Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta para sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Ang morphogenesis sa tinai sa tawo nagtukod og mga bahin sa crypt-villus sa 3D epithelial microarchitecture ug spatial organization. Kini nga talagsaon nga istruktura gikinahanglan aron mapadayon ang gut homeostasis pinaagi sa pagpanalipod sa stem cell niche sa basal crypt gikan sa exogenous microbial antigens ug sa ilang mga metabolite. Dugang pa, ang intestinal villi ug secreting mucus nagpresentar og functionally differentiated epithelial cells nga adunay protective barrier sa intestinal mucosal surface. Busa, ang pag-recreate sa 3D epithelial structures importante alang sa pagtukod og in vitro gut models. Ilabi na, ang organic mimetic gut-on-a-chip mahimong maka-induce sa spontaneous 3D morphogenesis sa intestinal epithelium nga adunay gipauswag nga physiological functions ug biomechanics. Dinhi, naghatag kami og reproducible protocol aron lig-on nga ma-induce ang intestinal morphogenesis sa tinai sa usa ka microfluidic chip ingon man sa usa ka Transwell embedded hybrid chip. Gihulagway namo ang detalyado nga mga pamaagi alang sa device fabrication, culture sa Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells sa conventional settings ingon man sa usa ka microfluidic platform, induction sa 3D morphogenesis, ug characterization sa natukod nga 3D epithelia gamit ang multiple imaging modalities. Kini nga protocol... Nakab-ot ang pagbag-o sa functional gut microarchitecture pinaagi sa pagkontrol sa basolateral fluid flow sulod sa 5 ka adlaw. Ang among in vitro morphogenesis method naggamit ug physiologically relevant shear stress ug mechanical motion ug wala magkinahanglan ug komplikado nga cell engineering o manipulation, nga mahimong molabaw sa ubang kasamtangang mga teknik. Among gilantaw nga ang among gisugyot nga protocol mahimong adunay halapad nga implikasyon alang sa biomedical research community, nga naghatag ug pamaagi sa pagbag-o sa 3D intestinal epithelial layers in vitro para sa biomedical, clinical, ug pharmaceutical applications.
Gipakita sa mga eksperimento nga ang intestinal epithelial Caco-2 cells nga gipatubo sa gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o bilayer microfluidic devices6,7 mahimong moagi sa spontaneous 3D morphogenesis in vitro nga walay klarong pagsabot sa nagpahiping mekanismo. Sa among bag-o nga pagtuon, among nakita nga ang pagtangtang sa basolaterally secreted morphogen antagonists gikan sa culture devices gikinahanglan ug igo aron ma-induce ang 3D epithelial morphogenesis in vitro, nga napamatud-an sa Caco-2 ug mga organoid sa intestinal nga nakuha sa pasyente. Gi-validate ang mga epithelial cells. Niini nga pagtuon, among gitutukan ang produksiyon sa selula ug ang pag-apod-apod sa konsentrasyon sa usa ka kusgan nga Wnt antagonist, ang Dickkopf-1 (DKK-1), sa gut-on-a-chip ug giusab nga mga microfluidic device nga adunay mga Transwell insert, nga gitawag og "Hybrid Chip". Gipakita namo nga ang pagdugang sa exogenous Wnt antagonists (sama sa DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, o Soggy-1) sa on-chip gut nagpugong sa morphogenesis o nakabalda sa prestructured 3D epithelial layer, nga nagsugyot nga ang antagonistic stress atol sa culture maoy responsable sa intestinal morphogenesis in vitro. Busa, ang praktikal nga pamaagi aron makab-ot ang lig-on nga morphogenesis sa epithelial interface mao ang pagtangtang o gamay nga pagmentinar sa lebel sa Wnt antagonists sa basolateral compartment pinaagi sa active flushing (pananglitan, sa gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip platforms) o diffusion. Basolateral media (pananglitan, gikan sa Transwell inserts ngadto sa dagkong basolateral reservoirs sa mga atabay).
Niini nga protocol, naghatag kami og detalyado nga pamaagi alang sa paghimo og gut-on-a-chip microdevices ug Transwell-insertable hybrid chips (mga lakang 1-5) aron i-culture ang intestinal epithelial cells sa polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (mga lakang 6A, 7A, 8, 9) o polyester membranes sa Transwell inserts (mga lakang 6B, 7B, 8, 9) ug gi-induce ang 3D morphogenesis in vitro (lakang 10). Giila usab namo ang mga cellular ug molecular features nga nagpakita sa tissue-specific histogenesis ug lineage-dependent cellular differentiation pinaagi sa pag-apply sa multiple imaging modalities (mga lakang 11-24). Gi-induce namo ang morphogenesis gamit ang human intestinal epithelial cells, sama sa Caco-2 o intestinal organoids, sa duha ka culture formats nga adunay teknikal nga mga detalye lakip ang surface modification sa porous membranes, paghimo og 2D monolayers, ug intestinal biochemical ug Reproduction sa biomechanical microenvironment. In vitro. Aron ma-induce ang 3D morphogenesis gikan sa 2D epithelial monolayers, among gikuha ang morphogen antagonists sa duha ka cultured forms pinaagi sa pag-agos. ang medium ngadto sa basolateral compartment sa kultura. Sa katapusan, naghatag kami og representasyon sa gamit sa usa ka mabag-o nga 3D epithelial layer nga magamit sa pag-modelo sa morphogen-dependent epithelial growth, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, ug probiotic-based therapies Example. mga impluwensya.
Ang among protocol mahimong mapuslanon sa daghang mga siyentista sa sukaranan (pananglitan, intestinal mucosal biology, stem cell biology, ug developmental biology) ug applied research (pananglitan, preclinical drug testing, disease modeling, tissue engineering, ug gastroenterology) nga halapad nga epekto. Tungod sa reproducibility ug kalig-on sa among protocol aron ma-induce ang 3D morphogenesis sa intestinal epithelium in vitro, among gilantaw nga ang among teknikal nga estratehiya mahimong ipakaylap sa mga tumatan-aw nga nagtuon sa dinamika sa cell signaling atol sa intestinal development, regeneration o homeostasis. Dugang pa, ang among protocol mapuslanon alang sa pag-imbestiga sa impeksyon ubos sa lain-laing mga infectious agent sama sa Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae. Mapuslanon usab ang mga tumatan-aw sa patolohiya ug pathogenesis sa sakit. Ang paggamit sa on-chip gut microphysiology system mahimong magtugot sa longitudinal co-culture 10 ug sunod nga pagtimbang-timbang sa host defense, immune responses ug pathogen-related injury repair sa gastrointestinal (GI) tract 11. Ang ubang mga sakit sa GI nga nalangkit sa leaky gut syndrome, celiac disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, pouchitis, o irritable bowel syndrome mahimong ma-simulate kung ang 3D intestinal epithelial layers giandam gamit ang 3D intestinal epithelial layers sa pasyente, kini nga mga sakit naglakip sa villous atrophy, crypt shortening, mucosal damage, o impaired epithelial barrier. Biopsy o stem cell-derived intestinal organoids 12,13. Aron mas maayo nga ma-modelo ang mas taas nga pagkakomplikado sa palibot sa sakit, ang mga magbabasa mahimong mokonsiderar sa pagdugang sa mga tipo sa selula nga may kalabutan sa sakit, sama sa peripheral blood mononuclear cells sa pasyente (PBMCs), sa mga modelo nga adunay 3D intestinal villus-crypt microarchitectures. tissue-specific immune cells, 5.
