Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Morfogeneza ljudskog crijeva uspostavlja karakteristike kripta-vilusa 3D epitelne mikroarhitekture i prostorne organizacije. Ova jedinstvena struktura je neophodna za održavanje homeostaze crijeva zaštitom niše matičnih ćelija u bazalnoj kripti od egzogenih mikrobnih antigena i njihovih metabolita. Osim toga, crijevne resice i sluz koja izlučuje predstavljaju funkcionalno diferencirane epitelne ćelije sa zaštitnom barijerom na površini crijevne sluznice. Stoga je ponovno stvaranje 3D epitelnih struktura ključno za konstrukciju in vitro modela crijeva. Posebno, organsko mimetičko crijevo na čipu može inducirati spontanu 3D morfogenezu crijevnog epitela s poboljšanim fiziološkim funkcijama i biomehanikom. Ovdje pružamo reproducibilan protokol za robusnu indukciju crijevne morfogeneze u crijevima na mikrofluidnom čipu, kao i u Transwell ugrađenom hibridnom čipu. Opisujemo detaljne metode za izradu uređaja, kultiviranje Caco-2 ili crijevnih organoidnih epitelnih ćelija u konvencionalnim okruženjima, kao i na mikrofluidnoj platformi, indukciju 3D morfogeneze i karakterizaciju uspostavljenog 3D epitela korištenjem višestrukih modaliteta snimanja. Ovaj protokol postiže regeneraciju funkcionalne mikroarhitekture crijeva kontroliranjem bazolateralnog protoka tekućine tokom 5 dana. Naša metoda morfogeneze in vitro koristi fiziološki relevantno naprezanje smicanja i mehaničko kretanje i ne zahtijeva složeno ćelijsko inženjerstvo ili manipulaciju, što može nadmašiti druge postojeće tehnike. Predviđamo da bi naš predloženi protokol mogao imati široke implikacije za biomedicinsku istraživačku zajednicu, pružajući metodu za regeneraciju 3D slojeva crijevnog epitela in vitro za biomedicinske, kliničke i farmaceutske primjene.
Eksperimenti pokazuju da Caco-2 ćelije crijevnog epitela kultivirane u crijevima na čipu1,2,3,4,5 ili dvoslojnim mikrofluidnim uređajima6,7 mogu proći kroz spontanu 3D morfogenezu in vitro bez jasnog razumijevanja osnovnog mehanizma. U našoj nedavnoj studiji otkrili smo da je uklanjanje bazolateralno izlučenih antagonista morfogena iz uređaja za kulturu neophodno i dovoljno za indukciju 3D epitelne morfogeneze in vitro, što je dokazano pomoću Caco-2 i crijevnih organoida izvedenih od pacijenata. Epitelne ćelije su validirane. U ovoj studiji, posebno smo se fokusirali na proizvodnju ćelija i distribuciju koncentracije potentnog Wnt antagonista, Dickkopf-1 (DKK-1), u crijevima na čipu i modificiranim mikrofluidnim uređajima koji sadrže Transwell umetke, nazvanim "Hibridni čip". Pokazujemo da dodavanje egzogenih Wnt antagonista (kao što su DKK-1, Wnt represor 1, sekretovani protein 1 povezan sa kovrčavom dlakom ili Soggy-1) u crijeva na čipu inhibira morfogenezu ili remeti prestrukturirani 3D epitelni sloj, što sugerira da je antagonistički stres tokom kulture odgovoran za crijevnu morfogenezu in vitro. Stoga je praktičan pristup za postizanje robusne morfogeneze na epitelnom interfejsu uklanjanje ili minimalno održavanje nivoa Wnt antagonista u bazolateralnom odjeljku aktivnim ispiranjem (npr. u platformama na čipu ili hibridu na čipu) ili difuzijom u bazolateralnim medijima (npr. iz Transwell umetaka u velike bazolateralne rezervoare u bunarima).
U ovom protokolu, pružamo detaljnu metodu za izradu mikrouređaja tipa "gut-on-a-chip" i hibridnih čipova koji se mogu umetnuti u Transwell (koraci 1-5) za kultivaciju crijevnih epitelnih ćelija na poroznim membranama na bazi polidimetilsiloksana (PDMS) (koraci 6A, 7A, 8, 9) ili poliesterskim membranama Transwell umetaka (koraci 6B, 7B, 8, 9) i induciranu 3D morfogenezu in vitro (korak 10). Također smo identificirali ćelijske i molekularne karakteristike koje ukazuju na tkivno specifičnu histogenezu i ćelijsku diferencijaciju zavisnu od loze primjenom višestrukih modaliteta snimanja (koraci 11-24). Induciramo morfogenezu korištenjem ljudskih crijevnih epitelnih ćelija, kao što su Caco-2 ili crijevni organoidi, u dva formata kulture s tehničkim detaljima koji uključuju modifikaciju površine poroznih membrana, stvaranje 2D monoslojeva i crijevnu biokemiju i reprodukciju biomehaničkog mikrookruženja in vitro. Da bismo inducirali 3D morfogenezu iz 2D epitelnih monoslojeva, uklonili smo antagoniste morfogena u oba kultivirana oblika protokom... medij u bazolateralni odjeljak kulture. Konačno, pružamo prikaz korisnosti regenerativnog 3D epitelnog sloja koji se može koristiti za modeliranje rasta epitela ovisnog o morfogenima, longitudinalnih ko-kultura domaćina i mikrobioma, infekcije patogenima, upalnih ozljeda, disfunkcije epitelne barijere i terapija baziranih na probioticima. Primjer utjecaja.
