Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा CSS को लागि सीमित समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड बन्द गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट प्रदर्शन गर्नेछौं।
मानव आन्द्राको मोर्फोजेनेसिसले थ्रीडी एपिथेलियल माइक्रोआर्किटेक्चर र स्पेसियल संगठनको क्रिप्ट-भिलस विशेषताहरू स्थापित गर्दछ। यो अद्वितीय संरचना बेसल क्रिप्टमा स्टेम सेल आलालाई बाह्य माइक्रोबियल एन्टिजेनहरू र तिनीहरूका मेटाबोलाइटहरूबाट जोगाएर आन्द्राको होमियोस्टेसिस कायम राख्न आवश्यक छ। थप रूपमा, आन्द्राको भिल्ली र स्रावित म्यूकसले आन्द्राको म्यूकोसल सतहमा सुरक्षात्मक अवरोधको साथ कार्यात्मक रूपमा भिन्न उपकला कोशिकाहरू प्रस्तुत गर्दछ। त्यसकारण, इन भिट्रो पेट मोडेलहरूको निर्माणको लागि थ्रीडी एपिथेलियल संरचनाहरू पुन: सिर्जना गर्नु महत्त्वपूर्ण छ। उल्लेखनीय रूपमा, जैविक मिमेटिक गट-अन-ए-चिपले बढेको शारीरिक कार्यहरू र बायोमेकानिक्सको साथ आन्द्राको एपिथेलियलको सहज 3D मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्न सक्छ। यहाँ, हामी माइक्रोफ्लुइडिक चिप साथै ट्रान्सवेल एम्बेडेड हाइब्रिड चिपमा आन्द्रामा आन्द्राको मोर्फोजेनेसिसलाई बलियो रूपमा प्रेरित गर्न पुनरुत्पादनयोग्य प्रोटोकल प्रदान गर्दछौं। हामी उपकरण निर्माण, परम्परागत सेटिङहरूमा साथै माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफर्ममा क्याको-२ वा आन्द्राको अर्गानोइड उपकला कोशिकाहरूको संवर्धन, थ्रीडी मोर्फोजेनेसिसको प्रेरण, र स्थापितको विशेषताको लागि विस्तृत विधिहरू वर्णन गर्दछौं। धेरै इमेजिङ मोडालिटीहरू प्रयोग गरेर 3D एपिथेलिया। यो प्रोटोकलले 5 दिनको लागि बेसोलेटरल फ्लुइड प्रवाह नियन्त्रण गरेर कार्यात्मक आन्द्राको माइक्रोआर्किटेक्चरको पुनरुत्थान प्राप्त गर्दछ। हाम्रो इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस विधिले शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक कतरनी तनाव र मेकानिकल गति प्रयोग गर्दछ र जटिल सेल इन्जिनियरिङ वा हेरफेर आवश्यक पर्दैन, जसले अन्य अवस्थित प्रविधिहरूलाई उत्कृष्ट प्रदर्शन गर्न सक्छ। हामी कल्पना गर्छौं कि हाम्रो प्रस्तावित प्रोटोकलले बायोमेडिकल अनुसन्धान समुदायको लागि व्यापक प्रभाव पार्न सक्छ, बायोमेडिकल, क्लिनिकल, र औषधि अनुप्रयोगहरूको लागि भिट्रोमा 3D आन्द्राको उपकला तहहरू पुन: उत्पन्न गर्ने विधि प्रदान गर्दछ।
प्रयोगहरूले देखाउँछन् कि पेट-अन-ए-चिप१,२,३,४,५ वा द्विस्तरीय माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणहरू६,७ मा कल्चर गरिएका आन्द्राको उपकला Caco-२ कोशिकाहरू अन्तर्निहित संयन्त्रको स्पष्ट बुझाइ बिना नै इन भिट्रोमा सहज 3D मोर्फोजेनेसिसबाट गुज्रन सक्छन्। हाम्रो हालैको अध्ययनमा, हामीले पत्ता लगायौं कि कल्चर उपकरणहरूबाट बेसोलेटरली स्रावित मोर्फोजेन विरोधीहरूलाई हटाउनु आवश्यक छ र इन भिट्रोमा 3D उपकला मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्न पर्याप्त छ, जुन Caco-2 र बिरामी-व्युत्पन्न आन्द्राको अर्गानोइडहरू द्वारा प्रदर्शन गरिएको छ। उपकला कोषहरू प्रमाणित गरियो। यस अध्ययनमा, हामीले विशेष रूपमा शक्तिशाली Wnt विरोधी, Dickkopf-1 (DKK-1) को कोशिका उत्पादन र एकाग्रता वितरणमा ध्यान केन्द्रित गर्यौं, जसमा gut-on-a-chip र परिमार्जित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणहरू छन् जसमा "हाइब्रिड चिप" भनिन्छ। हामी प्रदर्शन गर्छौं कि अन-चिप पेटमा बाह्य Wnt विरोधीहरू (जस्तै DKK-1, Wnt रिप्रेसर 1, स्रावित फ्रिजल्ड-सम्बन्धित प्रोटीन 1, वा Soggy-1) को थपले morphogenesis लाई रोक्छ वा पूर्व-संरचित 3D उपकला तहलाई बाधा पुर्‍याउँछ, जसले सुझाव दिन्छ कि संस्कृतिको समयमा विरोधी तनाव भिट्रोमा आन्द्राको morphogenesis को लागि जिम्मेवार छ। त्यसकारण, उपकला इन्टरफेसमा बलियो morphogenesis प्राप्त गर्नको लागि एक व्यावहारिक दृष्टिकोण सक्रिय फ्लशिंग (जस्तै, gut-on-a-chip वा हाइब्रिड-on-a-chip प्लेटफर्महरूमा) वा प्रसार द्वारा basolateral कम्पार्टमेन्टमा Wnt विरोधीहरूको स्तर हटाउनु वा न्यूनतम रूपमा कायम राख्नु हो। Basolateral मिडिया (जस्तै, ठूला basolateral जलाशयहरूमा transwell entires बाट)। इनारहरूमा)।
यस प्रोटोकलमा, हामी पोलिडाइमिथाइलसिलोक्सेन (PDMS)-आधारित छिद्रपूर्ण झिल्लीहरू (चरणहरू 6A, 7A, 8, 9) वा ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूको पलिएस्टर झिल्लीहरू (चरणहरू 6B, 7B, 8, 9) र प्रेरित 3D मोर्फोजेनेसिस इन भिट्रो (चरण 10) मा आन्द्राको उपकला कोशिकाहरूलाई कल्चर गर्न गट-अन-ए-चिप माइक्रोडिभाइसेसहरू र ट्रान्सवेल-इन्सर्टेबल हाइब्रिड चिप्स (चरण 1-5) निर्माण गर्ने विस्तृत विधि प्रदान गर्दछौं। हामीले धेरै इमेजिङ मोडालिटीहरू (चरणहरू 11-24) लागू गरेर टिश्यू-विशिष्ट हिस्टोजेनेसिस र वंश-निर्भर सेलुलर भिन्नताको सूचक सेलुलर र आणविक सुविधाहरू पनि पहिचान गर्यौं। हामी मानव आन्द्राको उपकला कोशिकाहरू, जस्तै Caco-2 वा आन्द्राको अर्गानोइडहरू प्रयोग गरेर मोर्फोजेनेसिस प्रेरित गर्छौं, जसमा प्राविधिक विवरणहरू छन् जसमा छिद्रपूर्ण झिल्लीहरूको सतह परिमार्जन, 2D मोनोलेयरहरूको सिर्जना, र आन्द्राको जैव रासायनिक र बायोमेकानिकल माइक्रोइनभाइरमेन्टको प्रजनन समावेश छ। इन भिट्रो। 2D उपकला मोनोलेयरहरूबाट 3D मोर्फोजेनेसिस प्रेरित गर्न, हामीले मोर्फोजेन हटायौं। कल्चरको बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टमा माध्यम प्रवाह गरेर दुवै संवर्धित रूपहरूमा विरोधीहरू। अन्तमा, हामी पुन: उत्पन्न गर्न सकिने 3D एपिथेलियल तहको उपयोगिताको प्रतिनिधित्व प्रदान गर्दछौं जुन मोर्फोजेन-निर्भर एपिथेलियल वृद्धि, अनुदैर्ध्य होस्ट-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतिहरू, रोगजनक संक्रमण, सूजन चोट, एपिथेलियल अवरोध डिसफंक्शन, र प्रोबायोटिक-आधारित उपचारहरू मोडेल गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ। उदाहरण। प्रभावहरू।
