Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակը սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ի համար: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Մարդու աղիքային մորֆոգենեզը հաստատում է կրիպտ-թավիկների եռաչափ էպիթելային միկրոճարտարապետության և տարածական կազմակերպման առանձնահատկությունները: Այս եզակի կառուցվածքը անհրաժեշտ է աղիքային հոմեոստազը պահպանելու համար՝ պաշտպանելով բազալ կրիպտում գտնվող ցողունային բջիջների խորշը էկզոգեն մանրէային հակածիններից և դրանց մետաբոլիտներից: Բացի այդ, աղիքային թավիկները և արտազատող լորձը ներկայացնում են ֆունկցիոնալորեն տարբերակված էպիթելային բջիջներ՝ աղիքային լորձաթաղանթի մակերեսին պաշտպանիչ պատնեշով: Հետևաբար, եռաչափ էպիթելային կառուցվածքների վերստեղծումը կարևոր է in vitro աղիքային մոդելների կառուցման համար: Նշենք, որ օրգանական միմետիկ աղիքը չիպի վրա կարող է առաջացնել աղիքային էպիթելիի ինքնաբուխ եռաչափ մորֆոգենեզ՝ բարելավված ֆիզիոլոգիական գործառույթներով և կենսամեխանիկայով: Այստեղ մենք ներկայացնում ենք վերարտադրելի արձանագրություն՝ աղիքում աղիքային մորֆոգենեզը կայուն կերպով առաջացնելու համար միկրոհեղուկային չիպի, ինչպես նաև Transwell ներդրված հիբրիդային չիպի վրա: Մենք նկարագրում ենք սարքերի պատրաստման, Caco-2 կամ աղիքային օրգանոիդ էպիթելային բջիջների կուլտիվացման, ինչպես ավանդական պայմաններում, այնպես էլ միկրոհեղուկային հարթակի վրա, եռաչափ մորֆոգենեզի ինդուկցիայի և հաստատված եռաչափ բնութագրման մանրամասն մեթոդներ: էպիթելի բազմակի պատկերման մեթոդների միջոցով: Այս արձանագրությունը հասնում է ֆունկցիոնալ աղիքային միկրոճարտարապետության վերականգնմանը՝ 5 օրվա ընթացքում վերահսկելով բազոլատերալ հեղուկի հոսքը: Մեր in vitro մորֆոգենեզի մեթոդը օգտագործում է ֆիզիոլոգիապես համապատասխան սղման լարվածություն և մեխանիկական շարժում և չի պահանջում բարդ բջջային ինժեներիա կամ մանիպուլյացիա, որը կարող է գերազանցել այլ առկա մեթոդներին: Մենք կանխատեսում ենք, որ մեր առաջարկվող արձանագրությունը կարող է լայն ազդեցություն ունենալ կենսաբժշկական հետազոտությունների համայնքի վրա՝ ապահովելով մեթոդ կենսաբժշկական, կլինիկական և դեղագործական կիրառությունների համար in vitro աղիքային էպիթելի եռաչափ շերտերը վերականգնելու համար:
Փորձերը ցույց են տալիս, որ աղիքային էպիթելային Caco-2 բջիջները, որոնք կուլտիվացվում են «gut-on-a-chip»1,2,3,4,5 կամ երկշերտ միկրոհոսքային սարքերում6,7, կարող են ենթարկվել ինքնաբուխ եռաչափ մորֆոգենեզի in vitro՝ առանց հիմքում ընկած մեխանիզմի հստակ պատկերացման: Մեր վերջին ուսումնասիրության մեջ մենք պարզեցինք, որ բազոլատերալ սեկրեցված մորֆոգեն անտագոնիստների հեռացումը կուլտիվ սարքերից անհրաժեշտ և բավարար է եռաչափ էպիթելային մորֆոգենեզը in vitro ինդուկցելու համար, ինչը ցույց է տրվել Caco-2-ի և հիվանդների կողմից ստացված աղիքային օրգանոիդների միջոցով: Էպիթելային բջիջները վավերացվել են։ Այս ուսումնասիրության մեջ մենք հատուկ ուշադրություն ենք դարձրել հզոր Wnt անտագոնիստի՝ Dickkopf-1-ի (DKK-1) բջիջների արտադրությանը և կոնցենտրացիայի բաշխմանը չիպի վրա գտնվող աղիքներում և «Հիբրիդային չիպ» անվանումով Transwell ներդիրներ պարունակող մոդիֆիկացված միկրոհոսքային սարքերում։ Մենք ցույց ենք տալիս, որ էկզոգեն Wnt անտագոնիստների (օրինակ՝ DKK-1, Wnt ռեպրեսոր 1, արտազատված frizzled-related սպիտակուց 1 կամ Soggy-1) ավելացումը չիպի վրա գտնվող աղիքներին կանխում է մորֆոգենեզը կամ խաթարում է նախապես կառուցվածքավորված եռաչափ էպիթելային շերտը, ինչը ենթադրում է, որ կուլտուրայի ընթացքում անտագոնիստական ​​սթրեսը պատասխանատու է in vitro աղիքային մորֆոգենեզի համար։ Հետևաբար, էպիթելային միջերեսում կայուն մորֆոգենեզի հասնելու գործնական մոտեցումը Wnt անտագոնիստների մակարդակները բազոլատերալ խցիկում հեռացնելը կամ նվազագույնի հասցնելն է՝ ակտիվ լվացման միջոցով (օրինակ՝ չիպի վրա գտնվող աղիքներ կամ չիպի վրա հիբրիդային հարթակներ) կամ դիֆուզիայի միջոցով։ Բազոլատերալ միջավայրեր (օրինակ՝ Transwell ներդիրներից մեծ բազոլատերալ ռեզերվուարներ) ջրհորներ):
Այս արձանագրության մեջ մենք ներկայացնում ենք մանրամասն մեթոդ՝ աղիքային միկրոսարքերի և Transwell-ում տեղադրվող հիբրիդային չիպերի (քայլեր 1-5) պատրաստման համար՝ աղիքային էպիթելային բջիջները պոլիդիմեթիլսիլօքսանի (PDMS) վրա հիմնված ծակոտկեն թաղանթների (քայլեր 6A, 7A, 8, 9) կամ Transwell-ում տեղադրվող պոլիեսթերային թաղանթների (քայլեր 6B, 7B, 8, 9) վրա կուլտուրա անելու և in vitro (քայլ 10) եռաչափ մորֆոգենեզ ինդուկցելու համար։ Մենք նաև բացահայտել ենք հյուսվածք-սպեցիֆիկ հիստոգենեզի և տոհմային կախված բջջային դիֆերենցիացիայի վկայող բջջային և մոլեկուլային առանձնահատկություններ՝ կիրառելով բազմաթիվ պատկերագրական մեթոդներ (քայլեր 11-24)։ Մենք ինդուկցրել ենք մորֆոգենեզ՝ օգտագործելով մարդու աղիքային էպիթելային բջիջներ, ինչպիսիք են Caco-2-ը կամ աղիքային օրգանոիդները, երկու կուլտուրայի ձևաչափերով՝ տեխնիկական մանրամասներով, ներառյալ ծակոտկեն թաղանթների մակերեսային մոդիֆիկացիան, 2D մոնաշերտերի ստեղծումը և աղիքային կենսաքիմիական միկրոմիջավայրի վերարտադրությունը in vitro։ 2D էպիթելային մոնաշերտերից եռաչափ մորֆոգենեզ ինդուկցելու համար մենք հեռացրել ենք... մորֆոգենի անտագոնիստները երկու կուլտուրային ձևերում՝ միջավայրը կուլտուրայի բազոլատերալ խցիկ հոսեցնելով։ Վերջապես, մենք ներկայացնում ենք վերականգնվող եռաչափ էպիթելային շերտի օգտակարությունը, որը կարող է օգտագործվել մորֆոգեն-կախյալ էպիթելի աճի, երկայնական տեր-միկրոբիոմ համատեղ կուլտուրաների, պաթոգեն վարակի, բորբոքային վնասվածքի, էպիթելային պատնեշի դիսֆունկցիայի և պրոբիոտիկների վրա հիմնված թերապիաների մոդելավորման համար։ Օրինակներ։ ազդեցություններ։
