Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Quá trình hình thành ruột người thiết lập các đặc điểm nhung mao-tuyến ruột của cấu trúc vi mô biểu mô 3D và tổ chức không gian. Cấu trúc độc đáo này cần thiết để duy trì cân bằng nội môi của ruột bằng cách bảo vệ ổ tế bào gốc ở đáy tuyến ruột khỏi các kháng nguyên vi khuẩn ngoại sinh và các chất chuyển hóa của chúng. Ngoài ra, nhung mao ruột và chất nhầy tiết ra có các tế bào biểu mô biệt hóa chức năng với một hàng rào bảo vệ trên bề mặt niêm mạc ruột. Do đó, việc tái tạo cấu trúc biểu mô 3D là rất quan trọng cho việc xây dựng các mô hình ruột trong ống nghiệm. Đáng chú ý, mô hình ruột trên chip mô phỏng hữu cơ có thể tạo ra quá trình hình thành 3D tự phát của biểu mô ruột với các chức năng sinh lý và cơ sinh học được tăng cường. Ở đây, chúng tôi cung cấp một quy trình có thể tái tạo để tạo ra quá trình hình thành ruột một cách mạnh mẽ trên ruột trên chip vi lưu cũng như trên chip lai nhúng Transwell. Chúng tôi mô tả chi tiết các phương pháp chế tạo thiết bị, nuôi cấy tế bào biểu mô Caco-2 hoặc cơ quan ruột trong điều kiện thông thường cũng như trên nền tảng vi lưu, tạo ra quá trình hình thành 3D và đặc điểm hóa. Phương pháp này tái tạo cấu trúc vi mô ruột 3D bằng cách kiểm soát dòng chảy dịch đáy trong 5 ngày. Phương pháp hình thái học trong ống nghiệm của chúng tôi sử dụng ứng suất cắt và chuyển động cơ học phù hợp với sinh lý và không yêu cầu kỹ thuật hoặc thao tác tế bào phức tạp, có thể vượt trội hơn các kỹ thuật hiện có khác. Chúng tôi hình dung rằng phương pháp đề xuất của chúng tôi có thể có ý nghĩa rộng lớn đối với cộng đồng nghiên cứu y sinh, cung cấp một phương pháp để tái tạo các lớp biểu mô ruột 3D trong ống nghiệm cho các ứng dụng y sinh, lâm sàng và dược phẩm.
Các thí nghiệm chứng minh rằng tế bào biểu mô ruột Caco-2 được nuôi cấy trong thiết bị ruột trên chip1,2,3,4,5 hoặc thiết bị vi lưu hai lớp6,7 có thể trải qua quá trình hình thành cấu trúc 3D tự phát trong ống nghiệm mà chưa hiểu rõ cơ chế cơ bản. Trong nghiên cứu gần đây của chúng tôi, chúng tôi nhận thấy rằng việc loại bỏ các chất đối kháng hình thái được tiết ra ở mặt đáy từ các thiết bị nuôi cấy là cần thiết và đủ để gây ra quá trình hình thành cấu trúc biểu mô 3D trong ống nghiệm, điều này đã được chứng minh bằng tế bào Caco-2 và các cơ quan ruột có nguồn gốc từ bệnh nhân. Các tế bào biểu mô đã được xác nhận. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung cụ thể vào quá trình sản xuất tế bào và phân bố nồng độ của chất đối kháng Wnt mạnh, Dickkopf-1 (DKK-1), trong hệ thống ruột trên chip và các thiết bị vi lưu biến được sửa đổi có chứa các miếng chèn Transwell, được gọi là "Chip lai". Chúng tôi chứng minh rằng việc bổ sung các chất đối kháng Wnt ngoại sinh (như DKK-1, chất ức chế Wnt 1, protein liên quan đến frizzled được tiết ra 1, hoặc Soggy-1) vào ruột trên chip ức chế quá trình hình thành hoặc phá vỡ lớp biểu mô 3D được cấu trúc sẵn, cho thấy rằng căng thẳng đối kháng trong quá trình nuôi cấy chịu trách nhiệm cho quá trình hình thành ruột trong ống nghiệm. Do đó, một cách tiếp cận thực tế để đạt được quá trình hình thành mạnh mẽ tại giao diện biểu mô là loại bỏ hoặc duy trì tối thiểu mức độ chất đối kháng Wnt trong ngăn đáy bằng cách rửa chủ động (ví dụ: trong nền tảng ruột trên chip hoặc chip lai) hoặc khuếch tán. Môi trường đáy (ví dụ: từ các miếng chèn Transwell vào các bể chứa đáy lớn trong giếng).
Trong quy trình này, chúng tôi cung cấp phương pháp chi tiết để chế tạo các thiết bị vi mô ruột trên chip và chip lai có thể chèn vào Transwell (các bước 1-5) để nuôi cấy tế bào biểu mô ruột trên màng xốp dựa trên polydimethylsiloxane (PDMS) (các bước 6A, 7A, 8, 9) hoặc màng polyester của miếng chèn Transwell (các bước 6B, 7B, 8, 9) và tạo hình thái 3D trong ống nghiệm (bước 10). Chúng tôi cũng xác định các đặc điểm tế bào và phân tử biểu thị quá trình hình thành mô đặc hiệu và sự biệt hóa tế bào phụ thuộc vào dòng dõi bằng cách áp dụng nhiều phương thức hình ảnh (các bước 11-24). Chúng tôi tạo hình thái bằng cách sử dụng tế bào biểu mô ruột người, chẳng hạn như Caco-2 hoặc các cơ quan ruột nhân tạo, trong hai định dạng nuôi cấy với các chi tiết kỹ thuật bao gồm sửa đổi bề mặt của màng xốp, tạo lớp đơn 2D và tái tạo môi trường vi mô sinh hóa và cơ học của ruột trong ống nghiệm. Để tạo hình thái 3D từ các lớp đơn biểu mô 2D, chúng tôi Loại bỏ các chất đối kháng hình thái trong cả hai dạng nuôi cấy bằng cách cho môi trường chảy vào ngăn đáy của môi trường nuôi cấy. Cuối cùng, chúng tôi cung cấp một hình ảnh minh họa về tiện ích của lớp biểu mô 3D có thể tái tạo, có thể được sử dụng để mô hình hóa sự phát triển biểu mô phụ thuộc vào hình thái, nuôi cấy đồng thời vật chủ-hệ vi sinh vật theo chiều dọc, nhiễm trùng mầm bệnh, tổn thương viêm, rối loạn chức năng hàng rào biểu mô và các liệu pháp dựa trên probiotic.
