Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے CSS کے لیے محدود سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربہ کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کر دیں)۔ اس دوران، مسلسل سپورٹ کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائلز اور جاوا اسکرپٹ کے ڈسپلے کریں گے۔
ہیومن گٹ مورفوگنیسیس 3D اپیتھیلیل مائیکرو آرکیٹیکچر اور مقامی تنظیم کی crypt-villus خصوصیات کو قائم کرتا ہے۔ اس منفرد ڈھانچے کی ضرورت ہے کہ گٹ ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے لیے بیسل کریپٹ میں اسٹیم سیل کے طاق کو exogenous microbial antigens اور ان کے میٹابولائٹس سے محفوظ رکھا جائے۔ آنتوں کی بلغم کی سطح پر حفاظتی رکاوٹ کے ساتھ خلیات۔ اس لیے ان وٹرو گٹ ماڈلز کی تعمیر کے لیے 3D اپیتھیلیل ڈھانچے کو دوبارہ بنانا بہت ضروری ہے۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ نامیاتی مائمیٹک گٹ آن اے چپ خود بخود تھری ڈی مورفوجینیسیس کو متحرک کر سکتی ہے۔ بائیو مکینکس۔ یہاں، ہم مائیکرو فلائیڈک چپ کے ساتھ ساتھ ٹرانس ویل ایمبیڈڈ ہائبرڈ چپ پر آنتوں کی مورفوجینیسیس کو مضبوطی سے دلانے کے لیے ایک تولیدی پروٹوکول فراہم کرتے ہیں۔ ہم آلہ کی ساخت، Caco-2 کی کلچرنگ یا آنت کے خلیات کے طور پر کنوینٹل کی ترتیب کے تفصیلی طریقے بیان کرتے ہیں۔ مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم، 3D مورفوجینیسیس کی شمولیت، اور متعدد امیجنگ طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے قائم 3D ایپیتھیلیا کی خصوصیت۔ یہ پروٹوکول 5 دن کے لیے باسولیٹرل فلوئڈ فلو کو کنٹرول کر کے فنکشنل گٹ مائیکرو آرکیٹیکچر کی تخلیق نو کو حاصل کرتا ہے۔ ہمارے ان وٹرو مورفوجینیسیس کے طریقہ کار میں جسمانی طور پر پیچیدہ دباؤ اور جسمانی دباؤ کی ضرورت نہیں ہے۔ انجینئرنگ یا ہیرا پھیری، جو دیگر موجودہ تکنیکوں کو پیچھے چھوڑ سکتی ہے۔ ہم تصور کرتے ہیں کہ ہمارا مجوزہ پروٹوکول بائیو میڈیکل ریسرچ کمیونٹی کے لیے وسیع مضمرات کا حامل ہو سکتا ہے، جو بائیو میڈیکل، کلینیکل، اور فارماسیوٹیکل ایپلی کیشنز کے لیے وٹرو میں 3D آنتوں کے اپکلا تہوں کو دوبارہ تخلیق کرنے کا طریقہ فراہم کرتا ہے۔
تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ گٹ آن اے چپ 1,2,3,4,5 یا بائلیئر مائیکرو فلائیڈک ڈیوائسز 6,7 میں کلچر شدہ آنتوں کے اپکلا Caco-2 خلیات بنیادی طریقہ کار کی واضح سمجھ کے بغیر وٹرو میں اچانک 3D مورفوجنیسیس سے گزر سکتے ہیں۔ وٹرو میں 3D اپیٹیلیل مورفوگنیسیس کو دلانے کے لیے کلچر ڈیوائسز کے مخالف ضروری اور کافی ہیں، جس کا مظاہرہ Caco-2 اور مریض سے حاصل کردہ آنتوں کے آرگنائڈز کے ذریعے کیا گیا ہے۔ اپیتھیلیل سیلز کی توثیق کی گئی تھی۔ اس مطالعے میں، ہم نے خاص طور پر ایک طاقتور Wnt مخالف، Dickkopf-1 (DKK-1) کی سیل پروڈکشن اور ارتکاز کی تقسیم پر توجہ مرکوز کی، گٹ آن اے چپ اور تبدیل شدہ مائکرو فلائیڈک ڈیوائسز جن میں ٹرانس ویل انسرٹس شامل ہیں، جسے "ہائبرڈ ڈیموجنٹ چِیپگنسٹس" کہا جاتا ہے۔ (جیسے DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) آن چپ گٹ میں مورفوجینیسیس کو روکتا ہے یا پہلے سے تشکیل شدہ 3D اپکلا پرت میں خلل ڈالتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ کلچر کے دوران مخالفانہ تناؤ آنتوں کے اندر وجینپرا کو حاصل کرنے کے لیے ذمہ دار ہے۔ اپیتھیلیل انٹرفیس پر مضبوط مورفوجینیسیس فعال فلشنگ (مثال کے طور پر گٹ آن اے چپ یا ہائبرڈ آن اے چپ پلیٹ فارمز میں) یا ڈفیوژن کے ذریعے بیسولیٹرل کمپارٹمنٹ میں Wnt مخالفوں کی سطح کو ہٹانا یا کم سے کم برقرار رکھنا ہے۔
اس پروٹوکول میں، ہم گٹ آن-اے-چپ مائیکرو ڈیوائسز اور ٹرانس ویل-انسرٹ ایبل ہائبرڈ چپس (مرحلہ 1-5) کو پولیڈیمیتھائلسلوکسین (PDMS) پر مبنی غیر محفوظ جھلیوں (اسٹیپس 6A، 7 کے ٹرانس ویلز، 7) پر آنتوں کے اپکلا خلیوں کی ثقافت کے لیے ایک تفصیلی طریقہ فراہم کرتے ہیں۔ داخل کرتا ہے (مرحلہ 6B, 7B, 8, 9) اور وٹرو میں 3D مورفوجینیسیس کی حوصلہ افزائی کرتا ہے (مرحلہ 10)۔ ہم نے متعدد امیجنگ طریقوں کو لاگو کرکے سیلولر اور مالیکیولر خصوصیات کی نشاندہی کی جو ٹشو سے متعلق مخصوص ہسٹوجنیسیس اور نسب پر منحصر سیلولر تفریق کی نشاندہی کرتے ہیں (مرحلہ 11۔ اپکلا خلیات، جیسے Caco-2 یا آنتوں کے آرگنائڈز، تکنیکی تفصیلات کے ساتھ دو کلچر فارمیٹس میں جن میں غیر محفوظ جھلیوں کی سطح میں ترمیم، 2D monolayers کی تخلیق، اور آنتوں کی بایو کیمیکل اور reproduction of biomechanical microenvironment.in vitro. To induce to 3D moorgenes سے ہٹا دیا گیا ہے۔ ثقافت کے بیسولٹرل کمپارٹمنٹ میں میڈیم کو بہا کر دونوں مہذب شکلوں میں مورفوجن مخالف۔ آخر میں، ہم ایک قابل تجدید 3D اپکلا پرت کی افادیت کی نمائندگی کرتے ہیں جو مورفوجن پر منحصر اپیتھیلیل نمو، طولانی میزبان-مائکرو بایوم، انفیکشن انفیکچر، انفیکچر، انفیکچر، انفیکچرز، انفیکچرز، انفیکچرز، انفیکچرنگ انڈیکس کو ماڈل بنانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اپکلا رکاوٹ کی خرابی، اور پروبائیوٹک پر مبنی علاج مثال کے طور پر اثر.