Մեր արձանագրությունը կարող է օգտակար լինել գիտնականների լայն շրջանակի համար՝ հիմնարար (օրինակ՝ աղիքային լորձաթաղանթի կենսաբանություն, ցողունային բջիջների կենսաբանություն և զարգացման կենսաբանություն) և կիրառական հետազոտությունների (օրինակ՝ նախակլինիկական դեղերի թեստավորում, հիվանդությունների մոդելավորում, հյուսվածքային ինժեներիա և գաստրոէնտերոլոգիա) լայն ազդեցության ոլորտներում: Աղիքային էպիթելի եռաչափ մորֆոգենեզը in vitro ինդուկցելու մեր արձանագրության վերարտադրելիության և կայունության շնորհիվ մենք նախատեսում ենք, որ մեր տեխնիկական ռազմավարությունը կարող է տարածվել աղիքային զարգացման, վերականգնման կամ հոմեոստազի ընթացքում բջջային ազդանշանային դինամիկան ուսումնասիրող լսարանների շրջանում: Բացի այդ, մեր արձանագրությունը օգտակար է տարբեր վարակիչ նյութերի, ինչպիսիք են Նորովիրուս 8-ը, Ծանր սուր շնչառական համախտանիշի կորոնավիրուս 2-ը (SARS-CoV-2), Clostridium difficile-ը, Salmonella Typhimurium 9-ը կամ Vibrio cholerae-ն, տակ վարակի հարցաքննության համար: Հիվանդությունների ախտաբանության և պաթոգենեզի լսարանները նույնպես օգտակար են: Չիպի վրա հիմնված աղիքային միկրոֆիզիոլոգիայի համակարգի օգտագործումը կարող է թույլ տալ երկայնական համատեղ մշակույթ 10 և հետագա գնահատում տիրոջ պաշտպանության, իմունային պատասխանների և ստամոքս-աղիքային (ՍՏ) տրակտում պաթոգենով վնասվածքների վերականգնման 11: Այլ ՍՏ խանգարումներ, որոնք կապված են արտահոսող աղիքի համախտանիշի, ցելիակիայի, Կրոնի հիվանդության, խոցային կոլիտի, պուչիտի կամ գրգռված աղիքի համախտանիշի հետ, կարող են մոդելավորվել, երբ 3D աղիքային էպիթելային շերտերը պատրաստվում են հիվանդի 3D աղիքային էպիթելային շերտերի միջոցով, այդ հիվանդությունները ներառում են թավիկների ատրոֆիա, կրիպտների կարճացում, լորձաթաղանթի վնասում կամ էպիթելային պատնեշի խանգարում: Կենսաբուժություն կամ ցողունային բջիջներից ստացված աղիքային օրգանոիդներ 12,13: Հիվանդության միջավայրի բարձր բարդությունն ավելի լավ մոդելավորելու համար ընթերցողները կարող են դիտարկել հիվանդությանը վերաբերող բջջային տեսակների ավելացումը, ինչպիսիք են հիվանդի ծայրամասային արյան մոնոնուկլեար բջիջները (PBMCs), 3D աղիքային թավիկների-կրիպտների միկրոճարտարապետականներ պարունակող մոդելներին: Հյուսվածք-սպեցիֆիկ իմունային բջիջներ, 5:
Քանի որ եռաչափ էպիթելի միկրոկառուցվածքը կարող է ֆիքսվել և վիզուալացվել առանց կտրման գործընթացի, տարածական տրանսկրիպտոմիկայի և բարձր կամ գերլուծաչափով պատկերման վրա աշխատող դիտողները կարող են հետաքրքրված լինել էպիթելի խորշերի վրա գեների և սպիտակուցների տարածաժամանակային դինամիկայի մեր քարտեզագրմամբ։ Հետաքրքրված են տեխնոլոգիայով։ Արձագանք մանրէային կամ իմունային խթաններին։ Ավելին, երկայնական տեր-միկրոբիոմ խաչաձև կապը 10, 14, որը համակարգում է աղիքային հոմեոստազը, կարող է հաստատվել եռաչափ աղիքային լորձաթաղանթի շերտում՝ տարբեր մանրէային տեսակների, մանրէային համայնքների կամ կղանքի միկրոբիոտայի համատեղ կուլտուրայով, հատկապես՝ չիպի վրա գտնվող աղիքներում։ հարթակում։ Այս մոտեցումը հատկապես գրավիչ է լորձաթաղանթի իմունոլոգիան, գաստրոէնտերոլոգիան, մարդու միկրոբիոմը, կուլտուրոմիկան և կլինիկական մանրէաբանությունն ուսումնասիրող լսարանի համար, որոնք ձգտում են լաբորատորիայում մշակել նախկինում չմշակված աղիքային միկրոբիոտա։ Եթե մեր in vitro մորֆոգենեզի արձանագրությունը կարող է հարմարեցվել մասշտաբային մշակութային ձևաչափերի, ինչպիսիք են բազմաբաղադրիչ ներդիրները 24, 96 կամ 384 բաղադրիչ թիթեղներում, որոնք անընդհատ լրացնում են բազոլատերալ խցիկները, արձանագրությունը կարող է նաև տարածվել սննդի արդյունաբերության համար դեղագործական, կենսաբժշկական կամ բարձր թողունակությամբ սկրինինգի կամ վավերացման հարթակներ մշակողներին։ Որպես սկզբունքի ապացույց, մենք վերջերս ցույց տվեցինք բազմակի բարձր թողունակությամբ մորֆոգենեզի համակարգի հնարավորությունը, որը կարող է մասշտաբային լինել 24 բաղադրիչ թիթեղի ձևաչափի համար։ Բացի այդ, չիպի վրա բազմաթիվ օրգաններ են առևտրայնացվել16,17,18։ Հետևաբար, մեր in vitro մորֆոգենեզի մեթոդի վավերացումը կարող է արագացվել և հնարավոր է ընդունվել բազմաթիվ հետազոտական ​​լաբորատորիաների, արդյունաբերության կամ կառավարության և կարգավորող գործակալությունների կողմից՝ in vitro աղիքային մորֆոգենեզի բջջային վերածրագրավորումը տրանսկրիպտոմիկ մակարդակում՝ դեղեր կամ Կենսաթերապևտիկ միջոցներ։ Դեղերի թեկնածուների կլանումը և տեղափոխումը գնահատվել են աղիքային եռաչափ փոխարինիչների կամ չիպի վրա օրգան-միջոցների վրա հատուկ կամ առևտրային մոդելների միջոցով՝ աղիքային մորֆոգենեզի գործընթացի վերարտադրելիությունը գնահատելու համար։
Մարդու համար կարևոր փորձարարական մոդելների սահմանափակ քանակ է օգտագործվել աղիքային էպիթելի մորֆոգենեզն ուսումնասիրելու համար, հիմնականում in vitro եռաչափ մորֆոգենեզը խթանելու համար կիրառելի արձանագրությունների բացակայության պատճառով: Փաստորեն, աղիքային մորֆոգենեզի մասին ներկայիս գիտելիքների մեծ մասը հիմնված է կենդանիների վրա կատարված ուսումնասիրությունների վրա (օրինակ՝ զեբրաձուկ20, մկներ21 կամ հավեր22): Այնուամենայնիվ, դրանք աշխատատար և ծախսատար են, կարող են էթիկապես կասկածելի լինել և, ամենակարևորը, ճշգրիտ չեն որոշում մարդու զարգացման գործընթացները: Այս մոդելները նաև շատ սահմանափակ են բազմակողմանի մասշտաբային եղանակով փորձարկվելու իրենց ունակությամբ: Հետևաբար, in vitro եռաչափ հյուսվածքային կառուցվածքների վերականգնման մեր արձանագրությունը գերազանցում է in vivo կենդանիների մոդելներին, ինչպես նաև այլ ավանդական ստատիկ 2D բջջային կուլտուրայի մոդելներին: Ինչպես նախկինում նկարագրվել է, եռաչափ էպիթելի կառուցվածքների օգտագործումը թույլ տվեց մեզ ուսումնասիրել դիֆերենցված բջիջների տարածական տեղայնացումը կրիպտ-թավիկների առանցքում՝ ի պատասխան տարբեր լորձաթաղանթային կամ իմունային խթանների: Եռաչափ էպիթելի շերտերը կարող են տարածք տրամադրել ուսումնասիրելու համար, թե ինչպես են մանրէային բջիջները մրցում տարածական խորշեր ձևավորելու և էկոլոգիական էվոլյուցիայի՝ ի պատասխան տիրոջ գործոնների (օրինակ՝ ներքին ընդդեմ արտաքին) ձևավորման համար: լորձային շերտեր, IgA-ի սեկրեցիա և հակամանրէային պեպտիդներ): Ավելին, եռաչափ էպիթելային ձևաբանությունը կարող է թույլ տալ մեզ հասկանալ, թե ինչպես է աղիքային միկրոբիոտան կառուցում իր համայնքները և սիներգիստորեն արտադրում մանրէային մետաբոլիտներ (օրինակ՝ կարճ շղթայով ճարպաթթուներ), որոնք ձևավորում են բջջային կազմակերպումը և ցողունային բջիջների խորշերը բազալ կրիպտներում: Այս առանձնահատկությունները կարող են ցուցադրվել միայն այն դեպքում, երբ եռաչափ էպիթելային շերտերը հաստատվում են in vitro պայմաններում:
Բացի մեր՝ աղիքային էպիթելային եռաչափ կառուցվածքներ ստեղծելու մեթոդից, կան մի քանի in vitro մեթոդներ: Աղիքային օրգանոիդային կուլտուրան հյուսվածքային ինժեներիայի ժամանակակից տեխնիկա է, որը հիմնված է աղիքային ցողունային բջիջների մշակման վրա՝ որոշակի մորֆոգեն պայմաններում23,24,25: Այնուամենայնիվ, տրանսպորտային վերլուծության կամ տեր-միկրոբիոմ համատեղ կուլտուրաների համար եռաչափ օրգանոիդային մոդելների օգտագործումը հաճախ մարտահրավեր է, քանի որ աղիքային լուսանցքը փակված է օրգանոիդի մեջ, և, հետևաբար, լուսանցքային բաղադրիչների, ինչպիսիք են մանրէային բջիջները կամ էկզոգեն հակածինները, ներմուծումը սահմանափակ է: Օրգանոիդային լուսանցքներին հասանելիությունը կարող է բարելավվել միկրոինյեկտորի միջոցով26,27, բայց այս մեթոդը ինվազիվ և աշխատատար է և պահանջում է մասնագիտացված գիտելիքներ կիրառելու համար: Ավելին, հիդրոգելային կառուցվածքներում ստատիկ պայմաններում պահպանվող ավանդական օրգանոիդային կուլտուրաները ճշգրիտ չեն արտացոլում ակտիվ in vivo կենսամեխանիկան:
Մի քանի հետազոտական ​​խմբերի կողմից կիրառվող այլ մոտեցումներում օգտագործվում են նախապես կառուցվածքավորված 3D հիդրոգելային կառուցվածքներ՝ աղիքային էպիթելի կառուցվածքը ընդօրինակելու համար՝ գելի մակերեսին մեկուսացված մարդու աղիքային բջիջներ աճեցնելով։ Հիդրոգելային կառուցվածքներ պատրաստել՝ օգտագործելով 3D տպագիր, միկրոաղացած կամ լիտոգրաֆիկ կերպով պատրաստված կաղապարներ։ Այս մեթոդը ցույց է տալիս մեկուսացված էպիթելային բջիջների ինքնակազմակերպված դասավորությունը in vitro՝ ֆիզիոլոգիապես համապատասխան մորֆոգենային գրադիենտներով, ստեղծելով բարձր ասպեկտային հարաբերակցության էպիթելային կառուցվածք և ստրոմա-էպիթելային խաչաձև կապ՝ կառուցվածքում ստրոմալ բջիջներ ներառելով։ Այնուամենայնիվ, նախապես կառուցվածքավորված կառուցվածքների բնույթը կարող է կանխել ինքնաբուխ մորֆոգենետիկ գործընթացի ցուցադրումը։ Այս մոդելները նաև չեն ապահովում դինամիկ լուսանցքային կամ միջբջջային հոսք, քանի որ չունեն հեղուկի սղման լարվածություն, որը աղիքային բջիջներին անհրաժեշտ է մորֆոգենեզ անցնելու և ֆիզիոլոգիական գործառույթ ձեռք բերելու համար։ Մեկ այլ վերջերս կատարված ուսումնասիրություն օգտագործել է հիդրոգելային կառուցվածքներ միկրոհոսքային հարթակում և նախշավորել աղիքային էպիթելի կառուցվածքները՝ օգտագործելով լազերային փորագրման տեխնիկա։ Մկների աղիքային օրգանոիդները հետևում են փորագրված նախշերին՝ աղիքային խողովակաձև կառուցվածքներ ձևավորելու համար, և ներբջջային հեղուկի հոսքը կարող է վերապատկվել՝ օգտագործելով միկրոհոսքային մոդուլ։ Սակայն, այս մոդելը ո՛չ ինքնաբուխ մորֆոգենետիկ պրոցեսներ է ցուցաբերում, ո՛չ էլ ներառում է աղիքային մեխանոբիոլոգիական շարժումներ։ Նույն խմբի 3D տպագրության տեխնիկաները կարողացան ստեղծել մանրանկարչական աղիքային խողովակներ՝ ինքնաբուխ մորֆոգենետիկ պրոցեսներով։ Չնայած խողովակի ներսում տարբեր աղիքային հատվածների բարդ արտադրությանը, այս մոդելը նաև զուրկ է լուսանցքային հեղուկի հոսքից և մեխանիկական դեֆորմացիայից։ Բացի այդ, մոդելի գործունակությունը կարող է սահմանափակ լինել, հատկապես կենսատպագրության գործընթացի ավարտից հետո, ինչը կխանգարի փորձարարական պայմաններին կամ բջիջ-բջիջ փոխազդեցություններին։ Փոխարենը, մեր առաջարկած արձանագրությունը ապահովում է ինքնաբուխ աղիքային մորֆոգենեզ, ֆիզիոլոգիապես համապատասխան սղման լարվածություն, աղիքային շարժունակությունը ընդօրինակող կենսամեխանիկա, անկախ ապիկալ և բազալատերալ խցիկների հասանելիություն և մոդուլային բարդ կենսաբանական միկրոմիջավայրերի վերստեղծում։ Հետևաբար, մեր in vitro 3D մորֆոգենեզի արձանագրությունը կարող է լրացուցիչ մոտեցում ապահովել առկա մեթոդների մարտահրավերները հաղթահարելու համար։
Մեր արձանագրությունը ամբողջությամբ կենտրոնացած է եռաչափ էպիթելային մորֆոգենեզի վրա՝ կուլտուրայում առկա միայն էպիթելային բջիջներով և առանց այլ տեսակի շրջապատող բջիջների, ինչպիսիք են մեզենքիմալ բջիջները, էնդոթելային բջիջները և իմունային բջիջները: Ինչպես նախկինում նկարագրվել է, մեր արձանագրության միջուկը էպիթելային մորֆոգենեզի ինդուկցիան է՝ հեռացնելով ներմուծված միջավայրի բազոլատերալ կողմում արտազատվող մորֆոգենների ինհիբիտորները: Մինչ մեր «աղիքային չիպի վրա» և «հիբրիդային չիպի վրա» համակարգերի ամուր մոդուլյարությունը թույլ է տալիս մեզ վերստեղծել ալիքավոր եռաչափ էպիթելային շերտը, լրացուցիչ կենսաբանական բարդություններ, ինչպիսիք են էպիթելային-մեզենքիմալ փոխազդեցությունները33,34, արտաբջջային մատրիցի (ECM) նստեցումը35 և, մեր մոդելում, կրիպտ-թավիկների առանձնահատկությունները, որոնք փոխանցում են ցողունային բջիջների խորշերը բազալ կրիպտներում, դեռևս հետագա քննարկման կարիք ունեն: Մեզենքիմի ստրոմալ բջիջները (օրինակ՝ ֆիբրոբլաստները) կարևոր դեր են խաղում ECM սպիտակուցների արտադրության և աղիքային մորֆոգենեզի կարգավորման մեջ in vivo35,37,38: Մեզենքիմալի ավելացումը Մեր մոդելին բջիջների ավելացումը բարելավեց մորֆոգենետիկ գործընթացը և բջիջների կցման արդյունավետությունը: Էնդոթելային շերտը (այսինքն՝ մազանոթները կամ լիմֆատիկ ուղիները) կարևոր դեր է խաղում աղիքային միկրոմիջավայրում մոլեկուլային փոխադրման39 և իմունային բջիջների հավաքագրման40 կարգավորման գործում: Ավելին, հյուսվածքային մոդելների միջև միացված անոթային բաղադրիչները նախապայման են, երբ հյուսվածքային մոդելները նախագծվում են բազմաօրգանային փոխազդեցությունները ցուցադրելու համար: Հետևաբար, օրգանային մակարդակի լուծմամբ ավելի ճշգրիտ ֆիզիոլոգիական առանձնահատկությունները մոդելավորելու համար կարող է անհրաժեշտ լինել ներառել էնդոթելային բջիջներ: Հիվանդից ստացված իմունային բջիջները նույնպես կարևոր են բնածին իմունային պատասխանների, անտիգենի ներկայացման, բնածին ադապտիվ իմունային փոխազդեցության և հյուսվածք-սպեցիֆիկ իմունիտետի ցուցադրման համար՝ աղիքային հիվանդությունը նմանակելու համատեքստում:
Հիբրիդային չիպերի կիրառումն ավելի պարզ է, քան «աղիքային միկրոֆլորան չիպի վրա» մեթոդը, քանի որ սարքի տեղադրումն ավելի պարզ է, իսկ Transwell ներդիրների կիրառումը թույլ է տալիս իրականացնել աղիքային էպիթելի մասշտաբային կուլտուրա։ Այնուամենայնիվ, պոլիեսթերային թաղանթներով առևտրային առումով մատչելի Transwell ներդիրները առաձգական չեն և չեն կարող մոդելավորել պերիստալտիկանման շարժումներ։ Ավելին, հիբրիդային չիպի մեջ տեղադրված Transwell ներդիրի գագաթային հատվածը մնացել է անշարժ՝ գագաթային կողմում առանց սղման լարվածության։ Ակնհայտ է, որ գագաթային հատվածի ստատիկ հատկությունները հազվադեպ են հնարավորություն տալիս հիբրիդային չիպերում երկարատև բակտերիալ համատեղ կուլտուրա իրականացնել։ Չնայած հիբրիդային չիպերի օգտագործման դեպքում մենք կարող ենք հուսալիորեն առաջացնել 3D մորֆոգենեզ Transwell ներդիրներում, ֆիզիոլոգիապես համապատասխան կենսամեխանիկայի և գագաթային հեղուկի հոսքի պակասը կարող է սահմանափակել հիբրիդային չիպային հարթակների հնարավոր կիրառման հնարավորությունը։
