Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Morfogeneza ljudskog crijeva uspostavlja značajke kripta-vilusa 3D epitelne mikroarhitekture i prostorne organizacije. Ova jedinstvena struktura potrebna je za održavanje homeostaze crijeva zaštitom niše matičnih stanica u bazalnoj kripti od egzogenih mikrobnih antigena i njihovih metabolita. Osim toga, crijevne resice i sluz koja izlučuje predstavljaju funkcionalno diferencirane epitelne stanice sa zaštitnom barijerom na površini crijevne sluznice. Stoga je ponovno stvaranje 3D epitelnih struktura ključno za konstrukciju in vitro modela crijeva. Posebno, organski mimetički crijevo na čipu može inducirati spontanu 3D morfogenezu crijevnog epitela s poboljšanim fiziološkim funkcijama i biomehanikom. Ovdje pružamo reproducibilan protokol za robusnu indukciju crijevne morfogeneze u crijevima na mikrofluidnom čipu, kao i u ugrađenom hibridnom čipu Transwell. Opisujemo detaljne metode za izradu uređaja, uzgoj Caco-2 ili crijevnih organoidnih epitelnih stanica u konvencionalnim uvjetima, kao i na mikrofluidnoj platformi, indukciju 3D morfogeneze i karakterizaciju uspostavljenog 3D epitela korištenjem višestrukih modaliteta snimanja. Ovaj protokol postiže regeneraciju funkcionalne mikroarhitekture crijeva kontroliranjem bazolateralnog protoka tekućine tijekom 5 dana. Naša metoda morfogeneze in vitro koristi fiziološki relevantno smično naprezanje i mehaničko kretanje te ne zahtijeva složeno stanično inženjerstvo ili manipulaciju, što bi moglo nadmašiti druge postojeće tehnike. Predviđamo da bi naš predloženi protokol mogao imati široke implikacije za biomedicinsku istraživačku zajednicu, pružajući metodu za regeneraciju 3D slojeva crijevnog epitela in vitro za biomedicinske, kliničke i farmaceutske primjene.
Eksperimenti pokazuju da Caco-2 stanice crijevnog epitela uzgajane u crijevima na čipu1,2,3,4,5 ili dvoslojnim mikrofluidnim uređajima6,7 mogu proći kroz spontanu 3D morfogenezu in vitro bez jasnog razumijevanja temeljnog mehanizma. U našoj nedavnoj studiji otkrili smo da je uklanjanje bazolateralno izlučenih antagonista morfogena iz uređaja za kulturu potrebno i dovoljno za indukciju 3D epitelne morfogeneze in vitro, što je dokazano pomoću Caco-2 i crijevnih organoida izvedenih od pacijenata. Epitelne stanice su validirane. U ovoj studiji smo se posebno usredotočili na staničnu proizvodnju i distribuciju koncentracije snažnog Wnt antagonista, Dickkopf-1 (DKK-1), u crijevima na čipu i modificiranim mikrofluidnim uređajima koji sadrže Transwell umetke, nazvanim "Hibridni čip". Pokazujemo da dodavanje egzogenih Wnt antagonista (kao što su DKK-1, Wnt represor 1, izlučeni protein 1 povezan s kovrčavom dlakom ili Soggy-1) u crijeva na čipu inhibira morfogenezu ili remeti prestrukturirani 3D epitelni sloj, što sugerira da je antagonistički stres tijekom kulture odgovoran za crijevnu morfogenezu in vitro. Stoga je praktičan pristup postizanju robusne morfogeneze na epitelnom sučelju uklanjanje ili minimalno održavanje razina Wnt antagonista u bazolateralnom odjeljku aktivnim ispiranjem (npr. u platformama s crijevima na čipu ili hibridima na čipu) ili difuzijom u bazolateralnim medijima (npr. iz Transwell umetaka u velike bazolateralne spremnike u bunarima).
U ovom protokolu pružamo detaljnu metodu za izradu mikrouređaja tipa "gut-on-a-chip" i hibridnih čipova koji se mogu umetnuti u Transwell (koraci 1-5) za uzgoj stanica crijevnog epitela na poroznim membranama na bazi polidimetilsiloksana (PDMS) (koraci 6A, 7A, 8, 9) ili poliesterskim membranama Transwell umetaka (koraci 6B, 7B, 8, 9) i induciranu 3D morfogenezu in vitro (korak 10). Također smo identificirali stanične i molekularne značajke koje ukazuju na tkivno specifičnu histogenezu i staničnu diferencijaciju ovisnu o lozi primjenom višestrukih modaliteta snimanja (koraci 11-24). Induciramo morfogenezu korištenjem stanica ljudskog crijevnog epitela, kao što su Caco-2 ili crijevni organoidi, u dva formata kulture s tehničkim detaljima koji uključuju modifikaciju površine poroznih membrana, stvaranje 2D monoslojeva te crijevnu biokemiju i reprodukciju biomehaničkog mikrookruženja in vitro. Kako bismo inducirali 3D morfogenezu iz 2D epitelnih monoslojeva, uklonili smo antagoniste morfogena u oba kultivirana oblika protokom... medij u bazolateralni odjeljak kulture. Konačno, pružamo prikaz korisnosti regenerabilnog 3D epitelnog sloja koji se može koristiti za modeliranje rasta epitela ovisnog o morfogenima, longitudinalnih kokultura domaćina i mikrobioma, infekcije patogenima, upalnih ozljeda, disfunkcije epitelne barijere i terapija temeljenih na probioticima. Primjer utjecaja.