Tungod kay ang 3D epithelial microstructure mahimong ayohon ug makita nga wala ang proseso sa sectioning, ang mga tumatan-aw nga nagtrabaho sa spatial transcriptomics ug high-resolution o super-resolution imaging mahimong interesado sa among pagmapa sa spatiotemporal dynamics sa mga gene ug protina sa epithelial niches. Interesado sa teknolohiya. Tubag sa microbial o immune stimuli. Dugang pa, ang longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 nga nag-coordinate sa gut homeostasis mahimong matukod sa 3D intestinal mucosal layer pinaagi sa co-culturing sa lainlaing mga microbial species, microbial communities o fecal microbiota, labi na sa gut-on-a-chip. sa plataporma. Kini nga pamaagi labi ka madanihon sa mga tumatan-aw nga nagtuon sa mucosal immunology, gastroenterology, human microbiome, culturomics ug clinical microbiology nga nagtinguha sa pag-ugmad sa kaniadto wala pa ma-culture nga gut microbiota sa laboratoryo. Kung ang among in vitro morphogenesis protocol mahimong ipahiangay sa scalable culture formats, sama sa multiwell inserts sa 24, 96 o 384 well plates nga padayon nga nagpuno sa basolateral compartments, ang protocol mahimo usab nga ipakaylap sa mga nagpalambo sa pharmaceutical, biomedical O high-throughput screening o validation platforms para sa industriya sa pagkaon. Isip usa ka proof-of-principle, bag-o lang namong gipakita ang posibilidad sa usa ka multiplex high-throughput morphogenesis system nga scalable ngadto sa 24-well plate format. Dugang pa, ang multiple organ-on-a-chip nga mga produkto gi-komersyalisado16,17,18. Busa, ang pag-validate sa among in vitro morphogenesis method mahimong mapadali ug posible nga magamit sa daghang mga research laboratory, industriya o gobyerno ug regulatory agencies aron masabtan ang cellular reprogramming sa in vitro gut morphogenesis sa transcriptomic level aron masulayan ang mga tambal o biotherapeutics Ang pagsuhop ug transportasyon Ang gidaghanon sa mga kandidato sa tambal gisusi gamit ang 3D gut surrogates o gamit ang custom o komersyal nga organ-on-a-chip models aron masusi ang reproducibility sa proseso sa gut morphogenesis.
Usa ka limitado nga gidaghanon sa mga modelo sa eksperimento nga may kalabutan sa tawo ang gigamit sa pagtuon sa intestinal epithelial morphogenesis, labi na tungod sa kakulang sa mga protocol nga mapatuman aron maaghat ang 3D morphogenesis in vitro. Sa tinuud, kadaghanan sa kasamtangang kahibalo bahin sa gut morphogenesis gibase sa mga pagtuon sa hayop (pananglitan, zebrafish20, ilaga21 o manok22). Bisan pa, kini matrabaho ug mahal, mahimong kuwestiyonable sa etika, ug labing hinungdanon, dili tukma nga nagtino sa mga proseso sa paglambo sa tawo. Kini nga mga modelo limitado usab kaayo sa ilang abilidad nga masulayan sa usa ka multi-way scalable nga paagi. Busa, ang among protocol alang sa pag-regenerate sa 3D tissue structures in vitro milabaw sa in vivo animal models ingon man uban pang tradisyonal nga static 2D cell culture models. Sama sa gihulagway kaniadto, ang paggamit sa 3D epithelial structures nagtugot kanamo sa pagsusi sa spatial localization sa differentiated cells sa crypt-villus axis agig tubag sa lainlaing mucosal o immune stimuli. Ang 3D epithelial layers makahatag og luna aron tun-an kung giunsa ang mga microbial cells nakigkompetensya aron maporma ang spatial niches ug ecological evolution agig tubag sa mga host factors (pananglitan, inner versus outer mucus layers, secretion sa IgA ug antimicrobial peptides). Dugang pa, ang 3D epithelial morphology makatabang nato nga masabtan kon giunsa pag-istruktura sa gut microbiota ang mga komunidad niini ug sinergistikong nagpatunghag mga microbial metabolite (pananglitan, short-chain fatty acids) nga nagporma sa cellular organization ug stem cell niches sa basal crypts. Kini nga mga bahin mapamatud-an lamang kung ang 3D epithelial layers matukod in vitro.
Gawas pa sa among pamaagi sa paghimo og 3D intestinal epithelial structures, adunay daghang in vitro nga mga pamaagi. Ang intestinal organoid culture usa ka state-of-the-art nga teknik sa tissue engineering nga gibase sa pag-cultivate sa intestinal stem cells ubos sa espesipikong mga kondisyon sa morphogen23,24,25. Bisan pa, ang paggamit sa 3D organoid models alang sa transport analysis o host-microbiome co-cultures kanunay nga mahagiton tungod kay ang intestinal lumen nasulod sa organoid ug, busa, ang pagpaila sa mga luminal components sama sa microbial cells o exogenous antigens limitado. Ang pag-access sa mga organoid lumens mahimong mapaayo gamit ang microinjector,26,27 apan kini nga pamaagi invasive ug labor-intensive ug nanginahanglan espesyal nga kahibalo aron mahimo. Dugang pa, ang tradisyonal nga mga organoid culture nga gipadayon sa hydrogel scaffolds ubos sa static nga mga kondisyon dili tukma nga nagpakita sa aktibo nga in vivo biomechanics.