Quy trình của chúng tôi có thể hữu ích cho nhiều nhà khoa học trong nghiên cứu cơ bản (ví dụ: sinh học niêm mạc ruột, sinh học tế bào gốc và sinh học phát triển) và nghiên cứu ứng dụng (ví dụ: thử nghiệm thuốc tiền lâm sàng, mô hình hóa bệnh tật, kỹ thuật mô và tiêu hóa). Nhờ khả năng tái tạo và tính ổn định của quy trình trong việc tạo ra hình thái 3D của biểu mô ruột trong ống nghiệm, chúng tôi dự đoán rằng chiến lược kỹ thuật này có thể được phổ biến đến các đối tượng nghiên cứu về động lực của tín hiệu tế bào trong quá trình phát triển, tái tạo hoặc cân bằng nội môi của ruột. Ngoài ra, quy trình của chúng tôi hữu ích cho việc nghiên cứu nhiễm trùng dưới tác nhân gây bệnh khác nhau như Norovirus 8, Coronavirus gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 hoặc Vibrio cholerae. Các nghiên cứu về bệnh lý và cơ chế bệnh sinh cũng rất hữu ích. Việc sử dụng hệ thống vi sinh lý đường ruột trên chip có thể cho phép nuôi cấy đồng thời theo chiều dọc 10 và đánh giá tiếp theo về khả năng phòng vệ của vật chủ, phản ứng miễn dịch và sửa chữa tổn thương liên quan đến mầm bệnh trong đường tiêu hóa (GI) 11. Các rối loạn GI khác liên quan đến hội chứng rò rỉ ruột, bệnh celiac, bệnh Crohn, viêm loét đại tràng, viêm túi hậu môn hoặc hội chứng ruột kích thích có thể được mô phỏng khi các lớp biểu mô ruột 3D được chuẩn bị bằng cách sử dụng các lớp biểu mô ruột 3D của bệnh nhân, các bệnh này bao gồm teo nhung mao, rút ​​ngắn hố tuyến, tổn thương niêm mạc hoặc hàng rào biểu mô bị suy yếu. Sinh thiết hoặc các cơ quan ruột có nguồn gốc từ tế bào gốc 12,13. Để mô hình hóa tốt hơn sự phức tạp cao hơn của môi trường bệnh, người đọc có thể xem xét thêm các loại tế bào liên quan đến bệnh, chẳng hạn như tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) của bệnh nhân, vào các mô hình chứa cấu trúc vi mô nhung mao-hố tuyến ruột 3D. tế bào miễn dịch đặc hiệu mô, 5.
Vì cấu trúc vi mô biểu mô 3D có thể được cố định và hình dung mà không cần quá trình cắt lát, những người xem đang nghiên cứu về phiên mã học không gian và hình ảnh độ phân giải cao hoặc siêu phân giải có thể quan tâm đến việc lập bản đồ động lực không gian-thời gian của gen và protein trên các hốc biểu mô của chúng tôi. Quan tâm đến công nghệ. Phản ứng với các kích thích vi khuẩn hoặc miễn dịch. Hơn nữa, sự tương tác giữa vật chủ và hệ vi sinh vật theo chiều dọc 10, 14 điều phối sự cân bằng nội môi đường ruột có thể được thiết lập trong lớp niêm mạc ruột 3D bằng cách nuôi cấy đồng thời nhiều loài vi khuẩn, cộng đồng vi khuẩn hoặc hệ vi sinh vật trong phân, đặc biệt là trong mô hình ruột trên chip. trên nền tảng này. Cách tiếp cận này đặc biệt hấp dẫn đối với các đối tượng nghiên cứu về miễn dịch niêm mạc, tiêu hóa, hệ vi sinh vật người, nuôi cấy vi sinh vật và vi sinh lâm sàng, những người đang tìm cách nuôi cấy hệ vi sinh vật đường ruột chưa từng được nuôi cấy trước đây trong phòng thí nghiệm. Nếu quy trình hình thái học trong ống nghiệm của chúng tôi có thể được điều chỉnh cho các định dạng nuôi cấy có thể mở rộng, chẳng hạn như các miếng chèn đa giếng trong đĩa 24, 96 hoặc 384 giếng liên tục bổ sung các ngăn đáy, thì quy trình này cũng có thể được phổ biến cho những người đang phát triển các nền tảng sàng lọc hoặc xác nhận dược phẩm, y sinh hoặc thông lượng cao cho ngành công nghiệp thực phẩm. Như một bằng chứng về nguyên tắc, gần đây chúng tôi đã chứng minh tính khả thi của một hệ thống hình thái học thông lượng cao đa kênh có thể mở rộng đến định dạng đĩa 24 giếng. Ngoài ra, nhiều sản phẩm cơ quan trên chip đã được thương mại hóa16,17,18. Do đó, việc xác nhận phương pháp hình thái học trong ống nghiệm của chúng tôi có thể được đẩy nhanh và có khả năng được nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu, ngành công nghiệp hoặc chính phủ và các cơ quan quản lý áp dụng để hiểu về quá trình tái lập trình tế bào của hình thái học ruột trong ống nghiệm ở cấp độ phiên mã để thử nghiệm thuốc hoặc Liệu pháp sinh học: Sự hấp thụ và vận chuyển các ứng viên thuốc được đánh giá bằng cách sử dụng mô hình ruột 3D hoặc sử dụng các mô hình "cơ quan trên chip" tùy chỉnh hoặc thương mại để đánh giá khả năng tái tạo của quá trình hình thành ruột.
Một số lượng hạn chế các mô hình thực nghiệm liên quan đến con người đã được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành biểu mô ruột, chủ yếu là do thiếu các quy trình có thể thực hiện được để tạo ra quá trình hình thành 3D trong ống nghiệm. Trên thực tế, phần lớn kiến ​​thức hiện tại về quá trình hình thành ruột dựa trên các nghiên cứu trên động vật (ví dụ: cá ngựa vằn20, chuột21 hoặc gà22). Tuy nhiên, chúng tốn nhiều công sức và chi phí, có thể gây ra những nghi vấn về mặt đạo đức, và quan trọng nhất là không xác định chính xác các quá trình phát triển của con người. Những mô hình này cũng rất hạn chế về khả năng được thử nghiệm theo nhiều cách có thể mở rộng. Do đó, quy trình của chúng tôi để tái tạo cấu trúc mô 3D trong ống nghiệm vượt trội hơn so với các mô hình động vật in vivo cũng như các mô hình nuôi cấy tế bào 2D tĩnh truyền thống khác. Như đã mô tả trước đây, việc sử dụng cấu trúc biểu mô 3D cho phép chúng tôi kiểm tra vị trí không gian của các tế bào biệt hóa trong trục hốc-nhung mao để đáp ứng với các kích thích niêm mạc hoặc miễn dịch khác nhau. Các lớp biểu mô 3D có thể cung cấp không gian để nghiên cứu cách các tế bào vi khuẩn cạnh tranh để hình thành các hốc không gian và sự tiến hóa sinh thái để đáp ứng với các yếu tố của vật chủ (ví dụ: bên trong so với bên ngoài). (lớp chất nhầy, sự tiết IgA và các peptide kháng khuẩn). Hơn nữa, hình thái biểu mô 3D cho phép chúng ta hiểu được cách hệ vi sinh vật đường ruột cấu trúc cộng đồng của nó và sản sinh ra các chất chuyển hóa vi khuẩn (ví dụ: axit béo chuỗi ngắn) một cách cộng hưởng, định hình nên cấu trúc tế bào và các hốc tế bào gốc trong các hốc đáy. Những đặc điểm này chỉ có thể được chứng minh khi các lớp biểu mô 3D được thiết lập trong ống nghiệm.
Ngoài phương pháp tạo cấu trúc biểu mô ruột 3D của chúng tôi, còn có một số phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm. Nuôi cấy cơ quan ruột là một kỹ thuật kỹ thuật mô tiên tiến dựa trên việc nuôi cấy tế bào gốc ruột trong điều kiện hình thái cụ thể23,24,25. Tuy nhiên, việc sử dụng mô hình cơ quan 3D để phân tích vận chuyển hoặc nuôi cấy đồng thời vật chủ-hệ vi sinh vật thường gặp khó khăn vì lòng ruột bị bao bọc bên trong cơ quan và do đó, việc đưa các thành phần trong lòng ruột như tế bào vi khuẩn hoặc kháng nguyên ngoại sinh vào bị hạn chế. Có thể cải thiện khả năng tiếp cận lòng ruột của cơ quan bằng cách sử dụng kim tiêm siêu nhỏ26,27, nhưng phương pháp này xâm lấn, tốn nhiều công sức và đòi hỏi kiến ​​thức chuyên môn để thực hiện. Hơn nữa, nuôi cấy cơ quan truyền thống được duy trì trong khung hydrogel trong điều kiện tĩnh không phản ánh chính xác cơ sinh học hoạt động trong cơ thể sống.
