Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት ለCSS የተወሰነ ድጋፍ አለው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የዘመነ አሳሽ እንዲጠቀሙ (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳሃኝነት ሁነታን እንዲያጠፉ) እንመክራለን። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን።
የሰው አንጀት ሞርፎጄኔሲስ የ3-ል ኤፒተልየል ማይክሮአርክቴክቸር እና የቦታ አደረጃጀት ክሪፕ-ቪለስ ባህሪያትን ያቋቁማል። ይህ ልዩ መዋቅር በመሠረታዊ ክሪፕቱ ውስጥ ያለውን የስቴም ሴል ቦታ ከውጭ ማይክሮባላዊ አንቲጂኖች እና ከሜታቦላይቶቻቸው በመጠበቅ የአንጀት ሆሞስታሲስን ለመጠበቅ ያስፈልጋል። በተጨማሪም የአንጀት ቪሊ እና የሚወጣው ንፍጥ በአንጀት ሙሲል ወለል ላይ የመከላከያ መከላከያ ያለው ተግባራዊ የተለዩ ኤፒተልየል ሴሎችን ያመነጫሉ። ስለዚህ፣ የ3-ል ኤፒተልየል መዋቅሮችን እንደገና መፍጠር ለኢንቪትሮ የአንጀት ሞዴሎች ግንባታ ወሳኝ ነው። በተለይም፣ ኦርጋኒክ ሚሜቲክ ጉት-ኦን-ቺፕ የአንጀት ኤፒተልየም ድንገተኛ 3-ል ሞርፎጄኔሲስን በተሻሻለ የፊዚዮሎጂ ተግባራት እና ባዮሜካኒክስ ሊያመጣ ይችላል። እዚህ፣ በአንጀት ውስጥ በማይክሮፍሉይዲክ ቺፕ ላይ እንዲሁም በትራንስዌል ውስጥ በተከተተ ድብልቅ ቺፕ ውስጥ የአንጀት ሞርፎጄኔሲስን በጠንካራ ሁኔታ ለማነሳሳት የሚባዛ ፕሮቶኮል እናቀርባለን። የመሳሪያ ማምረቻ፣ በባህላዊ ቅንብሮች እንዲሁም በማይክሮፍሉይዲክ መድረክ ላይ የካኮ-2 ወይም የአንጀት ኦርጋኖይድ ኤፒተልየል ሴሎችን ለማልማት፣ የ3-ል ሞርፎጄኔሲስን መነሳሳት እና የተቋቋመ 3-ል ባህሪን በተመለከተ ዝርዝር ዘዴዎችን እንገልፃለን። ኤፒተሊያ በርካታ የምስል ዘዴዎችን በመጠቀም። ይህ ፕሮቶኮል ለ5 ቀናት የባሶላተር ፈሳሽ ፍሰትን በመቆጣጠር ተግባራዊ የአንጀት ማይክሮአርክቴክቸርን እንደገና ማደስን ያስገኛል። የእኛ የኢንቪትሮ ሞርፎጄኔሲስ ዘዴ ፊዚዮሎጂያዊ ተዛማጅነት ያላቸውን የሸር ውጥረት እና ሜካኒካል እንቅስቃሴን ይጠቀማል እና ሌሎች ነባር ቴክኒኮችን በተሻለ ሁኔታ ሊወጣ የሚችል ውስብስብ የሕዋስ ምህንድስና ወይም ማኔጅመንት አያስፈልገውም። የታቀደው ፕሮቶኮላችን ለባዮሜዲካል ምርምር ማህበረሰብ ሰፊ አንድምታ ሊኖረው እንደሚችል እናስባለን፣ ይህም ለባዮሜዲካል፣ ለክሊኒካዊ እና ለመድኃኒት አፕሊኬሽኖች በብልቃጥ ውስጥ የ3-ል አንጀት ኤፒተልየል ንብርብሮችን እንደገና ለማደስ ዘዴን ይሰጣል።
ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የአንጀት ኤፒተልየል ካኮ-2 ሴሎች በጉበት-ኦን-ቺፕ1፣2፣3፣4፣5 ወይም ባለሁለት ሽፋን ማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያዎች6፣7 ውስጥ የሚበቅሉ የአንጀት ኤፒተልየል ካኮ-2 ሴሎች መሰረታዊውን ዘዴ በግልፅ ሳይረዱ በብልቃጥ ውስጥ ድንገተኛ የ3D ሞርፎጄኔሲስ ሊያደርጉ ይችላሉ። በቅርብ ጊዜ ባደረግነው ጥናት፣ ከባህል መሳሪያዎች ውስጥ ቤሶላተራል የሚወጡ ሞርፎጅን ተቃዋሚዎችን ማስወገድ አስፈላጊ እና በካኮ-2 እና በታካሚዎች የተገኙ የአንጀት ኦርጋኖይድስ ታይቷል፣ ይህም በብልቃጥ ውስጥ የ3D ኤፒተልየል ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት በቂ ነው። ኤፒተልያል ሴሎች ተረጋግጠዋል። በዚህ ጥናት፣ በተለይም በጉበት-ላይ-ቺፕ እና ትራንስዌል ማስገቢያዎችን በያዙ የተሻሻሉ ማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያዎች ውስጥ ኃይለኛ የWnt ተቃዋሚ ዲክኮፍ-1 (DKK-1) በሴል ምርት እና በማጎሪያ ስርጭት ላይ አተኩረናል፣ ይህም "ሃይብሪድ ቺፕ" በመባል ይታወቃል። ውጫዊ የWnt ተቃዋሚዎች (እንደ DKK-1፣ Wnt repressor 1፣ የተፈጨ frizzled-related protein 1 ወይም Soggy-1 ያሉ) ወደ ላይ-ቺፕ አንጀት መጨመር ሞርፎጄኔሲስን እንደሚገታ ወይም አስቀድሞ የተዋቀረውን 3D epithelial ንብርብር እንደሚያስተጓጉል እናሳያለን፣ ይህም በባህል ወቅት የሚፈጠረው ተቃዋሚ ውጥረት በብልቃጥ ውስጥ የአንጀት ሞርፎጄኔሲስን ተጠያቂ እንደሚያደርገው ይጠቁማል። ስለዚህ፣ በኤፒተልያል በይነገጽ ላይ ጠንካራ ሞርፎጄኔሲስን ለማሳካት ተግባራዊ አቀራረብ በባሶላተራል ክፍል ውስጥ የWnt ተቃዋሚዎችን መጠን በንቃት በማጠብ (ለምሳሌ፣ በጉበት-ላይ-ቺፕ ወይም በሃይብሪድ-ላይ-ቺፕ መድረኮች) ወይም ስርጭትን ማስወገድ ወይም በትንሹ ማቆየት ነው። ቤሶላተራል ሚዲያ (ለምሳሌ፣ ከትራንስዌል ወደ ትላልቅ ቤሶላተራል ማጠራቀሚያዎች ከገባ)።
በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ፣ አንጀት-በ-ቺፕ ማይክሮዲቪዥኖችን እና ትራንስዌል-ኢንሴክትብል ዲቃላ ቺፕስን (ደረጃ 1-5) በፖሊዲሜቲልሲሎክሳን (PDMS) ላይ የተመሰረቱ ባለ ቀዳዳ ሽፋኖች (ደረጃ 6A፣ 7A፣ 8፣ 9) ወይም የትራንስዌል ማስገቢያዎች (ደረጃ 6B፣ 7B፣ 8፣ 9) ላይ የአንጀት ኤፒተልየል ሴሎችን ለማልማት ዝርዝር ዘዴ እናቀርባለን እና በብልቃጥ ውስጥ ባለ 3D ሞርፎጄኔሲስን አስከትሏል (ደረጃ 10)። እንዲሁም በርካታ የምስል ዘዴዎችን (ደረጃ 11-24) በመተግበር የቲሹ-ተኮር ሂስቶጄኔሲስ እና የዘር መስመር ጥገኛ የሴል ልዩነትን የሚያመለክቱ የሴሉላር እና የሞለኪውላር ባህሪያትን ለይተናል። እንደ ካኮ-2 ወይም የአንጀት ኦርጋኖይድ ያሉ የሰው አንጀት ኤፒተልየል ሴሎችን በመጠቀም ሞርፎጄኔሲስን እናነሳሳለን፣ ባለ ቀዳዳ ሽፋኖችን ወለል ማሻሻል፣ የ2D ሞኖላይየሮች መፈጠር፣ እና የአንጀት ባዮሜካኒካል ማይክሮኢንቪሮንመንት መባዛትን ጨምሮ በሁለት የባህል ቅርፀቶች ቴክኒካዊ ዝርዝሮችን እናስወግዳለን። ከ2D ኤፒተልየል ሞኖላይየሮች የ3D ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት፣ አስወግደናል። ሞርፎጅን ተቃዋሚዎች በሁለቱም የተለማመዱ ቅርጾች መካከለኛውን ወደ ባህሉ መሰረታዊ ክፍል በማዘዋወር። በመጨረሻም፣ ሞርፎጅን-ጥገኛ የሆነ የኤፒተልየል እድገትን፣ ቁመታዊ አስተናጋጅ-ማይክሮባዮምን የጋራ ባህሎችን፣ በሽታ አምጪ ኢንፌክሽንን፣ የእብጠት ጉዳትን፣ የኤፒተልየል መከላከያ ችግርን እና ፕሮባዮቲክ-ተኮር ሕክምናዎችን ምሳሌ ለማድረግ ሊያገለግል የሚችል እንደገና የሚፈጠር የ3-ልኬት ኤፒተልየል ንብርብር ጥቅምን የሚያሳይ ውክልና እናቀርባለን።
የእኛ ፕሮቶኮል በመሠረታዊ (ለምሳሌ፣ የአንጀት ሙሲካል ባዮሎጂ፣ የስቴም ሴል ባዮሎጂ እና የእድገት ባዮሎጂ) እና ተግባራዊ ምርምር (ለምሳሌ፣ ቅድመ-ክሊኒካዊ የመድኃኒት ምርመራ፣ የበሽታ ሞዴሊንግ፣ የቲሹ ምህንድስና እና የጨጓራ ​​​​ህክምና) ሰፊ ተጽእኖ ላላቸው ሰፊ የሳይንስ ሊቃውንት ጠቃሚ ሊሆን ይችላል። በብልቃጥ ውስጥ የአንጀት ኤፒተልየም 3D ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት የፕሮቶኮላችን ዳግም መባዛት እና ጠንካራነት ምክንያት፣ የቴክኒክ ስልታችን በአንጀት እድገት፣ ዳግም መወለድ ወይም ሆሞስታሲስ ወቅት የሕዋስ ምልክት ተለዋዋጭነትን ለሚያጠኑ ታዳሚዎች ሊሰራጭ እንደሚችል እናስባለን። በተጨማሪም፣ ፕሮቶኮላችን እንደ ኖሮቫይረስ 8፣ ከባድ አጣዳፊ የመተንፈሻ አካላት ሲንድሮም ኮሮናቫይረስ 2 (SARS-CoV-2)፣ ክሎስትሪዲየም ዲፊሲል፣ ሳልሞኔላ ታይፊሙሪየም 9 ወይም ቪብሪዮ ኮሌራ ባሉ የተለያዩ ተላላፊ ወኪሎች ስር ኢንፌክሽንን ለመመርመር ጠቃሚ ነው። የበሽታ ፓቶሎጂ እና በሽታ አምጪ ተመልካች ታዳሚዎችም ጠቃሚ ናቸው። በቺፕ አንጀት ማይክሮፊዚዮሎጂ ስርዓት መጠቀም ረጅም ጊዜ አብሮ መስራት 10 እና በጨጓራና ትራክት (GI) ትራክት ውስጥ የአስተናጋጅ መከላከያ፣ የበሽታ መከላከያ ምላሾች እና ከበሽታ አምጪ ተህዋሲያን ጋር የተያያዘ ጉዳት ጥገናን ሊፈቅድ ይችላል። 11. ከፈሳሽ አንጀት ሲንድሮም፣ ሴሊካክ በሽታ፣ የክሮንስ በሽታ፣ አልሰረቲቭ ኮላይትስ፣ ፑቺቲስ ወይም የሚያበሳጭ የአንጀት ሲንድሮም ጋር የተያያዙ ሌሎች የጂአይ በሽታዎች በታካሚው ባለ 3D አንጀት ኤፒተልየል ንብርብሮች በመጠቀም ሲዘጋጁ ሊመሰሉ ይችላሉ፣ እነዚህ በሽታዎች ቪሎስ እየመነመኑ፣ ክሪፕቲ አጭርነት፣ የሙካሊ ጉዳት ወይም የተዳከመ የኤፒተልየል መከላከያ ያካትታሉ። ባዮፕሲ ወይም ከግንዱ ሴል የተገኙ የአንጀት ኦርጋኖይድስ12,13። የበሽታውን አካባቢ የበለጠ ውስብስብነት በተሻለ ሁኔታ ለመምሰል፣ አንባቢዎች እንደ የታካሚ ዳርቻ የደም ሞኖኑክሌር ሴሎች (PBMCs) ያሉ ከበሽታ ጋር የተያያዙ የሕዋስ ዓይነቶችን በ3D አንጀት ቪለስ-ክሪፕቲ ማይክሮአርክቴክቸርስ የያዙ ሞዴሎች ላይ ማከል ሊያስቡበት ይችላሉ። ቲሹ-ተኮር የበሽታ መከላከያ ሴሎች፣ 5.