Naš protokol može biti koristan širokom rasponu znanstvenika u osnovnim (npr. biologija crijevne sluznice, biologija matičnih stanica i razvojna biologija) i primijenjenim istraživanjima (npr. predkliničko testiranje lijekova, modeliranje bolesti, tkivno inženjerstvo i gastroenterologija) sa širokim utjecajem. Zbog ponovljivosti i robusnosti našeg protokola za induciranje 3D morfogeneze crijevnog epitela in vitro, predviđamo da se naša tehnička strategija može proširiti na publiku koja proučava dinamiku stanične signalizacije tijekom razvoja, regeneracije ili homeostaze crijeva. Osim toga, naš protokol je koristan za ispitivanje infekcije pod raznim zaraznim agensima kao što su norovirus 8, koronavirus 2 teškog akutnog respiratornog sindroma (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ili Vibrio cholerae. Publika patologije i patogeneze bolesti također je korisna. Korištenje sustava mikrofiziologije crijeva na čipu može omogućiti longitudinalnu kokulturu 10 i naknadnu procjenu obrane domaćina, imunoloških odgovora i popravka ozljeda povezanih s patogenima u gastrointestinalnom (GI) traktu 11. Drugi GI poremećaji povezani sa sindromom propusnog crijeva, celijakijom, Crohnovom bolešću, ulceroznim kolitisom, pouchitisom ili sindromom iritabilnog crijeva mogu se simulirati kada se 3D slojevi crijevnog epitela pripreme korištenjem pacijentovih 3D slojeva crijevnog epitela, a te bolesti uključuju atrofiju resica, skraćivanje kripti, oštećenje sluznice ili oštećenu epitelnu barijeru. Biopsija ili crijevni organoidi izvedeni iz matičnih stanica 12,13. Kako bi bolje modelirali veću složenost okruženja bolesti, čitatelji mogu razmotriti dodavanje tipova stanica relevantnih za bolest, kao što su mononuklearne stanice periferne krvi pacijenta (PBMC), modelima koji sadrže 3D mikroarhitekture crijevnih resica i kripti. tkivno specifične imunološke stanice, 5.
Budući da se 3D epitelna mikrostruktura može fiksirati i vizualizirati bez procesa seciranja, promatrači koji rade na prostornoj transkriptomici i snimanju visoke ili super rezolucije mogli bi biti zainteresirani za naše mapiranje prostorno-vremenske dinamike gena i proteina na epitelnim nišama. Zanima me tehnologija. Odgovor na mikrobne ili imunološke podražaje. Nadalje, longitudinalno preslušavanje domaćina i mikrobioma 10, 14 koje koordinira homeostazu crijeva može se uspostaviti u 3D sloju crijevne sluznice kokultivacijom različitih mikrobnih vrsta, mikrobnih zajednica ili fekalne mikrobiote, posebno u crijevu na čipu. na platformi. Ovaj pristup je posebno atraktivan za publiku koja proučava imunologiju sluznice, gastroenterologiju, ljudski mikrobiom, kulturomiku i kliničku mikrobiologiju, a želi uzgajati prethodno nekultiviranu crijevnu mikrobiotu u laboratoriju. Ako se naš protokol in vitro morfogeneze može prilagoditi skalabilnim formatima kulture, kao što su umetci s više jažica u pločama s 24, 96 ili 384 jažice koji kontinuirano nadopunjuju bazolateralne odjeljke, protokol se također može proširiti na one koji razvijaju farmaceutske, biomedicinske ili visokopropusne platforme za probir ili validaciju za prehrambenu industriju. Kao dokaz principa, nedavno smo pokazali izvedivost multipleksnog visokopropusnog sustava morfogeneze skalabilnog na format ploče s 24 jažice. Osim toga, komercijalizirani su višestruki proizvodi organ-na-čipu16,17,18. Stoga se validacija naše metode in vitro morfogeneze može ubrzati i potencijalno usvojiti od strane mnogih istraživačkih laboratorija, industrije ili vladinih i regulatornih agencija kako bi se razumjelo stanično reprogramiranje in vitro crijevne morfogeneze na transkriptomskoj razini za testiranje lijekova ili bioterapeutika. Apsorpcija i Transport kandidata za lijekove procijenjen je korištenjem 3D surogata crijeva ili korištenjem prilagođenih ili komercijalnih modela organa na čipu kako bi se procijenila ponovljivost procesa morfogeneze crijeva.
Ograničen broj eksperimentalnih modela relevantnih za ljude korišten je za proučavanje morfogeneze crijevnog epitela, uglavnom zbog nedostatka provedivih protokola za induciranje 3D morfogeneze in vitro. Zapravo, velik dio trenutnog znanja o morfogenezi crijeva temelji se na studijama na životinjama (npr. zebrice20, miševi21 ili kokoši22). Međutim, one su radno i financijski intenzivne, mogu biti etički upitne i, što je najvažnije, ne određuju precizno ljudske razvojne procese. Ovi modeli su također vrlo ograničeni u svojoj mogućnosti testiranja na višesmjerni skalabilan način. Stoga naš protokol za regeneraciju 3D tkivnih struktura in vitro nadmašuje in vivo životinjske modele kao i druge tradicionalne statičke 2D modele stanične kulture. Kao što je prethodno opisano, korištenje 3D epitelnih struktura omogućilo nam je ispitivanje prostorne lokalizacije diferenciranih stanica u osi kripta-vilus kao odgovor na različite mukozne ili imunološke podražaje. 3D epitelni slojevi mogu pružiti prostor za proučavanje kako se mikrobne stanice natječu za stvaranje prostornih niša i ekološke evolucije kao odgovor na čimbenike domaćina (npr. unutarnji naspram vanjskih slojeva sluzi, lučenje IgA i antimikrobni peptidi). Nadalje, 3D epitelna morfologija može nam omogućiti da razumijemo kako crijevna mikrobiota strukturira svoje zajednice i sinergijski proizvodi mikrobne metabolite (npr. masne kiseline kratkog lanca) koji oblikuju staničnu organizaciju i niše matičnih stanica u bazalnim kriptama. Ove se značajke mogu pokazati samo kada se 3D epitelni slojevi uspostave in vitro.
Uz našu metodu stvaranja 3D struktura crijevnog epitela, postoji nekoliko in vitro metoda. Kultura crijevnih organoida najsuvremenija je tehnika tkivnog inženjerstva temeljena na uzgoju crijevnih matičnih stanica pod specifičnim uvjetima morfogena23,24,25. Međutim, korištenje 3D modela organoida za analizu transporta ili kokulture domaćina i mikrobioma često je izazovno jer je crijevni lumen zatvoren unutar organoida i stoga je uvođenje luminalnih komponenti poput mikrobnih stanica ili egzogenih antigena ograničeno. Pristup lumenima organoida može se poboljšati korištenjem mikroinjektora26,27, ali ova metoda je invazivna i radno intenzivna te zahtijeva specijalizirano znanje za izvođenje. Nadalje, tradicionalne kulture organoida održavane u hidrogelnim nosačima pod statičkim uvjetima ne odražavaju točno aktivnu in vivo biomehaniku.
