Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Morfogenesis usus manungsa netepake fitur kript-villus saka mikroarsitektur epitel 3D lan organisasi spasial. Struktur unik iki dibutuhake kanggo njaga homeostasis usus kanthi nglindhungi niche sel punca ing kript basal saka antigen mikroba eksogen lan metabolite. Kajaba iku, vili usus lan lendir sing nyegerake nampilake sel epitel sing dibedakake kanthi fungsional kanthi alangan protèktif ing permukaan mukosa usus. Mulane, nggawe maneh struktur epitel 3D penting banget kanggo konstruksi model usus in vitro. Khususé, usus-on-a-chip mimetik organik bisa nyebabake morfogenesis 3D spontan saka epitel usus kanthi fungsi fisiologis lan biomekanik sing ditingkatake. Ing kene, kita nyedhiyakake protokol sing bisa direproduksi kanggo nyebabake morfogenesis usus kanthi kuat ing usus ing chip mikrofluidik uga ing chip hibrida sing dipasang ing Transwell. Kita njlèntrèhaké metode rinci kanggo fabrikasi piranti, budidaya Caco-2 utawa sel epitel organoid usus ing setelan konvensional uga ing platform mikrofluidik, induksi morfogenesis 3D, lan karakterisasi epitel 3D sing wis ditetepake nggunakake macem-macem modalitas pencitraan. Protokol iki nggayuh regenerasi mikroarsitektur usus fungsional kanthi ngontrol aliran cairan basolateral sajrone 5 dina. Metode morfogenesis in vitro kita nggunakake tegangan geser lan gerakan mekanik sing relevan sacara fisiologis lan ora mbutuhake rekayasa utawa manipulasi sel sing kompleks, sing bisa ngluwihi teknik liyane sing wis ana. Kita mbayangake manawa protokol sing diusulake bisa duwe implikasi sing amba kanggo komunitas riset biomedis, nyedhiyakake metode kanggo regenerasi lapisan epitel usus 3D in vitro kanggo aplikasi biomedis, klinis, lan farmasi.
Eksperimen nuduhake yen sel Caco-2 epitel usus sing dikultur ing gut-on-a-chip1,2,3,4,5 utawa piranti mikrofluidik bilayer6,7 bisa ngalami morfogenesis 3D spontan in vitro tanpa pangerten sing jelas babagan mekanisme sing ndasari. Ing panliten anyar, kita nemokake yen mbusak antagonis morfogen sing disekresi sacara basolateral saka piranti kultur perlu lan cukup kanggo ngindhuksi morfogenesis epitel 3D in vitro, sing wis dituduhake dening Caco-2 lan organoid usus sing diturunake pasien. Sel epitel wis divalidasi. Ing panliten iki, kita khusus fokus ing produksi sel lan distribusi konsentrasi antagonis Wnt sing kuat, Dickkopf-1 (DKK-1), ing piranti mikrofluida usus-on-a-chip lan piranti mikrofluida sing dimodifikasi sing ngemot sisipan Transwell, sing diarani "Hybrid Chip". Kita nduduhake manawa tambahan antagonis Wnt eksogen (kayata DKK-1, represor Wnt 1, protein sing ana gandhengane karo frizzled 1 sing disekresi, utawa Soggy-1) menyang usus ing-chip nyegah morfogenesis utawa ngganggu lapisan epitel 3D sing wis terstruktur, sing nuduhake manawa stres antagonis sajrone kultur tanggung jawab kanggo morfogenesis usus in vitro. Mulane, pendekatan praktis kanggo entuk morfogenesis sing kuat ing antarmuka epitel yaiku mbusak utawa njaga tingkat antagonis Wnt ing kompartemen basolateral kanthi pembilasan aktif (contone, ing platform usus-on-a-chip utawa hibrida-on-a-chip) utawa difusi. Media basolateral (contone, saka sisipan Transwell menyang reservoir basolateral gedhe ing sumur).
Ing protokol iki, kita nyedhiyakake metode rinci kanggo nggawe piranti mikro usus-ing-chip lan chip hibrida sing bisa dilebokake Transwell (langkah 1-5) kanggo ngkultur sel epitel usus ing membran berpori berbasis polidimetilsiloksan (PDMS) (langkah 6A, 7A, 8, 9) utawa membran poliester saka sisipan Transwell (langkah 6B, 7B, 8, 9) lan ngindhuksi morfogenesis 3D in vitro (langkah 10). Kita uga ngidentifikasi fitur seluler lan molekuler sing nuduhake histogenesis spesifik jaringan lan diferensiasi seluler sing gumantung karo garis keturunan kanthi ngetrapake pirang-pirang modalitas pencitraan (langkah 11-24). Kita ngindhuksi morfogenesis nggunakake sel epitel usus manungsa, kayata Caco-2 utawa organoid usus, ing rong format kultur kanthi rincian teknis kalebu modifikasi permukaan membran berpori, nggawe monolayer 2D, lan biokimia usus lan Reproduksi lingkungan mikro biomekanik. in vitro. Kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D saka monolayer epitel 2D, kita mbusak antagonis morfogen ing loro bentuk kultur kanthi mili Media kasebut mlebu ing kompartemen basolateral kultur. Pungkasan, kita nyedhiyakake perwakilan saka kegunaan lapisan epitel 3D sing bisa diregenerasi sing bisa digunakake kanggo model pertumbuhan epitel sing gumantung morfogen, ko-kultur mikrobioma host longitudinal, infeksi patogen, cedera inflamasi, disfungsi penghalang epitel, lan terapi berbasis probiotik. Conto pengaruh.
