Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman modeu kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal nampilkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Morfogenesis peujit manusa ngadegkeun fitur crypt-villus tina mikroarsitektur épitél 3D sareng organisasi spasial. Struktur unik ieu diperyogikeun pikeun ngajaga homeostasis peujit ku cara ngajaga niche sél stém dina crypt basal tina antigén mikroba éksogén sareng metabolitna. Salaku tambahan, vili peujit sareng mukus anu nyékrésikeun nampilkeun sél épitél anu dibédakeun sacara fungsional kalayan panghalang pelindung dina permukaan mukosa peujit. Ku alatan éta, nyiptakeun deui struktur épitél 3D penting pisan pikeun konstruksi modél peujit in vitro. Utamana, gut-on-a-chip mimetik organik tiasa ngainduksi morfogenesis 3D spontan tina épitél peujit kalayan fungsi fisiologis sareng biomékanika anu ditingkatkeun. Di dieu, kami nyayogikeun protokol anu tiasa diulang pikeun ngainduksi morfogenesis peujit sacara kuat dina peujit dina chip mikrofluidik ogé dina chip hibrida anu dipasang dina Transwell. Kami ngajelaskeun metode anu lengkep pikeun fabrikasi alat, budidaya Caco-2 atanapi sél épitél organoid peujit dina setélan konvensional ogé dina platform mikrofluidik, induksi morfogenesis 3D, sareng karakterisasi épitél 3D anu ditetepkeun nganggo sababaraha modalitas pencitraan. Protokol ieu ngahontal régenerasi mikroarsitektur peujit fungsional ku cara ngontrol aliran cairan basolateral salami 5 dinten. Métode morfogenesis in vitro kami nganggo tegangan geser sareng gerakan mékanis anu relevan sacara fisiologis sareng henteu meryogikeun rékayasa sél atanapi manipulasi anu rumit, anu tiasa ngaleuwihan téknik anu tos aya. Kami ngabayangkeun yén protokol anu diusulkeun tiasa gaduh implikasi anu lega pikeun komunitas panalungtikan biomédis, nyayogikeun metode pikeun ngarégenerasi lapisan epitel peujit 3D in vitro pikeun aplikasi biomédis, klinis, sareng farmasi.
Ékspérimén nunjukkeun yén sél Caco-2 epitél peujit anu dibudidayakeun dina alat mikrofluidik gut-on-a-chip1,2,3,4,5 atanapi bilayer6,7 tiasa ngalaman morfogenesis 3D spontan in vitro tanpa pamahaman anu jelas ngeunaan mékanisme anu mendasari. Dina panilitian anyar kami, kami mendakan yén ngaleungitkeun antagonis morfogen anu disékrésikeun sacara basolateral tina alat kultur diperyogikeun sareng cekap pikeun ngainduksi morfogenesis epitél 3D in vitro, anu parantos dipidangkeun ku Caco-2 sareng organoid peujit anu diturunkeun ku pasien. Sél épitél divalidasi. Dina panilitian ieu, urang sacara khusus museur kana produksi sél sareng distribusi konsentrasi antagonis Wnt anu kuat, Dickkopf-1 (DKK-1), dina alat mikrofluidik gut-on-a-chip sareng anu dimodifikasi anu ngandung sisipan Transwell, anu disebut "Hybrid Chip". Urang nunjukkeun yén panambahan antagonis Wnt éksogén (sapertos DKK-1, repressor Wnt 1, protéin anu aya hubunganana sareng frizzled 1, atanapi Soggy-1) kana peujit on-chip ngahalangan morfogenesis atanapi ngaganggu lapisan épitél 3D anu tos distruktur, nunjukkeun yén setrés antagonis salami kultur tanggung jawab pikeun morfogenesis peujit in vitro. Ku alatan éta, pendekatan praktis pikeun ngahontal morfogenesis anu kuat dina antarmuka épitél nyaéta miceun atanapi ngajaga tingkat antagonis Wnt dina kompartemen basolateral ku cara nyiram aktif (contona, dina platform gut-on-a-chip atanapi hibrida-on-a-chip) atanapi difusi. Média basolateral (contona, tina sisipan Transwell kana waduk basolateral ageung dina sumur).
Dina protokol ieu, kami nyayogikeun metode anu lengkep pikeun ngadamel microdevices gut-on-a-chip sareng chip hibrida anu tiasa dipasangkeun ku Transwell (léngkah 1-5) pikeun ngakultur sél épitél peujit dina mémbran porous berbasis polidimetilsiloxane (PDMS) (léngkah 6A, 7A, 8, 9) atanapi mémbran poliéster tina sisipan Transwell (léngkah 6B, 7B, 8, 9) sareng ngainduksi morfogenesis 3D in vitro (léngkah 10). Kami ogé ngaidentipikasi fitur sélular sareng molekuler anu nunjukkeun histogenesis spésifik jaringan sareng diferensiasi sélular anu gumantung kana garis keturunan ku cara nerapkeun sababaraha modalitas pencitraan (léngkah 11-24). Kami ngainduksi morfogenesis nganggo sél épitél peujit manusa, sapertos Caco-2 atanapi organoid peujit, dina dua format kultur kalayan rinci téknis kalebet modifikasi permukaan mémbran porous, nyiptakeun monolayer 2D, sareng biokimia peujit sareng Réproduksi lingkungan mikro biomékanis. in vitro. Pikeun ngainduksi morfogenesis 3D tina monolayer épitél 2D, kami miceun antagonis morfogen dina duanana bentuk anu dikultur ku cara ngalir. média kana kompartemen basolateral tina kultur. Pamungkas, urang nyayogikeun gambaran ngeunaan kagunaan lapisan epitel 3D anu tiasa diregenerasi anu tiasa dianggo pikeun modél kamekaran epitel anu gumantung kana morfogen, ko-kultur host-mikrobioma longitudinal, inféksi patogén, tatu radang, disfungsi panghalang epitel, sareng terapi berbasis probiotik Conto. pangaruh.