ہمارا پروٹوکول سائنس دانوں کی ایک وسیع رینج کے لیے کارآمد ہو سکتا ہے بنیادی (مثال کے طور پر، آنتوں کی میوکوسل بائیولوجی، اسٹیم سیل بیالوجی، اور ڈیولپمنٹ بائیولوجی) اور اطلاقی تحقیق (مثلاً، پری کلینکل ڈرگ ٹیسٹنگ، ڈیز ماڈلنگ، ٹشو انجینئرنگ، اور گیسٹرو اینٹرولوجی) کے وسیع اثرات۔ وٹرو میں آنتوں کے اپکلا کی شکل میں، ہم تصور کرتے ہیں کہ ہماری تکنیکی حکمت عملی کو آنتوں کی نشوونما، تخلیق نو یا ہومیوسٹاسس کے دوران سیل سگنلنگ کی حرکیات کا مطالعہ کرنے والے سامعین تک پہنچایا جا سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، ہمارا پروٹوکول مختلف متعدی ایجنٹوں کے تحت انفیکشن کی پوچھ گچھ کے لیے مفید ہے، جیسے کہ Norovirusyn2، Corovirusyn2. (SARS-CoV-2)، Clostridium difficile، Salmonella Typhimurium 9 یا Vibrio Cholerae۔ بیماری کے پیتھالوجی اور روگجنن کے سامعین بھی کارآمد ہیں۔ آن چپ گٹ مائکرو فزیالوجی سسٹم کا استعمال طول بلد کو کلچر 10 اور اس کے نتیجے میں میزبان دفاع، مدافعتی ردعمل اور معدے (GI) میں روگجن سے متعلقہ چوٹ کی مرمت کی اجازت دے سکتا ہے۔ بیماری، کروہن کی بیماری، السرٹیو کولائٹس، پاؤچائٹس، یا چڑچڑاپن والے آنتوں کے سنڈروم کی تقلید اس وقت کی جا سکتی ہے جب مریض کی 3D آنتوں کے اپکلا تہوں کا استعمال کرتے ہوئے 3D آنتوں کے اپکلا کی تہوں کو تیار کیا جاتا ہے، ان بیماریوں میں وائلوس ایٹروفی، کرپٹ شارٹننگ، امپیوسل باریری یا بیریڈیل ڈیمیج شامل ہیں۔ سیل سے ماخوذ آنتوں کے آرگنائڈز 12,13۔ بیماری کے ماحول کی اعلی پیچیدگی کو بہتر انداز میں پیش کرنے کے لیے، قارئین 3D آنتوں کے villus-crypt مائیکرو آرکیٹیکچرز پر مشتمل ماڈلز میں بیماری سے متعلقہ سیل اقسام، جیسے کہ مریض کے پیریفرل بلڈ مونو نیوکلیئر سیلز (PBMCs) کو شامل کرنے پر غور کر سکتے ہیں۔ ٹشو مخصوص مدافعتی خلیات، 5.
چونکہ 3D اپکلا مائیکرو اسٹرکچر کو سیکشننگ کے عمل کے بغیر فکس اور تصور کیا جا سکتا ہے، اس لیے مقامی ٹرانسکرپٹومکس اور ہائی ریزولوشن یا سپر ریزولوشن امیجنگ پر کام کرنے والے ناظرین اپکلا طاقوں پر جینز اور پروٹینوں کی spatiotemporal حرکیات کی ہماری میپنگ میں دلچسپی لے سکتے ہیں۔ ٹیکنالوجی میں دلچسپی ہے۔ مائکروبیل یا مدافعتی محرکات کا ردعمل۔ مزید برآں، طولانی میزبان-مائکروبائیوم کراسسٹالک 10، 14 جو کہ گٹ ہومیوسٹاسس کو مربوط کرتا ہے، 3D آنتوں کی میوکوسل تہہ میں مختلف مائکروبیل پرجاتیوں، خاص طور پر مائکروبیل کمیونٹیز میں مشترکہ ثقافت کے ذریعے قائم کیا جا سکتا ہے۔ گٹ آن ایک چپ پلیٹ فارم میں۔ یہ نقطہ نظر خاص طور پر ان سامعین کے لیے پرکشش ہے جو میوکوسل امیونولوجی، گیسٹرو اینٹرولوجی، ہیومن مائکرو بایوم، کلچرومکس اور کلینیکل مائکرو بایولوجی کا مطالعہ کر رہے ہیں جو لیبارٹری میں پہلے سے غیر کلچرڈ گٹ مائیکرو بائیوٹا کاشت کرنا چاہتے ہیں۔ 384 کنویں پلیٹیں جو مسلسل بیسولٹرل کمپارٹمنٹس کو بھرتی ہیں، پروٹوکول ان لوگوں کو بھی پھیلایا جا سکتا ہے جو فارماسیوٹیکل، بایومیڈیکل یا ہائی تھرو پٹ اسکریننگ یا فوڈ انڈسٹری کے لیے توثیق کرنے والے پلیٹ فارم تیار کر رہے ہیں۔ فارمیٹ۔اس کے علاوہ، ایک سے زیادہ آرگن آن اے چپ پراڈکٹس کو کمرشلائز کیا گیا ہے 16,17,18۔ اس لیے ہمارے ان وٹرو مورفوجینیسیس کے طریقہ کار کی توثیق کو تیز کیا جا سکتا ہے اور بہت سی تحقیقی لیبارٹریوں، صنعت یا حکومت اور ریگولیٹری ایجنسیوں کی طرف سے ممکنہ طور پر اپنایا جا سکتا ہے تاکہ ان وٹرو گٹ کی سیلولر ری پروگرامنگ کو سمجھا جا سکے۔ منشیات کے امیدواروں کے جذب اور نقل و حمل کا اندازہ 3D گٹ سروگیٹس کا استعمال کرتے ہوئے یا گٹ مورفوجینیسیس کے عمل کی تولیدی صلاحیت کا اندازہ کرنے کے لیے کسٹم یا کمرشل آرگن آن اے چپ ماڈلز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
انسانی متعلقہ تجرباتی ماڈلز کی ایک محدود تعداد کو آنتوں کے اپکلا مورفوگنیسیس کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے، جس کی بنیادی وجہ وٹرو میں 3D مورفوجینیسیس کو آمادہ کرنے کے قابل عمل پروٹوکول کی کمی ہے۔ درحقیقت، گٹ مورفوجینیسیس کے بارے میں موجودہ علم کا زیادہ تر حصہ جانوروں کے مطالعہ پر مبنی ہے (مثال کے طور پر، زیبرا فش، 20، 20، 20، 20، 20، 20، 20، 20، 2، 2، 2)۔ لیبر- اور لاگت کے لحاظ سے، اخلاقی طور پر قابل اعتراض ہو سکتے ہیں، اور سب سے اہم بات یہ ہے کہ انسانی ترقی کے عمل کو قطعی طور پر متعین نہیں کرتے۔ یہ ماڈلز بھی ان کی قابلیت کے لحاظ سے بہت محدود ہیں کہ وہ کثیر جہتی اسکیل ایبل انداز میں جانچے جا سکتے ہیں۔ اس لیے، وٹرو میں 3D ٹشو ڈھانچے کو دوبارہ تخلیق کرنے کے لیے ہمارا پروٹوکول ویوو ڈی اسٹا 2 روایتی جانوروں کے ماڈل کے طور پر دوسرے روایتی جانوروں کے ماڈلز سے بہتر کارکردگی کا مظاہرہ کرتا ہے۔ پہلے بیان کیا گیا تھا، 3D اپکلا ڈھانچے کے استعمال سے ہمیں مختلف بلغم یا مدافعتی محرکات کے جواب میں کرپٹ وِلس محور میں مختلف خلیات کی مقامی لوکلائزیشن کی جانچ پڑتال کرنے کی اجازت ملتی ہے۔ بیرونی بلغم کی تہہ، IgA کا سراو اور antimicrobial peptides) مزید برآں، 3D اپیتھیلیل مورفولوجی ہمیں یہ سمجھنے کی اجازت دیتی ہے کہ گٹ مائکرو بائیوٹا کس طرح اپنی کمیونٹیز کی ساخت بناتا ہے اور ہم آہنگی سے مائکروبیل میٹابولائٹس (مثلاً، شارٹ چین فیٹی ایسڈ) پیدا کرتا ہے جو صرف سیلولر آرگنائزیشن کو تشکیل دے سکتا ہے اور سیلولر آرگنائزیشن کی تشکیل کر سکتا ہے۔ جب وٹرو میں 3D اپکلا پرتیں قائم ہوتی ہیں تو اس کا مظاہرہ کیا جائے۔