Protokol kita bisa migunani kanggo macem-macem ilmuwan ing riset dhasar (kayata, biologi mukosa usus, biologi sel punca, lan biologi perkembangan) lan riset terapan (kayata, uji obat praklinis, pemodelan penyakit, rekayasa jaringan, lan gastroenterologi) kanthi dampak sing amba. Amarga reproduksibilitas lan kekuwatan protokol kita kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D epitel usus in vitro, kita mbayangake manawa strategi teknis kita bisa disebarake menyang pamirsa sing nyinaoni dinamika sinyal sel sajrone perkembangan usus, regenerasi utawa homeostasis. Kajaba iku, protokol kita migunani kanggo nginterogasi infeksi ing macem-macem agen infeksi kayata Norovirus 8, Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 utawa Vibrio cholerae. Pamirsa patologi lan patogenesis penyakit uga migunani. Panggunaan sistem mikrofisiologi usus on-chip bisa ngidini kultur longitudinal 10 lan penilaian sabanjure babagan pertahanan inang, respon imun lan perbaikan cedera sing ana gandhengane karo patogen ing saluran gastrointestinal (GI) 11. Gangguan GI liyane sing ana gandhengane karo sindrom usus bocor, penyakit celiac, penyakit Crohn, kolitis ulseratif, pouchitis, utawa sindrom usus gampang iritasi bisa disimulasikake nalika lapisan epitel usus 3D disiapake nggunakake lapisan epitel usus 3D pasien, penyakit kasebut kalebu atrofi vili, pemendekan crypt, kerusakan mukosa, utawa alangan epitel sing rusak. Biopsi utawa organoid usus sing asale saka sel punca 12,13. Kanggo model sing luwih apik babagan kerumitan lingkungan penyakit, para pamaca bisa nimbang nambahake jinis sel sing relevan karo penyakit, kayata sel mononuklear getih perifer pasien (PBMC), menyang model sing ngemot mikroarsitektur vili-crypt usus 3D. sel imun spesifik jaringan, 5.
Amarga mikrostruktur epitel 3D bisa didandani lan divisualisasikake tanpa proses sectioning, pamirsa sing nggarap transkriptomik spasial lan pencitraan resolusi dhuwur utawa super-resolusi bisa uga kasengsem karo pemetaan dinamika spatiotemporal gen lan protein ing relung epitel. Tertarik karo teknologi. Respon marang rangsangan mikroba utawa kekebalan. Salajengipun, crosstalk host-microbiome longitudinal 10, 14 sing koordinasi homeostasis usus bisa ditetepake ing lapisan mukosa usus 3D kanthi budidaya bebarengan macem-macem spesies mikroba, komunitas mikroba utawa mikrobiota feses, utamane ing usus-on-a-chip. ing platform kasebut. Pendekatan iki utamane narik kawigaten para pamirsa sing nyinaoni imunologi mukosa, gastroenterologi, mikrobioma manungsa, kulturomik, lan mikrobiologi klinis sing ngupaya ngolah mikrobiota usus sing durung dikultur ing laboratorium. Yen protokol morfogenesis in vitro kita bisa diadaptasi menyang format kultur sing bisa diskalakake, kayata sisipan multiwell ing piring 24, 96, utawa 384 sumur sing terus-terusan ngisi kompartemen basolateral, protokol kasebut uga bisa disebarake menyang wong-wong sing ngembangake platform skrining utawa validasi farmasi, biomedis, utawa throughput dhuwur kanggo industri panganan. Minangka bukti prinsip, kita bubar nduduhake kelayakan sistem morfogenesis throughput dhuwur multipleks sing bisa diskalakake menyang format piring 24 sumur. Kajaba iku, produk multi-organ-on-a-chip wis dikomersialake16,17,18. Mulane, validasi metode morfogenesis in vitro kita bisa dipercepat lan bisa diadopsi dening akeh laboratorium riset, industri utawa pemerintah lan badan pengatur kanggo mangerteni pemrograman ulang seluler morfogenesis usus in vitro ing tingkat transkriptomik kanggo nguji obat utawa bioterapeutik. Penyerapan lan transportasi Calon obat ditaksir nggunakake pengganti usus 3D utawa nggunakake model organ-on-a-chip khusus utawa komersial kanggo neliti reproduksibilitas proses morfogenesis usus.
Model eksperimen sing relevan karo manungsa wis digunakake kanggo nyinaoni morfogenesis epitel usus kanthi jumlah winates, utamane amarga kurang protokol sing bisa diimplementasikake kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D in vitro. Nyatane, akeh kawruh saiki babagan morfogenesis usus adhedhasar studi kewan (kayata, zebrafish20, tikus21 utawa pitik22). Nanging, model kasebut mbutuhake tenaga kerja lan biaya akeh, bisa dipertanyakan sacara etis, lan sing paling penting, ora nemtokake kanthi tepat proses perkembangan manungsa. Model kasebut uga winates banget ing kemampuane kanggo diuji kanthi cara sing bisa diskalakake kanthi multi-cara. Mulane, protokol kita kanggo regenerasi struktur jaringan 3D in vitro ngluwihi model kewan in vivo uga model kultur sel 2D statis tradisional liyane. Kaya sing wis diterangake sadurunge, nggunakake struktur epitel 3D ngidini kita mriksa lokalisasi spasial sel sing wis dibedakake ing sumbu crypt-villus minangka respon kanggo macem-macem rangsangan mukosa utawa kekebalan. Lapisan epitel 3D bisa nyedhiyakake papan kanggo nyinaoni kepiye sel mikroba saingan kanggo mbentuk relung spasial lan evolusi ekologis minangka respon kanggo faktor inang (kayata, lapisan lendir njero versus njaba, sekresi IgA lan antimikroba peptida). Salajengipun, morfologi epitel 3D saged ngidini kita mangertos kepriye mikrobiota usus nyusun komunitas lan kanthi sinergis ngasilake metabolit mikroba (contone, asam lemak rantai pendek) sing mbentuk organisasi seluler lan relung sel punca ing kriptus basal. Fitur-fitur kasebut mung bisa dituduhake nalika lapisan epitel 3D diadegake in vitro.
Saliyane metode kita kanggo nggawe struktur epitel usus 3D, ana sawetara metode in vitro. Kultur organoid usus minangka teknik rekayasa jaringan paling canggih adhedhasar budidaya sel punca usus ing kahanan morfogen tartamtu23,24,25. Nanging, panggunaan model organoid 3D kanggo analisis transportasi utawa ko-kultur mikrobioma inang asring dadi tantangan amarga lumen usus ditutup ing njero organoid lan, mula, introduksi komponen luminal kayata sel mikroba utawa antigen eksogen diwatesi. Akses menyang lumen organoid bisa ditingkatake nggunakake microinjector,26,27 nanging metode iki invasif lan intensif tenaga kerja lan mbutuhake kawruh khusus kanggo nindakake. Salajengipun, kultur organoid tradisional sing dijaga ing perancah hidrogel ing kahanan statis ora kanthi akurat nggambarake biomekanik aktif in vivo.