Drugi pristupi koje koriste nekoliko istraživačkih skupina koriste prestrukturirane 3D hidrogelne skele za oponašanje strukture crijevnog epitela uzgojem izoliranih ljudskih crijevnih stanica na površini gela. Izradite hidrogelne skele pomoću 3D printanih, mikro-glodanih ili litografski izrađenih kalupa. Ova metoda pokazuje samoorganizirani raspored izoliranih epitelnih stanica in vitro s fiziološki relevantnim gradijentima morfogena, uspostavljajući epitelnu strukturu visokog omjera stranica i preslušavanje strome i epitela uključivanjem stromalnih stanica u skelu. Međutim, priroda prestrukturiranih skela može spriječiti prikaz samog spontanog morfogenetskog procesa. Ovi modeli također ne pružaju dinamičan luminalni ili intersticijski protok, nedostaje im napon smicanja tekućine koji je crijevnim stanicama potreban za morfogenezu i postizanje fiziološke funkcije. Druga nedavna studija koristila je hidrogelne skele u mikrofluidnoj platformi i uzorkovane crijevne epitelne strukture korištenjem tehnika laserskog jetkanja. Mišji crijevni organoidi slijede urezane uzorke kako bi formirali crijevne tubularne strukture, a intraluminalni protok tekućine može se rekapitulirati pomoću mikrofluidnog modula. Međutim, ovaj model ne pokazuje ni spontani... morfogenetski procesi niti uključuje mehanobiološke pokrete crijeva. Tehnike 3D ispisa iz iste skupine uspjele su stvoriti minijaturne crijevne cijevi sa spontanim morfogenetskim procesima. Unatoč složenoj izradi različitih segmenata crijeva unutar cijevi, ovom modelu također nedostaje protok luminalne tekućine i mehanička deformacija. Osim toga, operabilnost modela može biti ograničena, posebno nakon što je proces bioprintanja završen, što remeti eksperimentalne uvjete ili interakcije stanica. Umjesto toga, naš predloženi protokol pruža spontanu morfogenezu crijeva, fiziološki relevantno naprezanje smicanja, biomehaniku koja oponaša pokretljivost crijeva, dostupnost neovisnih apikalnih i bazolateralnih odjeljaka i ponovno stvaranje složenih bioloških mikrookruženja modularnosti. Stoga, naš in vitro 3D protokol morfogeneze može pružiti komplementarni pristup prevladavanju izazova postojećih metoda.
Naš protokol je u potpunosti usmjeren na 3D epitelnu morfogenezu, s epitelnim stanicama u kulturi i bez drugih vrsta okolnih stanica poput mezenhimalnih stanica, endotelnih stanica i imunoloških stanica. Kao što je prethodno opisano, srž našeg protokola je indukcija epitelne morfogeneze uklanjanjem inhibitora morfogena koji se luče na bazolateralnoj strani uvedenog medija. Dok nam robusna modularnost našeg crijeva na čipu i hibrida na čipu omogućuje ponovno stvaranje valovitog 3D epitelnog sloja, dodatne biološke složenosti poput epitelno-mezenhimalnih interakcija33,34, taloženja izvanstanične matrice (ECM)35 i, u našem modelu, značajki kripte i resice koje prenose niše matičnih stanica u bazalnim kriptama, tek treba dalje razmotriti. Stromalne stanice (npr. fibroblasti) u mezenhimu igraju ključnu ulogu u proizvodnji ECM proteina i regulaciji crijevne morfogeneze in vivo35,37,38. Dodavanje mezenhimalnih stanica našem modelu poboljšalo je morfogenetski proces i pričvršćivanje stanica. učinkovitost. Endolni sloj (tj. kapilare ili limfne stanice) igra važnu ulogu u regulaciji molekularnog transporta39 i regrutiranju imunoloških stanica40 u crijevnom mikrookruženju. Nadalje, komponente vaskulature koje se mogu povezati između modela tkiva preduvjet su kada se modeli tkiva dizajniraju za demonstraciju interakcija više organa. Stoga će možda trebati uključiti endotelne stanice kako bi se modelirale točnije fiziološke značajke s rezolucijom na razini organa. Imuno stanice izvedene od pacijenta također su bitne za prikazivanje urođenih imunoloških odgovora, prezentacije antigena, urođenog adaptivnog imunološkog preslušavanja i tkivno specifičnog imuniteta u kontekstu oponašanja crijevnih bolesti.
Korištenje hibridnih čipova je jednostavnije od crijeva na čipu jer je postavljanje uređaja jednostavnije, a korištenje Transwell umetaka omogućuje skalabilnu kulturu crijevnog epitela. Međutim, komercijalno dostupni Transwell umetci s poliesterskim membranama nisu elastični i ne mogu simulirati peristaltičke pokrete. Nadalje, apikalni odjeljak Transwell umetka postavljenog u hibridni čip ostao je nepomičan bez smicanja na apikalnoj strani. Jasno je da statička svojstva u apikalnom odjeljku rijetko omogućuju dugotrajnu bakterijsku kokulturu u hibridnim čipovima. Iako možemo robusno inducirati 3D morfogenezu u Transwell umetcima kada koristimo hibridne čipove, nedostatak fiziološki relevantne biomehanike i apikalnog protoka tekućine može ograničiti izvedivost hibridnih čip platformi za potencijalne primjene.
Potpune rekonstrukcije ljudske osi kripta-resica u kulturama crijeva na čipu i hibrida na čipu nisu u potpunosti utvrđene. Budući da morfogeneza počinje od epitelnog monosloja, 3D mikroarhitekture ne pružaju nužno morfološku sličnost s kriptama in vivo. Iako smo karakterizirali proliferirajuću staničnu populaciju u blizini bazalne domene kripte u mikroinženjerskom 3D epitelu, područja kripte i resica nisu bila jasno razgraničena. Iako viši gornji kanali na čipu dovode do povećane visine mikroinženjerskog epitela, maksimalna visina je i dalje ograničena na ~300–400 µm. Stvarna dubina ljudskih crijevnih kripti u tankom i debelom crijevu je ~135 µm odnosno ~400 µm, a visina resica tankog crijeva je ~600 µm41.
