א דאנק פארן באזוכן Nature.com. די בראַוזער ווערסיע וואָס איר ניצט האט באַגרענעצטע שטיצע פֿאַר CSS. פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר ניצט אַן דערהייַנטיקטן בראַוזער (אָדער דיאַקטיווירן קאָמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). אין דער דערווייל, צו ענשור קאַנטיניואַס שטיצע, וועלן מיר ווייַזן די וועבזייטל אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
מענטשלעכע געדערעם מאָרפאָגענעסיס באַשטעטיקט קריפּט-ווילוס פֿעיִקייטן פון 3D עפּיטעליאַל מיקראָאַרכיטעקטור און ספּיישאַל אָרגאַניזאַציע. די יינציק סטרוקטור איז פארלאנגט צו האַלטן געדערעם כאָומיאָסטאַסיס דורך באַשיצן די סטעם צעל נישע אין די באַסאַל קריפּט פון עקסאָגענאָוס מיקראָביאַל אַנטיגענס און זייער מעטאַבאָליץ. אין אַדישאַן, געדערעם ווילי און סעקרעטינג מוקוס פאָרשטעלן פאַנגקשאַנאַלי דיפערענצירט עפּיטעליאַל סעלז מיט אַ פּראַטעקטיוו באַריער אויף די געדערעם מוקאָסאַל ייבערפלאַך. דעריבער, ריקריייטינג 3D עפּיטעליאַל סטראַקטשערז איז קריטיש פֿאַר די קאַנסטראַקשאַן פון אין וויטראָ געדערעם מאָדעלס. באַמערקונגסווערט, די אָרגאַניק מימעטיק געדערעם-אויף-אַ-טשיפּ קענען ינדוצירן ספּאַנטייניאַס 3D מאָרפאָגענעסיס פון די געדערעם עפּיטעליום מיט ענכאַנסט פיזיאַלאַדזשיקאַל פאַנגקשאַנז און ביאָמעכאַניקס. דאָ, מיר צושטעלן אַ רעפּראָדוסיבלע פּראָטאָקאָל צו ראָובאַסטלי ינדוצירן געדערעם מאָרפאָגענעסיס אין די געדערעם אויף אַ מיקראָפלוידיק טשיפּ ווי געזונט ווי אין אַ טראַנסוועלל עמבעדיד כייבריד טשיפּ. מיר באַשרייַבן דיטיילד מעטהאָדס פֿאַר מיטל פאַבריקאַציע, קולטורינג פון קאַקאָ-2 אָדער געדערעם אָרגאַנאָיד עפּיטעליאַל סעלז אין קאַנווענשאַנאַל סעטטינגס ווי געזונט ווי אויף אַ מיקראָפלוידיק פּלאַטפאָרמע, ינדוקציע פון ​​3D מאָרפאָגענעסיס, און קעראַקטעריזאַציע. פון עטאַבלירטע 3D עפּיטעליאַ ניצן קייפל בילדגעבונג מאָדאַליטעטן. דעם פּראָטאָקאָל דערגרייכט רעגענעראַציע פון ​​פאַנגקשאַנאַל געדערעם מיקראָאַרכיטעקטור דורך קאָנטראָלירן באַזאָלאַטעראַל פליסיק לויפן פֿאַר 5 טעג. אונדזער אין וויטראָ מאָרפאָגענעסיס מעטאָד ניצט פיזיאַלאַדזשיקלי באַטייַטיק שער דרוק און מעטשאַניקאַל באַוועגונג און ריקווייערז נישט קאָמפּלעקס צעל אינזשעניריע אָדער מאַניפּולאַציע, וואָס קען אַוטפּערפאָרמען אנדערע יגזיסטינג טעקניקס. מיר פאָרשטעלן זיך אַז אונדזער פארגעלייגט פּראָטאָקאָל קען האָבן ברייט ימפּלאַקיישאַנז פֿאַר די ביאָמעדיקאַל פאָרשונג קהל, פּראַוויידינג אַ מעטאָד צו רעגענערירן 3D ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל לייַערס אין וויטראָ פֿאַר ביאָמעדיקאַל, קליניש און פאַרמאַסוטיקאַל אַפּלאַקיישאַנז.
עקספּערימענטן ווייַזן אַז אינטעסטינאַלע עפּיטעליאַל קאַקאָ-2 צעלן קאָלטיווירט אין גוט-אויף-אַ-טשיפּ1,2,3,4,5 אָדער ביילייער מיקראָפלוידיק דעוויסעס6,7 קענען דורכגיין ספּאָנטאַנע 3D מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ אָן אַ קלאָר פארשטאנד פון די אַנדערלייינג מעקאַניזאַם. אין אונדזער לעצטער שטודיע, מיר געפֿונען אַז באַזייַטיקונג פון באַזאָלאַטעראַלי סעקרעטעד מאָרפאָגען אַנטאַגאַניסטן פון קולטור דעוויסעס איז נייטיק און גענוג צו ינדוצירן 3D עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ, וואָס איז געווען דעמאַנסטרייטיד דורך קאַקאָ-2 און פּאַציענט-דערייווד אינטעסטינאַלע אָרגאַנאָידס. עפּיטעליאַל צעלן זענען וואַלידירט געוואָרן. אין דעם לערנען, האָבן מיר ספּעציפֿיש פֿאָקוסירט אויף דער צעל פּראָדוקציע און קאָנצענטראַציע פֿאַרשפּרייטונג פֿון אַ שטאַרקן Wnt אַנטאַגאָניסט, דיקקאָפּף-1 (DKK-1), אין גוט-אויף-אַ-טשיפּ און מאָדיפֿיצירטע מיקראָפֿלואידיק דעוויסעס מיט טראַנסוועלל ינסערץ, גערופֿן "היבריד טשיפּ". מיר דעמאָנסטרירן אַז צוגעבן פֿון עקסאָגענע Wnt אַנטאַגאָניסטן (אַזאַ ווי DKK-1, Wnt רעפּרעסאָר 1, סעקרעטעד פֿריזאַלד-פֿאַרבונדענע פּראָטעין 1, אָדער סאָגי-1) צו דעם אויף-טשיפּ גוט אינהיביץ מאָרפֿאָגענעזיס אָדער דיסראַפּט די פּרעסטרוקטורירטע 3D עפּיטעליאַל שיכט, וואָס סאַגדזשעסט אַז אַנטאַגאָניסטישער דרוק בעת קולטור איז פֿאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר אינטעסטינאַלער מאָרפֿאָגענעזיס אין וויטראָ. דעריבער, אַ פּראַקטישער צוגאַנג צו דערגרייכן ראָבוסט מאָרפֿאָגענעזיס ביי דער עפּיטעליאַלער צובינד איז צו באַזייַטיקן אָדער מינימאַל האַלטן די לעוועלס פֿון Wnt אַנטאַגאָניסטן אין דעם באַזאָלאַטעראַל אָפּטייל דורך אַקטיוו פֿלאַשינג (למשל, אין גוט-אויף-אַ-טשיפּ אָדער היבריד-אויף-אַ-טשיפּ פּלאַטפֿאָרמעס) אָדער דיפֿוזיע. באַזאָלאַטעראַל מעדיע (למשל, פֿון טראַנסוועלל ינסערץ אין גרויסע באַזאָלאַטעראַל רעזערוווואַרן אין קוואלן).
אין דעם פּראָטאָקאָל, מיר צושטעלן אַ דעטאַלירטע מעטאָדע פֿאַר פאַבריצירן גוט-אויף-אַ-טשיפּ מיקראָדעווייסעס און טראַנסוועלל-אַרייַנשרייַבבאַרע כייבריד טשיפּס (טריט 1-5) צו קולטורירן אינטעסטינאַלע עפּיטעליאַל צעלן אויף פּאָלידימעטהילסילאָקסאַן (PDMS)-באַזירט פּאָרעז מעמבראַנעס (טריט 6A, 7A, 8, 9) אָדער פּאָליעסטער מעמבראַנעס פון טראַנסוועלל אַרייַנשרייַבן (טריט 6B, 7B, 8, 9) און ינדוסט 3D מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ (טריט 10). מיר האָבן אויך אידענטיפיצירט צעלולאַרע און מאָלעקולאַרע פֿעיִקייטן וואָס אָנווייַזן געוועב-ספּעציפֿיש היסטאָגענעסיס און ליניאַזש-אָפּהענגיק צעלולאַרע דיפערענציאַציע דורך אַפּלייינג קייפל בילדגעבונג מאָדאַליטעטן (טריט 11-24). מיר ינדוסירן מאָרפאָגענעסיס ניצן מענטשלעך אינטעסטינאַלע עפּיטעליאַל צעלן, אַזאַ ווי קאַקאָ-2 אָדער אינטעסטינאַלע אָרגאַנאָידס, אין צוויי קולטור פֿאָרמאַטן מיט טעכנישע דעטאַלן אַרייַנגערעכנט ייבערפלאַך מאָדיפיקאַציע פון ​​פּאָרעז מעמבראַנעס, שאַפונג פון 2D מאָנאָלייערס, און אינטעסטינאַלע ביאָכעמישע און רעפּראָדוקציע פון ​​די ביאָמעכאַניקאַל מיקראָסוויוועי. אין וויטראָ. צו ינדוסירן 3D מאָרפאָגענעסיס פון 2D עפּיטעליאַל מאָנאָלייערס, מיר אַוועקגענומען מאָרפאָגען. אַנטאַגאָניסטן אין ביידע קולטורירטע פֿאָרמען דורך פֿליסן דעם מעדיום אין דעם באַזאָלאַטעראַלן אָפּטייל פֿון דער קולטור. צום סוף, מיר צושטעלן אַ רעפּרעזענטאַציע פֿון דער נוצלעכקייט פֿון אַ רעגענערירבאַרער 3D עפּיטעליאַלער שיכט וואָס קען ווערן גענוצט צו מאָדעלירן מאָרפֿאָגען-אָפּהענגיקן עפּיטעליאַלן וואוקס, לאַנדזשאַטודאַנאַלער באַלעבאָס-מיקראָביאָם קאָ-קולטורן, פּאַטאָגענע אינפֿעקציע, אָנצינדונג-שאָדן, עפּיטעליאַלע באַריערע דיספֿונקציע, און פּראָביאָטיק-באַזירטע טעראַפּיעס בייַשפּיל. השפּעות.