Pendekatan liya sing digunakake dening sawetara klompok riset nggunakake perancah hidrogel 3D sing wis terstruktur kanggo niru struktur epitel usus kanthi ngkultur sel usus manungsa sing terisolasi ing permukaan gel. Nggawe perancah hidrogel nggunakake cetakan sing dicithak 3D, digiling mikro, utawa digawe kanthi litografi. Metode iki nuduhake susunan sel epitel sing terisolasi kanthi mandiri in vitro kanthi gradien morfogen sing relevan sacara fisiologis, netepake struktur epitel rasio aspek sing dhuwur lan crosstalk stroma-epitel kanthi nglebokake sel stroma ing perancah. Nanging, sifat perancah sing wis terstruktur bisa nyegah tampilan proses morfogenetik spontan dhewe. Model kasebut uga ora nyedhiyakake aliran luminal utawa interstitial dinamis, kekurangan tegangan geser cairan sing dibutuhake sel usus kanggo ngalami morfogenesis lan entuk fungsi fisiologis. Panaliten anyar liyane nggunakake perancah hidrogel ing platform mikrofluida lan struktur epitel usus sing dipola nggunakake teknik etsa laser. Organoid usus tikus ngetutake pola sing diukir kanggo mbentuk struktur tubular usus, lan aliran cairan intraluminal bisa direkapitulasi nggunakake modul mikrofluida. Nanging, model iki ora nuduhake spontan. Proses morfogenetik lan uga ora kalebu gerakan mekanobiologis usus. Teknik pencetakan 3D saka klompok sing padha bisa nggawe tabung usus miniatur kanthi proses morfogenetik spontan. Senadyan fabrikasi segmen usus sing beda-beda ing njero tabung kasebut rumit, model iki uga ora duwe aliran cairan luminal lan deformasi mekanik. Kajaba iku, operabilitas model bisa uga diwatesi, utamane sawise proses bioprinting rampung, ngganggu kahanan eksperimen utawa interaksi sel-ke-sel. Nanging, protokol sing diusulake nyedhiyakake morfogenesis usus spontan, tegangan geser sing relevan sacara fisiologis, biomekanik sing niru motilitas usus, aksesibilitas kompartemen apikal lan basolateral independen, lan nggawe maneh lingkungan mikro biologis modularitas sing kompleks. Mulane, protokol morfogenesis 3D in vitro kita bisa nyedhiyakake pendekatan komplementer kanggo ngatasi tantangan metode sing ana.
Protokol kita fokus banget ing morfogenesis epitel 3D, mung nganggo sel epitel ing kultur lan ora ana jinis sel liyane ing sekitar kayata sel mesenchymal, sel endotel, lan sel imun. Kaya sing wis diterangake sadurunge, inti saka protokol kita yaiku induksi morfogenesis epitel kanthi mbusak inhibitor morfogen sing disekresi ing sisih basolateral medium sing dikenalake. Nalika modularitas sing kuat saka gut-on-a-chip lan hybrid-on-a-chip ngidini kita nggawe maneh lapisan epitel 3D sing bergelombang, kerumitan biologis tambahan kayata interaksi epitel-mesenchymal33,34, deposisi Matriks ekstraseluler (ECM)35 lan, ing model kita, fitur crypt-villus sing ngirim niche sel punca ing crypt basal isih kudu ditimbang luwih lanjut. Sel stromal (contone, fibroblas) ing mesenchyme nduweni peran penting ing produksi protein ECM lan regulasi morfogenesis usus in vivo35,37,38. Penambahan sel mesenchymal menyang model kita nambah proses morfogenetik lan efisiensi perlekatan sel. Lapisan endotel (yaiku, kapiler utawa limfatik) nduweni peran penting kanggo ngatur transportasi molekuler39 lan rekrutmen sel imun40 ing lingkungan mikro usus. Salajengipun, komponen vaskularisasi sing bisa disambungake antarane model jaringan minangka prasyarat nalika model jaringan dirancang kanggo nduduhake interaksi multi-organ. Mulane, sel endotel bisa uga kudu dilebokake kanggo model fitur fisiologis sing luwih akurat kanthi resolusi tingkat organ. Sel imun sing asale saka pasien uga penting kanggo nampilake respon imun bawaan, presentasi antigen, crosstalk imun adaptif bawaan, lan kekebalan khusus jaringan ing konteks niru penyakit usus.
Panggunaan chip hibrida luwih gampang tinimbang gut-on-a-chip amarga persiyapan piranti luwih prasaja lan panggunaan sisipan Transwell ngidini kultur epitel usus sing bisa diskalakake. Nanging, sisipan Transwell sing kasedhiya sacara komersial nganggo membran poliester ora elastis lan ora bisa niru gerakan kaya peristaltik. Salajengipun, kompartemen apikal saka sisipan Transwell sing diselehake ing chip hibrida tetep stasioner tanpa tegangan geser ing sisih apikal. Temenan, sifat statis ing kompartemen apikal arang ngaktifake ko-kultur bakteri jangka panjang ing chip hibrida. Sanajan kita bisa kanthi kuat ngindhuksi morfogenesis 3D ing sisipan Transwell nalika nggunakake chip hibrida, kekurangan biomekanik sing relevan sacara fisiologis lan aliran cairan apikal bisa mbatesi kelayakan platform chip hibrida kanggo aplikasi potensial.
Rekonstruksi skala lengkap saka sumbu kript-villus manungsa ing kultur gut-on-a-chip lan hibrida-on-a-chip durung ditetepake kanthi lengkap. Amarga morfogenesis diwiwiti saka monolayer epitel, mikroarsitektur 3D ora mesthi menehi kamiripan morfologis karo kript in vivo. Sanajan kita njlentrehake populasi sel sing berkembang biak cedhak domain kript basal ing epitel 3D sing direkayasa mikro, wilayah kript lan vili ora diwatesi kanthi jelas. Sanajan saluran ndhuwur sing luwih dhuwur ing chip nyebabake tambah dhuwur epitel sing direkayasa mikro, dhuwur maksimal isih diwatesi nganti ~300-400 µm. Ambane kript usus manungsa ing usus cilik lan gedhe yaiku ~135 µm lan ~400 µm, lan dhuwur vili usus cilik yaiku ~600 µm41.
