Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSSకు పరిమిత మద్దతు ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను ఆఫ్ చేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము ఈ సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా ప్రదర్శిస్తాము.
మానవ ప్రేగుల రూపాంతరీకరణ 3D ఎపిథీలియల్ సూక్ష్మ నిర్మాణం మరియు ప్రాదేశిక అమరిక యొక్క క్రిప్ట్-విల్లస్ లక్షణాలను స్థాపిస్తుంది. బేసల్ క్రిప్ట్‌లోని మూల కణాల సముదాయాన్ని బాహ్య సూక్ష్మజీవుల యాంటిజెన్‌లు మరియు వాటి జీవక్రియల నుండి రక్షించడం ద్వారా ప్రేగుల సమతుల్యతను కాపాడుకోవడానికి ఈ ప్రత్యేక నిర్మాణం అవసరం. అదనంగా, ప్రేగు విల్లై మరియు స్రవించే శ్లేష్మం, క్రియాత్మకంగా భేదించబడిన ఎపిథీలియల్ కణాలను ప్రేగు శ్లేష్మ ఉపరితలంపై ఒక రక్షక అవరోధంగా కలిగి ఉంటాయి. అందువల్ల, ఇన్ విట్రో ప్రేగు నమూనాల నిర్మాణానికి 3D ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాలను పునఃసృష్టించడం చాలా కీలకం. ముఖ్యంగా, ఆర్గానిక్ మిమెటిక్ గట్-ఆన్-ఎ-చిప్, మెరుగైన శారీరక విధులు మరియు బయోమెకానిక్స్‌తో ప్రేగు ఎపిథీలియం యొక్క ఆకస్మిక 3D రూపాంతరీకరణను ప్రేరేపించగలదు. ఇక్కడ, మేము ఒక మైక్రోఫ్లూయిడిక్ చిప్‌పై అలాగే ట్రాన్స్‌వెల్ ఎంబెడెడ్ హైబ్రిడ్ చిప్‌లో ప్రేగులలో రూపాంతరీకరణను బలంగా ప్రేరేపించడానికి పునరుత్పత్తి చేయగల ఒక ప్రోటోకాల్‌ను అందిస్తున్నాము. మేము పరికరం తయారీ, సాంప్రదాయ పద్ధతులలో అలాగే మైక్రోఫ్లూయిడిక్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌పై కాకో-2 లేదా ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్ ఎపిథీలియల్ కణాల పెంపకం, 3D రూపాంతరీకరణ ప్రేరణ, మరియు లక్షణాల నిర్ధారణ కోసం వివరణాత్మక పద్ధతులను వివరిస్తాము. బహుళ ఇమేజింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి స్థాపించబడిన 3D ఎపిథీలియా యొక్క పునరుత్పత్తి. ఈ ప్రోటోకాల్ 5 రోజుల పాటు బేసోలేటరల్ ద్రవ ప్రవాహాన్ని నియంత్రించడం ద్వారా క్రియాత్మక ప్రేగు సూక్ష్మ నిర్మాణ పునరుత్పత్తిని సాధిస్తుంది. మా ఇన్ విట్రో మార్ఫోజెనిసిస్ పద్ధతి శారీరకంగా సంబంధిత షియర్ స్ట్రెస్ మరియు యాంత్రిక చలనాన్ని ఉపయోగిస్తుంది మరియు సంక్లిష్టమైన సెల్ ఇంజనీరింగ్ లేదా మానిప్యులేషన్ అవసరం లేదు, ఇది ఇతర ప్రస్తుత పద్ధతుల కంటే మెరుగైన పనితీరును కనబరచవచ్చు. బయోమెడికల్, క్లినికల్ మరియు ఫార్మాస్యూటికల్ అనువర్తనాల కోసం ఇన్ విట్రోలో 3D ప్రేగు ఎపిథీలియల్ పొరలను పునరుత్పత్తి చేయడానికి ఒక పద్ధతిని అందించడం ద్వారా, మా ప్రతిపాదిత ప్రోటోకాల్ బయోమెడికల్ పరిశోధన సమాజానికి విస్తృతమైన చిక్కులను కలిగి ఉంటుందని మేము భావిస్తున్నాము.
గట్-ఆన్-ఎ-చిప్1,2,3,4,5 లేదా బైలేయర్ మైక్రోఫ్లూయిడిక్ పరికరాలలో6,7 పెంచిన పేగు ఎపిథీలియల్ కాకో-2 కణాలు, వాటి అంతర్లీన యంత్రాంగంపై స్పష్టమైన అవగాహన లేకుండానే ఇన్ విట్రోలో ఆకస్మిక 3D రూపాంతరీకరణకు లోనవుతాయని ప్రయోగాలు నిరూపిస్తున్నాయి. మా ఇటీవలి అధ్యయనంలో, ఇన్ విట్రోలో 3D ఎపిథీలియల్ రూపాంతరీకరణను ప్రేరేపించడానికి, కల్చర్ పరికరాల నుండి బేసోలేటరల్‌గా స్రవించే మార్ఫోజెన్ వ్యతిరేక కారకాలను తొలగించడం అవసరం మరియు సరిపోతుందని మేము కనుగొన్నాము, దీనిని కాకో-2 మరియు రోగి నుండి తీసుకోబడిన పేగు ఆర్గానాయిడ్ల ద్వారా నిరూపించబడింది. ఎపిథీలియల్ కణాలను ధ్రువీకరించడం జరిగింది. ఈ అధ్యయనంలో, మేము ప్రత్యేకంగా గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న "హైబ్రిడ్ చిప్" అని పిలువబడే సవరించిన మైక్రోఫ్లూయిడిక్ పరికరాలలో, శక్తివంతమైన Wnt యాంటాగోనిస్ట్ అయిన డిక్‌కాఫ్-1 (DKK-1) యొక్క కణ ఉత్పత్తి మరియు సాంద్రత పంపిణీపై దృష్టి సారించాము. ఆన్-చిప్ గట్‌కు బాహ్య Wnt యాంటాగోనిస్ట్‌లను (DKK-1, Wnt రిప్రెసర్ 1, సెక్రెటెడ్ ఫ్రిజ్ల్డ్-రిలేటెడ్ ప్రోటీన్ 1, లేదా సాగీ-1 వంటివి) జోడించడం వల్ల మార్ఫోజెనిసిస్ నిరోధించబడుతుందని లేదా ముందుగా నిర్మించిన 3D ఎపిథీలియల్ పొర దెబ్బతింటుందని మేము ప్రదర్శిస్తున్నాము, ఇది కల్చర్ సమయంలో యాంటాగోనిస్టిక్ ఒత్తిడి ఇన్ విట్రోలో ప్రేగు మార్ఫోజెనిసిస్‌కు కారణమని సూచిస్తుంది. అందువల్ల, ఎపిథీలియల్ ఇంటర్‌ఫేస్ వద్ద బలమైన మార్ఫోజెనిసిస్‌ను సాధించడానికి ఒక ఆచరణాత్మక విధానం ఏమిటంటే, యాక్టివ్ ఫ్లషింగ్ (ఉదాహరణకు, గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ లేదా హైబ్రిడ్-ఆన్-ఎ-చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లలో) లేదా డిఫ్యూజన్ ద్వారా బేసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లో Wnt యాంటాగోనిస్ట్‌ల స్థాయిలను తొలగించడం లేదా కనీస స్థాయిలో నిర్వహించడం. బేసోలేటరల్ మీడియా (ఉదాహరణకు, ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌ల నుండి పెద్ద వాటిలోకి) బావులలోని బేసోలేటరల్ రిజర్వాయర్లు).
ఈ ప్రోటోకాల్‌లో, పాలిడైమిథైల్‌సిలోక్సేన్ (PDMS) ఆధారిత సచ్ఛిద్ర పొరలపై (దశలు 6A, 7A, 8, 9) లేదా ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌ల యొక్క పాలిస్టర్ పొరలపై (దశలు 6B, 7B, 8, 9) ప్రేగు ఎపిథీలియల్ కణాలను కల్చర్ చేయడానికి మరియు ఇన్ విట్రోలో 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి (దశ 10), గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మైక్రోడివైస్‌లు మరియు ట్రాన్స్‌వెల్-ఇన్సర్టబుల్ హైబ్రిడ్ చిప్‌లను (దశలు 1-5) తయారుచేయడానికి ఒక వివరణాత్మక పద్ధతిని మేము అందిస్తున్నాము. బహుళ ఇమేజింగ్ పద్ధతులను (దశలు 11-24) ఉపయోగించడం ద్వారా కణజాల-నిర్దిష్ట హిస్టోజెనిసిస్ మరియు వంశ-ఆధారిత సెల్యులార్ డిఫరెన్సియేషన్‌ను సూచించే సెల్యులార్ మరియు మాలిక్యులార్ లక్షణాలను కూడా మేము గుర్తించాము. సచ్ఛిద్ర పొరల ఉపరితల మార్పు, 2D మోనోలేయర్‌ల సృష్టి, మరియు ఇన్ విట్రోలో ప్రేగు జీవరసాయన మరియు జీవయాంత్రిక సూక్ష్మ పర్యావరణ పునరుత్పత్తి వంటి సాంకేతిక వివరాలతో, రెండు కల్చర్ ఫార్మాట్‌లలో కాకో-2 లేదా ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్స్ వంటి మానవ ప్రేగు ఎపిథీలియల్ కణాలను ఉపయోగించి మేము మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తాము. 2D ఎపిథీలియల్ నుండి 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి మోనోలేయర్‌లలో, కల్చర్ యొక్క బేసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి మీడియంను ప్రవహింపజేయడం ద్వారా రెండు కల్చర్డ్ రూపాలలోనూ మార్ఫోజెన్ యాంటాగోనిస్ట్‌లను మేము తొలగించాము. చివరగా, మార్ఫోజెన్-ఆధారిత ఎపిథీలియల్ పెరుగుదల, లాంగిట్యూడినల్ హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ కో-కల్చర్‌లు, పాథోజెన్ ఇన్ఫెక్షన్, ఇన్ఫ్లమేటరీ గాయం, ఎపిథీలియల్ బారియర్ డిస్ఫంక్షన్ మరియు ప్రోబయోటిక్-ఆధారిత చికిత్సల ప్రభావాలను మోడల్ చేయడానికి ఉపయోగపడే పునరుత్పత్తి చేయగల 3D ఎపిథీలియల్ పొర యొక్క ప్రయోజనాన్ని మేము ఉదాహరణగా అందిస్తున్నాము.