Các phương pháp khác được một số nhóm nghiên cứu sử dụng là dùng giàn giáo hydrogel 3D có cấu trúc sẵn để mô phỏng cấu trúc biểu mô ruột bằng cách nuôi cấy các tế bào ruột người được phân lập trên bề mặt gel. Giàn giáo hydrogel được chế tạo bằng khuôn in 3D, phay vi mô hoặc chế tạo bằng phương pháp quang khắc. Phương pháp này cho thấy sự sắp xếp tự tổ chức của các tế bào biểu mô được phân lập trong ống nghiệm với gradient chất tạo hình có liên quan đến sinh lý, thiết lập cấu trúc biểu mô có tỷ lệ chiều dài/chiều rộng cao và sự tương tác giữa mô đệm và biểu mô bằng cách đưa các tế bào mô đệm vào giàn giáo. Tuy nhiên, bản chất của giàn giáo có cấu trúc sẵn có thể ngăn cản sự thể hiện của quá trình tạo hình tự phát. Các mô hình này cũng không cung cấp dòng chảy động trong lòng ruột hoặc giữa các mô, thiếu ứng suất cắt chất lỏng mà các tế bào ruột cần để trải qua quá trình tạo hình và đạt được chức năng sinh lý. Một nghiên cứu gần đây khác đã sử dụng giàn giáo hydrogel trong nền tảng vi lưu và tạo hình cấu trúc biểu mô ruột bằng kỹ thuật khắc laser. Các cơ quan ruột chuột được tạo hình theo các mẫu khắc để tạo thành cấu trúc ống ruột, và dòng chảy chất lỏng trong lòng ruột có thể được tái tạo bằng cách sử dụng... Tuy nhiên, mô hình này không thể hiện các quá trình hình thái tự phát cũng như không bao gồm các chuyển động cơ sinh học của ruột. Các kỹ thuật in 3D từ cùng nhóm nghiên cứu đã có thể tạo ra các ống ruột thu nhỏ với các quá trình hình thái tự phát. Mặc dù việc chế tạo các đoạn ruột khác nhau bên trong ống rất phức tạp, mô hình này cũng thiếu dòng chảy chất lỏng trong lòng ống và biến dạng cơ học. Ngoài ra, khả năng hoạt động của mô hình có thể bị hạn chế, đặc biệt là sau khi quá trình in sinh học hoàn tất, làm xáo trộn các điều kiện thí nghiệm hoặc tương tác giữa các tế bào. Thay vào đó, quy trình được đề xuất của chúng tôi cung cấp quá trình hình thái ruột tự phát, ứng suất cắt phù hợp với sinh lý, cơ sinh học mô phỏng nhu động ruột, khả năng tiếp cận các ngăn đỉnh và đáy độc lập, và tái tạo môi trường vi sinh học phức tạp có tính mô-đun. Do đó, quy trình hình thái 3D trong ống nghiệm của chúng tôi có thể cung cấp một phương pháp bổ sung để khắc phục những thách thức của các phương pháp hiện có.
Giao thức của chúng tôi tập trung hoàn toàn vào quá trình hình thành biểu mô 3D, chỉ sử dụng tế bào biểu mô trong nuôi cấy và không có các loại tế bào xung quanh khác như tế bào trung mô, tế bào nội mô và tế bào miễn dịch. Như đã mô tả trước đây, cốt lõi của giao thức chúng tôi là việc tạo ra quá trình hình thành biểu mô bằng cách loại bỏ các chất ức chế hình thái được tiết ra ở mặt đáy của môi trường nuôi cấy. Mặc dù tính mô đun mạnh mẽ của hệ thống ruột trên chip và hệ thống lai trên chip cho phép chúng tôi tái tạo lớp biểu mô 3D lượn sóng, nhưng các phức tạp sinh học bổ sung như tương tác biểu mô-trung mô33,34, sự lắng đọng chất nền ngoại bào (ECM)35 và, trong mô hình của chúng tôi, các đặc điểm của hốc-nhung mao truyền tải các ổ tế bào gốc trong hốc đáy vẫn cần được xem xét thêm. Các tế bào mô đệm (ví dụ: nguyên bào sợi) trong trung mô đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất protein ECM và điều hòa quá trình hình thành ruột in vivo35,37,38. Việc bổ sung tế bào trung mô vào mô hình của chúng tôi đã tăng cường Quá trình hình thái học và hiệu quả gắn kết tế bào. Lớp nội mô (tức là mao mạch hoặc bạch huyết) đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa vận chuyển phân tử39 và tuyển mộ tế bào miễn dịch40 trong môi trường vi mô đường ruột. Hơn nữa, các thành phần mạch máu có thể được kết nối giữa các mô hình mô là điều kiện tiên quyết khi thiết kế các mô hình mô để thể hiện sự tương tác đa cơ quan. Do đó, các tế bào nội mô có thể cần được đưa vào để mô hình hóa các đặc điểm sinh lý chính xác hơn với độ phân giải cấp độ cơ quan. Các tế bào miễn dịch có nguồn gốc từ bệnh nhân cũng rất cần thiết để thể hiện các phản ứng miễn dịch bẩm sinh, trình diện kháng nguyên, tương tác miễn dịch bẩm sinh thích ứng và miễn dịch đặc hiệu mô trong bối cảnh mô phỏng bệnh đường ruột.
Việc sử dụng chip lai đơn giản hơn so với chip "ruột trên chip" vì thiết lập thiết bị dễ dàng hơn và việc sử dụng màng lọc Transwell cho phép nuôi cấy biểu mô ruột quy mô lớn. Tuy nhiên, các màng lọc Transwell thương mại có màng polyester không đàn hồi và không thể mô phỏng các chuyển động giống như nhu động ruột. Hơn nữa, ngăn đỉnh của màng lọc Transwell đặt trong chip lai vẫn đứng yên mà không có ứng suất cắt ở phía đỉnh. Rõ ràng, các đặc tính tĩnh trong ngăn đỉnh hiếm khi cho phép nuôi cấy vi khuẩn lâu dài trong chip lai. Mặc dù chúng ta có thể tạo ra quá trình hình thái 3D mạnh mẽ trong màng lọc Transwell khi sử dụng chip lai, nhưng sự thiếu hụt các đặc tính cơ sinh học phù hợp và dòng chảy chất lỏng ở đỉnh có thể hạn chế tính khả thi của nền tảng chip lai cho các ứng dụng tiềm năng.
Việc tái tạo hoàn chỉnh trục nhung mao-tuyến ruột người trong nuôi cấy ruột trên chip và nuôi cấy lai trên chip vẫn chưa được thiết lập đầy đủ. Vì quá trình hình thành bắt đầu từ một lớp biểu mô đơn, nên cấu trúc vi mô 3D không nhất thiết phải cung cấp sự tương đồng về hình thái với các tuyến ruột trong cơ thể sống. Mặc dù chúng tôi đã mô tả đặc điểm của quần thể tế bào tăng sinh gần vùng tuyến ruột đáy trong biểu mô 3D được vi chế tạo, nhưng vùng tuyến ruột và vùng nhung mao không được phân định rõ ràng. Mặc dù các kênh phía trên cao hơn trên chip dẫn đến chiều cao của biểu mô được vi chế tạo tăng lên, nhưng chiều cao tối đa vẫn bị giới hạn ở mức ~300–400 µm. Độ sâu thực tế của các tuyến ruột người ở ruột non và ruột già lần lượt là ~135 µm và ~400 µm, và chiều cao của nhung mao ruột non là ~600 µm41.