Saka sudut pandang pencitraan, pencitraan super-resolusi in situ saka mikroarsitektur 3D bisa uga diwatesi ing usus ing chip, amarga jarak kerja sing dibutuhake saka lensa objektif menyang lapisan epitel mung sawetara milimeter. Kanggo ngatasi masalah iki, obyektif sing adoh bisa uga dibutuhake. Salajengipun, nggawe bagean tipis kanggo persiapan spesimen pencitraan iku tantangan amarga elastisitas PDMS sing dhuwur. Salajengipun, amarga mikrofabrikasi lapisan demi lapisan usus ing chip nglibatake adhesi permanen antarane saben lapisan, mula angel banget kanggo mbukak utawa mbusak lapisan ndhuwur kanggo mriksa struktur permukaan lapisan epitel. Contone, kanthi nggunakake mikroskop elektron pindai (SEM).
Hidrofobisitas PDMS wis dadi faktor pembatas ing panliten adhedhasar mikrofluidik sing ana gandhengane karo molekul cilik hidrofobik, amarga PDMS bisa nyerep molekul hidrofobik kasebut kanthi nonspesifik. Alternatif kanggo PDMS bisa dianggep karo bahan polimer liyane. Utawa, modifikasi permukaan PDMS (kayata, lapisan nganggo bahan lipofilik 42 utawa poli(etilen glikol) 43) bisa dianggep kanggo nyuda adsorpsi molekul hidrofobik.
Pungkasanipun, metode kita dereng dipunkarakterisasi kanthi sae kangge nyedhiyakaken skrining throughput ingkang inggil utawi platform eksperimen "siji ukuran cocok kangge sedaya" ingkang ramah pangguna. Protokol samenika mbetahaken pompa syringe saben piranti mikro, ingkang mbetahaken papan ing inkubator CO2 lan nyegah eksperimen skala ageng. Watesan punika saged dipuntingkataken kanthi signifikan kanthi skalabilitas format kultur inovatif (contone, sisipan berpori 24-sumur, 96-sumur, utawi 384-sumur ingkang ngidini pengisian ulang lan penghapusan media basolateral kanthi terus-terusan).
Kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D epitel usus manungsa in vitro, kita nggunakake piranti usus chip mikrofluidik sing ngemot rong saluran mikro paralel lan membran berpori elastis ing antarane kanggo nggawe antarmuka lumen-kapiler. Kita uga nduduhake panggunaan piranti mikrofluidik saluran tunggal (chip hibrida) sing nyedhiyakake aliran basolateral terus-terusan ing sangisore lapisan epitel terpolarisasi sing ditanam ing sisipan Transwell. Ing loro platform kasebut, morfogenesis macem-macem sel epitel usus manungsa bisa didemonstrasikake kanthi ngetrapake manipulasi aliran arah kanggo mbusak antagonis morfogen saka kompartemen basolateral. Kabeh prosedur eksperimen (Gambar 1) kasusun saka limang bagean: (i) mikrofabrikasi chip usus utawa chip hibrida sing bisa dilebokake Transwell (langkah 1-5; Kothak 1), (ii) persiapan sel epitel usus (sel Caco-2) utawa organoid usus manungsa; kothak 2-5), (iii) kultur sel epitel usus ing chip usus utawa chip hibrida (langkah 6-9), (iv) induksi morfogenesis 3D in vitro (langkah 10) lan (v)) kanggo menehi ciri mikrostruktur epitel 3D (langkah 11-24). Pungkasan, klompok kontrol sing cocog (dibahas luwih lanjut ing ngisor iki) dirancang kanggo validasi efektifitas morfogenesis in vitro kanthi mbandhingake morfogenesis epitel karo kontrol spasial, temporal, kondisional, utawa prosedural.
Kita nggunakake rong platform kultur sing beda: gut-on-a-chip nganggo saluran lurus utawa saluran berbelit-belit nonlinier, utawa chip hibrida sing ngemot sisipan Transwell (TW) ing piranti mikrofluida, digawe kaya sing diterangake ing Kothak 1, lan langkah 1-5. "Fabrikasi Piranti" nuduhake langkah-langkah utama kanggo nggawe chip tunggal utawa chip hibrida. "Kultur Sel Epitel Usus Manusia" nerangake sumber sel (Caco-2 utawa organoid usus manusia) lan prosedur kultur sing digunakake ing protokol iki. "Morfogenesis in vitro" nuduhake langkah-langkah sakabèhé ing ngendi Caco-2 utawa sel epitel sing asale saka organoid dikultur ing chip usus utawa ing sisipan Transwell saka chip hibrida, banjur induksi morfogenesis 3D lan pembentukan struktur epitel sing ditandai. Nomer langkah program utawa nomer kothak ditampilake ing ngisor saben panah. Aplikasi kasebut nyedhiyakake conto babagan kepiye lapisan epitel usus sing wis ditetepake bisa digunakake, contone, ing karakterisasi diferensiasi sel, studi fisiologi usus, pembentukan ekosistem host-mikrobioma, lan pemodelan penyakit. Gambar imunofluoresensi ing "Sel "Diferensiasi" sing nuduhake inti, F-aktin lan MUC2 sing diekspresikan ing lapisan epitel 3D Caco-2 sing diasilake ing chip usus. Sinyal MUC2 ana ing sel goblet lan lendir sing disekresi saka permukaan mukosa. Gambar fluoresen ing Fisiologi Usus nuduhake lendir sing diasilake kanthi pewarnaan kanggo residu asam sialat lan N-asetilglukosamin nggunakake aglutinin kuman gandum fluoresen. Rong gambar sing tumpang tindih ing "Kultur Mikroba Host" nuduhake ko-kultur mikrobioma host sing representatif ing usus ing chip. Panel kiwa nuduhake ko-kultur protein fluoresen ijo (GFP) sing diekspresikan E. coli kanthi sel epitel Caco-2 3D sing direkayasa mikro. Panel tengen nuduhake lokalisasi GFP E. coli sing dikultur bebarengan karo sel epitel Caco-2 3D, diikuti pewarnaan imunofluoresensi karo F-aktin (abang) lan inti (biru). Pemodelan penyakit nggambarake usus sehat versus usus bocor ing chip inflamasi usus ing tantangan fisiologis karo antigen bakteri (contone, lipopolisakarida, LPS) lan sel imun (contone, PBMC; ijo). Sel Caco-2 dikultur kanggo mbentuk lapisan epitel 3D. Skala bar, 50 µm. Gambar ing baris ngisor: "Diferensiasi sel" diadaptasi kanthi ijin saka referensi. 2. Oxford University Press; Direproduksi kanthi ijin saka Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" diadaptasi kanthi ijin saka ref.3. NAS; "Pemodelan Penyakit" diadaptasi kanthi ijin saka referensi. 5. NAS.