మా ప్రోటోకాల్ ప్రాథమిక (ఉదాహరణకు, ప్రేగు శ్లేష్మ జీవశాస్త్రం, మూల కణ జీవశాస్త్రం మరియు అభివృద్ధి జీవశాస్త్రం) మరియు అనువర్తిత పరిశోధన (ఉదాహరణకు, ప్రీక్లినికల్ డ్రగ్ టెస్టింగ్, వ్యాధి మోడలింగ్, టిష్యూ ఇంజనీరింగ్ మరియు గ్యాస్ట్రోఎంటరాలజీ) రంగాలలోని విస్తృత శ్రేణి శాస్త్రవేత్తలకు ఉపయోగకరంగా ఉండవచ్చు. ఇన్ విట్రోలో ప్రేగు ఎపిథీలియం యొక్క 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడంలో మా ప్రోటోకాల్ యొక్క పునరుత్పత్తి మరియు పటిష్టత కారణంగా, ప్రేగు అభివృద్ధి, పునరుత్పత్తి లేదా హోమియోస్టాసిస్ సమయంలో కణ సంకేతాల గతిశీలతను అధ్యయనం చేసే ప్రేక్షకులకు మా సాంకేతిక వ్యూహాన్ని వ్యాప్తి చేయవచ్చని మేము భావిస్తున్నాము. అదనంగా, నోరోవైరస్ 8, తీవ్రమైన శ్వాసకోశ సిండ్రోమ్ కరోనావైరస్ 2 (SARS-CoV-2), క్లోస్ట్రిడియం డిఫిసిల్, సాల్మోనెల్లా టైఫిమ్యూరియం 9 లేదా విబ్రియో కలరా వంటి వివిధ అంటు ఏజెంట్ల కింద సంక్రమణను పరిశోధించడానికి మా ప్రోటోకాల్ ఉపయోగపడుతుంది. వ్యాధి పాథాలజీ మరియు పాథోజెనిసిస్ గురించిన అవగాహన కూడా ఉపయోగకరంగా ఉంటుంది. ఆన్-చిప్ గట్ మైక్రోఫిజియాలజీ సిస్టమ్ వాడకం, లాంగిట్యూడినల్ కో-కల్చర్ 10 మరియు తదనంతరం జీర్ణాశయాంతర (GI) మార్గంలో హోస్ట్ డిఫెన్స్, రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలు మరియు వ్యాధికారక-సంబంధిత గాయం మరమ్మత్తు యొక్క అంచనాను 11 అనుమతించవచ్చు. లీకీ గట్ సిండ్రోమ్, సెలియాక్ వ్యాధి, క్రోన్స్ వ్యాధి, అల్సరేటివ్ కొలైటిస్, పౌచైటిస్, లేదా ఇరిటబుల్ బవెల్ సిండ్రోమ్‌తో సంబంధం ఉన్న ఇతర GI రుగ్మతలను, రోగి యొక్క బయాప్సీ లేదా స్టెమ్ సెల్-ఉత్పన్న ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్స్12,13 ఉపయోగించి 3D ప్రేగు ఎపిథీలియల్ పొరలను తయారు చేసినప్పుడు అనుకరించవచ్చు. ఈ వ్యాధులలో విల్లస్ క్షీణత, క్రిప్ట్ కుదించుకుపోవడం, శ్లేష్మ పొర దెబ్బతినడం, లేదా బలహీనమైన ఎపిథీలియల్ అవరోధం ఉంటాయి. వ్యాధి వాతావరణం యొక్క అధిక సంక్లిష్టతను మెరుగ్గా నమూనా చేయడానికి, పాఠకులు 3D ప్రేగు విల్లస్-క్రిప్ట్ మైక్రోఆర్కిటెక్చర్‌లను కలిగి ఉన్న నమూనాలకు, రోగి పెరిఫెరల్ బ్లడ్ మోనోన్యూక్లియర్ కణాలు (PBMCలు) వంటి వ్యాధికి సంబంధించిన కణ రకాలను జోడించడాన్ని పరిగణించవచ్చు. కణజాల-నిర్దిష్ట రోగనిరోధక కణాలు, 5.
సెక్షనింగ్ ప్రక్రియ లేకుండానే 3D ఎపిథీలియల్ మైక్రోస్ట్రక్చర్‌ను స్థిరీకరించి, దృశ్యమానం చేయవచ్చు కాబట్టి, స్పేషియల్ ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు హై-రిజల్యూషన్ లేదా సూపర్-రిజల్యూషన్ ఇమేజింగ్‌పై పనిచేసే వీక్షకులు ఎపిథీలియల్ నిచ్‌లలో జన్యువులు మరియు ప్రోటీన్‌ల యొక్క స్పేషియోటెంపోరల్ డైనమిక్స్‌ను మేము మ్యాపింగ్ చేయడంలో ఆసక్తి చూపవచ్చు. సాంకేతికతపై ఆసక్తి. సూక్ష్మజీవి లేదా రోగనిరోధక ఉద్దీపనలకు ప్రతిస్పందన. అంతేకాకుండా, వివిధ సూక్ష్మజీవుల జాతులు, సూక్ష్మజీవుల సముదాయాలు లేదా మల మైక్రోబయోటాను సహ-సాగు చేయడం ద్వారా, ముఖ్యంగా గట్-ఆన్-ఎ-చిప్‌లో, గట్ హోమియోస్టాసిస్‌ను సమన్వయం చేసే లాంగిట్యూడినల్ హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ క్రాస్‌టాక్ 10, 14ను 3D ప్రేగు శ్లేష్మ పొరలో స్థాపించవచ్చు. ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో. ప్రయోగశాలలో ఇంతకు ముందు కల్చర్ చేయని గట్ మైక్రోబయోటాను పెంపొందించాలని కోరుకునే మ్యూకోసల్ ఇమ్యునాలజీ, గ్యాస్ట్రోఎంటరాలజీ, హ్యూమన్ మైక్రోబయోమ్, కల్చరోమిక్స్ మరియు క్లినికల్ మైక్రోబయాలజీని అధ్యయనం చేసే ప్రేక్షకులకు ఈ విధానం ప్రత్యేకంగా ఆకర్షణీయంగా ఉంటుంది. మన ఇన్ విట్రో మార్ఫోజెనిసిస్ ప్రోటోకాల్‌ను, బేసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లను నిరంతరం భర్తీ చేసే 24, 96 లేదా 384 వెల్ ప్లేట్‌లలోని మల్టీవెల్ ఇన్సర్ట్‌ల వంటి స్కేలబుల్ కల్చర్ ఫార్మాట్‌లకు అనుగుణంగా మార్చగలిగితే, ఈ ప్రోటోకాల్‌ను ఫార్మాస్యూటికల్, బయోమెడికల్ లేదా ఆహార పరిశ్రమ కోసం హై-త్రూపుట్ స్క్రీనింగ్ లేదా వాలిడేషన్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లను అభివృద్ధి చేసే వారికి కూడా విస్తరించవచ్చు. ఒక ప్రూఫ్-ఆఫ్-ప్రిన్సిపల్‌గా, మేము ఇటీవల 24-వెల్ ప్లేట్ ఫార్మాట్‌కు స్కేల్ చేయగల మల్టీప్లెక్స్ హై-త్రూపుట్ మార్ఫోజెనిసిస్ సిస్టమ్ యొక్క సాధ్యతను ప్రదర్శించాము. అదనంగా, బహుళ ఆర్గాన్-ఆన్-ఎ-చిప్ ఉత్పత్తులు వాణిజ్యీకరించబడ్డాయి16,17,18. అందువల్ల, మన ఇన్ విట్రో మార్ఫోజెనిసిస్ పద్ధతి యొక్క ధృవీకరణను వేగవంతం చేయవచ్చు మరియు ఇన్ విట్రో గట్ యొక్క సెల్యులార్ రీప్రోగ్రామింగ్‌ను అర్థం చేసుకోవడానికి అనేక పరిశోధనా ప్రయోగశాలలు, పరిశ్రమలు లేదా ప్రభుత్వ మరియు నియంత్రణ సంస్థలు దీనిని స్వీకరించే అవకాశం ఉంది. ఔషధాలు లేదా బయోథెరప్యూటిక్స్‌ను పరీక్షించడానికి ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ స్థాయిలో జరిగే మార్ఫోజెనిసిస్ ప్రక్రియ యొక్క పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి, 3D గట్ సర్రోగేట్‌లను లేదా కస్టమ్ లేదా కమర్షియల్ ఆర్గాన్-ఆన్-ఎ-చిప్ మోడల్‌లను ఉపయోగించి ఔషధ అభ్యర్థుల శోషణ మరియు రవాణాను అంచనా వేశారు.
పేగు ఎపిథీలియల్ మార్ఫోజెనిసిస్‌ను అధ్యయనం చేయడానికి, మానవులకు సంబంధించిన పరిమిత సంఖ్యలో ప్రయోగాత్మక నమూనాలను మాత్రమే ఉపయోగించారు. దీనికి ప్రధాన కారణం, ఇన్ విట్రోలో 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి అమలు చేయగల ప్రోటోకాల్స్ లేకపోవడమే. వాస్తవానికి, గట్ మార్ఫోజెనిసిస్ గురించిన ప్రస్తుత జ్ఞానంలో చాలా భాగం జంతు అధ్యయనాలపై (ఉదాహరణకు, జీబ్రాఫిష్20, ఎలుకలు21 లేదా కోళ్లు22) ఆధారపడి ఉంది. అయితే, అవి శ్రమతో కూడుకున్నవి మరియు ఖర్చుతో కూడుకున్నవి, నైతికంగా సందేహాస్పదంగా ఉండవచ్చు, మరియు అన్నింటికంటే ముఖ్యంగా, మానవ అభివృద్ధి ప్రక్రియలను కచ్చితంగా నిర్ధారించవు. ఈ నమూనాలను బహుళ-మార్గ స్కేలబుల్ పద్ధతిలో పరీక్షించే సామర్థ్యం కూడా చాలా పరిమితంగా ఉంది. అందువల్ల, ఇన్ విట్రోలో 3D కణజాల నిర్మాణాలను పునరుత్పత్తి చేయడానికి మా ప్రోటోకాల్, ఇన్ వివో జంతు నమూనాలతో పాటు ఇతర సాంప్రదాయ స్థిర 2D సెల్ కల్చర్ నమూనాల కంటే మెరుగైన పనితీరును కనబరుస్తుంది. ఇంతకు ముందు వివరించినట్లుగా, 3D ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాలను ఉపయోగించడం ద్వారా, వివిధ శ్లేష్మ లేదా రోగనిరోధక ఉద్దీపనలకు ప్రతిస్పందనగా క్రిప్ట్-విల్లస్ అక్షంలో భేదించిన కణాల ప్రాదేశిక స్థానాన్ని పరిశీలించడానికి మాకు వీలు కలిగింది. హోస్ట్ కారకాలకు ప్రతిస్పందనగా సూక్ష్మజీవుల కణాలు ప్రాదేశిక గూళ్లను ఏర్పరచడానికి మరియు పర్యావరణ పరిణామానికి ఎలా పోటీపడతాయో అధ్యయనం చేయడానికి 3D ఎపిథీలియల్ పొరలు ఒక అవకాశాన్ని అందిస్తాయి. (ఉదాహరణకు, లోపలి మరియు బయటి శ్లేష్మ పొరలు, IgA మరియు యాంటీమైక్రోబయల్ పెప్టైడ్ల స్రావం). అంతేకాకుండా, 3D ఎపిథీలియల్ స్వరూపం ద్వారా, గట్ మైక్రోబయోటా దాని సమూహాలను ఎలా నిర్మిస్తుందో మరియు బేసల్ క్రిప్ట్స్‌లో కణాల నిర్మాణం మరియు మూల కణాల నిచ్‌లను రూపొందించే మైక్రోబయల్ మెటబొలైట్‌లను (ఉదాహరణకు, షార్ట్-చైన్ ఫ్యాటీ యాసిడ్లు) సమన్వయంతో ఎలా ఉత్పత్తి చేస్తుందో మనం అర్థం చేసుకోవచ్చు. ఈ లక్షణాలను ఇన్ విట్రోలో 3D ఎపిథీలియల్ పొరలను ఏర్పాటు చేసినప్పుడు మాత్రమే ప్రదర్శించగలము.