हाम्रो प्रोटोकल आधारभूत (जस्तै, आन्द्राको म्यूकोसल जीवविज्ञान, स्टेम सेल जीवविज्ञान, र विकासात्मक जीवविज्ञान) र व्यावहारिक अनुसन्धान (जस्तै, प्रिक्लिनिकल औषधि परीक्षण, रोग मोडेलिङ, टिस्यु इन्जिनियरिङ, र ग्यास्ट्रोएन्टेरोलजी) व्यापक प्रभावका वैज्ञानिकहरूको विस्तृत दायराको लागि उपयोगी हुन सक्छ। इन भिट्रोमा आन्द्राको एपिथेलियमको 3D मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्न हाम्रो प्रोटोकलको पुनरुत्पादन क्षमता र बलियोपनको कारणले गर्दा, हामी कल्पना गर्छौं कि हाम्रो प्राविधिक रणनीति आन्द्राको विकास, पुनर्जनन वा होमियोस्टेसिसको समयमा कोशिका संकेतनको गतिशीलता अध्ययन गर्ने दर्शकहरूलाई प्रसारित गर्न सकिन्छ। थप रूपमा, हाम्रो प्रोटोकल नोरोभाइरस 8, गम्भीर तीव्र श्वसन सिन्ड्रोम कोरोनाभाइरस 2 (SARS-CoV-2), क्लोस्ट्रिडियम डिफिसाइल, साल्मोनेला टाइफिमुरियम 9 वा भिब्रिओ कोलेरा जस्ता विभिन्न संक्रामक एजेन्टहरू अन्तर्गत संक्रमणको सोधपुछ गर्न उपयोगी छ। रोग रोगविज्ञान र रोगजननका दर्शकहरू पनि उपयोगी छन्। अन-चिप पेट माइक्रोफिजियोलोजी प्रणालीको प्रयोगले अनुदैर्ध्य सह-संस्कृति १० र जठरांत्र (GI) पथ ११ मा होस्ट रक्षा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया र रोगजनक-सम्बन्धित चोट मर्मतको पछिल्ला मूल्याङ्कनलाई अनुमति दिन सक्छ। चुहावट पेट सिन्ड्रोम, सेलिआक रोग, क्रोहन रोग, अल्सरेटिभ कोलाइटिस, पाउचाइटिस, वा इरिटेबल बोवेल सिन्ड्रोमसँग सम्बन्धित अन्य GI विकारहरू बिरामीको 3D आन्द्राको उपकला तहहरू प्रयोग गरेर 3D आन्द्राको उपकला तहहरू तयार गर्दा सिमुलेट गर्न सकिन्छ। यी रोगहरूमा भिलस एट्रोफी, क्रिप्ट छोटो पार्ने, म्यूकोसल क्षति, वा बिग्रिएको उपकला अवरोध समावेश छ। बायोप्सी वा स्टेम सेल-व्युत्पन्न आन्द्राको अर्गानोइड्स12,13। रोग वातावरणको उच्च जटिलतालाई राम्रोसँग मोडेल गर्न, पाठकहरूले रोग-सम्बन्धित कोशिका प्रकारहरू, जस्तै बिरामी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाहरू (PBMCs) लाई 3D आन्द्राको भिलस-क्रिप्ट माइक्रोआर्किटेक्चरहरू भएको मोडेलहरूमा थप्ने विचार गर्न सक्छन्। टिश्यू-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाहरू, 5।
३D एपिथेलियल माइक्रोस्ट्रक्चरलाई सेक्शनिङ प्रक्रिया बिना नै फिक्स र भिजुअलाइज गर्न सकिने भएकोले, स्पेसियल ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र उच्च-रिजोल्युसन वा सुपर-रिजोल्युसन इमेजिङमा काम गर्ने दर्शकहरूलाई एपिथेलियल निचहरूमा जीन र प्रोटीनहरूको स्पेसियोटेम्पोरल गतिशीलताको हाम्रो म्यापिङमा रुचि हुन सक्छ। प्रविधिमा रुचि। माइक्रोबियल वा प्रतिरक्षा उत्तेजनाको प्रतिक्रिया। यसबाहेक, पेटको होमियोस्टेसिस समन्वय गर्ने अनुदैर्ध्य होस्ट-माइक्रोबायोम क्रसटलक १०, १४ लाई ३D आन्द्राको म्यूकोसल तहमा विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातिहरू, माइक्रोबियल समुदायहरू वा फेकल माइक्रोबायोटा, विशेष गरी पेट-अन-ए-चिपमा सह-संस्कृति गरेर स्थापित गर्न सकिन्छ। प्लेटफर्ममा। यो दृष्टिकोण प्रयोगशालामा पहिले असंस्कृत पेट माइक्रोबायोटा खेती गर्न खोज्ने म्यूकोसल इम्युनोलोजी, ग्यास्ट्रोएन्टेरोलजी, मानव माइक्रोबायोम, कल्चुरोमिक्स र क्लिनिकल माइक्रोबायोलोजी अध्ययन गर्ने दर्शकहरूका लागि विशेष रूपमा आकर्षक छ। यदि हाम्रो इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस प्रोटोकललाई स्केलेबल कल्चर ढाँचाहरूमा अनुकूलित गर्न सकिन्छ, जस्तै २४, ९६ वा ३८४ कुवा प्लेटहरूमा मल्टिवेल इन्सर्टहरू जसले निरन्तर बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टहरू भर्दछ, प्रोटोकललाई औषधि, बायोमेडिकल वा खाद्य उद्योगको लागि उच्च-थ्रुपुट स्क्रिनिङ वा प्रमाणीकरण प्लेटफर्महरू विकास गर्नेहरूलाई पनि प्रसारित गर्न सकिन्छ। सिद्धान्तको प्रमाणको रूपमा, हामीले हालसालै २४-कुवा प्लेट ढाँचामा स्केलेबल मल्टिप्लेक्स उच्च-थ्रुपुट मोर्फोजेनेसिस प्रणालीको सम्भाव्यता प्रदर्शन गर्यौं। थप रूपमा, धेरै अंग-अन-ए-चिप उत्पादनहरू व्यावसायीकरण गरिएको छ16,17,18।त्यसकारण, हाम्रो इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस विधिको प्रमाणीकरणलाई तीव्र बनाउन सकिन्छ र धेरै अनुसन्धान प्रयोगशालाहरू, उद्योग वा सरकार र नियामक एजेन्सीहरूले ट्रान्सक्रिप्टोमिक स्तरमा इन भिट्रो पेट मोर्फोजेनेसिसको सेलुलर पुन: प्रोग्रामिङ बुझ्नको लागि सम्भावित रूपमा अपनाउन सकिन्छ। औषधि वा बायोथेराप्यूटिक्स औषधि उम्मेदवारहरूको अवशोषण र ढुवानी 3D पेट सरोगेटहरू प्रयोग गरेर वा पेटको मोर्फोजेनेसिस प्रक्रियाको पुनरुत्पादन क्षमता मूल्याङ्कन गर्न अनुकूलन वा व्यावसायिक अंग-अन-ए-चिप मोडेलहरू प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
आन्द्राको उपकला मोर्फोजेनेसिस अध्ययन गर्न सीमित संख्यामा मानव-सम्बन्धित प्रयोगात्मक मोडेलहरू प्रयोग गरिएको छ, मुख्यतया भिट्रोमा 3D मोर्फोजेनेसिस प्रेरित गर्न कार्यान्वयनयोग्य प्रोटोकलहरूको अभावको कारणले। वास्तवमा, आन्द्राको मोर्फोजेनेसिसको बारेमा हालको धेरैजसो ज्ञान जनावर अध्ययनहरूमा आधारित छ (जस्तै, जेब्राफिश20, मुसा21 वा कुखुरा22)। यद्यपि, तिनीहरू श्रम- र लागत-गहन छन्, नैतिक रूपमा शंकास्पद हुन सक्छन्, र सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा, मानव विकास प्रक्रियाहरू निश्चित रूपमा निर्धारण गर्दैनन्। यी मोडेलहरू बहु-तरिका स्केलेबल तरिकामा परीक्षण गर्ने क्षमतामा पनि धेरै सीमित छन्। त्यसकारण, भिट्रोमा 3D टिस्यु संरचनाहरू पुन: उत्पन्न गर्ने हाम्रो प्रोटोकलले भिभो पशु मोडेलहरू साथै अन्य परम्परागत स्थिर 2D सेल संस्कृति मोडेलहरूमा उत्कृष्ट प्रदर्शन गर्दछ। पहिले वर्णन गरिएझैं, 3D एपिथेलियल संरचनाहरूको प्रयोगले हामीलाई विभिन्न म्यूकोसल वा प्रतिरक्षा उत्तेजनाहरूको प्रतिक्रियामा क्रिप्ट-भिलस अक्षमा विभेदित कोशिकाहरूको स्थानिक स्थानीयकरणको जाँच गर्न अनुमति दियो। 3D उपकला तहहरूले माइक्रोबियल कोशिकाहरूले होस्ट कारकहरूको प्रतिक्रियामा स्थानिक आलाहरू र पारिस्थितिक विकास कसरी प्रतिस्पर्धा गर्छन् भनेर अध्ययन गर्न ठाउँ प्रदान गर्न सक्छ (जस्तै, भित्री बनाम बाहिरी म्यूकस तहहरू, को स्राव)। IgA र एन्टिमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स)। यसबाहेक, 3D एपिथेलियल मोर्फोलजीले हामीलाई कसरी पेटको माइक्रोबायोटाले आफ्नो समुदायहरूलाई संरचना गर्छ र synergistically माइक्रोबियल मेटाबोलाइटहरू (जस्तै, छोटो-श्रृंखला फ्याटी एसिड) उत्पादन गर्छ भनेर बुझ्न अनुमति दिन सक्छ जसले बेसल क्रिप्टहरूमा सेलुलर संगठन र स्टेम सेल निचहरूलाई आकार दिन्छ। यी सुविधाहरू केवल तब मात्र प्रदर्शन गर्न सकिन्छ जब 3D एपिथेलियल तहहरू इन भिट्रोमा स्थापित हुन्छन्।