Մարդու կրիպտ-թավիկների առանցքի լիարժեք վերակառուցումները չիպի վրա աղիք և չիպի վրա հիբրիդ մշակույթներում լիովին հաստատված չեն։ Քանի որ մորֆոգենեզը սկսվում է էպիթելային մոնաշերտից, եռաչափ միկրոճարտարապետությունները պարտադիր չէ, որ in vivo ապահովեն կրիպտների մորֆոլոգիական նմանություն։ Չնայած մենք բնութագրեցինք բազմացող բջջային պոպուլյացիան միկրոինժեներական եռաչափ էպիթելի բազալ կրիպտային տիրույթի մոտ, կրիպտային և թավիկների շրջանները հստակորեն սահմանազատված չէին։ Չնայած չիպի վրա ավելի բարձր վերին ալիքները հանգեցնում են միկրոինժեներական էպիթելի բարձրության բարձրացման, առավելագույն բարձրությունը դեռևս սահմանափակվում է մոտ 300-400 մկմ-ով։ Մարդու աղիքային կրիպտների իրական խորությունը բարակ և հաստ աղիքներում համապատասխանաբար մոտ 135 մկմ և ~400 մկմ է, իսկ բարակ աղիքի թավիկների բարձրությունը՝ մոտ 600 մկմ։
Պատկերման տեսանկյունից, եռաչափ միկրոճարտարապետությունների in situ գերլուծաչափով պատկերումը կարող է սահմանափակվել չիպի վրա գտնվող աղիքներով, քանի որ օբյեկտիվ ոսպնյակից մինչև էպիթելային շերտ անհրաժեշտ աշխատանքային հեռավորությունը մի քանի միլիմետրի կարգի է: Այս խնդիրը հաղթահարելու համար կարող է անհրաժեշտ լինել հեռավոր օբյեկտիվ: Ավելին, պատկերման նմուշի պատրաստման համար բարակ հատվածներ պատրաստելը դժվար է՝ PDMS-ի բարձր առաձգականության պատճառով: Ավելին, քանի որ չիպի վրա աղիքի շերտ առ շերտ միկրոֆաբրիկացիան ենթադրում է յուրաքանչյուր շերտի միջև մշտական ​​կպչունություն, չափազանց դժվար է բացել կամ հեռացնել վերին շերտը՝ էպիթելային շերտի մակերեսային կառուցվածքը ուսումնասիրելու համար: Օրինակ՝ սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի (SEM) միջոցով:
PDMS-ի հիդրոֆոբությունը սահմանափակող գործոն է եղել հիդրոֆոբ փոքր մոլեկուլների միկրոհոսքային վրա հիմնված ուսումնասիրություններում, քանի որ PDMS-ը կարող է ոչ սպեցիֆիկ կերպով ադսորբել նման հիդրոֆոբ մոլեկուլները: PDMS-ի այլընտրանքներ կարելի է դիտարկել այլ պոլիմերային նյութերի հետ: Այլընտրանքորեն, PDMS-ի մակերեսային մոդիֆիկացիան (օրինակ՝ լիպոֆիլ նյութերով42 կամ պոլի(էթիլենգլիկոլ)43 պատում) կարելի է դիտարկել՝ հիդրոֆոբ մոլեկուլների ադսորբցիան ​​նվազագույնի հասցնելու համար:
Վերջապես, մեր մեթոդը լավ չի բնութագրվել բարձր թողունակությամբ սկրինինգային կամ «բոլորին հարմար» օգտագործողին հարմար փորձարարական հարթակ ապահովելու առումով: Ներկայիս արձանագրությունը պահանջում է ներարկիչ պոմպ յուրաքանչյուր միկրոսարքի համար, որը տեղ է զբաղեցնում CO2 ինկուբատորում և կանխում է մեծածավալ փորձերը: Այս սահմանափակումը կարող է զգալիորեն բարելավվել նորարարական կուլտուրայի ձևաչափերի մասշտաբայնության միջոցով (օրինակ՝ 24-խոռոչ, 96-խոռոչ կամ 384-խոռոչ ծակոտկեն ներդիրներ, որոնք թույլ են տալիս անընդհատ համալրել և հեռացնել բազոլատերալ միջավայրը):
Մարդու աղիքային էպիթելի եռաչափ մորֆոգենեզը in vitro ինդուկցելու համար մենք օգտագործել ենք միկրոհոսքային չիպային աղիքային սարք, որը պարունակում է երկու զուգահեռ միկրոալիքներ և դրանց միջև առաձգական ծակոտկեն թաղանթ՝ լուսանցք-մազանոթային միջերես ստեղծելու համար: Մենք նաև ցուցադրում ենք միալիք միկրոհոսքային սարքի (հիբրիդային չիպ) օգտագործումը, որն ապահովում է անընդհատ բազոլատերալ հոսք Transwell ներդիրների վրա աճեցված բևեռացված էպիթելային շերտերի տակ: Երկու հարթակներում էլ մարդու աղիքային էպիթելային տարբեր բջիջների մորֆոգենեզը կարող է ցուցադրվել՝ կիրառելով հոսքի ուղղորդված մանիպուլյացիա՝ մորֆոգենի անտագոնիստները բազոլատերալ խցիկից հեռացնելու համար: Ամբողջ փորձարարական ընթացակարգը (Նկար 1) բաղկացած է հինգ մասից՝ (i) աղիքային չիպի կամ Transwell ներդրվող հիբրիդային չիպի միկրոպատրաստում (քայլեր 1-5; շրջանակ 1), (ii) աղիքային էպիթելային բջիջների (Caco-2 բջիջներ) կամ մարդու աղիքային օրգանոիդների պատրաստում. (տողեր 2-5), (iii) աղիքային էպիթելային բջիջների կուլտուրա աղիքային չիպերի կամ հիբրիդային չիպերի վրա (քայլեր 6-9), (iv) եռաչափ մորֆոգենեզի ինդուկցիա in vitro (քայլ 10) և (v))՝ եռաչափ էպիթելային միկրոկառուցվածքը բնութագրելու համար (քայլեր 11-24): Վերջապես, նախագծվել է համապատասխան վերահսկիչ խումբ (որը քննարկվում է ստորև)՝ in vitro մորֆոգենեզի արդյունավետությունը ստուգելու համար՝ համեմատելով էպիթելային մորֆոգենեզը տարածական, ժամանակային, պայմանական կամ ընթացակարգային վերահսկիչների հետ:
Մենք օգտագործել ենք երկու տարբեր կուլտուրայի հարթակներ՝ ուղիղ կամ ոչ գծային ոլորուն ալիքներով աղիք-չիպի ​​վրա, կամ միկրոհոսքային սարքում Transwell (TW) ներդիրներ պարունակող հիբրիդային չիպեր, որոնք պատրաստվել են 1-ին շրջանակում նկարագրվածի պես, և 1-5 քայլերը. «Սարքի պատրաստում» ցույց են տալիս մեկ չիպի կամ հիբրիդային չիպի պատրաստման հիմնական քայլերը: «Մարդու աղիքային էպիթելային բջիջների կուլտուրա» -ը բացատրում է բջջային աղբյուրը (Caco-2 կամ մարդու աղիքային օրգանոիդներ) և այս արձանագրությունում օգտագործված կուլտուրայի ընթացակարգը: «In vitro մորֆոգենեզ» -ը ցույց է տալիս ընդհանուր քայլերը, որոնց ընթացքում Caco-2-ը կամ օրգանոիդներից ստացված էպիթելային բջիջները կուլտուրացվում են աղիքային չիպի կամ հիբրիդային չիպի Transwell ներդիրների վրա, որին հաջորդում է եռաչափ մորֆոգենեզի ինդուկցիան և բնութագրված էպիթելային կառուցվածքի ձևավորումը: Ծրագրի քայլի համարը կամ շրջանակի համարը ցուցադրվում է յուրաքանչյուր նետի տակ: Դիմումը օրինակներ է տալիս, թե ինչպես կարելի է օգտագործել հաստատված աղիքային էպիթելային շերտերը, օրինակ՝ բջիջների դիֆերենցիացիայի բնութագրման, աղիքային ֆիզիոլոգիայի ուսումնասիրությունների, տեր-միկրոբիոմի էկոհամակարգերի ստեղծման և հիվանդությունների մոդելավորման մեջ: Իմունոֆլուորեսցենցիա «Բջջային դիֆերենցիացիա» բաժնում պատկերները ցույց են տալիս կորիզները, F-ակտինը և MUC2-ը, որոնք արտահայտվում են աղիքային չիպի վրա ստեղծված եռաչափ Caco-2 էպիթելային շերտում: MUC2 ազդանշանային ուղին առկա է գավաթային բջիջներում և լորձաթաղանթի մակերեսներից արտազատվող լորձում: «Աղիքների ֆիզիոլոգիա» բաժնում ֆլուորեսցենտային պատկերները