Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana ny CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hamono ny fomba mifanaraka amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia hampiseho ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript izahay.
Ny morphogenesis ao amin'ny tsinain'olombelona dia mametraka ny endriky ny crypt-villus amin'ny microarchitecture epithelial 3D sy ny fandaminana ara-habakabaka. Ity rafitra miavaka ity dia ilaina mba hihazonana ny homeostasis amin'ny tsinay amin'ny alàlan'ny fiarovana ny niche sela fototra ao amin'ny crypt basal amin'ny antigen microbial exogenous sy ny metabolites. Ho fanampin'izany, ny villi intestinal sy ny mucus mamoaka dia mampiseho sela epithelial miavaka miasa miaraka amin'ny sakana miaro eo amin'ny velaran'ny mucosal intestinal. Noho izany, ny famoronana indray ny rafitra epithelial 3D dia tena ilaina amin'ny fananganana modely tsinay in vitro. Tsara homarihina fa ny gut-on-a-chip mimetic organika dia afaka miteraka morphogenesis 3D ho azy amin'ny epithelium intestinal miaraka amin'ny fiasa ara-batana sy biomekanika nohatsaraina. Eto izahay dia manome protocole azo averina mba hamporisihana mafy ny morphogenesis intestinal ao amin'ny tsinay amin'ny puce microfluidic ary koa amin'ny puce hybrid Transwell embedded. Mamaritra ny fomba amin'ny antsipiriany ho an'ny fanamboarana fitaovana, ny fambolena Caco-2 na sela epithelial organoid intestinal amin'ny toerana mahazatra ary koa amin'ny sehatra microfluidic, ny fampidirana ny morphogenesis 3D, ary ny famaritana ny epithelia 3D efa miorina amin'ny alàlan'ny fomba fanaovana sary maro. Ity protocole ity Mahavita manavao ny mikromaritrano miasa ao amin'ny tsinay amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny fikorianan'ny ranoka basolateral mandritra ny 5 andro. Ny fomba morphogenesis in vitro anay dia mampiasa fihenjanana ara-batana sy fihetsehana mekanika mifandraika amin'ny fiziolojika ary tsy mitaky injeniera na fanodinkodinana sela sarotra, izay mety hihoatra ny teknika efa misy. Mieritreritra izahay fa ny protocole narosonay dia mety hisy fiantraikany midadasika ho an'ny vondrom-piarahamonina mpikaroka biomedika, manome fomba iray hamerenana ny sosona epithelial tsinay 3D in vitro ho an'ny fampiharana biomedika, klinika ary fanafody.
Asehon'ny andrana fa ny sela Caco-2 epithelial intestinal izay ambolena ao anaty gut-on-a-chip1,2,3,4,5 na fitaovana microfluidic bilayer6,7 dia afaka mandalo morphogenesis 3D ho azy in vitro raha tsy misy fahatakarana mazava ny mekanisma fototra. Tao amin'ny fanadihadianay vao haingana, dia hitanay fa ilaina ary ampy ny fanesorana ireo antagonista morphogen nafenina basolateral avy amin'ny fitaovana fambolena mba hamporisihana ny morphogenesis epithelial 3D in vitro, izay nasehon'ny Caco-2 sy ireo organoïde intestinal avy amin'ny marary. Nohamarinina ireo sela epithelial. Ato amin'ity fandalinana ity, nifantoka manokana tamin'ny famokarana sela sy ny fizarana fifantohana ny mpanohitra Wnt mahery vaika, Dickkopf-1 (DKK-1), tao amin'ny fitaovana mikrôfluidika gut-on-a-chip sy novaina misy ny fampidirana Transwell, antsoina hoe "Hybrid Chip". Asehonay fa ny fanampiana mpanohitra Wnt exogenous (toy ny DKK-1, Wnt repressor 1, proteinina mifandraika amin'ny frizzled 1, na Soggy-1) ao amin'ny tsinay eo amin'ny chip dia manakana ny morphogenesis na manakorontana ny sosona epithelial 3D efa voarafitra mialoha, izay manondro fa ny fihenjanana antagonistic mandritra ny kolontsaina no tompon'andraikitra amin'ny morphogenesis tsinay in vitro. Noho izany, ny fomba azo ampiharina hahazoana morphogenesis matanjaka eo amin'ny interface epithelial dia ny fanesorana na fitazonana kely ny haavon'ny mpanohitra Wnt ao amin'ny fizarana basolateral amin'ny alàlan'ny fanadiovana mavitrika (ohatra, ao amin'ny sehatra gut-on-a-chip na hybrid-on-a-chip) na ny diffusion. Media basolateral (ohatra, avy amin'ny fampidirana Transwell ao anaty fitahirizana basolateral lehibe ao anaty lavadrano).
Ato amin'ity protocole ity, dia manome fomba amin'ny antsipiriany izahay amin'ny fanamboarana fitaovana bitika ao anaty tsinay sy puce hybrid azo ampidirina ao amin'ny Transwell (dingana 1-5) mba hambolena sela epithelial amin'ny tsinay amin'ny fonon-taolana miendrika polydimethylsiloxane (PDMS) (dingana 6A, 7A, 8, 9) na fonon-taolana polyester amin'ny fampidirana Transwell (dingana 6B, 7B, 8, 9) ary nampiditra morphogenesis 3D in vitro (dingana 10). Namantatra ihany koa izahay ny endri-javatra sela sy molekiola izay manondro ny histogenesis manokana amin'ny sela sy ny fiforonan'ny sela miankina amin'ny tetiarana amin'ny alàlan'ny fampiharana fomba fanaovana sary maro (dingana 11-24). Mampiditra morphogenesis izahay amin'ny fampiasana sela epithelial amin'ny tsinay olombelona, ​​​​toy ny Caco-2 na organoids amin'ny tsinay, amin'ny endrika kolontsaina roa miaraka amin'ny antsipiriany ara-teknika ao anatin'izany ny fanovana ny ety ambonin'ny fonon-taolana miendrika, ny famoronana monolayers 2D, ary ny biochemika sy ny famokarana ny tontolo iainana biolojika amin'ny tsinay. in vitro. Mba hampidirana morphogenesis 3D avy amin'ny monolayers epithelial 2D, dia nesorinay ny mpanohitra morphogen amin'ny endrika roa novolena tamin'ny alàlan'ny ... Farany, manome fanehoana ny fampiasana sosona epithelial 3D azo averina ampiasaina izahay mba hamolavolana ny fitomboan'ny epithelial miankina amin'ny morphogen, ny kolontsaina longitudinal host-microbiome, ny aretina pathogen, ny ratra amin'ny fivontosana, ny tsy fahombiazan'ny sakana epithelial, ary ny fitsaboana mifototra amin'ny probiotika. Ohatra.