3D आन्द्राको उपकला संरचनाहरू सिर्जना गर्ने हाम्रो विधिको अतिरिक्त, धेरै इन भिट्रो विधिहरू छन्।आन्द्राको अर्गानोइड कल्चर एक अत्याधुनिक टिस्यु इन्जिनियरिङ प्रविधि हो जुन विशिष्ट मोर्फोजेन अवस्थाहरू अन्तर्गत आन्द्राको स्टेम सेलहरूको खेतीमा आधारित छ23,24,25। यद्यपि, यातायात विश्लेषण वा होस्ट-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतिहरूको लागि 3D अर्गानोइड मोडेलहरूको प्रयोग प्रायः चुनौतीपूर्ण हुन्छ किनभने आन्द्राको लुमेन अर्गानोइड भित्र बन्द हुन्छ र त्यसैले, माइक्रोबियल कोशिकाहरू वा एक्सोजेनस एन्टिजेनहरू जस्ता ल्युमिनल घटकहरूको परिचय सीमित हुन्छ। माइक्रोइन्जेक्टर प्रयोग गरेर अर्गानोइड लुमेनहरूमा पहुँच सुधार गर्न सकिन्छ,26,27 तर यो विधि आक्रामक र श्रम-गहन छ र प्रदर्शन गर्न विशेष ज्ञान आवश्यक पर्दछ। यसबाहेक, स्थिर अवस्थाहरूमा हाइड्रोजेल स्क्याफोल्डहरूमा राखिएका परम्परागत अर्गानोइड कल्चरहरूले भिभो बायोमेकानिक्समा सक्रिय रूपमा प्रतिबिम्बित गर्दैनन्।
धेरै अनुसन्धान समूहहरूद्वारा प्रयोग गरिएका अन्य दृष्टिकोणहरूले जेल सतहमा पृथक मानव आन्द्रा कोषहरूलाई संवर्धन गरेर आन्द्राको उपकला संरचनाको नक्कल गर्न पूर्व-संरचित 3D हाइड्रोजेल स्क्याफोल्डहरू प्रयोग गर्छन्। 3D-प्रिन्टेड, माइक्रो-मिल्ड, वा लिथोग्राफिक रूपमा निर्मित मोल्डहरू प्रयोग गरेर हाइड्रोजेल स्क्याफोल्डहरू बनाउनुहोस्। यो विधिले शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक मोर्फोजेन ग्रेडियन्टहरूसँग भिट्रोमा पृथक उपकला कोषहरूको स्व-व्यवस्थित व्यवस्था देखाउँछ, स्क्याफोल्डमा स्ट्रोमल कोषहरू समावेश गरेर उच्च पक्ष अनुपात उपकला संरचना र स्ट्रोमा-उपग्रह क्रसटलक स्थापना गर्दछ। यद्यपि, पूर्व-संरचित स्क्याफोल्डहरूको प्रकृतिले सहज मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाको प्रदर्शनलाई रोक्न सक्छ। यी मोडेलहरूले गतिशील ल्युमिनल वा इन्टरस्टिशियल प्रवाह पनि प्रदान गर्दैनन्, आन्द्रा कोषहरूलाई मोर्फोजेनेसिसबाट गुज्रन र शारीरिक कार्य प्राप्त गर्न आवश्यक पर्ने तरल कतरनी तनावको अभाव छ। अर्को हालैको अध्ययनले माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफर्ममा हाइड्रोजेल स्क्याफोल्डहरू र लेजर-एचिंग प्रविधिहरू प्रयोग गरेर ढाँचाबद्ध आन्द्रा उपकला संरचनाहरू प्रयोग गर्‍यो। माउस आन्द्राका अर्गानोइडहरूले आन्द्राको ट्यूबलर संरचनाहरू बनाउनको लागि नक्काशी गरिएका ढाँचाहरू पछ्याउँछन्, र इन्ट्राल्युमिनल तरल पदार्थ प्रवाहलाई माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग गरेर पुन: प्राप्त गर्न सकिन्छ। मोड्युल। यद्यपि, यो मोडेलले न त सहज मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाहरू प्रदर्शन गर्दछ न त आन्द्राको मेकानोबायोलोजिकल चालहरू समावेश गर्दछ। एउटै समूहका थ्रीडी प्रिन्टिङ प्रविधिहरूले सहज मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाहरू भएका लघु आन्द्राको ट्यूबहरू सिर्जना गर्न सक्षम थिए। ट्यूब भित्र विभिन्न आन्द्रा खण्डहरूको जटिल निर्माणको बावजुद, यो मोडेलमा ल्युमिनल फ्लुइड प्रवाह र मेकानिकल विकृतिको पनि अभाव छ। थप रूपमा, मोडेल सञ्चालन सीमित हुन सक्छ, विशेष गरी बायोप्रिन्टिङ प्रक्रिया पूरा भएपछि, प्रयोगात्मक अवस्थाहरू वा सेल-टू-सेल अन्तरक्रियाहरूलाई बाधा पुर्‍याउँछ। यसको सट्टा, हाम्रो प्रस्तावित प्रोटोकलले सहज आन्द्राको मोर्फोजेनेसिस, शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक कतरनी तनाव, आन्द्राको गतिशीलताको नक्कल गर्ने बायोमेकानिक्स, स्वतन्त्र एपिकल र बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टहरूको पहुँच, र मोड्युलरिटीको जटिल जैविक सूक्ष्म वातावरणहरूको पुन: सिर्जना प्रदान गर्दछ। त्यसकारण, हाम्रो इन भिट्रो थ्रीडी मोर्फोजेनेसिस प्रोटोकलले अवस्थित विधिहरूको चुनौतीहरू पार गर्न पूरक दृष्टिकोण प्रदान गर्न सक्छ।
हाम्रो प्रोटोकल पूर्ण रूपमा 3D एपिथेलियल मोर्फोजेनेसिसमा केन्द्रित छ, जसमा कल्चरमा केवल एपिथेलियल कोशिकाहरू मात्र छन् र मेसेन्काइमल कोशिकाहरू, एन्डोथेलियल कोशिकाहरू, र प्रतिरक्षा कोशिकाहरू जस्ता वरपरका कोशिकाहरूका अन्य प्रकारहरू छैनन्। पहिले वर्णन गरिएझैं, हाम्रो प्रोटोकलको मूल परिचय गरिएको माध्यमको बेसोलेटरल छेउमा स्रावित मोर्फोजेन अवरोधकहरू हटाएर एपिथेलियल मोर्फोजेनेसिसको प्रेरण हो। हाम्रो पेट-अन-ए-चिप र हाइब्रिड-अन-ए-चिपको बलियो मोड्युलारिटीले हामीलाई अनडुलेटिंग 3D एपिथेलियल तह पुन: सिर्जना गर्न अनुमति दिन्छ, एपिथेलियल-मेसेन्काइमल अन्तरक्रियाहरू जस्ता अतिरिक्त जैविक जटिलताहरू33,34, एक्स्ट्रासेलुलर म्याट्रिक्स (ECM) निक्षेपण 35 र, हाम्रो मोडेलमा, बेसल क्रिप्टहरूमा स्टेम सेल निचहरू व्यक्त गर्ने क्रिप्ट-भिलस सुविधाहरूलाई थप विचार गर्न बाँकी छ। मेसेन्काइममा स्ट्रोमल कोशिकाहरू (जस्तै, फाइब्रोब्लास्टहरू) ले VIVO35,37,38 मा ECM प्रोटीनहरूको उत्पादन र आन्द्राको मोर्फोजेनेसिसको नियमनमा प्रमुख भूमिका खेल्छन्। हाम्रो मोडेलमा मेसेन्काइमल कोशिकाहरूको थपले बढायो मोर्फोजेनेटिक प्रक्रिया र कोशिका संलग्नता दक्षता। एन्डोथेलियल तह (अर्थात्, केशिका वा लिम्फ्याटिक्स) ले आन्द्राको सूक्ष्म वातावरणमा आणविक परिवहन39 र प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती40 लाई नियमन गर्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। यसबाहेक, टिस्यु मोडेलहरू बहु-अंग अन्तरक्रियाहरू प्रदर्शन गर्न डिजाइन गरिएको बेला टिस्यु मोडेलहरू बीच जडान गर्न सकिने भास्कुलेचर घटकहरू एक पूर्व शर्त हुन्। त्यसकारण, अंग-स्तर रिजोल्युसनको साथ थप सटीक शारीरिक सुविधाहरू मोडेल गर्न एन्डोथेलियल कोशिकाहरू समावेश गर्न आवश्यक पर्दछ। बिरामी-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाहरू आन्द्राको रोगको नक्कल गर्ने सन्दर्भमा जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरू, एन्टिजेन प्रस्तुतीकरण, जन्मजात अनुकूली प्रतिरक्षा क्रसटलक, र तन्तु-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रदर्शन गर्न पनि आवश्यक छन्।
