Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript.
Morfogenese i menneskelig tarm etablerer krypt-villus-trekk ved 3D-epitelmikroarkitektur og romlig organisering. Denne unike strukturen er nødvendig for å opprettholde tarmhomeostase ved å beskytte stamcelle-nisjen i basalkrypten mot eksogene mikrobielle antigener og deres metabolitter. I tillegg presenterer tarmtotter og sekreterende slim funksjonelt differensierte epitelceller med en beskyttende barriere på tarmslimhinneoverflaten. Derfor er det avgjørende å gjenskape 3D-epitelstrukturer for konstruksjonen av in vitro-tarmmodeller. Spesielt kan den organiske mimetiske tarm-på-en-brikke indusere spontan 3D-morfogenese av tarmepitelet med forbedrede fysiologiske funksjoner og biomekanikk. Her tilbyr vi en reproduserbar protokoll for robust å indusere tarmmorfogenese i tarmen på en mikrofluidisk chip så vel som i en Transwell-innebygd hybridchip. Vi beskriver detaljerte metoder for enhetsfabrikasjon, dyrking av Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller i konvensjonelle omgivelser så vel som på en mikrofluidisk plattform, induksjon av 3D-morfogenese og karakterisering. av etablerte 3D-epitelceller ved bruk av flere avbildningsmodaliteter. Denne protokollen oppnår regenerering av funksjonell tarmmikroarkitektur ved å kontrollere basolateral væskestrøm i 5 dager. Vår in vitro-morfogenesemetode benytter fysiologisk relevant skjærspenning og mekanisk bevegelse og krever ikke kompleks celleteknikk eller manipulasjon, noe som kan overgå andre eksisterende teknikker. Vi ser for oss at vår foreslåtte protokoll kan ha brede implikasjoner for det biomedisinske forskningsmiljøet, og gi en metode for å regenerere 3D-tarmepitelag in vitro for biomedisinske, kliniske og farmasøytiske anvendelser.
Eksperimenter viser at intestinale epiteliale Caco-2-celler dyrket i gut-on-a-chip1,2,3,4,5 eller dobbeltlags mikrofluidiske enheter6,7 kan gjennomgå spontan 3D-morfogenese in vitro uten en klar forståelse av den underliggende mekanismen. I vår nylige studie fant vi at fjerning av basolateralt utskilte morfogenantagonister fra kulturenheter er nødvendig og tilstrekkelig for å indusere 3D epitelial morfogenese in vitro, noe som har blitt demonstrert av Caco-2 og pasientavledede intestinale organoider. Epitelceller ble validert. I denne studien fokuserte vi spesifikt på celleproduksjon og konsentrasjonsfordeling av en potent Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), i tarm-på-en-brikke og modifiserte mikrofluidiske enheter som inneholder Transwell-innsatser, kalt "Hybrid Chip". Vi demonstrerer at tilsetning av eksogene Wnt-antagonister (som DKK-1, Wnt-repressor 1, sekretert frizzled-related protein 1 eller Soggy-1) til tarmen på brikken hemmer morfogenese eller forstyrrer det forhåndsstrukturerte 3D-epitellaget, noe som tyder på at antagonistisk stress under dyrking er ansvarlig for intestinal morfogenese in vitro. Derfor er en praktisk tilnærming for å oppnå robust morfogenese ved epitelgrensesnittet å fjerne eller minimalt opprettholde nivåene av Wnt-antagonister i det basolaterale rommet ved aktiv spyling (f.eks. i tarm-på-en-brikke- eller hybrid-på-en-brikke-plattformer) eller diffusjon. Basolaterale medier (f.eks. fra Transwell-innsatser inn i store basolaterale reservoarer i brønner).
I denne protokollen gir vi en detaljert metode for å fremstille tarm-på-en-brikke-mikroenheter og Transwell-innsettbare hybridbrikker (trinn 1-5) for å dyrke tarmepitelceller på polydimetylsiloksan (PDMS)-baserte porøse membraner (trinn 6A, 7A, 8, 9) eller polyestermembraner av Transwell-innsatser (trinn 6B, 7B, 8, 9) og indusere 3D-morfogenese in vitro (trinn 10). Vi identifiserte også cellulære og molekylære trekk som indikerer vevsspesifikk histogenese og avstamningsavhengig celledifferensiering ved å bruke flere avbildningsmodaliteter (trinn 11-24). Vi induserer morfogenese ved bruk av humane tarmepitelceller, som Caco-2 eller tarmorganoider, i to kulturformater med tekniske detaljer, inkludert overflatemodifisering av porøse membraner, opprettelse av 2D-monolager og intestinal biokjemisk og reproduksjon av det biomekaniske mikromiljøet in vitro. For å indusere 3D-morfogenese fra 2D-epitelmonolager fjernet vi morfogen. antagonister i begge dyrkede former ved å strømme mediet inn i det basolaterale kammeret i kulturen. Til slutt gir vi en representasjon av nytten av et regenererbart 3D-epitellag som kan brukes til å modellere morfogenavhengig epitelvekst, longitudinelle verts-mikrobiom-kokulturer, patogeninfeksjon, inflammatorisk skade, epitelbarriere-dysfunksjon og probiotikabaserte terapier Eksempel.påvirkninger.