Ang ubang mga pamaagi nga gigamit sa daghang mga grupo sa panukiduki naggamit sa prestructured 3D hydrogel scaffolds aron masundog ang istruktura sa epithelial sa tinai pinaagi sa pag-kultura sa nahimulag nga mga selula sa tinai sa tawo sa ibabaw sa gel. Paghimo og mga hydrogel scaffold gamit ang 3D-printed, micro-milled, o lithographically fabricated molds. Kini nga pamaagi nagpakita sa self-organized arrangement sa nahimulag nga mga epithelial cells in vitro nga adunay physiologically relevant morphogen gradients, nga nagtukod og taas nga aspect ratio epithelial structure ug stroma-epithelial crosstalk pinaagi sa paglakip sa stromal cells sa scaffold. Bisan pa, ang kinaiya sa prestructured scaffolds mahimong makapugong sa pagpakita sa spontaneous morphogenetic process mismo. Kini nga mga modelo wala usab maghatag og dynamic luminal o interstitial flow, kulang sa fluid shear stress nga gikinahanglan sa mga selula sa tinai aron moagi sa morphogenesis ug makakuha og physiological function. Laing bag-o nga pagtuon migamit og hydrogel scaffolds sa usa ka microfluidic platform ug patterned intestinal epithelial structures gamit ang laser-etching techniques. Ang mga mouse intestinal organoids nagsunod sa etched patterns aron maporma ang intestinal tubular structures, ug ang intraluminal fluid flow mahimong ma-recapitulate gamit ang microfluidics module. Bisan pa, kini nga modelo wala magpakita og spontaneous flow. Ang mga proseso sa morphogenetic ni naglakip sa mga gut mechanobiological nga paglihok. Ang mga teknik sa 3D printing gikan sa parehas nga grupo nakahimo sa paghimo og gagmay nga mga tubo sa tinai nga adunay kusang proseso sa morphogenetic. Bisan pa sa komplikado nga paghimo sa lainlaing mga bahin sa tinai sulod sa tubo, kini nga modelo kulang usab sa pag-agos sa luminal fluid ug mekanikal nga deformasyon. Dugang pa, ang operability sa modelo mahimong limitado, labi na pagkahuman sa proseso sa bioprinting, nga makabalda sa mga kondisyon sa eksperimento o mga interaksyon sa cell-to-cell. Hinuon, ang among gisugyot nga protocol naghatag og kusang gut morphogenesis, physiologically relevant shear stress, biomechanics nga nagsundog sa gut motility, pag-access sa independente nga apical ug basolateral compartments, ug paghimo pag-usab sa komplikado nga biological microenvironments nga modularity. Busa, ang among in vitro 3D morphogenesis protocol mahimong maghatag usa ka komplementaryong pamaagi aron mabuntog ang mga hagit sa kasamtangan nga mga pamaagi.
Ang among protocol hingpit nga naka-focus sa 3D epithelial morphogenesis, nga adunay mga epithelial cells lamang sa culture ug walay ubang mga klase sa palibot nga mga cell sama sa mesenchymal cells, endothelial cells, ug immune cells. Sama sa gihulagway kaniadto, ang kinauyokan sa among protocol mao ang induction sa epithelial morphogenesis pinaagi sa pagtangtang sa mga morphogen inhibitors nga gitago sa basolateral nga bahin sa gipaila nga medium. Samtang ang lig-on nga modularity sa among gut-on-a-chip ug hybrid-on-a-chip nagtugot kanamo sa paghimo pag-usab sa undulating 3D epithelial layer, ang dugang nga biological complexities sama sa epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition35 ug, sa among modelo, ang mga bahin sa crypt-villus nga nagdala sa stem cell niches sa basal crypts nagpabilin nga gikonsiderar pa. Ang mga stromal cells (pananglitan, fibroblasts) sa mesenchyme adunay hinungdanon nga papel sa paghimo sa mga protina sa ECM ug regulasyon sa intestinal morphogenesis in vivo35,37,38. Ang pagdugang sa mga mesenchymal cells sa among modelo nagpalambo sa proseso sa morphogenetic ug kahusayan sa pagdikit sa cell. Ang endothelial layer (ie, mga capillary o lymphatics) adunay importanteng papel sa pag-regulate sa molecular transport39 ug immune cell recruitment40 sa gut microenvironment. Dugang pa, ang mga vasculature component nga mahimong konektado tali sa mga tissue model usa ka kinahanglanon kung ang mga tissue model gidisenyo aron ipakita ang mga interaksyon sa multi-organ. Busa, ang mga endothelial cell mahimong kinahanglan nga ilakip aron mamodelo ang mas tukma nga mga bahin sa physiological nga adunay resolusyon sa lebel sa organ. Ang mga immune cell nga nakuha sa pasyente hinungdanon usab alang sa pagpakita sa innate immune responses, antigen presentation, innate adaptive immune crosstalk, ug tissue-specific immunity sa konteksto sa pagsundog sa sakit sa tinai.
Mas sayon ​​ang paggamit sa hybrid chips kaysa gut-on-a-chip tungod kay mas simple ang pag-setup sa device ug ang paggamit sa Transwell inserts nagtugot sa scalable culture sa gut epithelium. Apan, ang mga komersyal nga mabatonan nga Transwell inserts nga adunay polyester membranes dili elastic ug dili makasundog sa peristaltic-like nga mga lihok. Dugang pa, ang apical compartment sa Transwell insert nga gibutang sa hybrid chip nagpabilin nga stationary nga walay shear stress sa apical side. Klaro nga ang static properties sa apical compartment talagsa rang makapahimo sa long-term bacterial co-culture sa hybrid chips. Samtang lig-on natong ma-induce ang 3D morphogenesis sa Transwell inserts kung mogamit og hybrid chips, ang kakulang sa physiologically relevant biomechanics ug apical fluid flow mahimong limitahan ang posibilidad sa hybrid chip platforms para sa posibleng mga aplikasyon.
Ang bug-os nga sukod nga mga rekonstruksyon sa axis sa crypt-villus sa tawo sa gut-on-a-chip ug hybrid-on-a-chip nga mga kultura wala pa hingpit nga natukod. Tungod kay ang morphogenesis nagsugod gikan sa usa ka epithelial monolayer, ang 3D microarchitectures dili kinahanglan nga maghatag ug morphological similarity sa mga crypt in vivo. Bisan kung among gihulagway ang nagkadako nga populasyon sa selula duol sa basal crypt domain sa microengineered 3D epithelium, ang mga rehiyon sa crypt ug villous wala klaro nga gimarkahan. Bisan kung ang mas taas nga mga kanal sa ibabaw sa chip nagdala sa pagtaas sa gitas-on sa microengineered epithelium, ang labing taas nga gitas-on limitado gihapon sa ~300–400 µm. Ang tinuud nga giladmon sa mga crypt sa tinai sa tawo sa gamay ug dako nga tinai kay ~135 µm ug ~400 µm, matag usa, ug ang gitas-on sa gamay nga villi sa tinai kay ~600 µm41.