Mety hahasoa mpahay siansa isan-karazany ny protokolinay amin'ny fikarohana fototra (ohatra, ny biolojian'ny mucosa amin'ny tsinay, ny biolojian'ny sela fototra, ary ny biolojian'ny fivoarana) sy ny fikarohana ampiharina (ohatra, ny fitiliana fanafody mialoha ny fitsaboana, ny modely aretina, ny injenieran'ny sela, ary ny gastroenterolojia). Noho ny fahafaha-mamerina sy ny faharetan'ny protokolinay hamporisika ny morphogenesis 3D amin'ny epithelium amin'ny tsinay in vitro, dia heverinay fa azo aparitaka amin'ny mpihaino mandalina ny dinamikan'ny famantarana sela mandritra ny fivoaran'ny tsinay, ny fanavaozana na ny homeostasis ny paikadinay ara-teknika. Ankoatra izany, ny protokolinay dia ilaina amin'ny fanadihadiana ny aretina eo ambanin'ny otrikaretina isan-karazany toy ny Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 na Vibrio cholerae. Ilaina ihany koa ny mpihaino momba ny pathology sy ny pathogenesis amin'ny aretina. Ny fampiasana rafitra microphysiology amin'ny tsinay eo amin'ny chip dia mety hamela ny fiaraha-miompy maharitra 10 ary ny fanombanana manaraka ny fiarovana ny mpampiantrano, ny valin'ny hery fiarovana ary ny fanamboarana ratra mifandraika amin'ny pathogen ao amin'ny lalan-drà gastrointestinal (GI) 11. Ny aretina GI hafa mifandraika amin'ny syndrome leakage gut, celiac disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, pouchitis, na irritable bowel syndrome dia azo alaina tahaka rehefa omanina ny sosona epithelial intestinal 3D amin'ny fampiasana ny sosona epithelial intestinal 3D an'ny marary, ireo aretina ireo dia ahitana ny atrophy villous, ny fanafohezana crypt, ny fahasimban'ny mucosal, na ny sakana epithelial simba. Biopsy na organoids intestinal avy amin'ny sela fototra 12,13. Mba hanamorana kokoa ny fahasarotan'ny tontolo iainana amin'ny aretina, ny mpamaky dia mety handinika ny fanampiana karazana sela mifandraika amin'ny aretina, toy ny sela mononuclear ra peripheral marary (PBMCs), amin'ny modely misy microarchitectures villus-crypt intestinal 3D. sela hery fiarovana manokana amin'ny tavy, 5.
Koa satria azo amboarina sy jerena an-tsary ny firafitry ny epithelial 3D tsy mila fizarana, ireo mpijery miasa amin'ny transcriptomics ara-toerana sy ny sary avo lenta na super-resolution dia mety ho liana amin'ny sarintany ataontsika momba ny dinamika ara-toerana sy ara-potoana amin'ny fototarazo sy proteinina amin'ny niches epithelial. Liana amin'ny teknolojia. Valintenin'ny stimuli mikraoba na hery fiarovana. Ankoatra izany, ny crosstalk longitudinal host-microbiome 10, 14 izay mandrindra ny homeostasis amin'ny tsinay dia azo apetraka ao amin'ny sosona mucosal tsinay 3D amin'ny alàlan'ny fambolena karazana mikraoba isan-karazany, vondrom-piarahamonina mikraoba na microbiota diky, indrindra ao amin'ny tsinay-on-a-chip. ao amin'ny sehatra. Ity fomba fiasa ity dia tena manintona ny mpihaino mianatra momba ny immunology mucosal, gastroenterology, human microbiome, cultureromics ary clinical microbiology izay mikatsaka ny hamboly microbiota tsinay tsy mbola nokolokoloina tao amin'ny laboratoara. Raha azo ampifanarahana amin'ny endrika kolontsaina azo ovaina ny protocole morphogenesis in vitro anay, toy ny inserts multiwell amin'ny takelaka lavadrano 24, 96 na 384 izay mameno tsy tapaka ny compartments basolateral, dia azo aparitaka amin'ireo izay mampivelatra sehatra fitiliana na fanamarinana fanafody, biomedika na high-throughput ho an'ny indostrian'ny sakafo ihany koa ny protocole. Ho porofon'ny fitsipika, vao haingana izahay no naneho ny mety ho vitan'ny rafitra morphogenesis multiplex high-throughput azo ovaina amin'ny endrika takelaka 24-lavadrano. Ho fanampin'izany, vokatra organ-on-a-chip maro no efa novokarina16,17,18. Noho izany, ny fanamarinana ny fomba morphogenesis in vitro anay dia azo hafainganina ary mety horaisin'ny laboratoara fikarohana maro, indostria na governemanta ary masoivoho mpanara-maso mba hahatakarana ny fandaharana sela ny morphogenesis tsinay in vitro amin'ny ambaratonga transcriptomic mba hitsapana fanafody na biotherapeutics Ny absorption sy ny fitaterana Nodinihina tamin'ny alalan'ny fampiasana solon-tsinay 3D na modely organ-on-a-chip namboarina manokana na ara-barotra ny isan'ireo kandidà fanafody mba hanombanana ny fahafahan'ny fizotran'ny morphogenesis amin'ny tsinay mamerina izany.
Voafetra ny isan'ny modely fanandramana mifandraika amin'ny olombelona no nampiasaina handinihana ny morphogenesis epithelial amin'ny tsinay, indrindra noho ny tsy fahampian'ny protocols azo ampiharina mba hamporisihana ny morphogenesis 3D in vitro. Raha ny marina, ny ankamaroan'ny fahalalana ankehitriny momba ny morphogenesis amin'ny tsinay dia mifototra amin'ny fanadihadiana biby (ohatra, zebrafish20, totozy21 na akoho22). Na izany aza, dia mitaky asa sy vola be izy ireo, mety hampiahiahy ara-etika, ary ny tena zava-dehibe dia tsy mamaritra tsara ny fizotran'ny fivoaran'ny olombelona. Ireo modely ireo dia voafetra ihany koa amin'ny fahafahany andramana amin'ny fomba azo ampitomboina amin'ny fomba maro. Noho izany, ny protocole ho an'ny fanavaozana ny rafitra sela 3D in vitro dia mihoatra noho ny modely biby in vivo ary koa ny modely kolontsaina sela 2D mahazatra hafa. Araka ny voalaza teo aloha, ny fampiasana rafitra epithelial 3D dia namela anay handinika ny toerana misy ny sela samihafa ao amin'ny crypt-villus axis ho setrin'ny fanentanana mucosal na immune isan-karazany. Ny sosona epithelial 3D dia afaka manome toerana handinihana ny fomba fifaninanan'ny sela mikraoba mba hamoronana niches spatial sy ny fivoarana ara-tontolo iainana ho setrin'ny anton-javatra mpampiantrano (ohatra, sosona mucus anatiny vs. ivelany, famoahana IgA sy antimicrobial peptides). Ankoatra izany, ny morphology epithelial 3D dia ahafahantsika mahatakatra ny fomba firafitry ny microbiota ao amin'ny tsinay sy ny fomba famokarana metabolites mikraoba (ohatra, asidra matavy fohy) izay mamolavola ny fandaminana sela sy ny niches sela fototra ao amin'ny crypts basal. Ireo endri-javatra ireo dia tsy azo aseho raha tsy rehefa tafapetraka in vitro ny sosona epithelial 3D.
Ankoatra ny fomba famoronana rafitra epithelial amin'ny tsinay 3D, dia misy fomba in vitro maromaro. Ny kolontsaina organoïde amin'ny tsinay dia teknika injeniera sela maoderina mifototra amin'ny fambolena sela fototra amin'ny tsinay eo ambanin'ny fepetra morphogen manokana23,24,25. Na izany aza, ny fampiasana modely organoïde 3D ho an'ny famakafakana ny fitaterana na ny kolontsaina host-microbiome dia matetika sarotra satria ny lumen amin'ny tsinay dia voafefy ao anatin'ny organoïde ary, noho izany, ny fampidirana singa luminal toy ny sela mikraoba na antigen exogenous dia voafetra. Azo hatsaraina ny fidirana amin'ny lumen organoïde amin'ny alàlan'ny microinjector,26,27 saingy ity fomba ity dia manafika sy mitaky asa be ary mitaky fahalalana manokana mba hanaovana izany. Ankoatra izany, ny kolontsaina organoïde nentim-paharazana izay tazonina ao anaty scaffolds hydrogel eo ambanin'ny fepetra static dia tsy maneho tsara ny biomekanika mavitrika in vivo.