የ3-ልኬት ኤፒተልየል ማይክሮ መዋቅር ያለ ክፍልፋይ ሂደት ሊስተካከል እና ሊታይ ስለሚችል፣ በቦታ ትራንስክሪፕቶሚክስ እና በከፍተኛ ጥራት ወይም በከፍተኛ ጥራት ምስል ላይ የሚሰሩ ተመልካቾች በኤፒተልየል ኒኮች ላይ የጂኖች እና ፕሮቲኖች የቦታ ቴምፖራል ተለዋዋጭነት ካርታችንን ሊፈልጉ ይችላሉ። በቴክኖሎጂ ላይ ፍላጎት አላቸው። ለማይክሮባላዊ ወይም ለበሽታ መከላከያ ማነቃቂያዎች ምላሽ። በተጨማሪም፣ የአንጀት ሆሞስታሲስን የሚያስተባብረው ቁመታዊ የአስተናጋጅ-ማይክሮባዮም ክሮስቶክ 10፣ 14 ​​በ3-ልኬት አንጀት ሙኮሳል ንብርብር ውስጥ በተለይም በጉበት-ላይ-ቺፕ ውስጥ የተለያዩ የማይክሮባላዊ ዝርያዎችን፣ የማይክሮባላዊ ማህበረሰቦችን ወይም የፌካል ማይክሮባዮታን በጋራ በማልማት ሊቋቋም ይችላል። በመድረኩ ውስጥ። ይህ አካሄድ በተለይ ቀደም ሲል ያልሰለጠነ የአንጀት ማይክሮባዮምን ለማልማት ለሚፈልጉ የ mucosal immunology፣ የጨጓራና የአንጀት ማይክሮባዮምን፣ የባህልና የክሊኒካል ማይክሮባዮሎጂን ለሚያጠኑ ታዳሚዎች ማራኪ ነው። የእኛ የኢንቪትሮ ሞርፎጄኔሲስ ፕሮቶኮል እንደ 24፣ 96 ወይም 384 የጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ ያሉ ባለብዙ ጉድጓድ ማስገቢያዎች ባሉ ሊለኩ የሚችሉ የባህል ቅርጸቶች ሊስተካከል የሚችል ከሆነ፣ ፕሮቶኮሉ ለምግብ ኢንዱስትሪው የመድኃኒት፣ የባዮሜዲካል ወይም ከፍተኛ-ውጤት ማጣሪያ ወይም የማረጋገጫ መድረኮችን ለሚያዘጋጁ ሰዎችም ሊሰራጭ ይችላል። እንደ መርህ ማረጋገጫ፣ በቅርቡ ወደ 24-ጉድጓድ ሳህን ቅርጸት የሚስተካከል ባለብዙ-ውጤት ሞርፎጄኔሲስ ስርዓት አዋጭነትን አሳይተናል። በተጨማሪም፣ በርካታ የኦርጋን-ኦን-ቺፕ ምርቶች ለገበያ ተገብተዋል16፣17፣18። ስለዚህ፣ የኢንቪትሮ ሞርፎጄኔሲስ ዘዴያችንን ማረጋገጥ በብዙ የምርምር ላቦራቶሪዎች፣ በኢንዱስትሪ ወይም በመንግስት እና በተቆጣጣሪ ኤጀንሲዎች ሊፋጠን እና መድኃኒቶችን ወይም ባዮቴራፒዩቲክስን ለመፈተሽ በትራንስክሪፕቶሚክ ደረጃ የውስጠ-ጉድጓድ ሞርፎጄኔሲስን ሴሉላር ዳግም ፕሮግራም ማድረግን ለመረዳት ሊተገበር ይችላል። የመድኃኒት እጩዎች እና መጓጓዣዎች የተገመገሙት በ3D የአንጀት ተተኪዎች ወይም በአንጀት ሞርፎጄኔሲስ ሂደት ውስጥ የመራባት እድልን ለመገምገም ብጁ ወይም የንግድ የአካል ክፍሎች-በ-ቺፕ ሞዴሎችን በመጠቀም ነው።
የተወሰኑ የሰው ልጅ ተዛማጅ የሆኑ የሙከራ ሞዴሎች የአንጀት ኤፒተልየል ሞርፎጄኔሲስን ለማጥናት ጥቅም ላይ ውለዋል፣ ይህም በዋናነት በብልቃጥ ውስጥ 3D ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት ተግባራዊ ሊሆኑ የሚችሉ ፕሮቶኮሎች ባለመኖራቸው ነው። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ ስለ አንጀት ሞርፎጄኔሲስ ያለው አብዛኛው የአሁኑ እውቀት በእንስሳት ጥናቶች ላይ የተመሠረተ ነው (ለምሳሌ፣ zebrafish20፣ አይጦች21 ወይም ዶሮዎች22)። ሆኖም፣ ጉልበት የሚጠይቁ እና ወጪ የሚጠይቁ ናቸው፣ በሥነ ምግባር አጠያያቂ ሊሆኑ ይችላሉ፣ እና ከሁሉም በላይ ደግሞ የሰው ልጅ የእድገት ሂደቶችን በትክክል አይወስኑም። እነዚህ ሞዴሎች በብዙ መንገድ ሊሰፋ በሚችል መንገድ የመሞከር ችሎታቸው በጣም የተገደቡ ናቸው። ስለዚህ፣ በብልቃጥ ውስጥ 3D የቲሹ መዋቅሮችን እንደገና ለማቋቋም የኛ ፕሮቶኮል በቪቮ የእንስሳት ሞዴሎች እንዲሁም በሌሎች ባህላዊ የማይንቀሳቀሱ 2D የሴል ባህል ሞዴሎች የተሻለ ውጤት ያስገኛል። ቀደም ሲል እንደተገለጸው፣ 3D ኤፒተልየል መዋቅሮችን መጠቀም በክሪፕቲ-ቪልለስ ዘንግ ውስጥ የተለያዩ የ mucosal ወይም የበሽታ መከላከያ ማነቃቂያዎችን ምላሽ ለመስጠት የተለያዩ ሴሎችን የቦታ አካባቢያዊነት እንድንመረምር አስችሎናል። 3D ኤፒተልየል ሽፋኖች ማይክሮባላዊ ሴሎች ለአስተናጋጆች ምክንያቶች ምላሽ የቦታ ክፍተቶችን እና ሥነ ምህዳራዊ ዝግመተ ለውጥን እንዴት እንደሚወዳደሩ ለማጥናት ቦታ ሊሰጡ ይችላሉ (ለምሳሌ፣ ውስጣዊ እና ውጫዊ የ mucous ሽፋኖች፣ የ IgA ፈሳሽ እና ፀረ-ተሕዋስያን ፔፕታይዶች)። በተጨማሪም፣ የ3-ልኬት ኤፒተልየል ሞርፎሎጂ የአንጀት ማይክሮባዮታ ማህበረሰቦቹን እንዴት እንደሚያዋቅር እና በመሠረታዊ ክሪፕቶች ውስጥ የሴል አደረጃጀትን እና የስቴም ሴል ኖኮችን የሚቀርጹ ማይክሮባላይቶችን (ለምሳሌ፣ አጭር ሰንሰለት የሰባ አሲዶች) እንዴት እንደሚያመርት እንድንረዳ ያስችለናል። እነዚህ ባህሪያት ሊታዩ የሚችሉት 3-ልኬት ኤፒተልየል ንብርብሮች በብልቃጥ ውስጥ ሲቋቋሙ ብቻ ነው።
ከኛ የ3-ል አንጀት ኤፒተልየል አወቃቀሮችን ከመፍጠር ዘዴ በተጨማሪ በርካታ በብልቃጥ ውስጥ ያሉ ዘዴዎች አሉ። የአንጀት ኦርጋኖይድ ባህል በተወሰኑ የሞርፎጅን ሁኔታዎች ውስጥ የአንጀት ግንድ ሴሎችን በማልማት ላይ የተመሠረተ ዘመናዊ የቲሹ ምህንድስና ቴክኒክ ነው23,24,25። ሆኖም ግን፣ የአንጀት ሉመን በኦርጋኖይድ ውስጥ ስለተዘጋ እና ስለዚህ እንደ ማይክሮባይት ሴሎች ወይም ውጫዊ አንቲጂኖች ያሉ የብርሃን ክፍሎችን ማስተዋወቅ የተገደበ ስለሆነ የ3-ል ኦርጋኖይድ ሞዴሎችን መጠቀም ብዙውን ጊዜ ፈታኝ ነው። የኦርጋኖይድ ሉመንስ ተደራሽነት በማይክሮኢንጀክተር ሊሻሻል ይችላል፣26,27 ነገር ግን ይህ ዘዴ ወራሪ እና ጉልበት የሚጠይቅ እና ለማከናወን ልዩ እውቀትን ይፈልጋል። በተጨማሪም፣ በስታቲስቲክ ሁኔታዎች ውስጥ በሃይድሮጄል ስካፎልድስ ውስጥ የሚጠበቁ ባህላዊ የኦርጋኖይድ ባህሎች በቪቮ ውስጥ ንቁ ባዮሜካኒክስን በትክክል አያንፀባርቁም።