Gikan sa panglantaw sa imaging, ang in situ super-resolution imaging sa 3D microarchitectures mahimong limitado sa gut sa usa ka chip, tungod kay ang gikinahanglan nga working distance gikan sa objective lens ngadto sa epithelial layer naa sa order nga pipila ka milimetro. Aron masulbad kini nga problema, mahimong gikinahanglan ang usa ka layo nga objective. Dugang pa, ang paghimo og nipis nga mga seksyon alang sa pag-andam sa imaging specimen usa ka mahagiton tungod sa taas nga elasticity sa PDMS. Dugang pa, tungod kay ang layer-by-layer microfabrication sa gut sa usa ka chip naglambigit sa permanente nga adhesion tali sa matag layer, kini lisud kaayo nga ablihan o tangtangon ang ibabaw nga layer aron masusi ang istruktura sa ibabaw sa epithelial layer. Pananglitan, pinaagi sa paggamit sa scanning electron microscope (SEM).
Ang hydrophobicity sa PDMS usa ka limiting factor sa mga microfluidic-based studies nga naghisgot sa hydrophobic small molecules, tungod kay ang PDMS dili espesipikong maka-adsorb sa maong hydrophobic molecules. Ang mga alternatibo sa PDMS mahimong ikonsiderar uban sa ubang polymeric materials. Sa laing paagi, ang surface modification sa PDMS (pananglitan, pag-coat gamit ang lipophilic materials 42 o poly(ethylene glycol) 43) mahimong ikonsiderar aron maminusan ang adsorption sa hydrophobic molecules.
Sa katapusan, ang among pamaagi wala pa maayo nga gihulagway sa mga termino sa paghatag og high-throughput screening o "one-size-fits-all" user-friendly experimental platform. Ang kasamtangang protocol nanginahanglan og syringe pump kada microdevice, nga mokuha og espasyo sa usa ka CO2 incubator ug makapugong sa dagkong mga eksperimento. Kini nga limitasyon mahimong mapauswag pag-ayo pinaagi sa scalability sa mga inobatibong format sa kultura (pananglitan, 24-well, 96-well, o 384-well porous inserts nga nagtugot sa padayon nga pagpuno ug pagtangtang sa basolateral media).
Aron ma-induce ang 3D morphogenesis sa human intestinal epithelium in vitro, migamit mi og microfluidic chip intestinal device nga adunay duha ka parallel microchannels ug usa ka elastic porous membrane sa taliwala aron makahimo og lumen-capillary interface. Gipakita usab namo ang paggamit sa single-channel microfluidic device (usa ka hybrid chip) nga naghatag og padayon nga basolateral flow ubos sa polarized epithelial layers nga gipatubo sa Transwell inserts. Sa duha ka plataporma, ang morphogenesis sa lain-laing human intestinal epithelial cells mahimong mapakita pinaagi sa pag-apply sa directional manipulation sa flow aron makuha ang morphogen antagonists gikan sa basolateral compartment. Ang tibuok experimental procedure (Figure 1) gilangkoban sa lima ka bahin: (i) microfabrication sa gut chip o Transwell insertable hybrid chip (mga lakang 1-5; Box 1), (ii) pag-andam sa intestinal epithelial cells (Caco-2 cells) o human intestinal organoids; mga kahon 2-5), (iii) kultura sa mga intestinal epithelial cells sa mga intestinal chips o hybrid chips (mga lakang 6-9), (iv) induction sa 3D morphogenesis in vitro (lakang 10) ug (v)) aron mailhan ang 3D epithelial microstructure (mga lakang 11-24). Sa katapusan, usa ka angay nga control group (nga gihisgutan pa sa ubos) ang gidisenyo aron mapamatud-an ang kaepektibo sa in vitro morphogenesis pinaagi sa pagtandi sa epithelial morphogenesis sa spatial, temporal, conditional, o procedural nga mga kontrol.
Migamit mig duha ka lain-laing culture platforms: gut-on-a-chip nga adunay tul-id nga mga channel o nonlinear convoluted channels, o hybrid chips nga adunay Transwell (TW) inserts sa usa ka microfluidic device, nga gihimo sama sa gihulagway sa Box 1, ug ang step 1-5. "Device Fabrication" nagpakita sa mga nag-unang lakang sa paghimo og single chip o hybrid chip. "Culture of Human Intestinal Epithelial Cells" nagpatin-aw sa cell source (Caco-2 o human intestinal organoids) ug culture procedure nga gigamit niini nga protocol. "In vitro morphogenesis" nagpakita sa kinatibuk-ang mga lakang diin ang Caco-2 o organoid-derived epithelial cells gi-culture sa usa ka intestinal chip o sa Transwell inserts sa usa ka hybrid chip, gisundan sa induction sa 3D morphogenesis ug ang pagporma sa usa ka characterized epithelial structure. Ang program step number o box number gipakita sa ubos sa matag arrow. Ang aplikasyon naghatag og mga ehemplo kon giunsa magamit ang natukod nga intestinal epithelial layers, pananglitan, sa cell differentiation characterization, gut physiology studies, pagtukod sa host-microbiome ecosystems, ug disease modeling. Mga imahe sa Immunofluorescence sa "Cell... "Differentiation” nga nagpakita sa nuclei, F-actin ug MUC2 nga gipahayag sa 3D Caco-2 epithelial layer nga namugna sa gut chip. Ang MUC2 signaling anaa sa mga goblet cell ug mucus nga gipagawas gikan sa mucosal surfaces. Ang mga fluorescent nga imahe sa Gut Physiology nagpakita sa mucus nga gihimo pinaagi sa pag-staining para sa sialic acid ug N-acetylglucosamine residues gamit ang fluorescent wheat germ agglutinin. Ang duha ka nagsapaw nga mga imahe sa "Host-Microbe Co-Cultures" nagpakita sa representante nga host-microbiome co-cultures sa gut sa usa ka chip. Ang wala nga panel nagpakita sa co-culture sa E. coli nga nagpahayag sa berde nga fluorescent protein (GFP) nga adunay microengineered 3D Caco-2 epithelial cells. Ang tuo nga panel nagpakita sa localization sa GFP E. coli nga gi-co-culture sa 3D Caco-2 epithelial cells, gisundan sa immunofluorescence staining nga adunay F-actin (pula) ug nuclei (asul). Ang disease modeling nagpakita sa himsog batok sa leaky gut sa mga gut inflammation chips ubos sa physiological challenge nga adunay bacterial antigens (pananglitan, lipopolysaccharide, LPS) ug immune cells (pananglitan, PBMC; berde). Ang mga selula sa Caco-2 gikultura aron makahimo og 3D epithelial layer. Scale bar, 50 µm. Mga imahe sa ubos nga laray: “Differentiation of cells” nga gipahaum uban ang pagtugot gikan sa reperensya. 2. Oxford University Press; Gikopya uban ang pagtugot gikan sa Ref.5. NAS; “Host-Microbe Co-Culture” nga gipahaum uban ang pagtugot gikan sa ref.3. NAS; “Disease Modeling” nga gipahaum uban ang pagtugot gikan sa reperensya. 5. NAS.