Ny fomba fiasa hafa ampiasain'ny vondrona mpikaroka maromaro dia mampiasa scaffolds hydrogel 3D efa voarafitra mialoha mba hanahafana ny rafitry ny epithelial amin'ny tsinay amin'ny alàlan'ny fambolena sela tsinay olombelona mitokana eo amin'ny velaran'ny gel. Manamboatra scaffolds hydrogel amin'ny alàlan'ny lasitra vita pirinty 3D, micro-milled, na lithographically. Ity fomba ity dia mampiseho ny fandaminana voalamina ho azy ny sela epithelial mitokana in vitro miaraka amin'ny gradients morphogen mifandraika amin'ny physiologically, mametraka rafitra epithelial avo lenta sy crosstalk stroma-epithelial amin'ny alàlan'ny fampidirana sela stromal ao amin'ny scaffold. Na izany aza, ny toetran'ny scaffolds efa voarafitra mialoha dia mety hisoroka ny fampisehoana ny dingana morphogenetic spontaneous. Ireo modely ireo koa dia tsy manome fikorianan'ny luminal na interstitial dinamika, tsy ampy ny fihenjanana shear fluid izay ilain'ny sela tsinay mba handalo morphogenesis sy hahazoana asa ara-batana. Ny fanadihadiana vao haingana iray hafa dia nampiasa scaffolds hydrogel ao amin'ny sehatra microfluidic ary rafitra epithelial tsinay misy lamina mampiasa teknika laser-etching. Ny organoids tsinay totozy dia manaraka lamina voasokitra mba hamorona rafitra tubular tsinay, ary ny fikorianan'ny ranoka intraluminal dia azo averina amin'ny alàlan'ny module microfluidics. Na izany aza, ity modely ity dia tsy mampiseho spontaneous. Tsy misy dingana morphogenetic na fihetsehana mekanobiolojika ao amin'ny tsinay. Ny teknika fanontana 3D avy amin'io vondrona io ihany dia afaka namorona fantsona kely ao amin'ny tsinay miaraka amin'ny dingana morphogenetic ho azy. Na dia eo aza ny fanamboarana sarotra ny ampahan'ny tsinay samihafa ao anatin'ny fantsona, ity modely ity dia tsy manana fikorianan'ny ranon-javatra luminal sy ny fiovaovan'ny mekanika. Fanampin'izany, mety ho voafetra ny fahafahan'ny modely miasa, indrindra rehefa vita ny dingana bioprinting, izay manelingelina ny toe-javatra fanandramana na ny fifandraisana eo amin'ny sela. Ny protocole narosonay kosa dia manome morphogenesis tsinay ho azy, fihenjanana mifandraika amin'ny fiziolojika, biomekanika izay manahaka ny fihetsehan'ny tsinay, ny fahafahana miditra amin'ny fizarana apical sy basolateral mahaleo tena, ary ny famoronana indray ny tontolo biolojika sarotra modularity. Noho izany, ny protocole morphogenesis 3D in vitro anay dia mety hanome fomba fiasa mifameno handresena ireo fanamby amin'ny fomba efa misy.
Mifantoka tanteraka amin'ny morphogenesis epithelial 3D ny protocole-nay, miaraka amin'ny sela epithelial ihany no ampiasaina amin'ny kolontsaina ary tsy misy karazana sela manodidina toy ny sela mesenchymal, sela endothelial, ary sela fiarovana. Araka ny voalaza teo aloha, ny fototry ny protocole-nay dia ny fampidirana ny morphogenesis epithelial amin'ny alàlan'ny fanesorana ireo inhibitors morphogen nafenina tao amin'ny ilany basolateral amin'ny medium nampidirina. Na dia mamela anay hamerina ny sosona epithelial 3D miolikolika aza ny modularity matanjaka amin'ny gut-on-a-chip sy hybrid-on-a-chip anay, dia mbola hodinihina bebe kokoa ny fahasarotana ara-biolojika fanampiny toy ny fifandraisana epithelial-mesenchymal33,34, ny fametrahana Matrix extracellular (ECM) 35 ary, ao amin'ny modely anay, ny endri-javatra crypt-villus izay mampita ny niches sela fototra ao amin'ny crypts basal. Ny sela stromal (ohatra, fibroblasts) ao amin'ny mesenchyme dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny famokarana proteinina ECM sy ny fandrindrana ny morphogenesis tsinay in vivo35,37,38. Ny fanampiana sela mesenchymal amin'ny modely anay dia nanatsara ny fizotran'ny morphogenetic sy ny fahombiazan'ny fametahana sela. Ny sosona endothelial (ohatra, ny kapilaria na ny lymphatika) dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fandrindrana ny fitaterana molekiola39 sy ny fandraisana mpiasa sela fiarovana40 ao amin'ny tontolo manodidina ny tsinay. Ankoatra izany, ireo singa ao amin'ny lalan-dra izay azo ampifandraisina eo amin'ny modely sela dia fepetra takiana rehefa natao hampiseho ny fifandraisan'ny taova maro ny modely sela. Noho izany, mety ilaina ny fampidirana ny sela endothelial mba hanaovana modely momba ny endri-javatra ara-batana marina kokoa miaraka amin'ny famahana ny taova. Ny sela fiarovana avy amin'ny marary dia tena ilaina ihany koa amin'ny fampisehoana valin-kafatra voajanahary, ny fampisehoana antigen, ny fifandraisana voajanahary amin'ny hery fiarovana, ary ny hery fiarovana manokana amin'ny sela ao anatin'ny fanahafana ny aretin'ny tsinay.
Tsotra kokoa ny fampiasana "puce hybride" raha oharina amin'ny "gut-on-a-chip" satria tsotra kokoa ny fametrahana ny fitaovana ary ny fampiasana "insert Transwell" dia ahafahana mampitombo ny fambolena ny epithelium ao amin'ny tsinay. Na izany aza, ny "insert Transwell" misy "membranes polyester" amidy eny an-tsena dia tsy elastika ary tsy afaka manahaka ny fihetsehana toy ny peristaltika. Ankoatra izany, ny "extrait" ambony amin'ny "insert Transwell" napetraka ao amin'ny "puce hybride" dia nijanona tsy nihetsika ary tsy nisy fihenjanana teo amin'ny ilany ambony. Mazava ho azy fa mahalana ny toetra statika ao amin'ny "extrait" ambony no ahafahana mampitombo ny famokarana bakteria maharitra ao anaty "puce hybride". Na dia afaka mampirisika mafy ny morphogenesis 3D ao amin'ny "insert Transwell" aza isika rehefa mampiasa "puce hybride", ny tsy fahampian'ny biomekanika mifandraika amin'ny fiziolojika sy ny fikorianan'ny ranoka ambony dia mety hametra ny fahafahan'ny sehatra "puce hybride" ampiasaina amin'ny fampiharana mety hitranga.
Mbola tsy voaporofo tanteraka ny fanamboarana tanteraka ny axe crypt-villus olombelona ao amin'ny kolontsaina gut-on-a-chip sy hybrid-on-a-chip. Koa satria manomboka amin'ny monolayer epithelial ny morphogenesis, dia tsy voatery hitovy amin'ny crypts in vivo ny microarchitectures 3D. Na dia nofaritanay aza ny fitomboan'ny isan'ny sela akaikin'ny sehatra crypt fototra ao amin'ny epithelium 3D microengineered, dia tsy voafaritra mazava tsara ny faritra crypt sy villous. Na dia mitarika amin'ny fitomboan'ny haavon'ny epithelium microengineered aza ny fantsona ambony kokoa amin'ny chip, dia mbola voafetra amin'ny ~300–400 µm ny haavony ambony indrindra. Ny halaliny tena izy amin'ny crypts tsinain'olombelona ao amin'ny tsinaibe sy ny tsinaibe dia ~135 µm sy ~400 µm, tsirairay avy, ary ny haavon'ny villi tsinaibe dia ~600 µm41.