3D آنتوں کے اپکلا ڈھانچے بنانے کے ہمارے طریقہ کار کے علاوہ، وٹرو کے کئی طریقے ہیں۔ آنتوں کے آرگنائیڈ کلچر ایک جدید ترین ٹشو انجینئرنگ تکنیک ہے جس کی بنیاد مخصوص مورفوجن حالات23,24,25 کے تحت آنتوں کے اسٹیم سیلز کی کاشت پر مبنی ہے۔ شریک ثقافتیں اکثر مشکل ہوتی ہیں کیونکہ آنتوں کا لیمن آرگنائیڈ کے اندر بند ہوتا ہے اور اس وجہ سے، لومینل اجزاء جیسے مائکروبیل سیل یا خارجی اینٹیجنز کا تعارف محدود ہوتا ہے۔ مائیکرو انجیکٹر،26,27 کا استعمال کرتے ہوئے آرگنائیڈ لیمنس تک رسائی کو بہتر بنایا جا سکتا ہے لیکن یہ طریقہ ناگوار اور محنت طلب ہے اور اسے انجام دینے کے لیے خصوصی علم کی ضرورت ہوتی ہے۔ مزید برآں، جامد حالات میں ہائیڈروجیل اسکافولڈز میں برقرار روایتی آرگنائیڈ کلچرز ویوو بائیو مکینکس میں درست طریقے سے فعال نہیں ہوتے۔
کئی تحقیقی گروپوں کے ذریعہ استعمال کیے گئے دیگر نقطہ نظر جیل کی سطح پر الگ تھلگ انسانی آنتوں کے خلیوں کو کلچر کرکے گٹ اپکلا کی ساخت کی نقل کرنے کے لیے پہلے سے تیار کردہ 3D ہائیڈروجل اسکافولڈز کا استعمال کرتے ہیں۔ جسمانی طور پر متعلقہ مورفوجن گریڈینٹ کے ساتھ وٹرو میں اپکلا خلیات، اسکافولڈ میں اسٹرومل خلیات کو شامل کرکے ایک اعلی پہلو تناسب اپکلا ڈھانچہ اور اسٹروما اپکلا کراسسٹالک قائم کرتے ہیں۔ بیچوالا بہاؤ، فلو شیئر اسٹریس کا فقدان جس میں آنتوں کے خلیوں کو مورفوجینیسیس سے گزرنے اور جسمانی فنکشن حاصل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔ ایک اور حالیہ تحقیق میں مائکرو فلائیڈک پلیٹ فارم میں ہائیڈروجیل اسکافولڈز کا استعمال کیا گیا اور لیزر اینچنگ تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے پیٹرن والے آنتوں کے اپکلا ڈھانچے۔ ماؤس آنتوں کے آرگنائڈز وغیرہ کی پیروی کرنے کے لیے ایک مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم میں استعمال کیا گیا۔ مائیکرو فلائیڈکس ماڈیول کا استعمال کرتے ہوئے انٹرا لومینل فلو کے بہاؤ کو دوبارہ تیار کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، یہ ماڈل نہ تو خود بخود مورفوجینیٹک عمل کو ظاہر کرتا ہے اور نہ ہی اس میں گٹ میکانوبیولوجیکل موومنٹ شامل ہیں۔ ایک ہی گروپ کی 3D پرنٹنگ تکنیک اس قابل تھی کہ اسپونٹینیوس گٹ ٹیوبیں تخلیق کر سکیں۔ ٹیوب کے اندر حصوں میں، اس ماڈل میں luminal سیال بہاؤ اور مکینیکل اخترتی کی بھی کمی ہے۔ اس کے علاوہ، ماڈل کی آپریٹیبلٹی محدود ہو سکتی ہے، خاص طور پر بائیو پرنٹنگ کے عمل کے مکمل ہونے کے بعد، تجرباتی حالات یا خلیے سے خلیے کے تعاملات کو پریشان کرنے کے بعد۔ گٹ موٹیلٹی، آزاد اپیکل اور بیسولٹرل کمپارٹمنٹس کی رسائی، اور ماڈیولریٹی کے پیچیدہ حیاتیاتی مائیکرو ماحولیات کی دوبارہ تخلیق۔ اس لیے ہمارا ان وٹرو تھری ڈی مورفوجینیسیس پروٹوکول موجودہ طریقوں کے چیلنجوں پر قابو پانے کے لیے ایک تکمیلی نقطہ نظر فراہم کر سکتا ہے۔
ہمارا پروٹوکول مکمل طور پر تھری ڈی اپیتھیلیل مورفوجنیسیس پر مرکوز ہے، جس میں کلچر میں صرف اپیتھیلیل خلیات ہیں اور اس کے ارد گرد کے خلیات کی کوئی دوسری قسم نہیں ہے جیسے کہ mesenchymal خلیات، endothelial خلیات، اور مدافعتی خلیات۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، ہمارے پروٹوکول کا بنیادی حصہ epithelial morphogenesis induction by the secretion of the remorphogenesis at remotoral. متعارف کرائے گئے میڈیم کا۔ جب کہ ہمارے گٹ آن اے چپ اور ہائبرڈ آن اے چپ کی مضبوط ماڈیولریٹی ہمیں غیر منقطع 3D اپکلا پرت کو دوبارہ بنانے کی اجازت دیتی ہے، اضافی حیاتیاتی پیچیدگیاں جیسے اپکلا-میسنچیمل تعاملات 33,34، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس، ڈیپازٹ میٹرکس (کرپٹی) ماڈل (کرپٹ) بیسل کریپٹس میں اسٹیم سیل کے طاقوں کو پہنچانے والی خصوصیات پر مزید غور کیا جانا باقی ہے۔ mesenchyme میں سٹرومل خلیات (مثال کے طور پر، fibroblasts) ECM پروٹین کی پیداوار اور vivo35,37,38 میں آنتوں کی مورفوجنیسیس کے ریگولیشن میں کلیدی کردار ادا کرتے ہیں۔ اینڈوتھیلیل پرت (یعنی کیپلیریاں یا لمفیٹکس) آنت کے مائیکرو ماحولیات میں مالیکیولر ٹرانسپورٹ39 اور امیون سیل ریکروٹمنٹ 40 کو ریگولیٹ کرنے میں اہم کردار ادا کرتی ہے۔ مزید برآں، ویسکولیچر اجزاء جو ٹشو ماڈلز کے درمیان منسلک ہو سکتے ہیں ایک شرط ہے جب ٹشو ماڈلز کو ملٹی اسٹریٹمنٹ سیلز کے لیے ڈیزائن کیا جاتا ہے۔ اعضاء کی سطح کے ریزولیوشن کے ساتھ زیادہ درست جسمانی خصوصیات کو ماڈل کرنے کے لیے شامل کرنے کی ضرورت پڑ سکتی ہے۔ مریض سے حاصل کردہ مدافعتی خلیے بھی آنتوں کی بیماری کی نقل کرنے کے تناظر میں پیدائشی مدافعتی ردعمل، اینٹیجن پریزنٹیشن، فطری انکولی مدافعتی کراسسٹالک، اور ٹشو کے لیے مخصوص قوت مدافعت کو ظاہر کرنے کے لیے ضروری ہیں۔
ہائبرڈ چپس کا استعمال گٹ آن اے چپ کے مقابلے میں زیادہ سیدھا ہے کیونکہ ڈیوائس کا سیٹ اپ آسان ہے اور ٹرانس ویل انسرٹس کا استعمال گٹ اپیتھیلیم کی توسیع پذیر کلچر کی اجازت دیتا ہے۔ تاہم، پولیسٹر جھلیوں کے ساتھ تجارتی طور پر دستیاب ٹرانس ویل انسرٹس لچکدار نہیں ہوتے ہیں اور ٹرانس ویل انسرٹس کی نقل و حرکت کی جگہ پر پرسٹالٹک کی طرح نقل نہیں کر سکتے۔ ہائبرڈ چپ میں اپیکل سائیڈ پر بغیر کسی قینچ کے دباؤ کے ساکن رہی۔ واضح طور پر، اپیکل کمپارٹمنٹ میں جامد خصوصیات شاذ و نادر ہی ہائبرڈ چپس میں طویل مدتی بیکٹیریل کو کلچر کو قابل بناتی ہیں۔ جب کہ ہم ٹرانس ویل میں تھری ڈی مورفوجنیسس کو مضبوطی سے دلا سکتے ہیں، جب شارٹ ہائبریولوجیکل انسرٹ کا استعمال کرتے ہوئے بائیو مکینکس اور اپیکل فلو فلو ممکنہ ایپلی کیشنز کے لیے ہائبرڈ چپ پلیٹ فارم کی فزیبلٹی کو محدود کر سکتے ہیں۔
