gericht op de celkern (bijv. 4′,6-diamidino-2-fenyleen)indool, DAPI) of F-actine (bijv. fluorescent gelabeld phalloidine). Fluorescentiegebaseerde live-imaging kan ook in situ worden uitgevoerd om slijmproductie te detecteren (Fig. 1, "Celdifferentiatie" en "Darmfysiologie"), willekeurige kolonisatie van microbiële cellen (Fig. 1, "Gastheer-microbe co-cultuur"), de rekrutering van immuuncellen (Fig. 1, 'Ziektemodellering') of de contouren van 3D epitheliale morfologie (Fig. 3c,f en 4b,c). Bij het modificeren van de darm op de chip om de bovenste laag te scheiden van de onderste microkanaallaag, Zoals beschreven in ref. Zoals weergegeven in Fig. 2, kunnen de 3D epitheliale morfologie en de microvilli op de apicale borstelzoom worden gevisualiseerd met behulp van SEM (Fig. 3b). De expressie van differentiatie markers kan worden beoordeeld door middel van kwantitatieve PCR5 of single-cell RNA-sequencing. In dit geval worden 3D-lagen van epitheelcellen, gekweekt in darmchips of hybride chips, geoogst door middel van trypsinisatie en vervolgens gebruikt voor moleculaire of genetische analyse.
a, Werkwijze voor de inductie van intestinale morfogenese in een hybride chip. Caco-2-cellen en intestinale organoïden worden in dit protocol gebruikt om 3D-morfogenese in een hybride chipplatform aan te tonen. Gedissocieerde epitheelcellen werden gezaaid in voorbereide Transwell-inserts (TW-voorbereiding; zie onderstaande afbeelding). Nadat de cellen waren gezaaid (gezaaid) en gehecht aan polyestermembranen in de Transwell-inserts, werden alle cellen gekweekt onder statische omstandigheden (TW-kweek). Na 7 dagen werd een enkele Transwell-insert met een 2D-monolaag epitheelcellen geïntegreerd in een hybride chip om een ​​basolaterale stroming (stroming, BL) te introduceren, wat uiteindelijk leidde tot de vorming van een 3D-epitheellaag (morfogenese). Fasecontrastmicroscopie toont morfologische kenmerken van menselijke orgaanepitheelcellen afkomstig van de opstijgende dikke darm van een normale donor (C103-lijn) bij elke experimentele stap of tijdstip. De schema's in de bovenste lagen illustreren de experimentele configuratie voor elke stap. b, Hybride chips (linker schema) kunnen leiden tot 3D-morfogenese. Morfogenese van organoïde epitheelcellen met top-down confocale microscopiebeelden genomen op verschillende Z-posities (boven, midden en onder; zie schema rechts en bijbehorende stippellijnen). toonde duidelijke morfologische kenmerken. F-actine (cyaan), celkern (grijs). c, Fluorescentie confocale microfoto's (3D schuine weergave) van organoïde-afgeleide epitheelcellen gekweekt in een statische Transwell (TW; inzet binnen het witte gestippelde kader) versus hybride chip (grootste volledige opname) ter vergelijking van respectievelijk 2D- en 3D-morfologie. Een paar 2D verticale dwarsdoorsneden (inzet in de rechterbovenhoek; "XZ") tonen ook 2D- en 3D-kenmerken. Schaalbalk, 100 µm. c Overgenomen met toestemming van referentie 4. Elsevier.
Controles kunnen worden voorbereid door dezelfde cellen (Caco-2 of intestinale organoïde epitheelcellen) in tweedimensionale monolagen te kweken onder conventionele statische kweekomstandigheden. Het is belangrijk op te merken dat er sprake kan zijn van uitputting van voedingsstoffen als gevolg van de beperkte volumecapaciteit van de microkanalen (bijvoorbeeld ~4 µL in het bovenste kanaal van het oorspronkelijke darmchipontwerp). Daarom kan de epitheliale morfologie vóór en na toepassing van basolaterale stroming ook worden vergeleken.
Het softlithografieproces moet in een cleanroom worden uitgevoerd. Voor elke laag op de chip (bovenste en onderste lagen en membranen) en hybride chips werden verschillende fotomaskers gebruikt en op aparte siliciumwafers vervaardigd, omdat de hoogtes van de microkanalen verschillend waren. De beoogde hoogtes van de bovenste en onderste microkanalen van de darm op de chip zijn respectievelijk 500 µm en 200 µm. De beoogde kanaalhoogte van de hybride chip is 200 µm.
Plaats een siliciumwafel van 7,5 cm in een schaal met aceton. Beweeg de schaal voorzichtig 30 seconden rond en laat de wafel vervolgens aan de lucht drogen. Breng de wafel over naar een schaal met isopropylalcohol (IPA) en centrifugeer de schaal 30 seconden om deze te reinigen.
Een piranha-oplossing (mengsel van waterstofperoxide en geconcentreerd zwavelzuur, 1:3 (vol/vol)) kan optioneel worden gebruikt om de verwijdering van organische resten van het siliciumwafeloppervlak te maximaliseren.
Piranha-oplossing is extreem corrosief en genereert warmte. Extra veiligheidsmaatregelen zijn daarom noodzakelijk. Laat de oplossing afkoelen voordat u deze overbrengt naar een schone, droge afvalcontainer. Gebruik herbruikbare containers en voorzie deze van de juiste etiketten. Raadpleeg de veiligheidsrichtlijnen van de betreffende faciliteit voor meer gedetailleerde procedures.