Protokol kami tiasa mangpaat pikeun rupa-rupa élmuwan dina dasar (contona, biologi mukosa peujit, biologi sél stém, sareng biologi perkembangan) sareng panalungtikan terapan (contona, uji ubar praklinis, modél panyakit, rékayasa jaringan, sareng gastroenterologi) dampak anu lega. Kusabab réproduksibilitas sareng kakuatan protokol kami pikeun ngainduksi morfogenesis 3D tina épitél peujit in vitro, kami ngabayangkeun yén strategi téknis kami tiasa disebarkeun ka pamiarsa anu nalungtik dinamika sinyal sél salami perkembangan peujit, régenerasi atanapi homeostasis. Salaku tambahan, protokol kami mangpaat pikeun nalungtik inféksi dina rupa-rupa agén inféksi sapertos Norovirus 8, Sindrom Pernapasan Akut Parah Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 atanapi Vibrio cholerae. Pamirsa patologi sareng patogenesis panyakit ogé mangpaat. Panggunaan sistem mikrofisiologi peujit on-chip tiasa ngamungkinkeun ko-kultur longitudinal 10 sareng penilaian salajengna ngeunaan pertahanan host, réspon imun sareng perbaikan tatu anu aya hubunganana sareng patogén dina saluran gastrointestinal (GI) 11. Gangguan GI sanés anu aya hubunganana sareng sindrom peujit bocor, panyakit celiac, panyakit Crohn, kolitis ulseratif, pouchitis, atanapi sindrom peujit gampang ambek tiasa disimulasikeun nalika lapisan epitel peujit 3D disiapkeun nganggo lapisan epitel peujit 3D pasien, panyakit ieu kalebet atrofi villous, pondokna crypt, karusakan mukosa, atanapi gangguan panghalang epitel. Biopsi atanapi organoid peujit anu diturunkeun tina sél stém 12,13. Pikeun modél anu langkung saé tina kompleksitas lingkungan panyakit, pamiarsa tiasa mertimbangkeun nambihan jinis sél anu aya hubunganana sareng panyakit, sapertos sél mononuklear getih periferal pasien (PBMC), kana modél anu ngandung mikroarsitektur villus-crypt peujit 3D. sél imun spésifik jaringan, 5.
Kusabab mikrostruktur epitel 3D tiasa dibenerkeun sareng divisualisasikeun tanpa prosés sectioning, pamiarsa anu damel dina transkriptomik spasial sareng pencitraan résolusi tinggi atanapi super-résolusi tiasa resep kana pemetaan dinamika spatiotemporal gén sareng protéin dina relung epitel. Kabetot dina téknologi. Réspon kana rangsangan mikroba atanapi imun. Salajengna, crosstalk host-microbiome longitudinal 10, 14 anu koordinasi homeostasis peujit tiasa didirikeun dina lapisan mukosa peujit 3D ku cara ngakulturkeun rupa-rupa spésiés mikroba, komunitas mikroba atanapi mikrobiota fecal, khususna dina gut-on-a-chip. dina platform. Pendekatan ieu khususna pikaresepeun pikeun pamiarsa anu nalungtik imunologi mukosa, gastroenterologi, mikrobioma manusa, kulturomik sareng mikrobiologi klinis anu milarian budidaya mikrobiota peujit anu sateuacanna teu acan dikultur di laboratorium. Upami protokol morfogenesis in vitro urang tiasa diadaptasi kana format kultur anu tiasa diskalakeun, sapertos sisipan multiwell dina pelat 24, 96 atanapi 384 sumur anu terus-terusan ngeusian kompartemen basolateral, protokol ieu ogé tiasa disebarkeun ka anu ngembangkeun platform skrining atanapi validasi farmasi, biomédis atanapi throughput tinggi pikeun industri pangan. Salaku bukti prinsip, kami nembe nunjukkeun kalayakan sistem morfogenesis throughput tinggi multipleks anu tiasa diskalakeun kana format pelat 24-sumur. Salaku tambahan, produk sababaraha organ-on-a-chip parantos dikomersialkeun16,17,18. Ku alatan éta, validasi metode morfogenesis in vitro urang tiasa digancangan sareng berpotensi diadopsi ku seueur laboratorium panalungtikan, industri atanapi pamaréntah sareng lembaga pangaturan pikeun ngartos reprogramming sélular tina morfogenesis peujit in vitro dina tingkat transkriptomik pikeun nguji ubar atanapi bioterapeutik. Panyerepan sareng transportasi Calon ubar dipeunteun nganggo surogat peujit 3D atanapi nganggo modél organ-on-a-chip khusus atanapi komérsial pikeun meunteun réproduktibilitas prosés morfogenesis peujit.
Sajumlah kawates modél ékspériméntal anu aya hubunganana sareng manusa parantos dianggo pikeun nalungtik morfogenesis épitél peujit, utamina kusabab kurangna protokol anu tiasa diimplementasikeun pikeun ngainduksi morfogenesis 3D in vitro. Nyatana, seueur pangaweruh ayeuna ngeunaan morfogenesis peujit dumasar kana panilitian sato (contona, zebrafish20, beurit21 atanapi hayam22). Nanging, éta intensif tanaga gawé sareng biaya, tiasa dipertanyakeun sacara étis, sareng anu paling penting, henteu nangtukeun sacara pasti prosés kamekaran manusa. Modél ieu ogé terbatas pisan dina kamampuanana pikeun diuji ku cara anu tiasa diskalakeun ku sababaraha arah. Ku alatan éta, protokol kami pikeun regenerasi struktur jaringan 3D in vitro langkung unggul tibatan modél sato in vivo ogé modél kultur sél 2D statis tradisional anu sanés. Sakumaha anu parantos dijelaskeun sateuacanna, ngamangpaatkeun struktur épitél 3D ngamungkinkeun kami pikeun nalungtik lokalisasi spasial sél anu dibédakeun dina sumbu crypt-villus salaku réspon kana rupa-rupa rangsangan mukosa atanapi imun. Lapisan épitél 3D tiasa nyayogikeun rohangan pikeun nalungtik kumaha sél mikroba bersaing pikeun ngabentuk relung spasial sareng évolusi ékologis salaku réspon kana faktor host (contona, lapisan mukus jero versus luar, sékrési IgA sareng antimikroba péptida). Salajengna, morfologi épitél 3D tiasa ngamungkinkeun urang pikeun ngartos kumaha mikrobiota peujit nyusun komunitasna sareng sacara sinergis ngahasilkeun metabolit mikroba (contona, asam lemak ranté pondok) anu ngabentuk organisasi sél sareng relung sél stém dina kriptus basal. Fitur-fitur ieu ngan ukur tiasa dipidangkeun nalika lapisan épitél 3D ditetepkeun sacara in vitro.
Salian ti metode urang pikeun nyiptakeun struktur epitel peujit 3D, aya sababaraha metode in vitro. Kultur organoid peujit mangrupikeun téknik rékayasa jaringan anu canggih dumasar kana budidaya sél stém peujit dina kaayaan morfogén spésifik23,24,25. Nanging, panggunaan modél organoid 3D pikeun analisis transportasi atanapi ko-kultur host-microbiome sering nangtang sabab lumen peujit katutupan dina organoid sareng, ku kituna, bubuka komponén luminal sapertos sél mikroba atanapi antigén éksogén diwatesan. Aksés kana lumen organoid tiasa ditingkatkeun nganggo microinjector,26,27 tapi metode ieu invasif sareng intensif tanaga kerja sareng meryogikeun pangaweruh khusus pikeun ngalaksanakeunana. Salajengna, kultur organoid tradisional anu dijaga dina perancah hidrogel dina kaayaan statis henteu sacara akurat ngagambarkeun biomékanika aktif in vivo.