گٹ آن اے چپ اور ہائبرڈ آن اے چپ کلچرز میں انسانی کریپٹ وِلس ایکسس کی مکمل پیمانے پر تعمیر نو مکمل طور پر قائم نہیں ہوسکی ہے۔ چونکہ مورفوجینیسیس اپکلا مونولیئر سے شروع ہوتا ہے، اس لیے 3D مائیکرو آرکیٹیکچرز ضروری نہیں کہ ہم کرپٹوولوجیکل خصوصیات میں مورفولوجیکل مماثلت فراہم کریں۔ مائیکرو انجینیئرڈ 3D اپیتھلیم میں بیسل کریپٹ ڈومین کے قریب سیل کی بڑھتی ہوئی آبادی، کریپٹ اور وائلس علاقوں کی واضح طور پر حد بندی نہیں کی گئی تھی۔ اگرچہ چپ پر موجود اوپری چینلز مائیکرو انجینیئرڈ ایپیٹیلیم کی اونچائی میں اضافے کا باعث بنتے ہیں، لیکن زیادہ سے زیادہ اونچائی اب بھی انسانی حد تک محدود ہے۔ چھوٹی اور بڑی آنتوں میں آنتوں کے کریپٹس بالترتیب ~ 135 µm اور ~ 400 µm ہیں، اور چھوٹی آنت والی والی کی اونچائی ~ 600 µm41 ہے۔
امیجنگ کے نقطہ نظر سے، صورتحال میں 3D مائیکرو آرکیٹیکچرز کی سپر ریزولوشن امیجنگ ایک چپ پر گٹ تک محدود ہو سکتی ہے، کیونکہ مقصدی لینس سے اپیتھیلیل پرت تک مطلوبہ کام کا فاصلہ چند ملی میٹر کے حکم پر ہے۔ اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے، ایک دور مقصد کی ضرورت ہو سکتی ہے۔ PDMS کی اعلی لچک۔ مزید برآں، چونکہ ایک چپ پر گٹ کی پرت بہ پرت مائیکرو فیبریکیشن میں ہر پرت کے درمیان مستقل چپکنا شامل ہوتا ہے، اس لیے اپکلا پرت کی سطح کی ساخت کا جائزہ لینے کے لیے اوپری تہہ کو کھولنا یا ہٹانا انتہائی مشکل ہوتا ہے۔ مثال کے طور پر، ایک سکیننگ الیکٹران مائکروسکوپ (SEM) کا استعمال کرکے۔
ہائیڈروفوبک چھوٹے مالیکیولز سے متعلق مائیکرو فلائیڈک پر مبنی مطالعات میں PDMS کی ہائیڈرو فوبیسٹی ایک محدود عنصر رہی ہے، کیونکہ PDMS غیر مخصوص طور پر ایسے ہائیڈروفوبک مالیکیولز کو جذب کر سکتا ہے۔ PDMS کے متبادل کو دیگر پولیمرک مواد کے ساتھ سمجھا جا سکتا ہے۔ متبادل طور پر، PDMS کی سطح میں ترمیم کے ساتھ، PDMS کے متبادل کے ساتھ۔ یا poly(ethylene glycol) 43 ) کو ہائیڈروفوبک مالیکیولز کے جذب کو کم کرنے کے لیے سمجھا جا سکتا ہے۔
آخر میں، ہمارے طریقہ کار کو ہائی تھرو پٹ اسکریننگ یا "ایک سائز کے تمام فٹ" صارف دوست تجرباتی پلیٹ فارم فراہم کرنے کے لحاظ سے اچھی خاصیت نہیں دی گئی ہے۔ موجودہ پروٹوکول کے لیے ایک سرنج پمپ فی مائیکرو ڈیوائس کی ضرورت ہے، جو CO2 انکیوبیٹر میں جگہ لیتا ہے اور بڑے پیمانے پر تجربات کو روکتا ہے۔ اس حد کو نمایاں طور پر بہتر کیا جا سکتا ہے۔ 96-کنواں، یا 384-کنویں غیر محفوظ انسرٹس جو بیسولیٹرل میڈیا کو مسلسل بھرنے اور ہٹانے کی اجازت دیتے ہیں)۔
وٹرو میں انسانی آنتوں کے اپکلا کے 3D مورفوجینیسیس کو دلانے کے لیے، ہم نے ایک مائیکرو فلائیڈک چپ آنت کے آلے کا استعمال کیا جس میں دو متوازی مائکرو چینلز اور درمیان میں ایک لچکدار غیر محفوظ جھلی ہوتی ہے تاکہ ایک لیمن-کیپلیری انٹرفیس بنایا جا سکے۔ ٹرانس ویل انسرٹس پر اگنے والی پولرائزڈ اپیتھیلیل تہوں کے نیچے بہاؤ۔ دونوں پلیٹ فارمز میں، مختلف انسانی آنتوں کے اپکلا خلیوں کی مورفوجینیسیس کو بیسولیٹرل کمپارٹمنٹ سے مورفوجن مخالفوں کو ہٹانے کے لیے بہاؤ کی دشاتمک ہیرا پھیری کا استعمال کرتے ہوئے ظاہر کیا جا سکتا ہے۔ یا ٹرانس ویل داخل کرنے کے قابل ہائبرڈ چپ (مرحلہ 1-5؛ باکس 1)، (ii) آنتوں کے اپکلا خلیات (Caco-2 خلیات) یا انسانی آنتوں کے آرگنائڈز کی تیاری؛ باکسز 2-5)، (iii) آنتوں کے چپس یا ہائبرڈ چپس پر آنتوں کے اپکلا خلیوں کی ثقافت (مرحلہ 6-9)، (iv) وٹرو میں 3D مورفوجینیسیس کی شمولیت (مرحلہ 10) اور (v) ) 3D اپیٹیلیل مائکرو اسٹرکچر کی خصوصیت کے لیے، مناسب طور پر کنٹرول گروپ 12-4۔ (ذیل میں مزید بحث کی گئی ہے) کو مقامی، وقتی، مشروط، یا طریقہ کار کے کنٹرول سے اپیٹیلیل مورفوگنیسیس کا موازنہ کرکے وٹرو مورفوگنیسیس کی تاثیر کو درست کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا۔
ہم نے دو مختلف کلچر پلیٹ فارمز کا استعمال کیا: گٹ آن اے چپ سیدھے چینلز کے ساتھ یا نان لائنر کنولوٹیڈ چینلز، یا ہائبرڈ چپس جن میں ٹرانس ویل (TW) داخل ہوتے ہیں ایک مائیکرو فلائیڈک ڈیوائس میں، جیسا کہ باکس 1 میں بیان کیا گیا ہے، اور مرحلہ 1-5 "ڈیوائس فیبریکیشن" ایک Huchip یا سنگل چیپ بنانے کے اہم مراحل کو ظاہر کرتا ہے۔ Intestinal Epithelial Cells" اس پروٹوکول میں استعمال ہونے والے سیل کے ماخذ (Caco-2 یا انسانی آنتوں کے آرگنائڈز) اور کلچر کے طریقہ کار کی وضاحت کرتا ہے۔"In vitro morphogenesis" ان مجموعی مراحل کو ظاہر کرتا ہے جس میں Caco-2 یا organoid سے ماخوذ اپیتھیلیل خلیات آنتوں کے انسرٹ چپ کے ذریعے کلچر ہوتے ہیں۔ 3D مورفوجینیسیس کی شمولیت اور ایک خصوصیت والے اپیتھیلیل ڈھانچے کی تشکیل۔ پروگرام کا مرحلہ نمبر یا باکس نمبر ہر تیر کے نیچے ظاہر ہوتا ہے۔ ایپلی کیشن مثالیں فراہم کرتی ہے کہ آنتوں کے اپکلا پرتوں کو کس طرح استعمال کیا جا سکتا ہے، مثال کے طور پر، خلیے کی تفریق کی خصوصیت، گٹ فزیالوجی اسٹڈیز، میزبان مائیکرو بائیو سیسٹم فلو کی تشکیل، بیماری کے ماڈلز کا قیام۔ گٹ چپ پر پیدا ہونے والی 3D Caco-2 اپکلا پرت میں نیوکلی، F-actin اور MUC2 کو ظاہر کرنے والی "سیل تفریق" میں تصاویر۔ MUC2 سگنلنگ گوبلٹ سیلز اور بلغم کی سطحوں سے چھپنے والے بلغم میں موجود ہے۔ گٹ میں فلوروسینٹ امیجز اور گٹ فزیالوجی کے ذریعے پیدا ہونے والی تیزابیت کی نمائش۔ فلوروسینٹ گندم کے جراثیم ایگلوٹینن کا استعمال کرتے ہوئے N-acetylglucosamine کی باقیات۔ "Host-Microbe Co-Cultures" میں دو اوور لیپنگ امیجز ایک چپ پر گٹ میں نمائندہ میزبان-مائکروبائیوم کو کلچرز دکھاتی ہیں۔ بائیں پینل E. coliering کے ساتھ E. coliering expressing پروٹین (Fluoresent GreenF3) کو ظاہر کرتا ہے۔ Caco-2 اپیتھیلیل سیلز۔ دایاں پینل 3D Caco-2 اپیتھیلیل سیلز کے ساتھ مل کر GFP E. coli کی لوکلائزیشن کو ظاہر کرتا ہے، جس کے بعد F-actin (سرخ) اور نیوکلی (نیلا) کے ساتھ امیونو فلوروسینس سٹیننگ ہوتا ہے۔ بیماری کی ماڈلنگ واضح کرتی ہے کہ صحت مند بمقابلہ gutchitum چیلنج کے ساتھ gutchitsi in leaky. بیکٹیریل اینٹیجنز (مثلاً، لیپوپولیساکرائڈ، ایل پی ایس) اور مدافعتی خلیات (مثلاً، PBMC؛ سبز)۔ Caco-2 خلیات کو 3D اپیتھیلیل پرت قائم کرنے کے لیے کلچر کیا گیا تھا۔ اسکیل بار، 50 µm۔ نیچے کی قطار میں تصاویر: "خلیات کی تفریق" حوالہ2 سے اجازت کے ساتھ موافقت۔ آکسفورڈ یونیورسٹی پریس؛ Ref.5 سے اجازت کے ساتھ دوبارہ پیش کیا گیا۔ NAS; "میزبان مائیکروب کو کلچر" ریفری 3 کی اجازت سے ڈھال لیا گیا۔ NAS; "ڈیزیز ماڈلنگ" حوالہ سے اجازت کے ساتھ موافقت۔5۔ این اے ایس
گٹ آن چپ اور ہائبرڈ چپس دونوں PDMS نقلوں کا استعمال کرتے ہوئے من گھڑت تھے جنہیں نرم لتھوگرافی 1,44 کے ذریعے سلکان کے سانچوں سے ڈھایا گیا تھا اور SU-8 کے ساتھ نمونہ بنایا گیا تھا۔ ہر چپ میں مائیکرو چینلز کے ڈیزائن کا تعین ہائیڈروڈائینامکس جیسے شیئر اسٹریس اور ہائیڈروڈائنمک ڈیزائن، تھیٹروڈینا 1،44 کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 1a)، جو دو متوازی متوازی سیدھے مائیکرو چینلز پر مشتمل تھا، ایک پیچیدہ گٹ آن-اے-چپ (توسیعی ڈیٹا تصویر 1b) میں تیار ہوا ہے جس میں مڑے ہوئے مائیکرو چینلز کا ایک جوڑا شامل ہے تاکہ فلوڈ ریزیڈینس ٹائم میں اضافہ، سیلز کا ملٹی فلو پیٹرن اور ملٹی فلو (ملٹی فیلو) کی کلچر (ڈی فلو)۔ 2a–f) 12. جب زیادہ پیچیدہ گٹ بائیو مکینکس کو دوبارہ بنانے کی ضرورت ہوتی ہے، پیچیدہ گٹ آن اے چپس کا انتخاب کیا جا سکتا ہے۔ ہم نے یہ ظاہر کیا ہے کہ گٹ چپس بھی مضبوطی سے 3D مورفوجینیسیس کو اسی طرح کے ٹائم فریم میں اکساتی ہے جس میں اپیتھیلیل نمو کی ایک ہی ڈگری ہوتی ہے، اصل گٹ-کلچر کے مقابلے میں۔ induce 3D morphogenesis، لکیری اور پیچیدہ آن چپ گٹ ڈیزائن قابل تبادلہ ہیں۔ SU-8 پیٹرن کے ساتھ سلیکون کے سانچوں پر ٹھیک ہونے والے PDMS کی نقلیں ڈیمولڈنگ کے بعد منفی خصوصیات فراہم کرتی ہیں (تصویر 2a)۔ ایک چپ پر گٹ کو گھڑنے کے لیے، تیار شدہ اوپری PDMS تہہ کو PDMS کے ساتھ ترتیب دیا گیا تھا اور اس کے بعد PDMS کی تہہ کو ترتیب دیا گیا تھا۔ ایک کورونا ٹریٹر (تصویر 2b–f) کا استعمال کرتے ہوئے ناقابل واپسی بانڈنگ کے ذریعے PDMS تہہ۔ ہائبرڈ چپس بنانے کے لیے، علاج شدہ PDMS نقلوں کو شیشے کی سلائیڈوں سے منسلک کیا گیا تھا تاکہ سنگل چینل مائکرو فلائیڈک ڈیوائسز بنائی جا سکیں جو ٹرانس ویل انسرٹس کو ایڈجسٹ کر سکیں (تصویر 2h اور Fig. 2h اور توسیعی سطح کا علاج کرنے کے عمل کو انجام دیا گیا ہے)۔ آکسیجن پلازما یا کورونا کے علاج کے ساتھ PDMS کی نقل اور گلاس۔ سلیکون ٹیوب سے منسلک مائیکرو فیبریکیٹڈ ڈیوائس کو جراثیم سے پاک کرنے کے بعد، ڈیوائس کا سیٹ اپ آنتوں کے اپکلا (شکل 2 جی) کی 3D مورفوجینیسیس انجام دینے کے لیے تیار تھا۔
a، SU-8 پیٹرن والے سلیکون مولڈز سے PDMS حصوں کی تیاری کی اسکیمیٹک مثال۔ غیر علاج شدہ PDMS محلول کو سلیکون مولڈ (بائیں) پر ڈالا گیا، 60 ° C (درمیانی) پر ٹھیک کیا گیا اور (دائیں) توڑ دیا گیا۔ مسمار شدہ PDMS کو ٹکڑوں میں کاٹا گیا اور PDMS کو مزید استعمال کرنے کے لیے فوٹو گرافی کے استعمال کے لیے صاف کیا گیا۔ layer.c، PDMS غیر محفوظ جھلی بنانے کے لیے استعمال ہونے والے سلیکون مولڈ کی تصویر، اوپری اور نچلے PDMS اجزاء کی تصویروں کی ایک سیریز اور آن چپ آنت کے آلے کو جمع کیا جاتا ہے۔ یعنی اوپری، جھلی، اور نچلے PDMS اجزاء کی سیدھ کی منصوبہ بندی۔ علاج. ایف، سپر امپوزڈ مائیکرو چینلز اور ویکیوم چیمبرز کے ساتھ من گھڑت گٹ آن اے چپ ڈیوائس کا اسکیمیٹک، مائیکرو فلائیڈک سیل کلچر کے لیے گٹ آن اے چپ کا سیٹ اپ۔ سلیکون ٹیوب کے ساتھ اسمبل کردہ چپ پر من گھڑت گٹ کو سرنگ کی جگہ پر لپیٹ دیا گیا تھا۔ پروسیسنگ کے لیے 150 ملی میٹر پیٹری ڈش کا۔ بائنڈر کا استعمال سلیکون ٹیوب کو بند کرنے کے لیے کیا جاتا ہے، ہائبرڈ چپس کی تعمیر کے بصری اسنیپ شاٹس اور ہائبرڈ چپس کا استعمال کرتے ہوئے تھری ڈی مورفوجینیسیس۔ ٹرانس ویل انسرٹس آزادانہ طور پر کلچر کے لیے تیار کیے گئے 2D monolayers کو آنتوں کے خلیوں میں داخل کرنے کے لیے۔ آنتوں کے 3D مورفوجینیسیس کو دلانا۔ میڈیم کو ٹرانس ویل انسرٹ پر قائم سیل پرت کے نیچے مائکرو چینلز کے ذریعے پرفیوز کیا جاتا ہے۔ اسکیل بار، 1 cm.h حوالہ سے اجازت کے ساتھ دوبارہ پرنٹ کیا جاتا ہے۔4۔ ایلسیویئر۔
اس پروٹوکول میں، Caco-2 سیل لائن اور آنتوں کے آرگنائڈز کو اپکلا ذرائع (تصویر 3a) کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ دونوں قسم کے خلیات کو آزادانہ طور پر کلچر کیا گیا تھا (باکس 2 اور باکس 5) اور آن چپ گٹ یا ٹرانس ویل انسرٹس کے ECM کوٹڈ مائکرو چینلز کو سیڈ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ٹی فلاسکس میں Caco-2 خلیات (حصہ 10 اور 50 کے درمیان) کو ٹرپسنائزیشن فلوئڈ (باکس 2) کے ذریعے الگ تھلگ سیل سسپنشن تیار کرنے کے لیے کاٹا جاتا ہے۔ آنتوں کے بایپسی یا جراحی سے ہونے والے انسانی آنتوں کے آرگنائڈز کو میٹریجیل اسکافولڈ ڈومز میں مائیکرو ویلرول ڈومز کو سپورٹ کرنے کے لیے کلچر کیا گیا تھا۔ ضروری مورفوجینز (جیسے Wnt، R-spondin، اور Noggin) پر مشتمل اور Box 3 میں بیان کیے گئے نمو کے عوامل کو ہر دوسرے دن اس وقت تک پورا کیا جاتا ہے جب تک کہ organoids قطر میں ~500 µm تک بڑھ نہ جائیں۔ مکمل طور پر بڑھے ہوئے organoids کی کٹائی کی جاتی ہے اور ایک خلیے میں الگ کر دی جاتی ہے تاکہ وہ ایک خلیے میں منتقل ہو جائیں یا ٹرانسمیشن پر جی 5 پر سیڈنگ کریں۔ ہم نے پہلے اطلاع دی ہے، بیماری کی قسم 12,13 کے مطابق اس میں فرق کیا جا سکتا ہے (مثلاً السرٹیو کولائٹس، کروہن کی بیماری، کولوریکٹل کینسر، یا نارمل ڈونر)، زخم کی جگہ (مثلاً، گھاو بمقابلہ غیر زخم والے علاقے) اور نالی میں معدے کی جگہ (مثلاً، گرہنی، جیجنم، ileum، cecum، cocum، cocum) فراہم کرتے ہیں۔ 5 کالونک آرگنائڈز (کولائیڈز) کی ثقافت کے لیے جو عام طور پر چھوٹے آنتوں کے آرگنائڈز کے مقابلے مورفوجینز کی زیادہ تعداد کی ضرورت ہوتی ہے۔
