Kea leboha ha le etetse Nature.com. Mofuta wa sebatli seo o se sebedisang o na le tshehetso e fokolang bakeng sa CSS. Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetisisa, re kgothaletsa hore o sebedise sebatli se ntjhafaditsweng (kapa o tima mokgwa wa ho tsamaisana le Internet Explorer). Ho sa le jwalo, ho netefatsa tshehetso e tswelang pele, re tla bontsha sebaka sena sa marang-rang ntle le mekgwa le JavaScript.
Mokgwa wa mala a motho o theha dibopeho tsa crypt-villus tsa 3D epithelial microarchitecture le tlhophiso ya sebaka. Sebopeho sena se ikgethang se a hlokahala ho boloka homeostasis ya mala ka ho sireletsa niche ya sele ya kutu ka hara basal crypt ho tswa ho di-antigen tsa dikokwana-hloko tsa kantle le di-metabolite tsa tsona. Ho feta moo, intestinal villi le mucus e ntšang di hlahisa disele tsa epithelial tse arohaneng ka tshebetso ka thibelo e sireletsang hodima bokahodimo ba mucosal ya mala. Ka hona, ho bopa botjha dibopeho tsa epithelial tsa 3D ho bohlokwa bakeng sa kaho ya mehlala ya mala ka vitro. Haholo-holo, mimetic gut-on-a-chip ya tlhaho e ka baka morphogenesis ya 3D e sa reroang ya epithelium ya mala ka mesebetsi e ntlafetseng ya fisioloji le biomechanics. Mona, re fana ka protocol e ka iphetaphetang ho baka morphogenesis ya mala ka matla ka hara chipu ya microfluidic hammoho le ka hara chipu ya hybrid e kentsweng ya Transwell. Re hlalosa mekgwa e qaqileng ya ho etsa sesebediswa, ho hodisa disele tsa Caco-2 kapa intestinal organoid epithelial maemong a tlwaelehileng hammoho le sethaleng sa microfluidic, ho kenya morphogenesis ya 3D, le Tlhaloso ea epithelia ea 3D e thehiloeng ho sebelisoa mekhoa e mengata ea ho nka litšoantšo. Protocol ena e fihlella tsosoloso ea microarchitecture ea mala e sebetsang ka ho laola phallo ea mokelikeli oa basolateral bakeng sa matsatsi a 5. Mokhoa oa rona oa morphogenesis oa in vitro o sebelisa khatello ea shear e amanang le 'mele le motsamao oa mechini 'me ha o hloke boenjiniere bo rarahaneng ba lisele kapa ho li laola, tse ka 'nang tsa sebetsa ho feta mekhoa e meng e seng e ntse e le teng. Re nahana hore protocol ea rona e reriloeng e ka ba le litlamorao tse pharaletseng bakeng sa sechaba sa lipatlisiso tsa bongaka, e fanang ka mokhoa oa ho tsosolosa likarolo tsa epithelial tsa mala tsa 3D in vitro bakeng sa lits'ebetso tsa bongaka, tsa bongaka le tsa meriana.
Liteko li bontša hore lisele tsa Caco-2 tsa epithelial tsa mala tse lengoang ka har'a gut-on-a-chip1,2,3,4,5 kapa bilayer microfluidic devices6,7 li ka feta morphogenesis ea 3D e sa reroang ka har'a vitro ntle le kutloisiso e hlakileng ea mokhoa o ka sehloohong. Phuputsong ea rona ea morao tjena, re fumane hore ho tlosoa ha li-antigen tsa morphogen tse nkiloeng ka basolateral ho tsoa lisebelisoa tsa setso hoa hlokahala ebile ho lekane ho baka morphogenesis ea 3D epithelial ka har'a vitro, e bontšitsoeng ke Caco-2 le li-organoids tsa mala tse tsoang ho mokuli. Lisele tsa epithelial li netefalitsoe. Thutong ena, re tsepamisitse maikutlo ka ho khetheha tlhahisong ea sele le kabong ea mahloriso ea mohanyetsi ea matla oa Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), ka har'a gut-on-a-chip le lisebelisoa tse fetotsoeng tsa microfluidic tse nang le li-insert tsa Transwell, tse bitsoang "Hybrid Chip". Re bontša hore ho eketsoa ha li-anti-Wnt tse tsoang kantle (joalo ka DKK-1, Wnt repressor 1, protheine e amanang le frizzled 1, kapa Soggy-1) ka har'a mala a on-chip ho thibela morphogenesis kapa ho sitisa lera la epithelial la 3D le hlophisitsoeng esale pele, ho fana ka maikutlo a hore khatello ea maikutlo nakong ea setso e ikarabella bakeng sa morphogenesis ea mala ka har'a vitro. Ka hona, mokhoa o sebetsang oa ho fihlela morphogenesis e matla sebopehong sa epithelial ke ho tlosa kapa ho boloka maemo a li-anti-Wnt hanyane karolong ea basolateral ka ho hlatsoetsa ka mafolofolo (mohlala, ka har'a gut-on-a-chip kapa li-hybrid-on-a-chip platforms) kapa ho hasana. Mecha ea litaba ea Basolateral (mohlala, ho tsoa ho Transwell ho kenella ka har'a matamo a maholo a basolateral ka liliba).
Protokholeng ena, re fana ka mokhoa o qaqileng oa ho etsa li-microdevices tsa mala le li-chip tse kopantsoeng tsa Transwell (mehato ea 1-5) ho holisa lisele tsa epithelial tsa mala holim'a li-membrane tse nang le masoba tse thehiloeng ho polydimethylsiloxane (PDMS) (mehato ea 6A, 7A, 8, 9) kapa li-membrane tsa polyester tsa Transwell inserts (mehato ea 6B, 7B, 8, 9) le ho hlahisa morphogenesis ea 3D in vitro (mohato oa 10). Re boetse re hlwaile likarolo tsa sele le limolek'hule tse bontšang histogenesis e ikhethileng ea lisele le phapang ea lisele tse itšetlehileng ka moloko ka ho sebelisa mekhoa e mengata ea ho nka litšoantšo (mehato ea 11-24). Re hlahisa morphogenesis re sebelisa lisele tsa epithelial tsa mala a motho, joalo ka Caco-2 kapa li-organoids tsa mala, ka mekhoa e 'meli ea setso e nang le lintlha tsa tekheniki ho kenyeletsoa phetoho ea bokaholimo ba li-membrane tse nang le masoba, ho thehoa ha li-monolayers tsa 2D, le biochemical ea mala le Tlhahiso ea biomechanical microenvironment.in vitro. Ho hlahisa morphogenesis ea 3D ho tsoa ho 2D epithelial di-monolayers, re tlositse di-moropogen antagonists ka mefuta ka bobedi e hodisitsweng ka ho phallela mokgahlelo karolong ya motheo ya setso.Qetellong, re fana ka setshwantsho sa thuso ya lera la epithelial la 3D le ka ntjhafatswang le ka sebediswang ho etsa mohlala wa kgolo ya epithelial e itshetlehileng hodima morpogen, di-co-culture tsa ho kopana ha di-microbiome tse dulang di le teng ka nako e telele, tshwaetso ya dikokwana-hloko, kotsi ya ho ruruha, ho se sebetse hantle ha thibelo ya epithelial, le diphekolo tse thehilweng hodima probiotic.ditshusumetso.