በርካታ የምርምር ቡድኖች የሚጠቀሙባቸው ሌሎች አቀራረቦች በጄል ወለል ላይ የተነጠሉ የሰው አንጀት ሴሎችን በማልማት የአንጀት ኤፒተልየል መዋቅርን ለመምሰል አስቀድሞ የተዋቀሩ 3D ሃይድሮጄል ስካፎልዶችን ይጠቀማሉ። በ3D የታተሙ፣ ማይክሮ-ሚልድ ወይም በሊቶግራፊያዊ መንገድ የተፈጠሩ ሻጋታዎችን በመጠቀም የሃይድሮጄል ስካፎልዶችን ይሠሩ። ይህ ዘዴ በፊዚዮሎጂያዊ ተዛማጅ የሞርፎጅን ግሬዲየሞች ያሉት የተነጠሉ ኤፒተልየል ሴሎችን በብልቃጥ ውስጥ በራስ የተደራጀ ዝግጅት ያሳያል፣ ከፍተኛ ገጽታ ጥምርታ ኤፒተልየል መዋቅር እና ስትሮማ-ኤፒተልየል ክሮስቶክ በስካፎል ውስጥ ስትሮማል ሴሎችን በማካተት ይመሰርታል። ሆኖም፣ የቅድመ-ተዋቀሩ ስካፎልዶች ተፈጥሮ ድንገተኛ የሞርፎጄኔቲክ ሂደትን እራሱን እንዳያሳይ ሊያግድ ይችላል። እነዚህ ሞዴሎች እንዲሁም የአንጀት ሴሎች ሞርፎጄኔሲስን ማለፍ እና የፊዚዮሎጂ ተግባር ማግኘት የሚያስፈልጋቸውን የፈሳሽ መሸርሸር ጭንቀት ይጎድላቸዋል። ሌላ የቅርብ ጊዜ ጥናት በማይክሮፍሉይድክ መድረክ ውስጥ የሃይድሮጄል ስካፎልዶችን እና በሌዘር-ኢቺንግ ቴክኒኮችን በመጠቀም የተቀረጹ የአንጀት ኤፒተልየል መዋቅሮችን ተጠቅሟል። የአይጥ አንጀት ኦርጋኖይድስ የአንጀት ቱቦ አወቃቀሮችን ለመፍጠር የተቀረጹ ቅጦችን ይከተላሉ፣ እና የውስጥ-ሉሚናል ፈሳሽ ፍሰት በማይክሮፍሉይድክስ ሞጁል እንደገና ሊገለበጥ ይችላል። ሆኖም፣ ይህ ሞዴል ሁለቱም አይታዩም። ድንገተኛ የሞርፎጄኔቲክ ሂደቶችም ሆነ የአንጀት ሜካኖባዮሎጂካል እንቅስቃሴዎችን አያካትቱም። ከተመሳሳይ ቡድን የተውጣጡ የ3D ህትመት ቴክኒኮች ድንገተኛ የሞርፎጄኔቲክ ሂደቶችን ያካተቱ ጥቃቅን የአንጀት ቱቦዎችን መፍጠር ችለዋል። በቱቦው ውስጥ የተለያዩ የአንጀት ክፍሎች ውስብስብ መፈጠር ቢኖርም፣ ይህ ሞዴል የብርሃን ፈሳሽ ፍሰት እና ሜካኒካል መበላሸት የለውም። በተጨማሪም፣ የሞዴል ኦፕሬቲንግ አቅም ሊገደብ ይችላል፣ በተለይም የባዮፕሪንቲንግ ሂደቱ ከተጠናቀቀ በኋላ፣ የሙከራ ሁኔታዎችን ወይም ከሴል-ወደ-ሴል መስተጋብሮችን ያዛባል። በምትኩ፣ የቀረበው ፕሮቶኮል ድንገተኛ የአንጀት ሞርፎጄኔሲስን፣ ፊዚዮሎጂያዊ ተዛማጅ የሸር ጭንቀትን፣ የአንጀት እንቅስቃሴን የሚመስሉ ባዮሜካኒክስን፣ ገለልተኛ የአፕቲካል እና ቤሶላተራል ክፍሎችን ተደራሽነት እና የሞዱላሪቲ ውስብስብ ባዮሎጂያዊ ማይክሮ አካባቢዎችን እንደገና መፍጠርን ይሰጣል። ስለዚህ፣ የእኛ በብልቃጥ ውስጥ 3D የሞርፎጄኔሲስ ፕሮቶኮል አሁን ያሉትን ዘዴዎች ተግዳሮቶች ለማሸነፍ ተጨማሪ አቀራረብን ሊሰጥ ይችላል።
ፕሮቶኮላችን ሙሉ በሙሉ በ3D ኤፒተልየል ሞርፎጄኔሲስ ላይ ያተኮረ ሲሆን በባህል ውስጥ ኤፒተልየል ሴሎች ብቻ ሲሆኑ እንደ ሜሴንቺማል ሴሎች፣ ኢንዶቴሊየል ሴሎች እና የበሽታ መከላከያ ሴሎች ያሉ ሌሎች የአከባቢ ሴሎች አይነቶች የሉም። ቀደም ሲል እንደተገለጸው፣ የፕሮቶኮላችን ዋና ክፍል በገባበት መካከለኛ ቤሶላተር በኩል የሚወጡትን ሞርፎጅን አጋቾች በማስወገድ የኤፒተልየል ሞርፎጄኔሲስ መነሳሳት ነው። የአንጀት-በ-ቺፕ እና ሃይብሪድ-በ-አንድ-ቺፕ ጠንካራ ሞዱላሪቲ የማይወዛወዘውን 3D ኤፒተልየል ንብርብር እንደገና ለመፍጠር ቢያስችለንም፣ እንደ ኤፒተልየል-ሜሴንቺማል መስተጋብሮች33,34፣ ከሴል ውጭ ማትሪክስ (ECM) ማስቀመጫ 35 ያሉ ተጨማሪ ባዮሎጂያዊ ውስብስብ ነገሮች እና፣ በእኛ ሞዴል፣ በመሠረታዊ ክሪፕቶች ውስጥ የስቴም ሴል ኖችን የሚያስተላልፉ የክሪፕት-ቪለስ ባህሪያት የበለጠ ግምት ውስጥ መግባት አለባቸው። በሜሴንቺም ውስጥ ያሉት የስትሮማል ሴሎች (ለምሳሌ፣ ፋይብሮብላስትስ) በ ECM ፕሮቲኖች ምርት እና በ vivo35,37,38 ውስጥ የአንጀት ሞርፎጄኔሲስን በመቆጣጠር ረገድ ቁልፍ ሚና ይጫወታሉ። የሜሴንቺማል ሴሎች ወደ ሞዴላችን መጨመር የሞርፎጄኔቲክ ሂደቱን እና የሕዋስ ማያያዣን አሻሽሏል ውጤታማነት። የኢንዶቴልያል ንብርብር (ማለትም ካፒላሪዎች ወይም ሊምፋቲክስ) በአንጀት ማይክሮ አካባቢ ውስጥ የሞለኪውላር ትራንስፖርትን በመቆጣጠር ረገድ ትልቅ ሚና ይጫወታል39 እና የበሽታ መከላከያ ሴል ምልመላ40። በተጨማሪም፣ የቲሹ ሞዴሎች ባለብዙ አካል መስተጋብርን ለማሳየት ሲነደፉ በቲሹ ሞዴሎች መካከል ሊገናኙ የሚችሉ የደም ሥር ክፍሎች ቅድመ ሁኔታ ናቸው። ስለዚህ፣ የአካል ክፍል ደረጃ ጥራት ያላቸውን ይበልጥ ትክክለኛ የፊዚዮሎጂ ባህሪያትን ለመምሰል የኢንዶቴልያል ሴሎች መካተት ሊያስፈልጋቸው ይችላል። ከታካሚ የተገኙ የበሽታ መከላከያ ሴሎች እንዲሁም የአንጀት በሽታን በመምሰል ረገድ ተፈጥሯዊ የበሽታ መከላከያ ምላሾችን፣ አንቲጂን አቀራረብን፣ ውስጣዊ ተለዋዋጭ የበሽታ መከላከያ መስቀለኛ መንገድን እና የቲሹ-ተኮር የበሽታ መከላከያዎችን ለማሳየት አስፈላጊ ናቸው።
የሃይብሪድ ቺፖችን መጠቀም ከሆድ-ኦን-ቺፕ የበለጠ ቀላል ነው ምክንያቱም የመሳሪያው ማዋቀር ቀላል ስለሆነ እና የትራንስዌል ማስገቢያዎች አጠቃቀም ሊሰፋ የሚችል የአንጀት ኤፒተልየም ባህል እንዲኖር ያስችላል። ሆኖም ግን፣ በንግድ የሚገኙ የትራንስዌል ማስገቢያዎች ከፖሊስተር ሽፋኖች ጋር የሚለጠፉ አይደሉም እና እንደ ፔሪስታልቲክ ያሉ እንቅስቃሴዎችን ማስመሰል አይችሉም። በተጨማሪም፣ በሃይብሪድ ቺፕ ውስጥ የተቀመጠው የትራንስዌል ማስገቢያ አፒካል ክፍል በአፒካል ጎን ላይ ምንም አይነት የመቁረጥ ጫና ሳይኖር ቋሚ ሆኖ ቆይቷል። በግልጽ ለማየት እንደሚቻለው፣ በአፒካል ክፍል ውስጥ ያሉት የማይንቀሳቀሱ ባህሪያት በሃይብሪድ ቺፕስ ውስጥ የረጅም ጊዜ የባክቴሪያ የጋራ ባህልን እምብዛም አያስችሉም። ሃይብሪድ ቺፖችን በምንጠቀምበት ጊዜ በትራንስዌል ማስገቢያዎች ውስጥ 3D ሞርፎጄኔሲስን በጠንካራ ሁኔታ ልናመጣ ብንችልም፣ የፊዚዮሎጂያዊ ተዛማጅነት ያላቸው ባዮሜካኒክስ እና የአፒካል ፈሳሽ ፍሰት እጥረት ለሊሆኑ አፕሊኬሽኖች የሃይብሪድ ቺፕ መድረኮችን አዋጭነት ሊገድብ ይችላል።
በሰው ልጅ ውስጥ ያለው የክሪፕቶ-ቪለስ ዘንግ ሙሉ በሙሉ እንደገና መገንባት ሙሉ በሙሉ አልተመሠረተም። ሞርፎጄኔሲስ የሚጀምረው ከኤፒተልየል ሞኖላይየር ስለሆነ፣ የ3-ል ማይክሮአርክቴክቸርስ በቪቮ ውስጥ ካለው ክሪፕቶች ጋር ሞርፎሎጂያዊ ተመሳሳይነት አያሳዩም። ምንም እንኳን በማይክሮኢንጂነሪንግ 3-ል ኤፒተልየም ውስጥ ባለው መሰረታዊ ክሪፕቶ ጎራ አቅራቢያ የሚባዙትን የሴል ብዛት ብንገልጽም፣ ክሪፕቱ እና ቪሎውስ ክልሎች በግልጽ አልተለዩም። ምንም እንኳን በቺፕ ላይ ያሉ ከፍተኛ የላይኛው ቻናሎች የማይክሮኢንጂነሪንግ ኤፒተልየም ቁመት እንዲጨምር ቢያደርግም፣ ከፍተኛው ቁመት አሁንም በ~300–400 µm የተገደበ ነው። በትናንሽ እና በትልቁ አንጀት ውስጥ ያለው የሰው ልጅ የአንጀት ክሪፕቶች ትክክለኛ ጥልቀት በቅደም ተከተል ~135 µm እና ~400 µm ነው፣ እና የትንሹ አንጀት ቪሊ ቁመት ~600 µm41 ነው።