a، گٹ چپ میں گٹ مورفوجینیسیس کی شمولیت کے لیے ورک فلو۔ Caco-2 انسانی آنتوں کے اپکلا اور آنتوں کے آرگنائڈز کو اس پروٹوکول میں 3D مورفوجینیسیس کا مظاہرہ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ الگ تھلگ اپیٹیلیل سیلز کو تیار شدہ گٹ-آن-اے-چیپ سیلز میں سیڈ کیا گیا تھا (اٹیچڈ سیلز) اور سیپڈ آلے (سیپڈ ڈیوائس)۔ (منسلک) PDMS غیر محفوظ جھلی کے ساتھ دن 0 (D0) پر، apical (AP) بہاؤ شروع کیا جاتا ہے اور پہلے 2 دنوں تک برقرار رکھا جاتا ہے (flow, AP, D0-D2)۔ بیسولیٹرل (BL) بہاؤ بھی سائیکلک اسٹریچنگ حرکات کے ساتھ شروع کیا جاتا ہے (اسٹریچ، فلو، اے پی ایل ڈی مکمل ہونے پر) 3D مورفوجینیسیس مائیکرو فلائیڈک کلچر کے 5 دنوں کے بعد بے ساختہ واقع ہوا (مورفوجینیسیس، D5)۔ فیز کنٹراسٹ امیجز ہر تجرباتی قدم یا ٹائم پوائنٹ (بار گراف، 100 µm) پر Caco-2 سیلز کی نمائندہ مورفولوجی کو ظاہر کرتی ہیں۔ اسکیمیٹک میں ڈیشڈ تیر سیال کے بہاؤ کی سمت کی نمائندگی کرتے ہیں، SEM امیج جو 3D Caco-2 اپیتھلیم (بائیں) کی سطحی ٹوپولاجی کو دکھاتی ہے۔ میگنیفائیڈ ایریا (سفید ڈیشڈ باکس) کو نمایاں کرنے والا انسیٹ 3D Caco-2 پرت پر دوبارہ تخلیق شدہ مائکروویلی کو دکھاتا ہے (دائیں) Caco-2 پرت (دائیں)، Caco-2 کی قائم کردہ فرنٹون، کلین، ہو (ZO-1، سرخ) اور مسلسل برش کی سرحدی جھلیوں کا لیبل لگا ہوا F-actin (سبز) اور نیوکلی (نیلا) امیونو فلوروسینس کنفوکل ویژولائزیشن آنتوں کے چپس پر اپکلا خلیات کا۔ درمیانی اسکیمیٹک کی طرف اشارہ کرنے والے تیر ہر ایک کنفوکل کورس کے لیے فوکل ہوائی جہاز کے مقام کی نشاندہی کرتے ہیں۔ 3، 7، 9، 11، اور 13 دنوں میں فیز کنٹراسٹ مائیکروسکوپی کے ذریعے حاصل کیا گیا۔ انسیٹ (اوپر دائیں) فراہم کردہ امیج کی اعلی میگنیفیکیشن کو ظاہر کرتا ہے، یعنی دن 7.f پر لیے گئے ٹکڑوں پر گٹ میں آرگنائیڈ 3D اپیتھیلیم کا DIC فوٹومیکروگراف، اوورلیڈ امیجز امیونو فلورینس سیلز (سینٹ کے لیے اوورلیڈ امیونو فلورینس سیلز) دکھاتا ہے۔ گوبلٹ سیل (MUC2؛ سبز)، F-actin (گرے) اور نیوکلی (سیان) گٹ چپس پر بالترتیب (بائیں) اور 13 دن (درمیانی) اپیتھیلیل پرت پر اگائے گئے آرگنائڈز۔ توسیع شدہ ڈیٹا فگر 3 بھی دیکھیں، جو کہ ایل جی آر ایم یو ایف سگنل کو نمایاں کرتا ہے۔ کلچر کے 13 ویں دن CellMask ڈائی (دائیں) کے ساتھ پلازما جھلی کو داغ لگا کر چپ پر گٹ میں 3D آرگنائڈ اپیٹیلیم کا اپیتھیلیل مائیکرو اسٹرکچر (دائیں)۔ اسکیل بار 50 μm ہے جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو۔ آکسفورڈ یونیورسٹی پریس؛ c حوالہ سے اجازت کے ساتھ موافقت۔2۔ آکسفورڈ یونیورسٹی پریس؛ e اور f حوالہ کے ذریعہ اجازت کے ساتھ موافقت پذیر۔ 12 کریٹیو کامنز لائسنس CC BY 4.0 کے تحت۔
ایک چپ پر گٹ میں، کامیاب ECM کوٹنگ کے لیے PDMS غیر محفوظ جھلی کی ہائیڈروفوبک سطح کو تبدیل کرنا ضروری ہے۔ اس پروٹوکول میں، ہم PDMS جھلیوں کی ہائیڈرو فوبیسٹی کو تبدیل کرنے کے لیے دو مختلف طریقے استعمال کرتے ہیں۔ Caco-2 خلیات کو کلچر کرنے کے لیے، سطح کو اکیلے UV/Hydrophobic علاج کے ذریعے فعال کرنے کے لیے ہائیڈرو فوبک زون کو کم کرنا تھا۔ PDMS سطح، ECM کوٹ کریں اور Caco-2 خلیوں کو PDMS جھلی سے جوڑیں۔ تاہم، organoid epithelium کے microfluidic کلچر کو ECM پروٹین کی موثر جمع کرنے کے لیے کیمیکل پر مبنی سطح کی فنکشنلائزیشن کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ ترتیب وار پولیتھیلینیمین (PEI) اور glutaraldehyde کو PDMS کی سطح پر ECM پروٹین، ECM موڈفیکیشن مائیکرو فلوڈی ہائیڈ کی سطح پر لاگو کیا جا سکے۔ فنکشنلائزڈ PDMS سطح کو ڈھانپنے کے لیے جمع کیا جاتا ہے اور پھر الگ تھلگ آرگنائیڈ اپیتھیلیم میں متعارف کرایا جاتا ہے۔ سیلوں کے منسلک ہونے کے بعد، مائکرو فلائیڈک سیل کلچر صرف میڈیم کو اوپری مائیکرو چینل میں پرفیوز کر کے شروع ہوتا ہے جب تک کہ خلیات مکمل مونو لیئر نہ بن جائیں، جبکہ نچلا مائکرو چینل جامد حالات کو برقرار رکھتا ہے۔ PDMS سطح پر 3D مورفوجینیسیس دلانے کے لیے اپیتھیلیم۔
ٹرانس ویل ثقافتوں کو سیل سیڈنگ سے پہلے ECM کوٹنگ کی بھی ضرورت ہوتی ہے۔ تاہم، ٹرانس ویل کلچرز کو غیر محفوظ داخلوں کی سطح کو چالو کرنے کے لیے پیچیدہ پری ٹریٹمنٹ اقدامات کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔ ٹرانس ویل انسرٹس پر بڑھتے ہوئے Caco-2 سیلز کے لیے، غیر محفوظ انسرٹس پر ECM کوٹنگ منقطع Caco-2 خلیات (<1 گھنٹے) اور تنگ جنکشن بیریئر کی تشکیل کو تیز کرتی ہے (<1-2 کلچرز پر ٹرانس ویلز یا ٹرانس ویلز، ٹی ٹی یا 2 دن)۔ آرگنائڈز کو ای سی ایم لیپت داخلوں پر سیڈ کیا جاتا ہے، جھلی کی سطح (<3 ایچ) سے منسلک ہوتا ہے اور اس وقت تک برقرار رکھا جاتا ہے جب تک کہ آرگنائڈز رکاوٹ کی سالمیت کے ساتھ مکمل مونولیئر نہ بن جائیں۔ ٹرانس ویل کلچرز کو ہائبرڈ چپس کے استعمال کے بغیر 24 کنویں پلیٹوں میں انجام دیا جاتا ہے۔