אונדזער פּראָטאָקאָל קען זיין נוצלעך פֿאַר אַ ברייטע קייט פון וויסנשאַפֿטלער אין גרונטלעכע (למשל, אינטעסטינאַלע מוקאָסאַל ביאָלאָגיע, סטעם צעל ביאָלאָגיע, און אַנטוויקלונג ביאָלאָגיע) און אַפּליצירטע פאָרשונג (למשל, פּרעקלינישע מעדיצין טעסטינג, קראַנקייט מאָדעלינג, געוועב אינזשעניריע, און גאַסטראָענטעראָלאָגיע) ברייטע השפּעה. צוליב די רעפּראָדוסיביליטי און ראָובאַסטנאַס פון אונדזער פּראָטאָקאָל צו אינדוצירן 3D מאָרפאָגענעסיס פון די אינטעסטינאַלע עפּיטעליום אין וויטראָ, מיר פֿאָרשטעלן זיך אַז אונדזער טעכנישע סטראַטעגיע קען זיין פאַרשפּרייט צו וילעם וואָס שטודירן די דינאַמיק פון צעל סיגנאַלינג בעשאַס אינטעסטינאַלע אַנטוויקלונג, רעגענעראַציע אָדער כאָומיאָסטאַסיס. אין דערצו, אונדזער פּראָטאָקאָל איז נוצלעך פֿאַר אויספֿרעגן ינפעקציע אונטער פֿאַרשידענע ינפעקטיאָוס אַגענטן אַזאַ ווי נאָראָווירוס 8, שטרענג אַקוט רעספּעראַטאָרי סינדראָום קאָראָנאַווירוס 2 (SARS-CoV-2), קלאָסטרידיום דיפיסילע, סאַלמאָנעלאַ טיפּימוריום 9 אָדער וויבריאָ כאָלעראַע. אוידיענצן פון קראנקהייט פּאַטאַלאַדזשי און פּאַטאָגענעסיס זענען אויך נוצלעך. די נוצן פון אַן אויף-טשיפּ קישקע מיקראָפיזיאָלאָגי סיסטעם קען דערלויבן לאַנדזשאַטודאַנאַל קאָ-קולטור 10 און סאַבסאַקוואַנט אַסעסמאַנט פון באַלעבאָס פאַרטיידיקונג, ימיון ריספּאָנסעס און פּאַטאַדזשען-פֿאַרבונדענע שאָדן פאַרריכטן אין די גאַסטראָוינטעסטאַנאַל (GI) טראַקט 11. אנדערע GI דיסאָרדערס פֿאַרבונדן מיט ליקי קישקע סינדראָם, סעליאַק קרענק, קראָהן ס קרענק, ולסעראַטיווע קאָליטיס, פּאָוטשיטיס, אָדער יריטאַבאַל באָוועל סינדראָם קענען זיין סימיאַלייטיד ווען 3D ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל לייַערס זענען צוגעגרייט ניצן די פּאַציענט ס 3D ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל לייַערס, די חולאתן אַרייַננעמען ווילאַס אַטראָפי, קריפּט פאַרקירצן, מוקאָסאַל שעדיקן, אָדער ימפּערד עפּיטעליאַל באַריער. ביאָפּסי אָדער סטעם צעל-דערייווד ינטעסטאַנאַל אָרגאַנאָידס 12,13. צו בעסער מאָדעל די העכער קאָמפּלעקסיטי פון די קרענק סוויווע, לייענער קען באַטראַכטן צו לייגן קרענק-רעלאַוואַנט צעל טייפּס, אַזאַ ווי פּאַציענט פּעריפעראַל בלוט מאָנאָנוקלעאַר סעלז (PBMCs), צו מאָדעלס מיט 3D ינטעסטאַנאַל ווילוס-קריפּט מיקראָאַרכיטעקטורעס. געוועב-ספּעציפֿיש ימיון סעלז, 5.
זינט 3D עפּיטעליאַל מיקראָסטרוקטור קען זיין פיקסירט און וויזשוואַלייזד אָן דעם סעקשאַן פּראָצעס, צוקוקער וואָס אַרבעטן אויף ספּיישאַל טראַנסקריפּטאָמיקס און הויך-רעזאָלוציע אָדער סופּער-רעזאָלוציע ימאַגינג קען זיין אינטערעסירט אין אונדזער מאַפּינג פון די ספּיישאָטעמפּאָראַל דינאַמיק פון גענעס און פּראָטעינס אויף עפּיטעליאַל נישעס. אינטערעסירט אין טעכנאָלאָגיע. רעאַקציע צו מיקראָביאַל אָדער ימיון סטימיאַליי. דערצו, לאַנדזשאַטודאַנאַל באַלעבאָס-מיקראָביאָם קראָסטאָלק 10, 14 וואָס קאָואָרדאַנייט געדערעם כאָומיאָסטאַסיס קענען זיין געגרינדעט אין די 3D ינטעסטאַנאַל מיוקאָוסאַל שיכטע דורך קאָ-קולטורינג פאַרשידן מיקראָביאַל מינים, מיקראָביאַל קהילות אָדער פעקאַל מיקראָביאָטאַ, ספּעציעל אין די געדערעם-אויף-אַ-טשיפּ. אין דער פּלאַטפאָרמע. דער צוגאַנג איז באַזונדערס אַטראַקטיוו פֿאַר אַודיענס וואָס שטודירט מוקאָסאַל ימיונאָלאָגיע, גאַסטראָענטעראָלאָגיע, מענטשלעכע מיקראָביאָמע, קולטוראָמיקס און קלינישע מיקראָביאָלאָגיע וואָס זוכן צו קולטיווירן פריער נישט-קולטורירטע געדערעם מיקראָביאָטאַ אין לאַבאָראַטאָריע. אויב אונדזער אין וויטראָ מאָרפאָגענעסיס פּראָטאָקאָל קען זיין אַדאַפּטירט צו סקאַלירבאַרע קולטור פֿאָרמאַטן, אַזאַ ווי מולטיוועלל ינסערץ אין 24, 96 אָדער 384 וועלל פּלאַטעס וואָס קאַנטיניואַסלי ריפּלעניש באַזאָלאַטעראַל קאַמפּאַרטמאַנץ, קען דער פּראָטאָקאָל אויך זיין פאַרשפּרייט צו יענע וואָס אַנטוויקלען פאַרמאַסוטיקאַל, ביאָמעדיקאַל אָדער הויך-דורכפֿלוס סקרינינג אָדער וואַלידאַציע פּלאַטפאָרמעס פֿאַר די עסנוואַרג אינדוסטריע. ווי אַ באַווייַז-פון-פּרינציפּ, מיר לעצטנס דעמאַנסטרייטיד די מעגלעכקייט פון אַ מולטיפּלעקס הויך-דורכפֿלוס מאָרפאָגענעסיס סיסטעם סקאַלירבאַר צו אַ 24-וועלל פּלאַטע פֿאָרמאַט. אין דערצו, קייפל אָרגאַן-אויף-אַ-טשיפּ פּראָדוקטן זענען געווען קאַמערשאַלייזד16,17,18. דעריבער, די וואַלידאַציע פון ​​אונדזער אין וויטראָ מאָרפאָגענעסיס מעטאָד קען זיין אַקסעלערייטיד און פּאָטענציעל אנגענומען דורך פילע פאָרשונג לאַבאָראַטאָריעס, אינדוסטריע אָדער רעגירונג און רעגולאַטאָרי אַגענטורן צו פֿאַרשטיין סעליאַלער רעפּראָגראַממינג פון אין וויטראָ געדערעם מאָרפאָגענעסיס אין די טראַנסקריפּטאָמיק מדרגה צו פּרובירן דרוגס אָדער ביאָטהעראַפּיוטיקס די אַבזאָרפּשאַן און טראַנספּאָרט פון מעדיצין קאַנדידאַטן איז געווען אַססעססעד ניצן 3D געדערעם סוראָגאַטעס אָדער ניצן מנהג אָדער קאמערציעלע אָרגאַן-אויף-אַ-טשיפּ מאָדעלס צו אַססעסס די רעפּראָדוסיביליטי פון דעם געדערעם מאָרפאָגענעסיס פּראָצעס.
א באגרענעצטע צאָל פון מענטש-רעלעוואַנטע עקספּערימענטאַלע מאָדעלן זענען גענוצט געוואָרן צו שטודירן אינטעסטינאַלע עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס, הויפּטזעכלעך צוליב דעם מאַנגל פון אימפּלעמענטאַבלע פּראָטאָקאָלן צו אינדוצירן 3D מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ. אין פאַקט, פיל פון די איצטיקע וויסן וועגן קישקע מאָרפאָגענעסיס איז באַזירט אויף כייַע שטודיעס (למשל, זעבראַפיש20, מײַז21 אָדער הינער22). אָבער, זיי זענען אַרבעט- און קאָסטן-אינטענסיוו, קענען זײַן עטיש צווייפלדיק, און וויכטיקסטנס, באַשטימען נישט פּינקטלעך מענטשלעכע אַנטוויקלונג פּראָצעסן. די מאָדעלן זענען אויך זייער באגרענעצט אין זייער פיייקייט צו ווערן טעסטעד אין אַ מולטי-וועג סקאַלירבאַר שטייגער. דעריבער, אונדזער פּראָטאָקאָל פֿאַר רעגענערירן 3D געוועב סטרוקטורן אין וויטראָ אַוטפּערפאָרמז אין וויוואָ כייַע מאָדעלן ווי אויך אַנדערע טראַדיציאָנעלע סטאַטישע 2D צעל קולטור מאָדעלן. ווי פריער באַשריבן, די נוצן פון 3D עפּיטעליאַל סטרוקטורן האָט אונדז דערלויבט צו ונטערזוכן די ספּיישאַל לאָקאַליזאַציע פון ​​דיפערענצירטע צעלן אין די קריפּט-ווילוס אַקס אין ענטפער צו פאַרשידענע מיוקאָוסאַל אָדער ימיון סטימיאַליי.3D עפּיטעליאַל לייַערס קענען צושטעלן אַ פּלאַץ צו שטודירן ווי מיקראָביאַל צעלן קאָנקורירן צו פאָרעם ספּיישאַל נישעס און עקאַלאַדזשיקאַל עוואָלוציע אין ענטפער צו באַלעבאָס סיבות (למשל, ינער קעגן ויסווייניקסט מיוקאַס לייַערס, סעקרעשאַן פון IgA און אַנטימיקראָביאַל פּעפּטיידן). דערצו, 3D עפּיטעליאַל מאָרפאָלאָגיע קען אונדז דערלויבן צו פֿאַרשטיין ווי די געדערעם מיקראָביאָטאַ סטרוקטורירט זייַנע קהילות און סינערגיסטיש פּראָדוצירט מיקראָביאַל מעטאַבאָליטן (למשל, קורץ-קייט פעטי אַסאַדז) וואָס פֿאָרמען צעלולאַר אָרגאַניזאַציע און סטעם צעל נישעס אין די באַסאַל קריפּטס. די פֿעיִקייטן קענען בלויז דעמאַנסטרירט ווערן ווען 3D עפּיטעליאַל לייַערס זענען געגרינדעט אין וויטראָ.
אין צוגאב צו אונדזער מעטאד פון שאפן 3D אינטעסטינאלע עפּיטעליאַל סטרוקטורן, זענען דא עטלעכע אין וויטראָ מעטאָדן. אינטעסטינאלע אָרגאַנאָיד קולטור איז אַ שטאַט-פון-די-קונסט געוועב אינזשעניריע טעכניק באַזירט אויף דער קולטיוואַציע פון ​​אינטעסטינאלע סטעם סעלז אונטער ספּעציפֿישע מאָרפאָגען באדינגונגען23,24,25. אָבער, די נוצן פון 3D אָרגאַנאָיד מאָדעלס פֿאַר טראַנספּאָרט אַנאַליסיס אָדער באַלעבאָס-מיקראָביאָם קאָ-קולטורעס איז אָפט טשאַלאַנדזשינג ווייַל די אינטעסטינאלע לומען איז ענקלאָוזד אין די אָרגאַנאָיד און, דעריבער, די הקדמה פון לומינאַל קאַמפּאָונאַנץ אַזאַ ווי מיקראָביאַל סעלז אָדער עקסאָגענאָוס אַנטיגענס איז לימיטעד. צוטריט צו אָרגאַנאָיד לומענס קענען זיין ימפּרוווד ניצן אַ מיקראָינדזשעקטאָר,26,27 אָבער דעם מעטאָד איז ינווייסיוו און אַרבעט-אינטענסיוו און ריקווייערז ספּעשאַלייזד וויסן צו דורכפירן. דערצו, טראַדיציאָנעלע אָרגאַנאָיד קולטורן מיינטיינד אין הידראָגעל סקאַפאָולדז אונטער סטאַטיק באדינגונגען טאָן ניט אַקיעראַטלי שפּיגלען אַקטיוו אין וויוואָ ביאָמעכאַניקס.
אַנדערע צוגאַנגען וואָס ווערן גענוצט דורך עטלעכע פאָרשונג גרופּעס נוצן פאַר-סטרוקטורירטע 3D הידראָגעל סקאַפאָולדז צו נאָכמאַכן די קישקע עפּיטעליאַל סטרוקטור דורך קולטורירן אפגעזונדערטע מענטשלעכע קישקע צעלן אויף דער געל ייבערפלאַך. פאַבריצירן הידראָגעל סקאַפאָולדז מיט 3D-געדרוקטע, מיקראָ-געמילטע, אָדער ליטאָגראַפֿיש פאַבריצירטע פורמען. די מעטאָדע ווייזט די זיך-אָרגאַניזירטע אָרדענונג פון אפגעזונדערטע עפּיטעליאַל צעלן אין וויטראָ מיט פיזיאָלאָגיש באַטייַטיק מאָרפאָגען גראַדיענטן, גרינדן אַ הויך אַספּעקט פאַרהעלטעניש עפּיטעליאַל סטרוקטור און סטראָמאַ-עפּיטעליאַל קראָסטאָלק דורך אַרייננעמען סטראָמאַל צעלן אין די סקאַפאָולד. אָבער, די נאַטור פון פאַר-סטרוקטורירטע סקאַפאָולדז קען פאַרהיטן די אַרויסווייַזן פון די ספּאַנטייניאַס מאָרפאָגענעטיק פּראָצעס זיך. די מאָדעלס אויך טאָן ניט צושטעלן דינאַמיש לומינאַל אָדער ינטערסטיטיאַל לויפן, פעלנדיק די פליסיק שער דרוק וואָס קישקע צעלן דאַרפֿן צו דורכגיין מאָרפאָגענעסיס און געווינען פיזיאָלאָגישע פונקציע. אן אנדער פריש לערנען גענוצט הידראָגעל סקאַפאָולדז אין אַ מיקראָפלוידיק פּלאַטפאָרמע און פּאַטערנד קישקע עפּיטעליאַל סטראַקטשערז מיט לאַזער-עטשינג טעקניקס. מויז קישקע אָרגאַנאָידס נאָכפאָלגן עטשט פּאַטערנז צו פאָרעם קישקע טובולאַר סטראַקטשערז, און ינטראַלומינאַל פליסיק לויפן קענען זיין ריקאַפּיטאַלייטיד מיט אַ מיקראָפלוידיקס מאָדול. אָבער, דאָס מאָדעל ווייזט נישט קיין ספּאָנטאַנע מאָרפאָגענעטישע פּראָצעסן און נעמט נישט אַרײַן קיין מעכאַנאָביאָלאָגישע באַוועגונגען אין די קישקעס. 3D דרוק טעקניקס פֿון דער זעלבער גרופּע האָבן געקענט שאַפֿן מיניאַטור קישקע רערן מיט ספּאָנטאַנע מאָרפאָגענעטישע פּראָצעסן. טראָץ דער קאָמפּלעקסער פֿאַבריקאַציע פֿון פֿאַרשידענע קישקע סעגמענטן אין דער רער, פֿעלט דאָס מאָדעל אויך קיין לומינאַל פֿליסיקייט פֿלוס און מעכאַנישע דעפֿאָרמאַציע. דערצו, קען די מאָדעל אָפּעראַביליטי זײַן באַגרענעצט, ספּעציעל נאָכדעם ווי דער ביאָפּרינט פּראָצעס איז פֿאַרענדיקט, וואָס שטערט עקספּערימענטאַלע באַדינגונגען אָדער צעל-צו-צעל אינטעראַקציעס. אַנשטאָט, גיט אונדזער פֿאָרגעלייגטער פּראָטאָקאָל ספּאָנטאַנע קישקע מאָרפאָגענעסיס, פֿיזיאָלאָגיש באַטייַטיקע שער דרוק, ביאָמעכאַניקס וואָס נאָכמאַכן קישקע מאָטיליטי, צוטריטלעכקייט פֿון אומאָפּהענגיקע אַפּיקאַלע און באַזאָלאַטעראַלע אָפּטיילן, און ווידער-שאַפֿונג פֿון קאָמפּלעקסע ביאָלאָגישע מיקראָ-סביבות פֿון מאָדולאַריטעט. דעריבער, קען אונדזער אין וויטראָ 3D מאָרפאָגענעסיס פּראָטאָקאָל צושטעלן אַ קאָמפּלעמענטאַרן צוגאַנג צו איבערקומען די טשאַלאַנדזשיז פֿון עקזיסטירנדיקע מעטאָדן.
אונדזער פּראָטאָקאָל איז אינגאַנצן פאָקוסירט אויף 3D עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס, מיט בלויז עפּיטעליאַל צעלן אין קולטור און קיין אנדערע טייפּס פון אַרומיקע צעלן אַזאַ ווי מעזענטשימאַל צעלן, ענדאָטעליאַל צעלן, און ימיון צעלן. ווי פריער באַשריבן, דער קערן פון אונדזער פּראָטאָקאָל איז די אינדוקציע פון ​​עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס דורך באַזייַטיקן מאָרפאָגען ינכיבאַטאָרס סעקרעטעד ביי די באַזאָלאַטעראַל זייַט פון די ינטראָודוסט מעדיום. כאָטש די ראָבוסט מאַדזשולאַריטי פון אונדזער גוט-אויף-אַ-טשיפּ און כייבריד-אויף-אַ-טשיפּ אַלאַוז אונדז צו ריקריייט די כוואַליע 3D עפּיטעליאַל שיכטע, נאָך ביאָלאָגיש קאָמפּלעקסיטיז אַזאַ ווי עפּיטעליאַל-מעסענטשימאַל ינטעראַקשאַנז33,34, עקסטראַסעלולאַר מאַטריץ (ECM) דעפּאָזיציע35 און, אין אונדזער מאָדעל, קריפּט-ווילוס פֿעיִקייטן וואָס קאַנוויי סטעם צעל נישעס אין באַסאַל קריפּטס בלייבן צו זיין ווייַטער באַטראַכט. סטראָמאַל צעלן (למשל, פיבראָבלאַסטס) אין די מעזענטשימע שפּילן אַ שליסל ראָלע אין די פּראָדוקציע פון ​​ECM פּראָטעינס און רעגולירן פון ינטעסטאַנאַל מאָרפאָגענעסיס אין וויוואָ35,37,38. די דערצו פון מעזענטשימאַל צעלן צו אונדזער מאָדעל פֿאַרבעסערט דעם מאָרפאָגענעטישן פּראָצעס און צעל אַטאַטשמענט עפֿיקאַסי. די ענדאָטעליאַל שיכט (ד"ה קאַפּילאַריעס אָדער לימפאַטיקס) שפּילט אַ וויכטיקע ראָלע אין רעגולירן מאָלעקולאַר טראַנספּאָרט39 און ימיון צעל רעקרוטמענט40 אין די געדערעם מיקראָ-סביבה. דערצו, וואַסקולאַטור קאָמפּאָנענטן וואָס קענען זיין פארבונדן צווישן געוועב מאָדעלס זענען אַ פּרירעקוויזיט ווען געוועב מאָדעלס זענען דיזיינד צו דעמאָנסטרירן מולטי-אָרגאַן ינטעראַקשאַנז. דעריבער, ענדאָטעליאַל סעלז קען דאַרפֿן צו זיין אַרייַנגערעכנט צו מאָדעל מער פּינטלעך פיזיאַלאַדזשיקאַל פֿעיִקייטן מיט אָרגאַן-לעוועל האַכלאָטע. פּאַציענט-דערייווד ימיון סעלז זענען אויך יקערדיק פֿאַר אַרויסווייַזן ינייט ימיון ריספּאָנסעס, אַנטיגען פּרעזענטירונג, ינייט אַדאַפּטיוו ימיון קראָסטאָלק, און געוועב-ספּעציפֿיש ימיונאַטי אין דעם קאָנטעקסט פון נאָכמאַכן ינטעסטאַנאַל קרענק.
די נוצֿונג פֿון כייבריד טשיפּס איז מער גלייך ווי גוט-אויף-אַ-טשיפּ ווייל די דעווייס סעטאַפּ איז פּשוטער און די נוצֿונג פֿון טראַנסוועלל ינסערץ ערמעגליכט סקאַלירבאַרע קולטור פֿון גוט עפּיטעליום. אָבער, קאמערציעל בנימצא טראַנסוועלל ינסערץ מיט פּאָליעסטער מעמבראַנעס זענען נישט עלאַסטיש און קענען נישט סימולירן פּעריסטאַלטיק-ווי באַוועגונגען. דערצו, די אַפּיקאַל אָפּטייל פֿון די טראַנסוועלל ינסערץ געשטעלט אין די כייבריד טשיפּ איז געבליבן סטאַציאָנער אָן קיין שער דרוק אויף די אַפּיקאַל זייַט. קלאָר, די סטאַטיק פּראָפּערטיעס אין די אַפּיקאַל אָפּטייל ראַרעלי ערמעגליכן לאַנג-טערמין באַקטיריאַל קאָ-קולטור אין כייבריד טשיפּס. כאָטש מיר קענען ראָובאַסטלי אינדוצירן 3D מאָרפֿאָגענעסיס אין טראַנסוועלל ינסערץ ווען מיר נוצן כייבריד טשיפּס, דער מאַנגל פֿון פֿיזיאָלאָגיש באַטייַטיק ביאָמעכאַניקס און אַפּיקאַל פליסיק לויפן קען באַגרענעצן די מעגלעכקייט פֿון כייבריד טשיפּ פּלאַטפֿאָרמעס פֿאַר פּאָטענציעל אַפּלאַקיישאַנז.