Chip gut-on-chip lan hibrida digawe nggunakake replika PDMS sing dibongkar saka cetakan silikon kanthi litografi alus1,44 lan dipola nganggo SU-8. Desain saluran mikro ing saben chip ditemtokake kanthi nimbang hidrodinamika kayata tegangan geser lan tekanan hidrodinamik1,4,12. Desain gut-on-a-chip asli (Gambar Data Tambahan 1a), sing kasusun saka rong saluran mikro lurus paralel sing dijuxtapose, wis berkembang dadi gut-on-a-chip sing kompleks (Gambar Data Tambahan 1b) sing kalebu sepasang saluran mikro melengkung kanggo ngindhuksi wektu tinggal cairan sing tambah, pola aliran nonlinier, lan deformasi multiaksial sel sing dikultur (Gambar 2a–f)12. Nalika biomekanik usus sing luwih kompleks kudu digawe maneh, gut-on-a-chip sing kompleks bisa dipilih. Kita wis nduduhake manawa Gut-Chip sing rumit uga banget ngindhuksi morfogenesis 3D ing wektu sing padha kanthi tingkat pertumbuhan epitel sing padha dibandhingake karo asline. Gut-Chip, preduli saka jinis sel sing dikultur. Mulane, kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D, desain usus on-chip sing linier lan kompleks bisa diganti. Replika PDMS sing diawetake ing cetakan silikon nganggo pola SU-8 nyedhiyakake fitur negatif sawise demolding (Gambar 2a). Kanggo nggawe usus ing chip, lapisan PDMS ndhuwur sing wis disiapake diikat kanthi runtut menyang film PDMS berpori lan banjur disejajarake karo lapisan PDMS ngisor kanthi ikatan sing ora bisa dibalekake nggunakake corona treater (Gambar 2b–f). Kanggo nggawe chip hibrida, replika PDMS sing diawetake diikat menyang slide kaca kanggo nggawe piranti mikrofluida saluran tunggal sing bisa nampung sisipan Transwell (Gambar 2h lan Data Tambahan Gambar 2). Proses ikatan ditindakake kanthi ngolah permukaan replika PDMS lan kaca nganggo plasma oksigen utawa perawatan korona. Sawise sterilisasi piranti mikrofabrikasi sing dipasang ing tabung silikon, persiyapan piranti wis siyap kanggo nindakake morfogenesis 3D epitel usus (Gambar 2g).
a, Ilustrasi skematis persiapan bagean PDMS saka cetakan silikon berpola SU-8. Larutan PDMS sing durung diawetake diwutahake menyang cetakan silikon (kiwa), diawetake ing suhu 60 °C (tengah) lan dibongkar (tengen). PDMS sing dibongkar dipotong-potong lan diresiki kanggo digunakake luwih lanjut. b, Foto cetakan silikon sing digunakake kanggo nyiyapake lapisan ndhuwur PDMS. c, Foto cetakan silikon sing digunakake kanggo nggawe membran keropos PDMS. d, Serangkaian foto komponen PDMS ndhuwur lan ngisor lan piranti usus ing chip sing dirakit. e, Skema penjajaran komponen PDMS ndhuwur, membran, lan ngisor. Saben lapisan diikat kanthi ora bisa dibatalake dening perawatan plasma utawa korona. f, Skema piranti usus-ing-chip sing digawe kanthi saluran mikro sing rumit lan ruang vakum sing ditumpangake. g, Persiapan usus-ing-chip kanggo kultur sel mikrofluidik. Usus sing digawe ing chip sing dirakit nganggo tabung silikon lan jarum suntik dilebokake ing tutup kaca. Piranti chip diselehake ing tutup Petri 150 mm sajian kanggo diproses. Pengikat digunakake kanggo nutup tabung silikon. h, Gambar visual saka fabrikasi chip hibrida lan morfogenesis 3D nggunakake chip hibrida. Sisipan Transwell sing disiapake kanthi mandiri kanggo ngkultur lapisan mono 2D sel epitel usus dilebokake menyang chip hibrida kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D usus. Medium kasebut diperfusi liwat saluran mikro ing ngisor lapisan sel sing diadegake ing sisipan Transwell. Bilah skala, 1 cm. h Dicetak ulang kanthi ijin saka referensi. 4. Elsevier.
Ing protokol iki, garis sel Caco-2 lan organoid usus digunakake minangka sumber epitel (Gambar 3a). Kaloro jinis sel kasebut dikultur kanthi mandiri (Kothak 2 lan Kothak 5) lan digunakake kanggo nyebarake mikrokanal sing dilapisi ECM saka usus ing chip utawa sisipan Transwell. Nalika sel wis kumpul (cakupan >95% ing labu), sel Caco-2 sing dikultur kanthi rutin (antarane saluran 10 lan 50) ing labu-T dipanen kanggo nyiyapake suspensi sel sing disosiasi dening cairan tripsinisasi (kothak 2). Organoid usus manungsa saka biopsi usus utawa reseksi bedhah dikultur ing kubah scaffold Matrigel ing piring 24-sumur kanggo ndhukung lingkungan mikro struktural. Medium sing ngemot morfogen penting (kayata Wnt, R-spondin, lan Noggin) lan faktor pertumbuhan sing disiapake kaya sing diterangake ing Kothak 3 ditambah saben rong dina nganti organoid tuwuh nganti diameter ~500 µm. Organoid sing wis thukul lengkap dipanen lan disosiasi dadi sel tunggal kanggo disebarake ing usus. utawa sisipan Transwell ing chip (Kothak 5). Kaya sing wis dilapurake sadurunge, bisa dibedakake miturut jinis penyakit12,13 (kayata kolitis ulseratif, penyakit Crohn, kanker kolorektal, utawa donor normal), situs lesi (kayata, lesi lawan area sing ora ana lesi) lan lokasi gastrointestinal ing saluran (kayata, duodenum, jejunum, ileum, sekum, usus besar, utawa rektum). Kita nyedhiyakake protokol sing dioptimalake ing Kothak 5 kanggo budidaya organoid kolon (koloid) sing biasane mbutuhake konsentrasi morfogen sing luwih dhuwur tinimbang organoid usus cilik.