ከምስል እይታ አንፃር፣ በሲቱ ውስጥ የ3-ል ማይክሮአርክቴክቸርስ እጅግ በጣም ጥራት ያለው ምስል በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ላይ ብቻ የተወሰነ ሊሆን ይችላል፣ ምክንያቱም ከዓላማው ሌንስ እስከ ኤፒተልየል ንብርብር የሚፈለገው የስራ ርቀት በጥቂት ሚሊሜትር ቅደም ተከተል ላይ ነው። ይህንን ችግር ለማሸነፍ፣ የርቀት ዓላማ ሊያስፈልግ ይችላል። በተጨማሪም፣ የ PDMS ከፍተኛ የመለጠጥ ችሎታ ስላለው የናሙና ዝግጅትን ለመቅረጽ ቀጭን ክፍሎችን መስራት ፈታኝ ነው። በተጨማሪም፣ በቺፕ ላይ ያለው የአንጀት ንብርብር-በንብርብር ማይክሮፋብሪኬሽን በእያንዳንዱ ንብርብር መካከል ቋሚ ማጣበቂያ ስለሚያካትት፣ የኤፒተልየል ንብርብርን ወለል አወቃቀር ለመመርመር የላይኛውን ንብርብር መክፈት ወይም ማስወገድ እጅግ በጣም ፈታኝ ነው። ለምሳሌ፣ የስካኒንግ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (SEM) በመጠቀም።
የፒዲኤምኤስ ሃይድሮፎቢክነት ከሃይድሮፎቢክ ትናንሽ ሞለኪውሎች ጋር በተያያዙ ማይክሮፍሉይዲክ ላይ በተመሰረቱ ጥናቶች ላይ ውስን ምክንያት ሆኗል፣ ምክንያቱም ፒዲኤምኤስ እንደዚህ አይነት ሃይድሮፎቢክ ሞለኪውሎችን በተለይ ሊስብ ስለሚችል። ለፒዲኤምኤስ አማራጮች ከሌሎች ፖሊመሪክ ቁሳቁሶች ጋር ሊታሰቡ ይችላሉ። በአማራጭ፣ የፒዲኤምኤስ የገጽታ ማሻሻያ (ለምሳሌ፣ በሊፖፊሊክ ቁሶች 42 ወይም ፖሊ(ኤቲሊን ግላይኮል) 43 መቀባት) የሃይድሮፎቢክ ሞለኪውሎችን መምጠጥ ለመቀነስ ሊወሰድ ይችላል።
በመጨረሻም፣ የእኛ ዘዴ ከፍተኛ የውጤት ማጣሪያ ወይም "ለሁሉም የሚስማማ" ለተጠቃሚ ምቹ የሆነ የሙከራ መድረክ በማቅረብ ረገድ በደንብ አልተገለፀም። የአሁኑ ፕሮቶኮል በአንድ ማይክሮዲቬሪ ውስጥ የሲሪንጅ ፓምፕ ይፈልጋል፣ ይህም በ CO2 ኢንኩቤተር ውስጥ ቦታ የሚወስድ እና ትላልቅ ሙከራዎችን የሚከላከል ነው። ይህ ገደብ በፈጠራ የባህል ቅርጸቶች (ለምሳሌ፣ 24-ዌል፣ 96-ዌል፣ ወይም 384-ዌል ቀዳዳ ያላቸው ማስገቢያዎች ቀጣይነት ያለው መሙላት እና ቤሶላተር ሚዲያን ማስወገድ የሚፈቅዱ)።
የሰው አንጀት ኤፒተልየም በብልቃጥ ውስጥ ባለ 3-ልኬት ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት፣ ሁለት ትይዩ ማይክሮቻናሎችን እና የላስቲክ ቀዳዳ ያለው ሽፋን ያለው ማይክሮፍሉይዲክ ቺፕ የአንጀት መሳሪያ ተጠቅመን የሉመን-ካፒላሪ በይነገጽ ለመፍጠር ተጠቅመናል። እንዲሁም በትራንስዌል ማስገቢያዎች ላይ በሚበቅሉ ፖላራይዝድ ኤፒተልየል ንብርብሮች ስር ቀጣይነት ያለው ቤሶላተር ፍሰት የሚሰጥ ነጠላ-ቻናል ማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያ (ሃይብሪድ ቺፕ) መጠቀምን እናሳያለን። በሁለቱም መድረኮች፣ የተለያዩ የሰው አንጀት ኤፒተልየል ሴሎች ሞርፎጄኔሲስ የፍሰት አቅጣጫዊ ማዛባትን በመተግበር ሞርፎጅን ተቃዋሚዎችን ከባሶላተር ክፍል ውስጥ ለማስወገድ ሊረጋገጥ ይችላል። አጠቃላይ የሙከራ ሂደት (ምስል 1) አምስት ክፍሎችን ያቀፈ ነው፡ (i) የአንጀት ቺፕ ወይም የትራንስዌል ማስገቢያ ድብልቅ ቺፕ ማይክሮፋብሪኬሽን (ደረጃዎች 1-5፤ ሣጥን 1)፣ (ii) የአንጀት ኤፒተልየል ሴሎች (ካኮ-2 ሴሎች) ወይም የሰው አንጀት ኦርጋኖይድስ ዝግጅት፤ ሳጥኖች 2-5)፣ (iii) የአንጀት ኤፒተልየል ሴሎች በአንጀት ቺፕስ ወይም በድብልቅ ቺፕስ ላይ ባህል (ደረጃዎች 6-9)፣ (iv) የ3D ኤፒተልየል ማይክሮ መዋቅርን ለመለየት በብልቃጥ (ደረጃ 10) እና (v) ውስጥ የ3D ኤፒተልየል ማይክሮ መዋቅርን ለመለየት መነሳሳት (ደረጃዎች 11-24)። በመጨረሻም፣ ተገቢ የሆነ የቁጥጥር ቡድን (ከዚህ በታች ተብራርቷል) የኤፒተልየል ሞርፎጄኔሲስን ከቦታ፣ ጊዜያዊ፣ ሁኔታዊ ወይም የአሠራር ቁጥጥሮች ጋር በማነፃፀር የቪትሮ ሞርፎጄኔሲስን ውጤታማነት ለማረጋገጥ የተነደፈ ነው።
ሁለት የተለያዩ የባህል መድረኮችን ተጠቅመናል፡ ቀጥ ያሉ ቻናሎች ወይም መስመራዊ ያልሆኑ የተጠላለፉ ቻናሎች ያሉት የአንጀት-ላይ-ቺፕ ወይም ትራንስዌል (TW) ማስገቢያዎችን በማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያ ውስጥ የያዙ የተደባለቀ ቺፕስ፣ በሳጥን 1 እና ደረጃ 1 -5 ላይ እንደተገለጸው የተፈጠሩ። “የመሳሪያ ማምረቻ” አንድ ቺፕ ወይም የተደባለቀ ቺፕ ለማዘጋጀት ዋና ዋና እርምጃዎችን ያሳያል።” የሰው አንጀት ኤፒተልያል ሴሎች ባህል” በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለውን የሴል ምንጭ (ካኮ-2 ወይም የሰው አንጀት ኦርጋኖይድ) እና የባህል ሂደትን ያብራራል።“በብልቃጥ ውስጥ ሞርፎጄኔሲስ” Caco-2 ወይም ኦርጋኖይድ የተገኙ ኤፒተልያል ሴሎች በአንጀት ቺፕ ወይም በትራንስዌል የተደባለቀ ቺፕ ማስገቢያዎች ላይ የሚለማመዱበትን አጠቃላይ ደረጃዎች ያሳያል፣ ከዚያም የ3-ል ሞርፎጄኔሲስ መነሳሳት እና ተለይቶ የሚታወቅ የኤፒተልያል መዋቅር መፈጠርን ያሳያል። የፕሮግራሙ ደረጃ ቁጥር ወይም የሳጥን ቁጥር ከእያንዳንዱ ቀስት በታች ይታያል። አፕሊኬሽኑ የተቋቋሙ የአንጀት ኤፒተልያል ንብርብሮች ለምሳሌ በሴል ልዩነት ባህሪ፣ የአንጀት ፊዚዮሎጂ ጥናቶች፣ የአስተናጋጅ-ማይክሮባዮም ሥነ-ምህዳሮች መመስረት እና የበሽታ ሞዴሊንግ ውስጥ እንዴት ጥቅም ላይ ሊውሉ እንደሚችሉ ምሳሌዎችን ይሰጣል። “በሴል ውስጥ የኢሚውኖፍሎረሰንስ ምስሎች” ልዩነት” ኒውክሊየስ፣ ኤፍ-አክቲን እና MUC2 በአንጀት ቺፕ ላይ በሚፈጠረው 3D Caco-2 ኤፒተልየል ንብርብር ውስጥ ይገለፃሉ። የMUC2 ምልክት ማድረጊያ በጎብልት ሴሎች እና ከማከስ ወለል በሚወጣው ሙጫ ውስጥ ይገኛል። በአንጀት ውስጥ ያሉ የፍሎረሰንት ምስሎች ፊዚዮሎጂ የፍሎረሰንት የስንዴ ጀርም አግግሉቲኒንን በመጠቀም ለሲያሊክ አሲድ እና ለN-አሲቲልግሉኮስሚን ቅሪቶች በማቅለም የሚመነጨውን ሙጫ ያሳያሉ። በ"አስተናጋጅ-ማይክሮብ ኮ-ባህሎች" ውስጥ ያሉት ሁለት ተደራራቢ ምስሎች በአንጀት ውስጥ በቺፕ ላይ ተወካይ የአስተናጋጅ-ማይክሮባዮም የጋራ ባህሎችን ያሳያሉ። የግራ ፓነል አረንጓዴ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (GFP) ከማይክሮ ኢንጂነሪንግ 3D Caco-2 ኤፒተልየል ሴሎች ጋር የኢ. ኮላይ የጋራ ባህልን ያሳያል። የቀኝ ፓነል ከ3D Caco-2 ኤፒተልየል ሴሎች ጋር አብሮ የተለማመደውን የGFP ኢ. ኮላይ አካባቢያዊነትን ያሳያል፣ ከዚያም በF-አክቲን (ቀይ) እና ኒውክሊየስ (ሰማያዊ) የኢሚውኖፍሎረሰንስ ቀለም ይከተላል። የበሽታ ሞዴሊንግ በአንጀት እብጠት ቺፕስ ውስጥ ጤናማ እና የሚፈስ አንጀትን ያሳያል በባክቴሪያ አንቲጂኖች (ለምሳሌ፣ ሊፖፖሊካካርዴ፣ LPS) ፊዚዮሎጂያዊ ተግዳሮት ስር እና የበሽታ መከላከያ ሴሎች (ለምሳሌ፣ PBMC፤ አረንጓዴ)። የካኮ-2 ሴሎች ባለ 3-ልኬት ኤፒተልየል ንብርብር ለመመስረት ተቀርፀዋል። የመለኪያ አሞሌ፣ 50 µm። ከታች ረድፍ ላይ ያሉ ምስሎች፡- “የሴሎች ልዩነት” ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር ተስተካክሏል።2. የኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ፤ ከማጣቀሻ 5. NAS ፈቃድ ጋር እንደገና ተባዝቷል፤ “አስተናጋጅ-ማይክሮብ የጋራ ባህል” ከማጣቀሻ 3. NAS ፈቃድ ጋር ተስተካክሏል፤ “የበሽታ ሞዴሊንግ” ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር ተስተካክሏል።5. NAS።
ሁለቱም የአንጀት-ላይ-ቺፕ እና የተዳቀለ ቺፖች የተፈጠሩት በለስላሳ ሊቶግራፊ1,44 እና በSU-8 የተቀረጹ የPDMS ቅጂዎችን በመጠቀም ነው። በእያንዳንዱ ቺፕ ውስጥ ያሉት የማይክሮ ቻናሎች ዲዛይን የሚወሰነው እንደ የሸር ውጥረት እና የሃይድሮዳይናሚክ ግፊት1,4,12 ያሉ ሃይድሮዳይናሚክስን ከግምት ውስጥ በማስገባት ነው። ሁለት የተገጣጠሙ ትይዩ ቀጥ ያሉ ማይክሮ ቻናሎችን የያዘው የመጀመሪያው የአንጀት-ላይ-ቺፕ ዲዛይን (የተራዘመ የውሂብ ምስል 1a) ወደ ውስብስብ የአንጀት-ላይ-ቺፕ (የተራዘመ የውሂብ ምስል 1b) ተለውጧል ይህም የፈሳሽ የመኖሪያ ጊዜን፣ መስመራዊ ያልሆኑ የፍሰት ቅጦችን እና የተለማመዱ ሴሎች ባለብዙ አክሰሻል መበላሸትን ለማነሳሳት ጥንድ የተጠማዘዙ ማይክሮ ቻናሎችን ያካትታል (ምስል 2a-f) 12. የበለጠ ውስብስብ የአንጀት ባዮሜካኒክስ እንደገና መፈጠር ሲያስፈልግ፣ ውስብስብ የአንጀት-ላይ-ቺፕስ መምረጥ ይቻላል። የተዋሃደው የአንጀት-ቺፕ ከዋናው ጋር ሲነጻጸር በተመሳሳይ የኤፒተልየል እድገት ደረጃ በተመሳሳይ የጊዜ ፍሬም ውስጥ 3D ሞርፎጄኔሲስን በከፍተኛ ሁኔታ እንደሚያመጣ አሳይተናል። የጉት-ቺፕ፣ የተለማመደው የሴል አይነት ምንም ይሁን ምን። ስለዚህ፣ የ3-ል ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት፣ መስመራዊ እና ውስብስብ የቺፕ አንጀት ዲዛይኖች ሊለዋወጡ ይችላሉ። በሲሊኮን ሻጋታዎች ላይ በSU-8 ቅጦች የተፈወሱ የPDMS ቅጂዎች ከተፈቱ በኋላ አሉታዊ ባህሪያትን ሰጥተዋል (ምስል 2a)። አንጀትን በቺፕ ላይ ለመስራት፣ የተዘጋጀው የላይኛው የPDMS ንብርብር በቅደም ተከተል ከቀዳዳ PDMS ፊልም ጋር ተጣብቆ ከዚያም ከዝቅተኛው የPDMS ንብርብር ጋር በኮሮና ማከሚያ በመጠቀም በማይቀለበስ ትስስር ተስተካክሏል (ምስል 2ለ–f)። የተደባለቀ ቺፖችን ለመሥራት፣ የተፈወሱ የPDMS ቅጂዎች ከመስታወት ስላይዶች ጋር ተጣብቀዋል፣ ይህም የትራንስዌል ማስገቢያዎችን ማስተናገድ የሚችሉ ነጠላ-ቻናል ማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያዎችን ይፈጥራል (ምስል 2ሰ እና የተራዘመ መረጃ ምስል 2)። የመተሳሰሪያ ሂደቱ የሚከናወነው የPDMS ቅጂ እና የመስታወት ገጽታዎችን በኦክስጅን ፕላዝማ ወይም በኮሮና ህክምና በማከም ነው። ከሲሊኮን ቱቦ ጋር የተያያዘውን ማይክሮፋብሪክ መሳሪያ ከማምከን በኋላ፣ የመሳሪያው ማዋቀር የአንጀት ኤፒተልየምን 3-ልኬት ሞርፎጄኔሲስ ለማከናወን ዝግጁ ነበር (ምስል 2ሰ)።
ሀ፣ የ PDMS ክፍሎችን ከ SU-8 የተሳሉ የሲሊኮን ሻጋታዎች ዝግጅት የሚያሳይ ስዕላዊ መግለጫ። ያልታከመው የ PDMS መፍትሄ በሲሊኮን ሻጋታ (ግራ) ላይ ፈሰሰ፣ በ60°ሴ (መካከለኛ) ደርቆ (በስተቀኝ) ተወገደ። የተወገደው PDMS ወደ ቁርጥራጮች ተቆርጦ ለተጨማሪ ጥቅም ታጥቧል። ለ፣ የ PDMS የላይኛውን ንብርብር ለማዘጋጀት የሚያገለግል የሲሊኮን ሻጋታ ፎቶግራፍ። c፣ የ PDMS ቀዳዳ ሽፋን ለመፍጠር የሚያገለግል የሲሊኮን ሻጋታ ፎቶግራፍ።d፣ የላይኛው እና የታችኛው የ PDMS ክፍሎች እና የተገጣጠመው በቺፕ የአንጀት መሳሪያ ላይ ተከታታይ ፎቶግራፎች። e፣ የላይኛው፣ የሽፋኑ እና የታችኛው የ PDMS ክፍሎች አሰላለፍ ስዕላዊ መግለጫ። እያንዳንዱ ንብርብር በማይቀለበስ ሁኔታ በፕላዝማ ወይም በኮሮና ህክምና የተሳሰረ ነው። f፣ የተገጣጠሙ የተጠላለፉ ማይክሮ ቻናሎች እና የቫኩም ክፍሎች ያሉት የተመረተው የአንጀት-በ-ቺፕ መሳሪያ ስዕላዊ መግለጫ። g፣ ለማይክሮፍሉይድ ሴል ባህል የአንጀት-በ-ቺፕ ማዋቀር። በሲሊኮን ቱቦ እና በመርፌ በተሰበሰበ ቺፕ ላይ የተመረተው አንጀት በሽፋን ወረቀት ላይ ተተክሏል። የቺፕ መሣሪያው በክዳኑ ላይ ተቀምጧል 150 ሚሜ የፔትሪ ዲሽ ለማቀነባበር። ማያያዣው የሲሊኮን ቱቦን ለመዝጋት ያገለግላል። h፣ የተዳቀለ ቺፕ ማምረቻ እና የተዳቀለ ቺፕስ በመጠቀም የ3-ል ሞርፎጄኔሲስ ምስላዊ ቅጽበታዊ ገጽ እይታዎች። የትራንስዌል ማስገቢያዎች በተናጥል ለማልማት የተዘጋጁ 2-ልኬት አንጀት ኤፒተልየል ሴሎች ሞኖላይየሮች ወደ ድብልቁ ቺፕ ውስጥ ገብተዋል ይህም የአንጀት 3-ልኬት ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት ነው። መካከለኛው በትራንስዌል ማስገቢያ ላይ በተቀመጠው የሴል ንብርብር ስር ባሉ ማይክሮቻናሎች በኩል ይረጫል። የመለኪያ አሞሌ፣ 1 ሴ.ሜ.ሰ ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር እንደገና ታትሟል።4. Elsevier.
በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ፣ የካኮ-2 ሴል መስመር እና የአንጀት ኦርጋኖይድ እንደ ኤፒተልየል ምንጮች ጥቅም ላይ ውለዋል (ምስል 3a)። ሁለቱም የሕዋስ ዓይነቶች በተናጥል የተገነቡ ናቸው (ሣጥን 2 እና ሣጥን 5) እና በቺፕ አንጀት ወይም ትራንስዌል ማስገቢያዎች ላይ በECM የተሸፈኑ ማይክሮ ቻናሎችን ለመዝራት ያገለግሉ ነበር። ሴሎች ሲዋሃዱ (በብልቃጦች ውስጥ ከ95% በላይ ሽፋን ሲኖራቸው)፣ በቲ-ብልቃጦች ውስጥ በመደበኛነት የሚመረቱ የካኮ-2 ሴሎች (በአንቀጽ 10 እና 50 መካከል) በትራይፕሲኔዜሽን ፈሳሽ (ሣጥን 2) የተከፋፈሉ የሕዋስ እገዳዎችን ለማዘጋጀት ይሰበሰባሉ። ከአንጀት ባዮፕሲዎች ወይም ከቀዶ ጥገና መቆረጥ የተገኙ የሰው አንጀት ኦርጋኖይድ መዋቅራዊ ማይክሮ አካባቢን ለመደገፍ በማትሪግል ስካፎልድ ዶሜዎች ውስጥ በ24-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ ተክለዋል። መካከለኛ የያዙ አስፈላጊ ሞርፎጅኖች (እንደ Wnt፣ R-spondin እና Noggin ያሉ) እና በሳጥን 3 ላይ እንደተገለጸው የተዘጋጁ የእድገት ምክንያቶች ኦርጋኖይድ ዲያሜትር እስከ ~500 µm እስኪያድግ ድረስ በየሁለት ቀኑ ይጨመር ነበር። ሙሉ በሙሉ የሚያድጉ ኦርጋኖይድ ይሰበሰቡ እና ወደ ውስጥ ይከፋፈላሉ። በቺፕ ላይ በአንጀት ወይም በትራንስዌል ማስገቢያዎች ላይ ለመዝራት ነጠላ ሴሎች (ሣጥን 5)። ቀደም ብለን እንደዘገብነው፣ እንደ በሽታው አይነት 12,13 (ለምሳሌ አልሰረቲቭ ኮላይትስ፣ የክሮንስ በሽታ፣ የኮሎሬክታል ካንሰር ወይም መደበኛ ለጋሽ)፣ የቁስሉ ቦታ (ለምሳሌ፣ ቁስሉ ከቁስሉ ጋር ሲነጻጸር) እና በትራክቱ ውስጥ ባለው የጨጓራና ትራክት ቦታ (ለምሳሌ፣ ዱኦዴነም፣ ጄጁነም፣ ኢሌም፣ ሴኩም፣ ኮሎን ወይም ሬክታል) ሊለያይ ይችላል። በሳጥን 5 ውስጥ ከትንሽ አንጀት ኦርጋኖይድ ይልቅ ከፍተኛ የሞርፎጅን ክምችት የሚያስፈልጋቸውን የኮሎኒክ ኦርጋኖይድ (ኮሎይድ) ለማልማት የተመቻቸ ፕሮቶኮል እናቀርባለን።
ሀ፣ የአንጀት ሞርፎጄኔሲስ በአንጀት ቺፕ ውስጥ እንዲፈጠር የሚያስችል የስራ ፍሰት። የካኮ-2 የሰው አንጀት ኤፒተልየም እና የአንጀት ኦርጋኖይድስ በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ 3D ሞርፎጄኔሲስን ለማሳየት ጥቅም ላይ ይውላሉ። የተለዩት ኤፒተልየል ሴሎች በተዘጋጀው የአንጀት-ላይ-ቺፕ መሳሪያ (ቺፕ ዝግጅት) ውስጥ ተዘርተዋል። ሴሎች ከተዘሩ (ከተዘሩ) እና ከPDMS ባለ ቀዳዳ ሽፋን ጋር ከተያያዙ (ከተያያዙ) በኋላ፣ የአፕቲካል (AP) ፍሰት ተጀምሮ ለመጀመሪያዎቹ 2 ቀናት (ፍሰት፣ AP፣ D0-D2) ይቆያል። መሰረታዊ (BL) ፍሰት ሙሉ 2D ሞኖላይየር ሲፈጠር ከሳይክሊክ የመለጠጥ እንቅስቃሴዎች (ዝርጋታ፣ ፍሰት፣ AP እና BL) ጋር አብሮ ይጀምራል። የአንጀት 3D ሞርፎጄኔሲስ ከ5 ቀናት ማይክሮፍሉይዲክ ባህል (ሞርፎጄኔሲስ፣ D5) በኋላ በድንገት ተከስቷል። የደረጃ ንፅፅር ምስሎች በእያንዳንዱ የሙከራ ደረጃ ወይም የጊዜ ነጥብ የካኮ-2 ሴሎችን ተወካይ ሞርፎሎጂ ያሳያሉ (የባር ግራፍ፣ 100 µm)። ተጓዳኝ የአንጀት ክምችቶችን የሚያሳዩ አራት ስዕላዊ ንድፎች ሞርፎጄኔሲስ (ከላይ በቀኝ በኩል)። በንድፈ ሐሳቡ ውስጥ ያሉት የተቆራረጡ ቀስቶች የፈሳሽ ፍሰት አቅጣጫን ይወክላሉ። ለ፣ የSEM ምስል የተቋቋመውን 3D Caco-2 ኤፒተልየም (በግራ) የገጽታ ቶፖሎጂን ያሳያል። የተጎላበተውን ቦታ የሚያጎላው ኢንሴቱ (ነጭ የተቆራረጠ ሳጥን) በ3D Caco-2 ንብርብር (በቀኝ) ላይ እንደገና የተቋቋመውን ማይክሮቪሊ ያሳያል።c፣ የተቋቋመውን Caco-2 3D አግድም የፊት እይታ፣ ክላውዲን (ZO-1፣ ቀይ) እና ቀጣይ የብሩሽ ድንበር ሽፋኖች በአንጀት ቺፕስ ላይ የኤፒተልየል ሴሎችን F-actin (አረንጓዴ) እና ኒውክሊየስ (ሰማያዊ) ኢሚውኖፍሎረሰንስ ኮንፎካል ምስላዊነት የተሰየሙ ናቸው። ወደ መካከለኛው ስዕላዊ መግለጫ የሚያመለክቱ ቀስቶች ለእያንዳንዱ ኮንፎካል እይታ የትኩረት ፕላን ቦታ ያመለክታሉ።d፣ በ3፣ 7፣ 9፣ 11 እና 13 ቀናት በደረጃ ንፅፅር ማይክሮስኮፒ በተገኘ ቺፕ ላይ በሚለማ ኦርጋኖይድስ ውስጥ የሞርፎሎጂ ለውጦች የጊዜ ሂደት። ኢንሴቱ (ከላይ በቀኝ) የቀረበውን ምስል ከፍተኛ ማጉላት ያሳያል።e፣ በአንጀት ውስጥ የተቋቋመውን የኦርጋኖይድ 3D ኤፒተልየም DIC ፎቶማይክሮግራፍ በ7ኛው ቀን በተወሰደው ቁራጭ ላይ፣ ለግንድ ሴሎች (LGR5፤ ማጀንታ)፣ የጎብል ሴሎች (MUC2፤ አረንጓዴ)፣ F-actin (ግራጫ) እና ኒውክሊየስ (ሳይያን) ምልክቶች የሚያሳዩ የተደራረቡ የኢሚውኖፍሎረሰንስ ምስሎች፣ በቅደም ተከተል (በግራ) እና በኤፒተልየል ንብርብር ላይ ለ13 ቀናት (መካከለኛ) ኦርጋኖይድስ። እንዲሁም የLGR5 ምልክትን ያለ MUC2 ምልክት የሚያጎላ የተራዘመ የውሂብ ምስል 3ን ይመልከቱ። በባህል ቀን 13 ላይ በሴልማስክ ቀለም (በቀኝ) በፕላዝማ ሽፋን ላይ በአንጀት ውስጥ የተቋቋመውን የ3D ኦርጋኖይድ ኤፒተልየም ኤፒተልየል ማይክሮ መዋቅር (በቀኝ) የሚያሳዩ የፍሎረሰንስ ምስሎች። በሌላ መልኩ ካልተገለጸ በስተቀር የመለኪያ አሞሌ 50 μm ነው። ለ ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር እንደገና ታትሟል።2. የኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ፤ c ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር ተስተካክሏል።2. የኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ፤ e እና f በማጣቀሻ ፈቃድ ተስተካክለዋል።12 በ Creative Commons ፈቃድ ስር CC BY 4.0.
በአንጀት ውስጥ በቺፕ ላይ፣ የ PDMS ባለ ቀዳዳ ሽፋን ወለልን ሃይድሮፎቢክ ገጽታ ለተሳካ የ ECM ሽፋን ማሻሻል አስፈላጊ ነው። በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ፣ የ PDMS ሽፋኖችን ሃይድሮፎቢክነትን ለማሻሻል ሁለት የተለያዩ ዘዴዎችን እንተገብራለን። የካኮ-2 ሴሎችን ለማልማት፣ በ UV/ኦዞን ህክምና ብቻ የ PDMS ገጽ ሃይድሮፎቢክነትን ለመቀነስ፣ ECMን ለመሸፈን እና የካኮ-2 ሴሎችን ከ PDMS ሽፋን ጋር ለማያያዝ በቂ ነበር። ሆኖም፣ የኦርጋኖይድ ኤፒተልየም ማይክሮፍሎይዲክ ባህል ፖሊቲኢሊሚን (PEI) እና ግሉታራሌዴይድን በ PDMS ማይክሮቻናሎች ላይ በቅደም ተከተል በመተግበር የ ECM ፕሮቲኖችን ውጤታማ በሆነ መንገድ ለማስቀመጥ በኬሚካል ላይ የተመሠረተ የገጽታ ተግባራዊነት ይፈልጋል። የገጽታ ማሻሻያ ከተደረገ በኋላ፣ የ ECM ፕሮቲኖች ተግባራዊ የሆነውን የ PDMS ገጽ ለመሸፈን ተቀምጠዋል ከዚያም ወደ ተለየው ኦርጋኖይድ ኤፒተልየም ገብተዋል። ሴሎቹ ከተያያዙ በኋላ፣ የማይክሮፍሎይዲክ ሴል ባህል የሚጀምረው ሴሎቹ ሙሉ ሞኖላይየር እስኪፈጥሩ ድረስ መካከለኛውን ወደ ላይኛው ማይክሮቻናል ብቻ በመርጨት ሲሆን የታችኛው ማይክሮቻናል ደግሞ የማይንቀሳቀሱ ሁኔታዎችን ይጠብቃል። ይህ ለገጽታ ማግበር እና ለ ECM ሽፋን የተመቻቸ ዘዴ ኦርጋኖይድ መያያዝ ያስችላል። ኤፒተልየም በ PDMS ወለል ላይ የ3-ልኬት ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት።