Pamarekan séjén anu dianggo ku sababaraha kelompok panalungtikan ngamangpaatkeun perancah hidrogel 3D anu tos terstruktur pikeun niru struktur épitél peujit ku cara ngakultur sél peujit manusa anu diisolasi dina permukaan gél. Nyieun perancah hidrogel nganggo cetakan anu dicitak 3D, digiling mikro, atanapi didamel sacara litograf. Métode ieu nunjukkeun susunan sél épitél anu diisolasi sacara mandiri sacara in vitro kalayan gradién morfogén anu relevan sacara fisiologis, ngadegkeun struktur épitél rasio aspék anu luhur sareng crosstalk stroma-épitél ku cara ngalebetkeun sél stromal dina perancah. Nanging, sifat perancah anu tos terstruktur tiasa nyegah tampilan prosés morfogenetik spontan sorangan. Modél ieu ogé henteu nyayogikeun aliran luminal atanapi interstitial dinamis, kakurangan tegangan geser cairan anu diperyogikeun ku sél peujit pikeun ngalaman morfogenesis sareng kéngingkeun fungsi fisiologis. Panilitian anyar anu sanés nganggo perancah hidrogel dina platform mikrofluida sareng struktur épitél peujit anu dipola nganggo téknik laser-etching. Organoid peujit beurit nuturkeun pola anu diukir pikeun ngabentuk struktur tubular peujit, sareng aliran cairan intraluminal tiasa direkapitulasi nganggo modul mikrofluida. Nanging, modél ieu henteu nunjukkeun spontan. prosés morfogenetik atanapi kalebet gerakan mékanobiologis peujit. Téhnik percetakan 3D ti grup anu sami tiasa nyiptakeun tabung peujit miniatur kalayan prosés morfogenetik spontan. Sanaos fabrikasi anu rumit tina segmen peujit anu béda dina tabung, modél ieu ogé kakurangan aliran cairan luminal sareng deformasi mékanis. Salaku tambahan, operabilitas modél tiasa diwatesan, khususna saatos prosés bioprinting réngsé, ngaganggu kaayaan ékspériméntal atanapi interaksi sél-ka-sél. Sabalikna, protokol anu diusulkeun nyayogikeun morfogenesis peujit spontan, setrés geser anu relevan sacara fisiologis, biomékanika anu niru motilitas peujit, aksés kompartemen apikal sareng basolateral anu mandiri, sareng nyiptakeun deui lingkungan mikro biologis anu rumit tina modularitas. Ku alatan éta, protokol morfogenesis 3D in vitro kami tiasa nyayogikeun pendekatan anu saling ngalengkepan pikeun ngungkulan tantangan metode anu tos aya.
Protokol kami sapinuhna museur kana morfogenesis épitél 3D, kalayan ngan ukur sél épitél dina kultur sareng teu aya jinis sél sakurilingna sapertos sél mesenchymal, sél endothelial, sareng sél imun. Sakumaha anu parantos dijelaskeun sateuacanna, inti protokol kami nyaéta induksi morfogenesis épitél ku cara miceun inhibitor morfogen anu disékrésikeun di sisi basolateral média anu diwanohkeun. Sanaos modularitas anu kuat tina gut-on-a-chip sareng hybrid-on-a-chip kami ngamungkinkeun kami pikeun nyiptakeun deui lapisan épitél 3D anu ngagulung, kompleksitas biologis tambahan sapertos interaksi épitél-mesenchymal33,34, déposisi Matriks ékstrasélulér (ECM)35 sareng, dina modél kami, fitur crypt-villus anu ngirimkeun niche sél stém dina crypt basal tetep kedah dipertimbangkeun salajengna. Sél stromal (contona, fibroblast) dina mesenchyme maénkeun peran konci dina produksi protéin ECM sareng pangaturan morfogenesis peujit in vivo35,37,38. Panambahan sél mesenchymal kana modél kami ningkatkeun prosés morfogenetik sareng efisiensi napelna sél. Lapisan endothelial (nyaéta, kapiler atanapi limfatik) maénkeun peran penting dina ngatur transportasi molekuler39 sareng rekrutmen sél imun40 dina lingkungan mikro peujit. Salajengna, komponén vaskular anu tiasa dihubungkeun antara modél jaringan mangrupikeun prasarat nalika modél jaringan dirancang pikeun nunjukkeun interaksi multi-organ. Ku alatan éta, sél endotel panginten kedah dilebetkeun pikeun modél fitur fisiologis anu langkung akurat kalayan résolusi tingkat organ. Sél imun anu diturunkeun ti pasien ogé penting pikeun nampilkeun réspon imun bawaan, presentasi antigen, crosstalk imun adaptif bawaan, sareng imunitas spésifik jaringan dina kontéks niru panyakit peujit.
Panggunaan chip hibrida langkung lugas tibatan gut-on-a-chip sabab setelan alatna langkung saderhana sareng panggunaan sisipan Transwell ngamungkinkeun kultur épitél peujit anu tiasa diskalakeun. Nanging, sisipan Transwell anu sayogi sacara komersil kalayan mémbran poliéster henteu élastis sareng henteu tiasa ngasimulasikeun gerakan sapertos peristaltik. Salajengna, kompartemen apikal tina sisipan Transwell anu disimpen dina chip hibrida tetep cicing tanpa tegangan geser dina sisi apikal. Jelas, sipat statis dina kompartemen apikal jarang ngamungkinkeun ko-kultur baktéri jangka panjang dina chip hibrida. Sanaos urang tiasa sacara kuat ngainduksi morfogenesis 3D dina sisipan Transwell nalika nganggo chip hibrida, kakurangan biomékanika anu relevan sacara fisiologis sareng aliran cairan apikal tiasa ngawatesan kalayakan platform chip hibrida pikeun aplikasi poténsial.
Rekonstruksi skala pinuh tina sumbu crypt-villus manusa dina kultur gut-on-a-chip sareng hibrida-on-a-chip tacan ditetepkeun sacara lengkep. Kusabab morfogenesis dimimitian tina monolayer epitel, mikroarsitektur 3D henteu merta nyayogikeun kamiripan morfologis sareng crypts in vivo. Sanaos urang ngacirikeun populasi sél anu proliferasi caket domain crypt basal dina épitél 3D anu direkayasa mikro, daérah crypt sareng villous henteu diwatesan sacara jelas. Sanaos saluran luhur anu langkung luhur dina chip nyababkeun paningkatan jangkungna épitél anu direkayasa mikro, jangkungna maksimum masih diwatesan dugi ka ~300–400 µm. Jerona sabenerna crypts peujit manusa dina peujit leutik sareng ageung nyaéta ~135 µm sareng ~400 µm, masing-masing, sareng jangkungna vili peujit leutik nyaéta ~600 µm41.