Raha jerena amin'ny lafiny sary, ny sary in situ super-resolution amin'ny microarchitectures 3D dia mety ho voafetra amin'ny tsinay eo amin'ny puce, satria ny elanelana ilaina amin'ny fiasana avy amin'ny family objective mankany amin'ny sosona epithelial dia eo amin'ny milimetatra vitsivitsy. Mba handresena ity olana ity, dia mety ilaina ny objective lavitra. Ankoatra izany, ny fanaovana fizarana manify ho an'ny fanomanana santionany sary dia sarotra noho ny elasticity avo lenta amin'ny PDMS. Ankoatra izany, satria ny microfabrication isaky ny sosona amin'ny tsinay eo amin'ny puce dia mitaky fifikirana maharitra eo amin'ny sosona tsirairay, dia tena sarotra ny manokatra na manala ny sosona ambony mba handinihana ny rafitry ny sosona epithelial. Ohatra, amin'ny fampiasana mikroskopia elektronika scanning (SEM).
Ny tsy fahafahan'ny PDMS mandray rano dia anton-javatra mametra ny fidiran'ny molekiola kely amin'ny alalan'ny mikrôfluidika, satria ny PDMS dia afaka mandray ireo molekiola tsy dia mifantoka loatra amin'ny rano. Azo heverina ny fampiasana fitaovana polimerika hafa ho solon'ny PDMS. Raha tsy izany, ny fanovana ny velaran'ny PDMS (ohatra, ny fandokoana amin'ny fitaovana lipofilika 42 na poly(ethylene glycol) 43) dia azo heverina mba hampihenana ny fidiran'ny molekiola tsy dia mifantoka amin'ny rano.
Farany, ny fomba fiasantsika dia tsy voafaritra tsara amin'ny fanomezana sehatra fanandramana "tokan-toerana iray ho an'ny rehetra" mora ampiasaina. Ny protocole ankehitriny dia mitaky paompy syringe isaky ny microdevice, izay maka toerana ao amin'ny incubator CO2 ary misoroka ny fanandramana amin'ny ambaratonga lehibe. Azo hatsaraina be io fetra io amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny endrika kolontsaina vaovao (ohatra, inserts porous 24-well, 96-well, na 384-wells izay ahafahana mameno sy manala tsy tapaka ny media basolateral).
Mba hamporisihana ny morphogenesis 3D amin'ny epithelium tsinain'olombelona in vitro, dia nampiasa fitaovana tsinain'ny tsinain'olombelona misy microchannels roa mifanitsy sy membrane porous elastika eo anelanelany izahay mba hamoronana interface lumen-capillary. Asehonay ihany koa ny fampiasana fitaovana microfluidic misy fantsona tokana (chip hybrid) izay manome fikorianan'ny basolateral mitohy eo ambanin'ny sosona epithelial polarized izay ambolena amin'ny inserts Transwell. Amin'ireo sehatra roa ireo, ny morphogenesis amin'ny sela epithelial tsinain'olombelona isan-karazany dia azo aseho amin'ny alàlan'ny fampiharana ny fanodinkodinana ny fikorianan'ny rano mba hanesorana ireo mpanohitra morphogen avy amin'ny fizarana basolateral. Ny fomba fanandramana manontolo (Sary 1) dia misy fizarana dimy: (i) fanamboarana microchip amin'ny tsinain'olombelona na ny chip hybrid Transwell azo ampidirina (dingana 1-5; Boky 1), (ii) fanomanana ny sela epithelial tsinain'olombelona (sela Caco-2) na organoïde amin'ny tsinain'olombelona; boaty 2-5), (iii) fambolena sela epithelial amin'ny tsinay amin'ny poti-tsinay na poti-hybrid (dingana 6-9), (iv) fampidirana ny morphogenesis 3D in vitro (dingana 10) sy (v)) mba hamantarana ny microstructure epithelial 3D (dingana 11-24). Farany, vondrona fanaraha-maso mety (horesahina bebe kokoa etsy ambany) no natao hanamarinana ny fahombiazan'ny morphogenesis in vitro amin'ny alàlan'ny fampitahana ny morphogenesis epithelial amin'ny fanaraha-maso ara-toerana, ara-potoana, ara-dalàna, na ara-dalàna.
Nampiasa sehatra kolontsaina roa samihafa izahay: gut-on-a-chip misy fantsona mahitsy na fantsona miolikolika tsy mitongilana, na puce hybrid misy insert Transwell (TW) ao anaty fitaovana microfluidic, namboarina araka ny voalaza ao amin'ny Box 1, ary ny dingana 1 -5. "Famoronana fitaovana" dia mampiseho ireo dingana lehibe amin'ny fanaovana puce tokana na puce hybrid. "Ny Kolontsaina ny Sela Epithelial ao amin'ny Tsinay Olombelona" dia manazava ny loharanon'ny sela (Caco-2 na organoïde amin'ny tsinay olombelona) sy ny fomba fambolena ampiasaina amin'ity protocole ity. "Ny morphogenesis in vitro" dia mampiseho ireo dingana ankapobeny izay ambolena ny Caco-2 na sela epithelial avy amin'ny organoïde amin'ny puce intestinal na amin'ny insert Transwell amin'ny puce hybrid, arahin'ny fampidirana ny morphogenesis 3D sy ny fananganana rafitra epithelial miavaka. Ny laharan'ny dingana fandaharana na ny laharan'ny boaty dia aseho eo ambanin'ny zana-tsipìka tsirairay. Ny fampiharana dia manome ohatra amin'ny fomba azo ampiasana ny sosona epithelial amin'ny tsinay efa miorina, ohatra, amin'ny famaritana ny fahasamihafana sela, ny fandalinana ny fiziolojian'ny tsinay, ny fananganana tontolo iainana mpampiantrano-microbiome, ary ny modely aretina. Sary immunofluorescence ao amin'ny "Cell "Differentiation" mampiseho ny nokleary, F-actin ary MUC2 aseho ao amin'ny sosona epithelial 3D Caco-2 novokarina tao amin'ny puce tsinay. Ny famantarana MUC2 dia hita ao amin'ny sela goblet sy mucus navoaka avy amin'ny velaran'ny mucosal. Ny sary fluorescent ao amin'ny Gut Physiology dia mampiseho mucus novokarina tamin'ny fandokoana asidra sialic sy N-acetylglucosamine residues mampiasa fluorescent wheat germ agglutinin. Ny sary roa mifanindry ao amin'ny "Host-Microbe Co-Cultures" dia mampiseho ny co-cultures host-microbiome solontena ao amin'ny tsinay amin'ny puce. Ny tontonana havia dia mampiseho ny co-culture an'ny E. coli maneho proteinina fluorescent maitso (GFP) miaraka amin'ny sela epithelial 3D Caco-2 microengineered. Ny tontonana havanana dia mampiseho ny toerana misy ny GFP E. coli nokolokoloina miaraka amin'ny sela epithelial 3D Caco-2, arahin'ny fandokoana immunofluorescence amin'ny F-actin (mena) sy nuclei (manga). Ny modely aretina dia mampiseho ny tsinay salama sy ny tsinay mitete ao amin'ny puce fivontosana tsinay eo ambany fanamby ara-batana miaraka amin'ny antigen bakteria (ohatra, lipopolysaccharide, LPS) ary sela fiarovana (ohatra, PBMC; maitso). Nokolokoloina ny sela Caco-2 mba hananganana sosona epithelial 3D. Bara mizana, 50 µm. Sary eo amin'ny laharana ambany: "Fanavahana ny sela" namboarina rehefa nahazoana alalana avy amin'ny referansa. 2. Oxford University Press; Naverina navoaka rehefa nahazoana alalana avy amin'ny Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" namboarina rehefa nahazoana alalana avy amin'ny ref.3. NAS; "Disease Modeling" namboarina rehefa nahazoana alalana avy amin'ny referansa. 5. NAS.