Ang gut-on-chip ug hybrid chips parehong gihimo gamit ang mga replica sa PDMS nga gi-demold gikan sa mga silicon mold pinaagi sa soft lithography1,44 ug gi-pattern gamit ang SU-8. Ang disenyo sa mga microchannel sa matag chip gitino pinaagi sa pagkonsiderar sa hydrodynamics sama sa shear stress ug hydrodynamic pressure1,4,12. Ang orihinal nga disenyo sa gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1a), nga gilangkoban sa duha ka juxtaposed parallel straight microchannels, nahimong usa ka komplikado nga gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) nga naglakip sa usa ka pares sa curved microchannels aron ma-induce ang Dugang nga fluid residence time, nonlinear flow patterns, ug multiaxial deformation sa mga cultured cells (Fig. 2a–f) 12. Kung kinahanglan nga himuon pag-usab ang mas komplikado nga gut biomechanics, mahimong mapili ang komplikado nga gut-on-a-chips. Gipakita namo nga ang convoluted Gut-Chip kusganon usab nga nag-induce sa 3D morphogenesis sa parehas nga time frame nga adunay parehas nga degree sa epithelial growth kon itandi sa orihinal. Gut-Chip, bisan unsa pa ang klase sa cultured cell. Busa, aron ma-induce ang 3D morphogenesis, ang linear ug complex on-chip gut designs mahimong ibaylo. Ang mga PDMS replica nga gi-cure sa silicon molds nga adunay SU-8 patterns naghatag og negatibo nga mga feature human sa demolding (Fig. 2a). Aron mahimo ang gut sa usa ka chip, ang giandam nga ibabaw nga PDMS layer sunod-sunod nga gi-bond sa usa ka porous PDMS film ug dayon gi-align sa ubos nga PDMS layer pinaagi sa irreversible bonding gamit ang corona treater (Fig. 2b–f). Aron mahimo ang hybrid chips, ang gi-cure nga mga PDMS replica gi-bond sa mga glass slide aron makahimo og single-channel microfluidic devices nga maka-accommodate sa Transwell inserts (Fig. 2h ug Extended Data Fig. 2). Ang proseso sa bonding gihimo pinaagi sa pagtambal sa mga nawong sa PDMS replica ug bildo gamit ang oxygen plasma o corona treatment. Human sa sterilization sa microfabricated device nga gilakip sa silicone tube, ang device setup andam na sa paghimo sa 3D morphogenesis sa intestinal epithelium (Fig. 2g).
a, Eskematikong ilustrasyon sa pag-andam sa mga piyesa sa PDMS gikan sa SU-8 patterned silicon molds. Ang wala ma-cure nga solusyon sa PDMS gibubo sa usa ka silicon mold (wala), gi-cure sa 60 °C (tunga) ug gi-demold (tuo). Ang gi-demold nga PDMS giputol-putol ug gilimpyohan alang sa dugang nga paggamit. b, Litrato sa silicon mold nga gigamit sa pag-andam sa ibabaw nga layer sa PDMS. c, Litrato sa silicon mold nga gigamit sa paghimo sa PDMS porous membrane. d, Usa ka serye sa mga litrato sa ibabaw ug ubos nga mga sangkap sa PDMS ug ang gi-assemble nga on-chip intestinal device. e, Eskematikong pag-align sa ibabaw, lamad, ug ubos nga mga sangkap sa PDMS. Ang matag layer dili na mabalik nga gi-bond sa plasma o corona treatment. f, Eskematikong paghimo sa gut-on-a-chip device nga adunay superimposed convoluted microchannels ug vacuum chambers. g, Pag-setup sa gut-on-a-chip para sa microfluidic cell culture. Ang gihimo nga gut sa usa ka chip nga gi-assemble nga adunay silicone tube ug syringe gibutang sa usa ka coverslip. Ang chip device gibutang sa taklob sa usa ka 150 mm Petri pinggan para sa pagproseso. Ang binder gigamit sa pagsira sa silicone tube. h, Biswal nga mga snapshot sa hybrid chip fabrication ug 3D morphogenesis gamit ang hybrid chips. Ang mga Transwell insert nga giandam nga independente aron i-culture ang 2D monolayers sa intestinal epithelial cells gisulod sa hybrid chip aron ma-induce ang intestinal 3D morphogenesis. Ang medium gi-perfuse pinaagi sa mga microchannels sa ilawom sa cell layer nga natukod sa Transwell insert. Scale bar, 1 cm. h Giimprinta pag-usab uban ang pagtugot gikan sa reperensya. 4. Elsevier.
Niini nga protocol, ang Caco-2 cell line ug intestinal organoids gigamit isip epithelial sources (Fig. 3a). Ang duha ka klase sa cells gi-culture nga independente (Box 2 ug Box 5) ug gigamit sa pagpugas sa ECM-coated microchannels sa on-chip gut o Transwell inserts. Kung ang mga cells mag-confluent (>95% coverage sa flasks), ang routinely cultured Caco-2 cells (taliwala sa passages 10 ug 50) sa T-flasks gi-harvest aron maandam ang dissociated cell suspensions pinaagi sa trypsinization fluid (box 2). Ang human intestinal organoids gikan sa intestinal biopsies o surgical resections gi-culture sa Matrigel scaffold domes sa 24-well plates aron suportahan ang structural microenvironment. Ang medium nga adunay essential morphogens (sama sa Wnt, R-spondin, ug Noggin) ug growth factors nga giandam sama sa gihulagway sa Box 3 gi-suplemento matag laing adlaw hangtod nga ang mga organoids motubo ngadto sa ~500 µm ang diametro. Ang hingpit nga mitubo nga mga organoids gi-harvest ug gi-dissociate ngadto sa single cells para ipugas sa gut. o mga insert sa Transwell sa usa ka chip (Kahon 5). Sama sa among gitaho kaniadto, kini mailhan sumala sa tipo sa sakit12,13 (pananglitan ulcerative colitis, Crohn's disease, colorectal cancer, o normal donor), lesion site (pananglitan, lesion batok sa non-lesioned area) ug lokasyon sa gastrointestinal sa tract (pananglitan, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, o rectum). Naghatag kami og usa ka optimized protocol sa Kahon 5 alang sa pag-culture sa colonic organoids (coloids) nga kasagaran nanginahanglan og mas taas nga konsentrasyon sa morphogens kaysa sa small intestinal organoids.