Tina sudut pandang pencitraan, pencitraan super-résolusi in situ tina mikroarsitektur 3D tiasa diwatesan kana peujit dina chip, kumargi jarak kerja anu diperyogikeun ti lénsa obyektif ka lapisan épitélial aya dina urutan sababaraha milimeter. Pikeun ngungkulan masalah ieu, obyektif anu jauh tiasa diperyogikeun. Salajengna, ngadamel bagian ipis pikeun persiapan spésimén pencitraan mangrupikeun tantangan kusabab élastisitas PDMS anu luhur. Salajengna, kumargi mikrofabrikasi lapisan-demi-lapisan peujit dina chip ngalibatkeun adhesi permanén antara unggal lapisan, éta hésé pisan pikeun muka atanapi miceun lapisan luhur pikeun nalungtik struktur permukaan lapisan épitélial. Salaku conto, ku ngagunakeun mikroskop éléktron scanning (SEM).
Hidrofobisitas PDMS parantos janten faktor pangwates dina panilitian berbasis mikrofluidik anu ngurus molekul alit hidrofobik, kumargi PDMS tiasa nyerep molekul hidrofobik sapertos kitu sacara nonspésifik. Alternatif pikeun PDMS tiasa dipertimbangkeun sareng bahan polimér sanés. Alternatipna, modifikasi permukaan PDMS (contona, palapis ku bahan lipofilik 42 atanapi poli (etilen glikol) 43) tiasa dipertimbangkeun pikeun ngaminimalkeun adsorpsi molekul hidrofobik.
Pamungkas, metode urang tacan dicirikeun kalawan saé dina hal nyayogikeun panyaringan throughput anu luhur atanapi platform ékspériméntal anu ramah-pangguna "hiji ukuran pikeun sadayana". Protokol ayeuna meryogikeun pompa syringe per microdevice, anu nyéépkeun rohangan dina inkubator CO2 sareng nyegah ékspérimén skala ageung. Watesan ieu tiasa ningkat sacara signifikan ku skalabilitas format kultur inovatif (contona, sisipan porous 24-sumur, 96-sumur, atanapi 384-sumur anu ngamungkinkeun ngeusian deui sareng miceun média basolateral sacara kontinyu).
Pikeun ngainduksi morfogenesis 3D épitél peujit manusa in vitro, urang nganggo alat peujit chip mikrofluidik anu ngandung dua mikrokanal paralel sareng mémbran porous elastis di antawisna pikeun nyiptakeun antarmuka lumen-kapiler. Urang ogé nunjukkeun panggunaan alat mikrofluidik saluran tunggal (chip hibrida) anu nyayogikeun aliran basolateral kontinyu di handapeun lapisan épitél terpolarisasi anu dipelak dina sisipan Transwell. Dina dua platform, morfogenesis rupa-rupa sél épitél peujit manusa tiasa dipidangkeun ku cara nerapkeun manipulasi aliran arah pikeun miceun antagonis morfogen tina kompartemen basolateral. Sakabéh prosedur ékspériméntal (Gambar 1) diwangun ku lima bagian: (i) mikrofabrikasi chip peujit atanapi chip hibrida anu tiasa dipasang Transwell (léngkah 1-5; Kotak 1), (ii) persiapan sél épitél peujit (sél Caco-2) atanapi organoid peujit manusa; kotak 2-5), (iii) kultur sél épitél peujit dina chip peujit atanapi chip hibrida (léngkah 6-9), (iv) induksi morfogenesis 3D in vitro (léngkah 10) sareng (v)) pikeun ngacirikeun mikrostruktur épitél 3D (léngkah 11-24). Pamungkas, grup kontrol anu pas (anu bakal dibahas langkung lanjut di handap) dirancang pikeun ngavalidasi efektivitas morfogenesis in vitro ku cara ngabandingkeun morfogenesis épitél sareng kontrol spasial, temporal, kondisional, atanapi prosedural.
Kami nganggo dua platform kultur anu béda: gut-on-a-chip kalayan saluran lempeng atanapi saluran anu teu linier, atanapi chip hibrida anu ngandung sisipan Transwell (TW) dina alat mikrofluidik, didamel sapertos anu dijelaskeun dina Kotak 1, sareng léngkah 1 -5. "Fabrikasi Alat" nunjukkeun léngkah-léngkah utama dina ngadamel chip tunggal atanapi chip hibrida. "Kultur Sél Épitél Peujit Manusa" ngajelaskeun sumber sél (Caco-2 atanapi organoid peujit manusa) sareng prosedur kultur anu dianggo dina protokol ieu. "Morfogenesis in vitro" nunjukkeun léngkah-léngkah sakabéhna dimana Caco-2 atanapi sél épitél anu diturunkeun tina organoid dikultur dina chip peujit atanapi dina sisipan Transwell tina chip hibrida, dituturkeun ku induksi morfogenesis 3D sareng formasi struktur épitél anu dicirikeun. Nomer léngkah program atanapi nomer kotak ditampilkeun di handap unggal panah. Aplikasi ieu nyayogikeun conto kumaha lapisan épitél peujit anu parantos ditetepkeun tiasa dianggo, contona, dina karakterisasi diferensiasi sél, studi fisiologi peujit, ngadegna ékosistem host-mikrobioma, sareng modél panyakit. Gambar imunofluoresensi dina "Sél "Diferensiasi" nunjukkeun inti, F-aktin sareng MUC2 anu diekspresikeun dina lapisan epitel 3D Caco-2 anu dihasilkeun dina chip peujit. Sinyal MUC2 aya dina sél goblet sareng mukus anu dikaluarkeun tina permukaan mukosa. Gambar fluoresensi dina Fisiologi Gut nunjukkeun mukus anu dihasilkeun ku pewarnaan pikeun asam sialat sareng résidu N-asetilglukosamin nganggo aglutinin kuman gandum fluoresensi. Dua gambar anu tumpang tindih dina "Ko-Kultur Mikroba Host" nunjukkeun ko-kultur mikrobioma host anu representatif dina peujit dina chip. Panel kénca nunjukkeun ko-kultur protéin fluoresensi héjo (GFP) anu diékspresikeun ku E. coli kalayan sél epitel Caco-2 3D anu direkayasa mikro. Panel katuhu nunjukkeun lokalisasi GFP E. coli anu dikultur babarengan sareng sél epitel Caco-2 3D, dituturkeun ku pewarnaan imunofluoresensi kalayan F-aktin (beureum) sareng inti (biru). Pemodelan panyakit ngagambarkeun peujit anu séhat dibandingkeun sareng peujit anu bocor dina chip peradangan peujit dina tantangan fisiologis kalayan antigen baktéri (contona, lipopolisakarida, LPS) sareng sél imun (contona, PBMC; héjo). Sél Caco-2 dikultur pikeun ngawangun lapisan épitél 3D. Skala bar, 50 µm. Gambar dina baris handap: "Diferensiasi sél" diadaptasi kalayan idin ti rujukan. 2. Oxford University Press; Direproduksi kalayan idin ti Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" diadaptasi kalayan idin ti ref.3. NAS; "Disease Modeling" diadaptasi kalayan idin ti rujukan. 5. NAS.