የትራንስዌል ባህሎች ከሴል ዘር ከመትከሉ በፊት የECM ሽፋን ያስፈልጋቸዋል፤ ሆኖም ግን፣ የትራንስዌል ባህሎች የቀዳዳ ማስገቢያዎችን ገጽታ ለማግበር ውስብስብ የቅድመ-ህክምና እርምጃዎችን አያስፈልጋቸውም። በትራንስዌል ማስገቢያዎች ላይ የካኮ-2 ሴሎችን ለማብቀል፣ በቀዳዳ ማስገቢያዎች ላይ ያለው የECM ሽፋን የተከፋፈሉ የካኮ-2 ሴሎችን (ከ1 ሰዓት በታች) እና ጥብቅ የመጋጠሚያ መከላከያ መፈጠርን (ከ1-2 ቀናት በታች) ያፋጥናል። በትራንስዌል ማስገቢያዎች ላይ ኦርጋኖይድ ለማልማት፣ የተለዩ ኦርጋኖይድ በECM በተሸፈኑ ማስገቢያዎች ላይ ይዘራሉ፣ ከሽፋኑ ወለል ጋር ተያይዘው (ከ3 ሰዓታት በታች) እና ኦርጋኖይድስ ሙሉ በሙሉ የመከላከያ ታማኝነት ያለው ሞኖላይየር እስኪፈጥሩ ድረስ ይጠበቃሉ። የትራንስዌል ባህሎች የተዳቀለ ቺፕስ ሳይጠቀሙ በ24-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ ይከናወናሉ።
በብልቃጥ ውስጥ የ3-ልኬት ሞርፎጄኔሲስ የሚጀመረው በተቋቋመ የኤፒተልየል ንብርብር መሰረታዊ ገጽታ ላይ ፈሳሽ ፍሰትን በመተግበር ነው። በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ውስጥ፣ ኤፒተልየል ሞርፎጄኔሲስ የሚጀምረው መካከለኛው ወደ ላይኛው እና የታችኛው ማይክሮ ቻናሎች ሲገባ ነው (ምስል 3a)። ቀደም ሲል እንደተገለጸው፣ አቅጣጫዊ የሚወጡ የሞርፎጅን አጋቾችን በተከታታይ ለማስወገድ በታችኛው (ቤሶላተር) ክፍል ውስጥ የፈሳሽ ፍሰትን ማስተዋወቅ አስፈላጊ ነው። በቀዳዳ ሽፋኖች ላይ ለተሳሰሩ ሴሎች በቂ ንጥረ ነገሮችን እና ሴረም ለማቅረብ እና የብርሃን መሸርሸር ውጥረትን ለማመንጨት፣ በተለምዶ በቺፕ ላይ በአንጀት ውስጥ ድርብ ፍሰትን እንተገብራለን። በድብልቅ ቺፕስ ውስጥ፣ ኤፒተልየል ሞኖላይየሮችን የያዙ የትራንስዌል ማስገቢያዎች ወደ ድብልቁ ቺፕስ ውስጥ ገብተዋል። ከዚያም መካከለኛው በማይክሮቻናል በኩል ባለው ቀዳዳ ባለው የትራንስዌል ማስገቢያ ቤሶላተር ጎን ስር ተተግብሯል። የአንጀት ሞርፎጄኔሲስ የተከሰተው በሁለቱም የባህል መድረኮች ላይ የባሶላተር ፍሰት ከተጀመረ ከ3-5 ቀናት በኋላ ነው።
የማይክሮኢንጂነሪንግ 3D ኤፒተልየል ንብርብሮች ሞርፎሎጂካል ባህሪያት የደረጃ ንፅፅር ማይክሮስኮፒ፣ የዲፈረንሻል ጣልቃ ገብነት ንፅፅር (DIC) ማይክሮስኮፒ፣ SEM ወይም ኢሚውኖፍሎረሰንስ ኮንፎካል ማይክሮስኮፒን ጨምሮ የተለያዩ የምስል ዘዴዎችን በመተግበር ሊተነተኑ ይችላሉ (ምስል 3 እና 4)። የደረጃ ንፅፅር ወይም የDIC ምስል በባህል ወቅት በማንኛውም ጊዜ የ3D ኤፒተልየል ንብርብሮችን ቅርፅ እና እድገት ለመከታተል በቀላሉ ሊከናወን ይችላል። በPDMS እና በፖሊስተር ፊልሞች ኦፕቲካል ግልጽነት ምክንያት፣ ሁለቱም የአንጀት-ኦን-አ-ቺፕ እና የተቀላቀለ ቺፕ መድረኮች የመሳሪያውን ክፍል ወይም መበታተን ሳያስፈልጋቸው በእውነተኛ ጊዜ በቦታው ምስል መስጠት ይችላሉ። የኢሚውኖፍሎረሰንስ ምስል (ምስል 1፣ 3ሐ፣ ረ እና 4ለ፣ ሐ) ሲያካሂዱ፣ ሴሎች በተለምዶ በ4% (wt/vol) ፓራፎርማልዴይድ (PFA) ይስተካከላሉ፣ ከዚያም ትሪቶን X-100 እና 2% (wt/vol) ) የከብት ሴረም አልቡሚን (BSA) በቅደም ተከተል ይስተካከላሉ። እንደ ሴል አይነት፣ የተለያዩ ማስተካከያዎች፣ ፐርሜአቢላይዘሮች እና እገዳዎች ላይ በመመስረት። እንደ ሴል አይነት፣ የተለያዩ ማስተካከያዎች፣ ፐርሜአቢላይዘሮች እና እገዳዎች። ወኪሎች ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ። በዘር ላይ ጥገኛ የሆኑ የሴል ወይም የክልል ምልክቶችን ኢላማ የሚያደርጉ ዋና ዋና ፀረ እንግዳ አካላት በቺፑ ላይ በቦታ ውስጥ የማይንቀሳቀሱ ሴሎችን ለማጉላት ያገለግላሉ፣ ከዚያም ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካላትን ከኒውክሊየስ (ለምሳሌ፣ 4′፣ 6-ዲያሚዲኖ-2-ፌኒሊን) ኢንዶል፣ DAPI) ወይም F-አክቲን (ለምሳሌ፣ በፍሎረሰንት የተሰየመ ፋሎይዲን) ጋር በማነጣጠር በተቃራኒ እድፍ ቀለም ይጠቀማሉ። በፍሎረሰንስ ላይ የተመሠረተ የቀጥታ ምስል የንፍጥ ምርትን (ምስል 1፣ “የሴል ልዩነት” እና “የአንጀት ፊዚዮሎጂ”)፣ የማይክሮባላዊ ሴሎች የዘፈቀደ ቅኝ ግዛት (ምስል 1፣ “አስተናጋጅ-ማይክሮቤ የጋራ ባህል”)፣ የበሽታ መከላከያ ሴሎችን ቅጥር (ምስል 1፣ 'የበሽታ ሞዴሊንግ') ወይም የ3D ኤፒተልየል ሞርፎሎጂ ቅርጾችን (ምስል 3c፣ f እና 4b፣ c) ለመለየት በቺፑ ላይ ያለውን አንጀት ሲቀይሩ። በማጣቀሻው ላይ እንደተገለጸው የላይኛውን ንብርብር ከታችኛው ማይክሮቻናል ንብርብር ለመለየት በቺፑ ላይ ያለውን አንጀት ሲቀይሩ፣ በምስል 2 ላይ እንደሚታየው፣ የ3D ኤፒተልየል ሞርፎሎጂ እንዲሁም በ3D ኤፒተልየል ሞርፎሎጂ እንዲሁም በ3D ኤፒተልየል ሞርፎሎጂ ላይ ያለው ማይክሮቪሊ የአፕቲካል ብሩሽ ድንበር በSEM (ምስል 3ለ) ሊታይ ይችላል። የልዩነት ጠቋሚዎች አገላለጽ መጠናዊ PCR5 ወይም ነጠላ-ሴል RNA ቅደም ተከተል በማከናወን ሊገመገም ይችላል። በዚህ ሁኔታ፣ በአንጀት ቺፕስ ወይም በሃይብሪድ ቺፕስ ውስጥ የሚበቅሉ 3D ኤፒተልየል ሴሎች ንብርብሮች በትራይፕሲኔሽን ይሰበሰባሉ ከዚያም ለሞለኪውላር ወይም ለጄኔቲክ ትንተና ያገለግላሉ።
ሀ፣ በሃይብሪድ ቺፕ ውስጥ የአንጀት ሞርፎጄኔሲስን ለማነሳሳት የስራ ፍሰት። በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የካኮ-2 እና የአንጀት ኦርጋኖይድስ በሃይብሪድ ቺፕ መድረክ ውስጥ 3D ሞርፎጄኔሲስን ለማሳየት ጥቅም ላይ ይውላሉ። የተከፋፈሉ ኤፒተልየል ሴሎች በተዘጋጁ የትራንስዌል ማስገቢያዎች ውስጥ ተዘርተዋል (TW ዝግጅት፤ ከታች ያለውን ምስል ይመልከቱ)። ሴሎች ከተዘሩ (ከተዘሩ) እና በትራንስዌል ማስገቢያዎች ውስጥ ከፖሊስተር ሽፋኖች ጋር ከተያያዙ በኋላ፣ ሁሉም ሴሎች በማይንቀሳቀስ ሁኔታ (TW ባህል) ስር ተቀርፀዋል። ከ7 ቀናት በኋላ፣ 2D ሞኖላይር የኤፒተልየል ሴሎችን የያዘ አንድ የትራንስዌል ማስገቢያ ወደ ባሶላተር ፍሰት (ፍሰት፣ BL) ለማስተዋወቅ ወደ ድቅል ቺፕ ተዋህዷል፣ ይህም በመጨረሻ የ3D ኤፒተልየል ንብርብር (ሞርፎጄኔሲስ) እንዲፈጠር ምክንያት ሆኗል። በእያንዳንዱ የሙከራ ደረጃ ወይም የጊዜ ነጥብ ላይ ከመደበኛ ለጋሽ (C103 መስመር) ወደ ላይ ኮሎን የሚመጡ የሰው አካል ኤፒተልየል ሴሎች ሞርፎሎጂያዊ ባህሪያትን የሚያሳዩ የደረጃ ንፅፅር ማይክሮግራፎች። በላይኛው ንብርብሮች ውስጥ ያሉት ንድፎች ለእያንዳንዱ ደረጃ የሙከራ ውቅር ያሳያሉ። ለ፣ ሃይብሪድ ቺፕስ (የግራ ንድፍ) ከላይ ወደ ታች ኮንፎካል ያላቸው የኦርጋኖይድ ኤፒተልየል ሴሎችን 3D ሞርፎጄኔሲስ ሊያመራ ይችላል። በተለያዩ የZ ቦታዎች (የላይኛው፣ የመሃል እና የታችኛው፤ የቀኝ ንድፍ እና ተዛማጅ የነጥብ መስመሮችን ይመልከቱ) የተወሰዱ የማይክሮስኮፒ እይታዎች። ግልጽ የሆኑ የሞርፎሎጂ ባህሪያትን አሳይተዋል። F-actin (cyan)፣ ኒውክሊየስ (ግራጫ)።c፣ በስታቲክ ትራንስዌል (TW፤ በነጭ ሰረዝ ሳጥን ውስጥ የተተከለው ኢንሴት) እና በሃይብሪድ ቺፕ (ትልቁ ሙሉ ቀረጻ) ውስጥ የተዳቀሉ ኦርጋኖይድ-የተገኙ ኤፒተልየል ሴሎች የፍሎረሰንስ ኮንፎካል ማይክሮግራፎች (3D አንግል እይታ) በቅደም ተከተል 2D ከ3D ሞርፎሎጂ ጋር ያወዳድራሉ። ጥንድ 2D ቀጥ ያሉ የመስቀል-የተቆረጡ እይታዎች (በላይኛው ቀኝ ጥግ ላይ ኢንሴት፤ “XZ”) እንዲሁም 2D እና 3D ባህሪያትን ያሳያሉ። የልኬት አሞሌ፣ 100 µm.c ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር እንደገና ታትሟል።4. Elsevier.