Protokhole ya rona e ka ba molemo ho bo-rasaense ba bangata ba nang le tsebo ya motheo (mohlala, baeloji ya mala, baeloji ya disele tsa kutu, le baeloji ya ntshetsopele) le dipatlisiso tse sebediswang (mohlala, diteko tsa meriana ya pele ho kliniki, mohlala wa mafu, boenjiniere ba dinama, le gastroenterology) tshusumetso e pharaletseng. Ka lebaka la ho ikatisa le ho tiya ha protokhole ya rona ho hlahisa morphogenesis ya 3D ya epithelium ya mala ka vitro, re nahana hore leano la rona la botekgeniki le ka ajwa ho bamameli ba ithutang matla a ho bontsha sele nakong ya ntshetsopele ya mala, tsosoloso kapa homeostasis. Ho phaella moo, protokhole ya rona e thusa ho botsa tshwaetso tlasa di-agent tse fapaneng tse tshwaetsanang tse kang Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 kapa Vibrio cholerae. Bamameli ba lefu lena le pathogenesis le bona ba na le thuso.Tšebeliso ea sistimi ea microphysiology ea mala e ka lumella ho holisana ha nako e telele 10 le tlhahlobo e latelang ea ts'ireletso ea moamoheli, likarabo tsa 'mele oa ho itšireletsa mafung le tokiso ea likotsi tse amanang le pathogen tseleng ea mala (GI) 11. Mathata a mang a GI a amanang le leaky gut syndrome, lefu la celiac, lefu la Crohn, ulcerative colitis, pouchitis, kapa irritable bowel syndrome a ka etsisoa ha likarolo tsa epithelial tsa mala tsa 3D li lokisoa ho sebelisoa likarolo tsa epithelial tsa mala tsa mokuli tsa 3D, mafu ana a kenyelletsa villous atrophy, crypt shortening, tšenyo ea mucosal, kapa thibelo ea epithelial e senyehileng. Biopsy kapa stem cell-derived intestinal organoids12,13.Ho etsa mohlala o motle oa ho rarahana ho hoholo ha tikoloho ea lefu lena, babali ba ka nahana ho eketsa mefuta ea lisele tse amanang le lefu, joalo ka lisele tsa mali tsa mokuli tsa peripheral blood mononuclear (PBMCs), ho mehlala e nang le li-microarchitectures tsa 3D intestinal villus-crypt. lisele tsa 'mele tse ikhethileng, 5.
Kaha sebopeho sa microepithelial sa 3D se ka lokisoa le ho bonoa ntle le ts'ebetso ea ho arola, bashebelli ba sebetsang ho transcriptomics ea sebaka le litšoantšo tse nang le qeto e phahameng kapa tse nang le qeto e phahameng ba ka 'na ba thahasella' mapa oa rona oa matla a sebaka a liphatsa tsa lefutso le liprotheine holim'a li-niches tsa epithelial. Ba nang le thahasello theknolojing. Karabelo ho li-microbial kapa li-immune stimulis. Ho feta moo, crosstalk ea longitudinal host-microbiome 10, 14 e hokahanyang homeostasis ea mala e ka thehoa lera la mucosal ea mala a 3D ka ho lema hammoho mefuta e fapaneng ea likokoana-hloko, lichaba tsa likokoana-hloko kapa microbiota ea mantle, haholo-holo ka gut-on-a-chip. sethaleng.Mokhoa ona o hohela bamameli ba ithutang immunology ea mucosal, gastroenterology, human microbiome, culturomics le clinical microbiology ba batlang ho lema microbiota ea mala e neng e sa lengoa pele laboratoring.Haeba protocol ea rona ea in vitro morphogenesis e ka fetoloa ho latela mekhoa ea setso e ka atolosoang, joalo ka li-inserts tse ngata ka har'a lipoleiti tse 24, 96 kapa 384 tsa liliba tse tlatsang likarolo tsa basolateral khafetsa, protocol e ka boela ea ajoa ho ba hlahisang liforomo tsa meriana, tsa bongaka kapa tsa tlhahlobo e phahameng kapa tsa netefatso bakeng sa indasteri ea lijo.Joaloka bopaki ba molao-motheo, re sa tsoa bontša monyetla oa sistimi ea multiplex high-throughput morphogenesis e ka atolosoang ho ea ho sebopeho sa lipoleiti tse 24.Ho phaella moo, lihlahisoa tse ngata tsa litho-on-a-chip li rekisitsoe16,17,18.Ka hona, netefatso ea mokhoa oa rona oa in vitro morphogenesis e ka potlakisoa mme mohlomong ea amoheloa ke lilaboratori tse ngata tsa lipatlisiso, indasteri kapa mmuso le mekhatlo ea taolo ho utloisisa ho hlophisoa bocha ha sele ea in vitro gut morphogenesis boemong ba transcriptomic ho leka lithethefatsi kapa Li-biotherapeutics Ho monngoa le ho tsamaisoa ha meriana ho ile ha hlahlojoa ho sebelisoa li-surrogates tsa mala a 3D kapa ho sebelisoa mehlala ea litho tse ikhethileng kapa tsa khoebo ho lekola ho ikatisa hape ha ts'ebetso ea morphogenesis ea mala.
Palo e fokolang ea mehlala ea liteko e amanang le batho e sebelisitsoe ho ithuta morphogenesis ea mala, haholo-holo ka lebaka la ho hloka mekhoa e ka kenngoang tšebetsong ho baka morphogenesis ea 3D in vitro. Ha e le hantle, boholo ba tsebo ea hona joale mabapi le morphogenesis ea mala e thehiloe lithutong tsa liphoofolo (mohlala, zebrafish20, mice21 kapa likhoho22). Leha ho le joalo, li sebetsa ka thata ebile li bitsa chelete e ngata, li ka belaelloa ka boitšoaro, 'me habohlokoa le ho feta, ha li khetholle lits'ebetso tsa nts'etsopele ea batho ka nepo. Mehlala ena e boetse e fokola haholo bokhoning ba eona ba ho lekoa ka tsela e ka atolosoang ka litsela tse ngata. Ka hona, protocol ea rona ea ho nchafatsa meaho ea lisele tsa 3D in vitro e feta mehlala ea liphoofolo ea vivo hammoho le mehlala e meng ea setso ea setso sa lisele tsa 2D tse sa fetoheng. Joalokaha ho hlalositsoe pele, ho sebelisa meaho ea epithelial ea 3D ho re lumelletse ho hlahloba sebaka sa lisele tse arohaneng ka har'a axis ea crypt-villus ho arabela litšusumetso tse fapaneng tsa mucosal kapa tsa 'mele. Mealo ea epithelial ea 3D e ka fana ka sebaka sa ho ithuta kamoo lisele tsa microbial li qothisanang lehlokoa ho theha libaka tsa sebaka le phetoho ea tikoloho ho arabela lintlha tsa moamoheli (mohlala, ka hare khahlanong le mealo ya ka ntle ya mucus, ho ntshuwa ha IgA le dipeptide tse thibelang dikokwana-hloko).Ho feta moo, sebopeho sa epithelial sa 3D se ka re dumella ho utlwisisa hore na microbiota ya mala e bopa jwang metse ya yona mme e hlahisa metabolites ya dikokwana-hloko ka kopanelo (mohlala, di-fatty acid tse kgutshwane) tse bopang mokgahlelo wa sele le di-niches tsa sele ya stem di-crypt tsa basal.Dikarolo tsena di ka bontshwa feela ha mealo ya epithelial ya 3D e thehwa ka hara vitro.