פולשטענדיגע רעקאנסטרוקציעס פון דער מענטשלעכער קריפּט-ווילוס אַקס אין גוט-אויף-א-טשיפּ און כייבריד-אויף-א-טשיפּ קולטורן זענען נישט גאָר געגרינדעט געוואָרן. זינט מאָרפאָגענעסיס הייבט זיך אָן פון אַן עפּיטעליאַל מאָנאָלייער, 3D מיקראָאַרכיטעקטורן צושטעלן נישט דאַווקע מאָרפאָלאָגישע ענלעכקייט צו קריפּטן אין וויוואָ. כאָטש מיר האָבן קעראַקטעריזירט די פּראָליפערייטינג צעל באַפעלקערונג לעבן די באַזאַלע קריפּט דאָומיין אין די מיקראָענדזשאַנירד 3D עפּיטעליום, די קריפּט און ווילאַס מקומות זענען נישט קלאָר דעמאַרקייטיד. כאָטש העכער אויבערשטער טשאַנאַלז אויף די טשיפּ פירן צו געוואקסן הייך פון די מיקראָענדזשאַנירד עפּיטעליום, די מאַקסימום הייך איז נאָך לימיטעד צו ~300-400 µm. די פאַקטיש טיפקייַט פון מענטשלעכע קישקע קריפּטן אין די קליין און גרויס קישקע איז ~135 µm און ~400 µm, ריספּעקטיוולי, און די הייך פון די קליין קישקע ווילי איז ~600 µm41.
פֿון אַן אימעדזשינג שטאַנדפּונקט, קען אין סיטו סופּער-רעזאָלוציע אימעדזשינג פֿון 3D מיקראָאַרכיטעקטורן זײַן באַגרענעצט צו די געדערעם אויף אַ טשיפּ, ווײַל די נויטיקע אַרבעטס-דיסטאַנץ פֿון דער אָביעקטיוו לינזע ביז דער עפּיטעליאַלער שיכט איז אין דער אָרדענונג פֿון אַ פּאָר מילימעטערס. כּדי צו פֿאַרקומען דעם פּראָבלעם, קען אַ ווײַטער אָביעקטיוו זײַן נויטיק. ווײַטער, איז מאַכן דינע סעקשאַנז פֿאַר אימעדזשינג ספּעסאַמאַן צוגרייטונג אַ שווערע אויפֿגאַבע צוליב דער הויכער עלאַסטיסיטי פֿון PDMS. ווײַטער, ווײַל די שיכט-בײַ-שיכט מיקראָפֿאַבריקאַציע פֿון די געדערעם אויף אַ טשיפּ באַדײַט אַ שטענדיקע אַדכיזשאַן צווישן יעדער שיכט, איז עס גאָר שווער צו עפֿענען אָדער אַראָפּנעמען די אויבערשטע שיכט צו דורכקוקן די ייבערפֿלאַך סטרוקטור פֿון דער עפּיטעליאַלער שיכט. למשל, דורך ניצן אַ סקאַנינג עלעקטראָן מיקראָסקאָפּ (SEM).
די הידראָפאָביציטעט פון PDMS איז געווען אַ לימיטירנדיקער פאַקטאָר אין מיקראָפלוידיק-באַזירטע שטודיעס וואָס האַנדלען מיט הידראָפאָבישע קליינע מאָלעקולן, ווייַל PDMS קען נישט ספּעציפֿיש אַדסאָרבירן אַזעלכע הידראָפאָבישע מאָלעקולן. אַלטערנאַטיוון צו PDMS קען מען באַטראַכטן מיט אַנדערע פּאָלימערישע מאַטעריאַלן. אַלטערנאַטיוולי, קען מען באַטראַכטן ייבערפלאַך מאָדיפיקאַציע פון ​​PDMS (למשל, קאָוטינג מיט ליפּאָפילישע מאַטעריאַלן 42 אָדער פּאָלי(עטאַלין גליקאָל) 43) צו מינימיזירן אַדסאָרפּציע פון ​​הידראָפאָבישע מאָלעקולן.
צום סוף, אונדזער מעטאָדע איז נישט גוט כאַראַקטעריזירט געוואָרן אין טערמינען פון צושטעלן אַ הויך-דורכפיר סקרינינג אָדער "איין-גרייס-פּאַסט-אַלעמען" באַניצער-פרייַנדלעך עקספּערימענטאַל פּלאַטפאָרמע. דער איצטיקער פּראָטאָקאָל ריקווייערז אַ שפּריץ פּאָמפּע פּער מיקראָדעוויס, וואָס נעמט פּלאַץ אין אַ CO2 אינקובאַטאָר און פאַרהיט גרויס-וואָג עקספּערימענטן. די לימיטאַציע קען זיין באַדייטנד פֿאַרבעסערט דורך די סקאַלאַביליטי פון ינאָוואַטיווע קולטור פֿאָרמאַטן (למשל, 24-וועלל, 96-וועלל, אָדער 384-וועלל פּאָרעזע ינסערץ וואָס לאָזן קעסיידערדיק ריפּלענישמאַנט און באַזייַטיקונג פון באַזאָלאַטעראַל מעדיע).
כדי צו אינדוצירן 3D מאָרפאָגענעסיס פון מענטשלעכן אינטעסטינאַלן עפּיטעליום אין וויטראָ, האָבן מיר גענוצט אַ מיקראָפלוידיק טשיפּ אינטעסטינאַלן מיטל מיט צוויי פּאַראַלעלע מיקראָטשאַנאַלז און אַן עלאַסטישע פּאָרעזע מעמבראַנע צווישן צו שאַפֿן אַ לומען-קאַפּילערי צובינד. מיר דעמאָנסטרירן אויך די נוצן פון אַ איין-טשאַנאַל מיקראָפלוידיק מיטל (אַ כייבריד טשיפּ) וואָס גיט קאָנטינויִערלעך באַזאָלאַטעראַל לויפן אונטער פּאָלאַריזירטע עפּיטעליאַל לייַערס וואָס וואַקסן אויף טראַנסוועל ינסערץ. אין ביידע פּלאַטפאָרמעס, קען מען דעמאָנסטרירן מאָרפאָגענעסיס פון פֿאַרשידענע מענטשלעכע אינטעסטינאַלן עפּיטעליאַל צעלן דורך אַפּלייינג דירעקציאָנעלע מאַניפּולאַציע פון ​​לויפן צו באַזייַטיקן מאָרפאָגען אַנטאַגאָניסטן פון די באַזאָלאַטעראַל אָפּטייל. די גאַנצע עקספּערימענטאַלע פּראָצעדור (פיגור 1) באַשטייט פון פינף טיילן: (i) מיקראָפאַבריקאַציע פון ​​דעם קישקע טשיפּ אָדער טראַנסוועל ינסערטאַבל כייבריד טשיפּ (סטעפּס 1-5; קעסטל 1), (ii) צוגרייטונג פון אינטעסטינאַלן עפּיטעליאַל צעלן (קאַקאָ-2 צעלן) אָדער מענטשלעכע אינטעסטינאַלן אָרגאַנאָידס; קעסטלעך 2-5), (iii) קולטור פון אינטעסטינאַלע עפּיטעליאַל צעלן אויף אינטעסטינאַלע טשיפּס אָדער כייבריד טשיפּס (טריט 6-9), (iv) אינדוקציע פון ​​3D מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ (טריט 10) און (v)) צו כאַראַקטעריזירן די 3D עפּיטעליאַל מיקראָסטרוקטור (טריט 11-24). צום סוף, אַן אַפּראָפּריאַטע קאָנטראָל גרופּע (דיסקוטירט ווייטער אונטן) איז געווען דיזיינד צו וואַלידירן די עפעקטיווקייט פון אין וויטראָ מאָרפאָגענעסיס דורך פאַרגלייַכן עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס צו ספּיישאַל, טעמפּאָראַל, קאַנדישאַנאַל, אָדער פּראָצעדוראַל קאָנטראָלס.
מיר האָבן גענוצט צוויי פֿאַרשידענע קולטור פּלאַטפאָרמעס: גוט-אויף-אַ-טשיפּ מיט גלייכע קאַנאַלן אָדער ניט-לינעאַרע קאָנוואַלוטעד קאַנאַלן, אָדער כייבריד טשיפּס מיט טראַנסוועל (TW) ינסערץ אין אַ מיקראָפלוידיק מיטל, פאַבריצירט ווי באַשריבן אין קעסטל 1, און שריט 1-5. "מיטל פאַבריקאַציע" ווייזט די הויפּט טריט אין מאכן אַ איין טשיפּ אָדער אַ כייבריד טשיפּ. "קולטור פון מענטשלעכע אינטעסטינאַל עפּיטעליאַל סעלז" דערקלערט די צעל מקור (קאַקאָ-2 אָדער מענטשלעכע אינטעסטינאַל אָרגאַנאָידס) און קולטור פּראָצעדור געניצט אין דעם פּראָטאָקאָל. "אין וויטראָ מאָרפאָגענעסיס" ווייזט די קוילעלדיק טריט אין וועלכע קאַקאָ-2 אָדער אָרגאַנאָיד-דערייווד עפּיטעליאַל סעלז זענען קאַלטשערד אויף אַ אינטעסטינאַל טשיפּ אָדער אויף טראַנסוועל ינסערץ פון אַ כייבריד טשיפּ, נאכגעגאנגען דורך ינדוקציע פון ​​3D מאָרפאָגענעסיס און די פאָרמירונג פון אַ קעראַקטעריזד עפּיטעליאַל סטרוקטור. די פּראָגראַם שריט נומער אָדער קעסטל נומער איז געוויזן אונטער יעדער פייַל. די אַפּלאַקיישאַן גיט ביישפילן פון ווי געגרינדעט אינטעסטינאַל עפּיטעליאַל לייַערס קענען זיין געניצט, למשל, אין צעל דיפערענטשייישאַן קעראַקטעריזיישאַן, גוט פיזיאַלאַדזשי שטודיעס, פאַרלייגן פון באַלעבאָס-מיקראָביאָמע עקאָסיסטעמען, און קראַנקייט מאָדעלינג. יממונאָפלאָרעסענס בילדער אין "צעל דיפערענציאציע" וואס ווייזן קערנס, F-אקטין און MUC2 אויסגעדריקט אין די 3D קאקא-2 עפיטעליאלע שיכט גענערירט אויף די געדערעם טשיפּ. MUC2 סיגנאַלינג איז פאָרשטעלן אין גאָבלעט סעלז און מוקוס סעקרעטעד פון מיוקאָוסאַל סערפאַסיז. פלואָרעסענט בילדער אין געדערעם פיזיאָלאָגי ווייַזן מוקוס געשאפן דורך סטיינינג פֿאַר סיאַליק זויער און N-אַסעטילגלוקאָסאַמין רעזאַדוז ניצן פלואָרעסענט ווייץ קערן אַגלוטינין. די צוויי אָוווערלאַפּינג בילדער אין "האָסט-מיקראָב קאָ-קולטורעס" ווייַזן רעפּרעזענטאַטיוו באַלעבאָס-מיקראָביאָם קאָ-קולטורעס אין די געדערעם אויף אַ טשיפּ. די לינקע טאַפליע ווייזט די קאָ-קולטור פון E. coli אויסדריקן גרין פלואָרעסענט פּראָטעין (GFP) מיט מיקראָענדזשאַנירד 3D קאַקאָ-2 עפיטעליאַל סעלז. די רעכטע טאַפליע ווייזט די לאָקאַליזאַציע פון ​​GFP E. coli קאָ-קולטורעד מיט 3D קאַקאָ-2 עפיטעליאַל סעלז, נאכגעגאנגען דורך יממונאָפלואָרעסענס סטיינינג מיט F-אקטין (רויט) און קערנס (בלוי). קראַנקייט מאָדעלינג אילוסטרירט געזונט קעגן ליקי געדערעם אין געדערעם אָנצינדונג טשיפּס אונטער פיזיאַלאַדזשיקאַל אַרויסרופן מיט באַקטיריאַל אַנטיגענס (למשל, ליפּאָפּאָליסאַקאַריד, LPS) און ימיון צעלן (למשל, PBMC; גרין). קאַקאָ-2 צעלן זענען קאָלטיווירט געוואָרן צו שאַפֿן אַ 3D עפּיטעליאַל שיכט. סקאַלע באַר, 50 µm. בילדער אין אונטערשטער ריי: "דיפערענציאַציע פון ​​צעלן" אַדאַפּטירט מיט דערלויבעניש פון רעפערענץ.2. אָקספֿאָרד אוניווערסיטעט פּרעס; רעפּראָדוצירט מיט דערלויבעניש פון רעפערענץ 5. NAS; "האָסט-מיקראָב קאָ-קולטור" אַדאַפּטירט מיט דערלויבעניש פון רעפערענץ 3. NAS; "קרענק מאָדעלינג" אַדאַפּטירט מיט דערלויבעניש פון רעפערענץ 5. NAS.