Naš protokol može biti koristan širokom spektru naučnika u osnovnim (npr. biologija crijevne sluznice, biologija matičnih ćelija i razvojna biologija) i primijenjenim istraživanjima (npr. predkliničko testiranje lijekova, modeliranje bolesti, tkivni inženjering i gastroenterologija) sa širokim uticajem. Zbog reproducibilnosti i robusnosti našeg protokola za indukciju 3D morfogeneze crijevnog epitela in vitro, predviđamo da se naša tehnička strategija može proširiti na publiku koja proučava dinamiku ćelijske signalizacije tokom razvoja, regeneracije ili homeostaze crijeva. Osim toga, naš protokol je koristan za ispitivanje infekcije uzrokovane različitim infektivnim agensima kao što su Norovirus 8, Teški akutni respiratorni sindrom koronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ili Vibrio cholerae. Publika patologije i patogeneze bolesti je također korisna. Upotreba sistema za mikrofiziologiju crijeva na čipu može omogućiti longitudinalnu kokulturu 10 i naknadnu procjenu odbrane domaćina, imunoloških odgovora i popravka povreda povezanih s patogenima u gastrointestinalnom (GI) traktu 11. Drugi GI poremećaji povezani sa sindromom propusnog crijeva, celijakijom, Crohnovom bolešću, ulceroznim kolitisom, pouchitisom ili sindromom iritabilnog crijeva mogu se simulirati kada se 3D slojevi crijevnog epitela pripreme korištenjem pacijentovih 3D slojeva crijevnog epitela, a ove bolesti uključuju atrofiju resica, skraćivanje kripti, oštećenje sluznice ili oštećenu epitelnu barijeru. Biopsija ili crijevni organoidi izvedeni iz matičnih ćelija 12,13. Da bi bolje modelirali veću složenost okruženja bolesti, čitaoci mogu razmotriti dodavanje tipova ćelija relevantnih za bolest, kao što su mononuklearne ćelije periferne krvi pacijenta (PBMC), modelima koji sadrže 3D mikroarhitekture crijevnih resica i kripti, tkivno specifične imune ćelije, 5.
Budući da se 3D epitelna mikrostruktura može fiksirati i vizualizirati bez procesa seciranja, posmatrači koji rade na prostornoj transkriptomici i snimanju visoke ili super rezolucije mogli bi biti zainteresirani za naše mapiranje prostorno-vremenske dinamike gena i proteina na epitelnim nišama. Zainteresovani za tehnologiju. Odgovor na mikrobne ili imunološke podražaje. Nadalje, longitudinalno preslušavanje domaćina i mikrobioma 10, 14 koje koordinira homeostazu crijeva može se uspostaviti u 3D sloju crijevne sluznice kokultivacijom različitih mikrobnih vrsta, mikrobnih zajednica ili fekalne mikrobiote, posebno u crijevima na čipu. na platformi. Ovaj pristup je posebno atraktivan za publiku koja proučava imunologiju sluznice, gastroenterologiju, ljudski mikrobiom, kulturomiku i kliničku mikrobiologiju, a koja želi kultivirati prethodno nekultiviranu crijevnu mikrobiotu u laboratoriji. Ako se naš protokol in vitro morfogeneze može prilagoditi skalabilnim formatima kulture, kao što su umetci s više jažica u pločama s 24, 96 ili 384 jažice koji kontinuirano nadopunjuju bazolateralne odjeljke, protokol se također može proširiti na one koji razvijaju farmaceutske, biomedicinske ili platforme za skrining ili validaciju visokog protoka za prehrambenu industriju. Kao dokaz principa, nedavno smo pokazali izvodljivost multipleksnog sistema morfogeneze visokog protoka skalabilnog na format ploče s 24 jažice. Osim toga, komercijalizirani su višestruki proizvodi organ-na-čipu16,17,18. Stoga se validacija naše metode in vitro morfogeneze može ubrzati i potencijalno usvojiti od strane mnogih istraživačkih laboratorija, industrije ili vladinih i regulatornih agencija kako bi se razumjelo ćelijsko reprogramiranje in vitro crijevne morfogeneze na transkriptomskom nivou za testiranje lijekova ili bioterapeutika. Apsorpcija i Transport kandidata za lijekove procijenjen je korištenjem 3D surogata crijeva ili korištenjem prilagođenih ili komercijalnih modela organa na čipu kako bi se procijenila ponovljivost procesa morfogeneze crijeva.
Ograničen broj eksperimentalnih modela relevantnih za ljude korišten je za proučavanje morfogeneze crijevnog epitela, uglavnom zbog nedostatka protokola koji se mogu primijeniti za indukciju 3D morfogeneze in vitro. U stvari, veliki dio trenutnog znanja o morfogenezi crijeva zasniva se na studijama na životinjama (npr. zebrice20, miševi21 ili kokoši22). Međutim, one su radno i skupe, mogu biti etički upitne i, što je najvažnije, ne određuju precizno ljudske razvojne procese. Ovi modeli su također vrlo ograničeni u svojoj mogućnosti testiranja na višesmjerni skalabilan način. Stoga, naš protokol za regeneraciju 3D tkivnih struktura in vitro nadmašuje in vivo životinjske modele, kao i druge tradicionalne statičke 2D modele ćelijske kulture. Kao što je prethodno opisano, korištenje 3D epitelnih struktura omogućilo nam je da ispitamo prostornu lokalizaciju diferenciranih ćelija u osi kripta-vilus kao odgovor na različite mukozne ili imunološke podražaje. 3D epitelni slojevi mogu pružiti prostor za proučavanje kako se mikrobne ćelije takmiče u formiranju prostornih niša i ekološke evolucije kao odgovor na faktore domaćina (npr. unutrašnji naspram vanjskih slojeva sluzi, lučenje IgA i antimikrobni peptidi). Nadalje, 3D epitelna morfologija nam može omogućiti da razumijemo kako crijevna mikrobiota strukturira svoje zajednice i sinergijski proizvodi mikrobne metabolite (npr. masne kiseline kratkog lanca) koji oblikuju ćelijsku organizaciju i niše matičnih ćelija u bazalnim kriptama. Ove karakteristike se mogu demonstrirati samo kada se 3D epitelni slojevi uspostave in vitro.
Pored naše metode kreiranja 3D struktura crijevnog epitela, postoji nekoliko in vitro metoda. Kultura crijevnih organoida je najsavremenija tehnika tkivnog inženjerstva zasnovana na kultivaciji crijevnih matičnih ćelija pod specifičnim uslovima morfogena23,24,25. Međutim, upotreba 3D modela organoida za analizu transporta ili ko-kulture domaćina i mikrobioma često je izazovna jer je crijevni lumen zatvoren unutar organoida i stoga je uvođenje luminalnih komponenti kao što su mikrobne ćelije ili egzogeni antigeni ograničeno. Pristup lumenima organoida može se poboljšati korištenjem mikroinjektora,26,27 ali ova metoda je invazivna i radno intenzivna te zahtijeva specijalizirano znanje za izvođenje. Nadalje, tradicionalne kulture organoida održavane u hidrogelnim skelama pod statičkim uslovima ne odražavaju tačno aktivnu in vivo biomehaniku.