हाइब्रिड चिप्सको प्रयोग गट-अन-ए-चिप भन्दा बढी सीधा छ किनभने उपकरण सेटअप सरल छ र ट्रान्सवेल इन्सर्टको प्रयोगले गट एपिथेलियमको स्केलेबल कल्चरको लागि अनुमति दिन्छ। यद्यपि, पलिएस्टर झिल्लीहरू भएका व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू लोचदार हुँदैनन् र पेरिस्टाल्टिक-जस्तो चालहरूको नक्कल गर्न सक्दैनन्। यसबाहेक, हाइब्रिड चिपमा राखिएको ट्रान्सवेल इन्सर्टको एपिकल डिब्बा एपिकल साइडमा कुनै शियर स्ट्रेस बिना स्थिर रह्यो। स्पष्ट रूपमा, एपिकल डिब्बामा स्थिर गुणहरूले हाइब्रिड चिप्समा दीर्घकालीन ब्याक्टेरिया सह-संस्कृतिलाई विरलै सक्षम बनाउँछ। हाइब्रिड चिप्स प्रयोग गर्दा हामी ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा 3D मोर्फोजेनेसिसलाई बलियो रूपमा प्रेरित गर्न सक्छौं, शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक बायोमेकानिक्स र एपिकल फ्लुइड प्रवाहको अभावले सम्भावित अनुप्रयोगहरूको लागि हाइब्रिड चिप प्लेटफर्महरूको सम्भाव्यतालाई सीमित गर्न सक्छ।
मानव क्रिप्ट-भिलस अक्षको पूर्ण-स्तरीय पुनर्निर्माणहरू गट-अन-ए-चिप र हाइब्रिड-अन-ए-चिप संस्कृतिहरूमा पूर्ण-स्तरीय पुनर्निर्माणहरू पूर्ण रूपमा स्थापित भएका छैनन्। मोर्फोजेनेसिस एपिथेलियल मोनोलेयरबाट सुरु हुने भएकोले, 3D माइक्रोआर्किटेक्चरहरूले क्रिप्टहरूमा भिभोसँग रूपात्मक समानता प्रदान गर्दैनन्। यद्यपि हामीले माइक्रोइन्जिनियर गरिएको 3D एपिथेलियममा बेसल क्रिप्ट डोमेन नजिकै फैलिएको कोशिका जनसंख्यालाई चित्रण गर्यौं, क्रिप्ट र भिलस क्षेत्रहरू स्पष्ट रूपमा सीमांकित थिएनन्। यद्यपि चिपमा उच्च माथिल्लो च्यानलहरूले माइक्रोइन्जिनियर गरिएको एपिथेलियमको उचाइ बढाउँछन्, अधिकतम उचाइ अझै पनि ~300-400 µm मा सीमित छ।साना र ठूला आन्द्रामा मानव आन्द्राको क्रिप्टहरूको वास्तविक गहिराई क्रमशः ~135 µm र ~400 µm हो, र सानो आन्द्राको भिल्लीको उचाइ ~600 µm41 हो।
इमेजिङको दृष्टिकोणबाट, थ्रीडी माइक्रोआर्किटेक्चरको इन सिटू सुपर-रिजोल्युसन इमेजिङ चिपमा रहेको पेटमा सीमित हुन सक्छ, किनकि वस्तुगत लेन्सबाट उपकला तहसम्म आवश्यक कार्य दूरी केही मिलिमिटरको क्रममा हुन्छ। यो समस्यालाई पार गर्न, टाढाको वस्तुगत आवश्यक पर्न सक्छ। यसबाहेक, PDMS को उच्च लोचको कारणले गर्दा इमेजिङ नमूना तयारीको लागि पातलो खण्डहरू बनाउनु चुनौतीपूर्ण छ। यसबाहेक, चिपमा पेटको तह-दर-तह माइक्रोफ्याब्रिकेसनमा प्रत्येक तह बीच स्थायी आसंजन समावेश भएको हुनाले, उपकला तहको सतह संरचना जाँच गर्न माथिल्लो तह खोल्न वा हटाउन अत्यन्तै चुनौतीपूर्ण छ। उदाहरणका लागि, स्क्यानिङ इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (SEM) प्रयोग गरेर।
हाइड्रोफोबिक साना अणुहरूसँग सम्बन्धित माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित अध्ययनहरूमा PDMS को हाइड्रोफोबिसिटी एक सीमित कारक भएको छ, किनकि PDMS ले त्यस्ता हाइड्रोफोबिक अणुहरूलाई गैर-विशेष रूपमा सोस्न सक्छ। PDMS को विकल्पहरू अन्य पोलिमरिक सामग्रीहरूसँग विचार गर्न सकिन्छ। वैकल्पिक रूपमा, PDMS को सतह परिमार्जन (जस्तै, लिपोफिलिक सामग्री 42 वा पोली (इथिलीन ग्लाइकोल) 43) लाई हाइड्रोफोबिक अणुहरूको सोस्न कम गर्न विचार गर्न सकिन्छ।
अन्तमा, हाम्रो विधिलाई उच्च-थ्रुपुट स्क्रिनिङ वा "एक-आकार-फिट-सबै" प्रयोगकर्ता-अनुकूल प्रयोगात्मक प्लेटफर्म प्रदान गर्ने सन्दर्भमा राम्रोसँग चित्रण गरिएको छैन। हालको प्रोटोकललाई प्रति माइक्रोडिभाइस सिरिन्ज पम्प चाहिन्छ, जसले CO2 इन्क्यूबेटरमा ठाउँ लिन्छ र ठूला-ठूला प्रयोगहरूलाई रोक्छ। यो सीमालाई नवीन संस्कृति ढाँचाहरूको स्केलेबिलिटी (जस्तै, २४-वेल, ९६-वेल, वा ३८४-वेल पोरस इन्सर्टहरू जसले निरन्तर पुनःपूर्ति र बेसोलेटरल मिडिया हटाउन अनुमति दिन्छ) द्वारा उल्लेखनीय रूपमा सुधार गर्न सकिन्छ।
मानव आन्द्राको एपिथेलियमको भिट्रोमा 3D मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्न, हामीले लुमेन-केशिका इन्टरफेस सिर्जना गर्न दुई समानान्तर माइक्रोच्यानलहरू र बीचमा एक लोचदार छिद्रपूर्ण झिल्ली भएको माइक्रोफ्लुइडिक चिप आन्द्राको उपकरण प्रयोग गर्यौं। हामी ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा बढेको ध्रुवीकृत एपिथेलियम तहहरू मुनि निरन्तर बेसोलेटरल प्रवाह प्रदान गर्ने एकल-च्यानल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण (एक हाइब्रिड चिप) को प्रयोग पनि प्रदर्शन गर्छौं। दुबै प्लेटफर्महरूमा, विभिन्न मानव आन्द्राको एपिथेलियम कोशिकाहरूको मोर्फोजेनेसिस बेसोलेटरल कम्पार्टमेन्टबाट मोर्फोजेन विरोधीहरू हटाउन प्रवाहको दिशात्मक हेरफेर लागू गरेर प्रदर्शन गर्न सकिन्छ। सम्पूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया (चित्र १) मा पाँच भागहरू हुन्छन्: (i) पेट चिप वा ट्रान्सवेल इन्सर्टेबल हाइब्रिड चिपको माइक्रोफ्याब्रिकेशन (चरण १-५; बक्स १), (ii) आन्द्राको एपिथेलियम कोशिकाहरू (काको-२ कोशिकाहरू) वा मानव आन्द्राको अर्गानोइडहरूको तयारी; बक्स २-५), (iii) आन्द्राको चिप्स वा हाइब्रिड चिप्समा आन्द्राको उपकला कोषहरूको संस्कृति (चरण ६-९), (iv) ३D उपकला माइक्रोस्ट्रक्चर (चरण ११-२४) लाई चित्रण गर्न इन भिट्रोमा ३D मोर्फोजेनेसिस (चरण १०) र (v) को प्रेरण। अन्तमा, उपकला मोर्फोजेनेसिसलाई स्थानिय, अस्थायी, सर्तगत, वा प्रक्रियागत नियन्त्रणहरूसँग तुलना गरेर इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिसको प्रभावकारिता प्रमाणित गर्न उपयुक्त नियन्त्रण समूह (तल थप छलफल गरिएको) डिजाइन गरिएको थियो।
हामीले दुई फरक कल्चर प्लेटफर्महरू प्रयोग गर्यौं: सिधा च्यानलहरू वा ननलाइनर कन्भोलुटेड च्यानलहरू भएको पेट-अन-ए-चिप, वा माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणमा ट्रान्सवेल (TW) इन्सर्टहरू भएको हाइब्रिड चिपहरू, बक्स १ र चरण १-५ मा वर्णन गरिए अनुसार बनाइएको। "उपकरण निर्माण" ले एकल चिप वा हाइब्रिड चिप बनाउने मुख्य चरणहरू देखाउँछ।" मानव आन्द्राको उपकला कोषहरूको संस्कृति" ले यस प्रोटोकलमा प्रयोग गरिएको कोष स्रोत (काको-२ वा मानव आन्द्राको अर्गानोइडहरू) र संस्कृति प्रक्रियाको व्याख्या गर्दछ।" इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस" ले समग्र चरणहरू देखाउँछ जसमा क्याको-२ वा अर्गानोइड-व्युत्पन्न उपकला कोषहरू आन्द्राको चिपमा वा हाइब्रिड चिपको ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा कल्चर गरिन्छ, त्यसपछि 3D मोर्फोजेनेसिसको प्रेरण र एक विशेषतायुक्त उपकला संरचनाको गठन हुन्छ। कार्यक्रम चरण नम्बर वा बक्स नम्बर प्रत्येक तीर तल प्रदर्शित हुन्छ। अनुप्रयोगले स्थापित आन्द्राको उपकला तहहरू कसरी प्रयोग गर्न सकिन्छ भन्ने उदाहरणहरू प्रदान गर्दछ, उदाहरणका लागि, कोशिका भिन्नता विशेषताकरण, पेटको शरीर विज्ञान अध्ययन, होस्ट-माइक्रोबायोम इकोसिस्टमको स्थापना, र रोग मोडेलिङमा। इम्युनोफ्लोरेसेन्स छविहरू "कोष भिन्नता" मा आन्द्राको चिपमा उत्पन्न हुने ३D