Protokollen vår kan være nyttig for et bredt spekter av forskere innen grunnleggende (f.eks. tarmslimhinnebiologi, stamcellebiologi og utviklingsbiologi) og anvendt forskning (f.eks. preklinisk legemiddeltesting, sykdomsmodellering, vevsteknikk og gastroenterologi) bred innvirkning. På grunn av reproduserbarheten og robustheten til protokollen vår for å indusere 3D-morfogenese av tarmepitelet in vitro, ser vi for oss at den tekniske strategien vår kan formidles til publikum som studerer dynamikken i cellesignalering under tarmutvikling, regenerering eller homeostase. I tillegg er protokollen vår nyttig for å avhøre infeksjon under ulike smittestoffer som Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 eller Vibrio cholerae. Målgrupper for sykdomspatologi og patogenese er også nyttige. Bruk av et innebygd tarmmikrofysiologisystem kan tillate longitudinell samkultur 10 og påfølgende vurdering av vertsforsvar, immunresponser og patogenrelatert skadereparasjon i mage-tarmkanalen (GI) 11. Andre mage-tarmlidelser assosiert med lekk tarmsyndrom, cøliaki, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, pouchitt eller irritabel tarmsyndrom kan simuleres når 3D-tarmepitelag fremstilles ved hjelp av pasientens 3D-tarmepitelag. Disse sykdommene inkluderer villusatrofi, kryptforkorting, slimhinneskade eller svekket epitelbarriere. Biopsi eller stamcelleavledede tarmorganoider 12,13. For å bedre modellere den høyere kompleksiteten i sykdomsmiljøet, kan leserne vurdere å legge til sykdomsrelevante celletyper, for eksempel pasientens perifere blodmononukleære celler (PBMC), til modeller som inneholder 3D-tarmvillus-kryptmikroarkitekturer. vevsspesifikke immunceller, 5.
Siden 3D epitelmikrostruktur kan fikseres og visualiseres uten seksjoneringsprosessen, kan seere som arbeider med romlig transkriptomikk og høyoppløselig eller superoppløsningsavbildning være interessert i vår kartlegging av den spatiotemporale dynamikken til gener og proteiner i epitelnisjer. Interessert i teknologi. Respons på mikrobielle eller immune stimuli. Videre kan longitudinell vertsmikrobiom-krysstale 10, 14 som koordinerer tarmhomeostase etableres i det 3D tarmslimhinnelaget ved å samdyrke ulike mikrobielle arter, mikrobielle samfunn eller fekal mikrobiota, spesielt i gut-on-a-chip. i plattformen. Denne tilnærmingen er spesielt attraktiv for publikum som studerer mukosal immunologi, gastroenterologi, humant mikrobiom, kulturomikk og klinisk mikrobiologi som ønsker å dyrke tidligere udyrket tarmmikrobiota i laboratoriet. Hvis vår in vitro-morfogeneseprotokoll kan tilpasses skalerbare kulturformater, for eksempel flerbrønnsinnsatser i 24-, 96- eller 384-brønnsplater som kontinuerlig etterfyller basolaterale rom, kan protokollen også formidles til de som utvikler farmasøytiske, biomedisinske eller høykapasitets screening- eller valideringsplattformer for næringsmiddelindustrien. Som et bevis på prinsippet demonstrerte vi nylig muligheten for et multipleks høykapasitets morfogenesesystem som kan skaleres til et 24-brønns plateformat. I tillegg har flere organ-på-en-brikke-produkter blitt kommersialisert16,17,18. Derfor kan valideringen av vår in vitro-morfogenesemetode akselereres og potensielt tas i bruk av mange forskningslaboratorier, industri eller myndigheter og reguleringsorganer for å forstå cellulær omprogrammering av in vitro-tarmmorfogenese på transkriptomisk nivå for å teste legemidler eller bioterapeutika. Absorpsjonen og Transport av legemiddelkandidater ble vurdert ved hjelp av 3D-tarmsurrogater eller ved bruk av tilpassede eller kommersielle organ-på-en-brikke-modeller for å vurdere reproduserbarheten av tarmmorfogeneseprosessen.
Et begrenset antall menneskerelevante eksperimentelle modeller har blitt brukt til å studere tarmepitelmorfogenese, hovedsakelig på grunn av mangelen på implementerbare protokoller for å indusere 3D-morfogenese in vitro. Faktisk er mye av dagens kunnskap om tarmmorfogenese basert på dyrestudier (f.eks. sebrafisk20, mus21 eller kyllinger22). Imidlertid er de arbeids- og kostnadskrevende, kan være etisk tvilsomme, og viktigst av alt, bestemmer ikke nøyaktig menneskelige utviklingsprosesser. Disse modellene er også svært begrenset i sin evne til å testes på en flerveis skalerbar måte. Derfor overgår vår protokoll for regenerering av 3D-vevsstrukturer in vitro in vivo dyremodeller så vel som andre tradisjonelle statiske 2D-cellekulturmodeller. Som tidligere beskrevet, tillot bruk av 3D-epitelstrukturer oss å undersøke den romlige lokaliseringen av differensierte celler i krypt-villus-aksen som respons på ulike slimhinne- eller immunstimuli. 3D-epitellag kan gi et rom for å studere hvordan mikrobielle celler konkurrerer om å danne romlige nisjer og økologisk evolusjon som respons på vertsfaktorer (f.eks. indre versus ytre slimlag, utskillelse av IgA og antimikrobielle peptider). Videre kan 3D-epitelmorfologi gi oss muligheten til å forstå hvordan tarmmikrobiotaen strukturerer sine samfunn og synergistisk produserer mikrobielle metabolitter (f.eks. kortkjedede fettsyrer) som former cellulær organisering og stamcelle-nisjer i basalkryptene. Disse egenskapene kan bare demonstreres når 3D-epitellag etableres in vitro.
I tillegg til vår metode for å lage 3D-intestinale epitelstrukturer, finnes det flere in vitro-metoder. Intestinal organoidkultur er en toppmoderne vevsteknikk basert på dyrking av intestinale stamceller under spesifikke morfogenforhold23,24,25. Bruken av 3D-organoidmodeller for transportanalyse eller verts-mikrobiom-kokulturer er imidlertid ofte utfordrende fordi tarmlumen er innelukket i organoidet, og derfor er introduksjonen av luminale komponenter som mikrobielle celler eller eksogene antigener begrenset. Tilgang til organoidlumen kan forbedres ved hjelp av en mikroinjektor,26,27, men denne metoden er invasiv og arbeidskrevende og krever spesialisert kunnskap for å utføres. Videre gjenspeiler tradisjonelle organoidkulturer som opprettholdes i hydrogel-stillas under statiske forhold nøyaktig aktiv in vivo-biomekanikk.