Drugi pristupi koje koriste nekoliko istraživačkih grupa koriste prestrukturirane 3D hidrogelne skele za imitiranje strukture crijevnog epitela kultiviranjem izoliranih ljudskih crijevnih ćelija na površini gela. Izradite hidrogelne skele koristeći 3D printane, mikro-glodane ili litografski izrađene kalupe. Ova metoda pokazuje samoorganizirani raspored izoliranih epitelnih ćelija in vitro s fiziološki relevantnim morfogenskim gradijentima, uspostavljajući epitelnu strukturu visokog omjera stranica i preslušavanje strome i epitela uključivanjem stromalnih ćelija u skelu. Međutim, priroda prestrukturiranih skela može spriječiti prikaz samog spontanog morfogenetskog procesa. Ovi modeli također ne pružaju dinamičan luminalni ili intersticijski protok, nedostaje im napon smicanja fluida koji je crijevnim ćelijama potreban za morfogenezu i postizanje fiziološke funkcije. Druga nedavna studija koristila je hidrogelne skele u mikrofluidnoj platformi i uzorkovane crijevne epitelne strukture korištenjem tehnika laserskog nagrizanja. Mišji crijevni organoidi slijede urezane obrasce kako bi formirali crijevne tubularne strukture, a intraluminalni protok fluida može se rekapitulirati korištenjem mikrofluidnog modula. Međutim, ovaj model ne pokazuje ni spontani... morfogenetski procesi niti uključuje mehanobiološke pokrete crijeva. Tehnike 3D printanja iz iste grupe bile su u stanju stvoriti minijaturne crijevne cijevi sa spontanim morfogenetskim procesima. Uprkos složenoj izradi različitih segmenata crijeva unutar cijevi, ovom modelu također nedostaje protok luminalne tekućine i mehanička deformacija. Osim toga, operabilnost modela može biti ograničena, posebno nakon što je proces bioprintanja završen, što remeti eksperimentalne uvjete ili interakcije između ćelija. Umjesto toga, naš predloženi protokol pruža spontanu morfogenezu crijeva, fiziološki relevantno naprezanje smicanja, biomehaniku koja oponaša pokretljivost crijeva, dostupnost nezavisnih apikalnih i bazolateralnih odjeljaka i ponovno stvaranje složenih bioloških mikrookruženja modularnosti. Stoga, naš in vitro 3D protokol morfogeneze može pružiti komplementarni pristup za prevladavanje izazova postojećih metoda.
Naš protokol je u potpunosti fokusiran na 3D epitelnu morfogenezu, sa samo epitelnim ćelijama u kulturi i bez drugih tipova okolnih ćelija kao što su mezenhimalne ćelije, endotelne ćelije i imune ćelije. Kao što je prethodno opisano, srž našeg protokola je indukcija epitelne morfogeneze uklanjanjem inhibitora morfogena koji se luče na bazolateralnoj strani uvedenog medija. Dok nam robusna modularnost našeg crijeva na čipu i hibrida na čipu omogućava da ponovo stvorimo valoviti 3D epitelni sloj, dodatne biološke složenosti poput epitelno-mezenhimalnih interakcija33,34, taloženja ekstracelularnog matriksa (ECM)35 i, u našem modelu, karakteristika kripte i resice koje prenose niše matičnih ćelija u bazalnim kriptama, tek treba dalje razmotriti. Stromalne ćelije (npr. fibroblasti) u mezenhimu igraju ključnu ulogu u proizvodnji ECM proteina i regulaciji crijevne morfogeneze in vivo35,37,38. Dodavanje mezenhimalnih ćelija našem modelu poboljšalo je morfogenetski proces i vezivanje ćelija. efikasnost. Endolni sloj (tj. kapilari ili limfni čvorovi) igra važnu ulogu u regulaciji molekularnog transporta39 i regrutovanju imunoloških ćelija40 u crijevnom mikrookruženju. Nadalje, komponente vaskulature koje se mogu povezati između modela tkiva su preduvjet kada se modeli tkiva dizajniraju za demonstraciju interakcija više organa. Stoga, endotelne ćelije mogu biti uključene kako bi se modelirale preciznije fiziološke karakteristike s rezolucijom na nivou organa. Imune ćelije izvedene od pacijenta su također neophodne za prikazivanje urođenih imunoloških odgovora, prezentacije antigena, urođenog adaptivnog imunološkog preslušavanja i tkivno specifičnog imuniteta u kontekstu oponašanja crijevnih bolesti.
Upotreba hibridnih čipova je jednostavnija od crijeva na čipu jer je postavljanje uređaja jednostavnije, a upotreba Transwell umetaka omogućava skalabilnu kulturu crijevnog epitela. Međutim, komercijalno dostupni Transwell umetci s poliesterskim membranama nisu elastični i ne mogu simulirati peristaltičke pokrete. Nadalje, apikalni odjeljak Transwell umetka postavljenog u hibridni čip ostao je stacionaran bez smičućeg napona na apikalnoj strani. Jasno je da statička svojstva u apikalnom odjeljku rijetko omogućavaju dugoročnu bakterijsku kokulturu u hibridnim čipovima. Iako možemo robusno inducirati 3D morfogenezu u Transwell umetcima kada koristimo hibridne čipove, nedostatak fiziološki relevantne biomehanike i apikalnog protoka tekućine može ograničiti izvodljivost hibridnih čip platformi za potencijalne primjene.
Potpune rekonstrukcije ljudske kripto-vilus ose u kulturama crijeva na čipu i hibrida na čipu nisu u potpunosti utvrđene. Budući da morfogeneza počinje od epitelnog monosloja, 3D mikroarhitekture ne pružaju nužno morfološku sličnost s kriptama in vivo. Iako smo okarakterizirali populaciju proliferirajućih ćelija u blizini bazalne kripte u mikroinženjerskom 3D epitelu, regije kripte i resica nisu bile jasno razgraničene. Iako viši gornji kanali na čipu dovode do povećane visine mikroinženjerskog epitela, maksimalna visina je i dalje ograničena na ~300–400 µm. Stvarna dubina ljudskih crijevnih kripti u tankom i debelom crijevu je ~135 µm i ~400 µm, respektivno, a visina resica tankog crijeva je ~600 µm41.