Caco-२ उपकला तहमा व्यक्त गरिएको न्यूक्ली, F-एक्टिन र MUC2 देखाइएको छ। MUC2 सिग्नलिङ गोब्लेट कोषहरू र म्यूकोसल सतहहरूबाट स्रावित म्यूकसमा उपस्थित छ। आन्द्राको फिजियोलोजीमा फ्लोरोसेन्ट छविहरूले फ्लोरोसेन्ट गहुँको कीटाणु एग्ग्लुटिनिन प्रयोग गरेर सियालिक एसिड र N-एसिटिलग्लुकोसामाइन अवशेषहरूको लागि दाग लगाएर उत्पादित म्यूकस देखाउँछन्। "होस्ट-माइक्रोब को-कल्चर" मा दुई ओभरल्यापिङ छविहरूले चिपमा आन्द्रामा प्रतिनिधि होस्ट-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतिहरू देखाउँछन्। बायाँ प्यानलले माइक्रोइन्जिनियर गरिएको ३D Caco-२ उपकला कोषहरूसँग हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (GFP) व्यक्त गर्ने E. coli को सह-संस्कृति देखाउँछ। दायाँ प्यानलले ३D Caco-२ उपकला कोषहरूसँग सह-संस्कृत GFP E. coli को स्थानीयकरण देखाउँछ, त्यसपछि F-एक्टिन (रातो) र न्यूक्ली (नीलो) सँग इम्युनोफ्लोरेसेन्स स्टेनिङ देखाउँछ। रोग मोडेलिङले ब्याक्टेरिया एन्टिजेनहरू (जस्तै, लिपोपोलिसेकेराइड, LPS) र प्रतिरक्षाको साथ शारीरिक चुनौती अन्तर्गत आन्द्राको सूजन चिपहरूमा स्वस्थ बनाम चुहावट भएको आन्द्रालाई चित्रण गर्दछ। कोषहरू (जस्तै, PBMC; हरियो)। Caco-2 कोषहरूलाई 3D उपकला तह स्थापना गर्न कल्चर गरिएको थियो।स्केल बार, 50 µm।तलको पङ्क्तिमा छविहरू: "कोषहरूको भिन्नता" सन्दर्भबाट अनुमति लिएर अनुकूलित।2. अक्सफोर्ड युनिभर्सिटी प्रेस; सन्दर्भबाट अनुमति लिएर पुनरुत्पादित।5. NAS; "होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृति" सन्दर्भबाट अनुमति लिएर अनुकूलित।3. NAS; "रोग मोडेलिङ" सन्दर्भबाट अनुमति लिएर अनुकूलित।5. NAS।
दुवै गट-अन-चिप र हाइब्रिड चिपहरू PDMS प्रतिकृतिहरू प्रयोग गरेर बनाइएका थिए जुन सिलिकन मोल्डहरूबाट नरम लिथोग्राफी १,४४ द्वारा डिमोल्ड गरिएको थियो र SU-८ सँग ढाँचा गरिएको थियो। प्रत्येक चिपमा माइक्रोच्यानलहरूको डिजाइन कतरनी तनाव र हाइड्रोडायनामिक दबाव १,४,१२ जस्ता हाइड्रोडायनामिक्सलाई विचार गरेर निर्धारण गरिन्छ। मूल गट-अन-ए-चिप डिजाइन (विस्तारित डेटा चित्र १a), जसमा दुईवटा जोडिएको समानान्तर सीधा माइक्रोच्यानलहरू थिए, एक जटिल गट-अन-ए-चिप (विस्तारित डेटा चित्र १b) मा विकसित भएको छ जसमा बढेको तरल पदार्थ निवास समय, गैर-रेखीय प्रवाह ढाँचाहरू, र संवर्धित कोशिकाहरूको बहु-अक्षीय विकृतिलाई प्रेरित गर्न घुमाउरो माइक्रोच्यानलहरूको जोडी समावेश छ (चित्र २a–f) १२। जब थप जटिल गट बायोमेकानिक्स पुन: सिर्जना गर्न आवश्यक हुन्छ, जटिल गट-अन-ए-चिपहरू छनौट गर्न सकिन्छ। हामीले प्रदर्शन गरेका छौं कि कन्भोलुटेड गट-चिपले समान डिग्रीको उपकला वृद्धिको साथ समान समय फ्रेममा 3D मोर्फोजेनेसिसलाई पनि दृढतापूर्वक प्रेरित गर्दछ। मूल गट-चिपको तुलनामा, कल्चर्ड सेल प्रकारलाई ध्यान नदिई। त्यसकारण, 3D मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्न, रेखीय र जटिल अन-चिप पेट डिजाइनहरू आदानप्रदान गर्न सकिन्छ। SU-8 ढाँचाहरूसँग सिलिकन मोल्डहरूमा निको पारिएका PDMS प्रतिकृतिहरूले डिमोल्डिङ पछि नकारात्मक सुविधाहरू प्रदान गरे (चित्र 2a)। चिपमा पेटलाई निर्माण गर्न, तयार गरिएको माथिल्लो PDMS तहलाई क्रमिक रूपमा छिद्रपूर्ण PDMS फिल्ममा बाँधिएको थियो र त्यसपछि कोरोना ट्रीटर (चित्र 2b-f) प्रयोग गरेर अपरिवर्तनीय बन्धनद्वारा तल्लो PDMS तहसँग पङ्क्तिबद्ध गरिएको थियो। हाइब्रिड चिपहरू निर्माण गर्न, ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू समायोजन गर्न सक्ने एकल-च्यानल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणहरू सिर्जना गर्न निको पारिएका PDMS प्रतिकृतिहरूलाई गिलास स्लाइडहरूमा बाँधिएको थियो (चित्र 2h र विस्तारित डेटा चित्र 2)। बन्धन प्रक्रिया PDMS प्रतिकृति र गिलासको सतहहरूलाई अक्सिजन प्लाज्मा वा कोरोना उपचारको साथ उपचार गरेर गरिन्छ। सिलिकन ट्यूबमा जोडिएको माइक्रोफेब्रिकेटेड उपकरणको नसबंदी पछि, उपकरण सेटअप आन्द्राको एपिथेलियमको 3D मोर्फोजेनेसिस गर्न तयार थियो (चित्र 2g)।
a, SU-8 ढाँचाको सिलिकन मोल्डबाट PDMS भागहरूको तयारीको योजनाबद्ध चित्रण। नखुलाइएका PDMS घोललाई सिलिकन मोल्ड (बायाँ) मा खन्याइएको थियो, ६० °C (मध्य) मा निको पारिएको थियो र (दायाँ) डिमोल्ड गरिएको थियो। डिमोल्ड गरिएको PDMS टुक्राहरूमा काटिएको थियो र थप प्रयोगको लागि सफा गरिएको थियो।b, PDMS माथिल्लो तह तयार गर्न प्रयोग गरिएको सिलिकन मोल्डको तस्बिर।c, PDMS छिद्रपूर्ण झिल्ली बनाउन प्रयोग गरिएको सिलिकन मोल्डको तस्बिर।d, माथिल्लो र तल्लो PDMS कम्पोनेन्टहरू र भेला गरिएको अन-चिप आन्द्राको उपकरणको तस्बिरहरूको श्रृंखला।e, माथिल्लो, झिल्ली, र तल्लो PDMS कम्पोनेन्टहरूको पङ्क्तिबद्धताको योजनाबद्ध।प्रत्येक तह प्लाज्मा वा कोरोना उपचारद्वारा अपरिवर्तनीय रूपमा बाँधिएको छ।f, सुपरइम्पोज्ड कन्भोलुटेड माइक्रोच्यानलहरू र भ्याकुम चेम्बरहरू सहितको बनावटी पेट-अन-ए-चिप उपकरणको योजनाबद्ध।g, माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चरको लागि पेट-अन-ए-चिपको सेटअप। सिलिकन ट्यूब र सिरिन्जसँग भेला गरिएको चिपमा बनावटी पेट कभरस्लिपमा राखिएको थियो। चिप उपकरणमा राखिएको थियो। प्रशोधनको लागि १५० मिमी पेट्री डिशको ढक्कन। सिलिकन ट्यूब बन्द गर्न बाइन्डर प्रयोग गरिन्छ। h, हाइब्रिड चिप निर्माणको दृश्य स्न्यापशट र हाइब्रिड चिपहरू प्रयोग गरेर 3D मोर्फोजेनेसिस। आन्द्राको 3D मोर्फोजेनेसिसलाई प्रेरित गर्न आन्द्राको उपकला कोषहरूको 2D मोनोलेयरहरू कल्चर गर्न स्वतन्त्र रूपमा तयार पारिएका ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू हाइब्रिड चिपमा घुसाइयो। ट्रान्सवेल इन्सर्टमा स्थापित सेल तह मुनि माइक्रोच्यानलहरू मार्फत माध्यमलाई परफ्यूज गरिन्छ। स्केल बार, 1 सेमी। h सन्दर्भबाट अनुमति लिएर पुन: छापिएको।4। एल्सेभियर।