Boh chip gut-on-chip sareng hibrida didamel nganggo réplika PDMS anu dibongkar tina cetakan silikon ku litografi lemes1,44 sareng dipola ku SU-8. Desain mikrokanal dina unggal chip ditangtukeun ku cara mertimbangkeun hidrodinamika sapertos tegangan geser sareng tekanan hidrodinamik1,4,12. Desain gut-on-a-chip asli (Gambar Data Tambahan 1a), anu diwangun ku dua mikrokanal lempeng paralel anu disandingkeun, parantos mekar janten gut-on-a-chip anu rumit (Gambar Data Tambahan 1b) anu kalebet sapasang mikrokanal melengkung pikeun ngainduksi waktos tinggal cairan anu ningkat, pola aliran nonlinier, sareng deformasi multiaksial sél anu dikultur (Gambar 2a–f) 12. Nalika biomékanika peujit anu langkung rumit kedah diciptakeun deui, gut-on-a-chip anu rumit tiasa dipilih. Kami parantos nunjukkeun yén Gut-Chip anu rumit ogé ngainduksi morfogenesis 3D dina jangka waktu anu sami kalayan tingkat pertumbuhan epitel anu sami dibandingkeun sareng aslina. Gut-Chip, henteu paduli jinis sél anu dikultur. Ku kituna, pikeun ngainduksi morfogenesis 3D, desain peujit on-chip anu linier sareng kompléks tiasa ditukeurkeun. Réplika PDMS anu dikeringkeun dina kapang silikon kalayan pola SU-8 nyayogikeun fitur négatif saatos demolding (Gambar 2a). Pikeun ngadamel peujit dina chip, lapisan PDMS luhur anu disiapkeun sacara berurutan dihijikeun kana pilem PDMS anu porous teras disejajarkeun sareng lapisan PDMS handap ku beungkeutan anu teu tiasa dibalikkeun nganggo corona treater (Gambar 2b–f). Pikeun ngadamel chip hibrida, réplika PDMS anu dikeringkeun dihijikeun kana slide kaca pikeun nyiptakeun alat mikrofluida saluran tunggal anu tiasa nampung sisipan Transwell (Gambar 2h sareng Data Diperpanjang Gambar 2). Prosés beungkeutan dilakukeun ku cara ngubaran permukaan réplika PDMS sareng kaca nganggo plasma oksigén atanapi perawatan korona. Saatos sterilisasi alat mikrofabrikasi anu dipasang dina tabung silikon, setelan alat siap pikeun ngalakukeun morfogenesis 3D tina épitél peujit (Gambar 2g).
a, Ilustrasi skematis persiapan bagian PDMS tina cetakan silikon berpola SU-8. Larutan PDMS anu teu acan diawetkeun dituang kana cetakan silikon (kénca), diawetkeun dina suhu 60 °C (tengah) sareng dibongkar (katuhu). PDMS anu dibongkar dipotong-potong sareng dibersihkeun pikeun dianggo salajengna. b, Poto cetakan silikon anu dianggo pikeun nyiapkeun lapisan luhur PDMS. c, Poto cetakan silikon anu dianggo pikeun ngadamel mémbran porous PDMS. d, Sarangkaian poto komponén PDMS luhur sareng handap sareng alat peujit on-chip anu dirakit. e, Skema panyelarasan komponén PDMS luhur, mémbran, sareng handap. Unggal lapisan dihijikeun sacara teu tiasa dibalikkeun deui ku perlakuan plasma atanapi korona. f, Skema alat gut-on-a-chip anu didamel kalayan mikrokanal anu rumit sareng ruang vakum anu ditumpangkeun. g, Persiapan gut-on-a-chip pikeun kultur sél mikrofluidik. Gut anu didamel dina chip anu dirakit kalayan tabung silikon sareng jarum suntik disimpen dina panutup. Alat chip disimpen dina tutup Petri 150 mm wadah pikeun diolah. Pangiket dianggo pikeun nutup tabung silikon.h, Potret visual tina fabrikasi chip hibrida sareng morfogenesis 3D nganggo chip hibrida. Sisipan Transwell anu disiapkeun sacara mandiri pikeun ngakulturkeun monolayer 2D sél epitel peujit dilebetkeun kana chip hibrida pikeun ngainduksi morfogenesis 3D peujit. Médium ieu diperfusi ngaliwatan mikrokanal di handapeun lapisan sél anu ditetepkeun dina sisipan Transwell. Bilah skala, 1 cm.h Dicetak ulang kalayan ijin ti rujukan.4. Elsevier.
Dina protokol ieu, garis sél Caco-2 sareng organoid peujit dianggo salaku sumber epitel (Gambar 3a). Kadua jinis sél dibudidayakeun sacara mandiri (Kotak 2 sareng Kotak 5) sareng dianggo pikeun nyiram mikrokanal anu dilapis ECM tina usus dina chip atanapi sisipan Transwell. Nalika sél ngahiji (cakupan >95% dina labu), sél Caco-2 anu dibudidayakeun sacara rutin (antara petikan 10 sareng 50) dina labu-T dipanén pikeun nyiapkeun suspénsi sél anu dipisahkeun ku cairan tripsinisasi (kotak 2). Organoid peujit manusa tina biopsi peujit atanapi réséksi bedah dibudidayakeun dina kubah perancah Matrigel dina pelat 24-sumur pikeun ngadukung lingkungan mikro struktural. Médium anu ngandung morfogen penting (sapertos Wnt, R-spondin, sareng Noggin) sareng faktor pertumbuhan anu disiapkeun sapertos anu dijelaskeun dina Kotak 3 ditambah unggal dinten sanés dugi ka organoid tumuwuh dugi ka diaméter ~500 µm. Organoid anu dewasa pinuh dipanén sareng dipisahkeun kana sél tunggal pikeun disemai kana usus. atanapi sisipan Transwell dina chip (Kotak 5). Sakumaha anu parantos dilaporkeun sateuacanna, éta tiasa dibédakeun numutkeun jinis panyakit12,13 (contona kolitis ulseratif, panyakit Crohn, kanker kolorektal, atanapi donor normal), situs lesi (contona, lesi dibandingkeun daérah anu henteu lesi) sareng lokasi gastrointestinal dina saluran (contona, duodenum, jejunum, ileum, sekum, usus besar, atanapi rektum). Kami nyayogikeun protokol anu dioptimalkeun dina Kotak 5 pikeun ngakultur organoid kolon (koloid) anu biasana meryogikeun konsentrasi morfogen anu langkung luhur tibatan organoid peujit leutik.