Sa stanovišta snimanja, in situ superrezolucijsko snimanje 3D mikroarhitektura može biti ograničeno na crijevo na čipu, budući da je potrebna radna udaljenost od objektiva do epitelnog sloja reda veličine nekoliko milimetara. Da bi se prevazišao ovaj problem, može biti potreban udaljeni objektiv. Nadalje, izrada tankih presjeka za pripremu uzoraka za snimanje je izazovna zbog visoke elastičnosti PDMS-a. Nadalje, budući da mikrofabrikacija crijeva sloj po sloj na čipu uključuje trajno prianjanje između svakog sloja, izuzetno je izazovno otvoriti ili ukloniti gornji sloj kako bi se ispitala površinska struktura epitelnog sloja. Na primjer, korištenjem skenirajućeg elektronskog mikroskopa (SEM).
Hidrofobnost PDMS-a je ograničavajući faktor u studijama zasnovanim na mikrofluidima koje se bave hidrofobnim malim molekulama, budući da PDMS može nespecifično adsorbovati takve hidrofobne molekule. Mogu se razmotriti alternative PDMS-u s drugim polimernim materijalima. Alternativno, modifikacija površine PDMS-a (npr. premazivanje lipofilnim materijalima 42 ili poli(etilen glikolom) 43) može se razmotriti kako bi se minimizirala adsorpcija hidrofobnih molekula.
Konačno, naša metoda nije dobro okarakterizirana u smislu pružanja visokopropusnog skrininga ili univerzalne eksperimentalne platforme prilagođene korisnicima. Trenutni protokol zahtijeva špricu pumpu po mikrouređaju, što zauzima prostor u CO2 inkubatoru i sprječava eksperimente velikih razmjera. Ovo ograničenje se može značajno poboljšati skalabilnošću inovativnih formata kulture (npr. porozni umetci sa 24, 96 ili 384 jažice koji omogućavaju kontinuirano dopunjavanje i uklanjanje bazolateralnih medija).
Da bismo indukovali 3D morfogenezu ljudskog crijevnog epitela in vitro, koristili smo mikrofluidni čip crijevnog uređaja koji sadrži dva paralelna mikrokanala i elastičnu poroznu membranu između kako bismo stvorili lumen-kapilarni interfejs. Također demonstriramo upotrebu jednokanalnog mikrofluidnog uređaja (hibridnog čipa) koji omogućava kontinuirani bazolateralni protok ispod polariziranih epitelnih slojeva uzgojenih na Transwell umetcima. U obje platforme, morfogeneza različitih ljudskih crijevnih epitelnih ćelija može se demonstrirati primjenom usmjerene manipulacije protoka kako bi se uklonili antagonisti morfogena iz bazolateralnog odjeljka. Cijeli eksperimentalni postupak (Slika 1) sastoji se od pet dijelova: (i) mikrofabrikacija crijevnog čipa ili Transwell umetljivog hibridnog čipa (koraci 1-5; Okvir 1), (ii) priprema crijevnih epitelnih ćelija (Caco-2 ćelije) ili ljudskih crijevnih organoida; okviri 2-5), (iii) kultura crijevnih epitelnih ćelija na crijevnim čipovima ili hibridnim čipovima (koraci 6-9), (iv) indukcija 3D morfogeneze in vitro (korak 10) i (v)) za karakterizaciju 3D epitelne mikrostrukture (koraci 11-24). Konačno, odgovarajuća kontrolna grupa (o čemu će biti više riječi u nastavku) je dizajnirana za validaciju efikasnosti in vitro morfogeneze poređenjem epitelne morfogeneze sa prostornim, vremenskim, uslovnim ili proceduralnim kontrolama.
Koristili smo dvije različite platforme za kulturu: crijeva na čipu s ravnim kanalima ili nelinearnim zavijenim kanalima ili hibridne čipove koji sadrže Transwell (TW) umetke u mikrofluidnom uređaju, izrađenom kao što je opisano u Okviru 1, a korak 1-5. „Izrada uređaja“ prikazuje glavne korake u izradi jednog čipa ili hibridnog čipa. „Kultura ćelija ljudskog crijevnog epitela“ objašnjava izvor ćelija (Caco-2 ili ljudski crijevni organoidi) i postupak kulture koji se koristi u ovom protokolu. „In vitro morfogeneza“ prikazuje ukupne korake u kojima se Caco-2 ili epitelne ćelije izvedene iz organoida kultiviraju na crijevnom čipu ili na Transwell umetcima hibridnog čipa, nakon čega slijedi indukcija 3D morfogeneze i formiranje karakterizirane epitelne strukture. Broj koraka programa ili broj okvira prikazan je ispod svake strelice. Aplikacija pruža primjere kako se uspostavljeni slojevi crijevnog epitela mogu koristiti, na primjer, u karakterizaciji diferencijacije ćelija, studijama fiziologije crijeva, uspostavljanju ekosistema domaćina i mikrobioma i modeliranju bolesti. Imunofluorescentne slike u „Diferencijaciji ćelija“. prikazuje jezgre, F-aktin i MUC2 eksprimirane u 3D Caco-2 epitelnom sloju generiranom na crijevnom čipu. MUC2 signalizacija je prisutna u vrčastim ćelijama i sluzi koja se luči sa površina sluznice. Fluorescentne slike u Gut Physiology prikazuju sluz proizvedenu bojenjem na ostatke sijalinske kiseline i N-acetilglukozamina korištenjem fluorescentnog aglutinina pšeničnih klica. Dvije preklapajuće slike u "Host-Microbe Co-Cultures" prikazuju reprezentativne ko-kulture domaćina i mikrobioma u crijevima na čipu. Lijeva ploča prikazuje ko-kulturu E. coli koja eksprimira zeleni fluorescentni protein (GFP) s mikroinženjerskim 3D Caco-2 epitelnim ćelijama. Desna ploča prikazuje lokalizaciju GFP E. coli ko-kultiviranog s 3D Caco-2 epitelnim ćelijama, nakon čega slijedi imunofluorescentno bojenje s F-aktinom (crveno) i jezgrama (plavo). Modeliranje bolesti ilustruje zdravo naspram sindroma propusnih crijeva u čipovima s upalom crijeva pod fiziološkim izazovom s bakterijskim antigenima (npr. lipopolisaharid, LPS) i imunološkim ćelijama (npr. PBMC; zelena). Caco-2 ćelije su kultivirane kako bi se uspostavio 3D epitelni sloj. Mjerna traka, 50 µm. Slike u donjem redu: „Diferencijacija ćelija“ prilagođena uz dozvolu iz reference.2. Oxford University Press; Reprodukovano uz dozvolu iz Ref.5. NAS; „Kokultura domaćina i mikroba“ prilagođena uz dozvolu iz ref.3. NAS; „Modeliranje bolesti“ prilagođeno uz dozvolu iz reference.5. NAS.