Ntle le mokhoa oa rona oa ho theha meaho ea epithelial ea mala ea 3D, ho na le mekhoa e 'maloa ea in vitro. Setso sa organoid sa mala ke mokhoa oa boenjiniere ba lisele tsa sejoale-joale o thehiloeng ho lengoeng ha lisele tsa kutu ea mala tlas'a maemo a itseng a morphogen23,24,25. Leha ho le joalo, tšebeliso ea mehlala ea organoid ea 3D bakeng sa tlhahlobo ea lipalangoang kapa litso tse kopaneng tsa microbiome hangata e thata hobane lumen ea mala e koaletsoe ka har'a organoid, ka hona, ho kenngoa ha likarolo tsa luminal joalo ka lisele tsa microbial kapa li-antigen tsa kantle ho naha ho lekanyelitsoe. Phihlello ea li-lumens tsa organoid e ka ntlafatsoa ho sebelisoa microinjector,26,27 empa mokhoa ona oa kenella ebile o hloka mosebetsi o mongata 'me o hloka tsebo e khethehileng ho e etsa. Ho feta moo, litso tsa organoid tsa setso tse bolokiloeng ka har'a li-scaffolds tsa hydrogel tlas'a maemo a sa fetoheng ha li bonts'e ka nepo biomechanics e sebetsang ea in vivo.
Mekhoa e meng e sebelisoang ke lihlopha tse 'maloa tsa lipatlisiso e sebelisa li-scaffolds tsa 3D hydrogel tse hlophisitsoeng esale pele ho etsisa sebopeho sa epithelial ea mala ka ho holisa lisele tse arohaneng tsa mala a motho holim'a gel. Etsa li-scaffolds tsa hydrogel u sebelisa hlobo e hatisitsoeng ka 3D, e sililoeng ka micro-milled, kapa e entsoeng ka lithographically. Mokhoa ona o bontša tokisetso e hlophisitsoeng ea lisele tse arohaneng tsa epithelial ka vitro tse nang le li-gradients tsa morphogen tse amanang le 'mele, ho theha sebopeho sa epithelial se nang le tekanyo e phahameng le crosstalk ea stroma-epithelial ka ho kenyelletsa lisele tsa stromal ka har'a scaffold. Leha ho le joalo, mofuta oa li-scaffolds tse hlophisitsoeng esale pele o ka thibela ponts'o ea ts'ebetso ea morphogenetic e sa reroang ka boeona. Mefuta ena ha e fane ka phallo e matla ea luminal kapa ea interstitial, e haelloang ke khatello ea shear ea mokelikeli eo lisele tsa mala li e hlokang ho feta morphogenesis le ho fumana ts'ebetso ea 'mele. Phuputso e 'ngoe ea morao tjena e sebelisitse li-scaffolds tsa hydrogel sethaleng sa microfluidic le meaho ea epithelial ea mala e nang le paterone e sebelisang mekhoa ea laser-etching. Li-organoids tsa mala a toeba li latela mekhoa e betliloeng ho theha meaho ea tubula ea mala, 'me phallo ea mokelikeli oa intraluminal e ka e ka qapuoa hape ka ho sebedisa mojule wa microfluidics.Leha ho le jwalo, mohlala ona ha o bontshe ditsamaiso tsa morphogenetic tse sa reroang ebile ha o kenyelle metsamao ya mechanobiological ya mala.Mekgwa ya ho hatisa ya 3D ho tswa sehlopheng se le seng e ile ya kgona ho theha diphaephe tse nyane tsa mala ka ditsamaiso tsa morphogenetic tse sa reroang.Leha ho na le tlhahiso e rarahaneng ya dikarolo tse fapaneng tsa mala ka hara phaephe, mohlala ona o boetse o haelloa ke phallo ya mokelikeli wa luminal le phetoho ya mechine.Ho feta moo, tshebetso ya mohlala e ka nna ya fokotseha, haholoholo kamora hore tshebetso ya bioprinting e phethehe, e sitisa maemo a teko kapa dikamano tsa sele ho sele.Ho e-na le hoo, protocol ya rona e sisintsweng e fana ka morphogenesis ya mala e sa reroang, kgatello ya ho shear e amanang le mmele, biomechanics e etsisang motility ya mala, phihlello ya dikarolwana tse ikemetseng tsa apical le tsa basolateral, le ho bopa botjha tikoloho e rarahaneng ya di-microenvironments tsa baeloji tsa modularity.Ka hona, protocol ya rona ya morphogenesis ya in vitro ya 3D e ka fana ka mokhoa o tlatsetsang ho hlola diphephetso tsa mekgwa e seng e ntse e le teng.
Protocol ea rona e shebane ka botlalo le morphogenesis ea 3D epithelial, ka lisele tsa epithelial feela tse teng setsong 'me ha ho na mefuta e meng ea lisele tse potolohileng joalo ka lisele tsa mesenchymal, lisele tsa endothelial, le lisele tsa' mele. Joalokaha ho hlalositsoe pele, motheo oa protocol ea rona ke ho kenngoa ha morphogenesis ea epithelial ka ho tlosa li-morfogen inhibitors tse nkiloeng ka lehlakoreng la basolateral la sebaka se kentsoeng. Leha modularity e matla ea gut-on-a-chip ea rona le hybrid-on-a-chip e re lumella ho bopa bocha lera la 3D epithelial le sarollang, mathata a mang a baeloji joalo ka likamano tsa epithelial-mesenchymal33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 le, mohlaleng oa rona, likarolo tsa crypt-villus tse fetisang li-niches tsa sele ea stem ka har'a li-crypt tsa basal li ntse li lokela ho nahanoa ka ho eketsehileng. Lisele tsa stromal (mohlala, fibroblasts) ka har'a mesenchyme li bapala karolo ea bohlokoa tlhahisong ea liprotheine tsa ECM le taolo ea morphogenesis ea mala ka har'a vivo35,37,38. Ho eketsoa ha lisele tsa mesenchymal ho mohlala oa rona ho ntlafalitse ts'ebetso ea morphogenetic le katleho ea ho hokela sele. Lera la endothelial (ke hore, li-capillaries kapa li-lymphatic) le bapala karolo ea bohlokoa ho laoleng lipalangoang tsa limolek'hule39 le ho hiroa ha lisele tsa 'mele40 tikolohong e nyane ea mala. Ho feta moo, likarolo tsa methapo ea mali tse ka hokahanngoang pakeng tsa mehlala ea lisele ke tsa bohlokoa ha mehlala ea lisele e etselitsoe ho bontša likamano tsa litho tse ngata. Ka hona, lisele tsa endothelial li ka 'na tsa hloka ho kenyelletsoa ho etsa mohlala oa likarolo tse nepahetseng tsa 'mele ka qeto ea boemo ba litho. Lisele tsa 'mele tse tsoang ho mokuli le tsona lia hlokahala bakeng sa ho bontša likarabo tsa 'mele tse tsoang ho' mele, tlhahiso ea antigen, puisano ea 'mele e ikamahanyang le maemo, le tšireletso ea 'mele e ikhethileng ea lisele maemong a ho etsisa lefu la mala.
Tšebeliso ea li-chips tse tsoakiloeng e bonolo ho feta gut-on-a-chip hobane ho hlophisoa ha sesebelisoa ho bonolo 'me tšebeliso ea li-insert tsa Transwell e lumella ho holisa epithelium ea mala. Leha ho le joalo, li-insert tsa Transwell tse fumanehang khoebong tse nang le lera la polyester ha li tenyetsehe 'me li ke ke tsa etsisa metsamao e kang ea peristaltic. Ho feta moo, karolo ea apical ea Transwell e kentsoeng ka har'a chip e tsoakiloeng e ile ea lula e eme ntle le khatello ea shear lehlakoreng la apical. Ho hlakile hore thepa e sa fetoheng karolong ea apical ha se hangata e lumellang ho holisa baktheria nako e telele ka har'a li-chips tse tsoakiloeng. Le ha re ka baka morphogenesis ea 3D ka matla ho li-insert tsa Transwell ha re sebelisa li-chips tse tsoakiloeng, khaello ea biomechanics e amanang le 'mele le phallo ea mokelikeli oa apical e ka fokotsa ho khoneha ha li-platform tsa hybrid chip bakeng sa lits'ebetso tse ka bang teng.