S gledišta snimanja, in situ superrezolucijsko snimanje 3D mikroarhitektura može biti ograničeno na crijevo na čipu, budući da je potrebna radna udaljenost od objektiva do epitelnog sloja reda veličine nekoliko milimetara. Kako bi se prevladao ovaj problem, može biti potreban udaljeni objektiv. Nadalje, izrada tankih presjeka za pripremu uzoraka za snimanje je izazovna zbog visoke elastičnosti PDMS-a. Nadalje, budući da mikrofabrikacija crijeva sloj po sloj na čipu uključuje trajno prianjanje između svakog sloja, izuzetno je izazovno otvoriti ili ukloniti gornji sloj kako bi se ispitala površinska struktura epitelnog sloja. Na primjer, korištenjem skenirajućeg elektronskog mikroskopa (SEM).
Hidrofobnost PDMS-a bila je ograničavajući faktor u mikrofluidnim studijama koje se bave hidrofobnim malim molekulama, budući da PDMS može nespecifično adsorbirati takve hidrofobne molekule. Mogu se razmotriti alternative PDMS-u s drugim polimernim materijalima. Alternativno, modifikacija površine PDMS-a (npr. premazivanje lipofilnim materijalima 42 ili poli(etilen glikolom) 43) može se razmotriti kako bi se smanjila adsorpcija hidrofobnih molekula.
Konačno, naša metoda nije dobro okarakterizirana u smislu pružanja visokopropusnog probira ili univerzalne eksperimentalne platforme prilagođene svima. Trenutni protokol zahtijeva pumpu za šprice po mikrouređaju, što zauzima prostor u CO2 inkubatoru i sprječava eksperimente velikih razmjera. Ovo ograničenje može se značajno poboljšati skalabilnošću inovativnih formata kulture (npr. porozni umetci s 24, 96 ili 384 jažice koji omogućuju kontinuirano nadopunjavanje i uklanjanje bazolateralnog medija).
Kako bismo inducirali 3D morfogenezu ljudskog crijevnog epitela in vitro, koristili smo mikrofluidni čip za crijeva koji sadrži dva paralelna mikrokanala i elastičnu poroznu membranu između njih kako bismo stvorili lumen-kapilarno sučelje. Također demonstriramo upotrebu jednokanalnog mikrofluidnog uređaja (hibridnog čipa) koji omogućuje kontinuirani bazolateralni protok ispod polariziranih epitelnih slojeva uzgojenih na Transwell umetcima. U obje platforme, morfogeneza različitih stanica ljudskog crijevnog epitela može se demonstrirati primjenom usmjerene manipulacije protoka kako bi se uklonili antagonisti morfogena iz bazolateralnog odjeljka. Cijeli eksperimentalni postupak (Slika 1) sastoji se od pet dijelova: (i) mikrofabrikacija crijevnog čipa ili Transwell umetljivog hibridnog čipa (koraci 1-5; Okvir 1), (ii) priprema stanica crijevnog epitela (Caco-2 stanice) ili organoida ljudskog crijeva; okviri 2-5), (iii) kultura stanica crijevnog epitela na crijevnim čipovima ili hibridnim čipovima (koraci 6-9), (iv) indukcija 3D morfogeneze in vitro (korak 10) i (v)) za karakterizaciju 3D epitelne mikrostrukture (koraci 11-24). Konačno, dizajnirana je odgovarajuća kontrolna skupina (o čemu će biti više riječi u nastavku) kako bi se potvrdila učinkovitost in vitro morfogeneze usporedbom epitelne morfogeneze s prostornim, vremenskim, uvjetnim ili proceduralnim kontrolama.
Koristili smo dvije različite platforme za uzgoj: crijeva na čipu s ravnim kanalima ili nelinearnim zavijenim kanalima ili hibridne čipove koji sadrže Transwell (TW) umetke u mikrofluidnom uređaju, izrađenom kako je opisano u Okviru 1, a korak 1-5. „Izrada uređaja“ prikazuje glavne korake u izradi jednog čipa ili hibridnog čipa. „Kultura stanica ljudskog crijevnog epitela“ objašnjava izvor stanica (Caco-2 ili ljudski crijevni organoidi) i postupak uzgoja korišten u ovom protokolu. „In vitro morfogeneza“ prikazuje ukupne korake u kojima se Caco-2 ili stanice epitela izvedene iz organoida uzgajaju na crijevnom čipu ili na Transwell umetcima hibridnog čipa, nakon čega slijedi indukcija 3D morfogeneze i formiranje karakterizirane epitelne strukture. Broj koraka programa ili broj okvira prikazan je ispod svake strelice. Aplikacija pruža primjere kako se uspostavljeni slojevi crijevnog epitela mogu koristiti, na primjer, u karakterizaciji stanične diferencijacije, studijama fiziologije crijeva, uspostavljanju ekosustava domaćina i mikrobioma te modeliranju bolesti. Imunofluorescentne slike u „Diferencijaciji stanica“ prikazuje jezgre, F-aktin i MUC2 eksprimirane u 3D Caco-2 epitelnom sloju generiranom na crijevnom čipu. MUC2 signalizacija prisutna je u vrčastim stanicama i sluzi koja se izlučuje s površina sluznice. Fluorescentne slike u Gut Physiology prikazuju sluz proizvedenu bojenjem na ostatke sijalinske kiseline i N-acetilglukozamina pomoću fluorescentnog aglutinina pšeničnih klica. Dvije preklapajuće slike u "Host-Microbe Co-Cultures" prikazuju reprezentativne ko-kulture domaćina i mikrobioma u crijevima na čipu. Lijeva ploča prikazuje ko-kulturu E. coli koja eksprimira zeleni fluorescentni protein (GFP) s mikroinženjerskim 3D Caco-2 epitelnim stanicama. Desna ploča prikazuje lokalizaciju GFP E. coli ko-kultivirane s 3D Caco-2 epitelnim stanicama, nakon čega slijedi imunofluorescentno bojenje s F-aktinom (crveno) i jezgrama (plavo). Modeliranje bolesti ilustrira zdravo naspram propusnog crijeva u čipovima s upalom crijeva pod fiziološkim izazovom s bakterijskim antigenima (npr. lipopolisaharid, LPS) i imunološkim stanicama (npr. PBMC; zeleno). Caco-2 stanice su uzgajane kako bi se uspostavio 3D epitelni sloj. Mjerilo, 50 µm. Slike u donjem redu: „Diferencijacija stanica“ prilagođena uz dopuštenje iz reference.2. Oxford University Press; Reproducirano uz dopuštenje iz Ref.5. NAS; „Kokultura domaćina i mikroba“ prilagođena uz dopuštenje iz ref.3. NAS; „Modeliranje bolesti“ prilagođeno uz dopuštenje iz reference.5. NAS.