यस प्रोटोकलमा, Caco-2 कोशिका रेखा र आन्द्राको अर्गानोइडहरू उपकला स्रोतको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो (चित्र 3a)। दुवै प्रकारका कोशिकाहरूलाई स्वतन्त्र रूपमा कल्चर गरिएको थियो (बक्स 2 र बक्स 5) र अन-चिप गट वा ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूको ECM-लेपित माइक्रोच्यानलहरू बीउ गर्न प्रयोग गरिएको थियो। जब कोशिकाहरू संगम हुन्छन् (> फ्लास्कमा 95% कभरेज), T-फ्लास्कमा नियमित रूपमा कल्चर गरिएको Caco-2 कोशिकाहरू (प्यासेज 10 र 50 बीच) ट्रिप्सिनाइजेसन फ्लुइड (बक्स 2) द्वारा विच्छेदित सेल सस्पेंशनहरू तयार गर्न काटिन्छन्। आन्द्राको बायोप्सी वा सर्जिकल रिसेक्शनबाट मानव आन्द्राको अर्गानोइडहरू संरचनात्मक सूक्ष्म वातावरणलाई समर्थन गर्न 24-कुञ्जी प्लेटहरूमा म्याट्रिजेल स्क्याफोल्ड डोमहरूमा कल्चर गरिएको थियो। आवश्यक मोर्फोजेनहरू (जस्तै Wnt, R-स्पोन्डिन, र नोगिन) भएको मध्यम र बक्स 3 मा वर्णन गरिए अनुसार तयार पारिएको वृद्धि कारकहरू अर्गानोइडहरू ~500 µm व्यासमा नबढेसम्म प्रत्येक अर्को दिन पूरक गरिएको थियो। पूर्ण रूपमा बढेको अर्गानोइडहरू काटिन्छन् र आन्द्रामा बीउ रोप्नको लागि एकल कोषहरूमा विभाजित वा चिपमा ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू (बाकस ५)। हामीले पहिले रिपोर्ट गरिसकेका छौं, यसलाई रोगको प्रकार १२,१३ (जस्तै अल्सरेटिभ कोलाइटिस, क्रोहन रोग, कोलोरेक्टल क्यान्सर, वा सामान्य दाता), घाउ साइट (जस्तै, घाउ बनाम गैर-घाउ भएको क्षेत्र) र ट्र्याक्टमा जठरांत्र स्थान (जस्तै, डुओडेनम, जेजुनम, इलियम, सेकम, कोलोन, वा मलाशय) अनुसार फरक गर्न सकिन्छ। हामी बक्स ५ मा कोलोनिक अर्गानोइड्स (कोलोइड्स) को संवर्धनको लागि एक अनुकूलित प्रोटोकल प्रदान गर्दछौं जसलाई सामान्यतया सानो आन्द्राको अर्गानोइड्स भन्दा मोर्फोजेनको उच्च सांद्रता चाहिन्छ।
a, पेट चिपमा पेटको मोर्फोजेनेसिसको प्रेरणको लागि कार्यप्रवाह। यस प्रोटोकलमा Caco-2 मानव आन्द्राको एपिथेलियम र आन्द्राको अर्गानोइडहरू 3D मोर्फोजेनेसिस प्रदर्शन गर्न प्रयोग गरिन्छ। पृथक उपकला कोशिकाहरूलाई तयार पेट-अन-ए-चिप उपकरण (चिप तयारी) मा बीज गरिएको थियो। एक पटक कोशिकाहरू दिन 0 (D0) मा PDMS छिद्रपूर्ण झिल्लीमा सिड (बीज गरिएको) र संलग्न (संलग्न) गरिसकेपछि, एपिकल (AP) प्रवाह सुरु गरिन्छ र पहिलो 2 दिन (प्रवाह, AP, D0-D2) को लागि कायम राखिन्छ। पूर्ण 2D मोनोलेयर बनाउँदा चक्रीय स्ट्रेचिङ गतिहरू (स्ट्रेच, फ्लो, AP र BL) सँगसँगै बेसोलेटरल (BL) प्रवाह पनि सुरु गरिन्छ। माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर (मोर्फोजेनेसिस, D5) को 5 दिन पछि आन्द्राको 3D मोर्फोजेनेसिस सहज रूपमा भयो। चरण कन्ट्रास्ट छविहरूले प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण वा समय बिन्दु (बार ग्राफ, 100 µm) मा Caco-2 कोशिकाहरूको प्रतिनिधि आकारविज्ञान देखाउँछन्। पेटको मोर्फोजेनेसिसको सम्बन्धित क्यास्केडहरू चित्रण गर्ने चार योजनाबद्ध रेखाचित्रहरू (शीर्ष दायाँ)। योजनाबद्धमा ड्यास गरिएका तीरहरूले तरल पदार्थ प्रवाहको दिशालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। b, स्थापित 3D Caco-2 एपिथेलियम (बायाँ) को सतह टोपोलोजी देखाउने SEM छवि। म्याग्निफाइड क्षेत्र (सेतो ड्यास गरिएको बक्स) लाई हाइलाइट गर्ने इनसेटले 3D Caco-2 तह (दायाँ) मा पुन: उत्पन्न माइक्रोभिल्ली देखाउँछ। c, स्थापित Caco-2 3D, क्लाउडिन (ZO-1, रातो) र निरन्तर ब्रश सीमा झिल्लीहरूको तेर्सो फ्रन्टल दृश्य जसमा F-एक्टिन (हरियो) र न्यूक्ली (नीलो) लेबल गरिएको आन्द्राको चिप्समा उपकला कोशिकाहरूको इम्युनोफ्लोरेसेन्स कन्फोकल दृश्य। बीचको योजनाबद्धमा औंल्याउने तीरहरूले प्रत्येक कन्फोकल दृश्यको लागि फोकल प्लेनको स्थानलाई संकेत गर्दछ। d, दिन 3, 7, 9, 11, र 13 मा चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त चिपमा कल्चर गरिएको अर्गानोइडहरूमा मोर्फोलॉजिकल परिवर्तनहरूको समय पाठ्यक्रम। इनसेट (माथि दायाँ) ले प्रदान गरिएको छविको उच्च म्याग्निफिकेसन देखाउँछ। e, दिन 7 मा लिइएको स्लाइसमा पेटमा स्थापित अर्गानोइड 3D एपिथेलियमको DIC फोटोमाइक्रोग्राफ। f, ३ दिनसम्म पेटको चिप्समा क्रमशः (बायाँ) र १३-दिन (मध्य) अर्गानोइडहरू उब्जाएको स्टेम सेलहरू (LGR5; म्याजेन्टा), गोब्लेट सेलहरू (MUC2; हरियो), F-एक्टिन (खैरो) र न्यूक्ली (सियान) को लागि मार्करहरू देखाउने ओभरलेड इम्युनोफ्लोरेसेन्स छविहरू उपकला तहमा क्रमशः (बायाँ) र १३-दिन (मध्य) अर्गानोइडहरू। विस्तारित डेटा चित्र ३ पनि हेर्नुहोस्, जसले MUC2 सिग्नलिंग बिना LGR5 सिग्नलिंग हाइलाइट गर्दछ। संस्कृतिको १३ दिनमा सेलमास्क डाई (दायाँ) ले प्लाज्मा झिल्लीलाई दाग लगाएर चिपमा पेटमा स्थापित ३D अर्गानोइड एपिथेलियमको एपिथेलियल माइक्रोस्ट्रक्चर (दायाँ) देखाउने फ्लोरोसेन्स छविहरू। अन्यथा भनिएसम्म स्केल बार ५० μm छ।b सन्दर्भबाट अनुमति लिएर पुन: छापिएको।२। अक्सफोर्ड युनिभर्सिटी प्रेस; c सन्दर्भबाट अनुमति लिएर अनुकूलित।२। अक्सफोर्ड युनिभर्सिटी प्रेस; e र f सन्दर्भबाट अनुमति लिएर अनुकूलित।१२ क्रिएटिभ कमन्स लाइसेन्स CC BY ४.० अन्तर्गत।
चिपमा रहेको पेटमा, सफल ECM कोटिंगको लागि PDMS पोरस झिल्लीको हाइड्रोफोबिक सतह परिमार्जन गर्न आवश्यक छ। यस प्रोटोकलमा, हामी PDMS झिल्लीको हाइड्रोफोबिसिटी परिमार्जन गर्न दुई फरक विधिहरू लागू गर्छौं। Caco-2 कोशिकाहरूको संवर्धनको लागि, UV/ओजोन उपचारद्वारा सतह सक्रियता मात्र PDMS सतहको हाइड्रोफोबिसिटी कम गर्न, ECM कोट गर्न र Caco-2 कोशिकाहरूलाई PDMS झिल्लीमा जोड्न पर्याप्त थियो। यद्यपि, अर्गानोइड एपिथेलियमको माइक्रोफ्लुइडिक कल्चरलाई PDMS माइक्रोच्यानलहरूमा क्रमिक रूपमा पोलिथिलिनिमाइन (PEI) र ग्लुटाराल्डिहाइड लागू गरेर ECM प्रोटीनहरूको कुशल निक्षेप प्राप्त गर्न रासायनिक-आधारित सतह कार्यात्मककरण आवश्यक पर्दछ। सतह परिमार्जन पछि, ECM प्रोटीनहरू कार्यात्मक PDMS सतह ढाक्न जम्मा गरियो र त्यसपछि पृथक अर्गानोइड एपिथेलियममा परिचय गराइयो। कोशिकाहरू संलग्न भएपछि, माइक्रोफ्लुइडिक सेल संस्कृति कोशिकाहरूले पूर्ण मोनोलेयर नबन्दासम्म माथिल्लो माइक्रोच्यानलमा माध्यम मात्र परफ्यूज गरेर सुरु हुन्छ, जबकि तल्लो माइक्रोच्यानलले स्थिर अवस्था कायम राख्छ। सतह सक्रियता र ECM कोटिंगको लागि यो अनुकूलित विधिले अर्गानोइड एपिथेलियमको संलग्नतालाई प्रेरित गर्न सक्षम बनाउँछ। PDMS सतहमा 3D मोर्फोजेनेसिस।
ट्रान्सवेल कल्चरहरूलाई सेल सिडिङ गर्नुअघि ECM कोटिंग पनि आवश्यक पर्दछ; यद्यपि, ट्रान्सवेल कल्चरहरूलाई छिद्रपूर्ण इन्सर्टहरूको सतह सक्रिय गर्न जटिल पूर्व-उपचार चरणहरू आवश्यक पर्दैन। ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा Caco-2 कोशिकाहरू बढाउनको लागि, छिद्रपूर्ण इन्सर्टहरूमा ECM कोटिंगले विच्छेदित Caco-2 कोशिकाहरू (<१ घण्टा) र कडा जंक्शन अवरोध गठन (<१-२ दिन) को संलग्नतालाई गति दिन्छ। ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा कल्चर अर्गानोइडहरूमा, पृथक अर्गानोइडहरूलाई ECM-लेपित इन्सर्टहरूमा सिड गरिन्छ, झिल्ली सतहमा जोडिन्छ (<३ घण्टा) र अर्गानोइडहरूले अवरोध अखण्डताको साथ पूर्ण मोनोलेयर नबन्दासम्म कायम राखिन्छ। ट्रान्सवेल कल्चरहरू हाइब्रिड चिप्सको प्रयोग बिना २४-वेल प्लेटहरूमा प्रदर्शन गरिन्छ।