3D ప్రేగు ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాలను సృష్టించే మా పద్ధతికి అదనంగా, అనేక ఇన్ విట్రో పద్ధతులు ఉన్నాయి. ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్ కల్చర్ అనేది నిర్దిష్ట మార్ఫోజెన్ పరిస్థితులలో ప్రేగు మూల కణాలను పెంచడంపై ఆధారపడిన ఒక అత్యాధునిక టిష్యూ ఇంజనీరింగ్ టెక్నిక్23,24,25. అయితే, రవాణా విశ్లేషణ లేదా హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ కో-కల్చర్‌ల కోసం 3D ఆర్గానాయిడ్ నమూనాల వాడకం తరచుగా సవాలుగా ఉంటుంది, ఎందుకంటే ప్రేగు ల్యూమెన్ ఆర్గానాయిడ్ లోపల మూసివేయబడి ఉంటుంది మరియు అందువల్ల, మైక్రోబియల్ కణాలు లేదా ఎక్సోజెనస్ యాంటిజెన్‌ల వంటి ల్యూమినల్ భాగాలను ప్రవేశపెట్టడం పరిమితంగా ఉంటుంది. మైక్రోఇంజెక్టర్26,27 ఉపయోగించి ఆర్గానాయిడ్ ల్యూమెన్‌లకు ప్రాప్యతను మెరుగుపరచవచ్చు, కానీ ఈ పద్ధతి ఇన్వాసివ్ మరియు శ్రమతో కూడుకున్నది మరియు దీనిని నిర్వహించడానికి ప్రత్యేక పరిజ్ఞానం అవసరం. అంతేకాకుండా, స్టాటిక్ పరిస్థితులలో హైడ్రోజెల్ స్కాఫోల్డ్‌లలో నిర్వహించబడే సాంప్రదాయ ఆర్గానాయిడ్ కల్చర్‌లు క్రియాశీల ఇన్ వివో బయోమెకానిక్స్‌ను ఖచ్చితంగా ప్రతిబింబించవు.
అనేక పరిశోధన బృందాలు ఉపయోగించే ఇతర పద్ధతులు, జెల్ ఉపరితలంపై వేరుచేసిన మానవ ప్రేగు కణాలను పెంచడం ద్వారా ప్రేగు ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాన్ని అనుకరించడానికి ముందుగా నిర్మించిన 3D హైడ్రోజెల్ స్కాఫోల్డ్‌లను ఉపయోగిస్తాయి. 3D-ప్రింటెడ్, మైక్రో-మిల్డ్, లేదా లిథోగ్రాఫికల్‌గా తయారు చేసిన అచ్చులను ఉపయోగించి హైడ్రోజెల్ స్కాఫోల్డ్‌లను తయారు చేస్తారు. ఈ పద్ధతి, స్కాఫోల్డ్‌లో స్ట్రోమల్ కణాలను చేర్చడం ద్వారా, శారీరకంగా సంబంధిత మార్ఫోజెన్ గ్రేడియంట్‌లతో ఇన్ విట్రోలో వేరుచేసిన ఎపిథీలియల్ కణాల స్వీయ-వ్యవస్థీకృత అమరికను, అధిక యాస్పెక్ట్ రేషియో ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాన్ని మరియు స్ట్రోమా-ఎపిథీలియల్ క్రాస్‌టాక్‌ను స్థాపిస్తుంది. అయితే, ముందుగా నిర్మించిన స్కాఫోల్డ్‌ల స్వభావం, సహజసిద్ధమైన మార్ఫోజెనెటిక్ ప్రక్రియ యొక్క ప్రదర్శనను నిరోధించవచ్చు. ఈ నమూనాలు డైనమిక్ ల్యూమినల్ లేదా ఇంటర్‌స్టీషియల్ ప్రవాహాన్ని కూడా అందించవు, ఎందుకంటే ప్రేగు కణాలు మార్ఫోజెనిసిస్‌కు లోనవడానికి మరియు శారీరక విధులను పొందడానికి అవసరమైన ఫ్లూయిడ్ షియర్ స్ట్రెస్ వీటిలో ఉండదు. మరొక ఇటీవలి అధ్యయనం మైక్రోఫ్లూయిడిక్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో హైడ్రోజెల్ స్కాఫోల్డ్‌లను ఉపయోగించింది మరియు లేజర్-ఎచింగ్ టెక్నిక్‌లను ఉపయోగించి ప్రేగు ఎపిథీలియల్ నిర్మాణాలను నమూనా చేసింది. మౌస్ ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్లు ఎచింగ్ చేసిన నమూనాలను అనుసరించి ప్రేగు నాళికా నిర్మాణాలను ఏర్పరుస్తాయి, మరియు మైక్రోఫ్లూయిడిక్స్‌ను ఉపయోగించి ఇంట్రాల్యూమినల్ ద్రవ ప్రవాహాన్ని పునఃసృష్టించవచ్చు. మాడ్యూల్. అయితే, ఈ నమూనా సహజసిద్ధమైన రూపాంతర ప్రక్రియలను ప్రదర్శించదు మరియు ప్రేగు యొక్క యాంత్రిక-జీవ కదలికలను కూడా కలిగి ఉండదు. అదే బృందం యొక్క 3D ప్రింటింగ్ పద్ధతులు సహజసిద్ధమైన రూపాంతర ప్రక్రియలతో సూక్ష్మ ప్రేగు గొట్టాలను సృష్టించగలిగాయి. గొట్టంలోని వివిధ ప్రేగు భాగాల సంక్లిష్టమైన నిర్మాణం ఉన్నప్పటికీ, ఈ నమూనాలో ల్యూమినల్ ద్రవ ప్రవాహం మరియు యాంత్రిక విరూపణ కూడా లోపించాయి. అదనంగా, ముఖ్యంగా బయోప్రింటింగ్ ప్రక్రియ పూర్తయిన తర్వాత, ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులు లేదా కణాల మధ్య పరస్పర చర్యలకు అంతరాయం కలిగించడం వలన నమూనా యొక్క కార్యాచరణ పరిమితం కావచ్చు. బదులుగా, మేము ప్రతిపాదించిన ప్రోటోకాల్ సహజసిద్ధమైన ప్రేగు రూపాంతరీకరణ, శారీరకంగా సంబంధిత షియర్ స్ట్రెస్, ప్రేగు చలనశీలతను అనుకరించే బయోమెకానిక్స్, స్వతంత్ర అపికల్ మరియు బేసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్‌ల అందుబాటు, మరియు మాడ్యులారిటీ యొక్క సంక్లిష్ట జీవ సూక్ష్మ వాతావరణాల పునఃసృష్టిని అందిస్తుంది. అందువల్ల, మా ఇన్ విట్రో 3D రూపాంతరీకరణ ప్రోటోకాల్ ప్రస్తుత పద్ధతుల సవాళ్లను అధిగమించడానికి ఒక పరిపూరక విధానాన్ని అందించగలదు.
మా ప్రోటోకాల్ పూర్తిగా 3D ఎపిథీలియల్ మార్ఫోజెనిసిస్‌పై దృష్టి పెడుతుంది, కల్చర్‌లో కేవలం ఎపిథీలియల్ కణాలు మాత్రమే ఉంటాయి మరియు మీసెన్‌కైమల్ కణాలు, ఎండోథీలియల్ కణాలు మరియు రోగనిరోధక కణాల వంటి ఇతర రకాల పరిసర కణాలు ఉండవు. ఇంతకు ముందు వివరించినట్లుగా, ప్రవేశపెట్టిన మాధ్యమం యొక్క బేసోలేటరల్ వైపున స్రవించే మార్ఫోజెన్ నిరోధకాలను తొలగించడం ద్వారా ఎపిథీలియల్ మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడమే మా ప్రోటోకాల్ యొక్క ప్రధాన అంశం. మా గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్-ఆన్-ఎ-చిప్ యొక్క పటిష్టమైన మాడ్యులారిటీ, తరంగాల వంటి 3D ఎపిథీలియల్ పొరను పునఃసృష్టించడానికి మాకు వీలు కల్పిస్తున్నప్పటికీ, ఎపిథీలియల్-మీసెన్‌కైమల్ పరస్పర చర్యలు33,34, ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ మ్యాట్రిక్స్ (ECM) నిక్షేపణ 35 మరియు, మా నమూనాలో, బేసల్ క్రిప్ట్స్‌లో మూల కణ నిచ్‌లను తెలియజేసే క్రిప్ట్-విల్లస్ లక్షణాలు వంటి అదనపు జీవసంబంధమైన సంక్లిష్టతలను ఇంకా పరిగణించాల్సి ఉంది. మీసెన్‌కైమ్‌లోని స్ట్రోమల్ కణాలు (ఉదాహరణకు, ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు) ECM ప్రోటీన్ల ఉత్పత్తిలో మరియు వివోలో ప్రేగు మార్ఫోజెనిసిస్ నియంత్రణలో కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి35,37,38. మా నమూనాకు మీసెన్‌కైమల్ కణాలను జోడించడం మార్ఫోజెనెటిక్ ప్రక్రియను మెరుగుపరిచింది. మరియు కణాల అటాచ్‌మెంట్ సామర్థ్యం. ఎండోథెలియల్ పొర (అంటే, కేశనాళికలు లేదా శోషరస నాళాలు) ప్రేగు సూక్ష్మ వాతావరణంలో అణు రవాణాను39 మరియు రోగనిరోధక కణాల నియామకాన్ని40 నియంత్రించడంలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుంది. అంతేకాకుండా, బహుళ-అవయవ పరస్పర చర్యలను ప్రదర్శించడానికి కణజాల నమూనాలను రూపొందించినప్పుడు, కణజాల నమూనాల మధ్య అనుసంధానించగల వాస్కులర్ భాగాలు ఒక ముందస్తు అవసరం. అందువల్ల, అవయవ-స్థాయి రిజల్యూషన్‌తో మరింత ఖచ్చితమైన శారీరక లక్షణాలను నమూనా చేయడానికి ఎండోథెలియల్ కణాలను చేర్చవలసి ఉంటుంది. ప్రేగు వ్యాధిని అనుకరించే సందర్భంలో సహజ రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలు, యాంటిజెన్ ప్రెజెంటేషన్, సహజ అనుకూల రోగనిరోధక క్రాస్‌టాక్ మరియు కణజాల-నిర్దిష్ట రోగనిరోధక శక్తిని ప్రదర్శించడానికి రోగి నుండి తీసుకోబడిన రోగనిరోధక కణాలు కూడా అవసరం.
గట్-ఆన్-ఎ-చిప్‌తో పోలిస్తే హైబ్రిడ్ చిప్‌ల వాడకం చాలా సరళమైనది, ఎందుకంటే పరికరం యొక్క అమరిక సులభంగా ఉంటుంది మరియు ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌ల వాడకం ప్రేగు ఎపిథీలియం యొక్క విస్తృత స్థాయి పెంపకానికి వీలు కల్పిస్తుంది. అయితే, వాణిజ్యపరంగా లభించే పాలిస్టర్ పొరలతో కూడిన ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లు సాగే గుణం లేనివి మరియు పెరిస్టాల్టిక్ వంటి కదలికలను అనుకరించలేవు. అంతేకాకుండా, హైబ్రిడ్ చిప్‌లో ఉంచిన ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్ యొక్క అగ్రభాగం స్థిరంగా ఉండి, దాని అగ్రభాగంలో ఎటువంటి కోత ఒత్తిడి లేకుండా పోయింది. స్పష్టంగా, అగ్రభాగంలోని స్థిర లక్షణాలు హైబ్రిడ్ చిప్‌లలో దీర్ఘకాలిక బాక్టీరియా సహ-పెంపకానికి అరుదుగా వీలు కల్పిస్తాయి. హైబ్రిడ్ చిప్‌లను ఉపయోగించినప్పుడు మనం ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లలో 3D రూపాంతరాన్ని బలంగా ప్రేరేపించగలిగినప్పటికీ, శరీరధర్మశాస్త్రపరంగా సంబంధిత బయోమెకానిక్స్ మరియు అగ్రభాగ ద్రవ ప్రవాహం యొక్క కొరత, సంభావ్య అనువర్తనాల కోసం హైబ్రిడ్ చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌ల సాధ్యతను పరిమితం చేయవచ్చు.
గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్-ఆన్-ఎ-చిప్ కల్చర్‌లలో మానవ క్రిప్ట్-విల్లస్ అక్షం యొక్క పూర్తి-స్థాయి పునర్నిర్మాణాలు ఇంకా పూర్తిగా స్థాపించబడలేదు. రూపాంతరీకరణ ఎపిథీలియల్ ఏకపొర నుండి ప్రారంభమవుతుంది కాబట్టి, 3D సూక్ష్మ నిర్మాణాలు వివోలోని క్రిప్ట్‌లకు రూపాత్మక సారూప్యతను తప్పనిసరిగా అందించవు. మేము మైక్రోఇంజనీర్డ్ 3D ఎపిథీలియంలోని బేసల్ క్రిప్ట్ డొమైన్ సమీపంలో వృద్ధి చెందుతున్న కణ జనాభాను వర్గీకరించినప్పటికీ, క్రిప్ట్ మరియు విల్లస్ ప్రాంతాలు స్పష్టంగా విభజించబడలేదు. చిప్‌పై ఉన్న ఎత్తైన ఎగువ ఛానెల్‌లు మైక్రోఇంజనీర్డ్ ఎపిథీలియం యొక్క ఎత్తును పెంచినప్పటికీ, గరిష్ట ఎత్తు ఇప్పటికీ ~300–400 µm కు పరిమితం చేయబడింది. చిన్న మరియు పెద్ద ప్రేగులలో మానవ ప్రేగు క్రిప్ట్‌ల వాస్తవ లోతు వరుసగా ~135 µm మరియు ~400 µm, మరియు చిన్న ప్రేగు విల్లై యొక్క ఎత్తు ~600 µm41.
ఇమేజింగ్ దృక్కోణం నుండి చూస్తే, 3D సూక్ష్మ నిర్మాణాల యొక్క ఇన్ సిటు సూపర్-రిజల్యూషన్ ఇమేజింగ్ 'గట్ ఆన్ ఎ చిప్'కు మాత్రమే పరిమితం కావచ్చు, ఎందుకంటే ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ నుండి ఎపిథీలియల్ పొర వరకు అవసరమైన వర్కింగ్ డిస్టెన్స్ కొన్ని మిల్లీమీటర్ల క్రమంలో ఉంటుంది. ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, ఒక దూరపు ఆబ్జెక్టివ్ అవసరం కావచ్చు. అంతేకాకుండా, PDMS యొక్క అధిక స్థితిస్థాపకత కారణంగా, ఇమేజింగ్ నమూనా తయారీ కోసం సన్నని సెక్షన్లను తయారు చేయడం సవాలుతో కూడుకున్నది. ఇంకా, 'గట్ ఆన్ ఎ చిప్' యొక్క పొరల వారీ మైక్రోఫ్యాబ్రికేషన్‌లో ప్రతి పొర మధ్య శాశ్వత అతుకుదల ఉంటుంది కాబట్టి, ఎపిథీలియల్ పొర యొక్క ఉపరితల నిర్మాణాన్ని పరిశీలించడానికి పై పొరను తెరవడం లేదా తొలగించడం చాలా సవాలుతో కూడుకున్నది. ఉదాహరణకు, స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (SEM) ఉపయోగించి.
హైడ్రోఫోబిక్ చిన్న అణువులతో వ్యవహరించే మైక్రోఫ్లూయిడిక్-ఆధారిత అధ్యయనాలలో PDMS యొక్క హైడ్రోఫోబిసిటీ ఒక పరిమితి కారకంగా ఉంది, ఎందుకంటే PDMS అటువంటి హైడ్రోఫోబిక్ అణువులను నిర్దిష్టంగా కాకుండా అధిశోషించుకోగలదు. PDMSకు ప్రత్యామ్నాయాలను ఇతర పాలిమరిక్ పదార్థాలతో పరిగణించవచ్చు. ప్రత్యామ్నాయంగా, హైడ్రోఫోబిక్ అణువుల అధిశోషణను తగ్గించడానికి PDMS యొక్క ఉపరితల మార్పును (ఉదాహరణకు, లిపోఫిలిక్ పదార్థాలు 42 లేదా పాలి(ఇథిలీన్ గ్లైకాల్) 43 తో పూత పూయడం) పరిగణించవచ్చు.
చివరగా, అధిక-థ్రూపుట్ స్క్రీనింగ్ లేదా "అందరికీ సరిపోయే" యూజర్-ఫ్రెండ్లీ ప్రయోగాత్మక వేదికను అందించే విషయంలో మా పద్ధతి సరిగ్గా నిర్వచించబడలేదు. ప్రస్తుత ప్రోటోకాల్‌కు ప్రతి మైక్రోడివైస్‌కు ఒక సిరంజి పంప్ అవసరం, ఇది CO2 ఇంక్యుబేటర్‌లో స్థలాన్ని ఆక్రమిస్తుంది మరియు పెద్ద ఎత్తున ప్రయోగాలను నిరోధిస్తుంది. వినూత్న కల్చర్ ఫార్మాట్‌ల (ఉదాహరణకు, బేసోలేటరల్ మీడియాను నిరంతరం భర్తీ చేయడానికి మరియు తొలగించడానికి అనుమతించే 24-వెల్, 96-వెల్, లేదా 384-వెల్ పోరస్ ఇన్సర్ట్‌లు) స్కేలబిలిటీ ద్వారా ఈ పరిమితిని గణనీయంగా మెరుగుపరచవచ్చు.
ఇన్ విట్రోలో మానవ ప్రేగు ఎపిథీలియం యొక్క 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి, మేము రెండు సమాంతర మైక్రోఛానెల్‌లను మరియు వాటి మధ్య ల్యూమెన్-కేశనాళిక ఇంటర్‌ఫేస్‌ను సృష్టించడానికి ఒక సాగే రంధ్రాల పొరను కలిగి ఉన్న మైక్రోఫ్లూయిడిక్ చిప్ ప్రేగు పరికరాన్ని ఉపయోగించాము. ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై పెరిగిన ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ పొరల కింద నిరంతర బేసోలేటరల్ ప్రవాహాన్ని అందించే సింగిల్-ఛానెల్ మైక్రోఫ్లూయిడిక్ పరికరం (ఒక హైబ్రిడ్ చిప్) వాడకాన్ని కూడా మేము ప్రదర్శిస్తాము. ఈ రెండు ప్లాట్‌ఫారమ్‌లలో, బేసోలేటరల్ కంపార్ట్‌మెంట్ నుండి మార్ఫోజెన్ వ్యతిరేక కారకాలను తొలగించడానికి ప్రవాహం యొక్క దిశాత్మక మార్పును వర్తింపజేయడం ద్వారా వివిధ మానవ ప్రేగు ఎపిథీలియల్ కణాల మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రదర్శించవచ్చు. మొత్తం ప్రయోగాత్మక విధానం (మూర్తి 1) ఐదు భాగాలను కలిగి ఉంటుంది: (i) గట్ చిప్ లేదా ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్టబుల్ హైబ్రిడ్ చిప్ యొక్క మైక్రోఫ్యాబ్రికేషన్ (దశలు 1-5; బాక్స్ 1), (ii) ప్రేగు ఎపిథీలియల్ కణాలు (Caco-2 కణాలు) లేదా మానవ ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్‌ల తయారీ; (బాక్సులు 2-5), (iii) పేగు చిప్స్ లేదా హైబ్రిడ్ చిప్స్‌పై పేగు ఎపిథీలియల్ కణాల కల్చర్ (దశలు 6-9), (iv) ఇన్ విట్రోలో 3D మార్ఫోజెనిసిస్ ప్రేరణ (దశ 10) మరియు (v) 3D ఎపిథీలియల్ మైక్రోస్ట్రక్చర్‌ను వర్గీకరించడానికి (దశలు 11-24). చివరగా, ఎపిథీలియల్ మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రాదేశిక, తాత్కాలిక, షరతులతో కూడిన లేదా విధానపరమైన నియంత్రణలతో పోల్చడం ద్వారా ఇన్ విట్రో మార్ఫోజెనిసిస్ యొక్క ప్రభావాన్ని ధృవీకరించడానికి ఒక తగిన నియంత్రణ సమూహం (క్రింద మరింత చర్చించబడింది) రూపొందించబడింది.
మేము రెండు విభిన్న కల్చర్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లను ఉపయోగించాము: సరళమైన ఛానెల్‌లు లేదా నాన్‌లీనియర్ కన్వల్యూటెడ్ ఛానెల్‌లతో కూడిన గట్-ఆన్-ఎ-చిప్, లేదా మైక్రోఫ్లూయిడిక్ పరికరంలో ట్రాన్స్‌వెల్ (TW) ఇన్సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న హైబ్రిడ్ చిప్‌లు, ఇవి బాక్స్ 1 మరియు స్టెప్ 1-5లో వివరించిన విధంగా తయారు చేయబడ్డాయి. "పరికర తయారీ" అనేది ఒకే చిప్ లేదా హైబ్రిడ్ చిప్‌ను తయారు చేయడంలో ప్రధాన దశలను చూపుతుంది. "మానవ ప్రేగు ఎపిథీలియల్ కణాల కల్చర్" అనేది ఈ ప్రోటోకాల్‌లో ఉపయోగించిన కణ మూలం (Caco-2 లేదా మానవ ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్లు) మరియు కల్చర్ విధానాన్ని వివరిస్తుంది. "ఇన్ విట్రో మార్ఫోజెనిసిస్" అనేది Caco-2 లేదా ఆర్గానాయిడ్-ఉత్పన్న ఎపిథీలియల్ కణాలను ఒక ప్రేగు చిప్‌పై లేదా హైబ్రిడ్ చిప్ యొక్క ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై కల్చర్ చేసే మొత్తం దశలను చూపుతుంది, దీని తరువాత 3D మార్ఫోజెనిసిస్ ప్రేరణ మరియు ఒక నిర్దిష్ట ఎపిథీలియల్ నిర్మాణం ఏర్పడుతుంది. ప్రతి బాణం క్రింద ప్రోగ్రామ్ స్టెప్ నంబర్ లేదా బాక్స్ నంబర్ ప్రదర్శించబడుతుంది. ఈ అప్లికేషన్, స్థాపించబడిన ప్రేగు ఎపిథీలియల్ పొరలను ఎలా ఉపయోగించవచ్చో ఉదాహరణలతో అందిస్తుంది, ఉదాహరణకు, కణ భేదం యొక్క లక్షణీకరణ, గట్ ఫిజియాలజీ అధ్యయనాలు, హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ పర్యావరణ వ్యవస్థల స్థాపన మరియు వ్యాధి మోడలింగ్‌లో. ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలు గట్ చిప్‌పై సృష్టించబడిన 3D కాకో-2 ఎపిథీలియల్ పొరలో వ్యక్తమయ్యే కేంద్రకాలు, F-యాక్టిన్ మరియు MUC2లను "కణ భేదీకరణ" చూపిస్తుంది. MUC2 సిగ్నలింగ్ గోబ్లెట్ కణాలలో మరియు శ్లేష్మ ఉపరితలాల నుండి స్రవించే శ్లేష్మంలో ఉంటుంది. గట్ ఫిజియాలజీలోని ఫ్లోరోసెంట్ చిత్రాలు, ఫ్లోరోసెంట్ వీట్ జెర్మ్ అగ్లూటినిన్‌ను ఉపయోగించి సియాలిక్ యాసిడ్ మరియు N-ఎసిటైల్‌గ్లూకోసమైన్ అవశేషాల కోసం స్టెయినింగ్ చేయడం ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన శ్లేష్మాన్ని చూపుతాయి. "హోస్ట్-మైక్రోబ్ కో-కల్చర్స్"లోని రెండు అతివ్యాప్త చిత్రాలు, ఒక చిప్‌పై గట్‌లో ప్రాతినిధ్య హోస్ట్-మైక్రోబయోమ్ కో-కల్చర్‌లను చూపుతాయి. ఎడమ ప్యానెల్, మైక్రోఇంజనీర్డ్ 3D కాకో-2 ఎపిథీలియల్ కణాలతో గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP)ను వ్యక్తపరిచే E. coli యొక్క కో-కల్చర్‌ను చూపుతుంది. కుడి ప్యానెల్, 3D కాకో-2 ఎపిథీలియల్ కణాలతో కో-కల్చర్ చేయబడిన GFP E. coli యొక్క స్థానికీకరణను, ఆ తర్వాత F-యాక్టిన్ (ఎరుపు) మరియు కేంద్రకాలతో (నీలం) ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ స్టెయినింగ్‌ను చూపుతుంది. వ్యాధి నమూనా, బాక్టీరియల్ యాంటిజెన్‌లతో శారీరక సవాలు కింద గట్ ఇన్ఫ్లమేషన్ చిప్‌లలో ఆరోగ్యకరమైన మరియు లీకీ గట్‌లను వివరిస్తుంది. (ఉదా, లిపోపాలిసాకరైడ్, LPS) మరియు రోగనిరోధక కణాలు (ఉదా, PBMC; ఆకుపచ్చ). 3D ఎపిథీలియల్ పొరను ఏర్పాటు చేయడానికి కాకో-2 కణాలను కల్చర్ చేశారు. స్కేల్ బార్, 50 µm. కింది వరుసలోని చిత్రాలు: “కణాల భేదీకరణ” రిఫరెన్స్.2. ఆక్స్‌ఫర్డ్ యూనివర్సిటీ ప్రెస్ నుండి అనుమతితో స్వీకరించబడింది; రిఫరెన్స్.5. NAS నుండి అనుమతితో పునరుత్పత్తి చేయబడింది; “హోస్ట్-మైక్రోబ్ కో-కల్చర్” రిఫరెన్స్.3. NAS నుండి అనుమతితో స్వీకరించబడింది; “వ్యాధి మోడలింగ్” రిఫరెన్స్.5. NAS నుండి అనుమతితో స్వీకరించబడింది.