Andre tilnærminger som brukes av flere forskningsgrupper, bruker forhåndsstrukturerte 3D-hydrogelstillas for å etterligne tarmens epitelstruktur ved å dyrke isolerte humane tarmceller på geloverflaten. Lag hydrogelstillas ved hjelp av 3D-printede, mikrofreste eller litografisk fremstilte former. Denne metoden viser det selvorganiserte arrangementet av isolerte epitelceller in vitro med fysiologisk relevante morfogengradienter, og etablerer en epitelstruktur med høyt aspektforhold og stroma-epitelial krysstale ved å inkludere stromale celler i stillaset. Imidlertid kan naturen til forhåndsstrukturerte stillaser forhindre visning av selve den spontane morfogenetiske prosessen. Disse modellene gir heller ikke dynamisk luminal eller interstitiell strømning, og mangler væskeskjærspenningen som tarmceller trenger for å gjennomgå morfogenese og oppnå fysiologisk funksjon. En annen nylig studie brukte hydrogelstillas i en mikrofluidisk plattform og mønstrede tarmepitelstrukturer ved hjelp av laseretsingsteknikker. Musetarmorganoider følger etsede mønstre for å danne tarmrørstrukturer, og intraluminal væskestrømning kan rekapituleres ved hjelp av en mikrofluidikkmodul. Denne modellen viser imidlertid verken spontane morfogenetiske prosesser eller inkluderer mekanobiologiske bevegelser i tarmen. 3D-printingsteknikker fra samme gruppe var i stand til å lage miniatyr-tarmrør med spontane morfogenetiske prosesser. Til tross for den komplekse fabrikasjonen av forskjellige tarmsegmenter i røret, mangler denne modellen også luminal væskestrøm og mekanisk deformasjon. I tillegg kan modellens operabilitet være begrenset, spesielt etter at bioprintingsprosessen er fullført, noe som forstyrrer eksperimentelle forhold eller celle-til-celle-interaksjoner. I stedet gir vår foreslåtte protokoll spontan tarmmorfogenese, fysiologisk relevant skjærspenning, biomekanikk som etterligner tarmmotilitet, tilgjengelighet av uavhengige apikale og basolaterale rom, og gjenskaping av komplekse biologiske mikromiljøer med modularitet. Derfor kan vår in vitro 3D-morfogeneseprotokoll gi en komplementær tilnærming for å overvinne utfordringene med eksisterende metoder.
Protokollen vår er fullstendig fokusert på 3D epitelial morfogenese, med kun epitelceller i kultur og ingen andre typer omkringliggende celler som mesenkymale celler, endotelceller og immunceller. Som tidligere beskrevet, er kjernen i protokollen vår induksjon av epitelial morfogenese ved å fjerne morfogenhemmere som skilles ut på den basolaterale siden av det introduserte mediet. Selv om den robuste modulariteten til vår tarm-på-en-brikke og hybrid-på-en-brikke lar oss gjenskape det bølgende 3D epitellaget, gjenstår ytterligere biologiske kompleksiteter som epitel-mesenkymale interaksjoner33,34, ekstracellulær matriks (ECM)-avsetning35 og, i vår modell, krypt-villus-funksjoner som formidler stamcelle-nisjer i basale krypter å bli vurdert videre. Stromale celler (f.eks. fibroblaster) i mesenkymet spiller en nøkkelrolle i produksjonen av ECM-proteiner og regulering av intestinal morfogenese in vivo35,37,38. Tilsetning av mesenkymale celler Til vår modell forbedret den morfogenetiske prosessen og effektiviteten av cellefesting. Endotellaget (dvs. kapillærer eller lymfekar) spiller en viktig rolle i reguleringen av molekylær transport39 og rekruttering av immunceller40 i tarmmikromiljøet. Videre er vaskulaturkomponenter som kan kobles mellom vevsmodeller en forutsetning når vevsmodeller utformes for å demonstrere interaksjoner mellom flere organer. Derfor kan det være nødvendig å inkludere endotelceller for å modellere mer nøyaktige fysiologiske trekk med oppløsning på organnivå. Pasientavledede immunceller er også essensielle for å vise medfødte immunresponser, antigenpresentasjon, medfødt adaptiv immunoverhøring og vevsspesifikk immunitet i sammenheng med å etterligne tarmsykdom.
Bruken av hybridbrikker er enklere enn tarm-på-en-brikke fordi enhetens oppsett er enklere, og bruken av Transwell-innsatser muliggjør skalerbar dyrking av tarmepitelet. Kommersielt tilgjengelige Transwell-innsatser med polyestermembraner er imidlertid ikke elastiske og kan ikke simulere peristaltiske bevegelser. Videre forble det apikale rommet til Transwell-innsatsen plassert i hybridbrikken stasjonært uten skjærspenning på den apikale siden. Det er tydelig at de statiske egenskapene i det apikale rommet sjelden muliggjør langvarig bakteriell samkultur i hybridbrikker. Selv om vi robust kan indusere 3D-morfogenese i Transwell-innsatser når vi bruker hybridbrikker, kan mangelen på fysiologisk relevant biomekanikk og apikal væskestrøm begrense muligheten for hybridbrikkeplattformer for potensielle bruksområder.
Fullskala rekonstruksjoner av den menneskelige krypt-villus-aksen i tarm-på-en-brikke og hybrid-på-en-brikke-kulturer er ikke fullt ut etablert. Siden morfogenese starter fra et epitelmonolag, gir ikke 3D-mikroarkitekturer nødvendigvis morfologisk likhet med krypter in vivo. Selv om vi karakteriserte den prolifererende cellepopulasjonen nær det basale kryptdomenet i det mikrokonstruerte 3D-epitelet, var krypt- og villusregionene ikke tydelig avgrenset. Selv om høyere øvre kanaler på brikken fører til økt høyde på det mikrokonstruerte epitelet, er den maksimale høyden fortsatt begrenset til ~300–400 µm. Den faktiske dybden av menneskelige tarmkrypter i tynntarmen og tykktarmen er henholdsvis ~135 µm og ~400 µm, og høyden på tynntarmvilliene er ~600 µm41.