Ho tsosolosoa ka botlalo ha axis ea crypt-villus ea motho ka har'a litso tsa gut-on-a-chip le hybrid-on-a-chip ha ho so thehoe ka botlalo. Kaha morphogenesis e qala ho tloha ho monolayer ea epithelial, meralo e menyenyane ea 3D ha e fane ka ho tšoana ha sebopeho le li-crypts in vivo. Le hoja re tšoaile palo ea lisele tse atang haufi le sebaka sa basal crypt ho epithelium ea microengineered ea 3D, libaka tsa crypt le villous li ne li sa aroloa ka ho hlaka. Le hoja likanale tse phahameng tse holimo ho chip li lebisa bophahamong bo eketsehileng ba epithelium e microengineered, bophahamo bo boholo bo ntse bo lekanyelitsoe ho ~300–400 µm. Botebo ba 'nete ba li-crypts tsa mala a motho ka har'a mala a manyenyane le a maholo ke ~135 µm le ~400 µm, ka ho latellana, 'me bophahamo ba villi e nyane ea mala ke ~600 µm41.
Ho ya ka pono ya ditshwantsho, ditshwantsho tse nang le qeto e phahameng ya di-microarchitecture tsa 3D sebakeng seo di ka lekanyetswa mala a ka hara chip, kaha sebaka se hlokahalang sa ho sebetsa ho tloha lenseng ya sepheo ho ya lera la epithelial se ka ba dimilimithara tse mmalwa. Ho hlola bothata bona, sepheo se hole se ka hlokahala. Ho feta moo, ho etsa dikarolo tse tshesane bakeng sa ho lokisa disampole tsa ditshwantsho ho thata ka lebaka la ho tenyetseha ho hoholo ha PDMS. Ho feta moo, kaha ho etswa ha masela a manyane a mala a ka hara chip ho kenyelletsa ho kgomarela ho sa feleng pakeng tsa lera ka leng, ho thata haholo ho bula kapa ho tlosa lera le ka hodimo ho hlahloba sebopeho sa bokahodimo ba lera la epithelial. Mohlala, ka ho sebedisa microscope ya electron ya scanning (SEM).
Ho se rate metsi ha PDMS e bile ntlha e sitisang lithuto tse thehiloeng ho microfluidic tse sebetsanang le limolek'hule tse nyane tse sa rateng metsi, kaha PDMS e ka monya limolek'hule tse joalo tse sa rateng metsi ka ho khetheha. Mekhoa e meng ea PDMS e ka nahanoa ka thepa e meng ea polymeric. Ka lehlakoreng le leng, phetoho ea bokaholimo ba PDMS (mohlala, ho koahela ka thepa ea lipophilic 42 kapa poly(ethylene glycol) 43) e ka nkoa e le ho fokotsa ho monya ha limolek'hule tse sa rateng metsi.
Qetellong, mokhoa oa rona ha o so hlalosoe hantle mabapi le ho fana ka tlhahlobo e phahameng ea ho sebelisa kapa sethala sa liteko se bonolo ho se sebelisa sa "boholo bo le bong bo lekanang bohle". Protocol ea hajoale e hloka pompo ea syringe ka sesebelisoa se senyenyane, se nkang sebaka ka har'a incubator ea CO2 mme se thibela liteko tse kholo. Moeli ona o ka ntlafatsoa haholo ke ho hola ha liforomo tsa setso tse ncha (mohlala, li-inserts tse nang le masoba a 24, 96, kapa 384 tse lumellang ho tlatsa hape le ho tlosa mecha ea litaba ea basolateral ka ho tsoelang pele).
Ho hlahisa morphogenesis ea 3D ea epithelium ea mala a motho ka har'a vitro, re sebelisitse sesebelisoa sa mala sa microfluidic chip se nang le li-microchannel tse peli tse bapileng le lera le nang le masoba a elastic lipakeng ho theha sebopeho sa lumen-capillary. Re boetse re bontša ts'ebeliso ea sesebelisoa sa microfluidic sa kanale e le 'ngoe (chip e kopantsoeng) se fanang ka phallo e tsoelang pele ea basolateral tlas'a likarolo tsa epithelial tse nang le polarized tse holisitsoeng ho Transwell inserts. Li-platformeng ka bobeli, morphogenesis ea lisele tse fapaneng tsa epithelial tsa mala a motho e ka bontšoa ka ho sebelisa taolo ea tataiso ea phallo ho tlosa li-antigen tsa morphogen karolong ea basolateral. Ts'ebetso eohle ea liteko (Setšoantšo sa 1) e na le likarolo tse hlano: (i) microfabrication ea chip ea mala kapa chip ea Transwell e ka kenngoang (mehato ea 1-5; Lebokose la 1), (ii) ho lokisoa ha lisele tsa epithelial tsa mala (lisele tsa Caco-2) kapa li-organoids tsa mala a motho; mabokose a 2-5), (iii) setso sa lisele tsa epithelial tsa mala holim'a li-chips tsa mala kapa li-chips tse tsoakiloeng (mehato ea 6-9), (iv) ho kenngoa ha morphogenesis ea 3D in vitro (mohato oa 10) le (v) ) ho hlalosa sebopeho sa microstructure sa 3D epithelial (mehato ea 11-24). Qetellong, sehlopha se loketseng sa taolo (se tšohloang ka tlase) se entsoe ho netefatsa katleho ea morphogenesis ea in vitro ka ho bapisa morphogenesis ea epithelial le taolo ea sebaka, ea nako, ea maemo, kapa ea ts'ebetso.
Re sebelisitse liforomo tse peli tse fapaneng tsa setso: gut-on-a-chip e nang le likanale tse otlolohileng kapa likanale tse sa kopanngoeng, kapa li-chip tse kopantsoeng tse nang le li-insert tsa Transwell (TW) sesebelisoa sa microfluidic, tse entsoeng joalo ka ha ho hlalositsoe Lebokoseng la 1, le mohato oa 1 -5. "Thepa ea Sesebelisoa" e bontša mehato ea mantlha ea ho etsa chip e le 'ngoe kapa chip e kopantsoeng. "Setso sa Lisele tsa Epithelial tsa Mala a Motho" se hlalosa mohloli oa sele (Caco-2 kapa li-organoids tsa mala a motho) le mokhoa oa setso o sebelisitsoeng protocol ena. "In vitro morphogenesis" e bontša mehato e akaretsang eo lisele tsa epithelial tse tsoang ho Caco-2 kapa tse tsoang ho organoid li lengoang ho chip ea mala kapa ho li-insert tsa Transwell tsa chip e kopantsoeng, e lateloang ke ho kenngoa ha morphogenesis ea 3D le ho thehoa ha sebopeho se ikhethileng sa epithelial. Nomoro ea mohato oa lenaneo kapa nomoro ea lebokose e bontšoa ka tlase ho motsu o mong le o mong. Ts'ebeliso e fana ka mehlala ea hore na mekhahlelo ea epithelial ea mala e thehiloeng e ka sebelisoa joang, mohlala, ho khethollo ea lisele, lithuto tsa fisioloji ea mala, ho thehoa ha tikoloho ea microbiome ea moamoheli, le lefu. ho etsa mohlala. Litšoantšo tsa immunofluorescence ho "Cell Differentiation" tse bonts'ang nuclei, F-actin le MUC2 tse hlahisitsoeng lera la 3D Caco-2 epithelial le hlahisitsoeng holim'a chipu ea mala. Letšoao la MUC2 le teng liseleng tsa goblet le mucus e ntšoang holim'a mucosal. Litšoantšo tsa fluorescent ho Gut Physiology li bonts'a mucus e hlahisoang ke ho daea sialic acid le masala a N-acetylglucosamine ho sebelisoa fluorescent wheat germ agglutinin. Litšoantšo tse peli tse tšoanang ho "Host-Microbe Co-Cultures" li bonts'a li-co-cultures tsa moamoheli-microbiome tse emelang mala ka har'a chip. Phanele e ka letsohong le letšehali e bonts'a co-culture ea E. coli e hlahisang protheine e tala ea fluorescent (GFP) ka lisele tsa epithelial tsa 3D Caco-2 tse entsoeng ka microengineered. Phanele e ka letsohong le letona e bonts'a sebaka sa GFP E. coli e lengoang hammoho le lisele tsa epithelial tsa 3D Caco-2, e lateloa ke immunofluorescence staining ka F-actin (e khubelu) le nuclei (e putsoa). Ho etsa mohlala oa lefu ho bontša mala a phetseng hantle khahlanong le a lutlang ka maleng Li-chips tsa ho ruruha tlas'a phephetso ea 'mele ka li-antigen tsa baktheria (mohlala, lipopolysaccharide, LPS) le lisele tsa 'mele tsa ho itšireletsa mafung (mohlala, PBMC; e tala). Lisele tsa Caco-2 li ile tsa lengoa ho theha lera la epithelial la 3D. Sekala sa tekanyo, 50 µm. Litšoantšo moleng o ka tlase: "Phapang ea lisele" e fetotsoe ka tumello ho tsoa ho referense.2. Oxford University Press; E hlahisitsoe hape ka tumello ho tsoa ho Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" e fetotsoe ka tumello ho tsoa ho referense.3. NAS; "Mohlala oa Mafu" e fetotsoe ka tumello ho tsoa ho referense.5. NAS.