Từ góc độ hình ảnh, việc chụp ảnh siêu phân giải tại chỗ các cấu trúc vi mô 3D có thể bị hạn chế đối với mô hình ruột trên chip, vì khoảng cách làm việc cần thiết từ thấu kính vật kính đến lớp biểu mô chỉ khoảng vài milimét. Để khắc phục vấn đề này, có thể cần đến một thấu kính vật kính đặt xa hơn. Hơn nữa, việc tạo các lát cắt mỏng để chuẩn bị mẫu chụp ảnh rất khó khăn do độ đàn hồi cao của PDMS. Thêm vào đó, vì quá trình chế tạo vi mô từng lớp của mô hình ruột trên chip liên quan đến sự kết dính vĩnh viễn giữa mỗi lớp, nên việc mở hoặc loại bỏ lớp trên cùng để kiểm tra cấu trúc bề mặt của lớp biểu mô là vô cùng khó khăn. Ví dụ, bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Tính kỵ nước của PDMS là một yếu tố hạn chế trong các nghiên cứu dựa trên vi lưu chất liên quan đến các phân tử nhỏ kỵ nước, vì PDMS có thể hấp phụ không đặc hiệu các phân tử kỵ nước như vậy. Có thể xem xét các vật liệu thay thế cho PDMS bằng các vật liệu polyme khác. Ngoài ra, có thể xem xét việc sửa đổi bề mặt của PDMS (ví dụ: phủ bằng vật liệu ưa dầu 42 hoặc poly(ethylene glycol) 43) để giảm thiểu sự hấp phụ của các phân tử kỵ nước.
Cuối cùng, phương pháp của chúng tôi chưa được mô tả rõ ràng về khả năng cung cấp một nền tảng sàng lọc tốc độ cao hoặc một nền tảng thí nghiệm thân thiện với người dùng theo kiểu "một kích cỡ phù hợp cho tất cả". Quy trình hiện tại yêu cầu một bơm tiêm cho mỗi thiết bị vi mô, điều này chiếm không gian trong tủ ấm CO2 và cản trở các thí nghiệm quy mô lớn. Hạn chế này có thể được cải thiện đáng kể nhờ khả năng mở rộng của các định dạng nuôi cấy tiên tiến (ví dụ: các khay xốp 24 giếng, 96 giếng hoặc 384 giếng cho phép bổ sung và loại bỏ môi trường đáy liên tục).
Để tạo ra quá trình hình thành cấu trúc 3D của biểu mô ruột người trong ống nghiệm, chúng tôi đã sử dụng thiết bị vi mạch ruột chứa hai kênh vi mạch song song và một màng xốp đàn hồi ở giữa để tạo ra giao diện lòng ống-mao mạch. Chúng tôi cũng chứng minh việc sử dụng thiết bị vi mạch một kênh (chip lai) cung cấp dòng chảy liên tục ở mặt đáy bên dưới các lớp biểu mô phân cực được nuôi cấy trên các miếng chèn Transwell. Trên cả hai nền tảng, quá trình hình thành cấu trúc của các tế bào biểu mô ruột người khác nhau có thể được chứng minh bằng cách điều khiển dòng chảy theo hướng nhất định để loại bỏ các chất đối kháng hình thái từ ngăn đáy. Toàn bộ quy trình thí nghiệm (Hình 1) bao gồm năm phần: (i) chế tạo vi mạch chip ruột hoặc chip lai có thể chèn Transwell (các bước 1-5; Khung 1), (ii) chuẩn bị các tế bào biểu mô ruột (tế bào Caco-2) hoặc các cơ quan ruột người; (iii) nuôi cấy tế bào biểu mô ruột trên chip ruột hoặc chip lai (bước 6-9), (iv) cảm ứng hình thái 3D trong ống nghiệm (bước 10) và (v) để đặc trưng hóa cấu trúc vi mô biểu mô 3D (bước 11-24). Cuối cùng, một nhóm đối chứng thích hợp (được thảo luận thêm bên dưới) đã được thiết kế để xác nhận hiệu quả của quá trình hình thái trong ống nghiệm bằng cách so sánh quá trình hình thái biểu mô với các nhóm đối chứng về không gian, thời gian, điều kiện hoặc quy trình.
Chúng tôi đã sử dụng hai nền tảng nuôi cấy khác nhau: ruột trên chip với các kênh thẳng hoặc các kênh xoắn không tuyến tính, hoặc chip lai chứa các miếng chèn Transwell (TW) trong thiết bị vi lưu, được chế tạo như mô tả trong Khung 1 và các bước 1-5. Phần “Chế tạo thiết bị” trình bày các bước chính trong việc tạo ra một chip đơn hoặc một chip lai. Phần “Nuôi cấy tế bào biểu mô ruột người” giải thích nguồn tế bào (Caco-2 hoặc cơ quan ruột người) và quy trình nuôi cấy được sử dụng trong giao thức này. Phần “Hình thái học trong ống nghiệm” trình bày các bước tổng thể trong đó các tế bào biểu mô có nguồn gốc từ Caco-2 hoặc cơ quan ruột được nuôi cấy trên chip ruột hoặc trên các miếng chèn Transwell của chip lai, sau đó là cảm ứng hình thái học 3D và hình thành cấu trúc biểu mô đặc trưng. Số bước chương trình hoặc số khung được hiển thị bên dưới mỗi mũi tên. Ứng dụng này cung cấp các ví dụ về cách các lớp biểu mô ruột đã được thiết lập có thể được sử dụng, ví dụ, trong đặc điểm phân hóa tế bào, nghiên cứu sinh lý ruột, thiết lập hệ sinh thái vật chủ-vi sinh vật và mô hình hóa bệnh tật. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang Trong phần “Phân hóa tế bào”, hình ảnh cho thấy nhân tế bào, F-actin và MUC2 được biểu hiện trong lớp biểu mô Caco-2 3D được tạo ra trên chip ruột. Tín hiệu MUC2 hiện diện trong các tế bào hình chén và chất nhầy được tiết ra từ bề mặt niêm mạc. Hình ảnh huỳnh quang trong phần “Sinh lý ruột” cho thấy chất nhầy được tạo ra bằng cách nhuộm các gốc axit sialic và N-acetylglucosamine bằng cách sử dụng agglutinin mầm lúa mì huỳnh quang. Hai hình ảnh chồng lên nhau trong phần “Nuôi cấy đồng thời vật chủ-vi sinh vật” cho thấy các mẫu nuôi cấy đồng thời vật chủ-hệ vi sinh vật tiêu biểu trong ruột trên chip. Bảng bên trái cho thấy sự nuôi cấy đồng thời E. coli biểu hiện protein huỳnh quang xanh (GFP) với các tế bào biểu mô Caco-2 3D được thiết kế vi mô. Bảng bên phải cho thấy vị trí của GFP E. coli được nuôi cấy đồng thời với các tế bào biểu mô Caco-2 3D, sau đó được nhuộm miễn dịch huỳnh quang với F-actin (màu đỏ) và nhân tế bào (màu xanh). Mô hình bệnh lý minh họa ruột khỏe mạnh so với ruột rò rỉ trong các chip viêm ruột dưới thách thức sinh lý với các kháng nguyên vi khuẩn (ví dụ, lipopolysaccharide (LPS) và các tế bào miễn dịch (ví dụ: PBMC; màu xanh lá cây). Tế bào Caco-2 được nuôi cấy để tạo thành lớp biểu mô 3D. Thanh tỷ lệ, 50 µm. Hình ảnh ở hàng dưới cùng: “Sự phân hóa của tế bào” được điều chỉnh với sự cho phép từ tài liệu tham khảo 2. Nhà xuất bản Đại học Oxford; Được tái bản với sự cho phép từ Tài liệu tham khảo 5. NAS; “Nuôi cấy đồng thời vật chủ và vi sinh vật” được điều chỉnh với sự cho phép từ tài liệu tham khảo 3. NAS; “Mô hình hóa bệnh tật” được điều chỉnh với sự cho phép từ tài liệu tham khảo 5. NAS.