I crijeva na čipu i hibridni čipovi su izrađeni korištenjem PDMS replika koje su izvađene iz silikonskih kalupa mekom litografijom1,44 i oblikovane sa SU-8. Dizajn mikrokanala u svakom čipu određen je uzimajući u obzir hidrodinamiku kao što su napon smicanja i hidrodinamički pritisak1,4,12. Originalni dizajn crijeva na čipu (Prošireni podaci, slika 1a), koji se sastojao od dva paralelna ravna mikrokanala postavljena jedan pored drugog, evoluirao je u složeni crijevo na čipu (Prošireni podaci, slika 1b) koji uključuje par zakrivljenih mikrokanala kako bi se izazvalo povećano vrijeme zadržavanja fluida, nelinearni obrasci protoka i višeosna deformacija kultiviranih ćelija (slika 2a-f)12. Kada je potrebno rekreirati složeniju biomehaniku crijeva, mogu se odabrati složena crijeva na čipu. Pokazali smo da zavijeni crijevni čip također snažno inducira 3D morfogenezu u sličnom vremenskom okviru sa sličnim stepenom rasta epitela u poređenju sa originalnim crijevnim čipom. bez obzira na tip kultivisanih ćelija. Stoga, da bi se indukovala 3D morfogeneza, linearni i kompleksni dizajni crijeva na čipu su zamjenjivi. PDMS replike očvrsnute na silikonskim kalupima sa SU-8 uzorcima pružile su negativne karakteristike nakon vađenja iz kalupa (slika 2a). Da bi se izradila crijeva na čipu, pripremljeni gornji PDMS sloj je sekvencijalno vezan za porozni PDMS film, a zatim poravnat sa donjim PDMS slojem nepovratnim vezivanjem pomoću koronskog tretmana (slika 2b-f). Da bi se izradili hibridni čipovi, očvrsnute PDMS replike su vezane za staklene pločice kako bi se stvorili jednokanalni mikrofluidni uređaji koji bi mogli primiti Transwell umetke (slika 2h i prošireni podaci, slika 2). Proces vezivanja se izvodi tretiranjem površina PDMS replike i stakla plazmom kisika ili koronskim tretmanom. Nakon sterilizacije mikrofabrikovanog uređaja pričvršćenog na silikonsku cijev, postavka uređaja je bila spremna za izvođenje 3D morfogeneze crijevnog epitela (slika 2g).
a, Shematski prikaz pripreme PDMS dijelova iz silikonskih kalupa sa uzorkom SU-8. Nestvrdnuti PDMS rastvor je izliven na silikonski kalup (lijevo), stvrdnut na 60 °C (sredina) i izvađen iz kalupa (desno). Izvađeni PDMS je isječen na komade i očišćen za daljnju upotrebu.b, Fotografija silikonskog kalupa korištenog za pripremu gornjeg sloja PDMS-a.c, Fotografija silikonskog kalupa korištenog za izradu porozne PDMS membrane.d, Serija fotografija gornjih i donjih PDMS komponenti i sastavljenog crijevnog uređaja na čipu.e, Shematski prikaz poravnanja gornjih, membranskih i donjih PDMS komponenti. Svaki sloj je nepovratno vezan plazma ili koronskom obradom.f, Shematski prikaz izrađenog uređaja crijevo na čipu sa superponiranim zavijenim mikrokanalima i vakuumskim komorama.g, Postavljanje crijeva na čipu za mikrofluidnu kulturu ćelija. Izrađeno crijevo na čipu sastavljeno sa silikonskom cijevi i špricom postavljeno je na pokrovno staklo. Čip uređaj je postavljen na poklopac Petrijeve posude od 150 mm. posuda za obradu. Vezivo se koristi za zatvaranje silikonske cijevi.h, Vizuelni snimci izrade hibridnog čipa i 3D morfogeneze korištenjem hibridnih čipova. Transwell umetci pripremljeni nezavisno za kultivaciju 2D monoslojeva crijevnih epitelnih ćelija umetnuti su u hibridni čip kako bi se indukovala crijevna 3D morfogeneza. Medij se perfundira kroz mikrokanale ispod ćelijskog sloja uspostavljenog na Transwell umetku. Mjerna traka, 1 cm.h Preštampano uz dozvolu iz reference.4. Elsevier.
U ovom protokolu, ćelijska linija Caco-2 i crijevni organoidi korišteni su kao epitelni izvori (Slika 3a). Obje vrste ćelija kultivirane su nezavisno (Okvir 2 i Okvir 5) i korištene za zasijavanje ECM-om obloženih mikrokanala crijeva na čipu ili Transwell umetaka. Kada su ćelije konfluentne (>95% pokrivenost u bocama), rutinski kultivirane Caco-2 ćelije (između pasaža 10 i 50) u T-bocama se sakupljaju kako bi se pripremile suspenzije disociranih ćelija pomoću tekućine za tripsinizaciju (okvir 2). Ljudski crijevni organoidi iz crijevnih biopsija ili hirurških resekcija kultivirani su u Matrigel scaffold kupolama u pločama sa 24 jažice kako bi se podržalo strukturno mikrookruženje. Medij koji sadrži esencijalne morfogene (kao što su Wnt, R-spondin i Noggin) i faktore rasta pripremljene kao što je opisano u Okviru 3 dopunjavan je svaki drugi dan dok organoidi nisu narasli do ~500 µm u promjeru. Potpuno uzgojeni organoidi se sakupljaju i disociraju u pojedinačne ćelije za zasijavanje na crijevo ili Transwell umetci na čipu (Okvir 5). Kao što smo prethodno izvijestili, može se razlikovati prema vrsti bolesti12,13 (npr. ulcerozni kolitis, Crohnova bolest, kolorektalni karcinom ili normalni donor), mjestu lezije (npr. lezija naspram neoštećenog područja) i gastrointestinalnoj lokaciji u traktu (npr. duodenum, jejunum, ileum, cekum, debelo crijevo ili rektum). U Okviru 5 pružamo optimizirani protokol za kultiviranje organoida debelog crijeva (koloida) koji obično zahtijevaju veće koncentracije morfogena od organoida tankog crijeva.