I crijevo-na-čipu i hibridni čipovi izrađeni su korištenjem PDMS replika koje su izvađene iz silikonskih kalupa mekom litografijom1,44 i oblikovane sa SU-8. Dizajn mikrokanala u svakom čipu određen je uzimajući u obzir hidrodinamiku poput smicanja i hidrodinamičkog tlaka1,4,12. Izvorni dizajn crijeva-na-čipu (Prošireni podaci, slika 1a), koji se sastojao od dva paralelna ravna mikrokanala postavljena jedan pored drugog, evoluirao je u složeni crijevo-na-čipu (Prošireni podaci, slika 1b) koji uključuje par zakrivljenih mikrokanala kako bi se izazvalo povećano vrijeme zadržavanja fluida, nelinearni obrasci protoka i višeosna deformacija kultiviranih stanica (slika 2a-f)12. Kada je potrebno ponovno stvoriti složeniju biomehaniku crijeva, mogu se odabrati složena crijeva-na-čipu. Pokazali smo da zavijeni crijevni čip također snažno inducira 3D morfogenezu u sličnom vremenskom okviru sa sličnim stupnjem rasta epitela u usporedbi s izvornim crijevnim čipom. bez obzira na vrstu kultiviranih stanica. Stoga su, kako bi se inducirala 3D morfogeneza, linearni i složeni dizajni crijeva na čipu zamjenjivi. PDMS replike očvrsnute na silikonskim kalupima s SU-8 uzorcima pružile su negativne značajke nakon vađenja iz kalupa (slika 2a). Za izradu crijeva na čipu, pripremljeni gornji PDMS sloj sekvencijalno je vezan na porozni PDMS film, a zatim poravnat s donjim PDMS slojem nepovratnim vezanjem pomoću koronskog tretmana (slika 2b-f). Za izradu hibridnih čipova, očvrsnute PDMS replike vezane su na staklene pločice kako bi se stvorili jednokanalni mikrofluidni uređaji koji bi mogli primiti Transwell umetke (slika 2h i prošireni podaci, slika 2). Proces vezanja izvodi se tretiranjem površina PDMS replike i stakla plazmom kisika ili koronskim tretmanom. Nakon sterilizacije mikroizrađenog uređaja pričvršćenog na silikonsku cijev, postavka uređaja bila je spremna za izvođenje 3D morfogeneze crijevnog epitela (slika 2g).
a, Shematski prikaz pripreme PDMS dijelova iz silikonskih kalupa s uzorkom SU-8. Nestvrdnuta PDMS otopina izlivena je na silikonski kalup (lijevo), stvrdnuta na 60 °C (sredina) i izvađena iz kalupa (desno). Izvađeni PDMS izrezan je na komade i očišćen za daljnju upotrebu.b, Fotografija silikonskog kalupa korištenog za pripremu gornjeg sloja PDMS-a.c, Fotografija silikonskog kalupa korištenog za izradu porozne PDMS membrane.d, Niz fotografija gornjih i donjih PDMS komponenti i sastavljenog crijevnog uređaja na čipu.e, Shematski prikaz poravnanja gornjih, membranskih i donjih PDMS komponenti. Svaki sloj je nepovratno vezan plazma ili koronskom obradom.f, Shematski prikaz izrađenog uređaja crijevo na čipu sa superponiranim zavijenim mikrokanalima i vakuumskim komorama.g, Postavljanje crijeva na čipu za mikrofluidnu staničnu kulturu. Izrađeno crijevo na čipu sastavljeno sa silikonskom cijevi i štrcaljkom postavljeno je na pokrovno stakalce. Čip uređaj postavljen je na poklopac Petrijeve posude od 150 mm. zdjelica za obradu. Vezivo se koristi za zatvaranje silikonske cijevi.h, Vizualni snimci izrade hibridnog čipa i 3D morfogeneze korištenjem hibridnih čipova. Transwell umetci pripremljeni neovisno za kultiviranje 2D monoslojeva crijevnih epitelnih stanica umetnuti su u hibridni čip kako bi se inducirala crijevna 3D morfogeneza. Medij se perfundira kroz mikrokanale ispod staničnog sloja uspostavljenog na Transwell umetku. Mjerilo, 1 cm.h Pretiskano uz dopuštenje iz reference.4. Elsevier.
U ovom protokolu, stanična linija Caco-2 i crijevni organoidi korišteni su kao epitelni izvori (slika 3a). Obje vrste stanica uzgajane su neovisno (Okvir 2 i Okvir 5) i korištene su za sijanje ECM-om obloženih mikrokanala crijeva na čipu ili Transwell umetaka. Kada su stanice konfluentne (>95% pokrivenosti u tikvicama), rutinski uzgajane Caco-2 stanice (između pasaža 10 i 50) u T-tikvicama se sakupljaju za pripremu suspenzija disociranih stanica tripsinizacijskom tekućinom (okvir 2). Ljudski crijevni organoidi iz crijevnih biopsija ili kirurških resekcija uzgajani su u Matrigel scaffold kupolama u pločama s 24 jažice kako bi se podržalo strukturno mikrookruženje. Medij koji sadrži esencijalne morfogene (kao što su Wnt, R-spondin i Noggin) i faktore rasta pripremljene kako je opisano u Okviru 3 nadopunjavan je svaki drugi dan dok organoidi nisu narasli do ~500 µm u promjeru. Potpuno uzgojeni organoidi se sakupljaju i disociraju u pojedinačne stanice za sijanje na crijevo ili Transwell umetci na čipu (Okvir 5). Kao što smo prethodno izvijestili, može se razlikovati prema vrsti bolesti12,13 (npr. ulcerozni kolitis, Crohnova bolest, kolorektalni karcinom ili normalni donor), mjestu lezije (npr. lezija naspram neoštećenog područja) i gastrointestinalnoj lokaciji u traktu (npr. duodenum, jejunum, ileum, cekum, debelo crijevo ili rektum). U Okviru 5 pružamo optimizirani protokol za kultiviranje organoida debelog crijeva (koloida) koji obično zahtijevaju veće koncentracije morfogena od organoida tankog crijeva.