Cả chip ruột trên chip và chip lai đều được chế tạo bằng cách sử dụng bản sao PDMS được tách khỏi khuôn silicon bằng phương pháp in thạch bản mềm1,44 và được tạo hình bằng SU-8. Thiết kế của các kênh vi mô trong mỗi chip được xác định bằng cách xem xét các yếu tố thủy động lực học như ứng suất cắt và áp suất thủy động1,4,12. Thiết kế chip ruột trên chip ban đầu (Hình dữ liệu mở rộng 1a), bao gồm hai kênh vi mô thẳng song song đặt cạnh nhau, đã phát triển thành chip ruột trên chip phức tạp (Hình dữ liệu mở rộng 1b) bao gồm một cặp kênh vi mô cong để tạo ra thời gian lưu giữ chất lỏng tăng lên, các mô hình dòng chảy phi tuyến tính và biến dạng đa trục của các tế bào nuôi cấy (Hình 2a–f) 12. Khi cần tái tạo cơ sinh học ruột phức tạp hơn, có thể chọn chip ruột trên chip phức tạp. Chúng tôi đã chứng minh rằng chip ruột phức tạp cũng tạo ra quá trình hình thái 3D mạnh mẽ trong khung thời gian tương tự với mức độ tăng trưởng biểu mô tương tự so với chip ban đầu. Gut-Chip, bất kể loại tế bào nuôi cấy nào. Do đó, để tạo ra quá trình hình thành cấu trúc 3D, các thiết kế ruột trên chip tuyến tính và phức tạp có thể hoán đổi cho nhau. Các bản sao PDMS được làm cứng trên khuôn silicon với các mẫu SU-8 cung cấp các đặc điểm âm sau khi tháo khuôn (Hình 2a). Để chế tạo ruột trên chip, lớp PDMS phía trên đã chuẩn bị được liên kết tuần tự với một lớp màng PDMS xốp và sau đó được căn chỉnh với lớp PDMS phía dưới bằng cách liên kết không thể đảo ngược bằng cách sử dụng máy xử lý corona (Hình 2b–f). Để chế tạo chip lai, các bản sao PDMS đã được làm cứng được liên kết với các phiến kính để tạo ra các thiết bị vi lưu đơn kênh có thể chứa các miếng chèn Transwell (Hình 2h và Hình dữ liệu mở rộng 2). Quá trình liên kết được thực hiện bằng cách xử lý bề mặt của bản sao PDMS và kính bằng plasma oxy hoặc xử lý corona. Sau khi khử trùng thiết bị vi chế tạo được gắn vào ống silicon, thiết lập thiết bị đã sẵn sàng để thực hiện quá trình hình thành cấu trúc 3D của biểu mô ruột (Hình 2g).
a, Hình minh họa sơ đồ quá trình chuẩn bị các bộ phận PDMS từ khuôn silicon SU-8. Dung dịch PDMS chưa đông cứng được đổ lên khuôn silicon (trái), đông cứng ở 60 °C (giữa) và tháo khuôn (phải). PDMS sau khi tháo khuôn được cắt thành từng mảnh và làm sạch để sử dụng tiếp. b, Ảnh chụp khuôn silicon được sử dụng để chuẩn bị lớp PDMS trên. c, Ảnh chụp khuôn silicon được sử dụng để chế tạo màng xốp PDMS. d, Một loạt ảnh chụp các thành phần PDMS trên và dưới và thiết bị ruột trên chip đã được lắp ráp. e, Sơ đồ sắp xếp các thành phần PDMS trên, màng và dưới. Mỗi lớp được liên kết vĩnh viễn bằng phương pháp xử lý plasma hoặc corona. f, Sơ đồ thiết bị ruột trên chip đã chế tạo với các vi kênh xoắn và buồng chân không chồng lên nhau. g, Thiết lập thiết bị ruột trên chip để nuôi cấy tế bào vi lưu. Ruột trên chip đã chế tạo được lắp ráp với ống silicon và ống tiêm được đặt trên lam kính. Thiết bị chip được đặt trên nắp của một Đĩa Petri 150 mm dùng để xử lý. Chất kết dính được sử dụng để bịt kín ống silicon.h, Hình ảnh trực quan về quá trình chế tạo chip lai và hình thái 3D bằng cách sử dụng chip lai. Các miếng chèn Transwell được chuẩn bị độc lập để nuôi cấy các lớp đơn 2D của tế bào biểu mô ruột được đưa vào chip lai để tạo ra hình thái 3D của ruột. Môi trường được bơm qua các vi kênh bên dưới lớp tế bào được hình thành trên miếng chèn Transwell. Thanh tỷ lệ, 1 cm.h Được in lại với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.4. Elsevier.
Trong quy trình này, dòng tế bào Caco-2 và các cơ quan ruột nhân tạo được sử dụng làm nguồn biểu mô (Hình 3a). Cả hai loại tế bào đều được nuôi cấy độc lập (Ô 2 và Ô 5) và được sử dụng để gieo vào các vi kênh phủ ECM của ruột nhân tạo trên chip hoặc các miếng chèn Transwell. Khi tế bào đạt mật độ cao (>95% độ phủ trong bình), các tế bào Caco-2 được nuôi cấy thường xuyên (giữa các lần cấy chuyển từ 10 đến 50) trong bình T được thu hoạch để chuẩn bị huyền dịch tế bào phân tách bằng dung dịch trypsin hóa (ô 2). Các cơ quan ruột nhân tạo của người từ sinh thiết ruột hoặc phẫu thuật cắt bỏ được nuôi cấy trong các vòm khung Matrigel trong đĩa 24 giếng để hỗ trợ môi trường vi mô cấu trúc. Môi trường chứa các chất tạo hình thiết yếu (như Wnt, R-spondin và Noggin) và các yếu tố tăng trưởng được chuẩn bị như mô tả trong Ô 3 được bổ sung hai ngày một lần cho đến khi các cơ quan ruột nhân tạo phát triển đến đường kính khoảng 500 µm. Các cơ quan ruột nhân tạo đã phát triển hoàn toàn được thu hoạch và được phân tách thành các tế bào đơn lẻ để cấy lên ruột hoặc các miếng chèn Transwell trên chip (Hộp 5). Như chúng tôi đã báo cáo trước đây, nó có thể được phân biệt theo loại bệnh12,13 (ví dụ: viêm loét đại tràng, bệnh Crohn, ung thư đại trực tràng hoặc người hiến tặng bình thường), vị trí tổn thương (ví dụ: vùng tổn thương so với vùng không tổn thương) và vị trí trong đường tiêu hóa (ví dụ: tá tràng, hỗng tràng, hồi tràng, manh tràng, đại tràng hoặc trực tràng). Chúng tôi cung cấp một quy trình tối ưu trong Hộp 5 để nuôi cấy các cơ quan đại tràng (coloids) thường yêu cầu nồng độ chất điều hòa hình thái cao hơn so với các cơ quan ruột non.