a, Alur Kerja kanggo induksi morfogenesis usus ing chip usus. Epitel usus manungsa Caco-2 lan organoid usus digunakake ing protokol iki kanggo nduduhake morfogenesis 3D. Sel epitel sing diisolasi diwiji ing piranti usus-on-a-chip sing wis disiapake (persiapan chip). Sawise sel diwiji (diwiji) lan dipasang (dipasang) menyang membran berpori PDMS ing dina 0 (D0), aliran apikal (AP) diwiwiti lan dijaga sajrone 2 dina pisanan (aliran, AP, D0-D2). Aliran basolateral (BL) uga diwiwiti bebarengan karo gerakan peregangan siklik (peregangan, aliran, AP lan BL) nalika monolayer 2D lengkap dibentuk. Morfogenesis 3D usus kedadeyan kanthi spontan sawise 5 dina kultur mikrofluidik (morfogenesis, D5). Gambar kontras fase nuduhake morfologi representatif sel Caco-2 ing saben langkah eksperimen utawa titik wektu (grafik batang, 100 µm). Papat diagram skematis sing nggambarake kaskade morfogenesis usus sing cocog (tengen ndhuwur). Garis putus-putus Panah ing skematis makili arah aliran cairan. b, gambar SEM sing nuduhake topologi permukaan epitel Caco-2 3D sing wis mapan (kiwa). Sisipan sing nyorot area sing digedhekake (kothak putus-putus putih) nuduhake mikrovili sing diregenerasi ing lapisan Caco-2 3D (tengen). c, Tampilan frontal horisontal saka Caco-2 3D sing wis mapan, claudin (ZO-1, abang) lan membran wates sikat terus-terusan sing diwenehi label F-aktin (ijo) lan inti (biru). Visualisasi confocal imunofluoresensi saka sel epitel ing chip usus. Panah sing nuduhake skematis tengah nuduhake lokasi bidang fokus kanggo saben tampilan confocal. d, Perjalanan wektu owah-owahan morfologis ing organoid sing dikultur ing chip sing dipikolehi kanthi mikroskop kontras fase ing dina 3, 7, 9, 11, lan 13. Sisipan (tengen ndhuwur) nuduhake pembesaran dhuwur saka gambar sing diwenehake. e, fotomikrograf DIC saka epitel 3D organoid sing mapan ing usus ing irisan sing dijupuk ing dina 7. f, Gambar imunofluoresensi sing ditumpuk nuduhake penanda kanggo sel punca (LGR5; magenta), sel goblet (MUC2; ijo), F-aktin (abu-abu) lan inti (cyan) sing ditandur ing chip usus sajrone 3 dina, masing-masing (Kiri) lan organoid 13 dina (tengah) ing lapisan epitel. Deleng uga Gambar Data Tambahan 3, sing nyorot sinyal LGR5 tanpa sinyal MUC2. Gambar fluoresensi sing nuduhake mikrostruktur epitel (tengen) saka epitel organoid 3D sing diadegake ing usus ing chip kanthi pewarnaan membran plasma nganggo pewarna CellMask (tengen) ing dina kaping 13 kultur. Bilah skala yaiku 50 μm kajaba kasebut liya. b Dicetak ulang kanthi ijin saka referensi. 2. Oxford University Press; c Diadaptasi kanthi ijin saka Referensi. 2. Oxford University Press; e lan f diadaptasi kanthi ijin kanthi referensi. 12 Miturut Lisensi Creative Commons CC BY 4.0.
Ing usus ing chip, perlu kanggo ngowahi permukaan hidrofobik membran keropos PDMS kanggo lapisan ECM sing sukses. Ing protokol iki, kita ngetrapake rong cara sing beda kanggo ngowahi hidrofobisitas membran PDMS. Kanggo budidaya sel Caco-2, aktivasi permukaan kanthi perawatan UV/ozon wae wis cukup kanggo nyuda hidrofobisitas permukaan PDMS, nutupi ECM lan masang sel Caco-2 menyang membran PDMS. Nanging, kultur mikrofluidik epitel organoid mbutuhake fungsionalisasi permukaan berbasis kimia kanggo entuk deposisi protein ECM sing efisien kanthi ngetrapake polietilenimina (PEI) lan glutaraldehida kanthi runtut menyang saluran mikro PDMS. Sawise modifikasi permukaan, protein ECM didepositake kanggo nutupi permukaan PDMS sing difungsionalke banjur dilebokake ing epitel organoid sing diisolasi. Sawise sel dipasang, kultur sel mikrofluidik diwiwiti kanthi mung perfusi medium menyang saluran mikro ndhuwur nganti sel mbentuk monolayer lengkap, dene saluran mikro ngisor njaga kahanan statis. Cara sing dioptimalake kanggo aktivasi permukaan lan lapisan ECM iki ngidini lampiran epitel organoid kanggo ngindhuksi morfogenesis 3D ing PDMS. lumah.
Kultur Transwell uga mbutuhake lapisan ECM sadurunge nyemai sel; Nanging, kultur Transwell ora mbutuhake langkah-langkah perawatan awal sing kompleks kanggo ngaktifake permukaan sisipan berpori. Kanggo nuwuhake sel Caco-2 ing sisipan Transwell, lapisan ECM ing sisipan berpori nyepetake penempelan sel Caco-2 sing disosiasi (<1 jam) lan pembentukan penghalang sambungan sing rapet (<1-2 dina). Kanggo kultur organoid ing sisipan Transwell, organoid sing diisolasi diumbi ing sisipan sing dilapisi ECM, dipasang ing permukaan membran (<3 jam) lan dijaga nganti organoid mbentuk monolayer lengkap kanthi integritas penghalang. Kultur Transwell ditindakake ing piring 24-sumur tanpa nggunakake chip hibrida.