a, Tijek rada za indukciju morfogeneze crijeva u crijevnom čipu. Caco-2 ljudski crijevni epitel i crijevni organoidi koriste se u ovom protokolu za demonstraciju 3D morfogeneze. Izolirane epitelne stanice zasijane su u pripremljeni uređaj crijevo-na-čipu (priprema čipa). Nakon što su stanice zasijane (zasijane) i pričvršćene (pričvršćene) na poroznu membranu PDMS-a na dan 0 (D0), apikalni (AP) protok se pokreće i održava prva 2 dana (protok, AP, D0-D2). Bazolateralni (BL) protok se također pokreće zajedno s cikličkim pokretima istezanja (istezanje, protok, AP i BL) kada se formira potpuni 2D monosloj. Crijevna 3D morfogeneza dogodila se spontano nakon 5 dana mikrofluidne kulture (morfogeneza, D5). Slike faznog kontrasta prikazuju reprezentativnu morfologiju Caco-2 stanica u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj točki (stupčasti grafikon, 100 µm). Četiri shematska dijagrama koji ilustriraju odgovarajuće kaskade morfogeneze crijeva (gore desno). Isprekidane strelice Na shematskom prikazu prikazan je smjer protoka tekućine.b, SEM slika koja prikazuje površinsku topologiju uspostavljenog 3D Caco-2 epitela (lijevo). Umetak koji ističe uvećano područje (bijeli isprekidani okvir) prikazuje regenerirane mikrovile na 3D Caco-2 sloju (desno).c, Horizontalni frontalni prikaz uspostavljenog Caco-2 3D, klaudina (ZO-1, crveno) i kontinuiranih membrana s četkastim rubom označenih F-aktinom (zeleno) i jezgara (plavo) Imunofluorescentna konfokalna vizualizacija epitelnih stanica na crijevnim čipovima. Strelice koje pokazuju na srednji shemu označavaju položaj žarišne ravnine za svaki konfokalni prikaz.d, Vremenski tijek morfoloških promjena u organoidima kultiviranim na čipu dobivenim faznokontrastnom mikroskopijom 3., 7., 9., 11. i 13. dana. Umetak (gore desno) prikazuje veliko povećanje prikazane slike.e, DIC fotomikrografija organoidnog 3D epitela uspostavljenog u crijevu na kriški snimljenoj 7. dana.f, Preklopljene imunofluorescentne slike koje prikazuju markere za matične stanice (LGR5; magenta), vrčaste stanice (MUC2; zelena), F-aktin (sivo) i jezgre (cijan) uzgojene na crijevnim čipovima 3 dana, odnosno (lijevo) i 13-dnevni (srednji) organoidi na epitelnom sloju. Vidi također Prošireni podaci Slika 3, koja ističe LGR5 signalizaciju bez MUC2 signalizacije. Fluorescentne slike koje prikazuju epitelnu mikrostrukturu (desno) 3D organoidnog epitela uspostavljenog u crijevima na čipu bojenjem plazma membrane bojom CellMask (desno) 13. dana kulture. Mjerilo je 50 μm osim ako nije drugačije navedeno.b Pretiskano uz dopuštenje iz reference.2. Oxford University Press; c Prilagođeno uz dopuštenje iz reference.2. Oxford University Press; e i f prilagođeno uz dopuštenje referencom.12 Pod Creative Commons licencom CC BY 4.0.
U crijevu na čipu potrebno je modificirati hidrofobnu površinu porozne PDMS membrane za uspješno premazivanje ECM-om. U ovom protokolu primjenjujemo dvije različite metode za modificiranje hidrofobnosti PDMS membrana. Za kultiviranje Caco-2 stanica, aktivacija površine samo UV/ozonskim tretmanom bila je dovoljna za smanjenje hidrofobnosti PDMS površine, premazivanje ECM-a i pričvršćivanje Caco-2 stanica na PDMS membranu. Međutim, mikrofluidna kultura organoidnog epitela zahtijeva kemijsku funkcionalizaciju površine kako bi se postiglo učinkovito taloženje ECM proteina sekvencijalnim nanošenjem polietilenimina (PEI) i glutaraldehida na PDMS mikrokanale. Nakon modifikacije površine, ECM proteini su taloženi kako bi prekrili funkcionaliziranu PDMS površinu, a zatim uvedeni u izolirani organoidni epitel. Nakon što su stanice pričvršćene, mikrofluidna stanična kultura započinje perfuzijom samo medija u gornji mikrokanal dok stanice ne formiraju potpuni monosloj, dok donji mikrokanal održava statičke uvjete. Ova optimizirana metoda za aktivaciju površine i premazivanje ECM-om omogućuje pričvršćivanje organoidnog epitela kako bi se inducirala 3D morfogeneza na PDMS površini.
Transwell kulture također zahtijevaju ECM premaz prije sijanja stanica; međutim, Transwell kulture ne zahtijevaju složene korake predobrade za aktiviranje površine poroznih umetaka. Za uzgoj Caco-2 stanica na Transwell umetcima, ECM premaz na poroznim umetcima ubrzava pričvršćivanje disociranih Caco-2 stanica (<1 sat) i stvaranje čvrste barijere spoja (<1-2 dana). Za uzgoj organoida na Transwell umetcima, izolirani organoidi se siju na umetke obložene ECM-om, pričvršćuju na površinu membrane (<3 sata) i održavaju dok organoidi ne formiraju potpuni monosloj s integritetom barijere. Transwell kulture se izvode na pločama s 24 jažice bez upotrebe hibridnih čipova.