సాఫ్ట్ లిథోగ్రఫీ1,44 ద్వారా సిలికాన్ అచ్చుల నుండి వేరు చేయబడిన మరియు SU-8 తో నమూనా చేయబడిన PDMS ప్రతిరూపాలను ఉపయోగించి గట్-ఆన్-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్ చిప్‌లు రెండూ తయారు చేయబడ్డాయి. ప్రతి చిప్‌లోని మైక్రోఛానెల్‌ల రూపకల్పన షియర్ స్ట్రెస్ మరియు హైడ్రోడైనమిక్ ప్రెజర్1,4,12 వంటి హైడ్రోడైనమిక్స్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకుని నిర్ణయించబడుతుంది. రెండు ప్రక్కప్రక్కన ఉన్న సమాంతర సరళ మైక్రోఛానెల్‌లను కలిగి ఉన్న అసలైన గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ డిజైన్ (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 1a), కల్చర్డ్ కణాలలో ద్రవ నివాస సమయాన్ని పెంచడానికి, నాన్-లీనియర్ ప్రవాహ నమూనాలు మరియు బహుళ-అక్షీయ వైకల్యాన్ని ప్రేరేపించడానికి ఒక జత వక్ర మైక్రోఛానెల్‌లను కలిగి ఉన్న సంక్లిష్ట గట్-ఆన్-ఎ-చిప్‌గా (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 1b) అభివృద్ధి చెందింది (చిత్రం 2a–f) 12. మరింత సంక్లిష్టమైన గట్ బయోమెకానిక్స్‌ను పునఃసృష్టించాల్సిన అవసరం వచ్చినప్పుడు, సంక్లిష్ట గట్-ఆన్-ఎ-చిప్‌లను ఎంచుకోవచ్చు. మేము ప్రదర్శించిన దాని ప్రకారం, కన్వల్యూటెడ్ గట్-చిప్ కూడా, దానితో పోలిస్తే, అదే సమయంలో అదే స్థాయి ఎపిథీలియల్ పెరుగుదలతో 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను బలంగా ప్రేరేపిస్తుంది. కల్చర్ చేయబడిన కణ రకంతో సంబంధం లేకుండా, అసలైన గట్-చిప్. అందువల్ల, 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి, లీనియర్ మరియు కాంప్లెక్స్ ఆన్-చిప్ గట్ డిజైన్‌లు పరస్పరం మార్చుకోదగినవి. SU-8 నమూనాలతో సిలికాన్ అచ్చులపై క్యూర్ చేయబడిన PDMS రెప్లికాలు డీమోల్డింగ్ తర్వాత నెగటివ్ ఫీచర్లను అందించాయి (Fig. 2a). చిప్‌పై గట్‌ను ఫ్యాబ్రికేట్ చేయడానికి, సిద్ధం చేసిన పై PDMS పొరను వరుసగా పోరస్ PDMS ఫిల్మ్‌కు బంధించి, ఆపై కరోనా ట్రీటర్‌ను ఉపయోగించి ఇర్రివర్సిబుల్ బాండింగ్ ద్వారా కింది PDMS పొరతో సమలేఖనం చేయబడింది (Fig. 2b–f). హైబ్రిడ్ చిప్‌లను ఫ్యాబ్రికేట్ చేయడానికి, క్యూర్ చేయబడిన PDMS రెప్లికాలను గ్లాస్ స్లైడ్‌లకు బంధించి, ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లకు అనువుగా ఉండే సింగిల్-ఛానల్ మైక్రోఫ్లూయిడిక్ పరికరాలను సృష్టించారు (Fig. 2h మరియు ఎక్స్‌టెండెడ్ డేటా Fig. 2). PDMS రెప్లికా మరియు గ్లాస్ ఉపరితలాలను ఆక్సిజన్ ప్లాస్మా లేదా కరోనా ట్రీట్‌మెంట్‌తో ట్రీట్ చేయడం ద్వారా బాండింగ్ ప్రక్రియ నిర్వహించబడుతుంది. సిలికాన్ ట్యూబ్‌కు జోడించబడిన మైక్రోఫ్యాబ్రికేటెడ్ పరికరాన్ని స్టెరిలైజ్ చేసిన తర్వాత, ప్రేగు ఎపిథీలియం యొక్క 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను నిర్వహించడానికి పరికర సెటప్ సిద్ధంగా ఉంది. (పటం 2జి).
a, SU-8 నమూనా సిలికాన్ అచ్చుల నుండి PDMS భాగాల తయారీ యొక్క రేఖాచిత్ర వివరణ. గట్టిపడని PDMS ద్రావణాన్ని ఒక సిలికాన్ అచ్చుపై పోశారు (ఎడమ), 60 °C వద్ద గట్టిపడేలా చేశారు (మధ్య) మరియు అచ్చు నుండి తీశారు (కుడి). అచ్చు నుండి తీసిన PDMSను ముక్కలుగా కత్తిరించి, తదుపరి ఉపయోగం కోసం శుభ్రం చేశారు. b, PDMS పై పొరను తయారు చేయడానికి ఉపయోగించిన సిలికాన్ అచ్చు యొక్క ఛాయాచిత్రం. c, PDMS సచ్ఛిద్ర పొరను తయారు చేయడానికి ఉపయోగించిన సిలికాన్ అచ్చు యొక్క ఛాయాచిత్రం. d, పై మరియు కింది PDMS భాగాలు మరియు అమర్చబడిన ఆన్-చిప్ ప్రేగు పరికరం యొక్క ఛాయాచిత్రాల శ్రేణి. e, పై, పొర, మరియు కింది PDMS భాగాల అమరిక యొక్క రేఖాచిత్రం. ప్రతి పొర ప్లాస్మా లేదా కరోనా చికిత్స ద్వారా శాశ్వతంగా బంధించబడుతుంది. f, ఒకదానిపై ఒకటి అమర్చబడిన మెలికలు తిరిగిన మైక్రోఛానెల్‌లు మరియు వాక్యూమ్ ఛాంబర్‌లతో తయారు చేయబడిన గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ పరికరం యొక్క రేఖాచిత్రం. g, మైక్రోఫ్లూయిడిక్ కణ సంస్కృతి కోసం గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ యొక్క అమరిక. సిలికాన్ ట్యూబ్ మరియు సిరంజితో అమర్చబడిన, తయారు చేయబడిన గట్ ఆన్ ఎ చిప్‌ను ఉంచారు. ఒక కవర్‌స్లిప్. ప్రాసెసింగ్ కోసం చిప్ పరికరాన్ని 150 మిమీ పెట్రీ డిష్ మూతపై ఉంచారు. సిలికాన్ ట్యూబ్‌ను మూసివేయడానికి బైండర్‌ను ఉపయోగిస్తారు. h, హైబ్రిడ్ చిప్ ఫ్యాబ్రికేషన్ మరియు హైబ్రిడ్ చిప్‌లను ఉపయోగించి 3D మార్ఫోజెనిసిస్ యొక్క దృశ్య స్నాప్‌షాట్‌లు. ప్రేగు ఎపిథీలియల్ కణాల 2D మోనోలేయర్‌లను కల్చర్ చేయడానికి స్వతంత్రంగా తయారు చేసిన ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లను, ప్రేగు 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి హైబ్రిడ్ చిప్‌లోకి చొప్పించారు. ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌పై ఏర్పడిన కణ పొర కింద ఉన్న మైక్రోఛానెల్‌ల ద్వారా మీడియంను ప్రవహింపజేస్తారు. స్కేల్ బార్, 1 సెం.మీ. h రిఫరెన్స్ 4 నుండి అనుమతితో పునర్ముద్రించబడింది. ఎల్సెవియర్.
ఈ ప్రోటోకాల్‌లో, ఎపిథీలియల్ మూలాలుగా కాకో-2 కణ శ్రేణి మరియు ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్‌లను ఉపయోగించారు (పటం 3ఎ). రెండు రకాల కణాలను విడివిడిగా కల్చర్ చేసి (బాక్స్ 2 మరియు బాక్స్ 5), ఆన్-చిప్ గట్ లేదా ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌ల యొక్క ECM-పూత పూసిన మైక్రోఛానెల్‌లలో విత్తడానికి ఉపయోగించారు. కణాలు కాన్ఫ్లూయెంట్ అయినప్పుడు (ఫ్లాస్క్‌లలో >95% కవరేజ్), T-ఫ్లాస్క్‌లలో సాధారణంగా కల్చర్ చేయబడిన కాకో-2 కణాలను (10 మరియు 50 పాసేజ్‌ల మధ్య) ట్రైప్సినైజేషన్ ద్రవం ద్వారా విడదీసిన కణ సస్పెన్షన్‌లను తయారు చేయడానికి హార్వెస్ట్ చేస్తారు (బాక్స్ 2). ప్రేగు బయాప్సీలు లేదా శస్త్రచికిత్సల నుండి తీసిన మానవ ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్‌లను, నిర్మాణాత్మక సూక్ష్మ వాతావరణానికి మద్దతు ఇవ్వడానికి 24-వెల్ ప్లేట్లలోని మాట్రిజెల్ స్కాఫోల్డ్ డోమ్‌లలో కల్చర్ చేశారు. బాక్స్ 3లో వివరించిన విధంగా తయారు చేసిన, అవసరమైన మార్ఫోజెన్‌లు (Wnt, R-స్పాండిన్ మరియు నాగిన్ వంటివి) మరియు గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్లు కలిగిన మీడియంను, ఆర్గానాయిడ్‌లు ~500 µm వ్యాసానికి పెరిగే వరకు ప్రతి రెండు రోజులకొకసారి అనుబంధంగా అందించారు. పూర్తిగా పెరిగిన ఆర్గానాయిడ్‌లను హార్వెస్ట్ చేస్తారు. మరియు ఒక చిప్‌పై గట్ లేదా ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై సీడింగ్ చేయడానికి సింగిల్ కణాలుగా విడగొట్టబడతాయి (బాక్స్ 5). మేము ఇంతకు ముందు నివేదించినట్లుగా, దీనిని వ్యాధి రకం12,13 (ఉదా. అల్సరేటివ్ కొలైటిస్, క్రోన్స్ వ్యాధి, కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్, లేదా సాధారణ దాత), గాయం ఉన్న ప్రదేశం (ఉదా., గాయం ఉన్న ప్రాంతం వర్సెస్ గాయం లేని ప్రాంతం) మరియు జీర్ణవ్యవస్థలోని ప్రదేశం (ఉదా., డుయోడెనమ్, జెజునమ్, ఇలియమ్, సీకమ్, కోలన్, లేదా రెక్టమ్) ప్రకారం వేరు చేయవచ్చు. చిన్న ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్‌ల కంటే సాధారణంగా అధిక సాంద్రతలో మార్ఫోజెన్‌లు అవసరమయ్యే పెద్ద ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్‌లను (కొలాయిడ్‌లను) కల్చర్ చేయడానికి మేము బాక్స్ 5లో ఒక ఆప్టిమైజ్డ్ ప్రోటోకాల్‌ను అందిస్తున్నాము.