ان وٹرو 3D مورفوجینیسیس کو ایک قائم شدہ اپیتھیلیل پرت کے باسولیٹرل پہلو پر فلو فلو لگا کر شروع کیا جا سکتا ہے۔ ایک چپ پر گٹ میں، اپیتھیلیل مورفوجنیسس اس وقت شروع ہوا جب میڈیم کو اوپری اور نچلے مائکرو چینلز میں پرفیوز کیا گیا تھا (تصویر 3a،)۔ جیسا کہ پہلے فلو میں بیان کیا گیا ہے دشاتمک سیکریٹڈ مورفوجن انحیبیٹرز کو مسلسل ہٹانے کے لیے (بیسولیٹرل) کمپارٹمنٹ۔ غیر محفوظ جھلیوں پر جکڑے ہوئے خلیوں کو کافی غذائی اجزاء اور سیرم فراہم کرنے اور لومینل شیئر تناؤ پیدا کرنے کے لیے، ہم عام طور پر ایک چپ پر گٹ میں دوہری بہاؤ لگاتے ہیں۔ ہائبرڈ چپس۔ پھر، مائیکرو چینل کے ذریعے غیر محفوظ ٹرانس ویل انسرٹ کے بیسولیٹرل سائیڈ کے نیچے میڈیم لگایا گیا۔
مائیکرو انجنیئرڈ 3D اپکلا پرتوں کی مورفولوجیکل خصوصیات کا تجزیہ مختلف امیجنگ طریقوں کو لاگو کرکے کیا جاسکتا ہے، بشمول فیز کنٹراسٹ مائیکروسکوپی، ڈیفرینشل انٹرفینس کنٹراسٹ (DIC) مائیکروسکوپی، SEM، یا امیونو فلوروسینس کنفوکل مائیکروسکوپی (اعداد و شمار 3 اور 4)۔ فیز کسی بھی وقت ڈی آئی سی کلچر کی شکل کو مانیٹر کرنے کے لیے آسانی سے کر سکتے ہیں۔ اور 3D اپکلا تہوں کا پھیلاؤ۔ PDMS اور پالئیےسٹر فلموں کی نظری شفافیت کی وجہ سے، گٹ آن اے چپ اور ہائبرڈ چپ پلیٹ فارم دونوں سیٹو امیجنگ میں ڈیوائس کے سیکشننگ یا جدا کرنے کی ضرورت کے بغیر حقیقی وقت فراہم کر سکتے ہیں۔ عام طور پر 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) کے ساتھ طے کیا جاتا ہے، اس کے بعد Triton X-100 اور 2% (wt/vol) ) بووائن سیرم البومین (BSA) ترتیب میں ہوتا ہے۔ سیل کی قسم پر منحصر ہے، مختلف فکسیٹیو، پرمیابیلائزرز، اور بلاک کرنے والے ایجنٹوں کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ چپ پر سیٹو میں متحرک خلیات کو نمایاں کریں، اس کے بعد ثانوی اینٹی باڈیز کے ساتھ کاؤنٹر اسٹین ڈائی کے ساتھ نیوکلئس (مثال کے طور پر، 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole، DAPI) یا F-actin (مثال کے طور پر فلوروسینٹ لیبل لگا ہوا phalloidin) کا پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ (تصویر 1، "سیل کی تفریق" اور "گٹ فزیالوجی")، مائکروبیل خلیوں کی بے ترتیب نوآبادیات (تصویر 1، "میزبان مائکروب کو کلچر")، مدافعتی خلیوں کی بھرتی (تصویر 1، 'ڈیزیز ماڈلنگ') یا 3D epigalf کی شکل اور phigalf.3. 4b،c) جب اوپری پرت کو نچلی مائیکرو چینل پرت سے الگ کرنے کے لیے چپ پر گٹ کو تبدیل کرتے ہوئے، جیسا کہ ریف میں بیان کیا گیا ہے۔ جیسا کہ تصویر 2 میں دکھایا گیا ہے، 3D اپیتھیلیل مورفولوجی کے ساتھ ساتھ اپیکل برش بارڈر پر موجود مائکروویلی کو SEM کے ذریعے تصور کیا جا سکتا ہے (تصویر 3b کے ذریعے ظاہر کیے جانے والے مختلف نشانات کو ظاہر کیا جا سکتا ہے)۔ مقداری PCR5 یا سنگل سیل RNA کی ترتیب۔ اس صورت میں، گٹ چپس یا ہائبرڈ چپس میں اگنے والے اپکلا خلیوں کی 3D تہوں کو ٹرپسنائزیشن کے ذریعے کاٹا جاتا ہے اور پھر سالماتی یا جینیاتی تجزیہ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
a، ایک ہائبرڈ چپ میں آنتوں کے مورفوجینیسیس کی شمولیت کے لیے ورک فلو۔ اس پروٹوکول میں Caco-2 اور آنتوں کے آرگنائڈز کا استعمال ایک ہائبرڈ چپ پلیٹ فارم میں 3D مورفوجینیسیس کو ظاہر کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ منقطع اپیتھیلیل سیلز تیار شدہ ٹرانس ویل میں سیڈ کیے گئے تھے۔ (سیڈڈ) اور ٹرانس ویل انسرٹس میں پالئیےسٹر جھلیوں سے منسلک، تمام خلیات کو جامد حالات (TW کلچر) کے تحت کلچر کیا گیا تھا۔ 7 دن کے بعد، ایک واحد ٹرانس ویل انسرٹ جس میں اپیتھیلیل سیلز کے 2D monolayer پر مشتمل تھا، کو ایک ہائبرڈ چپ میں ضم کر دیا گیا تاکہ بیسولیٹرل فلو متعارف کرایا جا سکے (بہاؤ، بی ایل ڈی) کی ایک تہہ، جس نے ایک تہہ کی سطح کو بڑھایا۔ (morphogenesis) فیز کنٹراسٹ مائیکرو گراف ہر تجرباتی مرحلے یا ٹائم پوائنٹ پر نارمل ڈونر (C103 لائن) چڑھتے ہوئے بڑی آنت سے اخذ کردہ انسانی اعضاء کے اپکلا خلیات کی مورفولوجیکل خصوصیات کو ظاہر کرتے ہیں۔ اوپری تہوں میں اسکیمیٹکس ہر قدم کے لیے تجرباتی ترتیب کو واضح کرتے ہیں۔ مختلف Z پوزیشنوں پر لیے گئے اوپر سے نیچے کنفوکل مائیکروسکوپی کے نظارے والے اپکلا خلیات (اوپری، درمیانی اور نچلی؛ دائیں اسکیمیٹک اور متعلقہ ڈاٹڈ لائنیں دیکھیں)۔ نے واضح مورفولوجیکل خصوصیات دکھائیں۔ ایف ایکٹین (سیان)، نیوکلئس (گرے) سی، آرگنائیڈ سے ماخوذ اپیتھیلیل سیلز کے فلوروسینس کنفوکل مائیکرو گرافس (3D اینگلڈ ویو) جامد ٹرانس ویل میں کلچرڈ (TW؛ سفید ڈیشڈ باکس کے اندر اندر) بمقابلہ ہائبرڈ کمپیوسر 3D (3D اینگلڈ ویو)۔ مورفولوجی، بالترتیب۔ 2D عمودی کراس کٹ ویوز کا ایک جوڑا (اوپر دائیں کونے میں نصب؛ "XZ") 2D اور 3D خصوصیات بھی دکھاتا ہے۔ اسکیل بار، 100 µm.c حوالہ سے اجازت کے ساتھ دوبارہ پرنٹ کیا گیا۔4۔ ایلسیویئر۔
روایتی جامد کلچر کے حالات کے تحت ایک ہی خلیات (Caco-2 یا آنتوں کے آرگنائیڈ اپکلا خلیات) کو دو جہتی monolayers میں کلچر کرکے کنٹرول تیار کیے جاسکتے ہیں۔ خاص طور پر، غذائی اجزاء کی کمی مائکرو چینلز کی محدود حجم کی گنجائش کی وجہ سے ہوسکتی ہے (یعنی ~4 µL)۔ بیسولیٹرل فلو کے اطلاق سے پہلے اور بعد میں مورفولوجی کا بھی موازنہ کیا جا سکتا ہے۔