Fra et avbildningssynspunkt kan in situ superoppløsningsavbildning av 3D-mikroarkitekturer være begrenset til tarmen på en brikke, siden den nødvendige arbeidsavstanden fra objektivlinsen til epitellaget er i størrelsesorden noen få millimeter. For å overvinne dette problemet kan det være nødvendig med et fjerntliggende objektiv. Videre er det utfordrende å lage tynne snitt for avbildning av prøvepreparering på grunn av den høye elastisiteten til PDMS. Videre, siden lag-for-lag-mikrofabrikasjon av tarmen på en brikke innebærer permanent adhesjon mellom hvert lag, er det ekstremt utfordrende å åpne eller fjerne det øvre laget for å undersøke overflatestrukturen til epitellaget. For eksempel ved å bruke et skanningselektronmikroskop (SEM).
Hydrofobisiteten til PDMS har vært en begrensende faktor i mikrofluidikkbaserte studier som omhandler hydrofobe små molekyler, siden PDMS kan adsorbere slike hydrofobe molekyler uspesifikt. Alternativer til PDMS kan vurderes med andre polymere materialer. Alternativt kan overflatemodifisering av PDMS (f.eks. belegg med lipofile materialer 42 eller poly(etylenglykol) 43) vurderes for å minimere adsorpsjon av hydrofobe molekyler.
Til slutt har metoden vår ikke blitt godt karakterisert når det gjelder å tilby en høykapasitetsscreening eller en brukervennlig eksperimentell plattform som passer alle. Den nåværende protokollen krever en sprøytepumpe per mikroenhet, noe som tar opp plass i en CO2-inkubator og forhindrer storskalaeksperimenter. Denne begrensningen kan forbedres betydelig ved skalerbarheten til innovative kulturformater (f.eks. porøse innlegg med 24 brønner, 96 brønner eller 384 brønner som tillater kontinuerlig påfylling og fjerning av basolaterale medier).
For å indusere 3D-morfogenese av humant tarmepitel in vitro, brukte vi en mikrofluidisk chip-tarmenhet som inneholdt to parallelle mikrokanaler og en elastisk porøs membran imellom for å lage et lumen-kapillærgrensesnitt. Vi demonstrerer også bruken av en enkeltkanals mikrofluidisk enhet (en hybridbrikke) som gir kontinuerlig basolateral strømning under polariserte epitellag dyrket på Transwell-innsatser. I begge plattformene kan morfogenese av forskjellige humane tarmepitelceller demonstreres ved å bruke retningsbestemt manipulering av strømning for å fjerne morfogenantagonister fra det basolaterale rommet. Hele den eksperimentelle prosedyren (figur 1) består av fem deler: (i) mikrofabrikasjon av tarmbrikken eller Transwell-innsettbar hybridbrikke (trinn 1-5; boks 1), (ii) fremstilling av tarmepitelceller (Caco-2-celler) eller humane tarmorganoider; boks 2–5), (iii) kultur av tarmepitelceller på tarmbrikker eller hybridbrikker (trinn 6–9), (iv) induksjon av 3D-morfogenese in vitro (trinn 10) og (v)) for å karakterisere den 3D-epiteliale mikrostrukturen (trinn 11–24). Til slutt ble en passende kontrollgruppe (diskutert nærmere nedenfor) utformet for å validere effektiviteten av in vitro-morfogenese ved å sammenligne epitelmorfogenese med romlige, tidsmessige, betingede eller prosedyremessige kontroller.
Vi brukte to forskjellige kulturplattformer: tarm-på-en-brikke med rette kanaler eller ikke-lineære, konvoluterte kanaler, eller hybridbrikker som inneholder Transwell (TW)-innsatser i en mikrofluidisk enhet, fremstilt som beskrevet i boks 1, og trinn 1-5. «Enhetsfabrikasjon» viser hovedtrinnene i å lage en enkeltbrikke eller en hybridbrikke. «Dyrking av humane tarmepitelceller» forklarer cellekilden (Caco-2 eller humane tarmorganoider) og dyrkningsprosedyren som brukes i denne protokollen. «In vitro-morfogenese» viser de overordnede trinnene der Caco-2 eller organoid-avledede epitelceller dyrkes på en tarmbrikke eller på Transwell-innsatser i en hybridbrikke, etterfulgt av induksjon av 3D-morfogenese og dannelse av en karakterisert epitelstruktur. Programtrinnnummeret eller boksnummeret vises under hver pil. Applikasjonen gir eksempler på hvordan etablerte tarmepitellag kan brukes, for eksempel i celledifferensieringskarakterisering, tarmfysiologiske studier, etablering av vertsmikrobiomøkosystemer og sykdomsmodellering. Immunofluorescens Bilder i «Celledifferensiering» som viser kjerner, F-aktin og MUC2 uttrykt i 3D Caco-2-epitellaget generert på tarmbrikken. MUC2-signalering er tilstede i slimhinneceller og slim som skilles ut fra slimhinneoverflater. Fluorescerende bilder i Gut Physiology viser slim produsert ved farging for sialinsyre og N-acetylglukosaminrester ved bruk av fluorescerende hvetekimagglutinin. De to overlappende bildene i «Host-Microbe Co-Cultures» viser representative verts-mikrobiom-kokulturer i tarmen på en brikke. Venstre panel viser kokulturen av E. coli som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) med mikrokonstruerte 3D Caco-2-epitelceller. Høyre panel viser lokaliseringen av GFP E. coli kodyrket med 3D Caco-2-epitelceller, etterfulgt av immunfluorescensfarging med F-aktin (rød) og kjerner (blå). Sykdomsmodellering illustrerer sunn versus lekk tarm i tarmbetennelsesbrikker under fysiologisk utfordring med bakterielle antigener (f.eks. lipopolysakkarid, LPS) og immunceller (f.eks. PBMC; grønn). Caco-2-celler ble dyrket for å etablere et 3D-epitellag. Skala, 50 µm. Bilder i nederste rad: «Differensiering av celler» tilpasset med tillatelse fra referanse.2. Oxford University Press; Gjengitt med tillatelse fra Ref.5. NAS; «Vertsmikrobe-kokultur» tilpasset med tillatelse fra ref.3. NAS; «Sykdomsmodellering» tilpasset med tillatelse fra referanse.5. NAS.