Samy namboarina tamin'ny alalan'ny PDMS replicas izay noesorina avy amin'ny lasitra silikônina tamin'ny alalan'ny litografia malefaka1,44 ary nolokoina tamin'ny SU-8 ny puce gut-on-chip sy hybride. Ny famolavolana ny microchannels ao amin'ny puce tsirairay dia voafaritra amin'ny alalan'ny fiheverana ny hydrodynamics toy ny shear stress sy ny hydrodynamic pressure1,4,12. Ny famolavolana gut-on-a-chip tany am-boalohany (Extended Data Fig. 1a), izay ahitana microchannels mahitsy mifanitsy roa, dia nivoatra ho gut-on-a-chip sarotra (Extended Data Fig. 1b) izay ahitana microchannels miolikolika roa mba hampitomboana ny fotoana ipetrahan'ny ranoka, ny lamina mikoriana tsy lineary, ary ny deformation multiaxial amin'ny sela nokolokoloina (Sary 2a–f) 12. Rehefa mila averina amboarina ny biomekanika gastrointestinal sarotra kokoa, dia azo safidiana ny gut-on-a-chips sarotra. Nasehonay fa ny Gut-Chip miolikolika dia mampirisika mafy ny morphogenesis 3D amin'ny fotoana mitovy amin'ny fitomboan'ny epithelial mitovy amin'ny tany am-boalohany. Gut-Chip, na inona na inona karazana sela novolena. Noho izany, mba hamporisihana ny morphogenesis 3D, dia azo ovaina ny endrika tsinay linear sy sarotra ao anaty chip. Ny kopia PDMS nokarakaraina tamin'ny lasitra silikônina misy lamina SU-8 dia nanome endri-javatra ratsy taorian'ny fanesorana (Sary 2a). Mba hanamboarana ny tsinay amin'ny chip, ny sosona PDMS ambony voaomana dia nafatotra mifanesy tamin'ny sarimihetsika PDMS porous ary avy eo dia nampifanarahina tamin'ny sosona PDMS ambany tamin'ny alàlan'ny fatorana tsy azo ovaina amin'ny alàlan'ny fampiasana corona treater (Sary 2b–f). Mba hanamboarana chips hybrid, ny kopia PDMS nokarakaraina dia nafatotra tamin'ny slide fitaratra mba hamoronana fitaovana microfluidic tokana izay afaka mandray ny inserts Transwell (Sary 2h sy Extended Data Sary 2). Ny dingana fatorana dia tanterahina amin'ny alàlan'ny fitsaboana ny velaran'ny kopia PDMS sy ny fitaratra amin'ny plasma oksizenina na fitsaboana corona. Rehefa avy nodiovina ny fitaovana microfabricated miraikitra amin'ny fantsona silikônina, dia vonona ny fametrahana ny fitaovana hanao morphogenesis 3D amin'ny epithelium tsinay (Sary 2g).
a, Sary maneho ny fanomanana ny ampahany PDMS avy amin'ny lasitra silikônina misy lamina SU-8. Ny vahaolana PDMS tsy voatsabo dia nararaka teo amin'ny lasitra silikônina (ankavia), notsaboina tamin'ny 60 °C (afovoany) ary noravana (ankavanana). Ny PDMS noravana dia notapatapahina ary nodiovina mba hampiasaina bebe kokoa. b, Sarin'ny lasitra silikônina ampiasaina hanomanana ny sosona ambony PDMS. c, Sarin'ny lasitra silikônina ampiasaina hanamboarana ny fonon'ny tsinay PDMS. d, Andian-tsary misy ny singa PDMS ambony sy ambany ary ny fitaovana tsinay eo amin'ny puce tafangona. e, Sary maneho ny fampifanarahana ny singa PDMS ambony, foce, ary ambany. Ny sosona tsirairay dia mifamatotra tsy azo averina amin'ny alàlan'ny fitsaboana plasma na corona. f, Sary maneho ny fitaovana gut-on-a-chip namboarina miaraka amin'ny microchannels mikorontana sy efitrano banga. g, Fametrahana gut-on-a-chip ho an'ny kolontsaina sela microfluidic. Ny tsinay namboarina teo amin'ny puce tafangona miaraka amin'ny fantsona silikônina sy syringe dia napetraka teo amin'ny coverlip. Ny fitaovana puce dia napetraka teo amin'ny sarom-bilany Petri 150 mm. lovia ho an'ny fanodinana. Ampiasaina hanakatonana ny fantsona silikônina ny binder.h, Sary hita maso momba ny fanamboarana puce hybrid sy ny morphogenesis 3D amin'ny fampiasana puce hybrid. Ny inserts Transwell nomanina tsy miankina mba hampitomboana sosona 2D amin'ny sela epithelial amin'ny tsinay dia nampidirina tao amin'ny puce hybrid mba hamporisihana ny morphogenesis 3D amin'ny tsinay. Ny medium dia alefa amin'ny alàlan'ny microchannels eo ambanin'ny sosona sela napetraka eo amin'ny insert Transwell. Bara mizana, 1 sm.h Naverina navoaka miaraka amin'ny fahazoan-dàlana avy amin'ny referansa.4. Elsevier.
Ato amin'ity protocole ity, ny sela Caco-2 sy ny organoïde intestinal no nampiasaina ho loharanon'ny epithelial (Sary 3a). Samy novolena tsy miankina ireo karazana sela roa ireo (Vaovao 2 sy Vaovao 5) ary nampiasaina hamafy ireo microchannels voarakotra ECM amin'ny tsinay eo amin'ny chip na Transwell inserts. Rehefa miangona ireo sela (>95% ny fandrakofana ao anaty flasks), dia angonina ireo sela Caco-2 novolena tsy tapaka (eo anelanelan'ny andalana 10 sy 50) ao anaty flasks T mba hanomanana ireo fampiatoana sela misaraka amin'ny alàlan'ny ranon-javatra trypsinization (Vaovao 2). Ireo organoïde intestinal olombelona avy amin'ny biopsies intestinal na ny fandidiana dia novolena tao amin'ny Matrigel scaffold domes tao anaty takelaka 24-well mba hanohanana ny tontolo iainana ara-drafitra. Ny medium misy morphogens tena ilaina (toy ny Wnt, R-spondin, ary Noggin) sy ireo singa fitomboana nomanina araka ny voalaza ao amin'ny Vaovao 3 dia nampiana isaky ny roa andro mandra-pitomboan'ny organoïde hatramin'ny ~500 µm ny savaivony. Ireo organoïde efa lehibe dia angonina ary zaraina ho sela tokana mba hamafy ao amin'ny tsinay. na fampidirana Transwell amin'ny puce (Efajoro 5). Araka ny efa notaterinay teo aloha, dia azo avahana araka ny karazana aretina12,13 (ohatra, colitis ulcerative, aretin'i Crohn, homamiadan'ny colorectal, na mpanome ara-dalàna), toerana misy ny lesion (ohatra, lesion vs. faritra tsy misy lesion) ary ny toerana misy ny gastrointestinal ao amin'ny taratasy mivalona (ohatra, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, na rectum). Manome protocole nohatsaraina ao amin'ny Efajoro 5 izahay ho an'ny fambolena organoïde colonic (coloids) izay mazàna mitaky fifantohana morphogens ambony kokoa noho ny organoïde tsinay kely.