a, Workflow para sa induction sa gut morphogenesis sa gut chip. Ang Caco-2 human intestinal epithelium ug intestinal organoids gigamit niini nga protocol aron ipakita ang 3D morphogenesis. Ang isolated epithelial cells gipugas sa giandam nga gut-on-a-chip device (chip preparation). Kung ang mga cells gipugas na (gipugas na) ug gilakip (gikabit) sa PDMS porous membrane sa adlaw 0 (D0), ang apical (AP) flow gisugdan ug gipadayon sa unang 2 ka adlaw (flow, AP, D0-D2). Ang basolateral (BL) flow gisugdan usab uban sa cyclic stretching motions (stretch, flow, AP ug BL) kung ang usa ka kompleto nga 2D monolayer naporma. Ang intestinal 3D morphogenesis nahitabo nga spontaneously pagkahuman sa 5 ka adlaw nga microfluidic culture (morphogenesis, D5). Ang phase contrast images nagpakita sa representante nga morphology sa Caco-2 cells sa matag experimental step o time point (bar graph, 100 µm). Upat ka schematic diagrams nga nagpakita sa katugbang nga mga cascades sa gut morphogenesis (tuo sa ibabaw). Ang dashed Ang mga pana sa eskematiko nagrepresentar sa direksyon sa pag-agos sa pluwido.b, hulagway sa SEM nga nagpakita sa topolohiya sa ibabaw sa natukod nga 3D Caco-2 epithelium (wala).Ang inset nga nagpasiugda sa gipadako nga lugar (puti nga gisi nga kahon) nagpakita sa nabag-o nga microvilli sa 3D Caco-2 layer (tuo).c, Pinahigda nga frontal nga pagtan-aw sa natukod nga Caco-2 3D, claudin (ZO-1, pula) ug padayon nga brush border membranes nga gimarkahan og F-actin (berde) ug nuclei (asul) Immunofluorescence confocal visualization sa mga epithelial cells sa mga intestinal chips.Ang mga pana nga nagtudlo sa tunga nga eskematiko nagpakita sa lokasyon sa focal plane alang sa matag confocal nga pagtan-aw.d, Kurso sa oras sa mga pagbag-o sa morphological sa mga organoid nga gipatubo sa usa ka chip nga nakuha pinaagi sa phase contrast microscopy sa mga adlaw 3, 7, 9, 11, ug 13.Ang inset (ibabaw nga tuo) nagpakita sa taas nga pagpadako sa gihatag nga imahe.e, DIC photomicrograph sa organoid 3D epithelium nga natukod sa tinai sa hiwa nga gikuha sa adlaw 7.f, Gisapaw nga mga imahe sa immunofluorescence nga nagpakita sa mga marker alang sa mga stem cell (LGR5; magenta), goblet cells (MUC2; berde), F-actin (grey) ug nuclei (cyan) nga gipatubo sa gut chips sulod sa 3 ka adlaw, matag usa (Wala) ug 13-ka-adlaw (tunga) nga mga organoid sa epithelial layer. Tan-awa usab ang Extended Data Figure 3, nga nagpasiugda sa LGR5 signaling nga walay MUC2 signaling. Mga hulagway sa fluorescence nga nagpakita sa epithelial microstructure (tuo) sa 3D organoid epithelium nga natukod sa gut sa usa ka chip pinaagi sa pagtina sa plasma membrane gamit ang CellMask dye (tuo) sa ika-13 nga adlaw sa culture. Ang scale bar kay 50 μm gawas kon lahi ang giingon. b Gi-imprinta pag-usab uban ang pagtugot gikan sa reperensya. 2. Oxford University Press; c Gipahiangay uban ang pagtugot gikan sa Reperensya. 2. Oxford University Press; e ug f gipahiangay uban ang pagtugot pinaagi sa reperensya. 12 Ubos sa Creative Commons License CC BY 4.0.
Sa tinai sa usa ka chip, gikinahanglan nga usbon ang hydrophobic surface sa PDMS porous membrane para sa malampuson nga ECM coating. Niini nga protocol, among gigamit ang duha ka lain-laing pamaagi aron usbon ang hydrophobicity sa mga lamad sa PDMS. Para sa pag-cultivate sa mga Caco-2 cells, ang surface activation pinaagi sa UV/ozone treatment lamang igo na aron makunhuran ang hydrophobicity sa PDMS surface, i-coat ang ECM ug i-attach ang mga Caco-2 cells sa PDMS membrane. Bisan pa, ang microfluidic culture sa organoid epithelium nanginahanglan og chemical-based surface functionalization aron makab-ot ang episyente nga deposition sa mga protina sa ECM pinaagi sa sunod-sunod nga pag-apply sa polyethyleneimine (PEI) ug glutaraldehyde sa mga microchannel sa PDMS. Pagkahuman sa surface modification, ang mga protina sa ECM gideposito aron matabonan ang functionalized PDMS surface ug dayon gipaila sa isolated organoid epithelium. Human ma-attach ang mga selula, ang microfluidic cell culture magsugod pinaagi sa pag-perfusite lamang sa medium ngadto sa ibabaw nga microchannel hangtod nga ang mga selula mahimong kompleto nga monolayer, samtang ang ubos nga microchannel nagmintinar sa static nga mga kondisyon. Kini nga gi-optimize nga pamaagi para sa surface activation ug ECM coating nagtugot sa pag-attach sa organoid epithelium aron ma-induce ang 3D morphogenesis sa PDMS. nawong.
Ang mga kultura sa Transwell nanginahanglan usab og ECM coating sa dili pa ang cell seeding; bisan pa, ang mga kultura sa Transwell wala magkinahanglan og komplikado nga mga lakang sa pretreatment aron ma-activate ang nawong sa porous inserts. Alang sa pagpatubo sa mga Caco-2 cells sa mga Transwell inserts, ang ECM coating sa mga porous inserts mopadali sa pagtapot sa dissociated Caco-2 cells (<1 ka oras) ug pagporma sa tight junction barrier (<1-2 ka adlaw). Aron ma-culture ang mga organoid sa mga Transwell inserts, ang mga isolated nga organoid gipugas sa mga ECM-coated inserts, gilakip sa membrane surface (<3 ka oras) ug gimentinar hangtod nga ang mga organoid maporma og kompleto nga monolayer nga adunay barrier integrity. Ang mga kultura sa Transwell gihimo sa 24-well plates nga wala gigamit ang hybrid chips.
Ang in vitro 3D morphogenesis mahimong masugdan pinaagi sa pag-apply sa fluid flow ngadto sa basolateral aspect sa usa ka natukod nga epithelial layer. Sa tinai sa usa ka chip, ang epithelial morphogenesis nagsugod sa dihang ang medium gi-perfuse ngadto sa upper ug lower microchannels (Fig. 3a). Sama sa gihulagway kaniadto, importante ang pagpaila sa fluid flow sa inferior (basolateral) compartment para sa padayon nga pagtangtang sa directional secreted morphogen inhibitors. Aron makahatag og igong sustansya ug serum sa mga selula nga gigapos sa porous membranes ug makamugna og luminal shear stress, kasagaran among gigamit ang dual flow sa tinai sa usa ka chip. Sa hybrid chips, ang mga Transwell insert nga adunay epithelial monolayers gisulod sa hybrid chips. Dayon, ang medium gi-apply ubos sa basolateral side sa porous Transwell insert pinaagi sa microchannel. Ang intestinal morphogenesis nahitabo 3-5 ka adlaw human sa pagsugod sa basolateral flow sa duha ka culture platforms.