स्थापित एपिथेलियल तहको बेसोलेटरल पक्षमा तरल पदार्थ प्रवाह लागू गरेर इन भिट्रो ३डी मोर्फोजेनेसिस सुरु गर्न सकिन्छ। चिपमा रहेको पेटमा, माध्यमलाई माथिल्लो र तल्लो माइक्रोच्यानलहरूमा परफ्यूज गर्दा एपिथेलियल मोर्फोजेनेसिस सुरु भयो (चित्र ३क)। पहिले वर्णन गरिएझैं, दिशात्मक स्रावित मोर्फोजेन अवरोधकहरूलाई निरन्तर हटाउनको लागि इन्फिरियर (बेसोलेटरल) डिब्बामा तरल पदार्थ प्रवाह परिचय गराउनु महत्त्वपूर्ण छ। छिद्रपूर्ण झिल्लीहरूमा बाँधिएका कोषहरूलाई पर्याप्त पोषक तत्व र सीरम प्रदान गर्न र ल्युमिनल कतरनी तनाव उत्पन्न गर्न, हामी सामान्यतया चिपमा पेटमा दोहोरो प्रवाह लागू गर्छौं। हाइब्रिड चिप्समा, एपिथेलियल मोनोलेयरहरू भएको ट्रान्सवेल इन्सर्टहरू हाइब्रिड चिप्समा घुसाइयो। त्यसपछि, माइक्रोच्यानल मार्फत छिद्रपूर्ण ट्रान्सवेल इन्सर्टको बेसोलेटरल पक्ष अन्तर्गत माध्यम लागू गरियो। दुवै संस्कृति प्लेटफर्महरूमा बेसोलेटरल प्रवाह सुरु भएको ३-५ दिन पछि आन्द्राको मोर्फोजेनेसिस भयो।
माइक्रोइन्जिनियर गरिएको थ्रीडी एपिथेलियल तहहरूको मोर्फोलॉजिकल विशेषताहरूलाई फेज कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इन्टरफेरन्स कन्ट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, एसईएम, वा इम्युनोफ्लोरेसेन्स कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्र ३ र ४) सहित विभिन्न इमेजिङ मोडालिटीहरू लागू गरेर विश्लेषण गर्न सकिन्छ। थ्रीडी एपिथेलियल तहहरूको आकार र प्रोट्रुसन निगरानी गर्न कल्चरको समयमा कुनै पनि समयमा फेज कन्ट्रास्ट वा डीआईसी इमेजिङ सजिलै गर्न सकिन्छ। पीडीएमएस र पोलिएस्टर फिल्महरूको अप्टिकल पारदर्शिताको कारण, पेट-अन-ए-चिप र हाइब्रिड चिप प्लेटफर्महरू दुवैले उपकरणको सेक्शनिङ वा डिसेम्ब्ली बिना वास्तविक-समय इन सिटु इमेजिङ प्रदान गर्न सक्छन्। इम्युनोफ्लोरेसेन्स इमेजिङ (चित्र १, ३सी, एफ र ४बी, सी) प्रदर्शन गर्दा, कोषहरू सामान्यतया ४% (wt/vol) प्याराफर्मल्डिहाइड (PFA) सँग फिक्स गरिन्छ, त्यसपछि ट्राइटन X-१०० र २% (wt/vol) ) बोवाइन सीरम एल्बुमिन (BSA) क्रमशः। कोषको प्रकारमा निर्भर गर्दै, विभिन्न फिक्सेटिभहरू, पारगम्यताकर्ताहरू, र ब्लकिङ एजेन्टहरू हुन सक्छन्। प्रयोग गरिन्छ। वंश-निर्भर कोष वा क्षेत्र मार्करहरूलाई लक्षित गर्ने प्राथमिक एन्टिबडीहरू चिपमा स्थिर अवस्थामा रहेका कोषहरूलाई हाइलाइट गर्न प्रयोग गरिन्छ, त्यसपछि माध्यमिक एन्टिबडीहरू प्रयोग गरिन्छ जसमा काउन्टरस्टेन डाईले न्यूक्लियस (जस्तै, ४′,६-डायमिडिनो-२-फेनिलीन) इन्डोल, DAPI) वा F-एक्टिन (जस्तै, फ्लोरोसेन्टली लेबल गरिएको फालोइडिन) लाई लक्षित गर्दछ। फ्लोरोसेन्स-आधारित लाइभ इमेजिङ पनि बलगम उत्पादन (चित्र १, "कोष भिन्नता" र "आन्द्राको शरीर विज्ञान"), माइक्रोबियल कोषहरूको अनियमित उपनिवेशीकरण (चित्र १, "होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृति"), प्रतिरक्षा कोषहरूको भर्ती (चित्र १, 'रोग मोडेलिङ') वा ३D उपकला आकारविज्ञान (चित्र ३c, f र ४b, c) पत्ता लगाउन सकिन्छ। माथिल्लो तहलाई तल्लो माइक्रोच्यानल तहबाट अलग गर्न चिपमा आन्द्रा परिमार्जन गर्दा, सन्दर्भमा वर्णन गरिए अनुसार। चित्र २ मा देखाइए अनुसार, ३D उपकला आकारविज्ञान साथै एपिकल ब्रश सीमामा रहेको माइक्रोभिल्लीले SEM (चित्र ३ख) द्वारा दृश्यात्मक हुन सक्छ। भिन्नता मार्करहरूको अभिव्यक्ति मात्रात्मक PCR5 वा एकल-कोशिका RNA अनुक्रमण गरेर मूल्याङ्कन गर्न सकिन्छ। यस अवस्थामा, पेट चिप्स वा हाइब्रिड चिप्समा उब्जाएको उपकला कोशिकाहरूको 3D तहहरू ट्रिप्सिनाइजेसनद्वारा काटिन्छन् र त्यसपछि आणविक वा आनुवंशिक विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिन्छ।
a, हाइब्रिड चिपमा आन्द्राको मोर्फोजेनेसिसको प्रेरणको लागि कार्यप्रवाह। हाइब्रिड चिप प्लेटफर्ममा 3D मोर्फोजेनेसिस प्रदर्शन गर्न यस प्रोटोकलमा Caco-2 र आन्द्राको अर्गानोइडहरू प्रयोग गरिन्छ। विभाजित उपकला कोशिकाहरूलाई तयार ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा सिड गरिएको थियो (TW प्रेप; तलको चित्र हेर्नुहोस्)। एक पटक कोशिकाहरू सिड गरिएको (सीड गरिएको) र ट्रान्सवेल इन्सर्टहरूमा पलिएस्टर झिल्लीमा जोडिएपछि, सबै कोशिकाहरूलाई स्थिर अवस्थाहरू (TW कल्चर) अन्तर्गत कल्चर गरिएको थियो। 7 दिन पछि, उपकला कोशिकाहरूको 2D मोनोलेयर भएको एकल ट्रान्सवेल इन्सर्टलाई बेसोलेटरल फ्लो (फ्लो, BL) परिचय गराउन हाइब्रिड चिपमा एकीकृत गरिएको थियो, जसले अन्ततः 3D उपकला तह (मोर्फोजेनेसिस) को उत्पादन निम्त्यायो। प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण वा समय बिन्दुमा सामान्य दाता (C103 लाइन) आरोही कोलोनबाट व्युत्पन्न मानव अंग उपकला कोशिकाहरूको रूपात्मक विशेषताहरू देखाउने चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोग्राफहरू। माथिल्लो तहहरूमा भएका योजनाहरूले प्रत्येक चरणको लागि प्रयोगात्मक कन्फिगरेसनलाई चित्रण गर्दछ। b, हाइब्रिड चिप्स (बायाँ योजनाबद्ध) ले माथि-डाउन कन्फोकल माइक्रोस्कोपीको साथ अर्गानोइड उपकला कोशिकाहरूको 3D मोर्फोजेनेसिस निम्त्याउन सक्छ। विभिन्न Z स्थितिहरूमा लिइएका दृश्यहरू (माथिल्लो, मध्य, र तल्लो; दायाँ योजनाबद्ध र सम्बन्धित डटेड रेखाहरू हेर्नुहोस्)। स्पष्ट रूपात्मक विशेषताहरू देखाए। F-actin (सियान), न्यूक्लियस (खैरो)। c, स्थिर ट्रान्सवेल (TW; सेतो ड्यास गरिएको बक्स भित्र इनसेट) बनाम हाइब्रिड चिप (सबैभन्दा ठूलो पूर्ण शट) मा कल्चर गरिएको अर्गानोइड-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाहरूको फ्लोरोसेन्स कन्फोकल माइक्रोग्राफहरू (3D कोण दृश्य) क्रमशः 2D बनाम 3D आकारविज्ञान तुलना गर्दै। 2D ठाडो क्रस-कट दृश्यहरूको एक जोडी (माथिल्लो दायाँ कुनामा इनसेट; "XZ") ले 2D र 3D सुविधाहरू पनि देखाउँछ। स्केल बार, 100 µm.c सन्दर्भबाट अनुमति लिएर पुन: छापिएको।4. Elsevier।
परम्परागत स्थिर संस्कृति अवस्थाहरूमा एउटै कोषहरू (Caco-2 वा आन्द्राको अर्गानोइड एपिथेलियल कोषहरू) लाई दुई-आयामी मोनोलेयरहरूमा कल्चर गरेर नियन्त्रणहरू तयार गर्न सकिन्छ। उल्लेखनीय रूपमा, माइक्रोच्यानलहरूको सीमित मात्रा क्षमता (अर्थात् मूल पेट-चिप डिजाइनमा शीर्ष च्यानलमा ~4 µL) को कारणले पोषक तत्वको कमी हुन सक्छ। त्यसकारण, बेसोलेटरल प्रवाहको प्रयोग अघि र पछिको एपिथेलियल आकारविज्ञानलाई पनि तुलना गर्न सकिन्छ।