መቆጣጠሪያዎችን ማዘጋጀት የሚቻለው ተመሳሳይ ሴሎችን (ካኮ-2 ወይም የአንጀት ኦርጋኖይድ ኤፒተልየል ሴሎችን) በተለመደው የማይንቀሳቀስ ባህል ሁኔታዎች ስር ወደ ባለ ሁለት ገጽታ ሞኖላይዘር በማልማት ነው። በተለይም የንጥረ ነገር መሟጠጥ በማይክሮቻናሎች የመጠን አቅም ውስንነት ምክንያት ሊከሰት ይችላል (ማለትም በዋናው የአንጀት-ቺፕ ዲዛይን ላይ ~4 µL)። ስለዚህ፣ የኤፒተልየል ሞርፎሎጂ ከመተገብሩ በፊት እና በኋላ ሊወዳደር ይችላል።
ለስላሳው የሊቶግራፊ ሂደት በንጹህ ክፍል ውስጥ መከናወን አለበት። በቺፑ ላይ ላለው እያንዳንዱ ንብርብር (የላይኛው እና የታችኛው ንብርብሮች እና ሽፋኖች) እና ለሃይብሪድ ቺፕስ፣ የማይክሮቻናሎች ቁመት የተለያዩ ስለነበሩ የተለያዩ የፎቶ ጭምብሎች ጥቅም ላይ ውለው በተለያዩ የሲሊኮን ዋፈርዎች ላይ ተሠርተዋል። በቺፑ ላይ ያለው የአንጀት የላይኛው እና የታችኛው ማይክሮቻናሎች ኢላማ ቁመቶች በቅደም ተከተል 500 µm እና 200 µm ናቸው። የሃይብሪድ ቺፕ የቻናል ኢላማ ቁመት 200 µm ነው።
ባለ 3 ኢንች የሲሊኮን ዋፈር በአሴቶን ሳህን ውስጥ ያስቀምጡ። ሳህኑን ለ30 ሰከንዶች በቀስታ ያሽከርክሩት፣ ከዚያም ዋፈሩን በአየር ያድርቁት። ዋፈሩን ወደ IPA ወዳለው ሳህን ያስተላልፉት፣ ከዚያም ሳህኑን ለ30 ሰከንዶች ያሽከርክሩት።
የፒራንሃ መፍትሄ (የሃይድሮጂን ፐርኦክሳይድ እና የተጠናከረ ሰልፈሪክ አሲድ፣ 1:3 (ቮል/ቮል)) በአማራጭነት ከሲሊኮን ዋፈር ወለል ላይ ኦርጋኒክ ቅሪቶችን ከፍተኛ በሆነ መልኩ ለማስወገድ ሊያገለግል ይችላል።
የፒራንሃ መፍትሄ እጅግ በጣም ዝገት የሚፈጥር እና ሙቀትን የሚያመነጭ ነው። ተጨማሪ የደህንነት ጥንቃቄዎች አስፈላጊ ናቸው። ቆሻሻን ለማስወገድ፣ መፍትሄው እንዲቀዘቅዝ እና ወደ ንጹህ እና ደረቅ የቆሻሻ ማጠራቀሚያ እንዲተላለፍ ይፍቀዱለት። ሁለተኛ ደረጃ ኮንቴይነሮችን ይጠቀሙ እና የቆሻሻ መያዣዎችን በትክክል ይሰይሙ። ለተጨማሪ ዝርዝር ሂደቶች እባክዎን የተቋሙን የደህንነት መመሪያዎች ይከተሉ።
ዋፈሮቹን በ200 ዲግሪ ሴልሺየስ በሚሞቅ ሳህን ላይ ለ10 ደቂቃ በማስቀመጥ ያድርቁ። ከድርቀት በኋላ ዋፈሩን በአየር ውስጥ አምስት ጊዜ በማወዛወዝ እንዲቀዘቅዝ ተደርጓል።
~10 ግራም የፎቶ ሬዚስት SU-8 2100 በተጸዳው የሲሊኮን ዋፈር መሃል ላይ አፍስሱ። የፎቶ ሬዚስተሩን በዋፈር ላይ በእኩል ለማሰራጨት ሹካዎችን ይጠቀሙ። አልፎ አልፎ ዋፈርን በ65°ሴ ሙቅ ሳህን ላይ ያስቀምጡት ይህም የፎቶ ሬዚስተሩን በቀላሉ ለማጣበቅ እና ለማሰራጨት ቀላል ያደርገዋል። ዋፈርን በቀጥታ በሞቃት ሳህን ላይ አያስቀምጡት።
SU-8 በዋፈር ላይ በእኩል መጠን የተዘረጋውን የሽክርክሪት ሽፋን በማስኬድ ተሰራጭቷል። የSU-8ን ለ5-10 ሰከንድ በማዞር በ100 rpm/s ፍጥነት በ500 rpm እንዲሰራጭ ያድርጉ። ዋናውን ሽክርክሪት በ1,500 rpm ላይ ለ200 µm ውፍረት ንድፍ ያዘጋጁ ወይም 250 µm ውፍረት ያግኙ (በቺፕ ላይ ላለው የአንጀት የላይኛው ንብርብር 500 µm ቁመት ያድርጉ፤ ከዚህ በታች “ወሳኝ ደረጃዎች” የሚለውን ይመልከቱ) በ300 rpm/s 30 ሰከንድ ፍጥነት በ1,200 rpm ላይ ያስቀምጡ።
ዋናው የማዞሪያ ፍጥነት በሲሊኮን ዋፈር ላይ ባለው የSU-8 ንድፍ ኢላማ ውፍረት መሰረት ሊስተካከል ይችላል።
በቺፑ ላይ ላለው የአንጀት የላይኛው ንብርብር 500 µm ቁመት ያላቸውን የSU-8 ቅጦችን ለመስራት፣ የዚህ ሣጥን የማዞሪያ ሽፋን እና ለስላሳ የመጋገሪያ ደረጃዎች (ደረጃ 7 እና 8) በተከታታይ ተደግመዋል (ደረጃ 9ን ይመልከቱ)፣ በዚህ ሳጥን ደረጃ 12 ላይ በ UV መጋለጥ ሊደረደሩ እና ሊቀላቀሉ የሚችሉ ሁለት ንብርብሮች 250 µm ወፍራም የSU-8 ንብርብር ይፈጥራሉ፣ ይህም 500 µm ከፍታ ያለው ንብርብር ያደርገዋል።
በSU-8 የተሸፈኑትን ዋፈሮች በ65°ሴ ሙቀት ውስጥ ለ5 ደቂቃ በጥንቃቄ በሞቃት ሳህን ላይ በማስቀመጥ ለስላሳ በሆነ መንገድ ይጋግሩ፣ ከዚያም ቅንብሩን ወደ 95°ሴ ይቀይሩት እና ለተጨማሪ 40 ደቂቃ ያብስሉት።
በላይኛው ማይክሮ ቻናል ውስጥ የSU-8 ንድፍ 500 μm ቁመት ለማግኘት፣ ሁለት 250 μm ውፍረት ያላቸውን የSU-8 ንብርብሮችን ለመፍጠር ደረጃዎች 7 እና 8ን ይድገሙ።
የአልትራቫዮሌት ጭምብል አላይነርን በመጠቀም፣ የዋፈርን የተጋላጭነት ጊዜ ለማስላት በአምራቹ መመሪያ መሠረት የመብራት ሙከራ ያድርጉ። (የተጋላጭነት ጊዜ፣ ms) = (የተጋላጭነት መጠን፣ mJ/cm2)/(የመብራት ኃይል፣ mW/cm2)።
የተጋላጭነት ጊዜውን ከወሰኑ በኋላ፣ የፎቶ ጭምብሉን በ UV ጭምብል አላይነር ጭንብል መያዣ ላይ ያስቀምጡ እና የፎቶ ጭምብሉን በSU-8 በተሸፈነው ዋፈር ላይ ያድርጉት።
የ UV ስርጭትን ለመቀነስ የፎቶማስክን የታተመውን ገጽ በቀጥታ በሲሊኮን ዋፈር SU-8 ሽፋን ላይ ያድርጉት።
ለተወሰነው የተጋላጭነት ጊዜ በSU-8 የተሸፈነውን ዋፈር እና የፎቶማስክን በአቀባዊ ወደ 260 mJ/cm2 የአልትራቫዮሌት ብርሃን ያጋልጡት (የዚህን ሳጥን ደረጃ 10 ይመልከቱ)።
ከአልትራቫዮሌት ጨረር (UV) መጋለጥ በኋላ፣ በSU-8 የተሸፈኑ የሲሊኮን ዋፈሮች በ65°ሴ ለ5 ደቂቃ እና በ95°ሴ ለ15 ደቂቃ በእያንዳንዱ ትኩስ ሳህን ላይ በ200 μm ቁመት ቅጦችን ለመሥራት ተጋገሩ። የመጋገሪያ ጊዜውን ከ95°ሴ እስከ 30 ደቂቃ ያራዝሙና 500 μm ቁመት ያላቸው ቅጦችን ለመሥራት።
ገንቢው በመስታወት ሳህን ውስጥ ይፈስሳል፣ እና የተጋገረው ዋፈር በሳህኑ ውስጥ ይቀመጣል። የSU-8 ገንቢው መጠን እንደ የመስታወት ሳህን መጠን ሊለያይ ይችላል። ያልተጋለጠውን SU-8 ሙሉ በሙሉ ለማስወገድ በቂ የSU-8 ገንቢ መጠቀምዎን ያረጋግጡ። ለምሳሌ፣ 1 ሊትር አቅም ያለው 150 ሚሜ ዲያሜትር ያለው የመስታወት ሳህን ሲጠቀሙ ~ 300 ሚሊ ሊትር የSU-8 ገንቢ ይጠቀሙ። አልፎ አልፎ በቀስታ በማዞር ሻጋታውን ለ25 ደቂቃዎች ያዘጋጁ።
የተፈጠረውን ሻጋታ በ ~10 ሚሊ ሊትር ትኩስ ገንቢ ያጠቡ እና ከዚያም መፍትሄውን በፒፔት በመርጨት IPA ያጠቡ።
ዋፈርን በፕላዝማ ማጽጃ ውስጥ ያስቀምጡ እና ለ1.5 ደቂቃ ለኦክስጅን ፕላዝማ (የከባቢ አየር ጋዝ፣ የታለመ ግፊት 1 × 10−5 ቶር፣ ኃይል 125 ዋት) ያጋልጡት።
ዋፈርን በቫክዩም ዲሲካተር ውስጥ ያስቀምጡት፤ በውስጡም የመስታወት ስላይድ አለው። ዋፈርና ስላይዶች ጎን ለጎን ሊቀመጡ ይችላሉ። የቫክዩም ዲሲካተሩ በበርካታ ንብርብሮች በአንድ ሳህን የተከፈለ ከሆነ፣ ስላይዶቹን በታችኛው ክፍል ውስጥ እና ዋፈርዎቹን በላይኛው ክፍል ውስጥ ያስቀምጡ። 100 μL የትሪክሎሮ (1H፣ 1H፣ 2H፣ 2H-perfluorooctyl)ሲላን መፍትሄ በመስታወት ስላይድ ላይ ይጣሉ እና ለሲላኒዜሽን ቫክዩም ይተግብሩ።
የቀዘቀዘ የካኮ-2 ሴሎችን አንድ ጠርሙስ በ37°ሴ የውሃ መታጠቢያ ውስጥ ያቀልጡት፣ ከዚያም የቀለጡትን ሴሎች 15 ሚሊ ሊትር 37°ሴ ቀድሞ የተሞቀ የካኮ-2 መካከለኛ መጠን ያለው የT75 ብልቃጥ ወደያዘው ያስተላልፉ።
የካኮ-2 ሴሎችን በ~90% ኮንፍሉዌንሲ ለማለፍ፣ በመጀመሪያ በ37°ሴ የውሃ መታጠቢያ ውስጥ የካኮ-2 መካከለኛ፣ PBS እና 0.25% ትራይፕሲን/1 mM EDTA ሞቅ ያድርጉ።
በቫክዩም አሲስት አማካኝነት መካከለኛውን አየር ያስወጡት። የቫክዩም አሲስትን በመድገም እና ትኩስ PBS በመጨመር ሴሎችን በ5 ሚሊ ሊትር ሞቅ ባለ PBS ሁለት ጊዜ ያጠቡ።