ցույց են տալիս սիալաթթվի և N-ացետիլգլյուկոզամինի մնացորդների համար ֆլուորեսցենտ ցորենի սաղմի ագլյուտինինի միջոցով ներկման միջոցով առաջացած լորձը: «Հյուրընկալող-միկրոբ համատեղ մշակույթներ» բաժնում երկու համընկնող պատկերները ցույց են տալիս ներկայացուցչական հյուրընկալող-միկրոբիոմի համատեղ մշակույթներ աղիքներում չիպի վրա: Ձախ վահանակը ցույց է տալիս կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուց (GFP) արտահայտող E. coli-ի համատեղ մշակույթը՝ միկրոինժեներական եռաչափ Caco-2 էպիթելային բջիջների հետ: Աջ վահանակը ցույց է տալիս եռաչափ Caco-2 էպիթելային բջիջների հետ համատեղ մշակված GFP E. coli-ի տեղայնացումը, որին հաջորդում է իմունաֆլուորեսցենտային ներկումը F-ակտինով (կարմիր) և կորիզներով (կապույտ): Հիվանդության մոդելավորումը պատկերում է առողջ և արտահոսող աղիքներ աղիքային բորբոքման չիպերում՝ բակտերիալ հակածիններով ֆիզիոլոգիական ազդեցության տակ (օրինակ՝ լիպոպոլիսախարիդ, LPS) և իմունային բջիջներ (օրինակ՝ PBMC, կանաչ): Caco-2 բջիջները կուլտիվացվել են՝ եռաչափ էպիթելային շերտ ստեղծելու համար: Մասշտաբի գիծ, ​​50 մկմ: Պատկերները ներքևի շարքում. «Բջիջների տարբերակում»՝ հարմարեցված հղումից թույլտվությամբ: 2. Oxford University Press; Վերարտադրվել է հղում 5-ի թույլտվությամբ: NAS; «Հյուրընկալող-միկրոբ համատեղ կուլտուրա»՝ հարմարեցված հղում 3-ի թույլտվությամբ: NAS; «Հիվանդության մոդելավորում»՝ հարմարեցված հղումից թույլտվությամբ: 5. NAS:
Ե՛վ «աղիքային չիպի վրա» և՛ հիբրիդային չիպերը պատրաստվել են PDMS կրկնօրինակների միջոցով, որոնք սիլիկոնային կաղապարներից հանվել են փափուկ լիտոգրաֆիայի միջոցով1,44 և նախշվել SU-8-ով: Յուրաքանչյուր չիպի միկրոալիքների դիզայնը որոշվում է՝ հաշվի առնելով հիդրոդինամիկան, ինչպիսիք են սղման լարումը և հիդրոդինամիկ ճնշումը1,4,12: «աղիքային չիպի վրա» սկզբնական դիզայնը (Ընդլայնված տվյալներ, նկ. 1ա), որը բաղկացած էր երկու կողք կողքի դրված զուգահեռ ուղիղ միկրոալիքներից, զարգացել է բարդ «աղիքային չիպի վրա» դիզայնի (Ընդլայնված տվյալներ, նկ. 1բ), որը ներառում է կոր միկրոալիքների զույգ՝ հեղուկի նստեցման ժամանակի ավելացման, ոչ գծային հոսքի օրինաչափությունների և կուլտուրացված բջիջների բազմառանցքային դեֆորմացիայի առաջացման համար (նկ. 2ա-զ):12 Երբ անհրաժեշտ է վերստեղծել ավելի բարդ աղիքային կենսամեխանիկա, կարելի է ընտրել բարդ «աղիքային չիպ» մոդելներ: Մենք ցույց ենք տվել, որ խճճված «աղիքային չիպը» նաև ուժեղորեն առաջացնում է եռաչափ մորֆոգենեզ նմանատիպ ժամանակահատվածում՝ էպիթելի աճի նմանատիպ աստիճանով՝ համեմատած սկզբնականի հետ: Աղիք-չիպ, անկախ կուլտուրացված բջջի տեսակից։ Հետևաբար, եռաչափ մորֆոգենեզը առաջացնելու համար, չիպի վրա գծային և բարդ աղիքների դիզայնները փոխարինելի են։ SU-8 նախշերով սիլիկոնային կաղապարների վրա կարծրացված PDMS կրկնօրինակները կաղապարից հանելուց հետո բացասական հատկանիշներ են ապահովել (Նկար 2ա): Աղիք չիպի վրա ստեղծելու համար պատրաստված վերին PDMS շերտը հաջորդաբար միացվել է PDMS ծակոտկեն թաղանթին, ապա համապատասխանեցվել է PDMS ստորին շերտի հետ՝ անդառնալի կապով, օգտագործելով կորոնային մշակիչ (Նկար 2բ-զ): Հիբրիդային չիպեր ստեղծելու համար կարծրացված PDMS կրկնօրինակները միացվել են ապակե սլայդներին՝ Transwell ներդիրները տեղավորող միալիք միկրոհոսքային սարքեր ստեղծելու համար (Նկար 2ժ և ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 2): Կապման գործընթացն իրականացվում է PDMS կրկնօրինակի և ապակու մակերեսները թթվածնային պլազմայով կամ կորոնային մշակմամբ մշակելով: Սիլիկոնային խողովակին ամրացված միկրոպատրաստված սարքի ստերիլիզացումից հետո սարքի կարգավորումը պատրաստ էր աղիքային էպիթելիի եռաչափ մորֆոգենեզ կատարելու համար (Նկար 2գ):
ա, SU-8 նախշերով սիլիկոնային կաղապարներից PDMS մասերի պատրաստման սխեմատիկ պատկերազարդում: Չպնդեցված PDMS լուծույթը լցվել է սիլիկոնային կաղապարի վրա (ձախ), պնդացվել է 60°C-ում (մեջտեղում) և հանվել է կաղապարից (աջ): Հանված PDMS-ը կտրվել է կտորների և մաքրվել հետագա օգտագործման համար: բ, PDMS վերին շերտը պատրաստելու համար օգտագործված սիլիկոնային կաղապարի լուսանկար: գ, PDMS ծակոտկեն թաղանթը պատրաստելու համար օգտագործված սիլիկոնային կաղապարի լուսանկար: դ, PDMS վերին և ստորին բաղադրիչների և հավաքված չիպի վրա աղիքային սարքի լուսանկարների շարք: ե, PDMS վերին, թաղանթային և ստորին բաղադրիչների դասավորության սխեմատիկ պատկեր: Յուրաքանչյուր շերտ անդառնալիորեն կապված է պլազմային կամ կորոնային մշակմամբ: զ, Պատրաստված աղիք-չիպի ​​վրա սարքի սխեմատիկ պատկեր՝ վերադրված ոլորուն միկրոալիքներով և վակուումային խցիկներով: է, Աղիք-չիպի ​​վրա սարքի տեղադրում միկրոհեղուկային բջջային կուլտուրայի համար: Սիլիկոնային խողովակով և ներարկիչով հավաքված չիպի վրա պատրաստված աղիքները տեղադրվել են ծածկոցի վրա: Չիպային սարքը տեղադրվել է կափարիչի վրա: 150 մմ Պետրիի աման՝ մշակման համար։ Կապակցանյութն օգտագործվում է սիլիկոնային խողովակը փակելու համար։ ժ, Հիբրիդային չիպի պատրաստման և հիբրիդային չիպերի միջոցով եռաչափ մորֆոգենեզի տեսողական կադրեր։ Աղիքային էպիթելային բջիջների երկչափ մոնոշերտերի կուլտուրաների համար անկախ պատրաստված Transwell ներդիրները տեղադրվել են հիբրիդային չիպի մեջ՝ աղիքային եռաչափ մորֆոգենեզը առաջացնելու համար։ Միջավայրը պերֆուզվում է Transwell ներդիրի վրա ստեղծված բջջային շերտի տակ գտնվող միկրոալիքների միջոցով։ Մասշտաբի սյուն, 1 սմ։ ժ Վերատպված է հղումից թույլտվությամբ։ 4. Elsevier։