a, Radni tok za indukciju morfogeneze crijeva u crijevnom čipu. Caco-2 ljudski crijevni epitel i crijevni organoidi koriste se u ovom protokolu za demonstraciju 3D morfogeneze. Izolirane epitelne ćelije su zasijane u pripremljeni uređaj crijevo-na-čipu (priprema čipa). Nakon što su ćelije zasijane (zasijane) i pričvršćene (pričvršćene) na poroznu membranu PDMS-a na dan 0 (D0), apikalni (AP) protok se pokreće i održava prva 2 dana (protok, AP, D0-D2). Bazolateralni (BL) protok se također pokreće zajedno s cikličkim pokretima istezanja (istezanje, protok, AP i BL) kada se formira kompletan 2D monosloj. Intestinalna 3D morfogeneza se spontano dogodila nakon 5 dana mikrofluidne kulture (morfogeneza, D5). Slike faznog kontrasta pokazuju reprezentativnu morfologiju Caco-2 ćelija u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj tački (stupčasti grafikon, 100 µm). Četiri shematska dijagrama koji ilustruju odgovarajuće kaskade morfogeneze crijeva (gore desno). Isprekidane strelice. Na shemi je prikazan smjer protoka fluida.b, SEM slika koja prikazuje površinsku topologiju uspostavljenog 3D Caco-2 epitela (lijevo). Umetak koji ističe uvećano područje (bijeli isprekidani okvir) prikazuje regenerirane mikrovile na 3D Caco-2 sloju (desno).c, Horizontalni frontalni prikaz uspostavljenog Caco-2 3D, klaudina (ZO-1, crveno) i kontinuiranih membrana četkaste granice označenih F-aktinom (zeleno) i jezgara (plavo) Imunofluorescentna konfokalna vizualizacija epitelnih ćelija na crijevnim čipovima. Strelice koje pokazuju na srednji shemu označavaju lokaciju fokalne ravni za svaki konfokalni prikaz.d, Vremenski tok morfoloških promjena u organoidima kultiviranim na čipu dobivenim fazno kontrastnom mikroskopijom 3., 7., 9., 11. i 13. dana. Umetak (gore desno) prikazuje veliko uvećanje date slike.e, DIC fotomikrografija organoidnog 3D epitela uspostavljenog u crijevima na kriški snimljenoj 7. dana.f, Preklopljene imunofluorescentne slike koje prikazuju markere za matične ćelije (LGR5; magenta), vrčaste ćelije (MUC2; zelena), F-aktin (sivo) i jezgre (cijan) uzgajane na crijevnim čipovima 3 dana, respektivno (lijevo) i 13-dnevni (srednji) organoidi na epitelnom sloju. Pogledajte također Proširene podatke Slika 3, koja ističe LGR5 signalizaciju bez MUC2 signalizacije. Fluorescentne slike koje prikazuju epitelnu mikrostrukturu (desno) 3D organoidnog epitela uspostavljenog u crijevima na čipu bojenjem plazma membrane bojom CellMask (desno) 13. dana kulture. Mjerna traka je 50 μm osim ako nije drugačije navedeno.b Preštampano uz dozvolu iz reference.2. Oxford University Press; c Adaptirano uz dozvolu iz reference.2. Oxford University Press; e i f prilagođeno uz dozvolu referencom.12 Pod Creative Commons licencom CC BY 4.0.
U crijevima na čipu, potrebno je modificirati hidrofobnu površinu porozne PDMS membrane za uspješno ECM premazivanje. U ovom protokolu primjenjujemo dvije različite metode za modificiranje hidrofobnosti PDMS membrana. Za kultiviranje Caco-2 ćelija, aktivacija površine samo UV/ozonskim tretmanom bila je dovoljna da smanji hidrofobnost PDMS površine, premaza ECM i pričvrsti Caco-2 ćelije na PDMS membranu. Međutim, mikrofluidna kultura organoidnog epitela zahtijeva hemijski zasnovanu površinsku funkcionalizaciju kako bi se postiglo efikasno taloženje ECM proteina sekvencijalnim nanošenjem polietilenimina (PEI) i glutaraldehida na PDMS mikrokanale. Nakon modifikacije površine, ECM proteini su taloženi kako bi prekrili funkcionaliziranu PDMS površinu, a zatim uvedeni u izolirani organoidni epitel. Nakon što su ćelije pričvršćene, mikrofluidna ćelijska kultura počinje perfuzijom samo medija u gornji mikrokanal dok ćelije ne formiraju potpuni monosloj, dok donji mikrokanal održava statičke uslove. Ova optimizirana metoda za aktivaciju površine i ECM premazivanje omogućava pričvršćivanje organoidnog epitela kako bi se inducirala 3D morfogeneza na PDMS površini.
Transwell kulture također zahtijevaju ECM premaz prije zasijavanja ćelija; međutim, Transwell kulture ne zahtijevaju složene korake prethodne obrade za aktiviranje površine poroznih umetaka. Za uzgoj Caco-2 ćelija na Transwell umetcima, ECM premaz na poroznim umetcima ubrzava pričvršćivanje disociranih Caco-2 ćelija (<1 sat) i formiranje barijere čvrstog spoja (<1-2 dana). Za kultivaciju organoida na Transwell umetcima, izolirani organoidi se zasijavaju na umetke obložene ECM-om, pričvršćuju na površinu membrane (<3 sata) i održavaju dok organoidi ne formiraju potpuni monosloj s integritetom barijere. Transwell kulture se izvode na pločama s 24 jažice bez upotrebe hibridnih čipova.