Morfogenesis 3D in vitro bisa diwiwiti kanthi ngetrapake aliran cairan menyang aspek basolateral saka lapisan epitel sing wis diadegake. Ing usus ing chip, morfogenesis epitel diwiwiti nalika medium kasebut diperfusi menyang mikrokanal ndhuwur lan ngisor (Gambar 3a). Kaya sing wis diterangake sadurunge, penting banget kanggo ngenalake aliran cairan ing kompartemen inferior (basolateral) kanggo mbusak inhibitor morfogen sing disekresi kanthi arah. Kanggo nyedhiyakake nutrisi lan serum sing cukup kanggo sel sing kaiket ing membran keropos lan ngasilake tegangan geser luminal, biasane kita ngetrapake aliran ganda ing usus ing chip. Ing chip hibrida, sisipan Transwell sing ngemot monolayer epitel dilebokake menyang chip hibrida. Banjur, medium kasebut ditrapake ing sisih basolateral saka sisipan Transwell keropos liwat mikrokanal. Morfogenesis usus kedadeyan 3-5 dina sawise wiwitan aliran basolateral ing loro platform kultur.
Fitur morfologis lapisan epitel 3D sing direkayasa mikro bisa dianalisis kanthi ngetrapake macem-macem modalitas pencitraan, kalebu mikroskop kontras fase, mikroskop kontras interferensi diferensial (DIC), SEM, utawa mikroskop confocal imunofluoresensi (Gambar 3 lan 4). Pencitraan kontras fase utawa DIC bisa ditindakake kanthi gampang kapan wae sajrone kultur kanggo ngawasi bentuk lan tonjolan lapisan epitel 3D. Amarga transparansi optik PDMS lan film poliester, platform chip usus-on-a-chip lan hibrida bisa nyedhiyakake pencitraan in situ wektu nyata tanpa perlu sectioning utawa bongkar piranti. Nalika nindakake pencitraan imunofluoresensi (Gambar 1, 3c, f lan 4b, c), sel biasane difiksasi nganggo 4% (wt/vol) paraformaldehida (PFA), diikuti Triton X-100 lan 2% (wt/vol) ) albumin serum sapi (BSA), kanthi urutan. Gumantung saka jinis sel, fiksatif, permeabilisator, lan agen pemblokiran sing beda bisa digunakake. Antibodi utama sing nargetake sel sing gumantung karo garis keturunan utawa Penanda wilayah digunakake kanggo nyorot sel sing ora obah ing situ ing chip, banjur antibodi sekunder bebarengan karo pewarna counterstain sing nargetake inti (contone, 4′, 6-diamidino-2-phenylene) indol, DAPI) utawa F-aktin (contone, phalloidin sing diwenehi label fluoresensi). Pencitraan langsung berbasis fluoresensi uga bisa ditindakake ing situ kanggo ndeteksi produksi lendir (Gambar 1, "Diferensiasi sel" lan "Fisiologi usus"), kolonisasi acak sel mikroba (Gambar 1, "Ko-kultur mikroba host"), rekrutmen sel imun (Gambar 1, 'Pemodelan Penyakit') utawa kontur morfologi epitel 3D (Gambar 3c, f lan 4b, c). Nalika ngowahi usus ing chip kanggo misahake lapisan ndhuwur saka lapisan mikrokanal ngisor, kaya sing diterangake ing ref. Kaya sing dituduhake ing Gambar 2, morfologi epitel 3D uga mikrovili ing wates sikat apikal bisa divisualisasikake dening SEM (Gambar 3b). Ekspresi diferensiasi Penanda bisa ditaksir kanthi nindakake PCR5 kuantitatif utawa sekuensing RNA sel tunggal. Ing kasus iki, lapisan 3D sel epitel sing ditumbuhake ing chip usus utawa chip hibrida dipanen kanthi tripsinisasi banjur digunakake kanggo analisis molekuler utawa genetik.
a, Alur Kerja kanggo induksi morfogenesis usus ing chip hibrida. Caco-2 lan organoid usus digunakake ing protokol iki kanggo nduduhake morfogenesis 3D ing platform chip hibrida. Sel epitel sing dipisahake diunggulake ing sisipan Transwell sing wis disiapake (TW prep; deleng gambar ing ngisor iki). Sawise sel diunggulake (diunggulake) lan dipasang ing membran poliester ing sisipan Transwell, kabeh sel dikultur ing kahanan statis (kultur TW). Sawise 7 dina, sisipan Transwell tunggal sing ngemot monolayer 2D sel epitel diintegrasikan menyang chip hibrida kanggo ngenalake aliran basolateral (Flow, BL), sing pungkasane nyebabake generasi lapisan epitel 3D (morfogenesis). Mikrograf kontras fase sing nuduhake fitur morfologis sel epitel organ manungsa sing asale saka usus besar ascendens donor normal (garis C103) ing saben langkah eksperimen utawa titik wektu. Skema ing lapisan ndhuwur nggambarake konfigurasi eksperimen kanggo saben langkah. b, Chip hibrida (skema kiwa) bisa nyebabake morfogenesis 3D sel epitel organoid kanthi tampilan mikroskopi confocal ndhuwur-mudhun sing dijupuk ing posisi Z sing beda (ndhuwur, tengah, lan ngisor; deleng skematis tengen lan garis putus-putus sing cocog). nuduhake karakteristik morfologis sing jelas. F-aktin (cyan), inti (abu-abu). c, Mikrograf confocal fluoresensi (tampilan sudut 3D) saka sel epitel asal organoid sing dikultur ing Transwell statis (TW; inset ing kothak putus-putus putih) versus chip hibrida (foto lengkap paling gedhe) mbandhingake morfologi 2D versus 3D. Sepasang tampilan potongan silang vertikal 2D (sisipan ing pojok tengen ndhuwur; "XZ") uga nuduhake fitur 2D lan 3D. Bilah skala, 100 µm. c Dicetak ulang kanthi ijin saka referensi. 4. Elsevier.
Kontrol bisa disiapake kanthi ngkultur sel sing padha (Caco-2 utawa sel epitel organoid usus) dadi monolayer rong dimensi ing kahanan kultur statis konvensional. Khususé, kekurangan nutrisi bisa kedadeyan amarga kapasitas volume mikrokanal sing winates (yaiku ~4 µL ing saluran ndhuwur ing desain chip usus asli). Mulane, morfologi epitel sadurunge lan sawise aplikasi aliran basolateral uga bisa dibandhingake.
Proses litografi alus kudu ditindakake ing kamar sing resik. Kanggo saben lapisan ing chip (lapisan ndhuwur lan ngisor lan membran) lan chip hibrida, photomask sing beda digunakake lan digawe ing wafer silikon sing kapisah amarga dhuwure microchannels beda. Dhuwur target microchannels ndhuwur lan ngisor usus ing chip yaiku 500 µm lan 200 µm. Dhuwur target saluran chip hibrida yaiku 200 µm.