Ang mga morphological feature sa microengineered 3D epithelial layers mahimong analisahon pinaagi sa paggamit sa lain-laing mga imaging modalities, lakip ang phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, o immunofluorescence confocal microscopy (Mga Figure 3 ug 4). Ang phase contrast o DIC imaging dali nga mahimo bisan unsang orasa atol sa culture aron mabantayan ang porma ug protrusion sa 3D epithelial layers. Tungod sa optical transparency sa PDMS ug polyester films, ang gut-on-a-chip ug hybrid chip platforms makahatag og real-time in situ imaging nga dili kinahanglan ang sectioning o disassembly sa device. Kung maghimo og immunofluorescence imaging (Mga Figure 1, 3c, f ug 4b, c), ang mga cells kasagarang gi-fix gamit ang 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), gisundan sa Triton X-100 ug 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), sa han-ay. Depende sa klase sa cell, lain-laing mga fixative, permeabilizer, ug blocking agents ang magamit. Ang mga primary antibodies nga nagtumong sa lineage-dependent cell o Ang mga rehiyon nga marker gigamit aron i-highlight ang mga selula nga wala ma-mobilize in situ sa chip, gisundan sa mga secondary antibodies uban sa counterstain dye nga nagtumong sa nucleus (pananglitan, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) o F-actin (pananglitan, fluorescently labeled phalloidin). Ang fluorescence-based live imaging mahimo usab nga himuon in situ aron mahibal-an ang produksiyon sa mucus (Fig. 1, “Cell differentiation” ug “Gut physiology”), random colonization sa microbial cells (Fig. 1, “Host-microbe co-culture”), ang recruitment sa immune cells (Fig. 1, 'Disease Modeling') o ang mga contours sa 3D epithelial morphology (Fig. 3c,f ug 4b,c). Kung gi-modify ang gut sa chip aron ibulag ang ibabaw nga layer gikan sa ubos nga microchannel layer, sama sa gihulagway sa ref. Sama sa gipakita sa Fig. 2, ang 3D epithelial morphology ingon man ang microvilli sa apical brush border mahimong makita sa SEM (Fig. 3b). Ang ekspresyon sa differentiation Ang mga marker mahimong masusi pinaagi sa pagpahigayon og quantitative PCR5 o single-cell RNA sequencing. Niini nga kaso, ang 3D layers sa epithelial cells nga gipatubo sa gut chips o hybrid chips gi-ani pinaagi sa trypsinization ug dayon gigamit alang sa molecular o genetic analysis.
a, Workflow para sa induction sa intestinal morphogenesis sa usa ka hybrid chip. Ang Caco-2 ug intestinal organoids gigamit niini nga protocol aron ipakita ang 3D morphogenesis sa usa ka hybrid chip platform. Ang mga dissociated epithelial cells gipugas sa giandam nga Transwell inserts (TW prep; tan-awa ang figure sa ubos). Sa dihang ang mga cells gipugas na (gipugas na) ug gilakip sa polyester membranes sa Transwell inserts, ang tanan nga mga cells gi-culture ubos sa static nga mga kondisyon (TW culture). Pagkahuman sa 7 ka adlaw, usa ka Transwell insert nga adunay 2D monolayer sa epithelial cells ang gi-integrate sa usa ka hybrid chip aron ipaila ang usa ka basolateral flow (Flow, BL), nga sa katapusan misangpot sa pagmugna sa usa ka 3D epithelial layer (morphogenesis). Ang phase contrast micrographs nga nagpakita sa morphological features sa human organ epithelial cells nga nakuha gikan sa normal donor (C103 line) ascending colon sa matag experimental step o time point. Ang schematics sa ibabaw nga mga layer nagpakita sa experimental configuration para sa matag step. b, Hybrid chips (wala nga schematic) mahimong mosangpot sa 3D morphogenesis sa organoid epithelial cells nga adunay top-down confocal microscopy views nga gikuha sa lain-laing Z positions (ibabaw, tunga, ug ubos; tan-awa ang tuo nga eskematiko ug katugbang nga tuldok-tuldok nga mga linya). nagpakita sa klaro nga mga kinaiya sa morpolohiya.F-actin (cyan), nucleus (abohon).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) sa mga organoid-derived epithelial cells nga gipatubo sa static Transwell (TW; inset sulod sa puti nga dashed box) batok sa hybrid chip (pinakadako nga full shot) nga nagtandi sa 2D batok sa 3D morphology, matag usa.Ang usa ka pares sa 2D vertical cross-cut views (inset sa ibabaw nga tuo nga suok; "XZ") nagpakita usab sa 2D ug 3D nga mga bahin.Scale bar, 100 µm.c Giimprinta pag-usab uban ang pagtugot gikan sa reperensya.4. Elsevier.
Ang mga kontrol mahimong maandam pinaagi sa pag-kultura sa parehas nga mga selula (Caco-2 o mga intestinal organoid epithelial cells) ngadto sa duha ka dimensyon nga monolayers ubos sa naandan nga static nga mga kondisyon sa pag-kultura. Talalupangdon nga ang pagkunhod sa sustansya mahimong moresulta tungod sa limitado nga kapasidad sa volume sa mga microchannels (ie ~4 µL sa ibabaw nga channel sa orihinal nga disenyo sa gut-chip). Busa, ang epithelial morphology sa wala pa ug pagkahuman sa pag-apply sa basolateral flow mahimo usab nga itandi.
Ang proseso sa humok nga lithography kinahanglan nga himuon sa usa ka limpyo nga kwarto. Alang sa matag layer sa chip (ibabaw ug ubos nga mga layer ug mga lamad) ug hybrid chips, lain-laing mga photomask ang gigamit ug gihimo sa managlahing silicon wafers tungod kay managlahi ang gitas-on sa mga microchannel. Ang target nga gitas-on sa ibabaw ug ubos nga mga microchannel sa gut sa chip kay 500 µm ug 200 µm, matag usa. Ang channel target nga gitas-on sa hybrid chip kay 200 µm.
Ibutang ang 3-pulgada nga silicon wafer sa usa ka plato nga adunay acetone. Hinayhinaya nga pagtuyok ang plato sulod sa 30 segundos, dayon paugha sa hangin ang wafer. Ibalhin ang wafer ngadto sa usa ka plato nga adunay IPA, dayon patuyok ang plato sulod sa 30 segundos aron malimpyohan.
Ang solusyon sa piranha (sinagol nga hydrogen peroxide ug concentrated sulfuric acid, 1:3 (vol/vol)) mahimong gamiton aron mapadako ang pagtangtang sa mga organikong residue gikan sa ibabaw sa silicon wafer.