In vitro 3D morfogeneza može se pokrenuti primjenom protoka tekućine na bazolateralni aspekt uspostavljenog epitelnog sloja. U crijevu na čipu, epitelna morfogeneza započela je kada je medij perfuziran u gornji i donji mikrokanal (slika 3a). Kao što je prethodno opisano, ključno je uvesti protok tekućine u donji (bazolateralni) odjeljak za kontinuirano uklanjanje usmjereno izlučenih inhibitora morfogena. Kako bismo osigurali dovoljno hranjivih tvari i seruma stanicama vezanim na porozne membrane i generirali luminalno smično naprezanje, obično primjenjujemo dvostruki protok u crijevu na čipu. U hibridnim čipovima, Transwell umetci koji sadrže epitelne monoslojeve umetnuti su u hibridne čipove. Zatim je medij nanesen ispod bazolateralne strane poroznog Transwell umetka kroz mikrokanal. Intestinalna morfogeneza dogodila se 3-5 dana nakon početka bazolateralnog protoka u obje platforme za kulturu.
Morfološke značajke mikroinženjerskih 3D epitelnih slojeva mogu se analizirati primjenom različitih modaliteta snimanja, uključujući fazno kontrastnu mikroskopiju, mikroskopiju s diferencijalnim interferentnim kontrastom (DIC), SEM ili imunofluorescentnu konfokalnu mikroskopiju (slike 3 i 4). Fazno kontrastno ili DIC snimanje može se lako izvesti u bilo kojem trenutku tijekom kulture kako bi se pratio oblik i izbočina 3D epitelnih slojeva. Zbog optičke transparentnosti PDMS i poliesterskih filmova, i platforma gut-on-a-chip i hibridna čip platforma mogu pružiti snimanje in situ u stvarnom vremenu bez potrebe za sekcioniranjem ili rastavljanjem uređaja. Prilikom izvođenja imunofluorescentnog snimanja (slike 1, 3c, f i 4b, c), stanice se obično fiksiraju s 4% (wt/vol) paraformaldehida (PFA), zatim Triton X-100 i 2% (wt/vol) goveđeg serumskog albumina (BSA), redom. Ovisno o vrsti stanice, mogu se koristiti različiti fiksativi, permeabilizatori i blokirajući agensi. Primarna antitijela usmjerena na stanicu ili regiju ovisnu o liniji. Markeri se koriste za isticanje stanica imobiliziranih in situ na čipu, nakon čega slijede sekundarna antitijela zajedno s kontrastnom bojom usmjerenom na jezgru (npr. 4',6-diamidino-2-fenilen)indol, DAPI) ili F-aktin (npr. fluorescentno obilježeni faloidin). Snimanje uživo temeljeno na fluorescenciji također se može izvesti in situ za otkrivanje proizvodnje sluzi (slika 1, „Diferencijacija stanica“ i „Fiziologija crijeva“), slučajne kolonizacije mikrobnih stanica (slika 1, „Kokultura domaćina i mikroba“), regrutiranja imunoloških stanica (slika 1, „Modeliranje bolesti“) ili kontura 3D epitelne morfologije (slika 3c, f i 4b, c). Prilikom modificiranja crijeva na čipu kako bi se odvojio gornji sloj od donjeg sloja mikrokanala, kao što je opisano u ref. Kao što je prikazano na slici 2, 3D epitelna morfologija, kao i mikrovili na apikalnom rubu četkice, mogu se vizualizirati SEM-om (slika 3b). Ekspresija Markeri diferencijacije mogu se procijeniti kvantitativnim PCR5 ili sekvenciranjem RNA pojedinačnih stanica. U ovom slučaju, 3D slojevi epitelnih stanica uzgojenih u crijevnim čipovima ili hibridnim čipovima sakupljaju se tripsinizacijom, a zatim koriste za molekularnu ili genetsku analizu.
a, Tijek rada za indukciju crijevne morfogeneze u hibridnom čipu. Caco-2 i crijevni organoidi koriste se u ovom protokolu za demonstraciju 3D morfogeneze na hibridnoj platformi čipa. Disocirane epitelne stanice zasijane su u pripremljene Transwell umetke (TW prep; vidi sliku ispod). Nakon što su stanice zasijane (seeded) i pričvršćene na poliesterske membrane u Transwell umetcima, sve stanice su uzgajane u statičkim uvjetima (TW culture). Nakon 7 dana, jedan Transwell umetak koji sadrži 2D monosloj epitelnih stanica integriran je u hibridni čip kako bi se uveo bazolateralni protok (Flow, BL), što je u konačnici dovelo do stvaranja 3D epitelnog sloja (morfogeneza). Fazno kontrastne mikrografije koje prikazuju morfološke značajke stanica epitela ljudskih organa dobivenih iz normalnog donora (linija C103) uzlaznog debelog crijeva u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj točki. Sheme u gornjim slojevima ilustriraju eksperimentalnu konfiguraciju za svaki korak.b, Hibridni čipovi (lijevi shematski prikaz) mogu dovesti do 3D morfogeneze organoidnih epitelnih stanica s konfokalnim mikroskopskim prikazima odozgo prema dolje snimljenim u različitim Z pozicije (gornji, srednji i donji; vidi desni shemu i odgovarajuće isprekidane linije). pokazale su očite morfološke karakteristike. F-aktin (cijan), jezgra (sivo).c, Fluorescentne konfokalne mikrografije (3D kutni pogled) epitelnih stanica izvedenih iz organoida kultiviranih u statičkom Transwellu (TW; umetak unutar bijelog isprekidanog okvira) u odnosu na hibridni čip (najveći puni snimak) uspoređujući 2D i 3D morfologiju. Par 2D vertikalnih poprečnih presjeka (umetak u gornjem desnom kutu; „XZ“) također prikazuje 2D i 3D značajke. Mjerilo, 100 µm.c Pretiskano uz dopuštenje iz reference.4. Elsevier.
Kontrole se mogu pripremiti uzgojem istih stanica (Caco-2 ili stanica intestinalnog organoidnog epitela) u dvodimenzionalne monoslojeve pod konvencionalnim uvjetima statičke kulture. Važno je napomenuti da iscrpljivanje hranjivih tvari može nastati zbog ograničenog volumenskog kapaciteta mikrokanala (tj. ~4 µL u gornjem kanalu na originalnom dizajnu crijevnog čipa). Stoga se može usporediti i morfologija epitela prije i nakon primjene bazolateralnog protoka.
Proces meke litografije treba izvoditi u čistoj sobi. Za svaki sloj na čipu (gornji i donji slojevi i membrane) i hibridnim čipovima korištene su različite fotomaske i izrađene na odvojenim silicijskim pločicama jer su visine mikrokanala bile različite. Ciljane visine gornjeg i donjeg mikrokanala crijeva na čipu su 500 µm odnosno 200 µm. Ciljana visina kanala hibridnog čipa je 200 µm.