In vitro 3D morfogeneza može se pokrenuti primjenom protoka tekućine na bazolateralni aspekt uspostavljenog epitelnog sloja. U crijevima na čipu, epitelna morfogeneza je započela kada je medij perfuziran u gornji i donji mikrokanal (Sl. 3a). Kao što je prethodno opisano, ključno je uvesti protok tekućine u donji (bazolateralni) odjeljak radi kontinuiranog uklanjanja usmjereno izlučenih inhibitora morfogena. Da bismo osigurali dovoljno hranjivih tvari i seruma ćelijama vezanim za porozne membrane i generirali luminalni stres smicanja, obično primjenjujemo dvostruki protok u crijevima na čipu. Kod hibridnih čipova, Transwell umetci koji sadrže epitelne monoslojeve umetnuti su u hibridne čipove. Zatim je medij nanesen ispod bazolateralne strane poroznog Transwell umetka kroz mikrokanal. Intestinalna morfogeneza se dogodila 3-5 dana nakon početka bazolateralnog protoka u obje platforme za kulturu.
Morfološke karakteristike mikroinženjerskih 3D epitelnih slojeva mogu se analizirati primjenom različitih modaliteta snimanja, uključujući mikroskopiju faznog kontrasta, mikroskopiju diferencijalnog interferentnog kontrasta (DIC), SEM ili imunofluorescentnu konfokalnu mikroskopiju (Slike 3 i 4). Fazni kontrast ili DIC snimanje može se lako izvesti u bilo kojem trenutku tokom kulture kako bi se pratio oblik i izbočina 3D epitelnih slojeva. Zbog optičke transparentnosti PDMS i poliesterskih filmova, i platforme crijeva na čipu i hibridne čipove mogu pružiti snimanje in situ u realnom vremenu bez potrebe za seciranjem ili rastavljanjem uređaja. Prilikom izvođenja imunofluorescentnog snimanja (Slike 1, 3c, f i 4b, c), ćelije se obično fiksiraju sa 4% (tež./vol.) paraformaldehidom (PFA), zatim Triton X-100 i 2% (tež./vol.) goveđim serumskim albuminom (BSA), redom. U zavisnosti od tipa ćelije, mogu se koristiti različiti fiksativi, permeabilizatori i blokirajući agensi. Primarna antitijela usmjerena na ćeliju ili regiju zavisnu od loze. Markeri se koriste za isticanje ćelija imobiliziranih in situ na čipu, nakon čega slijede sekundarna antitijela zajedno s kontrastnom bojom usmjerenom ili na jezgro (npr. 4',6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) ili F-aktin (npr. fluorescentno obilježeni faloidin). Snimanje uživo zasnovano na fluorescenciji također se može izvesti in situ za detekciju proizvodnje sluzi (slika 1, "Diferencijacija ćelija" i "Fiziologija crijeva"), slučajne kolonizacije mikrobnih ćelija (slika 1, "Kokultura domaćina i mikroba"), regrutacije imunih ćelija (slika 1, "Modeliranje bolesti") ili kontura 3D epitelne morfologije (slika 3c,f i 4b,c). Prilikom modifikacije crijeva na čipu kako bi se odvojio gornji sloj od donjeg sloja mikrokanala, kao što je opisano u ref. Kao što je prikazano na slici 2, 3D epitelna morfologija, kao i mikrovili na apikalnoj četkastoj ivici, mogu se vizualizirati SEM-om (slika 3b). Ekspresija Markeri diferencijacije mogu se procijeniti kvantitativnim PCR5 ili sekvenciranjem RNK pojedinačnih ćelija. U ovom slučaju, 3D slojevi epitelnih ćelija uzgojenih u crijevnim čipovima ili hibridnim čipovima se sakupljaju tripsinizacijom, a zatim koriste za molekularnu ili genetsku analizu.
a, Radni tok za indukciju crijevne morfogeneze u hibridnom čipu. Caco-2 i crijevni organoidi se koriste u ovom protokolu za demonstraciju 3D morfogeneze na hibridnoj čip platformi. Disocirane epitelne ćelije su zasijane u pripremljene Transwell umetke (TW prep; vidi sliku ispod). Nakon što su ćelije zasijane (zasijane) i pričvršćene na poliesterske membrane u Transwell umetcima, sve ćelije su kultivirane u statičkim uslovima (TW kultura). Nakon 7 dana, jedan Transwell umetak koji sadrži 2D monosloj epitelnih ćelija integrisan je u hibridni čip kako bi se uveo bazolateralni tok (Flow, BL), što je na kraju dovelo do stvaranja 3D epitelnog sloja (morfogeneza). Fazno kontrastne mikrografije koje prikazuju morfološke karakteristike ćelija epitela ljudskih organa izvedenih iz normalnog donora (C103 linija) uzlaznog debelog crijeva u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj tački. Sheme u gornjim slojevima ilustruju eksperimentalnu konfiguraciju za svaki korak.b, Hibridni čipovi (lijevi shematski prikaz) mogu dovesti do 3D morfogeneze organoidnih epitelnih ćelija sa konfokalnim mikroskopskim prikazima odozgo prema dolje snimljenim u različitim Z pozicije (gornja, srednja i donja; vidi desnu shemu i odgovarajuće isprekidane linije). pokazale su očite morfološke karakteristike. F-aktin (cijan), jezgro (sivo).c, Fluorescentne konfokalne mikrografije (3D ugaoni pogled) epitelnih ćelija izvedenih iz organoida kultiviranih u statičkom Transwellu (TW; umetak unutar bijelog isprekidanog okvira) u odnosu na hibridni čip (najveći puni snimak) koje upoređuju 2D u odnosu na 3D morfologiju. Par 2D vertikalnih poprečnih presjeka (umetak u gornjem desnom uglu; "XZ") također prikazuje 2D i 3D karakteristike. Mjerna traka, 100 µm.c Preštampano uz dozvolu iz reference.4. Elsevier.
Kontrole se mogu pripremiti kultiviranjem istih ćelija (Caco-2 ili intestinalnih organoidnih epitelnih ćelija) u dvodimenzionalne monoslojeve pod konvencionalnim statičkim uslovima kulture. Važno je napomenuti da iscrpljivanje hranjivih tvari može nastati zbog ograničenog kapaciteta volumena mikrokanala (tj. ~4 µL u gornjem kanalu na originalnom dizajnu crijevnog čipa). Stoga se može uporediti i morfologija epitela prije i nakon primjene bazolateralnog protoka.
Proces meke litografije treba izvoditi u čistoj prostoriji. Za svaki sloj na čipu (gornji i donji sloj i membrane) i hibridnim čipovima korištene su različite fotomaske i izrađene na odvojenim silicijumskim pločicama jer su visine mikrokanala bile različite. Ciljne visine gornjeg i donjeg mikrokanala crijeva na čipu su 500 µm i 200 µm, respektivno. Ciljna visina kanala hibridnog čipa je 200 µm.