Lebokake wafer silikon 3 inci ing piring sing wis diisi aseton. Goyangake piring alon-alon suwene 30 detik, banjur garingake wafer kanthi diangin-angin. Pindahake wafer menyang piring sing wis diisi IPA, banjur puter piring suwene 30 detik kanggo ngresiki.
Larutan piranha (campuran hidrogen peroksida lan asam sulfat pekat, 1:3 (vol/vol)) bisa digunakake kanggo ngoptimalake penghapusan residu organik saka permukaan wafer silikon.
Larutan piranha iku korosif banget lan ngasilake panas. Pancegahan keamanan tambahan dibutuhake. Kanggo mbuwang limbah, adhemke larutan kasebut lan pindhah menyang wadhah limbah sing resik lan garing. Gunakake wadhah sekunder lan wenehi label wadhah limbah kanthi bener. Tututi pandhuan keamanan fasilitas kanggo prosedur sing luwih rinci.
Dehidrasi wafer kanthi nyelehake ing hot plate 200 °C suwene 10 menit. Sawise dehidrasi, wafer diocok kaping lima ing udara supaya adhem.
Tuangna ~10 g photoresist SU-8 2100 ing tengah wafer silikon sing wis diresiki. Gunakake pinset kanggo nyebarake photoresist kanthi rata ing wafer. Kadhangkala lebokake wafer ing hot plate 65°C supaya photoresist ora lengket lan luwih gampang disebar. Aja nyelehake wafer langsung ing hot plate.
SU-8 disebarake kanthi rata ing wafer kanthi mbukak lapisan spin. Program rotasi SU-8 sing mlebu sajrone 5-10 detik supaya nyebar ing 500 rpm kanthi akselerasi 100 rpm/s. Setel spin utama kanggo pola kekandelan 200 µm ing 1.500 rpm, utawa entuk kekandelan 250 µm (nggawe dhuwur 500 µm kanggo lapisan ndhuwur usus ing chip; deleng "Langkah-langkah penting" ing ngisor iki) disetel ing akselerasi 300 rpm/s 30 detik ing 1.200 rpm.
Kacepetan puteran utama bisa diatur miturut kekandelan target pola SU-8 ing wafer silikon.
Kanggo nggawe pola SU-8 kanthi dhuwur 500 µm kanggo lapisan ndhuwur usus ing chip, langkah-langkah spin coating lan soft bake saka Kothak iki (langkah 7 lan 8) diulang kanthi runtut (deleng langkah 9) kanggo ngasilake rong lapisan SU-8 kanthi kandel 250 µm, sing bisa dilapisi lan digabungake kanthi paparan UV ing langkah 12 saka kothak iki, nggawe lapisan kanthi dhuwur 500 µm.
Panggang wafer sing dilapisi SU-8 kanthi alon-alon kanthi nyelehake wafer kasebut ing hot plate kanthi suhu 65 °C suwene 5 menit, banjur ganti setelan dadi 95 °C lan inkubasi maneh suwene 40 menit.
Kanggo entuk dhuwur pola SU-8 500 μm ing microchannel ndhuwur, baleni langkah 7 lan 8 kanggo ngasilake rong lapisan SU-8 sing kandele 250 μm.
Nggunakake UV Mask Aligner, lakoni uji lampu miturut pandhuan pabrikan kanggo ngetung wektu paparan wafer. (wektu paparan, ms) = (dosis paparan, mJ/cm2)/(daya lampu, mW/cm2).
Sawise nemtokake wektu paparan, pasang photomask ing wadhah masker aligner masker UV lan pasang photomask ing wafer sing dilapisi SU-8.
Selehake permukaan photomask sing wis dicetak langsung ing sisih wafer silikon sing dilapisi SU-8 kanggo nyuda dispersi UV.
Paparake wafer lan photomask sing dilapisi SU-8 kanthi vertikal menyang cahya UV 260 mJ/cm2 sajrone wektu paparan sing wis ditemtokake (deleng langkah 10 ing kothak iki).
Sawisé kena sinar UV, wafer silikon sing dilapisi SU-8 dipanggang ing suhu 65°C suwéné 5 menit lan 95°C suwéné 15 menit ing saben hot plate kanggo nggawé pola kanthi dhuwur 200 μm. Tambah wektu pasca-panggang ing suhu 95 °C nganti 30 menit kanggo nggawé pola kanthi dhuwur 500 µm.
Pengembang diwutahake menyang wadhah kaca, lan wafer sing wis dipanggang dilebokake ing wadhah kasebut. Volume pengembang SU-8 bisa beda-beda gumantung saka ukuran piring kaca. Priksa manawa nggunakake pengembang SU-8 sing cukup kanggo mbusak SU-8 sing ora kena pengaruh kanthi lengkap. Contone, nalika nggunakake wadhah kaca diameter 150 mm kanthi kapasitas 1 L, gunakake ~300 mL pengembang SU-8. Kembangake cetakan sajrone 25 menit kanthi rotasi alon-alon sok-sok.
Bilas cetakan sing wis dikembangake nganggo ~10 mL pangembang seger, banjur nyemprotake larutan nganggo IPA nganggo pipet.
Lebokake wafer ing pembersih plasma lan kena plasma oksigen (gas atmosfer, tekanan target 1 × 10−5 Torr, daya 125 W) suwene 1,5 menit.
Selehake wafer ing desikator vakum kanthi slide kaca ing njero. Wafer lan slide bisa diselehake jejer-jejer. Yen desikator vakum dipérang dadi sawetara lapisan dening piring, lebokake slide ing ruang ngisor lan wafer ing ruang ndhuwur. Selehake 100 μL larutan trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silana ing slide kaca lan aplikasi vakum kanggo silanisasi.
Cairkan botol sel Caco-2 sing beku ing bak banyu suhu 37°C, banjur pindahkan sel sing wis cair menyang labu T75 sing isine 15 mL medium Caco-2 sing wis dipanasake ing suhu 37°C.
Kanggo ngliwati sel Caco-2 ing konfluensi ~90%, angetna dhisik medium Caco-2, PBS, lan 0,25% tripsin/1 mM EDTA ing bak banyu 37°C.
Aspirasi medium nganggo aspirasi vakum. Cuci sel kaping pindho nganggo 5 mL PBS anget kanthi mbaleni aspirasi vakum lan nambahake PBS anyar.