ఎ, గట్ చిప్‌లో గట్ మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి వర్క్‌ఫ్లో. 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రదర్శించడానికి ఈ ప్రోటోకాల్‌లో కాకో-2 మానవ ప్రేగు ఎపిథీలియం మరియు ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్‌లను ఉపయోగిస్తారు. వేరుచేసిన ఎపిథీలియల్ కణాలను తయారుచేసిన గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ పరికరంలో (చిప్ ప్రిపరేషన్) విత్తారు. 0వ రోజు (D0) నాడు కణాలను విత్తిన (సీడెడ్) మరియు PDMS పోరస్ పొరకు అటాచ్ చేసిన (అటాచ్డ్) తర్వాత, అపికల్ (AP) ప్రవాహాన్ని ప్రారంభించి, మొదటి 2 రోజులు కొనసాగిస్తారు (ఫ్లో, AP, D0-D2). పూర్తి 2D మోనోలేయర్ ఏర్పడినప్పుడు, సైక్లిక్ స్ట్రెచింగ్ కదలికలతో (స్ట్రెచ్, ఫ్లో, AP మరియు BL) పాటు బేసోలేటరల్ (BL) ప్రవాహాన్ని కూడా ప్రారంభిస్తారు. మైక్రోఫ్లూయిడిక్ కల్చర్ యొక్క 5 రోజుల తర్వాత ప్రేగు 3D మార్ఫోజెనిసిస్ దానంతట అదే జరిగింది (మార్ఫోజెనిసిస్, D5). ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ చిత్రాలు ప్రతి ప్రయోగాత్మక దశ లేదా సమయ బిందువు వద్ద కాకో-2 కణాల ప్రతినిధి స్వరూపాన్ని చూపుతాయి (బార్ గ్రాఫ్, 100 µm). సంబంధిత ప్రక్రియలను వివరించే నాలుగు స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రాలు. పేగు ఆకృతి యొక్క కాస్కేడ్‌లు (కుడివైపు పైభాగం). స్కీమాటిక్‌లోని చుక్కల బాణాలు ద్రవ ప్రవాహ దిశను సూచిస్తాయి. బి, స్థాపించబడిన 3D కాకో-2 ఎపిథీలియం యొక్క ఉపరితల టోపాలజీని చూపిస్తున్న SEM చిత్రం (ఎడమవైపు). విస్తరించిన ప్రాంతాన్ని (తెల్లటి చుక్కల పెట్టె) హైలైట్ చేసే ఇన్సెట్, 3D కాకో-2 పొరపై పునరుత్పత్తి చెందిన మైక్రోవిల్లీని చూపిస్తుంది (కుడివైపు). సి, స్థాపించబడిన కాకో-2 3D యొక్క క్షితిజ సమాంతర ఫ్రంటల్ వీక్షణ, క్లాడిన్ (ZO-1, ఎరుపు) మరియు F-యాక్టిన్ (ఆకుపచ్చ) మరియు కేంద్రకాలు (నీలం) అని లేబుల్ చేయబడిన నిరంతర బ్రష్ బోర్డర్ పొరలు. పేగు చిప్‌లపై ఎపిథీలియల్ కణాల ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ కాన్ఫోకల్ విజువలైజేషన్. మధ్య స్కీమాటిక్‌ను సూచించే బాణాలు ప్రతి కాన్ఫోకల్ వీక్షణకు ఫోకల్ ప్లేన్ యొక్క స్థానాన్ని సూచిస్తాయి. డి, 3, 7, 9, 11, మరియు 13వ రోజులలో ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పొందిన చిప్‌పై కల్చర్ చేయబడిన ఆర్గానాయిడ్స్‌లోని మార్ఫలాజికల్ మార్పుల కాలక్రమం. ఇన్సెట్ (కుడివైపు పైభాగం) అందించిన చిత్రం యొక్క అధిక మాగ్నిఫికేషన్‌ను చూపిస్తుంది. ఇ, DIC 7వ రోజున తీసిన స్లైస్‌పై ప్రేగులో స్థాపించబడిన ఆర్గానాయిడ్ 3D ఎపిథీలియం యొక్క ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్.f, వరుసగా 3 రోజులు (ఎడమ) మరియు 13-రోజుల (మధ్య) ఆర్గానాయిడ్‌లను గట్ చిప్‌లపై పెంచినప్పుడు ఎపిథీలియల్ పొరపై మూల కణాలు (LGR5; మెజెంటా), గోబ్లెట్ కణాలు (MUC2; ఆకుపచ్చ), F-యాక్టిన్ (బూడిద రంగు) మరియు కేంద్రకాల (సియాన్) మార్కర్‌లను చూపిస్తున్న అతివ్యాప్త ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలు. MUC2 సిగ్నలింగ్ లేకుండా LGR5 సిగ్నలింగ్‌ను హైలైట్ చేసే విస్తరించిన డేటా ఫిగర్ 3ని కూడా చూడండి. కల్చర్ యొక్క 13వ రోజున సెల్‌మాస్క్ డైతో ప్లాస్మా పొరను స్టెయిన్ చేయడం ద్వారా చిప్‌పై ప్రేగులో స్థాపించబడిన 3D ఆర్గానాయిడ్ ఎపిథీలియం యొక్క ఎపిథీలియల్ మైక్రోస్ట్రక్చర్‌ను (కుడి) చూపిస్తున్న ఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలు. వేరే విధంగా పేర్కొనకపోతే స్కేల్ బార్ 50 μm.b రిఫరెన్స్.2. ఆక్స్‌ఫర్డ్ యూనివర్సిటీ ప్రెస్ నుండి అనుమతితో పునర్ముద్రించబడింది; c రిఫరెన్స్.2. ఆక్స్‌ఫర్డ్ యూనివర్సిటీ ప్రెస్ నుండి అనుమతితో స్వీకరించబడింది; e మరియు f లు సూచన ద్వారా అనుమతితో స్వీకరించబడ్డాయి.12 క్రియేటివ్ కామన్స్ లైసెన్స్ CC BY 4.0 క్రింద.
గట్ ఆన్ ఎ చిప్‌లో, ECM కోటింగ్ విజయవంతం కావడానికి PDMS పోరస్ మెంబ్రేన్ యొక్క హైడ్రోఫోబిక్ ఉపరితలాన్ని సవరించడం అవసరం. ఈ ప్రోటోకాల్‌లో, మేము PDMS మెంబ్రేన్‌ల హైడ్రోఫోబిసిటీని సవరించడానికి రెండు విభిన్న పద్ధతులను వర్తింపజేస్తాము. Caco-2 కణాలను కల్చర్ చేయడానికి, PDMS ఉపరితలం యొక్క హైడ్రోఫోబిసిటీని తగ్గించడానికి, ECMను కోట్ చేయడానికి మరియు Caco-2 కణాలను PDMS మెంబ్రేన్‌కు అటాచ్ చేయడానికి UV/ఓజోన్ ట్రీట్‌మెంట్ ద్వారా ఉపరితల యాక్టివేషన్ మాత్రమే సరిపోయింది. అయితే, ఆర్గానాయిడ్ ఎపిథీలియం యొక్క మైక్రోఫ్లూయిడిక్ కల్చర్‌కు, PDMS మైక్రోఛానెల్‌లకు వరుసగా పాలిథిలీన్‌మైన్ (PEI) మరియు గ్లూటరాల్డిహైడ్‌లను వర్తింపజేయడం ద్వారా ECM ప్రోటీన్‌ల సమర్థవంతమైన డిపాజిషన్‌ను సాధించడానికి రసాయన-ఆధారిత ఉపరితల ఫంక్షనలైజేషన్ అవసరం. ఉపరితల సవరణ తర్వాత, ఫంక్షనలైజ్ చేయబడిన PDMS ఉపరితలాన్ని కవర్ చేయడానికి ECM ప్రోటీన్‌లు డిపాజిట్ చేయబడ్డాయి మరియు తరువాత వేరుచేయబడిన ఆర్గానాయిడ్ ఎపిథీలియంలోకి ప్రవేశపెట్టబడ్డాయి. కణాలు అటాచ్ అయిన తర్వాత, కణాలు పూర్తి మోనోలేయర్‌ను ఏర్పరిచే వరకు పై మైక్రోఛానెల్‌లోకి కేవలం మీడియంను ప్రవహింపజేయడం ద్వారా మైక్రోఫ్లూయిడిక్ సెల్ కల్చర్ ప్రారంభమవుతుంది, అయితే దిగువ మైక్రోఛానెల్ స్థిరమైన పరిస్థితులను నిర్వహిస్తుంది. ఉపరితల యాక్టివేషన్ మరియు ECM కోటింగ్ కోసం ఈ ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన పద్ధతి ఆర్గానాయిడ్ అటాచ్‌మెంట్‌ను సాధ్యం చేస్తుంది. PDMS ఉపరితలంపై 3D రూపాంతరీకరణను ప్రేరేపించడానికి ఎపిథీలియం.
ట్రాన్స్‌వెల్ కల్చర్‌లకు కూడా కణాలను విత్తే ముందు ECM పూత అవసరం; అయితే, రంధ్రాలు గల ఇన్సర్ట్‌ల ఉపరితలాన్ని క్రియాశీలం చేయడానికి ట్రాన్స్‌వెల్ కల్చర్‌లకు సంక్లిష్టమైన ముందస్తు చికిత్సా దశలు అవసరం లేదు. ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై కాకో-2 కణాలను పెంచడానికి, రంధ్రాలు గల ఇన్సర్ట్‌లపై ECM పూత, విడదీయబడిన కాకో-2 కణాల అటాచ్‌మెంట్‌ను (<1 గంట) మరియు టైట్ జంక్షన్ బారియర్ ఏర్పడటాన్ని (<1-2 రోజులు) వేగవంతం చేస్తుంది. ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లపై ఆర్గానాయిడ్‌లను కల్చర్ చేయడానికి, వేరు చేయబడిన ఆర్గానాయిడ్‌లను ECM-పూత పూసిన ఇన్సర్ట్‌లపై విత్తారు, పొర ఉపరితలానికి అటాచ్ చేస్తారు (<3 గంటలు) మరియు ఆర్గానాయిడ్‌లు బారియర్ సమగ్రతతో పూర్తి మోనోలేయర్‌ను ఏర్పరిచే వరకు నిర్వహిస్తారు. ట్రాన్స్‌వెల్ కల్చర్‌లను హైబ్రిడ్ చిప్‌లను ఉపయోగించకుండా 24-వెల్ ప్లేట్లలో నిర్వహిస్తారు.