Både tarm-på-brikke og hybridbrikker ble fremstilt ved hjelp av PDMS-replikaer som ble tatt ut av silisiumformer ved myk litografi1,44 og mønstret med SU-8. Utformingen av mikrokanalene i hver brikke bestemmes ved å vurdere hydrodynamikk som skjærspenning og hydrodynamisk trykk1,4,12. Den opprinnelige tarm-på-en-brikke-designen (Utvidede data fig. 1a), som besto av to sidestilte parallelle rette mikrokanaler, har utviklet seg til en kompleks tarm-på-en-brikke (Utvidede data fig. 1b) som inkluderer et par buede mikrokanaler for å indusere økt væskeoppholdstid, ikke-lineære strømningsmønstre og multiaksial deformasjon av dyrkede celler (fig. 2a–f)12. Når mer kompleks tarmbiomekanikk må gjenskapes, kan kompleks tarm-på-brikke velges. Vi har vist at den konvolverte tarmbrikken også sterkt induserer 3D-morfogenese i en lignende tidsramme med en lignende grad av epitelvekst sammenlignet med den opprinnelige Gut-Chip, uavhengig av den dyrkede celletypen. Derfor, for å indusere 3D-morfogenese, er lineære og komplekse on-chip-tarmdesign utskiftbare. PDMS-replikaer herdet på silikonformer med SU-8-mønstre ga negative egenskaper etter avforming (figur 2a). For å fremstille tarmen på en chip ble det fremstilte øvre PDMS-laget sekvensielt bundet til en porøs PDMS-film og deretter justert med det nedre PDMS-laget ved irreversibel binding ved bruk av en koronabehandler (figur 2b–f). For å fremstille hybridbrikker ble herdede PDMS-replikaer bundet til glassplater for å lage enkanals mikrofluidiske enheter som kunne romme Transwell-innsatser (figur 2h og utvidede data figur 2). Bindingsprosessen utføres ved å behandle overflatene til PDMS-replikaen og glasset med oksygenplasma eller koronabehandling. Etter sterilisering av den mikrofabrikerte enheten festet til silikonrøret, var enhetsoppsettet klart til å utføre 3D-morfogenese av tarmepitelet (figur 2g).
a, Skjematisk illustrasjon av fremstillingen av PDMS-deler fra SU-8-mønstrede silisiumformer. Den uherdede PDMS-løsningen ble helt i en silisiumform (venstre), herdet ved 60 °C (midten) og tatt ut av formen (høyre). Den utformede PDMS-en ble kuttet i biter og rengjort for videre bruk. b, Fotografi av silisiumformen som ble brukt til å fremstille det øvre PDMS-laget. c, Fotografi av silisiumformen som ble brukt til å fremstille den porøse PDMS-membranen. d, En serie fotografier av de øvre og nedre PDMS-komponentene og den monterte intestinale enheten på brikken. e, Skjematisk fremstilling av justeringen av de øvre, membran- og nedre PDMS-komponentene. Hvert lag er irreversibelt bundet ved plasma- eller koronabehandling. f, Skjematisk fremstilling av den fabrikkerte tarm-på-en-brikke-enheten med overliggende, viklede mikrokanaler og vakuumkamre. g, Oppsett av tarm-på-en-brikke for mikrofluidisk cellekultur. Den fabrikkerte tarmen på en brikke satt sammen med et silikonrør og en sprøyte ble plassert på et dekkglass. Brikkeenheten ble plassert på Lokk på en 150 mm petriskål for prosessering. Bindemiddelet brukes til å lukke silikonrøret. h, Visuelle øyeblikksbilder av hybridbrikkefabrikasjon og 3D-morfogenese ved bruk av hybridbrikker. Transwell-innsatser fremstilt uavhengig for å dyrke 2D-monolag av tarmepitelceller ble satt inn i hybridbrikken for å indusere intestinal 3D-morfogenese. Mediet perfuseres gjennom mikrokanaler under cellelaget etablert på Transwell-innsatsen. Skala, 1 cm. h Gjengitt med tillatelse fra referanse.4. Elsevier.
I denne protokollen ble Caco-2-cellelinjen og intestinale organoider brukt som epitelkilder (fig. 3a). Begge celletyper ble dyrket uavhengig (boks 2 og boks 5) og brukt til å så de ECM-belagte mikrokanalene i on-chip-tarm eller Transwell-innsatser. Når cellene er konfluente (>95 % dekning i kolber), høstes rutinemessig dyrkede Caco-2-celler (mellom passasjer 10 og 50) i T-kolber for å fremstille dissosierte cellesuspensjoner ved hjelp av trypsiniseringsvæske (boks 2). Humane intestinale organoider fra intestinale biopsier eller kirurgiske reseksjoner ble dyrket i Matrigel-stillaskupler i 24-brønnsplater for å støtte det strukturelle mikromiljøet. Medium som inneholdt essensielle morfogener (som Wnt, R-spondin og Noggin) og vekstfaktorer fremstilt som beskrevet i boks 3 ble tilsatt annenhver dag inntil organoidene vokste til ~500 µm i diameter. Fullvoksne organoider høstes og dissosieres til enkeltceller for såing på tarm eller Transwell-innsatser på en chip (boks 5). Som vi tidligere har rapportert, kan det differensieres i henhold til sykdomstype12,13 (f.eks. ulcerøs kolitt, Crohns sykdom, kolorektal kreft eller normal donor), lesjonssted (f.eks. lesjon versus ikke-lesjonert område) og gastrointestinal plassering i trakten (f.eks. tolvfingertarm, jejunum, ileum, cecum, kolon eller endetarm). Vi tilbyr en optimalisert protokoll i boks 5 for dyrking av kolonorganoider (koloider) som vanligvis krever høyere konsentrasjoner av morfogener enn tynntarmorganoider.