a, Fomba fiasa ho an'ny fampidirana ny morphogenesis amin'ny tsinay ao amin'ny puce tsinay. Ny epithelium amin'ny tsinay olombelona Caco-2 sy ny organoïde amin'ny tsinay dia ampiasaina amin'ity protocole ity mba hampisehoana ny morphogenesis 3D. Ny sela epithelial mitokana dia nafafy tao amin'ny fitaovana gut-on-a-chip efa voaomana (fiomanana puce). Rehefa voafafy (voafafy) ny sela ary miraikitra (miraikitra) amin'ny fonon'ny PDMS porous amin'ny andro 0 (D0), dia atomboka ny fikorianan'ny apical (AP) ary tazonina mandritra ny 2 andro voalohany (mikoriana, AP, D0-D2). Ny fikorianan'ny basolateral (BL) dia atomboka miaraka amin'ny fihetsehana mivelatra (mikoriana, mikoriana, AP ary BL) rehefa miforona ny monolayer 2D feno. Ny morphogenesis 3D amin'ny tsinay dia nitranga ho azy taorian'ny 5 andro nanaovana kolontsaina microfluidic (morphogenesis, D5). Ny sary mifanohitra amin'ny dingana dia mampiseho ny morphology solontenan'ny sela Caco-2 amin'ny dingana na fotoana fanandramana tsirairay (grafika bara, 100 µm). Kisary skematika efatra mampiseho ny cascades mifanaraka amin'ny morphogenesis amin'ny tsinay (ambony havanana). Ny tsipika Ny zana-tsipìka ao amin'ny kisarisary dia maneho ny lalana izoran'ny fikorianan'ny ranoka.b, Sary SEM mampiseho ny topolojian'ny ety ambonin'ny epithelium 3D Caco-2 efa napetraka (ankavia). Ny sary kely manasongadina ny faritra nohalehibeazina (boaty fotsy misy tsipika) dia mampiseho ny microvilli nohavaozina eo amin'ny sosona 3D Caco-2 (ankavanana).c, Fijery mitsivalana eo anoloana amin'ny Caco-2 3D efa napetraka, claudin (ZO-1, mena) ary ny fonon'ny sisin-damba mitohy misy marika F-actin (maitso) sy nuclei (manga). Fanehoana confocal immunofluorescence ny sela epithelial amin'ny poti-tsinay. Ny zana-tsipìka manondro ny kisarisary afovoany dia manondro ny toerana misy ny fiaramanidina focal ho an'ny fijery confocal tsirairay.d, Fizotry ny fiovan'ny morphological amin'ny organoids novolena tamin'ny poti-tsinay azo tamin'ny mikroskopia phase contrast tamin'ny andro faha-3, faha-7, faha-9, faha-11, ary faha-13. Ny sary kely (ambony havanana) dia mampiseho ny fampitomboana avo lenta ny sary nomena.e, Photomicrograph DIC an'ny epithelium 3D organoid napetraka ao amin'ny tsinay amin'ny silaka nalaina tamin'ny andro faha-7.f, Sary immunofluorescence overlaid mampiseho marika ho an'ny sela fototra (LGR5; magenta), sela goblet (MUC2; maitso), F-actin (volondavenona) ary nokleary (cyan) novolena tao amin'ny poti-tsinay nandritra ny 3 andro, tsirairay avy (Havia) ary 13 andro (afovoany) organoïde eo amin'ny sosona epithelial. Jereo koa ny Sary Extended Data 3, izay manasongadina ny famantarana LGR5 tsy misy famantarana MUC2. Sary fluorescence mampiseho ny microstructure epithelial (ankavanana) amin'ny epithelium organoïde 3D napetraka ao amin'ny tsinay amin'ny poti-tsinay amin'ny alàlan'ny fandokoana ny fonon'ny plasma amin'ny loko CellMask (ankavanana) amin'ny andro faha-13 amin'ny kolontsaina. Ny bara mizana dia 50 μm raha tsy misy voalaza manokana. b Naverina natonta miaraka amin'ny fahazoan-dàlana avy amin'ny referansa. 2. Oxford University Press; c Nampifanarahina miaraka amin'ny fahazoan-dàlana avy amin'ny Referansa. 2. Oxford University Press; e sy f nampifanarahina miaraka amin'ny fahazoan-dàlana avy amin'ny referansa. 12 Eo ambanin'ny Creative Commons License CC BY 4.0.
Ao amin'ny tsinay amin'ny puce, ilaina ny manova ny velaran-tany hydrophobic amin'ny fonon-taolana PDMS mba hahomby amin'ny coating ECM. Amin'ity protocole ity, dia mampihatra fomba roa samihafa izahay mba hanovana ny hydrophobicity amin'ny fonon-taolana PDMS. Ho an'ny fambolena sela Caco-2, ny fampandehanana ny velarana amin'ny alàlan'ny fitsaboana UV/ozone fotsiny dia ampy hampihenana ny hydrophobicity amin'ny velaran-tany PDMS, handrakotra ny ECM ary hampiraikitra ny sela Caco-2 amin'ny fonon-taolana PDMS. Na izany aza, ny kolontsaina microfluidic amin'ny epithelium organoïde dia mitaky ny fiasan'ny velarana mifototra amin'ny simika mba hahazoana fametrahana mahomby ny proteinina ECM amin'ny alàlan'ny fampiharana polyethyleneimine (PEI) sy glutaraldehyde amin'ny microchannels PDMS. Aorian'ny fanovana ny velarana, dia napetraka ny proteinina ECM mba handrakofana ny velaran-tany PDMS miasa ary avy eo ampidirina ao amin'ny epithelium organoïde mitokana. Rehefa avy mifamatotra ny sela, ny kolontsaina sela microfluidic dia manomboka amin'ny fampidirana ny medium fotsiny ao amin'ny microchannel ambony mandra-pahatongan'ny sela ho monolayer feno, raha ny microchannel ambany kosa dia mitazona fepetra statika. Ity fomba nohatsaraina ho an'ny fampandehanana ny velarana sy ny coating ECM ity dia ahafahan'ny fampiraisana ny epithelium organoïde miteraka morphogenesis 3D amin'ny PDMS. ambonin'ny tany.
Mila sosona ECM ihany koa ny kolontsaina Transwell alohan'ny famafazana sela; na izany aza, ny kolontsaina Transwell dia tsy mitaky dingana fitsaboana sarotra mialoha mba hampavitrika ny velaran'ny inserts porous. Ho an'ny fambolena sela Caco-2 amin'ny inserts Transwell, ny sosona ECM amin'ny inserts porous dia manafaingana ny fifamatoran'ny sela Caco-2 misaraka (<1 ora) sy ny fiforonan'ny sakana fifandraisana tery (<1-2 andro). Mba hamboly organoïde amin'ny inserts Transwell, ny organoïde mitokana dia afafy amin'ny inserts voarakotra ECM, miraikitra amin'ny velaran'ny membrane (<3 ora) ary tazonina mandra-pahatongan'ny organoïde ho monolayer feno miaraka amin'ny sakana tsy miovaova. Ny kolontsaina Transwell dia atao amin'ny takelaka 24-lavaka tsy misy fampiasana puce hybrid.
Azo atomboka amin'ny alalan'ny fampiharana ny fikorianan'ny ranoka amin'ny lafiny basolateral amin'ny sosona epithelial efa miorina ny morphogenesis 3D in vitro. Ao amin'ny tsinay eo amin'ny puce, nanomboka ny morphogenesis epithelial rehefa natsofoka tao amin'ny microchannels ambony sy ambany ny medium (Sary 3a). Araka ny voalaza teo aloha, tena ilaina ny mampiditra fikorianan'ny ranoka ao amin'ny fizarana ambany (basolateral) mba hanesorana tsy tapaka ny inhibitors morphogen voatokana. Mba hanomezana otrikaina sy serum ampy ho an'ny sela mifamatotra amin'ny fonon-taolana porous ary hiteraka fihenjanana luminal shear, dia matetika izahay mampihatra fikorianan'ny roa sosona ao amin'ny tsinay amin'ny puce. Ao amin'ny puce hybrid, ny inserts Transwell misy epithelial monolayers dia nampidirina tao amin'ny puce hybrid. Avy eo, ny medium dia nampiharina teo ambanin'ny lafiny basolateral amin'ny insert Transwell porous tamin'ny alàlan'ny microchannel. Ny morphogenesis amin'ny tsinay dia nitranga 3-5 andro taorian'ny nanombohan'ny fikorianan'ny basolateral tamin'ny sehatra kolontsaina roa.