नरम लिथोग्राफी प्रक्रिया सफा कोठामा गर्नुपर्छ। चिपमा रहेको प्रत्येक तह (माथिल्लो र तल्लो तह र झिल्ली) र हाइब्रिड चिपहरूको लागि, फरक-फरक फोटोमास्कहरू प्रयोग गरिएको थियो र छुट्टाछुट्टै सिलिकन वेफरहरूमा बनाइएको थियो किनभने माइक्रोच्यानलहरूको उचाइ फरक थियो। चिपमा रहेको पेटको माथिल्लो र तल्लो माइक्रोच्यानलहरूको लक्ष्य उचाइ क्रमशः ५०० µm र २०० µm हो। हाइब्रिड चिपको च्यानल लक्ष्य उचाइ २०० µm हो।
एसीटोन भएको थालमा ३ इन्चको सिलिकन वेफर राख्नुहोस्। प्लेटलाई ३० सेकेन्डसम्म बिस्तारै घुमाउनुहोस्, त्यसपछि वेफरलाई हावामा सुकाउनुहोस्। वेफरलाई IPA भएको प्लेटमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्, त्यसपछि प्लेटलाई सफा गर्न ३० सेकेन्डसम्म घुमाउनुहोस्।
सिलिकन वेफरको सतहबाट जैविक अवशेषहरू अधिकतम रूपमा हटाउनको लागि पिरान्हा घोल (हाइड्रोजन पेरोक्साइड र गाढा सल्फ्यूरिक एसिडको मिश्रण, १:३ (भोल्युम/भोल्युम)) वैकल्पिक रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।
पिरान्हा घोल अत्यन्तै संक्षारक हुन्छ र गर्मी उत्पन्न गर्छ। थप सुरक्षा सावधानीहरू आवश्यक छन्। फोहोर व्यवस्थापनको लागि, घोललाई चिसो हुन दिनुहोस् र सफा, सुख्खा फोहोर कन्टेनरमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। माध्यमिक कन्टेनरहरू प्रयोग गर्नुहोस् र फोहोर कन्टेनरहरूलाई राम्ररी लेबल गर्नुहोस्। थप विस्तृत प्रक्रियाहरूको लागि कृपया सुविधाको सुरक्षा दिशानिर्देशहरू पालना गर्नुहोस्।
वेफरहरूलाई २०० डिग्री सेल्सियसको तातो प्लेटमा १० मिनेटको लागि राखेर डिहाइड्रेट गर्नुहोस्। डिहाइड्रेट भएपछि, वेफरलाई चिसो पार्न हावामा पाँच पटक हल्लाइयो।
सफा गरिएको सिलिकन वेफरको केन्द्रमा ~१० ग्राम फोटोरेसिस्ट SU-8 २१०० खन्याउनुहोस्। फोटोरेसिस्टलाई वेफरमा समान रूपमा फैलाउन चिमटी प्रयोग गर्नुहोस्। फोटोरेसिस्ट कम टाँसिने र फैलाउन सजिलो बनाउन कहिलेकाहीं वेफरलाई ६५ डिग्री सेल्सियसको तातो प्लेटमा राख्नुहोस्। वेफरलाई सिधै हट प्लेटमा नराख्नुहोस्।
स्पिन कोटिंग चलाएर SU-8 लाई वेफरमा समान रूपमा वितरण गरिएको थियो। १०० rpm/s को गतिमा ५०० rpm मा प्रसारित गर्न SU-8 को आगमन रोटेशनलाई ५-१० सेकेन्डको लागि प्रोग्राम गर्नुहोस्। १,५०० rpm मा २०० µm मोटाई ढाँचाको लागि मुख्य स्पिन सेट गर्नुहोस्, वा २५० µm मोटाई प्राप्त गर्नुहोस् (चिपमा पेटको माथिल्लो तहको लागि ५०० µm उचाइ बनाउँदै; तल "महत्वपूर्ण चरणहरू" हेर्नुहोस्) १,२०० rpm मा ३० सेकेन्डमा ३०० rpm/s को गतिमा सेट गर्नुहोस्।
सिलिकन वेफरमा रहेको SU-8 ढाँचाको लक्ष्य मोटाई अनुसार मुख्य स्पिन गति समायोजन गर्न सकिन्छ।
चिपमा रहेको पेटको माथिल्लो तहको लागि ५०० µm उचाइको SU-8 ढाँचाहरू बनाउन, यस बक्सको स्पिन कोटिंग र नरम बेक चरणहरू (चरण ७ र ८) क्रमिक रूपमा दोहोर्याइएको थियो (चरण ९ हेर्नुहोस्) २५० µm को दुई तहहरू उत्पादन गर्न। SU-8 को बाक्लो तह, जुन तहमा राख्न सकिन्छ र यस बक्सको चरण १२ मा UV एक्सपोजरद्वारा जोड्न सकिन्छ, जसले गर्दा ५०० µm अग्लो तह बन्छ।
SU-8 लेपित वेफरहरूलाई सावधानीपूर्वक हट प्लेटमा ६५ डिग्री सेल्सियसमा ५ मिनेटको लागि राखेर नरम बेक गर्नुहोस्, त्यसपछि सेटिङलाई ९५ डिग्री सेल्सियसमा स्विच गर्नुहोस् र थप ४० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।
माथिल्लो माइक्रोच्यानलमा SU-8 ढाँचाको ५०० μm उचाइ प्राप्त गर्न, दुई २५० μm बाक्लो SU-8 तहहरू उत्पन्न गर्न चरण ७ र ८ दोहोर्याउनुहोस्।
UV मास्क एलाइनर प्रयोग गरेर, वेफरको एक्सपोजर समय गणना गर्न निर्माताको निर्देशन अनुसार बत्ती परीक्षण गर्नुहोस्। (एक्सपोजर समय, ms) = (एक्सपोजर खुराक, mJ/cm2)/(बत्ती पावर, mW/cm2)।
एक्सपोजर समय निर्धारण गरेपछि, UV मास्क एलाइनरको मास्क होल्डरमा फोटोमास्क राख्नुहोस् र SU-8 लेपित वेफरमा फोटोमास्क राख्नुहोस्।
UV फैलावट कम गर्न फोटोमास्कको छापिएको सतहलाई सिलिकन वेफरको SU-8 लेपित छेउमा सिधै राख्नुहोस्।
पूर्वनिर्धारित एक्सपोजर समयको लागि SU-8 लेपित वेफर र फोटोमास्कलाई ठाडो रूपमा २६० mJ/cm2 UV प्रकाशमा प्रदर्शन गर्नुहोस् (यस बाकसको चरण १० हेर्नुहोस्)।
UV एक्सपोजर पछि, SU-8-लेपित सिलिकन वेफरहरूलाई २०० μm उचाइको ढाँचाहरू बनाउन प्रत्येक हट प्लेटमा ६५°C मा ५ मिनेट र ९५°C मा १५ मिनेटको लागि बेक गरियो। ५०० μm उचाइको ढाँचाहरू बनाउन ९५°C मा पोस्ट-बेक समयलाई ३० मिनेटसम्म बढाउनुहोस्।
विकासकर्तालाई गिलासको थालमा खन्याइन्छ, र बेक्ड वेफरलाई थालमा राखिन्छ। SU-8 विकासकर्ताको आयतन गिलास प्लेटको आकारमा निर्भर गर्दै फरक पर्न सक्छ। खुला नभएको SU-8 लाई पूर्ण रूपमा हटाउन पर्याप्त SU-8 विकासकर्ता प्रयोग गर्न निश्चित गर्नुहोस्। उदाहरणका लागि, १ लिटर क्षमता भएको १५० मिमी व्यासको गिलास डिश प्रयोग गर्दा, ~३०० एमएल SU-8 विकासकर्ता प्रयोग गर्नुहोस्। कहिलेकाहीं हल्का घुमाउरो पारेर २५ मिनेटको लागि मोल्ड विकास गर्नुहोस्।
विकसित मोल्डलाई ~१० एमएल ताजा डेभलपरले पखाल्नुहोस् र त्यसपछि पिपेट प्रयोग गरेर घोल स्प्रे गरेर IPA लगाउनुहोस्।
वेफरलाई प्लाज्मा क्लिनरमा राख्नुहोस् र १.५ मिनेटको लागि अक्सिजन प्लाज्मा (वायुमण्डलीय ग्यास, लक्षित चाप १ × १०−५ टोर, पावर १२५ वाट) मा राख्नुहोस्।
वेफरलाई भ्याकुम डेसिकेटरमा राख्नुहोस् जसको भित्र गिलास स्लाइड छ। वेफर र स्लाइडहरू छेउछाउमा राख्न सकिन्छ। यदि भ्याकुम डेसिकेटरलाई प्लेटद्वारा धेरै तहहरूमा विभाजित गरिएको छ भने, स्लाइडहरूलाई तल्लो चेम्बरमा र वेफरहरूलाई माथिल्लो चेम्बरमा राख्नुहोस्। १०० μL ट्राइक्लोरो(१H, १H, २H, २H-पर्फ्लुरोओक्टाइल) सिलेन घोललाई गिलास स्लाइडमा खसाल्नुहोस् र सिलेनाइजेसनको लागि भ्याकुम लगाउनुहोस्।
जमेको Caco-2 कोषहरूको एउटा शीशीलाई ३७°C पानीको नुहाउने ठाउँमा पगाल्नुहोस्, त्यसपछि पग्लिएका कोषहरूलाई १५ एमएल ३७°C पूर्व-तातो Caco-2 माध्यम भएको T75 फ्लास्कमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।
Caco-2 कोषहरूलाई ~90% संगममा पास गर्न, पहिले Caco-2 माध्यम, PBS, र 0.25% trypsin/1 mM EDTA लाई ३७°C पानीको नुहाउने ठाउँमा न्यानो पार्नुहोस्।
भ्याकुम एस्पिरेशनद्वारा माध्यमलाई एस्पिरेट गर्नुहोस्। भ्याकुम एस्पिरेशन दोहोर्याएर र ताजा PBS थपेर कोषहरूलाई ५ एमएल न्यानो PBS ले दुई पटक धुनुहोस्।