Ang solusyon sa Piranha grabe ka makadaot ug makamugna og kainit. Gikinahanglan ang dugang nga mga pag-amping sa kaluwasan. Alang sa paglabay sa basura, pabugnawa ang solusyon ug ibalhin sa limpyo ug uga nga sudlanan sa basura. Gamita ang ikaduhang mga sudlanan ug markahi sa husto ang mga sudlanan sa basura. Palihug sunda ang mga giya sa kaluwasan sa pasilidad alang sa mas detalyado nga mga pamaagi.
Paugaa ang mga wafer pinaagi sa pagbutang niini sa 200 °C nga hot plate sulod sa 10 ka minuto. Human sa pag-uga, ang wafer giuyog sa lima ka beses sa hangin aron mobugnaw.
Ibubo ang ~10 g nga photoresist SU-8 2100 sa tunga sa nalimpyohan nga silicon wafer. Gamita ang sipit aron ipakaylap ang photoresist nga parehas sa wafer. Usahay ibutang ang wafer sa usa ka 65°C nga hot plate aron ang photoresist dili kaayo mopilit ug mas sayon ​​ipakaylap. Ayaw ibutang ang wafer direkta sa hot plate.
Ang SU-8 parehas nga giapod-apod sa wafer pinaagi sa pagpadagan sa spin coating. I-program ang usa ka mosulod nga pagtuyok sa SU-8 sulod sa 5-10 segundos aron mokaylap sa 500 rpm sa usa ka acceleration nga 100 rpm/s. Ibutang ang main spin para sa 200 µm nga gibag-on nga patterning sa 1,500 rpm, o pagkab-ot sa 250 µm nga gibag-on (paghimo og 500 µm nga gitas-on para sa ibabaw nga layer sa gut sa chip; tan-awa ang "Mga Kritikal nga Lakang" sa ubos) nga gibutang sa usa ka acceleration nga 300 rpm/s 30 segundos sa 1,200 rpm.
Ang pangunang gikusgon sa pagtuyok mahimong i-adjust sumala sa gibag-on sa SU-8 pattern sa silicon wafer.
Aron makahimo og mga SU-8 pattern nga may gitas-on nga 500 µm para sa ibabaw nga layer sa gut sa chip, ang spin coating ug soft bake steps niini nga Box (mga lakang 7 ug 8) sunod-sunod nga gisubli (tan-awa ang lakang 9) aron makahimo og duha ka layer nga may gibag-on nga 250 µm nga SU-8, nga mahimong ipatong-patong ug sumpayon pinaagi sa UV exposure sa lakang 12 niini nga box, nga makahimo og layer nga may gitas-on nga 500 µm.
I-soft bake ang SU-8 coated wafers pinaagi sa maampingong pagbutang sa mga wafers sa hot plate sa 65 °C sulod sa 5 ka minuto, dayon ibalhin ang setting ngadto sa 95 °C ug i-incubate sulod sa dugang 40 ka minuto.
Aron makab-ot ang 500 μm nga gitas-on sa SU-8 pattern sa ibabaw nga microchannel, balika ang mga lakang 7 ug 8 aron makamugna og duha ka 250 μm nga gibag-on nga SU-8 layers.
Gamit ang UV Mask Aligner, paghimo og lamp test sumala sa instruksyon sa tiggama aron makalkulo ang exposure time sa wafer. (exposure time, ms) = (exposure dose, mJ/cm2)/(lamp power, mW/cm2).
Human sa pagtino sa oras sa pagkaladlad, ibutang ang photomask sa mask holder sa UV mask aligner ug ibutang ang photomask sa SU-8 coated wafer.
Ibutang ang giimprinta nga nawong sa photomask direkta sa kilid sa silicon wafer nga gisapinan og SU-8 aron maminusan ang UV dispersion.
Ibutyag ang SU-8 coated wafer ug photomask nga patindog ngadto sa 260 mJ/cm2 nga UV light sulod sa gitakdang oras sa pagkaladlad (tan-awa ang lakang 10 niini nga kahon).
Human sa pagkaladlad sa UV, ang mga SU-8-coated silicon wafer giluto sa 65°C sulod sa 5 ka minuto ug 95°C sulod sa 15 ka minuto sa matag hot plate aron makahimo og mga pattern nga may gitas-on nga 200 μm. Palawiga ang oras sa post-bake sa 95 °C ngadto sa 30 ka minuto aron makahimo og mga pattern nga may gitas-on nga 500 µm.
Ang developer ibubo sa usa ka bildo nga plato, ug ang giluto nga wafer ibutang sa plato. Ang gidaghanon sa SU-8 developer mahimong magkalahi depende sa gidak-on sa bildo nga plato. Siguruha nga mogamit og igo nga SU-8 developer aron hingpit nga matangtang ang wala ma-expose nga SU-8. Pananglitan, kung mogamit og 150 mm nga diametro nga bildo nga plato nga adunay 1 L nga kapasidad, gamita ang ~300 mL nga SU-8 developer. I-develop ang molde sulod sa 25 minutos nga hinayhinay nga pagtuyok usahay.
Hugasi ang naugmad nga agup-op gamit ang ~10 mL nga presko nga developer gisundan sa IPA pinaagi sa pag-spray sa solusyon gamit ang pipette.
Ibutang ang wafer sa usa ka plasma cleaner ug ibutyag sa oxygen plasma (atmospheric gas, target pressure 1 × 10−5 Torr, power 125 W) sulod sa 1.5 ka minuto.
Ibutang ang wafer sa usa ka vacuum desiccator nga adunay glass slide sa sulod. Ang mga wafer ug slide mahimong ibutang nga magkatapad. Kon ang vacuum desiccator gibahin sa daghang mga lut-od pinaagi sa usa ka plato, ibutang ang mga slide sa ubos nga lawak ug ang mga wafer sa ibabaw nga lawak. Ihulog ang 100 μL nga trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane solution sa usa ka glass slide ug i-vacuum para sa silanization.
Tunawi ang usa ka vial sa nagyelo nga Caco-2 cells sa 37°C water bath, dayon ibalhin ang natunaw nga mga cells ngadto sa usa ka T75 flask nga adunay sulod nga 15 mL sa 37°C prewarmed Caco-2 medium.
Aron mapasa ang mga Caco-2 cells sa ~90% nga confluency, una ipainit ang Caco-2 medium, PBS, ug 0.25% trypsin/1 mM EDTA sa 37°C nga water bath.
Suyopi ang medium pinaagi sa vacuum aspiration. Hugasi ang mga selula kaduha gamit ang 5 mL nga init nga PBS pinaagi sa pagsubli sa vacuum aspiration ug pagdugang og presko nga PBS.