స్థాపించబడిన ఎపిథీలియల్ పొర యొక్క బేసోలేటరల్ భాగానికి ద్రవ ప్రవాహాన్ని వర్తింపజేయడం ద్వారా ఇన్ విట్రో 3D మార్ఫోజెనిసిస్‌ను ప్రారంభించవచ్చు. గట్ ఆన్ ఎ చిప్‌లో, పై మరియు దిగువ మైక్రోఛానెల్‌లలోకి మీడియంను ప్రవేశపెట్టినప్పుడు ఎపిథీలియల్ మార్ఫోజెనిసిస్ ప్రారంభమైంది (Fig. 3a). ఇంతకు ముందు వివరించినట్లుగా, దిశానిర్దేశితంగా స్రవించబడిన మార్ఫోజెన్ నిరోధకాలను నిరంతరం తొలగించడానికి దిగువ (బేసోలేటరల్) భాగంలో ద్రవ ప్రవాహాన్ని ప్రవేశపెట్టడం చాలా ముఖ్యం. పోరస్ పొరలపై బంధించబడిన కణాలకు తగినంత పోషకాలు మరియు సీరం అందించడానికి మరియు ల్యూమినల్ షియర్ స్ట్రెస్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, మేము సాధారణంగా గట్ ఆన్ ఎ చిప్‌లో ద్వంద్వ ప్రవాహాన్ని వర్తింపజేస్తాము. హైబ్రిడ్ చిప్‌లలో, ఎపిథీలియల్ మోనోలేయర్‌లను కలిగి ఉన్న ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లను హైబ్రిడ్ చిప్‌లలోకి చొప్పించారు. అప్పుడు, మైక్రోఛానెల్ ద్వారా పోరస్ ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్ యొక్క బేసోలేటరల్ వైపు కింద మీడియంను వర్తింపజేశారు. రెండు కల్చర్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లలో బేసోలేటరల్ ప్రవాహాన్ని ప్రారంభించిన 3-5 రోజుల తర్వాత ప్రేగు మార్ఫోజెనిసిస్ సంభవించింది.
మైక్రోఇంజనీరింగ్ చేయబడిన 3D ఎపిథీలియల్ పొరల యొక్క స్వరూప లక్షణాలను ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ, డిఫరెన్షియల్ ఇంటర్‌ఫెరెన్స్ కాంట్రాస్ట్ (DIC) మైక్రోస్కోపీ, SEM, లేదా ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ (పటాలు 3 మరియు 4) వంటి వివిధ ఇమేజింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి విశ్లేషించవచ్చు. 3D ఎపిథీలియల్ పొరల ఆకారాన్ని మరియు ఉబ్బెత్తును పర్యవేక్షించడానికి, కల్చర్ సమయంలో ఎప్పుడైనా ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ లేదా DIC ఇమేజింగ్‌ను సులభంగా చేయవచ్చు. PDMS మరియు పాలిస్టర్ ఫిల్మ్‌ల యొక్క ఆప్టికల్ పారదర్శకత కారణంగా, గట్-ఆన్-ఎ-చిప్ మరియు హైబ్రిడ్ చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లు రెండూ పరికరాన్ని విభజించడం లేదా విడదీయడం అవసరం లేకుండా రియల్-టైమ్ ఇన్ సిటు ఇమేజింగ్‌ను అందించగలవు. ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ ఇమేజింగ్ (పటాలు 1, 3c, f మరియు 4b, c) చేస్తున్నప్పుడు, కణాలను సాధారణంగా 4% (wt/vol) పారాఫార్మాల్డిహైడ్ (PFA)తో, ఆ తర్వాత వరుసగా ట్రైటాన్ X-100 మరియు 2% (wt/vol) బోవిన్ సీరం ఆల్బుమిన్ (BSA)తో ఫిక్స్ చేస్తారు. కణ రకాన్ని బట్టి, వివిధ ఫిక్సేటివ్‌లు, పర్మియబిలైజర్‌లు మరియు బ్లాకింగ్ ఏజెంట్‌లను ఉపయోగించవచ్చు. చిప్‌పై యథాస్థానంలో స్థిరీకరించబడిన కణాలను హైలైట్ చేయడానికి, వంశక్రమ-ఆధారిత కణ లేదా ప్రాంత మార్కర్‌లను లక్ష్యంగా చేసుకున్న ప్రాథమిక యాంటీబాడీలను ఉపయోగిస్తారు. ఆ తర్వాత, కేంద్రకాన్ని (ఉదాహరణకు, 4′,6-డయామిడినో-2-ఫినైలీన్ ఇండోల్, DAPI) లేదా F-యాక్టిన్‌ను (ఉదాహరణకు, ఫ్లోరోసెంట్ లేబుల్డ్ ఫాలోయిడిన్) లక్ష్యంగా చేసుకున్న కౌంటర్‌స్టెయిన్ డైతో పాటు ద్వితీయ యాంటీబాడీలను ఉపయోగిస్తారు. శ్లేష్మ ఉత్పత్తిని (పటం 1, “కణ భేదం” మరియు “పేగు శరీరధర్మశాస్త్రం”), సూక్ష్మజీవుల కణాల యాదృచ్ఛిక వలసను (పటం 1, “ఆతిథేయి-సూక్ష్మజీవి సహ-సాగు”), రోగనిరోధక కణాల సమీకరణను (పటం 1, 'వ్యాధి నమూనా') లేదా 3D ఎపిథీలియల్ స్వరూపం యొక్క ఆకృతులను (పటం 3c,f మరియు 4b,c) గుర్తించడానికి ఫ్లోరోసెన్స్-ఆధారిత లైవ్ ఇమేజింగ్‌ను కూడా యథాస్థానంలో నిర్వహించవచ్చు. రిఫరెన్స్‌లో వివరించినట్లుగా, పై పొరను కింది మైక్రోఛానల్ పొర నుండి వేరు చేయడానికి చిప్‌పై పేగును సవరించినప్పుడు, పటం 2లో చూపిన విధంగా, 3D ఎపిథీలియల్ స్వరూపం అలాగే మైక్రోవిల్లీ అపికల్ బ్రష్ బోర్డర్‌ను SEM ద్వారా చూడవచ్చు (Fig. 3b). క్వాంటిటేటివ్ PCR5 లేదా సింగిల్-సెల్ RNA సీక్వెన్సింగ్ చేయడం ద్వారా డిఫరెన్సియేషన్ మార్కర్ల వ్యక్తీకరణను అంచనా వేయవచ్చు. ఈ సందర్భంలో, గట్ చిప్స్ లేదా హైబ్రిడ్ చిప్స్‌లో పెరిగిన ఎపిథీలియల్ కణాల 3D పొరలను ట్రిప్సినైజేషన్ ద్వారా సేకరించి, ఆపై మాలిక్యులర్ లేదా జెనెటిక్ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగిస్తారు.
a, హైబ్రిడ్ చిప్‌లో ప్రేగుల రూపాంతరీకరణను ప్రేరేపించడానికి కార్యప్రవాహం. హైబ్రిడ్ చిప్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌లో 3D రూపాంతరీకరణను ప్రదర్శించడానికి ఈ ప్రోటోకాల్‌లో కాకో-2 మరియు ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్‌లను ఉపయోగిస్తారు. విడదీసిన ఎపిథీలియల్ కణాలను సిద్ధం చేసిన ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లలో (TW prep; క్రింది చిత్రాన్ని చూడండి) విత్తారు. కణాలను విత్తిన (సీడెడ్) తర్వాత మరియు ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌లలోని పాలిస్టర్ పొరలకు అటాచ్ చేసిన తర్వాత, అన్ని కణాలను స్థిర పరిస్థితులలో (TW కల్చర్) కల్చర్ చేశారు. 7 రోజుల తర్వాత, ఎపిథీలియల్ కణాల 2D ఏకపొరను కలిగి ఉన్న ఒకే ట్రాన్స్‌వెల్ ఇన్సర్ట్‌ను బేసోలేటరల్ ప్రవాహాన్ని (ఫ్లో, BL) ప్రవేశపెట్టడానికి హైబ్రిడ్ చిప్‌లో ఏకీకృతం చేశారు, ఇది చివరికి 3D ఎపిథీలియల్ పొర (రూపాంతరీకరణ) ఉత్పత్తికి దారితీసింది. ప్రతి ప్రయోగాత్మక దశ లేదా సమయ బిందువు వద్ద సాధారణ దాత (C103 లైన్) ఆరోహణ పెద్దప్రేగు నుండి పొందిన మానవ అవయవ ఎపిథీలియల్ కణాల స్వరూప లక్షణాలను చూపే ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు. పై పొరలలోని స్కీమాటిక్స్ ప్రతి దశకు ప్రయోగాత్మక ఆకృతీకరణను వివరిస్తాయి. b, హైబ్రిడ్ చిప్‌లు (ఎడమ స్కీమాటిక్) టాప్-డౌన్ కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ వీక్షణలతో ఆర్గానాయిడ్ ఎపిథీలియల్ కణాల 3D రూపాంతరీకరణకు దారితీయగలవు. వివిధ Z స్థానాలలో (ఎగువ, మధ్య మరియు దిగువ; కుడి వైపున ఉన్న స్కీమాటిక్ మరియు దానికి సంబంధించిన చుక్కల గీతలను చూడండి) తీసినవి స్పష్టమైన రూపాత్మక లక్షణాలను చూపించాయి. F-యాక్టిన్ (సియాన్), కేంద్రకం (బూడిద రంగు). c, స్టాటిక్ ట్రాన్స్‌వెల్ (TW; తెలుపు డాష్డ్ బాక్స్‌లోని ఇన్సెట్) మరియు హైబ్రిడ్ చిప్ (అతిపెద్ద పూర్తి షాట్) లలో కల్చర్ చేయబడిన ఆర్గానాయిడ్-ఉత్పన్న ఎపిథీలియల్ కణాల ఫ్లోరోసెన్స్ కాన్ఫోకల్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు (3D కోణీయ వీక్షణ), వరుసగా 2D మరియు 3D రూపాత్మకతను పోలుస్తున్నాయి. ఒక జత 2D నిలువు క్రాస్-కట్ వీక్షణలు (ఎగువ కుడి మూలలో ఇన్సెట్; “XZ”) కూడా 2D మరియు 3D లక్షణాలను చూపుతాయి. స్కేల్ బార్, 100 µm. c రిఫరెన్స్ 4 నుండి అనుమతితో పునర్ముద్రించబడింది. ఎల్సెవియర్.
సాంప్రదాయ స్థిర సాగు పరిస్థితులలో అవే కణాలను (Caco-2 లేదా ప్రేగు ఆర్గానాయిడ్ ఎపిథీలియల్ కణాలు) రెండు-డైమెన్షనల్ మోనోలేయర్‌లుగా పెంచడం ద్వారా నియంత్రణలను సిద్ధం చేయవచ్చు. ముఖ్యంగా, మైక్రోఛానెల్‌ల పరిమిత పరిమాణ సామర్థ్యం (అంటే అసలు గట్-చిప్ డిజైన్‌లోని పై ఛానెల్‌లో ~4 µL) కారణంగా పోషకాల క్షీణత సంభవించవచ్చు. అందువల్ల, బేసోలేటరల్ ప్రవాహాన్ని వర్తింపజేయడానికి ముందు మరియు తర్వాత ఎపిథీలియల్ స్వరూపాన్ని కూడా పోల్చవచ్చు.