Li-chip tsa gut-on-chip le tsa hybrid ka bobeli li entsoe ka ho sebelisa likopi tsa PDMS tse ileng tsa tlosoa liforomong tsa silicon ka lithography e bonolo1,44 'me tsa etsoa ka SU-8. Moralo oa li-microchannel ka har'a chip ka 'ngoe o khethoa ka ho nahana ka hydrodynamics joalo ka khatello ea shear le khatello ea hydrodynamic1,4,12. Moralo oa pele oa gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1a), o neng o e-na le li-microchannel tse peli tse otlolohileng tse kopaneng, o fetohile gut-on-a-chip e rarahaneng (Extended Data Fig. 1b) e kenyeletsang para ea li-microchannel tse kobehileng ho susumetsa Nako e eketsehileng ea bolulo ba mokelikeli, mekhoa ea phallo e seng ea linear, le phetoho ea multiaxial ea lisele tse lengoang (Setšoantšo sa 2a–f) 12. Ha biomechanics e rarahaneng haholoanyane ea mala e hloka ho etsoa bocha, li-gut-on-a-chips tse rarahaneng li ka khethoa. Re bontšitse hore Gut-Chip e kobehileng e boetse e susumetsa ka matla morphogenesis ea 3D ka nako e ts'oanang ka tekanyo e ts'oanang ea kholo ea epithelial ha e bapisoa le ea pele. Gut-Chip, ho sa tsotelehe mofuta oa sele e holisitsoeng. Ka hona, ho susumetsa morphogenesis ea 3D, meralo ea mala e otlolohileng le e rarahaneng ea on-chip lia fapanyetsana. Likopi tsa PDMS tse phekotsoeng holim'a liforomo tsa silicon ka lipaterone tsa SU-8 li fane ka litšobotsi tse mpe kamora ho tlosoa (Setšoantšo sa 2a). Ho etsa mala holim'a chip, lera le holimo la PDMS le lokisitsoeng le ile la hokahanngoa ka tatellano ho filimi ea PDMS e nang le masoba ebe le hokahanngoa le lera le ka tlase la PDMS ka ho hokahanngoa ho sa fetoheng ho sebelisoa sesebelisoa sa corona (Setšoantšo sa 2b-f). Ho etsa li-chips tse kopantsoeng, likopi tsa PDMS tse phekotsoeng li ile tsa hokahanngoa le li-slide tsa khalase ho etsa lisebelisoa tsa microfluidic tsa kanale e le 'ngoe tse ka amohelang li-inserts tsa Transwell (Setšoantšo sa 2h le Setšoantšo sa Lintlha tse Atolositsoeng sa 2). Ts'ebetso ea ho hokahanngoa e etsoa ka ho phekola bokaholimo ba kopi ea PDMS le khalase ka plasma ea oksijene kapa kalafo ea corona. Kamora ho sterilization ea sesebelisoa se entsoeng ka microfabricated se khomaretsoeng tube ea silicone, setaele sa sesebelisoa se ne se loketse ho etsa morphogenesis ea 3D ea epithelium ea mala (Setšoantšo sa 2g).
a, Setšoantšo sa moralo oa ho lokisa likarolo tsa PDMS ho tsoa mefuteng ea silicon e nang le paterone ea SU-8. Tharollo ea PDMS e sa phekoloang e tšetsoe holim'a hlobo ea silicon (ka letsohong le letšehali), ea folisoa mochesong oa 60 °C (bohareng) 'me ea tlosoa (ka ho le letona). PDMS e tlositsoeng e ile ea khaoloa likotoana 'me ea hloekisoa bakeng sa tšebeliso e eketsehileng.b, Setšoantšo sa hlobo ea silicon e sebelisitsoeng ho lokisa lera le ka holimo la PDMS.c, Setšoantšo sa hlobo ea silicon e sebelisetsoang ho etsa lera le nang le masoba la PDMS.d, Letoto la lifoto tsa likarolo tse ka holimo le tse ka tlase tsa PDMS le sesebelisoa sa mala se kopantsoeng ka har'a chip.e., Sebopeho sa ho hokahanya likarolo tse ka holimo, lera le tse ka tlase tsa PDMS. Lera ka leng le hokahanngoa ka mokhoa o ke keng oa fetoloa ke kalafo ea plasma kapa corona.f, Sebopeho sa sesebelisoa se entsoeng ka gut-on-a-chip se nang le li-microchannel tse kopantsoeng tse kentsoeng le likamore tsa vacuum.g, Ho hlophisoa ha gut-on-a-chip bakeng sa setso sa sele ea microfluidic. Mala a entsoeng ka chip a kopantsoeng ka tube ea silicone le syringe a ile a beoa holim'a sekoahelo. Sesebelisoa sa chip se ile sa beoa sekoahelong sa Sejana sa Petri sa 150 mm bakeng sa ho sebetsoa. Sehokelo se sebelisetsoa ho koala tube ea silicone.h, Litšoantšo tse bonahalang tsa tlhahiso ea chip e kopantsoeng le morphogenesis ea 3D ho sebelisoa li-chip tse kopantsoeng. Li-insert tsa Transwell tse lokisitsoeng ka boikemelo ho ea setsong. Li-monolayers tsa 2D tsa lisele tsa epithelial tsa mala li kentsoe ka har'a chip e kopantsoeng ho hlahisa morphogenesis ea 3D ea mala. Sejo se tšeloa ka har'a likanale tse nyane ka tlas'a lera la sele le thehiloeng ho Transwell insert. Sekala sa bareng, 1 cm.h E hatisitsoe hape ka tumello ho tsoa ho referense.4. Elsevier.