ביידע גוט-אויף-טשיפּ און כייבריד טשיפּס זענען פאַבריצירט מיט PDMS רעפּליקעס וואָס זענען דעמאָולדעד פון סיליקאָן פורמען דורך ווייך ליטאָגראַפֿיע1,44 און פּאַטערנד מיט SU-8. דער פּלאַן פון די מיקראָטשאַנאַלז אין יעדן טשיפּ איז באַשטימט דורך באַטראַכטן הידראָדינאַמיק אַזאַ ווי שער דרוק און הידראָדינאַמיש דרוק1,4,12. דער אָריגינעל גוט-אויף-אַ-טשיפּ פּלאַן (עקסטענדעד דאַטאַ פיג. 1אַ), וואָס באַשטאַנען פון צוויי דזשוקסטאַפּאָוזד פּאַראַלעל גלייַך מיקראָטשאַנאַלז, האט יוואַלווד אין אַ קאָמפּלעקס גוט-אויף-אַ-טשיפּ (עקסטענדעד דאַטאַ פיג. 1ב) וואָס כולל אַ פּאָר פון קערווד מיקראָטשאַנאַלז צו ינדוסירן געוואקסן פליסיק וווינאָרט צייט, ניט-לינעאַר לויפן פּאַטערנז, און מולטיאַקסיאַל דעפאָרמאַטיאָן פון קאַלטשערד סעלז (פיג. 2אַ-ו)12.ווען מער קאָמפּלעקס גוט ביאָמעכאַניקס דאַרפֿן צו זיין ריקריייטיד, קאָמפּלעקס גוט-אויף-אַ-טשיפּס קענען זיין אויסדערוויילט. מיר האָבן דעמאַנסטרייטיד אַז די קאָנוואַלוטעד גוט-טשיפּ אויך שטאַרק ינדוסיז 3D מאָרפאָגענעסיס אין אַ ענלעך צייט ראַם מיט אַ ענלעך גראַד פון עפּיטעליאַל וווּקס קאַמפּערד צו די אָריגינעל. גוט-טשיפּ, אומאפהענגיק פון דעם קולטורירטן צעל טיפ. דעריבער, צו אינדוצירן 3D מאָרפאָגענעסיס, זענען לינעאַרע און קאָמפּלעקסע אויף-טשיפּ גוט דיזיינז אויסטוישלעך. PDMS רעפּליקעס געהאַרט אויף סיליקאָן פורמען מיט SU-8 פּאַטערנז האָבן צוגעשטעלט נעגאַטיווע פֿעיִקייטן נאָך דעמאָולדינג (פיגור 2אַ). צו פאַבריצירן דעם גוט אויף אַ טשיפּ, איז די צוגעגרייטע אויבערשטע PDMS שיכט סיקווענטשאַלי געבונדן צו אַ פּאָרעז PDMS פילם און דערנאָך אַליינד מיט די נידעריקער PDMS שיכט דורך אומקערלעך באַנדינג ניצן אַ קאָראָנאַ טרעאַטער (פיגור 2ב-ו). צו פאַבריצירן כייבריד טשיפּס, זענען געהאַרטע PDMS רעפּליקעס געבונדן צו גלאז סליידז צו שאַפֿן איין-קאַנאַל מיקראָפלוידיק דעוויסעס וואָס קענען אַקאַמאַדייט טראַנסוועל ינסערץ (פיגור 2ה און עקסטענדעד דאַטאַ פיגור 2). דער באַנדינג פּראָצעס איז דורכגעפירט דורך באַהאַנדלען די סערפאַסיז פון די PDMS רעפּליקע און גלאז מיט זויערשטאָף פּלאַזמע אָדער קאָראָנאַ באַהאַנדלונג. נאָך סטעריליזאַציע פון ​​די מיקראָפאַבריקירטע מיטל אַטאַטשט צו די סיליקאָנע רער, איז די מיטל סעטאַפּ געווען גרייט צו דורכפירן 3D מאָרפאָגענעסיס פון די ינטעסטאַנאַל עפּיטעליום (פיגור 2ג).
א, סכעמאטישע אילוסטראציע פון ​​דער צוגרייטונג פון PDMS טיילן פון SU-8 געמוסטערטע סיליקאן פורעמען. די נישט-אויסגעהארטע PDMS לייזונג איז געגאסן געווארן אויף א סיליקאן פורעם (לינקס), אויסגעהארטעוועט ביי 60 °C (מיטן) און ארויסגענומען פון די מאָולד (רעכטס). די ארויסגענומעןע PDMS איז געשניטן געווארן אין שטיקלעך און ריין געמאכט פאר ווייטערדיגע באנוץ. ב, פאטאגראפיע פון ​​דער סיליקאן פורעם גענוצט צו צוגרייטן די PDMS אויבערשטע שיכט. ג, פאטאגראפיע פון ​​דער סיליקאן פורעם גענוצט צו פאבריצירן די PDMS פּאָרעזע מעמבראַנע. ד, א סעריע פאטאגראפיעס פון די אויבערשטע און אונטערשטע PDMS קאמפאנענטן און די צוזאמענגעשטעלטע אויף-טשיפּ אינטעסטינאַלע מיטל. ה, סכעמאטישע פון ​​דער אויסריכטונג פון די אויבערשטע, מעמבראַנע, און אונטערשטע PDMS קאמפאנענטן. יעדע שיכט איז אומקערלעך געבונדן דורך פּלאַזמע אדער קאָראָנאַ באַהאַנדלונג. ו, סכעמאטישע פון ​​די פאבריצירטע גוט-אויף-א-טשיפּ מיטל מיט איבערגעלייגטע קאָנוואַלוטעד מיקראָטשאַננעלס און וואַקוום קאַמערן. ז, סעטאַפּ פון גוט-אויף-א-טשיפּ פאר מיקראָפלוידיק צעל קולטור. די פאבריצירטע גוט-אויף-א-טשיפּ צוזאמענגעשטעלט מיט א סיליקאן רער און שפּריץ איז געשטעלט געווארן אויף א דעקל. די טשיפּ מיטל איז געשטעלט געווארן אויף די דעקל פון א 150 מ״מ פּעטרי שיסל פאר פּראַסעסינג. דער בינדער ווערט גענוצט צו פארמאכן די סיליקאָנע רער.h, וויזועלע בילדער פון כייבריד טשיפּ פאַבריקאַציע און 3D מאָרפאָגענעסיס מיט כייבריד טשיפּס. טראַנסוועלל ינסערץ צוגעגרייט אומאָפּהענגיק צו קולטור 2D מאָנאָלייערס פון ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל סעלז זענען ינסערטאַד אין די כייבריד טשיפּ צו ינדוסינג ינטעסטאַנאַל 3D מאָרפאָגענעסיס. די מעדיום איז פּערפיוזד דורך מיקראָטשאַנאַלז אונטער די צעל שיכטע געגרינדעט אויף די טראַנסוועלל ינסערץ. סקאַלע באַר, 1 סענטימעטער.h איבערגעדרוקט מיט דערלויבעניש פון רעפערענץ.4. עלסעוויער.