సాఫ్ట్ లిథోగ్రఫీ ప్రక్రియను క్లీన్ రూమ్‌లో నిర్వహించాలి. చిప్‌లోని ప్రతి పొర (పై మరియు కింది పొరలు మరియు మెంబ్రేన్‌లు) మరియు హైబ్రిడ్ చిప్‌ల కోసం, మైక్రోఛానెల్‌ల ఎత్తులు భిన్నంగా ఉన్నందున, వేర్వేరు ఫోటోమాస్క్‌లను ఉపయోగించి వాటిని వేర్వేరు సిలికాన్ వేఫర్‌లపై తయారుచేశారు. చిప్‌లోని గట్ యొక్క పై మరియు కింది మైక్రోఛానెల్‌ల లక్ష్య ఎత్తులు వరుసగా 500 µm మరియు 200 µm. హైబ్రిడ్ చిప్ యొక్క ఛానెల్ లక్ష్య ఎత్తు 200 µm.
ఒక గిన్నెలో ఎసిటోన్ ఉంచి, అందులో 3-అంగుళాల సిలికాన్ వేఫర్‌ను పెట్టండి. ప్లేట్‌ను 30 సెకన్ల పాటు మెల్లగా తిప్పండి, ఆ తర్వాత వేఫర్‌ను గాలికి ఆరనివ్వండి. వేఫర్‌ను IPA ఉన్న ప్లేట్‌పైకి మార్చి, శుభ్రపరచడానికి ప్లేట్‌ను 30 సెకన్ల పాటు స్పిన్ చేయండి.
సిలికాన్ వేఫర్ ఉపరితలం నుండి సేంద్రీయ అవశేషాలను గరిష్టంగా తొలగించడానికి, ఐచ్ఛికంగా పిరాన్హా ద్రావణాన్ని (హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ మరియు గాఢ సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లం, 1:3 (ఘనపరిమాణం/ఘనపరిమాణం) నిష్పత్తిలో కలిపిన మిశ్రమం) ఉపయోగించవచ్చు.
పిరాన్హా ద్రావణం అత్యంత తినివేసే స్వభావం కలది మరియు వేడిని ఉత్పత్తి చేస్తుంది. అదనపు భద్రతా జాగ్రత్తలు అవసరం. వ్యర్థాలను పారవేయడానికి, ద్రావణాన్ని చల్లారనిచ్చి, శుభ్రమైన, పొడి వ్యర్థాల కంటైనర్‌లోకి మార్చండి. ద్వితీయ కంటైనర్‌లను ఉపయోగించండి మరియు వ్యర్థాల కంటైనర్‌లపై సరిగ్గా లేబుల్ చేయండి. మరింత వివరణాత్మక విధానాల కోసం దయచేసి సంస్థ యొక్క భద్రతా మార్గదర్శకాలను అనుసరించండి.
వేఫర్‌లను 10 నిమిషాల పాటు 200 °C హాట్ ప్లేట్‌పై ఉంచి నిర్జలీకరణం చేయండి. నిర్జలీకరణం తర్వాత, వేఫర్‌ను చల్లబరచడానికి గాలిలో ఐదుసార్లు ఊపారు.
శుభ్రం చేసిన సిలికాన్ వేఫర్ మధ్యలో సుమారు 10 గ్రాముల ఫోటోరెసిస్ట్ SU-8 2100 పోయండి. ఫోటోరెసిస్ట్‌ను వేఫర్‌పై సమానంగా పరచడానికి ట్వీజర్లను ఉపయోగించండి. ఫోటోరెసిస్ట్ జిగురును తగ్గించి, పరచడానికి సులభతరం చేయడానికి, అప్పుడప్పుడు వేఫర్‌ను 65°C హాట్ ప్లేట్‌పై ఉంచండి. వేఫర్‌ను నేరుగా హాట్ ప్లేట్‌పై ఉంచవద్దు.
స్పిన్ కోటింగ్ చేయడం ద్వారా SU-8 ను వేఫర్‌పై సమానంగా విస్తరించారు. 100 rpm/s త్వరణంతో 500 rpm వద్ద వ్యాపించడానికి, SU-8 యొక్క ఇన్‌కమింగ్ రొటేషన్‌ను 5–10 సెకన్ల పాటు ప్రోగ్రామ్ చేయండి. 200 µm మందం ప్యాటర్నింగ్ కోసం మెయిన్ స్పిన్‌ను 1,500 rpm వద్ద సెట్ చేయండి, లేదా 250 µm మందాన్ని సాధించడానికి (చిప్‌పై గట్ యొక్క పై పొర కోసం 500 µm ఎత్తును తయారు చేస్తూ; క్రింద ఉన్న "క్లిష్టమైన దశలు" చూడండి) 300 rpm/s త్వరణంతో 30 సెకన్ల పాటు 1,200 rpm వద్ద సెట్ చేయండి.
సిలికాన్ వేఫర్‌పై ఉన్న SU-8 ప్యాటర్న్ యొక్క లక్షిత మందానికి అనుగుణంగా ప్రధాన స్పిన్ వేగాన్ని సర్దుబాటు చేయవచ్చు.
చిప్‌పై గట్ యొక్క పై పొర కోసం 500 µm ఎత్తు గల SU-8 నమూనాలను తయారు చేయడానికి, ఈ బాక్స్ యొక్క స్పిన్ కోటింగ్ మరియు సాఫ్ట్ బేక్ దశలను (దశలు 7 మరియు 8) వరుసగా పునరావృతం చేయడం జరిగింది (దశ 9 చూడండి). దీనివల్ల 250 µm మందం గల రెండు SU-8 పొరలు ఉత్పత్తి అయ్యాయి, వీటిని ఈ బాక్స్ యొక్క 12వ దశలో UV ఎక్స్‌పోజర్ ద్వారా పొరలుగా అమర్చి, కలపడం ద్వారా 500 µm ఎత్తు గల పొరను తయారు చేయవచ్చు.
SU-8 పూత పూసిన వేఫర్‌లను జాగ్రత్తగా హాట్ ప్లేట్‌పై 65 °C వద్ద 5 నిమిషాల పాటు ఉంచి, ఆపై సెట్టింగ్‌ను 95 °C కి మార్చి, అదనంగా 40 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా సాఫ్ట్ బేక్ చేయండి.
ఎగువ మైక్రోఛానల్‌లో SU-8 నమూనా యొక్క 500 μm ఎత్తును సాధించడానికి, రెండు 250 μm మందం గల SU-8 పొరలను రూపొందించడానికి 7 మరియు 8 దశలను పునరావృతం చేయండి.
UV మాస్క్ అలైన్‌ర్‌ను ఉపయోగించి, వేఫర్ యొక్క ఎక్స్‌పోజర్ సమయాన్ని లెక్కించడానికి తయారీదారు సూచనల ప్రకారం ల్యాంప్ పరీక్షను నిర్వహించండి. (ఎక్స్‌పోజర్ సమయం, ms) = (ఎక్స్‌పోజర్ డోస్, mJ/cm2)/(ల్యాంప్ పవర్, mW/cm2).
ఎక్స్పోజర్ సమయాన్ని నిర్ధారించిన తర్వాత, ఫోటోమాస్క్‌ను UV మాస్క్ అలైన్ర్ యొక్క మాస్క్ హోల్డర్‌పై ఉంచి, ఆపై SU-8 పూత పూసిన వేఫర్‌పై ఉంచండి.
UV వ్యాప్తిని తగ్గించడానికి, ఫోటోమాస్క్ యొక్క ముద్రిత ఉపరితలాన్ని సిలికాన్ వేఫర్ యొక్క SU-8 పూత పూసిన వైపున నేరుగా ఉంచండి.
SU-8 పూత పూసిన వేఫర్ మరియు ఫోటోమాస్క్‌ను ముందుగా నిర్ణయించిన ఎక్స్‌పోజర్ సమయం పాటు 260 mJ/cm2 UV కాంతికి నిలువుగా బహిర్గతం చేయండి (ఈ బాక్స్‌లోని 10వ దశను చూడండి).
UV కిరణాలకు గురిచేసిన తర్వాత, 200 μm ఎత్తు గల నమూనాలను తయారు చేయడానికి, SU-8 పూత పూసిన సిలికాన్ వేఫర్‌లను ఒక్కో హాట్ ప్లేట్‌పై 65°C వద్ద 5 నిమిషాలు మరియు 95°C వద్ద 15 నిమిషాలు బేక్ చేశారు. 500 µm ఎత్తు గల నమూనాలను తయారు చేయడానికి, 95°C వద్ద బేక్ అనంతర సమయాన్ని 30 నిమిషాలకు పొడిగించండి.
డెవలపర్‌ను ఒక గాజు పాత్రలో పోసి, బేక్ చేసిన వేఫర్‌ను ఆ పాత్రలో ఉంచాలి. గాజు పలక పరిమాణాన్ని బట్టి SU-8 డెవలపర్ పరిమాణం మారవచ్చు. ఎక్స్‌పోజ్ కాని SU-8ను పూర్తిగా తొలగించడానికి తగినంత SU-8 డెవలపర్‌ను ఉపయోగించేలా చూసుకోండి. ఉదాహరణకు, 1 లీటరు సామర్థ్యం గల 150 మిమీ వ్యాసం ఉన్న గాజు పాత్రను ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, సుమారు 300 మిల్లీలీటర్ల SU-8 డెవలపర్‌ను వాడండి. అప్పుడప్పుడు నెమ్మదిగా తిప్పుతూ, మోల్డ్‌ను 25 నిమిషాల పాటు డెవలప్ చేయండి.
అభివృద్ధి చెందిన మోల్డ్‌ను సుమారు 10 mL తాజా డెవలపర్‌తో శుభ్రం చేసి, ఆ తర్వాత పైపెట్ ఉపయోగించి ద్రావణాన్ని స్ప్రే చేయడం ద్వారా IPA ను కలపండి.
వేఫర్‌ను ప్లాస్మా క్లీనర్‌లో ఉంచి, 1.5 నిమిషాల పాటు ఆక్సిజన్ ప్లాస్మాకు (వాతావరణ వాయువు, లక్ష్య పీడనం 1 × 10−5 టార్, పవర్ 125 W) గురిచేయండి.
లోపల ఒక గ్లాస్ స్లైడ్ ఉంచి, వేఫర్‌ను వాక్యూమ్ డెసికేటర్‌లో పెట్టండి. వేఫర్‌లను, స్లైడ్‌లను పక్కపక్కనే పెట్టవచ్చు. ఒకవేళ వాక్యూమ్ డెసికేటర్‌ను ఒక ప్లేట్‌తో అనేక పొరలుగా విభజించినట్లయితే, స్లైడ్‌లను కింది చాంబర్‌లో, వేఫర్‌లను పై చాంబర్‌లో పెట్టండి. ఒక గ్లాస్ స్లైడ్‌పై 100 μL ట్రైక్లోరో(1H, 1H, 2H, 2H-పెర్ఫ్లోరోఆక్టైల్)సిలేన్ ద్రావణాన్ని వేసి, సిలేనైజేషన్ కోసం వాక్యూమ్ ప్రయోగించండి.
ఘనీభవించిన కాకో-2 కణాల సీసాను 37°C నీటి స్నానంలో కరిగించండి, ఆ తర్వాత కరిగించిన కణాలను 37°C వద్ద ముందుగా వేడి చేసిన 15 mL కాకో-2 మీడియం ఉన్న T75 ఫ్లాస్క్‌లోకి బదిలీ చేయండి.
Caco-2 కణాలను సుమారు 90% సాంద్రతకు చేర్చి వృద్ధి చేయడానికి, మొదట Caco-2 మీడియం, PBS, మరియు 0.25% ట్రిప్సిన్/1 mM EDTA లను 37°C నీటి స్నానంలో వేడి చేయండి.
వాక్యూమ్ ఆస్పిరేషన్ ద్వారా మీడియంను ఆస్పిరేట్ చేయండి. వాక్యూమ్ ఆస్పిరేషన్‌ను పునరావృతం చేసి, తాజా PBSను జోడించడం ద్వారా కణాలను 5 mL గోరువెచ్చని PBSతో రెండుసార్లు కడగండి.