a, Alur kerja pikeun induksi morfogenesis peujit dina chip peujit. Épitél peujit manusa Caco-2 sareng organoid peujit dianggo dina protokol ieu pikeun nunjukkeun morfogenesis 3D. Sél épitél anu diisolasi disiram dina alat peujit-on-a-chip anu disiapkeun (persiapan chip). Sakali sél disiram (disiram) sareng napel (dipasang) kana mémbran porous PDMS dina dinten ka-0 (D0), aliran apikal (AP) dimimitian sareng dijaga salami 2 dinten mimiti (aliran, AP, D0-D2). Aliran basolateral (BL) ogé dimimitian sareng gerakan peregangan siklik (peregangan, aliran, AP sareng BL) nalika monolayer 2D lengkep kabentuk. Morfogenesis 3D peujit lumangsung sacara spontan saatos 5 dinten kultur mikrofluidik (morfogenesis, D5). Gambar kontras fase nunjukkeun morfologi anu ngawakilan sél Caco-2 dina unggal léngkah ékspérimén atanapi titik waktos (grafik batang, 100 µm). Opat diagram skematis anu ngagambarkeun kaskade morfogenesis peujit anu saluyu (katuhu luhur). Titik-titik panah dina skematis ngagambarkeun arah aliran cairan. b, gambar SEM anu nunjukkeun topologi permukaan épitél 3D Caco-2 anu tos ditetepkeun (kénca). Sisipan anu nyorot daérah anu digedekeun (kotak putus-putus bodas) nunjukkeun mikrovili anu dihasilkeun deui dina lapisan 3D Caco-2 (katuhu). c, tampilan frontal horizontal tina Caco-2 3D, claudin (ZO-1, beureum) sareng mémbran wates sikat kontinyu anu dilabélan F-aktin (héjo) sareng inti (biru) Visualisasi confocal imunofluoresensi sél épitél dina chip peujit. Panah anu nunjuk ka skematis tengah nunjukkeun lokasi bidang fokus pikeun unggal tampilan confocal. d, Jalanna waktos parobahan morfologis dina organoid anu dibudidayakeun dina chip anu diala ku mikroskop kontras fase dina dinten ka-3, 7, 9, 11, sareng 13. Sisipan (katuhu luhur) nunjukkeun pembesaran anu luhur tina gambar anu disayogikeun. e, fotomikrograf DIC tina épitél 3D organoid anu ditetepkeun dina peujit dina irisan anu dicandak dina dinten ka-7. f, gambar imunofluoresensi anu ditumpuk nunjukkeun spidol pikeun sél stém (LGR5; magenta), sél goblet (MUC2; héjo), F-aktin (abu-abu) sareng inti (cyan) anu dipelak dina chip peujit salami 3 dinten, masing-masing (Kénca) sareng 13 dinten (tengah) organoid dina lapisan epitel. Tingali ogé Gambar Data Tambahan 3, anu nyorot sinyal LGR5 tanpa sinyal MUC2. Gambar fluoresensi anu nunjukkeun mikrostruktur epitel (katuhu) tina epitel organoid 3D anu diadegkeun dina peujit dina chip ku cara ngawarnaan mémbran plasma ku pewarna CellMask (katuhu) dina dinten ka-13 kultur. Bilah skala nyaéta 50 μm kecuali upami dinyatakeun sanés. b Dicetak ulang kalayan idin ti rujukan. 2. Oxford University Press; c Diadaptasi kalayan idin ti Rujukan. 2. Oxford University Press; e sareng f diadaptasi kalayan idin ku rujukan. 12 Dina Lisénsi Creative Commons CC BY 4.0.
Dina peujit dina chip, perlu pikeun ngarobih permukaan hidrofobik mémbran porous PDMS pikeun palapis ECM anu suksés. Dina protokol ieu, urang nerapkeun dua metode anu béda pikeun ngarobih hidrofobisitas mémbran PDMS. Pikeun budidaya sél Caco-2, aktivasi permukaan ku perlakuan UV/ozon nyalira cekap pikeun ngirangan hidrofobisitas permukaan PDMS, ngalapis ECM sareng ngagantelkeun sél Caco-2 kana mémbran PDMS. Nanging, kultur mikrofluidik épitél organoid meryogikeun fungsionalisasi permukaan berbasis kimia pikeun ngahontal déposisi protéin ECM anu efisien ku cara nerapkeun polietilenimina (PEI) sareng glutaraldehida sacara berurutan kana mikrokanal PDMS. Saatos modifikasi permukaan, protéin ECM disimpen pikeun nutupan permukaan PDMS anu difungsionalkeun teras diwanohkeun kana épitél organoid anu diisolasi. Saatos sél napel, kultur sél mikrofluidik dimimitian ku ngan ukur perfusi média kana mikrokanal luhur dugi ka sél ngabentuk monolayer lengkep, sedengkeun mikrokanal handap ngajaga kaayaan statis. Métode anu dioptimalkeun pikeun aktivasi permukaan sareng palapis ECM ieu ngamungkinkeun napelna épitél organoid pikeun ngainduksi morfogenesis 3D dina PDMS. permukaan.
Kultur Transwell ogé meryogikeun palapis ECM sateuacan nyebarkeun sél; kumaha oge, kultur Transwell henteu meryogikeun léngkah-léngkah perlakuan awal anu rumit pikeun ngaktipkeun permukaan sisipan porous. Pikeun numuwuhkeun sél Caco-2 dina sisipan Transwell, palapis ECM dina sisipan porous ngagancangkeun napelna sél Caco-2 anu disosiasi (<1 jam) sareng formasi panghalang sambungan anu pageuh (<1-2 dinten). Pikeun ngokolakeun organoid dina sisipan Transwell, organoid anu diisolasi disiramkeun dina sisipan anu dilapis ECM, dipasangkeun kana permukaan mémbran (<3 jam) sareng dijaga dugi ka organoid ngabentuk monolayer lengkep kalayan integritas panghalang. Kultur Transwell dilakukeun dina pelat 24-sumur tanpa nganggo chip hibrida.