Mokgweng ona, mola wa sele ya Caco-2 le di-organoid tsa mala di sebedisitswe e le mehlodi ya epithelial (Setshwantsho sa 3a). Mefuta ka bobedi ya disele e ile ya hodiswa ka boikemelo (Lebokose la 2 le Lebokose la 5) mme ya sebediswa ho jala di-microchannel tse kwahetsweng ke ECM tsa on-chip gut kapa di-inserts tsa Transwell. Ha disele di kopane (>95% ya sekwahelo ka hara diflask), disele tsa Caco-2 tse hodisitsweng ka mehla (pakeng tsa diphaseje tsa 10 le 50) ka hara di-T-flask di kotulwa ho lokisa di-suspension tsa disele tse arohaneng ka mokelikeli wa trypsinization (lebokose la 2). Di-organoid tsa mala a batho tse tswang ho di-biopsies tsa mala kapa di-resection tsa opereishene di ile tsa hodiswa ka hara di-domes tsa Matrigel scaffold ka dipoleiting tsa di-well 24 ho tshehetsa tikoloho e nyane ya sebopeho. Di-morphogen tse mahareng tse nang le di-essential (tse kang Wnt, R-spondin, le Noggin) mme dintho tsa kgolo tse lokisitsweng jwalo ka ha ho hlalositswe Lebokoseng la 3 di ne di tlatselletswa letsatsi le leng le le leng ho fihlela di-organoid di hola ho fihlela ho ~500 µm ka bophara. Di-organoid tse hodisitsweng ka botlalo di a kotulwa mme e arohaneng hore e be lisele tse le 'ngoe bakeng sa ho mela mala kapa Transwell inserts holim'a chip (Lebokose la 5). Joalokaha re tlalehile pejana, e ka aroloa ho latela mofuta oa lefu12,13 (mohlala, ulcerative colitis, lefu la Crohn, kankere ea mala a maholo, kapa mofani ea tloaelehileng), sebaka sa leqeba (mohlala, leqeba khahlanong le sebaka se sa nang le leqeba) le sebaka sa mala ka har'a pampitšana (mohlala, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, kapa rectum). Re fana ka protocol e ntlafalitsoeng Lebokoseng la 5 bakeng sa ho holisa li-organoids tsa colonic (coloids) tseo hangata li hlokang maemo a holimo a morphogens ho feta li-organoids tse nyane tsa mala.
a, Mokgwa wa ho sebetsa bakeng sa ho kenya sebopeho sa mala ka hara chipu ya mala. Epithelium ya mala a motho ya Caco-2 le di-organoids tsa mala di sebediswa protocoleng ena ho bontsha sebopeho sa 3D. Disele tsa epithelial tse arohaneng di ile tsa jalwa ka hara sesebediswa se lokisitsweng sa mala-ho-chipu (ho lokisa chipu). Hang ha disele di jalwa (di jalwa) mme di kgomaretswe (di kgomaretswe) ho lera la masoba la PDMS ka letsatsi la 0 (D0), phallo ya apical (AP) e qalwa mme e bolokwa matsatsi a 2 a pele (phallo, AP, D0-D2). Phallo ya basolateral (BL) le yona e qalwa hammoho le metsamao ya ho otlolla ka potoloho (ho otlolla, phallo, AP le BL) ha ho thehwa monolayer e felletseng ya 2D. Mokgwa wa mala wa 3D o etsahetse ka boiketsetso kamora matsatsi a 5 a setso sa microfluidic (morphogenesis, D5). Ditshwantsho tsa phapang ya mekhahlelo di bontsha sebopeho se emetseng sa disele tsa Caco-2 mohatong o mong le o mong wa teko kapa nako (grafe ya bare, 100 µm). Ditshwantsho tse nne tsa schematic tse bontshang di-cascades tse tsamaellanang ea mofetoho oa mala (holimo ka ho le letona). Metsu e tabotsoeng ka har'a schematic e emela tataiso ea phallo ea mokelikeli.b, setšoantšo sa SEM se bonts'a topology ea bokaholimo ba epithelium ea 3D Caco-2 e thehiloeng (ka letsohong le letšehali). Setšoantšo se ka hare se totobatsang sebaka se holisitsoeng (lebokose le lesoeu le nang le dash) se bonts'a microvilli e tsosolositsoeng lera la 3D Caco-2 (ka ho le letona).c, Pono e otlolohileng ea Caco-2 3D e thehiloeng, claudin (ZO-1, e khubelu) le li-membrane tse tsoelang pele tsa moedi oa borashe tse ngotsoeng F-actin (e tala) le nuclei (e putsoa) Pono ea immunofluorescence confocal ea lisele tsa epithelial holim'a li-chips tsa mala. Metsu e supang schematic e bohareng e bontša sebaka sa focal plane bakeng sa pono e 'ngoe le e 'ngoe ea confocal.d, Nako ea liphetoho tsa morphological ho li-organoids tse lengoang ho chip e fumanoeng ka microscopy ea phase contrast matsatsing a 3, 7, 9, 11, le 13. Setšoantšo se ka hare (ka ho le letona ka holimo) se bontša kholo e phahameng ea setšoantšo se fanoeng.e, DIC photomicrograph ea organoid 3D epithelium e thehiloeng ka mpeng ka selae se nkiloeng letsatsing la 7.f, Litšoantšo tse koahetsoeng tsa immunofluorescence tse bontšang matšoao a lisele tsa stem (LGR5; magenta), lisele tsa goblet (MUC2; tse tala), F-actin (e putsoa) le nuclei (cyan) tse holisitsoeng holim'a li-chips tsa mala ka matsatsi a 3, ka ho latellana (Ka letsohong le letšehali) le li-organoid tsa matsatsi a 13 (tse bohareng) holim'a lera la epithelial.Sheba hape Setšoantšo sa 3 sa Lintlha tse Ekelitsoeng, se totobatsang matšoao a LGR5 ntle le ho bontša MUC2. Litšoantšo tsa khanya tse bontšang sebopeho sa epithelial microstructure (ka ho le letona) sa epithelium ea organoid ea 3D e thehiloeng ka mpeng holim'a chip ka ho silafatsa lera la plasma ka dae ea CellMask (ka ho le letona) letsatsing la 13 la setso. Sekala sa tekanyo ke 50 μm ntle le haeba ho boletsoe ka tsela e 'ngoe.b E hatisitsoe hape ka tumello ho tsoa ho referense.2. Oxford University Press; c E fetotsoe ka tumello ho tsoa ho Referense.2. Oxford University Press; e le f e fetotsoe ka tumello ho tsoa ho referense.12 Tlas'a Creative Commons License CC BY 4.0.
Ka mpeng ho chip, ho hlokahala ho fetola bokaholimo ba hydrophobic ba lera la PDMS le nang le masoba bakeng sa ho roala ka katleho ha ECM. Protokholeng ena, re sebelisa mekhoa e 'meli e fapaneng ho fetola hydrophobic ea lera la PDMS. Bakeng sa ho holisa lisele tsa Caco-2, ho kenya tšebetsong bokaholimo ka kalafo ea UV/ozone feela ho ne ho lekane ho fokotsa hydrophobic ea bokaholimo ba PDMS, ho koahela ECM le ho hokela lisele tsa Caco-2 lera la PDMS. Leha ho le joalo, setso sa microfluidic sa epithelium ea organoid se hloka ts'ebetso ea bokaholimo e thehiloeng lik'hemik'hale ho fihlela ho kenngoa hantle ha liprotheine tsa ECM ka ho sebelisa polyethyleneimine (PEI) le glutaraldehyde ka tatellano ho li-microchannel tsa PDMS. Kamora ho fetoloa ha bokaholimo, liprotheine tsa ECM li ile tsa beoa ho koahela bokaholimo ba PDMS bo sebetsang ebe li kenngoa ka har'a epithelium ea organoid e arohaneng. Kamora hore lisele li hokeloe, setso sa sele ea microfluidic se qala ka ho ntša feela medium ka har'a microchannel e kaholimo ho fihlela lisele li theha monolayer e felletseng, ha microchannel e ka tlase e boloka maemo a sa fetoheng. Mokhoa ona o ntlafalitsoeng oa ho kenya tšebetsong bokaholimo le ho roala ha ECM ho nolofalletsa ho hokela organoid. epithelium ho hlahisa morphogenesis ea 3D holim'a bokaholimo ba PDMS.