a, Quy trình gây cảm ứng hình thái ruột trong chip ruột. Biểu mô ruột người Caco-2 và các cơ quan ruột nhân tạo được sử dụng trong quy trình này để chứng minh sự hình thành hình thái 3D. Các tế bào biểu mô được phân lập được gieo vào thiết bị ruột trên chip đã chuẩn bị (chuẩn bị chip). Sau khi các tế bào được gieo (gieo) và gắn (gắn) vào màng xốp PDMS vào ngày 0 (D0), dòng chảy đỉnh (AP) được bắt đầu và duy trì trong 2 ngày đầu tiên (dòng chảy, AP, D0-D2). Dòng chảy đáy (BL) cũng được bắt đầu cùng với các chuyển động kéo giãn theo chu kỳ (kéo giãn, dòng chảy, AP và BL) khi một lớp đơn 2D hoàn chỉnh được hình thành. Sự hình thành hình thái 3D của ruột xảy ra tự phát sau 5 ngày nuôi cấy vi lỏng (hình thành hình thái, D5). Hình ảnh tương phản pha cho thấy hình thái đại diện của tế bào Caco-2 ở mỗi bước thí nghiệm hoặc thời điểm (biểu đồ cột, 100 µm). Bốn sơ đồ minh họa các chuỗi phản ứng tương ứng của ruột. a, Hình thái học (phía trên bên phải). Các mũi tên nét đứt trong sơ đồ biểu thị hướng dòng chảy của chất lỏng. b, Hình ảnh SEM cho thấy cấu trúc bề mặt của biểu mô Caco-2 3D đã hình thành (bên trái). Hình nhỏ làm nổi bật vùng được phóng đại (khung nét đứt màu trắng) cho thấy các vi nhung mao được tái tạo trên lớp Caco-2 3D (bên phải). c, Hình chiếu ngang mặt trước của Caco-2 3D đã hình thành, claudin (ZO-1, màu đỏ) và màng viền bàn chải liên tục được dán nhãn F-actin (màu xanh lá cây) và nhân tế bào (màu xanh lam). Hình ảnh hiển vi huỳnh quang confocal của các tế bào biểu mô trên chip ruột. Các mũi tên chỉ vào sơ đồ ở giữa cho biết vị trí của mặt phẳng tiêu điểm cho mỗi hình ảnh confocal. d, Diễn biến theo thời gian của các thay đổi hình thái trong các cơ quan được nuôi cấy trên chip thu được bằng kính hiển vi tương phản pha vào các ngày 3, 7, 9, 11 và 13. Hình nhỏ (phía trên bên phải) cho thấy độ phóng đại cao của hình ảnh được cung cấp. e, Ảnh chụp hiển vi DIC của biểu mô 3D cơ quan đã hình thành. trong ruột trên lát cắt lấy vào ngày thứ 7.f, Hình ảnh huỳnh quang miễn dịch chồng lên nhau cho thấy các dấu ấn của tế bào gốc (LGR5; màu đỏ tươi), tế bào hình chén (MUC2; màu xanh lá cây), F-actin (màu xám) và nhân tế bào (màu lục lam) được nuôi cấy trên chip ruột trong 3 ngày, tương ứng (Trái) và các cơ quan nhân tạo 13 ngày (giữa) trên lớp biểu mô. Xem thêm Hình dữ liệu mở rộng 3, làm nổi bật tín hiệu LGR5 mà không có tín hiệu MUC2. Hình ảnh huỳnh quang cho thấy cấu trúc vi mô biểu mô (phải) của biểu mô cơ quan nhân tạo 3D được thiết lập trong ruột trên chip bằng cách nhuộm màng huyết tương bằng thuốc nhuộm CellMask (phải) vào ngày thứ 13 nuôi cấy. Thanh tỷ lệ là 50 μm trừ khi có ghi chú khác. b Được in lại với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.2. Nhà xuất bản Đại học Oxford; c Được điều chỉnh với sự cho phép từ Tài liệu tham khảo.2. Nhà xuất bản Đại học Oxford; e và f được điều chỉnh với sự cho phép của tài liệu tham khảo.12 Theo Giấy phép Creative Commons CC BY 4.0.
Trong mô hình ruột trên chip, việc biến đổi bề mặt kỵ nước của màng xốp PDMS là cần thiết để phủ lớp ECM thành công. Trong quy trình này, chúng tôi áp dụng hai phương pháp khác nhau để biến đổi tính kỵ nước của màng PDMS. Đối với nuôi cấy tế bào Caco-2, chỉ cần kích hoạt bề mặt bằng phương pháp xử lý UV/ozone là đủ để giảm tính kỵ nước của bề mặt PDMS, phủ lớp ECM và giúp tế bào Caco-2 bám vào màng PDMS. Tuy nhiên, nuôi cấy vi mô biểu mô cơ quan cần phải có sự biến đổi chức năng bề mặt dựa trên hóa chất để đạt được sự lắng đọng hiệu quả các protein ECM bằng cách lần lượt áp dụng polyethyleneimine (PEI) và glutaraldehyde vào các kênh vi mô PDMS. Sau khi biến đổi bề mặt, các protein ECM được lắng đọng để bao phủ bề mặt PDMS đã được biến đổi chức năng và sau đó được đưa vào biểu mô cơ quan đã được phân lập. Sau khi các tế bào bám dính, quá trình nuôi cấy tế bào vi mô bắt đầu bằng cách chỉ bơm môi trường vào kênh vi mô phía trên cho đến khi các tế bào tạo thành một lớp đơn hoàn chỉnh, trong khi kênh vi mô phía dưới duy trì điều kiện tĩnh. Phương pháp tối ưu hóa này cho việc kích hoạt bề mặt và phủ lớp ECM cho phép biểu mô cơ quan bám dính để tạo ra sự hình thành. Sự hình thành cấu trúc 3D trên bề mặt PDMS.
Nuôi cấy Transwell cũng yêu cầu phủ lớp ECM trước khi gieo tế bào; tuy nhiên, nuôi cấy Transwell không yêu cầu các bước tiền xử lý phức tạp để kích hoạt bề mặt của các miếng chèn xốp. Để nuôi cấy tế bào Caco-2 trên các miếng chèn Transwell, việc phủ lớp ECM trên các miếng chèn xốp giúp tăng tốc độ bám dính của các tế bào Caco-2 đã tách rời (<1 giờ) và hình thành hàng rào liên kết chặt chẽ (<1-2 ngày). Để nuôi cấy các cơ quan nhân tạo trên các miếng chèn Transwell, các cơ quan nhân tạo đã được tách rời được gieo trên các miếng chèn được phủ ECM, bám vào bề mặt màng (<3 giờ) và duy trì cho đến khi các cơ quan nhân tạo tạo thành một lớp đơn hoàn chỉnh với tính toàn vẹn của hàng rào. Nuôi cấy Transwell được thực hiện trong các đĩa 24 giếng mà không cần sử dụng chip lai.