Azo hadihadiana amin'ny alalan'ny fampiasana fomba fanaovana sary isan-karazany ny endriky ny sosona epithelial 3D vita amin'ny microengineered, anisan'izany ny mikroskopia phase contrast, mikroskopia differential interference contrast (DIC), SEM, na mikroskopia confocal immunofluorescence (Sary 3 sy 4). Azo atao mora foana ny fanaovana sary phase contrast na DIC amin'ny fotoana rehetra mandritra ny fambolena mba hanaraha-maso ny endrika sy ny fipoiran'ny sosona epithelial 3D. Noho ny mangarahara optika an'ny PDMS sy ny sarimihetsika polyester, ny sehatra gut-on-a-chip sy hybrid chip dia afaka manome sary mivantana tsy mila manapaka na manala ny fitaovana. Rehefa manao sary immunofluorescence (Sary 1, 3c, f sy 4b, c), ny sela dia matetika amboarina amin'ny 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), arahin'ny Triton X-100 sy 2% (wt/vol) bovine serum albumin (BSA), araka ny filaharany. Miankina amin'ny karazana sela, azo ampiasaina ny fixatives, permeabilizers, ary blocking agents samihafa. Antikôra voalohany mikendry ny sela miankina amin'ny razambe na Ampiasaina hanasongadinana ireo sela tsy mihetsika eo amin'ny puce ny mari-pamantarana faritra, arahin'ny antikôra faharoa miaraka amin'ny loko counterstain mikendry ny nucleus (ohatra, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) na F-actin (ohatra, phalloidin misy marika fluorescent). Azo atao koa ny manao sary mivantana mifototra amin'ny fluorescence eo amin'ny toerana mba hamantarana ny famokarana mucus (Sary 1, "Fiovan'ny sela" sy "Fiziolojian'ny tsinay"), ny fanjanahantany kisendrasendra ny sela mikraoba (Sary 1, "Kolontsaina Host-microbe"), ny fandraisana mpiasa ny sela hery fiarovana (Sary 1, 'Modely aretina') na ny endriky ny morphology epithelial 3D (Sary 3c,f sy 4b,c). Rehefa manova ny tsinay eo amin'ny puce mba hanasarahana ny sosona ambony amin'ny sosona microchannel ambany, araka ny voalaza ao amin'ny ref. Araka ny aseho amin'ny Sary 2, ny morphology epithelial 3D ary koa ny microvilli eo amin'ny sisin'ny borosy apical dia azo jerena amin'ny alàlan'ny SEM (Sary 3b). Ny fanehoana ny fahasamihafana Azo tombanana amin'ny alalan'ny fanaovana PCR5 quantitative na ny filaharan'ny RNA sela tokana ireo marika. Amin'ity tranga ity, ny sosona 3D amin'ny sela epithelial ambolena ao anaty poti-tsinay na poti-hybride dia angonina amin'ny alalan'ny trypsinization ary avy eo ampiasaina amin'ny fanadihadiana molekiolary na fototarazo.
a, Fomba fiasa ho an'ny fampidirana ny morphogenesis amin'ny tsinay ao anaty puce hybrid. Ny Caco-2 sy ny organoïde amin'ny tsinay dia ampiasaina amin'ity protocole ity mba hampisehoana ny morphogenesis 3D ao anaty sehatra puce hybrid. Ny sela epithelial misaraka dia nafafy tao anaty inserts Transwell efa voaomana (TW prep; jereo ny sary etsy ambany). Rehefa voafafy (voafafy) ny sela ary miraikitra amin'ny fonon'ny polyester ao amin'ny inserts Transwell, dia nokolokoloina tao anatin'ny toe-javatra statika (kolontsaina TW) ny sela rehetra. Rehefa afaka 7 andro, ny insert Transwell tokana misy sosona 2D amin'ny sela epithelial dia nampidirina tao anaty puce hybrid mba hampidirana fikorianan'ny basolateral (Flow, BL), izay nitarika ho amin'ny famoronana sosona epithelial 3D (morphogenesis). Ny mikrôgrafia mifanohitra amin'ny dingana mampiseho ny endri-javatra morphological amin'ny sela epithelial amin'ny taova olombelona avy amin'ny mpanome ara-dalàna (tsipika C103) miakatra amin'ny dingana fanandramana na fotoana tsirairay. Ny skematika ao amin'ny sosona ambony dia mampiseho ny firafitra fanandramana ho an'ny dingana tsirairay. b, Ny puce Hybrid (skematika havia) dia mety hitarika amin'ny morphogenesis 3D amin'ny sela epithelial organoid miaraka amin'ny fijery mikroskopia confocal ambony midina nalaina tamin'ny toerana Z samihafa (ambony, afovoany, sy ambany; jereo ny kisarisary havanana sy ny tsipika teboteboka mifanaraka amin'izany). dia naneho toetra morfolojika miharihary. F-actin (cyan), vihy (volondavenona). c, Mikrografy confocal fluorescence (fijery zoro 3D) an'ny sela epithelial avy amin'ny organoïde novolena tao amin'ny Transwell static (TW; ampidirina ao anatin'ny boaty fotsy misy tsipika) raha oharina amin'ny puce hybrid (sary feno lehibe indrindra) mampitaha ny morphology 2D raha oharina amin'ny 3D. Ny fijery roa mitsangana 2D (ampidirina eo amin'ny zoro ambony havanana; "XZ") dia mampiseho ihany koa ny endri-javatra 2D sy 3D. Bara mizana, 100 µm. c Naverina navoaka niaraka tamin'ny fahazoan-dàlana avy amin'ny referansa. 4. Elsevier.
Azo omanina amin'ny alalan'ny fambolena ireo sela mitovy (Caco-2 na sela epithelial organoïde intestinal) ho sosona roa refy eo ambanin'ny fepetra fambolena statika mahazatra ny fanaraha-maso. Tsara homarihina fa mety hiteraka fihenan'ny otrikaina noho ny fahafahan'ny microchannels voafetra (ohatra ~4 µL ao amin'ny fantsona ambony amin'ny endrika chip-tsinay tany am-boalohany) ny fihenan'ny otrikaina. Noho izany, azo ampitahaina ihany koa ny endriky ny epithelial aloha sy aorian'ny fampiharana ny fikorianan'ny basolateral.
Tokony hatao ao anaty efitrano madio ny dingana fanaovana litografia malefaka. Ho an'ny sosona tsirairay eo amin'ny puce (sosona ambony sy ambany ary fonon-damba) sy ny puce hybride, dia nampiasaina sy namboarina tamin'ny wafer silikônina misaraka ny saron-tava samihafa satria samy hafa ny haavon'ny microchannels. Ny haavon'ny microchannels ambony sy ambany amin'ny tsinay eo amin'ny puce dia 500 µm sy 200 µm tsirairay avy. Ny haavon'ny fantsona kendren'ny puce hybride dia 200 µm.
Apetraho ao anaty lovia misy acétone ny wafer silikônina 3 santimetatra. Ahodino moramora mandritra ny 30 segondra ny lovia, dia ahenao amin'ny rivotra maina. Afindrao ao anaty lovia misy IPA ny wafer, dia ahodino mandritra ny 30 segondra mba hanadiovana azy.