Stavite silikonsku pločicu od 7,5 cm u posudu s acetonom. Lagano miješajte ploču 30 sekundi, a zatim je osušite na zraku. Prebacite pločicu na ploču s IPA-om, a zatim je okrenite 30 sekundi da se očisti.
Za maksimalno uklanjanje organskih ostataka sa površine silicijumske pločice opcionalno se može koristiti rastvor pirane (smjesa vodonik-peroksida i koncentrovane sumporne kiseline, 1:3 (vol/vol)).
Rastvor pirane je izuzetno korozivan i stvara toplotu. Neophodne su dodatne sigurnosne mjere. Za odlaganje otpada, ostavite rastvor da se ohladi i prebacite ga u čistu, suhu posudu za otpad. Koristite sekundarne posude i pravilno označite posude za otpad. Molimo vas da slijedite sigurnosne smjernice objekta za detaljnije procedure.
Dehidrirajte oblatne tako što ćete ih staviti na grijaću ploču zagrijanu na 200 °C na 10 minuta. Nakon dehidracije, oblatna je pet puta protresena na zraku da se ohladi.
Sipajte ~10 g fotorezista SU-8 2100 na sredinu očišćene silikonske pločice. Koristite pincetu da ravnomjerno rasporedite fotorezist po pločici. Povremeno stavite pločicu na vruću ploču zagrijanu na 65°C kako bi fotorezist bio manje ljepljiv i lakše se razmazivao. Ne stavljajte pločicu direktno na vruću ploču.
SU-8 je ravnomjerno raspoređen na pločici pokretanjem centrifugalnog premazivanja. Programirajte dolaznu rotaciju SU-8 tokom 5-10 sekundi da se širi brzinom od 500 rpm uz ubrzanje od 100 rpm/s. Postavite glavno okretanje za oblikovanje debljine 200 µm na 1.500 rpm ili postignite debljinu od 250 µm (praveći visinu od 500 µm za gornji sloj crijeva na čipu; pogledajte "Kritični koraci" u nastavku) postavljenu na ubrzanje od 300 rpm/s tokom 30 sekundi pri 1.200 rpm.
Glavna brzina okretanja može se podesiti prema ciljanoj debljini SU-8 uzorka na silicijumskoj pločici.
Za izradu SU-8 uzoraka visine 500 µm za gornji sloj crijeva na čipu, koraci centrifugiranja i mekog pečenja ove kutije (koraci 7 i 8) su sekvencijalno ponovljeni (vidi korak 9) kako bi se dobila dva sloja SU-8 debljine 250 µm, koji se mogu slagati i spajati UV zračenjem u koraku 12 ove kutije, čime se dobija sloj visok 500 µm.
Meko pecite oblatne obložene SU-8 tako što ćete ih pažljivo staviti na vruću ploču na 65 °C tokom 5 minuta, zatim prebacite postavku na 95 °C i inkubirajte dodatnih 40 minuta.
Da biste postigli visinu SU-8 uzorka od 500 μm u gornjem mikrokanalu, ponovite korake 7 i 8 kako biste generirali dva SU-8 sloja debljine 250 μm.
Koristeći UV Mask Aligner, izvršite test lampe prema uputama proizvođača kako biste izračunali vrijeme ekspozicije pločice. (vrijeme ekspozicije, ms) = (doza ekspozicije, mJ/cm2) / (snaga lampe, mW/cm2).
Nakon određivanja vremena ekspozicije, postavite fotomask na držač maske uređaja za poravnavanje UV maski i postavite fotomask na SU-8 obloženu pločicu.
Postavite odštampanu površinu fotomaske direktno na stranu silicijumske pločice obloženu SU-8 kako biste smanjili UV disperziju.
Izložite SU-8 obloženu pločicu i fotomasku vertikalno UV svjetlu od 260 mJ/cm2 tokom unaprijed određenog vremena ekspozicije (pogledajte korak 10 ovog okvira).
Nakon izlaganja UV zračenju, silikonske pločice obložene SU-8 pečene su na 65°C tokom 5 minuta i 95°C tokom 15 minuta na svakoj vrućoj ploči kako bi se izradili uzorci visine 200 μm. Vrijeme naknadnog pečenja na 95°C produženo je na 30 minuta kako bi se izradili uzorci visine 500 µm.
Razvijač se sipa u staklenu posudu, a pečena pločica se stavlja u posudu. Volumen razvijača SU-8 može varirati ovisno o veličini staklene ploče. Obavezno koristite dovoljno razvijača SU-8 da biste potpuno uklonili neosvijetljeni SU-8. Na primjer, kada koristite staklenu posudu promjera 150 mm i kapaciteta 1 L, koristite ~300 mL razvijača SU-8. Razvijajte kalup 25 minuta uz povremeno lagano okretanje.
Razvijeni kalup isprati sa ~10 mL svježeg razvijača, a zatim IPA prskanjem rastvora pipetom.
Stavite pločicu u plazma čistač i izložite je plazmi kisika (atmosferski plin, ciljani tlak 1 × 10−5 Torr, snaga 125 W) tokom 1,5 minuta.
Stavite pločicu u vakuumski eksikator sa staklenom pločicom unutra. Pločice i pločice mogu se postaviti jedna pored druge. Ako je vakuumski eksikator podijeljen na nekoliko slojeva pločom, pločice stavite u donju komoru, a pločice u gornju komoru. Na staklenu pločicu nakapajte 100 μL otopine trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silana i primijenite vakuum za silanizaciju.
Odmrznite bočicu smrznutih Caco-2 ćelija u vodenom kupatilu na 37°C, a zatim prebacite odmrznute ćelije u T75 tikvicu koja sadrži 15 mL prethodno zagrijanog Caco-2 medija na 37°C.
Da bi se Caco-2 ćelije progutale pri ~90% konfluencije, prvo se zagrije Caco-2 podloga, PBS i 0,25% tripsina/1 mM EDTA u vodenom kupatilu na 37°C.
Aspirirajte medij vakuumskom aspiracijom. Isprati ćelije dva puta sa 5 mL toplog PBS-a ponavljanjem vakuumske aspiracije i dodavanjem svježeg PBS-a.