Quá trình hình thành cấu trúc 3D trong ống nghiệm có thể được khởi phát bằng cách cho dòng chảy chất lỏng tác động lên mặt đáy của lớp biểu mô đã hình thành. Trong mô hình ruột trên chip, quá trình hình thành biểu mô bắt đầu khi môi trường nuôi cấy được bơm vào các vi kênh phía trên và phía dưới (Hình 3a). Như đã mô tả trước đó, việc đưa dòng chảy chất lỏng vào ngăn dưới (mặt đáy) là rất quan trọng để liên tục loại bỏ các chất ức chế hình thái được tiết ra theo hướng xác định. Để cung cấp đủ chất dinh dưỡng và huyết thanh cho các tế bào bám trên màng xốp và tạo ra ứng suất cắt trong lòng ruột, chúng tôi thường áp dụng dòng chảy kép trong mô hình ruột trên chip. Trong các chip lai, các miếng chèn Transwell chứa các lớp biểu mô đơn được đưa vào chip lai. Sau đó, môi trường nuôi cấy được bơm vào phía dưới mặt đáy của miếng chèn Transwell xốp thông qua vi kênh. Quá trình hình thành ruột xảy ra 3-5 ngày sau khi bắt đầu dòng chảy ở mặt đáy trên cả hai nền tảng nuôi cấy.
Các đặc điểm hình thái của lớp biểu mô 3D được chế tạo bằng kỹ thuật vi mô có thể được phân tích bằng cách áp dụng nhiều phương pháp hình ảnh khác nhau, bao gồm kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi tương phản giao thoa vi sai (DIC), SEM hoặc kính hiển vi confocal huỳnh quang miễn dịch (Hình 3 và 4). Hình ảnh tương phản pha hoặc DIC có thể dễ dàng được thực hiện bất cứ lúc nào trong quá trình nuôi cấy để theo dõi hình dạng và độ nhô ra của lớp biểu mô 3D. Do tính trong suốt quang học của màng PDMS và polyester, cả nền tảng "ruột trên chip" và nền tảng chip lai đều có thể cung cấp hình ảnh tại chỗ theo thời gian thực mà không cần phải cắt lát hoặc tháo rời thiết bị. Khi thực hiện hình ảnh huỳnh quang miễn dịch (Hình 1, 3c, f và 4b, c), các tế bào thường được cố định bằng 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), tiếp theo là Triton X-100 và 2% (wt/vol) albumin huyết thanh bò (BSA), theo thứ tự. Tùy thuộc vào loại tế bào, các chất cố định, chất thấm và chất chặn khác nhau sẽ được sử dụng. Các tác nhân có thể được sử dụng. Kháng thể chính nhắm mục tiêu vào các dấu ấn tế bào hoặc vùng phụ thuộc vào dòng dõi được sử dụng để làm nổi bật các tế bào được cố định tại chỗ trên chip, tiếp theo là kháng thể thứ cấp cùng với thuốc nhuộm đối chứng nhắm mục tiêu vào nhân tế bào (ví dụ: 4′,6-diamidino-2-phenylene indole, DAPI) hoặc F-actin (ví dụ: phalloidin được gắn nhãn huỳnh quang). Hình ảnh trực tiếp dựa trên huỳnh quang cũng có thể được thực hiện tại chỗ để phát hiện sự sản sinh chất nhầy (Hình 1, “Phân hóa tế bào” và “Sinh lý ruột”), sự xâm chiếm ngẫu nhiên của các tế bào vi khuẩn (Hình 1, “Nuôi cấy đồng thời vật chủ-vi khuẩn”), sự tuyển mộ các tế bào miễn dịch (Hình 1, “Mô hình bệnh”) hoặc đường viền của hình thái biểu mô 3D (Hình 3c,f và 4b,c). Khi sửa đổi ruột trên chip để tách lớp trên khỏi lớp vi kênh dưới, như được mô tả trong tài liệu tham khảo. Như được hiển thị trong Hình 2, hình thái biểu mô 3D cũng như Các vi nhung mao trên viền bàn chải đỉnh có thể được quan sát bằng SEM (Hình 3b). Sự biểu hiện của các dấu ấn phân hóa có thể được đánh giá bằng cách thực hiện PCR định lượng5 hoặc giải trình tự RNA đơn bào. Trong trường hợp này, các lớp tế bào biểu mô 3D được nuôi cấy trong chip ruột hoặc chip lai được thu hoạch bằng phương pháp trypsin hóa và sau đó được sử dụng để phân tích phân tử hoặc di truyền.
a, Quy trình thực hiện để tạo hình thái ruột trong chip lai. Tế bào Caco-2 và các cơ quan ruột được sử dụng trong quy trình này để chứng minh sự hình thành hình thái 3D trên nền tảng chip lai. Các tế bào biểu mô đã được phân tách được gieo vào các miếng chèn Transwell đã chuẩn bị (TW prep; xem hình dưới). Sau khi các tế bào được gieo (seeded) và gắn vào màng polyester trong các miếng chèn Transwell, tất cả các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (TW culture). Sau 7 ngày, một miếng chèn Transwell duy nhất chứa một lớp đơn 2D tế bào biểu mô được tích hợp vào chip lai để tạo ra dòng chảy đáy (Flow, BL), cuối cùng dẫn đến sự hình thành lớp biểu mô 3D (morphogenesis). Ảnh hiển vi tương phản pha cho thấy các đặc điểm hình thái của tế bào biểu mô cơ quan người có nguồn gốc từ đại tràng lên của người hiến tặng bình thường (dòng C103) ở mỗi bước thí nghiệm hoặc thời điểm. Sơ đồ ở các lớp trên minh họa cấu hình thí nghiệm cho mỗi bước. b, Chip lai (sơ đồ bên trái) có thể dẫn đến sự hình thành hình thái 3D của các tế bào biểu mô cơ quan với phương pháp từ trên xuống. Hình ảnh hiển vi confocal được chụp ở các vị trí Z khác nhau (trên, giữa và dưới; xem sơ đồ bên phải và các đường chấm tương ứng) cho thấy các đặc điểm hình thái rõ ràng. F-actin (màu lục lam), nhân (màu xám). c, Ảnh hiển vi confocal huỳnh quang (góc nhìn 3D) của các tế bào biểu mô có nguồn gốc từ cơ quan được nuôi cấy trong Transwell tĩnh (TW; hình nhỏ trong khung gạch ngang màu trắng) so với chip lai (ảnh toàn cảnh lớn nhất) so sánh hình thái 2D và 3D. Một cặp hình ảnh cắt ngang dọc 2D (hình nhỏ ở góc trên bên phải; “XZ”) cũng cho thấy các đặc điểm 2D và 3D. Thanh tỷ lệ, 100 µm. c Được in lại với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.4. Elsevier.
Có thể chuẩn bị các mẫu đối chứng bằng cách nuôi cấy cùng loại tế bào (tế bào Caco-2 hoặc tế bào biểu mô ruột non) thành các lớp đơn hai chiều trong điều kiện nuôi cấy tĩnh thông thường. Đáng chú ý, sự cạn kiệt chất dinh dưỡng có thể xảy ra do dung tích hạn chế của các kênh vi mô (ví dụ: khoảng 4 µL ở kênh trên cùng trong thiết kế chip ruột ban đầu). Do đó, hình thái biểu mô trước và sau khi áp dụng dòng chảy đáy cũng có thể được so sánh.