Dikokwanyana tsa Transwell le tsona di hloka ho kwahelwa ha ECM pele ho ho bewa ha sele; leha ho le jwalo, dikokwanyana tsa Transwell ha di hloke mehato e rarahaneng ya pele ho kalafo ho kenya tshebetsong bokahodimo ba dikokwanyana tse nang le masoba. Bakeng sa ho hodisa disele tsa Caco-2 hodima dikokwanyana tsa Transwell, kokwanyana ya ECM hodima dikokwanyana tse nang le masoba e potlakisa ho hokellwa ha disele tsa Caco-2 tse arohaneng (
Litšobotsi tsa sebopeho sa mekhahlelo ea 3D epithelial e entsoeng ka microengineered li ka hlahlojoa ka ho sebelisa mekhoa e fapaneng ea ho nka litšoantšo, ho kenyeletsoa le microscopy ea phase contrast, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, kapa immunofluorescence confocal microscopy (Litšoantšo tsa 3 le tsa 4). Phase contrast kapa DIC imaging li ka etsoa habonolo neng kapa neng nakong ea temo ho lekola sebopeho le ho hlahella ha mekhahlelo ea 3D epithelial. Ka lebaka la ho pepeseha ha optical ha PDMS le lifilimi tsa polyester, li-platform tsa gut-on-a-chip le hybrid chip li ka fana ka nako ea sebele ea ho nka litšoantšo tsa in situ ntle le tlhoko ea ho arola kapa ho qhaqha sesebelisoa. Ha ho etsoa setšoantšo sa immunofluorescence (Litšoantšo tsa 1, 3c, f le 4b, c), lisele hangata li tsitsitse ka 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), e lateloa ke Triton X-100 le 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), ka tatellano. Ho latela mofuta oa sele, li-fixative tse fapaneng, Li-permeabilizer, le li-blocker agent li ka sebelisoa. Li-antibodies tsa mantlha tse shebaneng le lisele tse itšetlehileng ka leloko kapa matšoao a sebaka li sebelisoa ho totobatsa lisele tse sa sisinyeheng sebakeng se itseng holim'a chip, li lateloa ke li-antibodies tsa bobeli hammoho le dae ea counterstain e shebaneng le nucleus (mohlala, 4′, 6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) kapa F-actin (mohlala, phalloidin e ngotsoeng ka fluorescent). Litšoantšo tse phelang tse thehiloeng ho fluorescence li ka boela tsa etsoa sebakeng se itseng ho lemoha tlhahiso ea mucus (Setšoantšo sa 1, "Phapang ea sele" le "Fioloji ea mala"), ho koloneloa ha lisele tsa microbial ka mokhoa o sa reroang (Setšoantšo sa 1, "Setso sa Host-microbe"), ho hiroa ha lisele tsa 'mele (Setšoantšo sa 1, 'Mohlala oa Mafu') kapa libopeho tsa sebopeho sa epithelial sa 3D (Setšoantšo sa 3c, f le 4b, c). Ha ho fetoloa mala holim'a chip ho arola lera le ka holimo ho lera le ka tlase la microchannel, joalo ka ha ho hlalositsoe ho ref.Joalokaha ho bontšitsoe ho Setšoantšo sa 2, epithelial ea 3D Sebopeho hammoho le microvilli moeling oa borashe ba apical li ka bonoa ka SEM (Setšoantšo sa 3b). Pontšo ea matšoao a phapang e ka hlahlojoa ka ho etsa PCR5 ea bongata kapa tatellano ea RNA ea sele e le 'ngoe. Tabeng ena, mekhahlelo ea 3D ea lisele tsa epithelial tse holisitsoeng ka har'a li-chips tsa mala kapa li-chips tse kopantsoeng li kotuloa ka trypsinization ebe li sebelisoa bakeng sa tlhahlobo ea limolek'hule kapa ea liphatsa tsa lefutso.
a, Mokgwa wa ho kenya tshebetsong ha morphogenesis ya mala ka hara chip e kopantsweng. Caco-2 le di-organoids tsa mala di sebediswa protocol ena ho bontsha morphogenesis ya 3D sethaleng sa chip e kopantsweng. Disele tsa epithelial tse arohaneng di ile tsa jalwa ka di-inserts tse lokisitsweng tsa Transwell (TW prep; bona setshwantsho se ka tlase). Hang ha disele di jalwa (di jalwa) mme di kgomaretswe lera la polyester ka hara di-inserts tsa Transwell, disele tsohle di ile tsa jalwa tlasa maemo a sa fetoheng (TW culture). Kamora matsatsi a 7, insert e le nngwe ya Transwell e nang le monolayer ya 2D ya disele tsa epithelial e ile ya kopanngwa ka hara chip e kopantsweng ho hlahisa phallo ya basolateral (Flow, BL), e ileng ya qetella e lebisitse tlhahisong ya lera la epithelial la 3D (morphogenesis). Di-micrograph tsa phapang ya mokgahlelo tse bontshang dikarolo tsa morphological tsa disele tsa epithelial tsa ditho tsa motho tse tswang ho mofani ya tlwaelehileng (mola wa C103) o nyolohang ka hara colon mohatong o mong le o mong wa teko kapa nako. Di-schematics tse ka hara dikarolo tse ka hodimo di bontsha tlhophiso ya teko bakeng sa mohato o mong le o mong.b, Di-chip tse kopantsweng (schema e ka letsohong le letshehadi) di ka lebisa ho morphogenesis ya 3D ya epithelial ya organoid lisele tse nang le maikutlo a holimo-tlase a confocal microscopy a nkiloeng maemong a fapaneng a Z (holimo, bohareng, le tlase; bona mela e nepahetseng ea schematic le e tsamaellanang le matheba). li bontšitse litšobotsi tse totobetseng tsa sebopeho. F-actin (cyan), nucleus (grey).c, Li-micrograph tsa confocal tsa Fluorescence (pono e nang le angle ea 3D) ea lisele tsa epithelial tse nkiloeng ho organoid tse lengoang ho static Transwell (TW; setšoantšo se ka hare ho lebokose le lesoeu le nang le matheba) khahlanong le chip e kopantsoeng (setšoantšo se seholo ka ho fetisisa) se bapisang sebopeho sa 2D khahlanong le sa 3D, ka ho latellana. Para ea maikutlo a cross-cut a otlolohileng a 2D (setšoantšo se ka holimo sekhutlong se letona; "XZ") le eona e bontša likarolo tsa 2D le 3D. Sekala sa bareng, 100 µm.c E hatisitsoe hape ka tumello ho tsoa ho referense.4. Elsevier.
Litaolo li ka lokisoa ka ho holisa lisele tse tšoanang (Caco-2 kapa lisele tsa epithelial tsa intestinal organoid) hore e be li-monolayers tse peli tlas'a maemo a tloaelehileng a setso sa static. Haholo-holo, ho fokotseha ha limatlafatsi ho ka bakoa ke bokhoni bo fokolang ba bongata ba li-microchannels (ke hore ~4 µL mokerong o ka holimo ho moralo oa pele oa gut-chip). Ka hona, sebopeho sa epithelial pele le ka mor'a ts'ebeliso ea phallo ea basolateral le sona se ka bapisoa.
Ts'ebetso ea lithography e bonolo e lokela ho etsoa ka phapusing e hloekileng. Bakeng sa lera le leng le le leng holim'a chip (mara a ka holimo le a ka tlase le lera) le li-chips tse kopantsoeng, ho sebelisitsoe li-photomasks tse fapaneng 'me tsa etsoa holim'a li-wafer tse arohaneng tsa silicon hobane bophahamo ba li-microchannel bo ne bo fapane. Bophahamo ba sepheo sa li-microchannel tse ka holimo le tse ka tlase tsa mala holim'a chip ke 500 µm le 200 µm, ka ho latellana. Bophahamo ba sepheo sa kanale ea chip e kopantsoeng ke 200 µm.