Այս արձանագրության մեջ Caco-2 բջջային գիծը և աղիքային օրգանոիդները օգտագործվել են որպես էպիթելային աղբյուրներ (Նկար 3ա): Երկու տեսակի բջիջներն էլ կուլտիվացվել են անկախ (Տուփ 2 և Տուփ 5) և օգտագործվել են չիպի վրա գտնվող աղիքի կամ Transwell ներդիրների ECM-պատված միկրոալիքները ցանելու համար: Երբ բջիջները միաձուլվում են (>95% ծածկույթ սրվակներում), T-սրվակներում պարբերաբար կուլտիվացված Caco-2 բջիջները (10-րդ և 50-րդ անցուղիների միջև) հավաքվում են տրիպսինացման հեղուկով դիսոցացված բջջային կախույթներ պատրաստելու համար (տուփ 2): Աղիքային բիոպսիաներից կամ վիրաբուժական հեռացումներից մարդու աղիքային օրգանոիդները կուլտիվացվել են Matrigel կառուցվածքային գմբեթներում 24-փոսանի թիթեղներում՝ կառուցվածքային միկրոմիջավայրը պահպանելու համար: Տուփ 3-ում նկարագրվածի պես պատրաստված էական մորֆոգեններ (օրինակ՝ Wnt, R-սպոնդին և Նոգգին) և աճի գործոններ պարունակող միջավայրը լրացվել է ամեն երկրորդ օրը, մինչև որ օրգանոիդները աճել են մինչև ~500 մկմ տրամագծով: Լիովին աճեցված օրգանոիդները հավաքվում և դիսոցացվում են առանձին բջիջների՝ ցանելու համար: աղիք կամ Transwell ներդիրներ չիպի վրա (Տուփ 5): Ինչպես նախկինում նշել ենք, այն կարելի է տարբերակել հիվանդության տեսակի12,13 (օրինակ՝ խոցային կոլիտ, Կրոնի հիվանդություն, հաստ աղիքի քաղցկեղ կամ նորմալ դոնոր), վնասվածքի տեղակայման (օրինակ՝ վնասվածք ընդդեմ չվնասված տարածքի) և ստամոքս-աղիքային տրակտի տեղակայման (օրինակ՝ տասներկումատնյա աղիք, աղիք, իլեում, կույր աղիք, հաստ աղիք կամ ուղիղ աղիք): Տուփ 5-ում մենք տրամադրում ենք օպտիմալացված արձանագրություն հաստ աղիքի օրգանոիդների (կոլոիդներ) կուլտիվացման համար, որոնք սովորաբար պահանջում են մորֆոգենների ավելի բարձր կոնցենտրացիաներ, քան բարակ աղիքի օրգանոիդները:
ա, Աղիքային մորֆոգենեզի ինդուկցիայի աշխատանքային հոսքը աղիքային չիպում: Այս արձանագրությունում օգտագործվում են Caco-2 մարդու աղիքային էպիթելիումը և աղիքային օրգանոիդները՝ եռաչափ մորֆոգենեզը ցուցադրելու համար: Մեկուսացված էպիթելային բջիջները ցանվել են պատրաստված «աղիքային չիպի վրա» սարքի մեջ (չիպի պատրաստում): Երբ բջիջները ցանվում են (սերմնացվում) և կցվում (ամրացվում) PDMS ծակոտկեն թաղանթին 0-րդ օրը (D0), սկսվում է ապիկալ (AP) հոսքը և պահպանվում առաջին 2 օրերի ընթացքում (հոսք, AP, D0-D2): Բազոլատերալ (BL) հոսքը նույնպես սկսվում է ցիկլիկ ձգման շարժումների հետ միասին (ձգում, հոսք, AP և BL), երբ ձևավորվում է ամբողջական 2D մոնաշերտ: Աղիքային եռաչափ մորֆոգենեզը տեղի է ունեցել ինքնաբուխ՝ միկրոհոսքային կուլտուրայի 5 օր անց (մորֆոգենեզ, D5): Փուլային կոնտրաստային պատկերները ցույց են տալիս Caco-2 բջիջների ներկայացուցչական մորֆոլոգիան յուրաքանչյուր փորձարարական քայլում կամ ժամանակային կետում (սյունակային գրաֆիկ, 100 մկմ): Աղիքային մորֆոգենեզի համապատասխան կասկադները պատկերող չորս սխեմատիկ դիագրամներ (վերևում աջ)։ Սխեմայում կետավոր նետերը ներկայացնում են հեղուկի հոսքի ուղղությունը։ բ, ՍԷՄ պատկեր, որը ցույց է տալիս հաստատված 3D Caco-2 էպիթելի մակերեսային տոպոլոգիան (ձախ)։ Մեծացված տարածքը ընդգծող ներդիրը (սպիտակ կետավոր վանդակ) ցույց է տալիս վերականգնված միկրոթավիկները 3D Caco-2 շերտի վրա (աջ)։ գ, հաստատված Caco-2 3D, կլոդինի (ZO-1, կարմիր) և F-ակտինով (կանաչ) և կորիզներով (կապույտ) նշված անընդհատ խոզանակային սահմանային թաղանթների հորիզոնական ճակատային տեսք։ Էպիթելային բջիջների իմունաֆլուորեսցենտային կոնֆոկալ վիզուալիզացիա աղիքային չիպերի վրա։ Միջին սխեմատիկին մատնանշող նետերը ցույց են տալիս ֆոկուսային հարթության տեղը յուրաքանչյուր կոնֆոկալ տեսքի համար։ դ, Ֆազային կոնտրաստային մանրադիտակով ստացված չիպի վրա կուլտիվացված օրգանոիդների մորֆոլոգիական փոփոխությունների ժամանակային ընթացքը 3, 7, 9, 11 և 13 օրերին։ Ներդիրը (վերևի աջ կողմում) ցույց է տալիս տրամադրված պատկերի մեծ մեծացումը։ ե, 7-րդ օրը կատարված կտորի վրա աղիքում հաստատված օրգանոիդ 3D էպիթելի DIC ֆոտոմիկրոգրաֆիա։ զ, Վերադրված իմունաֆլուորեսցենտային պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս ցողունային բջիջների (LGR5; մանուշակագույն), գոբլետային բջիջների (MUC2; կանաչ), F-ակտինի (մոխրագույն) և կորիզների (երկնագույն) մարկերներ, որոնք համապատասխանաբար 3 օր (ձախ) և 13-օրյա (միջին) օրգանոիդների են աճեցվել էպիթելային շերտի վրա: Տես նաև ընդլայնված տվյալների նկար 3-ը, որը ընդգծում է LGR5 ազդանշանային ուղին առանց MUC2 ազդանշանային ուղու: Ֆլուորեսցենտային պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս աղիքում հաստատված եռաչափ օրգանոիդ էպիթելի էպիթելի միկրոկառուցվածքը (աջ) չիպի վրա՝ պլազմային թաղանթը CellMask ներկանյութով ներկելով (աջ) կուլտուրայի 13-րդ օրը: Մասշտաբի գիծը 50 մկմ է, եթե այլ բան նշված չէ:բ Վերատպված է հղումից թույլտվությամբ:2. Oxford University Press; գ Հարմարեցված է հղումից թույլտվությամբ:2. Oxford University Press; ե և զ հարմարեցված է հղումից թույլտվությամբ:12 Creative Commons License CC BY 4.0-ի ներքո:
Աղիքներում չիպի վրա անհրաժեշտ է փոփոխել PDMS ծակոտկեն թաղանթի հիդրոֆոբ մակերեսը՝ ECM-ի հաջող ծածկույթի համար: Այս արձանագրությունում մենք կիրառում ենք երկու տարբեր մեթոդ՝ PDMS թաղանթների հիդրոֆոբությունը փոփոխելու համար: Caco-2 բջիջների կուլտիվացման համար միայն ուլտրամանուշակագույն/օզոնային մշակմամբ մակերեսային ակտիվացումը բավարար էր PDMS մակերեսի հիդրոֆոբությունը նվազեցնելու, ECM-ը պատելու և Caco-2 բջիջները PDMS թաղանթին կցելու համար: Այնուամենայնիվ, օրգանոիդ էպիթելիի միկրոհեղուկային կուլտուրան պահանջում է քիմիական հիմքով մակերեսային ֆունկցիոնալիզացիա՝ ECM սպիտակուցների արդյունավետ նստեցման համար՝ PDMS միկրոալիքներին հաջորդաբար պոլիէթիլենիմին (PEI) և գլուտարալդեհիդ կիրառելով: Մակերեսային փոփոխությունից հետո ECM սպիտակուցները նստեցվել են PDMS ֆունկցիոնալիզացված մակերեսը ծածկելու համար, ապա ներմուծվել են մեկուսացված օրգանոիդ էպիթելիում: Բջիջների կցվելուց հետո միկրոհեղուկային բջջային կուլտուրան սկսվում է միայն վերին միկրոալիքի մեջ միջամտելով մինչև բջիջները ձևավորեն ամբողջական մոնաշերտ, մինչդեռ ստորին միկրոալիքը պահպանում է ստատիկ պայմաններ: Մակերեսային ակտիվացման և ECM ծածկույթի այս օպտիմիզացված մեթոդը հնարավորություն է տալիս օրգանոիդ էպիթելիի կցելը՝ 3D առաջացնելու համար: Մորֆոգենեզը PDMS մակերեսին։
Տրանսվելային կուլտուրաները նույնպես պահանջում են ECM ծածկույթ բջիջների ցանքից առաջ, սակայն Տրանսվելային կուլտուրաները չեն պահանջում բարդ նախնական մշակման քայլեր՝ ծակոտկեն ներդիրների մակերեսը ակտիվացնելու համար: Տրանսվելային ներդիրների վրա Caco-2 բջիջներ աճեցնելու համար ծակոտկեն ներդիրների վրա ECM ծածկույթը արագացնում է դիսոցացված Caco-2 բջիջների կպչունությունը (<1 ժամ) և ամուր միացման արգելքի առաջացումը (<1-2 օր): Տրանսվելային ներդիրների վրա օրգանոիդներ աճեցնելու համար մեկուսացված օրգանոիդները ցանվում են ECM-ով պատված ներդիրների վրա, կպչում թաղանթի մակերեսին (<3 ժամ) և պահպանվում մինչև օրգանոիդների կողմից արգելքի ամբողջականությամբ ամբողջական մոնաշերտ ձևավորումը: Տրանսվելային կուլտուրաները կատարվում են 24-փոսանոց թիթեղներում՝ առանց հիբրիդային չիպերի օգտագործման:
In vitro 3D մորֆոգենեզը կարող է սկսվել՝ հեղուկի հոսք կիրառելով արդեն իսկ ձևավորված էպիթելային շերտի բազոլատերալ կողմում: Չիպի վրա գտնվող աղիքում էպիթելային մորֆոգենեզը սկսվել է, երբ միջավայրը պերֆուզիայի է ենթարկվել վերին և ստորին միկրոալիքների մեջ (Նկար 3ա): Ինչպես նախկինում նկարագրվել է, կարևոր է ստորին (բազոլատերալ) խցիկ ներմուծել հեղուկի հոսք՝ ուղղորդված արտազատվող մորֆոգենի ինհիբիտորների շարունակական հեռացման համար: Ծակոտկեն թաղանթների վրա կապված բջիջներին բավարար սննդանյութեր և շիճուկ ապահովելու և լուսային սղման լարվածություն առաջացնելու համար մենք սովորաբար կրկնակի հոսք ենք կիրառում աղիքում՝ չիպի վրա: Հիբրիդային չիպերում էպիթելային մոնաշերտեր պարունակող Transwell ներդիրները տեղադրվել են հիբրիդային չիպերի մեջ: Այնուհետև միջավայրը տեղադրվել է ծակոտկեն Transwell ներդիրի բազոլատերալ կողմի տակ՝ միկրոալիքի միջոցով: Աղիքային մորֆոգենեզը տեղի է ունեցել բազոլատերալ հոսքի սկսվելուց 3-5 օր անց երկու կուլտուրային հարթակներում:
Միկրոինժեներական 3D էպիթելային շերտերի ձևաբանական առանձնահատկությունները կարող են վերլուծվել տարբեր պատկերման մեթոդների կիրառմամբ, ներառյալ փուլային կոնտրաստային մանրադիտակը, դիֆերենցիալ ինտերֆերենցիալ կոնտրաստային (DIC) մանրադիտակը, SEM-ը կամ իմունաֆլուորեսցենտային կոնֆոկալ մանրադիտակը (Նկարներ 3 և 4): Փուլային կոնտրաստային կամ DIC պատկերումը կարող է հեշտությամբ իրականացվել կուլտուրայի ընթացքում ցանկացած պահի՝ 3D էպիթելային շերտերի ձևը և ելուստը վերահսկելու համար: PDMS-ի և պոլիեսթերային թաղանթների օպտիկական թափանցիկության շնորհիվ, թե՛ չիպի վրա աղիք, թե՛ հիբրիդային չիպային հարթակները կարող են ապահովել իրական ժամանակի in situ պատկերացում՝ առանց սարքի կտրման կամ ապամոնտաժման անհրաժեշտության: Իմունաֆլուորեսցենտային պատկերացում կատարելիս (Նկարներ 1, 3c, f և 4b, c), բջիջները սովորաբար ֆիքսվում են 4% (քաշ/ծավալ) պարաֆորմալդեհիդով (PFA), որին հաջորդում է Triton X-100-ը և 2% (քաշ/ծավալ)) խոշոր եղջերավոր անասունների շիճուկային ալբումինով (BSA)՝ ըստ հերթականության: Կախված բջջի տեսակից, կարող են օգտագործվել տարբեր ֆիքսատորներ, թափանցելիացնող նյութեր և արգելափակող նյութեր: օգտագործված։ Չիպի վրա տեղում անշարժացված բջիջները առանձնացնելու համար օգտագործվում են տոհմածառից կախված բջջային կամ շրջանային մարկերներ թիրախավորող առաջնային հակամարմիններ, որոնց հաջորդում են երկրորդային հակամարմինները՝ հականերկման ներկանյութի հետ միասին, որը թիրախավորում է կամ միջուկը (օրինակ՝ 4',6-դիամիդինո-2-ֆենիլեն) ինդոլը, DAPI-ն, կամ F-ակտինը (օրինակ՝ ֆլուորեսցենտային նշագրված ֆալոիդինը)։ Ֆլուորեսցենցիայի վրա հիմնված կենդանի պատկերումը կարող է նաև իրականացվել տեղում՝ լորձի արտադրությունը հայտնաբերելու համար (Նկար 1, «Բջջային դիֆերենցիացիա» և «Աղիքային ֆիզիոլոգիա»), մանրէային բջիջների պատահական գաղութացումը (Նկար 1, «Հյուրընկալող-միկրոբ համատեղ կուլտուրա»), իմունային բջիջների հավաքագրումը (Նկար 1, «Հիվանդության մոդելավորում») կամ եռաչափ էպիթելային ձևաբանության ուրվագծերը (Նկար 3c,f և 4b,c)։ Երբ չիպի վրա աղիքը փոփոխվում է՝ վերին շերտը ստորին միկրոալիքային շերտից առանձնացնելու համար, ինչպես նկարագրված է հղումում։ Ինչպես ցույց է տրված նկար 2-ում, եռաչափ էպիթելային ձևաբանությունը, ինչպես նաև գագաթային միկրոթավիկները Խոզանակաձև եզրը կարելի է վիզուալիզացնել ՍԷՄ-ի միջոցով (Նկ. 3բ): Դիֆերենցիացիայի մարկերների էքսպրեսիան կարելի է գնահատել քանակական ՊՇՌ5 կամ միաբջիջ ՌՆԹ հաջորդականացման միջոցով: Այս դեպքում, աղիքային չիպերում կամ հիբրիդային չիպերում աճեցված էպիթելային բջիջների եռաչափ շերտերը հավաքվում են տրիպսինիզացիայի միջոցով, այնուհետև օգտագործվում են մոլեկուլային կամ գենետիկական վերլուծության համար:
ա, Աշխատանքային հոսք հիբրիդային չիպում աղիքային մորֆոգենեզի ինդուկցիայի համար: Այս արձանագրությունում Caco-2-ը և աղիքային օրգանոիդները օգտագործվում են հիբրիդային չիպային հարթակում եռաչափ մորֆոգենեզը ցուցադրելու համար: Դիսոցացված էպիթելային բջիջները ցանվել են պատրաստված Transwell ներդիրներում (TW նախապատրաստում; տե՛ս ստորև նկարը): Բջիջները ցանելուց (սերմացվելուց) և Transwell ներդիրներում պոլիեսթերային թաղանթներին կցվելուց հետո բոլոր բջիջները կուլտիվացվել են ստատիկ պայմաններում (TW կուլտիվացիա): 7 օր անց, էպիթելային բջիջների երկչափ մոնաշերտ պարունակող Transwell ներդիրը ինտեգրվել է հիբրիդային չիպի մեջ՝ բազոլատերալ հոսք ներմուծելու համար (Flow, BL), որը, ի վերջո, հանգեցրել է եռաչափ էպիթելային շերտի առաջացմանը (մորֆոգենեզ): Փուլային կոնտրաստային միկրոֆոտոները ցույց են տալիս մարդու օրգանի էպիթելային բջիջների մորֆոլոգիական առանձնահատկությունները, որոնք ստացվել են նորմալ դոնորի (C103 գիծ) վերելք կատարող հաստ աղիքից յուրաքանչյուր փորձարարական քայլում կամ ժամանակային կետում: Վերին շերտերի սխեմատիկ պատկերները պատկերում են յուրաքանչյուր քայլի փորձարարական կոնֆիգուրացիան: բ, Հիբրիդային չիպերը (ձախ սխեմատիկ պատկեր) կարող են հանգեցնել օրգանոիդ էպիթելային բջիջների եռաչափ մորֆոգենեզի՝ Վերևից ներքև կոնֆոկալ մանրադիտակի պատկերներ, որոնք արվել են տարբեր Z դիրքերում (վերին, միջին և ստորին; տե՛ս աջ սխեման և համապատասխան կետավոր գծերը): Ցույց են տվել ակնհայտ ձևաբանական բնութագրեր: F-ակտին (երկնագույն), կորիզ (մոխրագույն): c, ստատիկ Transwell-ում (TW; ներդիրը սպիտակ կետավոր վանդակում) կուլտիվացված օրգանոիդներից ստացված էպիթելային բջիջների ֆլուորեսցենտ կոնֆոկալ միկրոֆոտոներ (3D անկյունային պատկեր)՝ համեմատած հիբրիդային չիպի (ամենամեծ ամբողջական պատկերը), որոնք համեմատում են համապատասխանաբար 2D և 3D ձևաբանությունը: 2D ուղղահայաց խաչաձև կտրվածքի պատկերների զույգը (ներդիրը վերին աջ անկյունում; «XZ») նույնպես ցույց են տալիս 2D և 3D առանձնահատկություններ: Մասշտաբի սյուն, 100 µm: c Վերատպվել է հղումից թույլտվությամբ: 4. Elsevier:
Վերահսկիչները կարող են պատրաստվել նույն բջիջները (Caco-2 կամ աղիքային օրգանոիդ էպիթելային բջիջներ) երկչափ մոնոշերտերի մեջ կուլտիվացնելով՝ ավանդական ստատիկ կուլտիվացման պայմաններում: Հատկանշական է, որ սննդանյութերի սպառումը կարող է պայմանավորված լինել միկրոալիքների սահմանափակ ծավալային տարողությամբ (այսինքն՝ ~4 մկլ վերին ալիքում՝ սկզբնական աղիքային չիպի դիզայնի վրա): Հետևաբար, կարելի է համեմատել նաև էպիթելային ձևաբանությունը բազոլատերալ հոսքի կիրառումից առաջ և հետո:
Փափուկ լիտոգրաֆիայի գործընթացը պետք է իրականացվի մաքուր սենյակում: Չիպի յուրաքանչյուր շերտի (վերին և ստորին շերտեր և թաղանթներ) և հիբրիդային չիպերի համար օգտագործվել և պատրաստվել են տարբեր ֆոտոդիմակներ առանձին սիլիկոնային վաֆլիների վրա, քանի որ միկրոալիքների բարձրությունները տարբեր էին: Չիպի վրա աղիքի վերին և ստորին միկրոալիքների նպատակային բարձրությունները համապատասխանաբար 500 մկմ և 200 մկմ են: Հիբրիդային չիպի ալիքի նպատակային բարձրությունը 200 մկմ է:
Տեղադրեք 3 դյույմանոց սիլիկոնային վաֆլի ացետոնով լցված ամանի մեջ։ Զգուշորեն պտտեցրեք թիթեղը 30 վայրկյան, այնուհետև չորացրեք վաֆլին օդում։ Տեղափոխեք վաֆլին IPA-ով լցված ափսեի մեջ, այնուհետև պտտեցրեք թիթեղը 30 վայրկյան՝ մաքրելու համար։
Սիլիկոնային վաֆլիի մակերեսից օրգանական մնացորդների հեռացումը մեծացնելու համար կարող է ընտրովի օգտագործվել պիրանյայի լուծույթ (ջրածնի պերօքսիդի և խտացված ծծմբական թթվի խառնուրդ, 1:3 (ծավալ/ծավալ)):
Պիրանյայի լուծույթը չափազանց կոռոզիվ է և ջերմություն է առաջացնում: Անհրաժեշտ են լրացուցիչ անվտանգության միջոցառումներ: Թափոնների հեռացման համար թողեք լուծույթը սառչի և տեղափոխեք մաքուր, չոր թափոնների տարայի մեջ: Օգտագործեք երկրորդական տարաներ և պատշաճ կերպով պիտակավորեք թափոնների տարաները: Խնդրում ենք հետևել հաստատության անվտանգության ուղեցույցներին՝ ավելի մանրամասն ընթացակարգերի համար:
Վաֆլիները չորացրեք՝ դրանք 10 րոպե դնելով 200°C տաքացնող ափսեի վրա: Ջրազրկումից հետո վաֆլին հինգ անգամ թափահարել են օդում՝ սառչելու համար:
Մաքրված սիլիկոնային վաֆլիի կենտրոնի վրա լցրեք մոտ 10 գ SU-8 2100 լուսակայուն նյութ։ Օգտագործեք աքցան՝ լուսակայուն նյութը վաֆլիի վրա հավասարաչափ տարածելու համար։ Ժամանակ առ ժամանակ վաֆլին դրեք 65°C տաքացնող ափսեի վրա, որպեսզի այն պակաս կպչուն լինի և ավելի հեշտ տարածվի։ Վաֆլին մի դրեք անմիջապես տաքացնող ափսեի վրա։
SU-8-ը հավասարաչափ բաշխվեց վաֆլիի վրա՝ պտտվող ծածկույթով։ Ծրագրավորեք SU-8-ի մուտքային պտույտը 5-10 վայրկյանում՝ 500 պտ/րոպե արագությամբ տարածվելու համար՝ 100 պտ/րոպե արագությամբ։ Սահմանեք հիմնական պտույտը 200 մկմ հաստության նախշերի համար 1500 պտ/րոպե արագությամբ կամ հասեք 250 մկմ հաստության (չիպի վրա ներքին շերտի վերին շերտի համար ստեղծելով 500 մկմ բարձրություն. տե՛ս «Կարևոր քայլեր» ստորև)՝ սահմանելով 300 պտ/րոպե արագացում 30 վայրկյանում՝ 1200 պտ/րոպե արագությամբ։
Հիմնական պտտման արագությունը կարող է կարգավորվել սիլիկոնային վաֆլիի վրա SU-8 նախշի նպատակային հաստության համաձայն։
Չիպի վրա աղիքի վերին շերտի համար 500 մկմ բարձրությամբ SU-8 նախշեր պատրաստելու համար, այս տուփի պտտվող ծածկույթի և փափուկ թխման քայլերը (7-րդ և 8-րդ քայլերը) հաջորդաբար կրկնվել են (տե՛ս 9-րդ քայլը)՝ ստանալով SU-8-ի 250 մկմ հաստությամբ երկու շերտ, որոնք կարող են շերտավորվել և միացվել ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման միջոցով այս տուփի 12-րդ քայլում՝ ստանալով 500 մկմ բարձրությամբ շերտ։
SU-8 պատված վաֆլիները մեղմ թխեք՝ զգուշորեն դրանք տեղադրելով տաք թիթեղի վրա 65°C ջերմաստիճանում 5 րոպե, այնուհետև ջերմաստիճանը փոխեք 95°C-ի և ինկուբացեք ևս 40 րոպե։
Վերին միկրոալիքում SU-8 նախշի 500 մկմ բարձրություն ստանալու համար կրկնեք 7-րդ և 8-րդ քայլերը՝ 250 մկմ հաստությամբ երկու SU-8 շերտեր ստանալու համար։
Օգտագործելով UV դիմակի ուղղիչ սարքը, կատարեք լամպի թեստ արտադրողի հրահանգների համաձայն՝ վաֆլիի ազդեցության ժամանակը հաշվարկելու համար։ (ազդեցության ժամանակը, մվ) = (ազդեցության դոզան, մՋ/սմ2)/(լամպի հզորությունը, մՎտ/սմ2):
Էքսպոզիցիայի ժամանակը որոշելուց հետո լուսանկարչական դիմակը տեղադրեք ուլտրամանուշակագույն դիմակի դասավորիչի դիմակի պահոցի վրա և լուսանկարչական դիմակը տեղադրեք SU-8 ծածկույթով վաֆլիի վրա։
Լուսադիմակի տպագիր մակերեսը տեղադրեք անմիջապես սիլիկոնային վաֆլիի SU-8 ծածկույթով կողմի վրա՝ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթների ցրումը նվազագույնի հասցնելու համար։
SU-8 պատված վաֆլին և ֆոտոդիմակը ուղղահայաց ենթարկեք 260 մՋ/սմ2 ուլտրամանուշակագույն լույսի՝ նախապես որոշված ​​​​ազդեցության ժամանակի համար (տե՛ս այս շրջանակի 10-րդ քայլը):
Ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման ենթարկվելուց հետո, SU-8-ով պատված սիլիկոնային վաֆլիները թխվել են 65°C ջերմաստիճանում 5 րոպե և 95°C ջերմաստիճանում 15 րոպե յուրաքանչյուր տաք թիթեղի վրա՝ 200 մկմ բարձրությամբ նախշեր պատրաստելու համար: 500 մկմ բարձրությամբ նախշեր պատրաստելու համար թխման հետժամանակը երկարացնել մինչև 30 րոպե:
Զարգացնող նյութը լցնում են ապակե ամանի մեջ, և թխված վաֆլին տեղադրում են այնտեղ։ SU-8 մշակողի ծավալը կարող է տարբեր լինել՝ կախված ապակե ափսեի չափից։ Համոզվեք, որ օգտագործում եք բավարար քանակությամբ SU-8 մշակող՝ չբացահայտված SU-8-ը ամբողջությամբ հեռացնելու համար։ Օրինակ, երբ օգտագործում եք 150 մմ տրամագծով և 1 լիտր տարողությամբ ապակե աման, օգտագործեք մոտ 300 մլ SU-8 մշակող։ Զարգացրեք կաղապարը 25 րոպե՝ պարբերաբար մեղմ պտտելով։
Լվացեք զարգացած կաղապարը մոտ 10 մլ թարմ մշակիչով, որին հաջորդում է IPA-ի կիրառումը՝ լուծույթը պիպետով ցողելով։
Տեղադրեք վաֆլին պլազմային մաքրող սարքի մեջ և 1.5 րոպե ենթարկեք թթվածնային պլազմայի (մթնոլորտային գազ, նպատակային ճնշում՝ 1 × 10−5 Տոր, հզորություն՝ 125 Վտ):
Տեղադրեք վաֆլին վակուումային էքսիկատորում՝ ներսում ապակե սահիկով։ Վաֆլիները և սահիկները կարող են տեղադրվել կողք կողքի։ Եթե վակուումային էքսիկատորը թիթեղով բաժանված է մի քանի շերտերի, սահիկները տեղադրեք ստորին խցիկում, իսկ վաֆլիները՝ վերին խցիկում։ Ապակե սահիկի վրա կաթեցրեք 100 մկլ տրիքլոր(1H, 1H, 2H, 2H-պերֆտորօկտիլ)սիլանային լուծույթ և կիրառեք վակուում սիլանիզացման համար։
Սառեցված Caco-2 բջիջների սրվակը հալեցրեք 37°C ջրային բաղնիքում, այնուհետև հալեցված բջիջները տեղափոխեք T75 սրվակի մեջ, որը պարունակում է 15 մլ 37°C ջերմաստիճանում նախապես տաքացված Caco-2 միջավայր։
Caco-2 բջիջները մոտ 90% միաձուլման դեպքում անցկացնելու համար նախ 37°C ջրային բաղնիքում տաքացրեք Caco-2 միջավայրը, PBS-ը և 0.25% տրիպսին/1 մՄ EDTA-ն։
Միջավայրը վակուումային ասպիրացիայի միջոցով ասպիրացրեք։ Բջիջները երկու անգամ լվացեք 5 մլ տաք PBS-ով՝ կրկնելով վակուումային ասպիրացիան և ավելացնելով թարմ PBS։