a, Arbeidsflyt for induksjon av tarmmorfogenese i tarmbrikken. Caco-2 humant tarmepitel og tarmorganoider brukes i denne protokollen for å demonstrere 3D-morfogenese. De isolerte epitelcellene ble sådd i den forberedte tarm-på-en-brikke-enheten (brikkepreparering). Når cellene er sådd (sådd) og festet (festet) til den porøse PDMS-membranen på dag 0 (D0), initieres apikal (AP) strømning og opprettholdes de første 2 dagene (strømning, AP, D0-D2). Basolateral (BL) strømning initieres også sammen med sykliske strekkbevegelser (strekk, strømning, AP og BL) når et komplett 2D-monolag dannes. Intestinal 3D-morfogenese skjedde spontant etter 5 dager med mikrofluidisk kultur (morfogenese, D5). Fasekontrastbilder viser representativ morfologi av Caco-2-celler ved hvert eksperimentelt trinn eller tidspunkt (stolpediagram, 100 µm). Fire skjematiske diagrammer som illustrerer de tilsvarende kaskadene av tarmmorfogenese (øverst til høyre). Den stiplede Pilene i skjemaet representerer retningen på væskestrømmen.b, SEM-bilde som viser overflatetopologien til det etablerte 3D Caco-2-epitelet (venstre). Innsettet som fremhever det forstørrede området (hvit stiplet boks) viser de regenererte mikrovilliene på 3D Caco-2-laget (høyre).c, Horisontal frontvisning av etablerte Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rød) og kontinuerlige børstekantmembraner merket F-aktin (grønn) og kjerner (blå). Immunofluorescens-konfokal visualisering av epitelceller på tarmbrikker. Piler som peker mot det midterste skjemaet indikerer plasseringen av fokusplanet for hver konfokalvisning.d, Tidsforløp for morfologiske endringer i organoider dyrket på en brikke oppnådd ved fasekontrastmikroskopi på dag 3, 7, 9, 11 og 13. Innsettet (øverst til høyre) viser den høye forstørrelsen av det medfølgende bildet.e, DIC-fotomikrografi av organoid 3D-epitel etablert i tarmen på snitt tatt på dag 7.f, Overlappende immunofluorescensbilder viser markører for stamceller (LGR5; magenta), slimceller (MUC2; grønn), F-aktin (grå) og kjerner (cyan) dyrket på tarmbrikker i henholdsvis 3 dager (venstre) og 13 dager (midten) organoider på epitellaget. Se også utvidede data figur 3, som fremhever LGR5-signalering uten MUC2-signalering. Fluorescensbilder som viser epitelmikrostrukturen (høyre) til 3D organoid epitel etablert i tarmen på en brikke ved å farge plasmamembranen med CellMask-fargestoff (høyre) på dag 13 av kulturen. Skalalinjen er 50 μm med mindre annet er angitt. b Gjengitt med tillatelse fra referanse. 2. Oxford University Press; c Tilpasset med tillatelse fra referanse. 2. Oxford University Press; e og f tilpasset med tillatelse ved referanse. 12 Under Creative Commons-lisens CC BY 4.0.
I tarmen på en brikke er det nødvendig å modifisere den hydrofobe overflaten til den porøse PDMS-membranen for vellykket ECM-belegg. I denne protokollen bruker vi to forskjellige metoder for å modifisere hydrofobisiteten til PDMS-membraner. For dyrking av Caco-2-celler var overflateaktivering ved UV/ozonbehandling alene tilstrekkelig til å redusere hydrofobisiteten til PDMS-overflaten, belegge ECM og feste Caco-2-celler til PDMS-membranen. Mikrofluidisk kultur av organoid epitel krever imidlertid kjemisk basert overflatefunksjonalisering for å oppnå effektiv avsetning av ECM-proteiner ved sekvensielt å påføre polyetylenimin (PEI) og glutaraldehyd på PDMS-mikrokanaler. Etter overflatemodifisering ble ECM-proteiner avsatt for å dekke den funksjonaliserte PDMS-overflaten og deretter introdusert i det isolerte organoidepitelet. Etter at cellene er festet, starter den mikrofluidiske cellekulturen ved å perfusere bare mediet inn i den øvre mikrokanalen til cellene danner et komplett monolag, mens den nedre mikrokanalen opprettholder statiske forhold. Denne optimaliserte metoden for overflateaktivering og ECM-belegg muliggjør feste av organoid. epitel for å indusere 3D-morfogenese på PDMS-overflaten.
Transwell-kulturer krever også ECM-belegg før cellesåing; Transwell-kulturer krever imidlertid ikke komplekse forbehandlingstrinn for å aktivere overflaten av porøse innlegg. For dyrking av Caco-2-celler på Transwell-innlegg, akselererer ECM-belegg på porøse innlegg festet av dissosierte Caco-2-celler (<1 time) og dannelse av tett forbindelsesbarriere (<1–2 dager). For å dyrke organoider på Transwell-innlegg, sås isolerte organoider på ECM-belagte innlegg, festes til membranoverflaten (<3 timer) og opprettholdes til organoidene danner et komplett monolag med barriereintegritet. Transwell-kulturer utføres i 24-brønnsplater uten bruk av hybridbrikker.