Stavite 7,5 cm silikonsku pločicu u posudu s acetonom. Lagano vrtite ploču 30 sekundi, a zatim je osušite na zraku. Prebacite pločicu na ploču s IPA-om, a zatim je vrtite 30 sekundi da se očisti.
Otopina pirane (smjesa vodikovog peroksida i koncentrirane sumporne kiseline, 1:3 (vol/vol)) može se opcionalno koristiti za maksimalno uklanjanje organskih ostataka s površine silicijske pločice.
Otopina piranja je izuzetno korozivna i stvara toplinu. Potrebne su dodatne sigurnosne mjere. Za odlaganje otpada, pustite da se otopina ohladi i prebacite je u čistu, suhu posudu za otpad. Koristite sekundarne spremnike i pravilno označite spremnike za otpad. Za detaljnije postupke slijedite sigurnosne smjernice objekta.
Dehidrirajte oblatne tako da ih stavite na grijaću ploču od 200 °C tijekom 10 minuta. Nakon dehidracije, oblatna je pet puta protresena na zraku da se ohladi.
Ulijte ~10 g fotorezista SU-8 2100 na sredinu očišćene silicijske pločice. Pincetom ravnomjerno rasporedite fotorezist po pločici. Povremeno stavite pločicu na vruću ploču na 65°C kako bi fotorezist bio manje ljepljiv i lakše se razmazivao. Nemojte stavljati pločicu izravno na vruću ploču.
SU-8 je ravnomjerno raspoređen na pločici pokretanjem centrifugalnog premazivanja. Programirajte dolaznu rotaciju SU-8 tijekom 5-10 s da se širi pri 500 rpm uz ubrzanje od 100 rpm/s. Postavite glavnu rotaciju za oblikovanje debljine 200 µm pri 1500 rpm ili postignite debljinu od 250 µm (izrađujući visinu od 500 µm za gornji sloj crijeva na čipu; vidi "Kritični koraci" u nastavku) postavljenu na ubrzanje od 300 rpm/s 30 sekundi pri 1200 rpm.
Glavna brzina vrtnje može se podesiti prema ciljanoj debljini SU-8 uzorka na silicijskoj pločici.
Za izradu SU-8 uzoraka visine 500 µm za gornji sloj crijeva na čipu, koraci centrifugiranja i mekog pečenja ove kutije (koraci 7 i 8) sekvencijalno su ponovljeni (vidi korak 9) kako bi se dobila dva sloja SU-8 debljine 250 µm, koji se mogu slagati i spajati UV izlaganjem u koraku 12 ove kutije, čime se dobiva sloj visok 500 µm.
Meko pecite oblatne obložene SU-8 tako da ih pažljivo stavite na vruću ploču na 65 °C tijekom 5 minuta, zatim promijenite temperaturu na 95 °C i inkubirajte dodatnih 40 minuta.
Za postizanje visine SU-8 uzorka od 500 μm u gornjem mikrokanalu, ponovite korake 7 i 8 za generiranje dva SU-8 sloja debljine 250 μm.
Pomoću UV Mask Aligner-a provedite test lampe prema uputama proizvođača kako biste izračunali vrijeme ekspozicije pločice. (vrijeme ekspozicije, ms) = (doza ekspozicije, mJ/cm2) / (snaga lampe, mW/cm2).
Nakon određivanja vremena ekspozicije, postavite fotomask na držač maske UV poravnavača maski i postavite fotomask na SU-8 premazanu pločicu.
Postavite otisnutu površinu fotomaske izravno na stranu silicijske pločice obloženu SU-8 kako biste smanjili UV disperziju.
Izložite SU-8 premazanu pločicu i fotomasku vertikalno UV svjetlu od 260 mJ/cm2 tijekom unaprijed određenog vremena ekspozicije (vidi korak 10 ovog okvira).
Nakon izlaganja UV zračenju, silicijske pločice obložene SU-8 pečene su na 65°C tijekom 5 minuta i 95°C tijekom 15 minuta na svakoj vrućoj ploči kako bi se izradili uzorci visine 200 μm. Vrijeme naknadnog pečenja na 95°C produženo je na 30 minuta kako bi se izradili uzorci visine 500 µm.
Razvijač se ulije u staklenu posudu, a pečena oblatna se stavlja u posudu. Volumen razvijača SU-8 može varirati ovisno o veličini staklene ploče. Obavezno upotrijebite dovoljno razvijača SU-8 da biste potpuno uklonili neosvijetljeni SU-8. Na primjer, kada koristite staklenu posudu promjera 150 mm i kapaciteta 1 L, upotrijebite ~300 mL razvijača SU-8. Razvijajte kalup 25 minuta uz povremeno lagano okretanje.
Razvijeni kalup isperite s ~10 mL svježeg razvijača, a zatim IPA raspršivanjem otopine pipetom.
Stavite pločicu u plazma čistač i izložite kisikovoj plazmi (atmosferski plin, ciljani tlak 1 × 10−5 Torr, snaga 125 W) tijekom 1,5 min.
Stavite pločicu u vakuumski eksikator sa staklenim pločicom unutra. Pločice i pločice mogu se postaviti jedna pored druge. Ako je vakuumski eksikator podijeljen na nekoliko slojeva pločom, pločice stavite u donju komoru, a pločice u gornju komoru. Na staklenu pločicu ukapajte 100 μL otopine trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silana i primijenite vakuum za silanizaciju.
Odmrznite bočicu smrznutih Caco-2 stanica u vodenoj kupelji na 37 °C, a zatim odmrznute stanice prebacite u tikvicu T75 koja sadrži 15 mL prethodno zagrijanog Caco-2 medija na 37 °C.
Za prolazak Caco-2 stanica pri ~90% konfluencije, prvo zagrijte Caco-2 medij, PBS i 0,25% tripsina/1 mM EDTA u vodenoj kupelji na 37°C.
Aspirirajte medij vakuumskom aspiracijom. Isprati stanice dva puta s 5 mL toplog PBS-a ponavljanjem vakuumske aspiracije i dodavanjem svježeg PBS-a.