Azo ampiasaina raha ilaina ny vahaolana piranha (fangaroan'ny peroxyde hidrôzenina sy asidra solifara mifantoka, 1:3 (vol/vol)) mba hanesorana betsaka indrindra ny poti-javatra organika amin'ny velaran'ny wafer silikônina.
Tena manimba be ny ranon-javatra Piranha ary miteraka hafanana. Ilaina ny fepetra fiarovana fanampiny. Ho an'ny fanariana fako, avelao hangatsiaka ny ranon-javatra ary afindra ao anaty fitoeran-javatra madio sy maina. Ampiasao fitoeran-javatra faharoa ary asio marika tsara ny fitoeran-javatra. Araho azafady ny torolàlana momba ny fiarovana ao amin'ny toerana raha mila fomba fiasa amin'ny antsipiriany bebe kokoa.
Avela hangatsiaka mandritra ny 10 minitra ireo "wafers" mba ho maina tsara. Rehefa avy maina dia nohozongozonina in-dimy tamin'ny rivotra mba hangatsiaka.
Araraka eo afovoan'ny "wafer" silikônina efa voadio ny "photoresist SU-8 2100" eo amin'ny 10 g eo ho eo. Ampiasao "tweezers" mba hanaparitahana mitovy tsara ny "photoresist" eo amin'ny "wafer". Indraindray apetraho eo amin'ny takelaka mafana 65°C ny "wafer" mba tsy hiraikitra loatra ny "photoresist" ary ho mora kokoa ny manaparitaka azy. Aza apetraka mivantana eo amin'ny takelaka mafana ny "wafer".
Nozaraina mitovy tsara teo amin'ny wafer ny SU-8 tamin'ny alalan'ny fampiasana "spin coating". Andramo ny fihodinan'ny SU-8 mandritra ny 5–10 segondra mba hiparitaka amin'ny 500 rpm amin'ny hafainganam-pandeha 100 rpm/s. Apetraho amin'ny 1.500 rpm ny hatevin'ny "main spin", na ataovy 250 µm ny hateviny (mamorona haavo 500 µm ho an'ny sosona ambony amin'ny tsinay eo amin'ny "chip"; jereo ny "Dingana manan-danja" etsy ambany) amin'ny hafainganam-pandeha 300 rpm/s 30 segondra amin'ny 1.200 rpm.
Azo amboarina araka ny hatevin'ny lamina SU-8 kendrena eo amin'ny wafer silikônina ny hafainganam-pandehan'ny fihodinana fototra.
Mba hanamboarana lamina SU-8 mirefy 500 µm ny haavony ho an'ny sosona ambony amin'ny tsinay eo amin'ny puce, dia naverina nifanesy (jereo ny dingana 9) ny dingana "spin coating" sy ny "soft bake" tamin'ity boaty ity (dingana 7 sy 8) mba hamokarana sosona roa matevina 250 µm amin'ny SU-8, izay azo asiana sosona sy ampiarahina amin'ny alalan'ny taratra UV amin'ny dingana 12 amin'ity boaty ity, ka mahatonga sosona 500 µm ny haavony.
Andrahoy moramora ireo wafer voarakotra SU-8 amin'ny fametrahana azy ireo amim-pitandremana eo amin'ny lovia mafana amin'ny 65 °C mandritra ny 5 minitra, avy eo ovay ho 95 °C ny mari-pana ary kobanina mandritra ny 40 minitra fanampiny.
Mba hahazoana haavo 500 μm amin'ny lamina SU-8 ao amin'ny microchannel ambony, avereno ny dingana 7 sy 8 mba hamoronana sosona SU-8 roa mirefy 250 μm ny hateviny.
Ampiasao ny UV Mask Aligner, manaova fitsapana jiro araka ny torolalan'ny mpanamboatra mba hikajiana ny fotoana isehoan'ny wafer. (fotoana isehoan'ny hazavana, ms) = (fatran'ny hazavana, mJ/cm2)/(herin'ny jiro, mW/cm2).
Rehefa voafaritra ny fotoana ipoiran'ny hazavana dia apetraho eo amin'ny fitoeran'ny saron-tava amin'ny aligner saron-tava UV ny saron-tava ary apetraho eo amin'ny wafer voarakotra SU-8 ny saron-tava.
Apetraho mivantana eo amin'ny ilany voarakotra SU-8 amin'ny wafer silikônina ny velaran'ny saron-tava vita pirinty mba hampihenana ny fiparitahan'ny taratra UV.
Apetaho mitsangana amin'ny hazavana UV 260 mJ/cm2 ny wafer sy ny saron-tava voarakotra SU-8 mandritra ny fotoana voafaritra mialoha (jereo ny dingana 10 amin'ity boaty ity).
Rehefa avy niharan'ny taratra UV, dia nendasina tamin'ny 65°C nandritra ny 5 minitra ary 95°C nandritra ny 15 minitra teo amin'ny takelaka mafana tsirairay ireo takelaka silikônina voarakotra SU-8 mba hamoronana lamina manana haavo 200 μm. Ampitomboy hatramin'ny 30 minitra ny fotoana aorian'ny fandrahoana amin'ny 95 °C mba hamoronana lamina manana haavo 500 µm.
Araraka ao anaty lovia fitaratra ny "developer", ary apetraka ao anaty lovia ny "wafer" efa masaka. Mety miovaova arakaraka ny haben'ny lovia fitaratra ny habetsahan'ny "developer" SU-8. Ataovy azo antoka fa ampy tsara ny SU-8 developer ampiasaina mba hanesorana tanteraka ny SU-8 tsy mibaribary. Ohatra, rehefa mampiasa lovia fitaratra 150 mm ny savaivony ary afaka mahazaka 1 L, dia ampiasao ~300 mL ny SU-8 developer. Amboary ny lasitra mandritra ny 25 minitra ary ahodino moramora tsindraindray.
Kobanina amin'ny "developer" vaovao miisa 10 mL eo ho eo ny lasitra voavoatra, arahin'ny IPA amin'ny famafazana azy amin'ny alalan'ny pipette.
Apetraho ao anaty mpanadio plasma ny wafer ary avela hilona amin'ny plasma oksizenina (gazy atmosfera, tsindry kendrena 1 × 10−5 Torr, hery 125 W) mandritra ny 1.5 minitra.
Apetraho ao anaty "aspirateur" misy "glass slide" ao anatiny ny "wafer". Azo apetraka mifanila ny "wafer" sy ny "slides". Raha mizara ho sosona maromaro amin'ny alalan'ny takelaka iray ny "aspirateur", dia apetraho ao amin'ny efitrano ambany ny "slides" ary ao amin'ny efitrano ambony kosa ny "wafer". Araraka eo amin'ny "slides" fitaratra ny vahaolana trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane 100 μL ary asio "aspirateur" mba hanaovana "silanisation".
Atsobohy ao anaty rano mafana 37°C ny tavoara kely misy sela Caco-2 mangatsiaka, avy eo afindra ao anaty tavoara T75 misy ranoka Caco-2 efa nafanaina mialoha 37°C 15 mL ireo sela efa levona.
Mba hampandalo ny sela Caco-2 amin'ny fihaonan'ny ~90%, dia asio rano mafana 37°C aloha, PBS, ary trypsin/1 mM EDTA 0.25%.
Tsofy amin'ny alalan'ny "aspiration" ny rano ao anaty "vacuum". Sasao indroa amin'ny PBS mafana 5 mL ny sela amin'ny alalan'ny famerimberenana ny "aspiration" amin'ny alalan'ny "aspiration" ary ampio PBS vaovao.