In vitro 3D-morfogenese kan initieres ved å påføre væskestrøm til den basolaterale delen av et etablert epitellag. I tarmen på en brikke begynte epitelmorfogenesen da mediet ble perfusert inn i de øvre og nedre mikrokanalene (fig. 3a). Som tidligere beskrevet er det kritisk å introdusere væskestrøm i det nedre (basolaterale) rommet for kontinuerlig fjerning av retningsbestemte utskilte morfogenhemmere. For å gi tilstrekkelig næringsstoffer og serum til celler bundet på porøse membraner og generere luminal skjærspenning, anvender vi vanligvis dobbel strømning i tarmen på en brikke. I hybridbrikker ble Transwell-innsatser som inneholder epitelmonolager satt inn i hybridbrikkene. Deretter ble mediet påført under den basolaterale siden av det porøse Transwell-innsatsen gjennom mikrokanalen. Intestinal morfogenese skjedde 3–5 dager etter initiering av basolateral strømning i begge kulturplattformene.
De morfologiske egenskapene til mikrokonstruerte 3D-epitellag kan analyseres ved å bruke ulike avbildningsmodaliteter, inkludert fasekontrastmikroskopi, differensiell interferenskontrast (DIC)-mikroskopi, SEM eller immunofluorescens-konfokalmikroskopi (figur 3 og 4). Fasekontrast- eller DIC-avbildning kan enkelt utføres når som helst under dyrking for å overvåke formen og fremspringet til 3D-epitellag. På grunn av den optiske gjennomsiktigheten til PDMS- og polyesterfilmer, kan både gut-on-a-chip- og hybridchip-plattformene gi sanntids in situ-avbildning uten behov for seksjonering eller demontering av enheten. Ved utførelse av immunofluorescensavbildning (figur 1, 3c, f og 4b, c), fikseres cellene vanligvis med 4 % (vekt/volum) paraformaldehyd (PFA), etterfulgt av Triton X-100 og 2 % (vekt/volum) bovint serumalbumin (BSA), i rekkefølge. Avhengig av celletypen kan forskjellige fikseringsmidler, permeabilisatorer og blokkeringsmidler brukes. Primære antistoffer som målretter seg Avstamningsavhengige celle- eller regionmarkører brukes til å fremheve celler immobilisert in situ på brikken, etterfulgt av sekundære antistoffer sammen med et motfargestoff som retter seg mot enten kjernen (f.eks. 4',6-diamidino-2-fenylen) indol, DAPI) eller F-aktin (f.eks. fluorescensmerket falloidin). Fluorescensbasert live-avbildning kan også utføres in situ for å oppdage slimproduksjon (fig. 1, "Celledifferensiering" og "Tarmfysiologi"), tilfeldig kolonisering av mikrobielle celler (fig. 1, "Vert-mikrobe samkultur"), rekruttering av immunceller (fig. 1, 'Sykdomsmodellering') eller konturene av 3D epitelmorfologi (fig. 3c, f og 4b, c). Når tarmen på brikken modifiseres for å skille det øvre laget fra det nedre mikrokanallaget, som beskrevet i ref. Som vist i fig. 2, kan 3D epitelmorfologien så vel som mikrovilli på den apikale børstegrensen visualiseres ved SEM. (Fig. 3b). Ekspresjonen av differensieringsmarkører kan vurderes ved å utføre kvantitativ PCR5- eller enkeltcelle-RNA-sekvensering. I dette tilfellet høstes 3D-lag av epitelceller dyrket i tarmbrikker eller hybridbrikker ved trypsinering og brukes deretter til molekylær eller genetisk analyse.
a, Arbeidsflyt for induksjon av intestinal morfogenese i en hybridbrikke. Caco-2 og intestinale organoider brukes i denne protokollen for å demonstrere 3D-morfogenese i en hybridbrikkeplattform. Dissosierte epitelceller ble sådd i forberedte Transwell-innsatser (TW-forberedelse; se figur nedenfor). Når cellene var sådd (sådd) og festet til polyestermembraner i Transwell-innsatser, ble alle cellene dyrket under statiske forhold (TW-kultur). Etter 7 dager ble et enkelt Transwell-innsats som inneholdt et 2D-monolag av epitelceller integrert i en hybridbrikke for å introdusere en basolateral strømning (Flow, BL), som til slutt førte til generering av et 3D-epitellag (morfogenese). Fasekontrastmikrografer som viser morfologiske trekk ved epitelceller fra menneskelige organer avledet fra normal donor (C103-linje) ascenderende kolon ved hvert eksperimentelt trinn eller tidspunkt. Skjemaene i de øvre lagene illustrerer den eksperimentelle konfigurasjonen for hvert trinn. b, Hybridbrikker (venstre skjematisk) kan føre til 3D-morfogenese av organoide epitelceller med Konfokalmikroskopibilder ovenfra og ned tatt i forskjellige Z-posisjoner (øvre, midtre og nedre; se høyre skjematiske og tilsvarende stiplede linjer). viste tydelige morfologiske egenskaper. F-aktin (cyan), kjerne (grå). c, Fluorescens-konfokalmikrografer (3D-vinklet visning) av organoid-avledede epitelceller dyrket i statisk Transwell (TW; innsatt i hvit stiplet boks) versus hybridbrikke (største fullbilde) som sammenligner henholdsvis 2D og 3D-morfologi. Et par 2D vertikale tverrsnittsvisninger (innsatt i øvre høyre hjørne; "XZ") viser også 2D- og 3D-funksjoner. Målestokk, 100 µm. c Gjengitt med tillatelse fra referanse. 4. Elsevier.
Kontroller kan fremstilles ved å dyrke de samme cellene (Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller) i todimensjonale monolag under konvensjonelle statiske kulturforhold. Det er verdt å merke seg at næringsuttømming kan oppstå på grunn av den begrensede volumkapasiteten til mikrokanalene (dvs. ~4 µL i den øverste kanalen på den originale tarmbrikkedesignen). Derfor kan epitelmorfologien før og etter påføring av basolateral strømning også sammenlignes.
Myklitografiprosessen bør utføres i et rent rom. For hvert lag på brikken (øvre og nedre lag og membraner) og hybridbrikker ble det brukt forskjellige fotomasker som ble produsert på separate silisiumskiver fordi høydene på mikrokanalene var forskjellige. Målhøydene for de øvre og nedre mikrokanalene i tarmen på brikken er henholdsvis 500 µm og 200 µm. Kanalmålhøyden for hybridbrikken er 200 µm.