Morfogenesis 3D in vitro tiasa dimimitian ku cara nerapkeun aliran cairan kana aspék basolateral tina lapisan epitel anu tos ditetepkeun. Dina peujit dina chip, morfogenesis epitel dimimitian nalika média diperfusi kana mikrokanal luhur sareng handap (Gambar 3a). Sakumaha anu parantos dijelaskeun sateuacanna, penting pikeun ngenalkeun aliran cairan dina kompartemen inferior (basolateral) pikeun ngaleungitkeun inhibitor morfogen anu disekresikeun sacara langsung. Pikeun nyayogikeun nutrisi sareng sérum anu cekap pikeun sél anu kaiket dina mémbran porous sareng ngahasilkeun tegangan geser luminal, biasana urang nerapkeun aliran ganda dina peujit dina chip. Dina chip hibrida, sisipan Transwell anu ngandung monolayer epitel dilebetkeun kana chip hibrida. Teras, média diterapkeun di handapeun sisi basolateral tina sisipan Transwell porous ngalangkungan mikrokanal. Morfogenesis peujit lumangsung 3-5 dinten saatos ngamimitian aliran basolateral dina dua platform kultur.
Fitur morfologis lapisan epitel 3D anu didamel nganggo mikro tiasa dianalisis ku cara nerapkeun rupa-rupa modalitas pencitraan, kalebet mikroskop kontras fase, mikroskop kontras gangguan diferensial (DIC), SEM, atanapi mikroskop confocal imunofluoresensi (Gambar 3 sareng 4). Pencitraan kontras fase atanapi DIC tiasa gampang dilakukeun iraha waé salami kultur pikeun ngawas bentuk sareng tonjolan lapisan epitel 3D. Kusabab transparansi optik PDMS sareng pilem poliéster, platform chip gut-on-a-chip sareng hibrida tiasa nyayogikeun pencitraan in situ sacara real-time tanpa kedah motong atanapi ngabongkar alat. Nalika ngalakukeun pencitraan imunofluoresensi (Gambar 1, 3c, f sareng 4b, c), sél biasana difiksasi ku 4% (wt/vol) paraformaldehida (PFA), dituturkeun ku Triton X-100 sareng 2% (wt/vol)) albumin sérum sapi (BSA), dina urutan. Gumantung kana jinis sél, fiksatif, permeabilisator, sareng agén pameungpeuk anu béda tiasa dianggo. Antibodi primér anu narékahan sél anu gumantung kana garis keturunan atanapi Pananda daérah dianggo pikeun nyorot sél anu diimobilisasi in situ dina chip, dituturkeun ku antibodi sekundér sareng pewarna counterstain anu narékahan boh inti (contona, 4′, 6-diamidino-2-phenylene) indol, DAPI) atanapi F-aktin (contona, phalloidin anu dilabélan fluoresensi). Pencitraan langsung berbasis fluoresensi ogé tiasa dilakukeun in situ pikeun ngadeteksi produksi mukus (Gambar 1, "Diferensiasi sél" sareng "Fisiologi peujit"), kolonisasi acak sél mikroba (Gambar 1, "Ko-kultur host-mikroba"), rekrutmen sél imun (Gambar 1, 'Pemodelan Panyakit') atanapi kontur morfologi epitel 3D (Gambar 3c, f sareng 4b, c). Nalika ngarobih peujit dina chip pikeun misahkeun lapisan luhur tina lapisan mikrokanal handap, sapertos anu dijelaskeun dina ref. Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 2, morfologi epitel 3D ogé mikrovili dina wates sikat apikal tiasa divisualisasikeun ku SEM (Gambar 3b). Éksprési diferensiasi Pananda tiasa dipeunteun ku cara ngalaksanakeun PCR5 kuantitatif atanapi sekuensing RNA sél tunggal. Dina hal ieu, lapisan 3D sél epitel anu dipelak dina chip peujit atanapi chip hibrida dipanén ku tripsinisasi teras dianggo pikeun analisis molekuler atanapi genetik.
a, Alur kerja pikeun induksi morfogenesis peujit dina chip hibrida. Caco-2 sareng organoid peujit dianggo dina protokol ieu pikeun nunjukkeun morfogenesis 3D dina platform chip hibrida. Sél épitél anu dipisahkeun diumbi dina sisipan Transwell anu disiapkeun (TW prep; tingali gambar di handap). Sakali sél diumbi (diumbi) sareng napel kana mémbran poliéster dina sisipan Transwell, sadaya sél dibudidayakeun dina kaayaan statis (kultur TW). Saatos 7 dinten, hiji sisipan Transwell anu ngandung monolayer 2D sél épitél diintegrasikeun kana chip hibrida pikeun ngenalkeun aliran basolateral (Flow, BL), anu pamustunganana ngarah kana generasi lapisan épitél 3D (morfogenesis). Mikrograf kontras fase anu nunjukkeun fitur morfologis sél épitél organ manusa anu diturunkeun tina donor normal (garis C103) usus besar naék dina unggal léngkah ékspérimén atanapi titik waktos. Skéma dina lapisan luhur ngagambarkeun konfigurasi ékspérimén pikeun unggal léngkah. b, Chip hibrida (skéma kénca) tiasa ngarah kana morfogenesis 3D sél épitél organoid kalayan pandangan mikroskop confocal luhur-handap anu dicandak dina posisi Z anu béda (luhur, tengah, sareng handap; tingali skematis katuhu sareng garis putus-putus anu saluyu). nunjukkeun ciri morfologis anu atra. F-aktin (cyan), inti (abu). c, Mikrograf confocal fluoresensi (tampilan sudut 3D) sél epitel turunan organoid anu dibudidayakeun dina Transwell statis (TW; inset dina kotak putus-putus bodas) dibandingkeun chip hibrida (poto pinuh panggedéna) ngabandingkeun morfologi 2D dibandingkeun 3D, masing-masing. Sapasang pandangan cross-cut vertikal 2D (inset di pojok katuhu luhur; "XZ") ogé nunjukkeun fitur 2D sareng 3D. Bilah skala, 100 µm. c Dicetak ulang kalayan ijin ti rujukan. 4. Elsevier.
Kontrol tiasa disiapkeun ku cara ngakultur sél anu sami (Caco-2 atanapi sél épitél organoid peujit) kana monolayer dua diménsi dina kaayaan kultur statis konvensional. Anu penting, panurunan nutrisi tiasa disababkeun ku kapasitas volume mikrokanal anu kawates (nyaéta ~4 µL dina saluran luhur dina desain chip peujit asli). Ku alatan éta, morfologi épitél sateuacan sareng saatos aplikasi aliran basolateral ogé tiasa dibandingkeun.
Prosés litografi lemes kedah dilaksanakeun di rohangan anu bersih. Pikeun unggal lapisan dina chip (lapisan luhur sareng handap sareng mémbran) sareng chip hibrida, photomask anu béda dianggo sareng didamel dina wafer silikon anu misah sabab jangkungna mikrokanal béda-béda. Jangkungna target mikrokanal luhur sareng handap peujit dina chip nyaéta 500 µm sareng 200 µm, masing-masing. Jangkungna target saluran chip hibrida nyaéta 200 µm.