אין דעם פּראָטאָקאָל, די קאַקאָ-2 צעל ליניע און אינטעסטינאַלע אָרגאַנאָידן זענען געניצט געוואָרן ווי עפּיטעליאַלע קוועלער (פיגור 3אַ). ביידע טיפּן צעלן זענען קאָלטיווירט געוואָרן אומאָפּהענגיק (קעסטל 2 און קעסטל 5) און געניצט צו זייען די ECM-קאָוטאַד מיקראָטשאַנאַלז פון אויף-טשיפּ קישקע אָדער טראַנסוועלל ינסערץ. ווען צעלן זענען קאָנפלוענט (>95% קאַווערידזש אין פלאַשקס), רוטינלי קאָלטיווירטע קאַקאָ-2 צעלן (צווישן פּאַסאַזשעס 10 און 50) אין T-פלאַשקס זענען כאַרוואַסטיד צו צוגרייטן דיסאָסיאַטעד צעל סאַספּענשאַנז דורך טריפּסיניזאַטיאָן פליסיק (קעסטל 2). מענטשלעכע אינטעסטינאַלע אָרגאַנאָידן פון אינטעסטינאַלע ביאָפּסיעס אָדער כירורגיש רעסעקשאַנז זענען קאָלטיווירט געוואָרן אין מאַטריגעל סקאַפאָולד דאָמעס אין 24-ברונע פּלאַטעס צו שטיצן די סטרוקטוראַל מיקראָענווייראָנמענט. מעדיום וואָס כּולל עסענטשאַל מאָרפאָגענס (אַזאַ ווי Wnt, R-ספּאָנדין, און נאָגגין) און וווּקס פאַקטאָרן צוגעגרייט ווי דיסקרייבד אין קעסטל 3 איז געווען סאַפּלאַמענטאַד יעדן צווייטן טאָג ביז די אָרגאַנאָידן זענען געוואקסן צו ~500 µm אין דיאַמעטער. גאָר דערוואַקסן אָרגאַנאָידן זענען כאַרוואַסטיד און דיסאָסיאַטעד אין איין צעלן פֿאַר זוימען אויף געדערעם אדער טראַנסוועלל ינסערץ אויף אַ טשיפּ (קעסטל 5). ווי מיר האָבן פריער געמאלדן, קען עס זיין דיפערענצירט לויט קראַנקייט טיפּ12,13 (למשל, ולסעראַטיווע קאָליטיס, קראָהן'ס קרענק, קאָלאָרעקטאַל ראַק, אָדער נאָרמאַל דאָנאָר), לעזשאַן פּלאַץ (למשל, לעזשאַן קעגן ניט-לעסיאָנעד געגנט) און גאַסטראָוינטעסטאַנאַל אָרט אין די טראַקט (למשל, דואָדענום, דזשעדזשונום, אילעום, צעקום, קאָלאָן, אָדער רעקטום). מיר צושטעלן אַן אָפּטימיזעד פּראָטאָקאָל אין קעסטל 5 פֿאַר קולטיווייטינג קאָלאָניק אָרגאַנאָידס (קאָלאָידס) וואָס טיפּיקלי דאַרפן העכער קאַנסאַנטריישאַנז פון מאָרפאָגענס ווי קליין געדערעם אָרגאַנאָידס.
א, ארבעטס-פלוס פאר דער אינדוקציע פון ​​געדערעם-מאָרפאָגענעסיס אין דעם געדערעם-טשיפּ. קאַקאָ-2 מענטשלעכע געדערעם-עפּיטעליום און געדערעם-אָרגאַנאָידן ווערן גענוצט אין דעם פּראָטאָקאָל צו דעמאָנסטרירן 3D מאָרפאָגענעסיס. די אפגעזונדערטע עפּיטעליאַלע צעלן זענען געזייט געוואָרן אין דעם צוגעגרייטן געדערעם-אויף-אַ-טשיפּ מיטל (טשיפּ-פּרעפּאַראַציע). אַמאָל צעלן זענען געזייט (געזייט) און אַטאַטשט (אַטאַטשט) צו דער PDMS פּאָרעזער מעמבראַנע אויף טאָג 0 (D0), אַפּיקאַל (AP) פלוס ווערט איניציאירט און מיינטיינד פֿאַר די ערשטע 2 טעג (פלוס, AP, D0-D2). באַזאָלאַטעראַל (BL) פלוס ווערט אויך איניציאירט צוזאַמען מיט ציקלישע אויסשטרעקן-באַוועגונגען (אויסשטרעקן, פלוס, AP און BL) ווען אַ גאַנצע 2D מאָנאָלייער ווערט געשאַפֿן. געדערעם-3D מאָרפאָגענעסיס איז געשען ספּאָנטאַניש נאָך 5 טעג פון מיקראָפלוידיק קולטור (מאָרפאָגענעסיס, D5). פאַזע-קאָנטראַסט בילדער ווייַזן רעפּרעזענטאַטיווע מאָרפאָגענעסיס פון קאַקאָ-2 צעלן ביי יעדן עקספּערימענטאַלן שריט אָדער צייט-פונקט (באַר-גראַף, 100 µm). פיר סכעמאַטישע דיאַגראַמען וואָס אילוסטרירן די קאָרעספּאָנדירנדיקע קאַסקיידן פון געדערעם-מאָרפאָגענעסיס (אויבן רעכטס). די געשטריכטעטע פײַלן אין דער סכעמאַטישער בילד רעפּרעזענטירן די ריכטונג פון פליסיק שטראָם.ב, SEM בילד ווײַזט די ייבערפלאַך טאָפּאָלאָגיע פון ​​דעם געגרינדעטן 3D קאַקאָ-2 עפּיטעליום (לינקס).די אינסעט וואָס כיילייט די פאַרגרעסערטע געגנט (ווײַסע געשטריכלטע קעסטל) ווײַזט די רעגענערירטע מיקראָוויללי אויף דער 3D קאַקאָ-2 שיכט (רעכטס).ג, האָריזאָנטאַלער פראָנטאַלער קוק פון געגרינדעטן קאַקאָ-2 3D, קלאַודין (ZO-1, רויט) און קאָנטינויִערלעכע באַרשט גרענעץ מעמבראַנעס מיטן נאָמען F-אַקטין (גרין) און קערנס (בלוי). יממונאָפלאָרעסענס קאָנפאָקאַל וויזואַליזאַציע פון ​​עפּיטעליאַלע צעלן אויף אינטעסטינאַלע טשיפּס.פײַלן וואָס ווײַזן אויף דער מיטלערער סכעמאַטישער בילד ווײַזן די אָרט פון דער פאָקאַלער פלאַך פֿאַר יעדן קאָנפאָקאַלן קוק.ד, צײַט קורס פון מאָרפאָלאָגישע ענדערונגען אין אָרגאַנאָידן קולטיווירט אויף אַ טשיפּ באַקומען דורך פאַזע קאָנטראַסט מיקראָסקאָפּי אויף טעג 3, 7, 9, 11, און 13.די אינסעט (אויבן רעכטס) ווײַזט די הויכע פאַרגרעסערונג פון דעם צוגעשטעלטן בילד.ה, DIC פאָטאָמיקראָגראַף פון אָרגאַנאָיד 3D עפּיטעליום געגרינדעט אין די קישקע אויף אַ שניט גענומען אויף טאָג 7.ו, איבערגעלייגטע יממונאָפלאָרעסענס בילדער ווייזנדיק מאַרקערס פֿאַר סטעם צעלן (LGR5; מאַגענטאַ), גלעזל צעלן (MUC2; גרין), F-אַקטין (גרוי) און קערן (ציאַן) געוואַקסן אויף געדערעם טשיפּס פֿאַר 3 טעג, ריספּעקטיוולי (לינקס) און 13-טאָג (מיטל) אָרגאַנאָידן אויף דער עפּיטעליאַל שיכט. זעט אויך עקסטענדעד דאַטאַ פיגור 3, וואָס כיילייץ LGR5 סיגנאַלינג אָן MUC2 סיגנאַלינג. פלאָרעסענס בילדער וואָס ווייַזן די עפּיטעליאַל מיקראָסטרוקטור (רעכטס) פון 3D אָרגאַנאָיד עפּיטעליום געגרינדעט אין די געדערעם אויף אַ טשיפּ דורך פֿאַרבן די פּלאַזמע מעמבראַנע מיט סעללמאַסק פאַרב (רעכטס) אויף טאָג 13 פון קולטור. סקאַלע באַר איז 50 μm סייַדן אַנדערש סטייטיד. b איבערגעדרוקט מיט דערלויבעניש פון רעפֿערענץ. 2. אָקספֿאָרד אוניווערסיטעט פּרעס; c אַדאַפּטעד מיט דערלויבעניש פון רעפֿערענץ. 2. אָקספֿאָרד אוניווערסיטעט פּרעס; e און f אַדאַפּטעד מיט דערלויבעניש דורך רעפֿערענץ. 12 אונטער Creative Commons License CC BY 4.0.
אין דעם געדערעם אויף א טשיפּ, איז עס נויטיק צו מאָדיפיצירן די הידראָפאָבישע ייבערפלאַך פון די PDMS פּאָרעז מעמבראַנע פֿאַר אַ מצליח ECM קאָוטינג. אין דעם פּראָטאָקאָל, נוצן מיר צוויי פֿאַרשידענע מעטאָדן צו מאָדיפיצירן די הידראָפאָביציטעט פון PDMS מעמבראַנעס. פֿאַר קולטורירן קאַקאָ-2 צעלן, איז ייבערפלאַך אַקטיוואַציע דורך UV/אָזאָן באַהאַנדלונג אַליין געווען גענוג צו רעדוצירן די הידראָפאָביציטעט פון די PDMS ייבערפלאַך, באַדעקן די ECM און אַטאַטש קאַקאָ-2 צעלן צו די PDMS מעמבראַנע. אָבער, מיקראָפלוידיק קולטור פון אָרגאַנאָיד עפּיטעליום ריקווייערז כעמיש-באַזירט ייבערפלאַך פאַנגקשאַנאַליזיישאַן צו דערגרייכן עפעקטיוו דעפּאָזיציע פון ​​ECM פּראָטעינס דורך סיקווענטשאַלי אַפּלייינג פּאָליעטילימין (PEI) און גלוטאַראַלדעהייד צו PDMS מיקראָטשאַנאַלז. נאָך ייבערפלאַך מאָדיפיקאַציע, זענען ECM פּראָטעינס דעפּאָנירט צו דעקן די פאַנגקשאַנאַלייזד PDMS ייבערפלאַך און דאַן ינטראָודוסט אין די אפגעזונדערט אָרגאַנאָיד עפּיטעליום. נאָך די צעלן זענען אַטאַטשט, הייבט די מיקראָפלוידיק צעל קולטור זיך אָן דורך פּערפיוזינג בלויז די מעדיום אין די אויבערשטער מיקראָטשאַננעל ביז די צעלן פאָרעם אַ גאַנץ מאָנאָלייער, בשעת די נידעריקער מיקראָטשאַננעל מיינט סטאַטיק באדינגונגען. דעם אָפּטימיזעד אופֿן פֿאַר ייבערפלאַך אַקטיוואַציע און ECM קאָוטינג ינייבאַלז די אַטאַטשמאַנט פון אָרגאַנאָיד. עפּיטעליום צו אינדוצירן 3D מאָרפאָגענעסיס אויף דער PDMS ייבערפלאַך.
טראַנסוועל קולטורן דאַרפן אויך ECM קאָוטינג איידער צעל זוימען; אָבער, טראַנסוועל קולטורן דאַרפן נישט קאָמפּלעקסע פאָרבאַהאַנדלונג טריט צו אַקטיווירן די ייבערפלאַך פון פּאָרעזע ינסערץ. פֿאַר גראָוינג קאַקאָ-2 סעלז אויף טראַנסוועל ינסערץ, ECM קאָוטינג אויף פּאָרעזע ינסערץ אַקסעלערייץ די אַטאַטשמאַנט פון דיסאָסיאַטעד קאַקאָ-2 סעלז (<1 שעה) און ענג דזשאַנקשאַן באַריער פאָרמירונג (<1-2 טעג). צו קולטור אָרגאַנאָידס אויף טראַנסוועל ינסערץ, אפגעזונדערטע אָרגאַנאָידס זענען געזייט אויף ECM-קאָוטאַד ינסערץ, אַטאַטשט צו די מעמבראַנע ייבערפלאַך (<3 שעה) און מיינטיינד ביז די אָרגאַנאָידס פאָרעם אַ גאַנץ מאָנאָלייער מיט באַריער אָרנטלעכקייט. טראַנסוועל קולטורן זענען דורכגעפירט אין 24-וועלל פּלאַטעס אָן די נוצן פון כייבריד טשיפּס.