Plasser en 7,5 cm silisiumskive i en skål med aceton. Svirvl platen forsiktig i 30 sekunder, og lufttørk deretter skiven. Overfør skiven til en plate med IPA, og snurr deretter platen i 30 sekunder for å rengjøre den.
En piranhaløsning (blanding av hydrogenperoksid og konsentrert svovelsyre, 1:3 (vol/vol)) kan eventuelt brukes for å maksimere fjerningen av organiske rester fra silisiumskivens overflate.
Piranha-løsning er ekstremt etsende og genererer varme. Ytterligere sikkerhetsforanstaltninger er nødvendige. For avfallshåndtering, la løsningen avkjøles og overfør den til en ren, tørr avfallsbeholder. Bruk sekundære beholdere og merk avfallsbeholderne riktig. Følg anleggets sikkerhetsretningslinjer for mer detaljerte prosedyrer.
Dehydrer waferne ved å plassere dem på en 200 °C varm plate i 10 minutter. Etter dehydrering ble waferen ristet fem ganger i luft for å avkjøles.
Hell ~10 g fotoresist SU-8 2100 på midten av den rengjorte silisiumskiven. Bruk pinsett til å fordele fotoresisten jevnt på skiven. Plasser skiven av og til på en 65 °C varm plate for å gjøre fotoresisten mindre klissete og lettere å fordele. Ikke plasser skiven direkte på den varme platen.
SU-8 ble jevnt fordelt på waferen ved å kjøre spinnbelegg. Programmer en innkommende rotasjon av SU-8 i 5–10 sekunder for å forplante seg ved 500 o/min med en akselerasjon på 100 o/min/s. Still hovedspinnen for 200 µm tykkelsesmønster ved 1500 o/min, eller oppnå en tykkelse på 250 µm (som gir en høyde på 500 µm for det øvre laget av tarmen på brikken; se "Kritiske trinn" nedenfor) satt til en akselerasjon på 300 o/min/s 30 sekunder ved 1200 o/min.
Hovedspinhastigheten kan justeres i henhold til måltykkelsen på SU-8-mønsteret på silisiumskiven.
For å lage SU-8-mønstre med en høyde på 500 µm for det øvre laget av tarmen på brikken, ble spinnbelegget og mykbrenningen i denne boksen (trinn 7 og 8) gjentatt sekvensielt (se trinn 9) for å produsere to lag med et 250 µm tykt lag med SU-8, som kan legges lagvis og sammenføyes ved UV-eksponering i trinn 12 i denne boksen, slik at det blir et lag som er 500 µm høyt.
Myk stek SU-8-belagte wafere ved å forsiktig plassere wafere på en varm plate ved 65 °C i 5 minutter, deretter bytte innstillingen til 95 °C og inkuber i ytterligere 40 minutter.
For å oppnå en høyde på 500 μm på SU-8-mønsteret i den øvre mikrokanalen, gjenta trinn 7 og 8 for å generere to 250 μm tykke SU-8-lag.
Bruk UV-maskejusteringen til å utføre en lampetest i henhold til produsentens instruksjoner for å beregne eksponeringstiden til waferen. (eksponeringstid, ms) = (eksponeringsdose, mJ/cm2)/(lampeeffekt, mW/cm2).
Etter at eksponeringstiden er bestemt, plasser fotomasken på maskeholderen til UV-maskejusteringen og plasser fotomasken på den SU-8-belagte waferen.
Plasser den trykte overflaten av fotomasken direkte på den SU-8-belagte siden av silisiumskiven for å minimere UV-spredning.
Eksponer den SU-8-belagte waferen og fotomasken vertikalt for 260 mJ/cm2 UV-lys i den forhåndsbestemte eksponeringstiden (se trinn 10 i denne boksen).
Etter UV-eksponering ble SU-8-belagte silisiumskiver bakt ved 65 °C i 5 minutter og 95 °C i 15 minutter på hver varmeplate for å lage mønstre med en høyde på 200 μm. Forleng etterbrenningstiden ved 95 °C til 30 minutter for å lage mønstre med en høyde på 500 μm.
Fremkalleren helles i en glassskål, og den stekte kjeksen plasseres i skålen. Volumet av SU-8-fremkaller kan variere avhengig av størrelsen på glassplaten. Sørg for å bruke nok SU-8-fremkaller til å fjerne ueksponert SU-8 fullstendig. For eksempel, når du bruker en glassskål med en diameter på 150 mm og en kapasitet på 1 liter, bruk ~300 ml SU-8-fremkaller. Fremkalle formen i 25 minutter med forsiktig rotasjon av og til.
Skyll den utviklede formen med ~10 ml frisk utvikler etterfulgt av IPA ved å sprøyte løsningen med en pipette.
Plasser waferen i en plasmarenser og utsett den for oksygenplasma (atmosfærisk gass, måltrykk 1 × 10−5 Torr, effekt 125 W) i 1,5 min.
Plasser waferen i en vakuumeksikkator med et glassplate inni. Wafere og objektglass kan plasseres side om side. Hvis vakuumeksikkatoren er delt inn i flere lag med en plate, plasserer du objektglassene i det nedre kammeret og wafere i det øvre kammeret. Slipp 100 μL triklor(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl)silanløsning på et glassplate og påfør vakuum for silanisering.
Tin et hetteglass med frosne Caco-2-celler i et 37 °C vannbad, og overfør deretter de tinte cellene til en T75-kolbe som inneholder 15 ml 37 °C forvarmet Caco-2-medium.
For å la Caco-2-celler passere ved ~90 % konfluens, varm først Caco-2-medium, PBS og 0,25 % trypsin/1 mM EDTA i et 37 °C vannbad.
Aspirer mediet ved vakuumaspirasjon. Vask cellene to ganger med 5 ml varm PBS ved å gjenta vakuumaspirasjonen og tilsette fersk PBS.