De wafels werden 10 minuten op een hete plaat van 200 °C geplaatst om ze te drogen. Na het drogen werden de wafels vijfmaal in de lucht geschud om ze af te koelen.
Giet ongeveer 10 g fotolak SU-8 2100 in het midden van de gereinigde silicium wafer. Gebruik een pincet om de fotolak gelijkmatig over de wafer te verdelen. Plaats de wafer af en toe op een verwarmingsplaat van 65 °C om de fotolak minder plakkerig en gemakkelijker te verspreiden te maken. Plaats de wafer niet direct op de verwarmingsplaat.
SU-8 werd gelijkmatig over de wafer verdeeld door middel van spincoating. Programmeer een inkomende rotatie van de SU-8 gedurende 5-10 seconden om deze met 500 rpm en een acceleratie van 100 rpm/s te laten voortplanten. Stel de hoofdrotatie in voor een patroon van 200 µm dikte bij 1500 rpm, of bereik een dikte van 250 µm (waardoor de bovenste laag van de gut op de chip een hoogte van 500 µm krijgt; zie "Kritieke stappen" hieronder) met een acceleratie van 300 rpm/s gedurende 30 seconden bij 1200 rpm.
De hoofdrotatiesnelheid kan worden aangepast aan de gewenste dikte van het SU-8-patroon op de siliciumwafer.
Om SU-8-patronen van 500 µm hoogte te fabriceren voor de bovenste laag van de darm op de chip, werden de spincoating- en softbaking-stappen van deze Box (stappen 7 en 8) achtereenvolgens herhaald (zie stap 9) om twee lagen van 250 µm dikke SU-8 te produceren, die in stap 12 van deze Box door UV-belichting aan elkaar kunnen worden gehecht, waardoor een laag van 500 µm hoog ontstaat.
Bak de met SU-8 gecoate wafers voorzichtig af door ze 5 minuten op een hete plaat van 65 °C te plaatsen, vervolgens de temperatuur te verhogen naar 95 °C en ze nog 40 minuten te laten incuberen.
Om een ​​SU-8-patroon met een hoogte van 500 μm in het bovenste microkanaal te verkrijgen, herhaalt u stap 7 en 8 om twee SU-8-lagen van 250 μm dik te genereren.
Gebruik de UV Mask Aligner om een ​​lamptest uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant om de belichtingstijd van de wafer te berekenen. (belichtingstijd, ms) = (belichtingsdosis, mJ/cm2)/(lampvermogen, mW/cm2).
Nadat de belichtingstijd is bepaald, plaatst u het fotomasker op de maskerhouder van de UV-maskeruitlijner en legt u het fotomasker op de met SU-8 gecoate wafer.
Plaats het bedrukte oppervlak van het fotomasker direct op de met SU-8 gecoate zijde van de siliciumwafer om UV-verstrooiing te minimaliseren.
Stel de met SU-8 gecoate wafer en het fotomasker verticaal bloot aan 260 mJ/cm2 UV-licht gedurende de vooraf bepaalde belichtingstijd (zie stap 10 van dit kader).
Na blootstelling aan UV-licht werden de met SU-8 gecoate siliciumwafers gedurende 5 minuten op 65 °C en gedurende 15 minuten op 95 °C op elk van de verwarmingsplaten gebakken om patronen met een hoogte van 200 µm te vervaardigen. Door de nabaktijd op 95 °C te verlengen tot 30 minuten werden patronen met een hoogte van 500 µm vervaardigd.
De ontwikkelaar wordt in een glazen schaal gegoten en de gebakken wafer wordt erin geplaatst. De hoeveelheid SU-8-ontwikkelaar kan variëren afhankelijk van de grootte van de glazen schaal. Zorg ervoor dat u voldoende SU-8-ontwikkelaar gebruikt om alle niet-belichte SU-8 volledig te verwijderen. Bijvoorbeeld, bij gebruik van een glazen schaal met een diameter van 150 mm en een inhoud van 1 liter, gebruikt u ongeveer 300 ml SU-8-ontwikkelaar. Ontwikkel de mal gedurende 25 minuten met af en toe een voorzichtige rotatie.
Spoel de ontwikkelde mal af met ongeveer 10 ml verse ontwikkelaar, gevolgd door IPA door de oplossing met een pipet te verstuiven.
Plaats de wafer in een plasmareiniger en stel deze gedurende 1,5 minuut bloot aan zuurstofplasma (atmosferisch gas, streefdruk 1 × 10−5 Torr, vermogen 125 W).
Plaats de wafer in een vacuüm desiccator met een objectglas erin. Wafers en objectglazen kunnen naast elkaar worden geplaatst. Als de vacuüm desiccator door een plaat in meerdere lagen is verdeeld, plaatst u de objectglazen in de onderste kamer en de wafers in de bovenste kamer. Druppel 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silaanoplossing op een objectglas en breng vacuüm aan voor silanisatie.
Ontdooi een ampul met bevroren Caco-2-cellen in een waterbad van 37 °C en breng de ontdooide cellen vervolgens over naar een T75-kolf met 15 ml voorverwarmd Caco-2-medium van 37 °C.
Om Caco-2-cellen te subcultiveren bij een confluentie van ongeveer 90%, moet eerst het Caco-2-medium, PBS en 0,25% trypsine/1 mM EDTA worden verwarmd in een waterbad van 37 °C.
Zuig het medium af met behulp van vacuümaspiratie. Was de cellen tweemaal met 5 ml warme PBS door de vacuümaspiratie te herhalen en verse PBS toe te voegen.