אין וויטראָ 3D מאָרפאָגענעסיס קען ווערן איניציאירט דורך אַפּלייינג פליסיק שטראָם צו די באַזאָלאַטעראַל אַספּעקט פון אַן עטאַבלירטע עפּיטעליאַל שיכט. אין די געדערעם אויף אַ טשיפּ, עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס האָט זיך אָנגעהויבן ווען די מעדיום איז געווען פּערפיוזד אין די אויבערשטע און אונטערשטע מיקראָטשאַנאַלז (פיגור 3אַ). ווי פריער באַשריבן, איז עס קריטיש צו באַקענען פליסיק שטראָם אין די אונטערשטע (באַזאָלאַטעראַל) אָפּטייל פֿאַר קעסיידערדיק באַזייַטיקונג פון דירעקציאָנעל סעקרעטעד מאָרפאָגען ינכיבאַטאָרס. צו צושטעלן גענוג נוטריאַנץ און סערום צו סעלז געבונדן אויף פּאָרעזע מעמבראַנעס און דזשענערייט לומינאַל שער דרוק, מיר טיפּיקלי אַפּלייינג דואַל שטראָם אין די געדערעם אויף אַ טשיפּ. אין כייבריד טשיפּס, טראַנסוועלל ינסערץ מיט עפּיטעליאַל מאָנאָלייערס זענען ינסערטאַד אין די כייבריד טשיפּס. דערנאָך, די מעדיום איז געווען אַפּליייד אונטער די באַזאָלאַטעראַל זייַט פון די פּאָרעזע טראַנסוועלל ינסערץ דורך די מיקראָטשאַננעל. אינטעסטינאַל מאָרפאָגענעסיס פארגעקומען 3-5 טעג נאָך די אָנהייב פון באַזאָלאַטעראַל שטראָם אין ביידע קולטור פּלאַטפאָרמעס.
די מאָרפאָלאָגישע פֿעיִקייטן פֿון מיקראָענדזשאַנירטע 3D עפּיטעליאַל לייַערס קענען אַנאַליזירט ווערן דורך אַפּלייינג פֿאַרשידענע בילדגעבונג מאָדאַליטעטן, אַרייַנגערעכנט פֿאַזע קאָנטראַסט מיקראָסקאָפּיע, דיפערענציעל ינטערפֿערענס קאָנטראַסט (DIC) מיקראָסקאָפּיע, SEM, אָדער יממונאָפֿלאָרעסענס קאָנפֿאָקאַל מיקראָסקאָפּיע (פֿיגורן 3 און 4). פֿאַזע קאָנטראַסט אָדער DIC בילדגעבונג קען לייכט דורכגעפֿירט ווערן אין יעדער צייט בעת קולטור צו מאָניטאָרירן די פֿאָרעם און פּראָטרוזשאַן פֿון 3D עפּיטעליאַל לייַערס. צוליב דער אָפּטישער טראַנספּאַרענץ פֿון PDMS און פּאָליעסטער פֿילמען, קענען ביידע די גוט-אויף-אַ-טשיפּ און כייבריד טשיפּ פּלאַטפֿאָרמעס צושטעלן רעאַל-צייט אין סיטו בילדגעבונג אָן די נויט פֿאַר סעקשאַנינג אָדער דיסאַסעמבלי פֿון די מיטל. ווען מען דורכפֿירט יממונאָפֿלאָרעסענס בילדגעבונג (פֿיגורן 1, 3c, f און 4b, c), ווערן צעלן טיפּיש פֿיקסירט מיט 4% (wt/vol) פּאַראַפֿאָרמאַלדעהייד (PFA), נאָכגעפֿאָלגט דורך טריטאָן X-100 און 2% (wt/vol)) רינדער סערום אַלבומין (BSA), אין סדר. דעפּענדינג אויף די צעל טיפּ, קענען פֿאַרשידענע פֿיקסאַטיוון, פּערמעאַבילייזערס און בלאָקירנדיקע אַגענטן געניצט ווערן. ערשטיק אַנטיבאָדיעס טאַרגעטינג ליניע-אפהענגיקע צעל אדער ראיאן מארקערס ווערן גענוצט צו ארויסהייבן צעלן אימאביליזירט אין סיטו אויף דעם טשיפּ, נאכגעפאלגט דורך צווייטיקע אנטיקערפערס צוזאמען מיט א קאנטערסטיין פארב וואס צילט אדער קערן (למשל, 4′,6-דיאמידינא-2-פענילען) אינדאל, DAPI) אדער F-אקטין (למשל, פלורעסענטלי לייבאַלד פאַלאָידין). פלורעסענס-באזירטע לעבעדיגע בילדגעבונג קען אויך ווערן דורכגעפירט אין סיטו צו דעטעקטירן מוקוס פּראָדוקציע (פיגור 1, "צעל דיפערענציאַציע" און "געדערעם פיזיאָלאָגיע"), ראַנדאָם קאָלאָניזאַציע פון ​​מיקראָביאַל צעלן (פיגור 1, "האָסט-מיקראָב קאָ-קולטור"), די רעקרוטמענט פון ימיון צעלן (פיגור 1, 'קרענק מאָדעלינג') אדער די קאָנטורן פון 3D עפּיטעליאַל מאָרפאָלאָגיע (פיגור 3c,f און 4b,c). ווען מען מאָדיפיצירט דעם געדערעם אויף דעם טשיפּ צו צעטיילן די אויבערשטע שיכט פון די נידעריקער מיקראָטשאַננעל שיכט, ווי באַשריבן אין רעף. ווי געוויזן אין פיגור 2, די 3D עפּיטעליאַל מאָרפאָלאָגיע ווי אויך די מיקראָווילי אויף די אַפּיקאַל באַרשט גרענעץ קענען ווערן וויזשוואַלייזד דורך SEM. (פיגור 3ב). די אויסדרוק פון דיפערענציאציע מארקערס קען ווערן אפגעשאצט דורך דורכפירן קוואנטיטאטיווע PCR5 אדער איין-צעל RNA סיקווענסינג. אין דעם פאל, 3D לייַערס פון עפּיטעליאַל סעלז געוואקסן אין געדערעם טשיפּס אדער כייבריד טשיפּס ווערן געהאַרוועסט דורך טריפּסיניזאַציע און דערנאָך געניצט פֿאַר מאָלעקולאַר אָדער גענעטישע אַנאַליז.
א, ארבעטספלוס פאר דער אינדוקציע פון ​​אינטעסטינאַלער מאָרפאָגענעסיס אין א כייבריד טשיפּ. קאַקאָ-2 און אינטעסטינאַלע אָרגאַנאָידן ווערן גענוצט אין דעם פּראָטאָקאָל צו דעמאָנסטרירן 3D מאָרפאָגענעסיס אין א כייבריד טשיפּ פּלאַטפאָרמע. דיסאָסיאַטעד עפּיטעליאַל צעלן זענען געזייט געוואָרן אין צוגעגרייטע טראַנסוועלל ינסערץ (TW פּרעפּ; זען בילד אונטן). אַמאָל צעלן זענען געזייט געוואָרן (געזעצט) און אַטאַטשט צו פּאָליעסטער מעמבראַנעס אין טראַנסוועלל ינסערץ, אַלע צעלן זענען קולטיווירט געוואָרן אונטער סטאַטישע באדינגונגען (TW קולטור). נאָך 7 טעג, אַ איין טראַנסוועלל ינסערץ מיט אַ 2D מאָנאָלייער פון עפּיטעליאַל צעלן איז געווען ינטאַגרייטאַד אין אַ כייבריד טשיפּ צו באַקענען אַ באַזאָלאַטעראַל פלאָו (פלאָו, BL), וואָס לעסאָף געפירט צו דער דזשענעריישאַן פון אַ 3D עפּיטעליאַל שיכט (מאָרפאָגענעסיס). פאַזע קאַנטראַסט מיקראָגראַפס וואָס ווייַזן מאָרפאַלאַדזשיקאַל פֿעיִקייטן פון מענטשלעך אָרגאַן עפּיטעליאַל צעלן דערייווד פון נאָרמאַל דאָנאָר (C103 ליניע) אַסענדינג קאָלאָן אין יעדער עקספּערימענטאַל שריט אָדער צייט פונט. די סכעמאַטיקס אין די אויבערשטער לייַערס אילוסטרירן די עקספּערימענטאַל קאַנפיגיעריישאַן פֿאַר יעדער שריט. ב, כייבריד טשיפּס (לינקס סכעמאַטיש) קענען פירן צו 3D מאָרפאָגענעסיס פון אָרגאַנאָיד עפּיטעליאַל צעלן מיט אויבן-אראפ קאנפאקאל מיקראסקאפיע בילדער גענומען ביי פארשידענע Z פאזיציעס (אויבערשטער, מיטל, און נידעריגער; זעה רעכטע סכעמאטישע און קארעספאנדירנדע פונקטירטע ליניעס). האבן געוויזן קלארע מארפאלאגישע אייגנשאפטן. F-אקטין (ציאן), קערן (גרוי). c, פלוארעסענס קאנפאקאל מיקראגראפן (3D ווינקלדיקע בילד) פון ארגאנאיד-דערייווד עפיטעליאַל צעלן קולטיווירט אין סטאטישן טראנסוועל (TW; אינסערט אין ווייסער פונקטירטער קעסטל) קעגן כייבריד טשיפּ (גרעסטער פולער שאט) פארגלייכנדיג 2D קעגן 3D מאָרפאָלאָגיע, ריספּעקטיוולי. א פּאָר פון 2D ווערטיקאַלע קראָס-שניט בילדער (אינסערט אין דער אויבערשטער רעכטער ווינקל; "XZ") ווייזן אויך 2D און 3D פֿעיִקייטן. סקאַלע באַר, 100 µm. c איבערגעדרוקט מיט דערלויבעניש פון רעפערענץ. 4. עלסעוויער.
קאָנטראָלן קענען צוגעגרייט ווערן דורך קולטורירן די זעלבע צעלן (קאַקאָ-2 אָדער אינטעסטינאַלע אָרגאַנאָיד עפּיטעליאַל צעלן) אין צוויי-דימענסיאָנאַלע מאָנאָלייערס אונטער קאַנווענשאַנעל סטאַטישע קולטור באדינגונגען. באַמערקענסווערט, נוטריאַנט דיפּלישאַן קען רעזולטירן רעכט צו דער לימיטעד באַנד קאַפּאַציטעט פון די מיקראָטשאַנאַלז (ד"ה ~4 µL אין די שפּיץ קאַנאַל אויף די אָריגינעל גוט-טשיפּ פּלאַן). דעריבער, עפּיטעליאַל מאָרפאָלאָגי איידער און נאָך אַפּלאַקיישאַן פון באַסאָלאַטעראַל לויפן קען אויך קאַמפּערד ווערן.