Beha wafer ea silicon ea lisenthimithara tse 3 ka sekotlolong se nang le acetone. Phetla poleiti butle metsotsoana e 30, ebe u omisa wafer ka moea. Fetisetsa wafer poleiting e nang le IPA, ebe u phetla poleiti metsotso e 30 ho e hloekisa.
Tharollo ea piranha (motsoako oa hydrogen peroxide le asiti e matla ea sulfuric, 1:3 (vol/vol)) e ka sebelisoa ka boikhethelo ho tlosa masala a lintho tse phelang holim'a silicon wafer.
Tharollo ea Piranha e senya haholo 'me e hlahisa mocheso. Ho hlokahala mehato e meng ea ts'ireletso. Bakeng sa ho lahla litšila, lumella tharollo hore e phole 'me u e fetisetse setshelong se hloekileng, se omileng sa litšila. Sebelisa lijana tsa bobeli 'me u ngole mabitso a lijana tsa litšila ka nepo. Ka kopo latela litataiso tsa polokeho tsa setsi bakeng sa mekhoa e qaqileng haholoanyane.
Nwesa di-wafer ka metsi ka ho di beha poleiting e chesang ya 200 °C metsotso e 10. Kamora ho fellwa ke metsi, wafer e ile ya sisinngwa ka makgetlo a mahlano moeeng hore e pholile.
Tšela ~10 g ea photoresist SU-8 2100 bohareng ba wafer e hloekisitsoeng ea silicon. Sebelisa li-tweezers ho jala photoresist ka ho lekana holim'a wafer. Ka linako tse ling beha wafer poleiting e chesang ea 65°C ho etsa hore photoresist e se ke ea khomarela haholo 'me e be bonolo ho e jala. U se ke ua beha wafer ka ho toba poleiting e chesang.
SU-8 e ne e ajoa ka ho lekana holim'a wafer ka ho sebelisa sekoahelo sa spin. Lokisetsa potoloho e kenang ea SU-8 metsotsoana e 5-10 ho jala ka 500 rpm ka lebelo la 100 rpm/s. Beha spin e kholo bakeng sa ho etsa lipaterone tsa botenya ba 200 µm ka 1,500 rpm, kapa u fihlelle botenya ba 250 µm (ho etsa bophahamo ba 500 µm bakeng sa lera le ka holimo la mala holim'a chip; sheba "Mehato ea bohlokoa" ka tlase) e behiloeng ka lebelo la 300 rpm/s metsotsoana e 30 ka 1,200 rpm.
Lebelo le leholo la ho potoloha le ka fetoloa ho latela botenya ba sepheo sa paterone ea SU-8 holim'a wafer ea silicon.
Ho etsa dipaterone tsa SU-8 tsa bophahamo ba 500 µm bakeng sa lera le ka hodimo la mala hodima chip, ho kwahela ka ho potoloha le mehato ya ho baka e bonolo ya Lebokose lena (mehato ya 7 le ya 8) di ile tsa phetwa ka tatellano (sheba mohato wa 9) ho hlahisa mekhahlelo e mmedi ya 250 µm Lera le teteaneng la SU-8, le ka arolwang le ho kopanngwa ke ho pepesehela UV mohatong wa 12 wa lebokose lena, ho etsa hore lera le be bophahamo ba 500 µm.
Apeha di-wafer tse manehilweng ka SU-8 ka bonolo ka ho di beha ka hloko poleiting e chesang ho 65 °C metsotso e 5, ebe o fetola maemo ho 95 °C mme o di futhumatse metsotso e meng e 40.
Ho fihlella bophahamo ba 500 μm ba paterone ea SU-8 ka har'a microchannel e ka holimo, pheta mehato ea 7 le ea 8 ho hlahisa mekhahlelo e 'meli ea SU-8 e teteaneng ea 250 μm.
U sebelisa UV Mask Aligner, etsa teko ea lebone ho latela litaelo tsa moetsi ho bala nako ea ho pepesehela oafer. (nako ea ho pepesehela, ms) = (tekanyo ea ho pepesehela, mJ/cm2)/(matla a lebone, mW/cm2).
Kamora ho fumana nako ea ho pepesehela, beha photomask holim'a sets'oants'o sa maske sa aligner ea maske ea UV 'me u behe photomask holim'a wafer e koahetsoeng ka SU-8.
Beha bokaholimo bo hatisitsoeng ba photomask ka kotloloho lehlakoreng le koahetsoeng ke SU-8 la wafer ea silicon ho fokotsa ho hasana ha UV.
Hlahisa wafer e koahetsoeng ka SU-8 le photomask ka ho otloloha ho 260 mJ/cm2 ea khanya ea UV bakeng sa nako e behiloeng esale pele ea ho pepesehela (sheba mohato oa 10 oa lebokose lena).
Kamora ho pepesehela mahlaseli a kotsi a UV, di-wafer tsa silicon tse manehilweng ka SU-8 di ile tsa beswa mochesong wa 65°C metsotso e 5 le 95°C metsotso e 15 poleiting e nngwe le e nngwe e chesang ho etsa dipaterone tse bolelele ba 200 μm. Atolosa nako ya kamora ho beswa ho 95°C ho isa ho metsotso e 30 ho etsa dipaterone tse bolelele ba 500 µm.
Moqapi o tšeloa ka sejaneng sa khalase, 'me wafer e besitsoeng e beoa ka sejaneng. Bophahamo ba moqapi oa SU-8 bo ka fapana ho latela boholo ba poleiti ea khalase. Etsa bonnete ba hore u sebelisa moqapi oa SU-8 o lekaneng ho tlosa SU-8 e sa pepesoang ka botlalo. Mohlala, ha u sebelisa sejana sa khalase sa bophara ba 150 mm se nang le bokhoni ba 1 L, sebelisa ~300 mL ea moqapi oa SU-8. Hlahisa hlobo metsotso e 25 ka ho e potoloha ka bonolo nako le nako.
Hlatsoa hlobo e hlahisitsoeng ka ~10 mL ea developer e foreshe e lateloe ke IPA ka ho fafatsa tharollo u sebelisa pipette.
Beha wafer ka har'a sesebelisoa sa ho hloekisa plasma 'me u e behe ho plasma ea oksijene (khase ea sepakapaka, khatello e reriloeng 1 × 10−5 Torr, matla a 125 W) metsotso e 1.5.
Beha wafer ka har'a vacuum desiccator e nang le slide ea khalase kahare. Li-wafer le li-slide li ka beoa lehlakoreng le leng. Haeba desiccator ea vacuum desiccator e arotsoe ka mekhahlelo e 'maloa ka poleiti, beha li-slide ka kamoreng e ka tlase le li-wafer ka kamoreng e ka holimo. Lahlela 100 μL ea tharollo ea trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane holim'a slide ea khalase 'me u sebelise vacuum bakeng sa silanization.
Qhibilihisa botlolo ea lisele tsa Caco-2 tse hoamisitsoeng ka bateng ea metsi ea 37°C, ebe u fetisetsa lisele tse qhibilihisitsoeng ka har'a botlolo ea T75 e nang le 15 mL ea 37°C e futhumetseng pele ho Caco-2.
Ho fetisa lisele tsa Caco-2 ka ho kopana ha ~90%, pele ho futhumetse Caco-2 medium, PBS, le 0.25% trypsin/1 mM EDTA ka bateng ea metsi ea 37°C.
Hlatsoa lisele habeli ka 5 mL ea PBS e futhumetseng ka ho pheta pompo ea vacuum le ho eketsa PBS e ncha.
Nako ea poso: Phupu-16-2022