Quá trình tạo cấu trúc quang khắc mềm cần được thực hiện trong phòng sạch. Đối với mỗi lớp trên chip (lớp trên, lớp dưới và màng) và chip lai, các mặt nạ quang khắc khác nhau được sử dụng và chế tạo trên các tấm silicon riêng biệt vì chiều cao của các kênh vi mô khác nhau. Chiều cao mục tiêu của các kênh vi mô trên và dưới của ruột trên chip lần lượt là 500 µm và 200 µm. Chiều cao mục tiêu của kênh trên chip lai là 200 µm.
Đặt một tấm silicon đường kính 3 inch vào đĩa chứa acetone. Xoay nhẹ đĩa trong 30 giây, sau đó để khô tự nhiên. Chuyển tấm silicon sang đĩa chứa IPA, sau đó quay đĩa trong 30 giây để làm sạch.
Có thể sử dụng thêm dung dịch piranha (hỗn hợp hydro peroxide và axit sulfuric đậm đặc, tỷ lệ 1:3 (thể tích/thể tích)) để tối đa hóa việc loại bỏ cặn hữu cơ khỏi bề mặt tấm silicon.
Dung dịch cá piranha cực kỳ ăn mòn và sinh nhiệt. Cần có các biện pháp phòng ngừa an toàn bổ sung. Để xử lý chất thải, hãy để dung dịch nguội và chuyển vào thùng chứa chất thải sạch sẽ, khô ráo. Sử dụng các thùng chứa phụ và dán nhãn đúng cách cho các thùng chứa chất thải. Vui lòng tuân theo hướng dẫn an toàn của cơ sở để biết thêm chi tiết về quy trình.
Làm khô các tấm wafer bằng cách đặt chúng lên tấm gia nhiệt ở 200 °C trong 10 phút. Sau khi làm khô, lắc tấm wafer năm lần trong không khí để làm nguội.
Đổ khoảng 10 g chất cản quang SU-8 2100 vào giữa tấm silicon đã được làm sạch. Dùng nhíp để dàn đều chất cản quang trên tấm silicon. Thỉnh thoảng đặt tấm silicon lên bếp điện 65°C để làm cho chất cản quang bớt dính và dễ dàn đều hơn. Không đặt tấm silicon trực tiếp lên bếp điện.
SU-8 được phân bố đều trên đế bán dẫn bằng phương pháp phủ quay ly tâm. Lập trình chuyển động quay của SU-8 trong 5–10 giây để lan truyền ở tốc độ 500 vòng/phút với gia tốc 100 vòng/phút/giây. Thiết lập tốc độ quay chính để tạo mẫu có độ dày 200 µm ở 1.500 vòng/phút, hoặc đạt được độ dày 250 µm (tạo chiều cao 500 µm cho lớp trên cùng của đường dẫn trên chip; xem phần “Các bước quan trọng” bên dưới) với gia tốc 300 vòng/giây trong 30 giây ở tốc độ 1.200 vòng/phút.
Tốc độ quay chính có thể được điều chỉnh tùy theo độ dày mục tiêu của lớp SU-8 trên đế silicon.
Để chế tạo các mẫu SU-8 có chiều cao 500 µm cho lớp trên cùng của ruột trên chip, các bước phủ quay ly tâm và nung mềm trong Hộp này (bước 7 và 8) được lặp lại tuần tự (xem bước 9) để tạo ra hai lớp SU-8 dày 250 µm, có thể được xếp chồng lên nhau và nối lại bằng cách chiếu tia UV trong bước 12 của hộp này, tạo thành một lớp cao 500 µm.
Nướng nhẹ các tấm wafer phủ SU-8 bằng cách đặt cẩn thận các tấm wafer lên bếp điện ở 65 °C trong 5 phút, sau đó chuyển cài đặt lên 95 °C và ủ thêm 40 phút nữa.
Để đạt được chiều cao 500 μm của lớp SU-8 trong kênh dẫn vi mô phía trên, hãy lặp lại bước 7 và 8 để tạo ra hai lớp SU-8 dày 250 μm.
Sử dụng thiết bị căn chỉnh mặt nạ UV, thực hiện kiểm tra đèn theo hướng dẫn của nhà sản xuất để tính toán thời gian chiếu xạ của tấm wafer. (thời gian chiếu xạ, ms) = (liều chiếu xạ, mJ/cm2)/(công suất đèn, mW/cm2).
Sau khi xác định thời gian phơi sáng, đặt mặt nạ quang học lên giá đỡ mặt nạ của máy căn chỉnh mặt nạ UV và đặt mặt nạ quang học lên tấm wafer đã được phủ SU-8.
Đặt bề mặt in của mặt nạ quang học trực tiếp lên mặt được phủ SU-8 của tấm silicon để giảm thiểu sự tán xạ tia cực tím.
Chiếu tia UV có cường độ 260 mJ/cm2 lên tấm wafer phủ SU-8 và mặt nạ quang học theo chiều dọc trong thời gian chiếu xạ đã định trước (xem bước 10 trong hộp này).
Sau khi chiếu tia UV, các tấm silicon phủ SU-8 được nung ở 65°C trong 5 phút và 95°C trong 15 phút trên mỗi tấm gia nhiệt để tạo ra các họa tiết có chiều cao 200 μm. Kéo dài thời gian nung sau đó ở 95°C lên 30 phút để tạo ra các họa tiết có chiều cao 500 µm.
Đổ dung dịch tráng phim vào đĩa thủy tinh, sau đó đặt khuôn đã nung vào trong đĩa. Thể tích dung dịch tráng phim SU-8 có thể thay đổi tùy thuộc vào kích thước của tấm kính. Hãy đảm bảo sử dụng đủ dung dịch tráng phim SU-8 để loại bỏ hoàn toàn phần SU-8 chưa bị phơi sáng. Ví dụ, khi sử dụng đĩa thủy tinh đường kính 150 mm với dung tích 1 lít, hãy sử dụng khoảng 300 ml dung dịch tráng phim SU-8. Tráng khuôn trong 25 phút, thỉnh thoảng xoay nhẹ.
Rửa sạch khuôn đã phát triển bằng khoảng 10 ml dung dịch hiện hình mới, sau đó rửa bằng IPA bằng cách phun dung dịch bằng pipet.
Đặt tấm bán dẫn vào máy làm sạch plasma và tiếp xúc với plasma oxy (khí quyển, áp suất mục tiêu 1 × 10−5 Torr, công suất 125 W) trong 1,5 phút.
Đặt tấm bán dẫn vào bình hút ẩm chân không có kèm lam kính. Có thể đặt tấm bán dẫn và lam kính cạnh nhau. Nếu bình hút ẩm chân không được chia thành nhiều ngăn bằng một tấm chắn, hãy đặt lam kính vào ngăn dưới và tấm bán dẫn vào ngăn trên. Nhỏ 100 μL dung dịch trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane lên lam kính và hút chân không để thực hiện quá trình silan hóa.
Rã đông một lọ tế bào Caco-2 đông lạnh trong bể nước 37°C, sau đó chuyển các tế bào đã rã đông vào bình T75 chứa 15 mL môi trường Caco-2 đã được làm ấm trước ở 37°C.
Để nuôi cấy tế bào Caco-2 ở độ phủ khoảng 90%, trước tiên hãy làm ấm môi trường nuôi cấy Caco-2, PBS và dung dịch trypsin 0,25%/EDTA 1 mM trong bể nước ở 37°C.
Hút bỏ môi trường nuôi cấy bằng phương pháp hút chân không. Rửa tế bào hai lần với 5 mL dung dịch PBS ấm bằng cách lặp lại quá trình hút chân không và thêm dung dịch PBS mới.