דער ווייכער ליטאגראַפֿיע פּראָצעס זאָל דורכגעפֿירט ווערן אין אַ ריינעם צימער. פֿאַר יעדער שיכט אויף דעם טשיפּ (אויבערשטע און אונטערשטע שיכטן און מעמבראַנען) און כייבריד טשיפּס, זענען פֿאַרשידענע פֿאָטאָמאַסקעס געניצט און פֿאַבריצירט געוואָרן אויף באַזונדערע סיליקאָן וועיפֿערס ווייל די הייכן פֿון די מיקראָטשאַנעלס זענען געווען אַנדערש. די ציל הייכן פֿון די אויבערשטע און אונטערשטע מיקראָטשאַנעלס פֿון די געדערעם אויף דעם טשיפּ זענען 500 מיקראָמעטער און 200 מיקראָמעטער, ריספּעקטיוולי. די קאַנאַל ציל הייך פֿון דעם כייבריד טשיפּ איז 200 מיקראָמעטער.
לייגט אַ 3-אינטש סיליקאָן וועיפער אין אַ טעלער מיט אַצעטאָן. דרייט די טעלער מיט אַ פֿאָרזיכטיקייט פֿאַר 30 סעקונדעס, און דאַן טריקנט די וועיפער אין דער לופֿט. לייגט די וועיפער איבער אויף אַ טעלער מיט IPA, און דרייט די טעלער פֿאַר 30 סעקונדעס צו רייניקן.
א פּיראַנה לייזונג (א געמיש פון וואַסערשטאָף פּעראָקסייד און קאָנצענטרירטע שוועבל זויער, 1:3 (וואָל/וואָל)) קען אָפּציאָנעל געניצט ווערן צו מאַקסאַמיזירן די באַזייַטיקונג פון אָרגאַנישע רעשטלעך פון דער סיליקאָן וועיפער ייבערפלאַך.
פּיראַנה לייזונג איז גאָר קעראָוסיוו און דזשענערירט היץ. נאָך זיכערהייט מיטלען זענען נייטיק. פֿאַר אָפּפאַל באַזייַטיקונג, לאָזט די לייזונג אָפּקילן און איבערפירן צו אַ ריין, טרוקן אָפּפאַל קאַנטיינער. ניצט צווייטיק קאַנטיינערז און ריכטיק לייבאַלד אָפּפאַל קאַנטיינערז. ביטע נאָכפאָלגן די פאַסיליטיעס זיכערהייט גיידליינז פֿאַר מער דיטיילד פּראָוסידזשערז.
טריקנט אויס די וועיפערס דורך זיי צו לייגן אויף א 200 °C הייסע טעלער פאר 10 מינוט. נאך דיטריכידראטאציע, איז די וועיפער געשאקלט געווארן פינף מאל אין לופט צו קילן.
גיסט אריין בערך 10 גראַם פאָטאָרעזיסט SU-8 2100 אין צענטער פון דעם רייניגטן סיליקאָן וועיפער. ניצט פּינצעטן צו פֿאַרשפּרייטן דעם פאָטאָרעזיסט גלײַך אויף דעם וועיפער. לייגט פֿון צײַט צו צײַט דעם וועיפער אויף אַ 65°C הייסער טעלער כּדי צו מאַכן דעם פאָטאָרעזיסט ווייניקער קלעפּיק און גרינגער צו פֿאַרשפּרייטן. לייגט נישט דעם וועיפער גלייך אויף דער הייסער טעלער.
SU-8 איז געווען גלייך פארטיילט אויף די וועיפער דורך לויפן ספּין קאָוטינג. פּראָגראַמירן אַן אנקומענדיקע ראָטאַציע פון ​​די SU-8 פֿאַר 5-10 סעקונדעס צו פאַרשפּרייטן ביי 500 רפּם מיט אַ אַקסעלעריישאַן פון 100 רפּם/ס. שטעלן די הויפּט ספּין פֿאַר 200 מיקראָמעטער גרעב פּאַטערנינג ביי 1,500 רפּם, אָדער דערגרייכן אַ 250 מיקראָמעטער גרעב (מאַכן אַ 500 מיקראָמעטער הייך פֿאַר די אויבערשטע שיכט פון די געדערעם אויף די טשיפּ; זען "קריטישע טריט" אונטן) שטעלן ביי אַ אַקסעלעריישאַן פון 300 רפּם/ס 30 סעקונדעס ביי 1,200 רפּם.
די הויפּט ספּין גיכקייט קען ווערן אַדזשאַסטיד לויט די ציל גרעב פון די SU-8 מוסטער אויף די סיליקאָן וועיפער.
כדי צו פאבריצירן SU-8 מוסטערן פון 500 µm הויך פאר דער אויבערשטער שיכט פון די געדערעם אויפן טשיפּ, זענען די ספּין קאָוטינג און ווייכע באַקן טריט פון דעם קעסטל (טריט 7 און 8) סיקווענשעל איבערגעחזרט געוואָרן (זען טריט 9) צו פּראָדוצירן צוויי שיכטן פון 250 µm א דיקע שיכט פון SU-8, וואָס קען ווערן איבערגעשיכט און פארבונדן דורך UV עקספּאָוזשער אין טריט 12 פון דעם קעסטל, מאַכנדיג אַ שיכט 500 µm הויך.
ווייך באַקן די SU-8 באדעקטע וועיפערס דורך פֿאָרזיכטיק שטעלן די וועיפערס אויף אַ הייס טעלער ביי 65 °C פֿאַר 5 מינוט, דערנאָך באַשטימען די שטאַפּל צו 95 °C און אינקובירן פֿאַר נאָך 40 מינוט.
כדי צו דערגרייכן א 500 μm הייך פון די SU-8 מוסטער אין די אויבערשטע מיקראָטשאַננעל, איבערחזרן טריט 7 און 8 צו שאַפֿן צוויי 250 μm דיקע SU-8 שיכטן.
ניצנדיק דעם UV מאַסקע אַליינער, פירט אויס אַ לאָמפּ טעסט לויט די פאַבריקאַנט'ס אינסטרוקציעס צו רעכענען די עקספּאָוזשער צייט פון די וועיפער. (עקספּאָוזשער צייט, מס) = (עקספּאָוזשער דאָזע, mJ/cm2)/(לאָמפּ מאַכט, mW/cm2).
נאכדעם וואס איר באשטימט די אויסשטעל צייט, לייגט די פאטאמאסק אויפן מאסקע האלטער פונעם UV מאסקע אליינער און לייגט די פאטאמאסק אויפן SU-8 באדעקטן וועיפער.
שטעלט די געדרוקטע ייבערפלאַך פון דער פאָטאָמאַסקע גלייך אויף דער SU-8 באדעקטער זײַט פון דעם סיליקאָן וועיפער צו מינימיזירן UV צעשפּרייטונג.
שטעלט אויס דעם SU-8 באדעקטן ווייפער און פאָטאָמאַסקע ווערטיקאַל צו 260 mJ/cm2 פון UV ליכט פאר דער פארבעשטימטער אויסשטעלונג צייט (זעט שריט 10 פון דעם קעסטל).
נאך UV אויסשטעלונג, זענען SU-8-באדעקטע סיליקאן וועיפערס געבאקן געווארן ביי 65°C פאר 5 מינוט און 95°C פאר 15 מינוט אויף יעדער הייסער טעלער צו פאבריצירן מוסטערן מיט א הייך פון 200 μm. פארלענגערט די נאך-באק צייט ביי 95°C צו 30 מינוט צו פאבריצירן מוסטערן מיט א הייך פון 500 μm.
דער דעוועלאָפּער ווערט אַרײַנגעגאָסן אין אַ גלאָז שיסל, און דער געבאַקענער וועיפער ווערט אַרײַנגעלייגט אין דער שיסל. דער באַנד פֿון SU-8 דעוועלאָפּער קען זיך פֿאַרשיידן לויט דער גרייס פֿון דער גלאָז פּלאַטע. מאַכט זיכער צו נוצן גענוג SU-8 דעוועלאָפּער צו גאָר אַראָפּנעמען דעם נישט-אויסגעשטעלטן SU-8. למשל, ווען איר נוצט אַ 150 מ״מ דיאַמעטער גלאָז שיסל מיט אַ 1 ל קאַפּאַציטעט, נוצט ~300 מל SU-8 דעוועלאָפּער. אַנטוויקלט די פֿאָרעם פֿאַר 25 מינוט מיט אַ מאָל אַ מאָל אַ זאַפֿטיקער ראָטאַציע.
שווענקט אויס די אנטוויקלטע פורעם מיט ~10 מל פון פרישן דעוועלאָפּער, און דערנאָך IPA דורך שפּריצן די לייזונג מיט אַ פּיפּעטטע.
לייגט אריין דעם וועיפער אין א פלאזמע רייניגער און שטעלט אויס צו זויערשטאָף פלאזמע (אטמאספערישער גאז, ציל דרוק 1 × 10−5 טאר, מאכט 125 וואט) פאר 1.5 מינוט.
לייגט דעם וועיפער אין א וואקיום דעסיקאטאר מיט א גלאז גליטש אינעווייניק. וועיפערס און גליטשעס קענען געשטעלט ווערן איינער לעבן דעם צווייטן. אויב דער וואקיום דעסיקאטאר איז צעטיילט אין עטלעכע שיכטן דורך א טעלער, לייגט די גליטשעס אין דער אונטערשטער קאמער און די וועיפערס אין דער אויבערשטער קאמער. לאָזט 100 μL פון טריכלאָר(1H, 1H, 2H, 2H-פּערפלאָראָאָקטיל)סילאַן לייזונג אויף א גלאז גליטש און לייגט אויף וואקיום פאר סילאַניזאַציע.
אויפטויען א פלעשל מיט פארפרוירענע קאַקאָ-2 צעלן אין א 37°C וואסער-באד, און דערנאך אריבערפירן די אויפגעטויטע צעלן צו א T75 פלעשל וואס אנטהאלט 15 מל פון 37°C פארווארעמטן קאַקאָ-2 מעדיום.
כּדי דורכצולאָזן קאַקאָ-2 צעלן ביי ~90% קאָנפלוענסי, וואַרעמט ערשט קאַקאָ-2 מעדיום, PBS, און 0.25% טריפּסין/1 mM EDTA אין אַ 37°C וואַסער־באָד.
אַספּירירן דעם מעדיום דורך וואַקוום אַספּיראַציע. וואַשט די צעלן צוויי מאָל מיט 5 מל וואַרעם PBS דורך איבערחזרן וואַקוום אַספּיראַציע און צולייגן פריש PBS.