Tempatkeun wafer silikon 3 inci dina piring anu dieusi aseton. Goyangkeun piring lalaunan salami 30 detik, teras garingkeun wafer ku cara diangin-anginkeun. Pindahkeun wafer ka piring anu dieusi IPA, teras puterkeun piring salami 30 detik pikeun ngabersihkeun.
Larutan piranha (campuran hidrogén péroksida sareng asam sulfat pekat, 1:3 (vol/vol)) sacara opsional tiasa dianggo pikeun maksimalkeun panyabutan sésa organik tina permukaan wafer silikon.
Larutan piranha téh korosif pisan sarta ngahasilkeun panas. Perlu aya tindakan pencegahan kaamanan tambahan. Pikeun miceun runtah, antepkeun heula larutan nepi ka tiis tuluy pindahkeun kana wadah runtah anu bersih jeung garing. Anggo wadah sekundér sarta beri labél wadah runtah kalawan bener. Mangga turutan pedoman kaamanan fasilitas pikeun prosedur anu leuwih lengkep.
Dehidrasi wafer ku cara neundeunna dina hot plate 200 °C salami 10 menit. Saatos dehidrasi, wafer dikocok lima kali dina hawa supados tiis.
Tuangkeun ~10 g photoresist SU-8 2100 kana tengah wafer silikon anu tos dibersihkeun. Anggo pinset pikeun nyebarkeun photoresist sacara rata dina wafer. Sakali-kali tempatkeun wafer dina hot plate 65°C supados photoresist kirang lengket sareng langkung gampang disebarkeun. Entong nempatkeun wafer langsung dina hot plate.
SU-8 disebarkeun rata dina wafer ku cara ngajalankeun spin coating. Programkeun rotasi SU-8 anu asup salami 5–10 detik pikeun nyebarkeun dina 500 rpm dina akselerasi 100 rpm/s. Setel spin utama pikeun pola ketebalan 200 µm dina 1.500 rpm, atanapi ngahontal ketebalan 250 µm (ngajadikeun jangkungna 500 µm pikeun lapisan luhur peujit dina chip; tingali "Léngkah-léngkah kritis" di handap) disetel dina akselerasi 300 rpm/s 30 detik dina 1.200 rpm.
Kecepatan puteran utama tiasa disaluyukeun numutkeun ketebalan target pola SU-8 dina wafer silikon.
Pikeun nyieun pola SU-8 jangkungna 500 µm pikeun lapisan luhur peujit dina chip, léngkah spin coating sareng soft bake dina Kotak ieu (léngkah 7 sareng 8) diulang sacara berurutan (tingali léngkah 9) pikeun ngahasilkeun dua lapisan SU-8 kandel 250 µm, anu tiasa dilapis sareng digabungkeun ku paparan UV dina léngkah 12 kotak ieu, ngajantenkeun lapisan jangkungna 500 µm.
Panggang wafer anu dilapis SU-8 sacara lemes ku cara nempatkeun wafer sacara ati-ati dina piring panas dina suhu 65 °C salami 5 menit, teras gentos setélan ka 95 °C sareng inkubasi salami 40 menit deui.
Pikeun ngahontal jangkungna 500 μm tina pola SU-8 dina mikrokanal luhur, balikan léngkah 7 sareng 8 pikeun ngahasilkeun dua lapisan SU-8 anu kandelna 250 μm.
Ngagunakeun UV Mask Aligner, laksanakeun uji lampu numutkeun pitunjuk produsén pikeun ngitung waktos paparan wafer. (waktos paparan, ms) = (dosis paparan, mJ/cm2)/(kakuatan lampu, mW/cm2).
Saatos nangtukeun waktos paparan, pasang photomask dina wadah topéng aligner topéng UV teras pasang photomask dina wafer anu dilapis SU-8.
Tempatkeun permukaan photomask anu dicitak langsung dina sisi wafer silikon anu dilapis SU-8 pikeun ngaminimalkeun dispersi UV.
Pasangkeun wafer sareng photomask anu dilapis SU-8 sacara vertikal kana 260 mJ/cm2 sinar UV salami waktos paparan anu parantos ditangtukeun (tingali léngkah 10 dina kotak ieu).
Saatos kakeunaan UV, wafer silikon anu dilapis SU-8 dipanggang dina suhu 65°C salami 5 menit sareng 95°C salami 15 menit dina unggal hot plate pikeun ngadamel pola kalayan jangkungna 200 μm. Perpanjang waktos pasca-panggang dina 95 °C dugi ka 30 menit pikeun ngadamel pola kalayan jangkungna 500 µm.
Pangembang dituang kana piring kaca, teras wafer anu dipanggang disimpen dina piring. Volume pangembang SU-8 tiasa bénten-bénten gumantung kana ukuran piring kaca. Pastikeun nganggo pangembang SU-8 anu cekap pikeun miceun SU-8 anu teu kakeunaan. Salaku conto, nalika nganggo piring kaca diaméter 150 mm kalayan kapasitas 1 L, anggo ~300 mL pangembang SU-8. Kembangkeun citakan salami 25 menit kalayan puteran anu lalaunan sakali-kali.
Bilas kapang anu geus dikembangkeun ku ~10 mL pamekar seger dituturkeun ku IPA ku cara nyemprotkeun larutan nganggo pipet.
Lebetkeun wafer kana pembersih plasma teras pasihan kana plasma oksigén (gas atmosfir, tekanan target 1 × 10−5 Torr, daya 125 W) salami 1,5 menit.
Tempatkeun wafer dina desikator vakum anu aya slide kaca di jerona. Wafer sareng slide tiasa disimpen gigireun. Upami desikator vakum dibagi kana sababaraha lapisan ku pelat, tempatkeun slide di ruang handap sareng wafer di ruang luhur. Teteskeun 100 μL larutan trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silana dina slide kaca sareng terapkeun vakum pikeun silanisasi.
Cairkeun sabotol sél Caco-2 anu beku dina bak cai 37°C, teras pindahkeun sél anu parantos dicairkeun kana labu T75 anu ngandung 15 mL média Caco-2 anu parantos dipanaskeun sateuacanna dina suhu 37°C.
Pikeun ngalirkeun sél Caco-2 dina konfluensi ~90%, mimitina média Caco-2 haneut, PBS, sareng 0,25% tripsin/1 mM EDTA dina bak cai 37°C.
Aspirasi média ku cara aspirasi vakum. Kumbah sél dua kali ku 5 mL PBS haneut ku cara ngulang aspirasi vakum sareng nambihan PBS anyar.