نرم لتھوگرافی کا عمل صاف کمرے میں انجام دیا جانا چاہیے۔ چپ (اوپری اور نچلی تہوں اور جھلیوں) اور ہائبرڈ چپس پر ہر ایک پرت کے لیے، الگ الگ سلیکون ویفرز پر مختلف فوٹو ماسک استعمال کیے گئے اور گھڑے گئے کیونکہ مائیکرو چینلز کی اونچائیاں مختلف تھیں۔ بالترتیب 200 µm۔ ہائبرڈ چپ کی چینل ہدف کی اونچائی 200 µm ہے۔
ایسٹون والی ڈش میں 3 انچ کا سلکان ویفر رکھیں۔ پلیٹ کو 30 سیکنڈ کے لیے ہلکے سے گھمائیں، پھر ویفر کو ہوا میں خشک کریں۔ IPA والی پلیٹ میں ویفر کو منتقل کریں، پھر پلیٹ کو 30 سیکنڈ تک صاف کرنے کے لیے گھمائیں۔
ایک پیرانہ محلول (ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ اور مرتکز سلفیورک ایسڈ کا مرکب، 1:3 (جلد/ والیوم)) اختیاری طور پر سلکان ویفر کی سطح سے نامیاتی باقیات کو زیادہ سے زیادہ ہٹانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
پیرانہ محلول انتہائی سنکنرن ہے اور گرمی پیدا کرتا ہے۔ اضافی حفاظتی احتیاطیں ضروری ہیں۔ فضلے کو ٹھکانے لگانے کے لیے، محلول کو ٹھنڈا ہونے دیں اور صاف، خشک کچرے کے کنٹینر میں منتقل کریں۔ ثانوی کنٹینرز کا استعمال کریں اور فضلے کے کنٹینرز کو مناسب طریقے سے لیبل کریں۔ مزید تفصیلی طریقہ کار کے لیے براہ کرم سہولت کی حفاظتی ہدایات پر عمل کریں۔
ویفرز کو 10 منٹ کے لیے 200 ° C کی گرم پلیٹ میں رکھ کر پانی کی کمی کریں۔ پانی کی کمی کے بعد، ویفر کو ٹھنڈا ہونے کے لیے پانچ بار ہوا میں ہلایا گیا۔
صاف کیے گئے سلیکون ویفر کے بیچ میں ~10 گرام فوٹو ریزسٹ SU-8 2100 ڈالیں۔ فوٹو ریزسٹ کو ویفر پر یکساں طور پر پھیلانے کے لیے چمٹی کا استعمال کریں۔ کبھی کبھار ویفر کو 65 ° C گرم پلیٹ پر رکھیں تاکہ فوٹو ریزسٹ کو کم چپچپا اور پھیلانا آسان ہو۔
SU-8 کو سپن کوٹنگ چلا کر ویفر پر یکساں طور پر تقسیم کیا گیا۔ 5-10 s کے لیے SU-8 کی آنے والی گردش کا پروگرام کریں تاکہ 100 rpm/s کی سرعت سے 500 rpm پر پھیل سکے۔ (چپ پر گٹ کی اوپری تہہ کے لیے 500 µm اونچائی بنانا؛ ذیل میں "اہم مراحل" دیکھیں) 1,200 rpm پر 300 rpm/s 30 سیکنڈ کے ایکسلریشن پر سیٹ کریں۔
سلکان ویفر پر SU-8 پیٹرن کی ہدف کی موٹائی کے مطابق مرکزی اسپن کی رفتار کو ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔
چپ پر گٹ کی اوپری پرت کے لیے 500 µm اونچائی کے SU-8 پیٹرن بنانے کے لیے، اس باکس کے اسپن کوٹنگ اور نرم بیک اسٹیپس (مرحلہ 7 اور 8) کو ترتیب وار دہرایا گیا (مرحلہ 9 دیکھیں) تاکہ 250 µm A کی دو پرتیں تیار کی جا سکیں، جس میں SU-8 کی موٹی پرت جوڑ سکتی ہے اس باکس میں سے 12، 500 µm اونچی پرت بناتی ہے۔
SU-8 کوٹڈ ویفرز کو 5 منٹ کے لیے 65 ° C پر احتیاط سے گرم پلیٹ پر رکھ کر نرم طریقے سے بیک کریں، پھر سیٹنگ کو 95 ° C پر تبدیل کریں اور اضافی 40 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔
اوپری مائیکرو چینل میں SU-8 پیٹرن کی 500 μm اونچائی حاصل کرنے کے لیے، دو 250 μm موٹی SU-8 پرتیں بنانے کے لیے اقدامات 7 اور 8 کو دہرائیں۔
یووی ماسک الائنر کا استعمال کرتے ہوئے، ویفر کی نمائش کے وقت کا حساب لگانے کے لیے مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق لیمپ ٹیسٹ کریں۔
نمائش کے وقت کا تعین کرنے کے بعد، فوٹو ماسک کو UV ماسک الائنر کے ماسک ہولڈر پر رکھیں اور فوٹو ماسک کو SU-8 کوٹڈ ویفر پر رکھیں۔
فوٹو ماسک کی پرنٹ شدہ سطح کو براہ راست سلیکون ویفر کے SU-8 کوٹڈ سائیڈ پر رکھیں تاکہ UV کے پھیلاؤ کو کم سے کم کیا جاسکے۔
پہلے سے طے شدہ نمائش کے وقت کے لیے SU-8 لیپت ویفر اور فوٹو ماسک کو عمودی طور پر 260 mJ/cm2 UV لائٹ پر ظاہر کریں (اس باکس کا مرحلہ 10 دیکھیں)۔
UV کی نمائش کے بعد، SU-8 کوٹڈ سلکان ویفرز کو 65°C پر 5 منٹ اور 95°C پر 15 منٹ کے لیے ہر ہاٹ پلیٹ پر 200 μm کی اونچائی کے ساتھ پیٹرن بنانے کے لیے بیک کیا گیا تھا۔ بیک بیک کے بعد کا وقت 95 °C سے 30 منٹ تک بڑھائیں
ڈویلپر کو شیشے کی ڈش میں ڈالا جاتا ہے، اور بیکڈ ویفر کو ڈش میں رکھا جاتا ہے۔ SU-8 ڈویلپر کا حجم شیشے کی پلیٹ کے سائز کے لحاظ سے مختلف ہو سکتا ہے۔ اس بات کو یقینی بنائیں کہ کافی SU-8 ڈویلپر استعمال کریں تاکہ غیر ظاہر شدہ SU-8 کو مکمل طور پر ہٹایا جا سکے۔ مثال کے طور پر، جب 150 ملی میٹر قطر کی گلاس کی ڈش کا استعمال کرتے ہوئے، SU-8 کی گنجائش کے ساتھ SU-8 کا استعمال کریں۔ ڈویلپر۔ کبھی کبھار ہلکی گردش کے ساتھ 25 منٹ کے لیے مولڈ کو تیار کریں۔
تیار شدہ مولڈ کو ~ 10 ملی لیٹر تازہ ڈویلپر کے ساتھ کللا کریں جس کے بعد آئی پی اے کو پائپیٹ کا استعمال کرتے ہوئے محلول کا چھڑکاؤ کریں۔
ویفر کو پلازما کلینر میں رکھیں اور 1.5 منٹ کے لیے آکسیجن پلازما (ماحول کی گیس، ہدف کا دباؤ 1 × 10−5 Torr، پاور 125 W) کے سامنے رکھیں۔
ویفر کو ویکیوم ڈیسیکیٹر میں رکھیں جس کے اندر شیشے کی سلائیڈ ہو۔ ویفرز اور سلائیڈز کو ساتھ ساتھ رکھا جا سکتا ہے۔ اگر ویکیوم ڈیسیکیٹر کو پلیٹ کے ذریعے کئی تہوں میں تقسیم کیا گیا ہے تو سلائیڈوں کو نچلے چیمبر میں اور ویفرز کو اوپری چیمبر میں رکھیں۔ شیشے کی سلائیڈ پر 2H-perfluorooctyl) سائلین محلول اور سائلینائزیشن کے لیے ویکیوم لگائیں۔
منجمد Caco-2 خلیوں کی ایک شیشی کو 37°C کے پانی کے غسل میں پگھلا دیں، پھر پگھلے ہوئے خلیوں کو T75 فلاسک میں منتقل کریں جس میں 37°C پہلے سے تیار شدہ Caco-2 میڈیم کے 15 ملی لیٹر پر مشتمل ہو۔
Caco-2 سیلز کو ~90% سنگم پر منتقل کرنے کے لیے، پہلے گرم Caco-2 میڈیم، PBS، اور 0.25% trypsin/1 mM EDTA 37°C پانی کے غسل میں ڈالیں۔
ویکیوم اسپائریشن کے ذریعے میڈیم کو ایسپریٹ کریں۔ خلیات کو 5 ملی لیٹر گرم پی بی ایس سے دو بار دھوئیں اور ویکیوم اسپائریشن کو دہرائیں اور تازہ پی بی ایس شامل کریں۔