Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо аз браузери навшуда истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Морфогенези рӯдаи инсон хусусиятҳои криптовиллаҳои микромеъмории эпителиалии сеченака ва ташкили фазоӣ-ро муқаррар мекунад. Ин сохтори беназир барои нигоҳ доштани гомеостази рӯда тавассути ҳифзи нишебии ҳуҷайраҳои бунёдӣ дар крипти базалӣ аз антигенҳои микробҳои экзогенӣ ва метаболитҳои онҳо зарур аст. Илова бар ин, виллаҳои рӯда ва луоби ҷудошаванда ҳуҷайраҳои эпителиалии функсионалии фарқкунандаро бо монеаи муҳофизатӣ дар сатҳи луобпардаи рӯда пешниҳод мекунанд. Аз ин рӯ, барқарор кардани сохторҳои эпителиалии сеченака барои сохтани моделҳои рӯдаи in vitro муҳим аст. Қобили зикр аст, ки рӯдаи органикии тақлидкунанда дар чип метавонад морфогенези сеченака-и стихиявии эпителиали рӯдаро бо функсияҳои беҳтаршудаи физиологӣ ва биомеханика ба вуҷуд орад. Дар ин ҷо мо протоколи такроршавандаро барои ба таври қавӣ ба вуҷуд овардани морфогенези рӯда дар рӯда дар чипи микрофлюидӣ ва инчунин дар чипи гибридии дарунсохти Трансвелл пешниҳод мекунем. Мо усулҳои муфассали истеҳсоли дастгоҳ, парвариши ҳуҷайраҳои эпителиалии Caco-2 ё органоиди рӯда дар шароити анъанавӣ, инчунин дар платформаи микрофлюидӣ, индуксияи морфогенези сеченака ва тавсифи эпителиали муқарраршудаи сеченака-ро бо истифода аз усулҳои гуногуни тасвирӣ тавсиф мекунем. Ин протокол бо назорати ҷараёни моеъи базолатералӣ барои 5 рӯз барқароршавии микроархитектураи функсионалии рӯдаро ба даст меорад. Усули морфогенези in vitro-и мо аз стресси буриши физиологӣ ва ҳаракати механикӣ истифода мебарад ва муҳандисӣ ё манипуляцияи мураккаби ҳуҷайраро талаб намекунад, ки метавонад аз дигар усулҳои мавҷуда беҳтар бошад. Мо тасаввур мекунем, ки протоколи пешниҳодшудаи мо метавонад барои ҷомеаи тадқиқоти биотиббӣ таъсири васеъ дошта бошад ва усули барқарор кардани қабатҳои эпителиалии сеченакаи рӯдаро дар in vitro барои барномаҳои биотиббӣ, клиникӣ ва фармасевтӣ фароҳам оварад.
Таҷрибаҳо нишон медиҳанд, ки ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда Caco-2, ки дар дастгоҳҳои микрофлюиди дуқабата6,7 ё gut-on-a-chip парвариш карда мешаванд, метавонанд морфогенези сеандозаи стихиявиро дар in vitro бидуни дарки возеҳи механизми аслӣ аз сар гузаронанд. Дар таҳқиқоти ахири худ, мо муайян кардем, ки хориҷ кардани антагонистҳои морфогении базолатералӣ аз дастгоҳҳои парвариш барои ба вуҷуд овардани морфогенези эпителиалии сеандоза дар in vitro зарурӣ ва кофӣ аст, ки инро Caco-2 ва органоидҳои рӯдаи аз ҷониби бемор гирифташуда нишон додаанд. Ҳуҷайраҳои эпителиалӣ тасдиқ карда шуданд. Дар ин таҳқиқот, мо махсусан ба истеҳсол ва тақсимоти консентратсияи антагонисти пуриқтидори Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1) дар дастгоҳҳои микрофлюиди тағйирёфтаи дорои воридҳои Трансвелл, ки "Чипи гибридӣ" номида мешаванд, тамаркуз кардем. Мо нишон медиҳем, ки илова кардани антагонистҳои экзогении Wnt (ба монанди DKK-1, репрессори Wnt 1, сафедаи марбут ба печидашудаи 1 ё Soggy-1) ба рӯдаи он-чип морфогенезро бозмедорад ё қабати эпителиалии сеченакаи пешакӣ сохташударо вайрон мекунад, ки нишон медиҳад, ки стресси антагонистӣ ҳангоми парвариш барои морфогенези рӯда дар in vitro масъул аст. Аз ин рӯ, як равиши амалӣ барои ноил шудан ба морфогенези қавӣ дар интерфейси эпителиалӣ ин нест кардан ё ҳадди ақал нигоҳ доштани сатҳи антагонистҳои Wnt дар қисмати базоларӣ тавассути шустани фаъол (масалан, дар платформаҳои gut-on-a-chip ё гибрид-on-a-chip) ё диффузияи .муҳити базоларӣ (масалан, аз воридҳои Трансвелл ба обанборҳои калони базоларӣ дар чоҳҳо) мебошад.
Дар ин протокол, мо усули муфассали истеҳсоли микродастгоҳҳои дарунсохт ва чипҳои гибридии воридшавандаи Transwell (қадамҳои 1-5) барои парвариши ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда дар мембранаҳои сӯрохидор дар асоси полидиметилсилоксан (PDMS) (қадамҳои 6A, 7A, 8, 9) ё мембранаҳои полиэстерии воридшавандаҳои Transwell (қадамҳои 6B, 7B, 8, 9) ва ба вуҷуд овардани морфогенези сеченака дар vitro (қадами 10) -ро пешниҳод менамоем. Мо инчунин хусусиятҳои ҳуҷайравӣ ва молекулавиро, ки нишондиҳандаи гистогенези мушаххаси бофта ва дифференсиатсияи ҳуҷайраҳои вобаста ба насл мебошанд, бо истифода аз усулҳои гуногуни тасвирӣ муайян кардем (қадамҳои 11-24). Мо морфогенезро бо истифода аз ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯдаи инсон, ба монанди Caco-2 ё органоидҳои рӯда, дар ду формати парвариш бо тафсилоти техникӣ, аз ҷумла тағир додани сатҳи мембранаҳои сӯрохдор, эҷоди моноқабатҳои 2D ва биохимикии рӯда ва такрористеҳсоли микромуҳити биомеханикии рӯда ба вуҷуд овардем. in vitro. Барои ба вуҷуд овардани морфогенези сеченака аз моноқабатҳои эпителиалии 2D, мо антагонистҳои морфогенро дар... ҳарду шаклҳои парваришёфта бо роҳи ҷори кардани муҳит ба қисмати базоларии парвариш. Дар ниҳоят, мо намояндагии фоиданокии қабати эпителиалии сеченака барқароршавандаро пешниҳод мекунем, ки метавонад барои моделсозии афзоиши эпителиали вобаста ба морфоген, ҳамфарҳангии тӯлонии мизбон-микробиома, сироятёбии патоген, осеби илтиҳобӣ, вайроншавии монеаи эпителиалӣ ва терапияҳои дар асоси пробиотикӣ истифода шавад. Мисол. Таъсири.
Протоколи мо метавонад барои доираи васеи олимон дар таҳқиқоти асосӣ (масалан, биологияи луобпардаи рӯда, биологияи ҳуҷайраҳои бунёдӣ ва биологияи рушд) ва амалӣ (масалан, санҷиши пеш аз клиникӣ, моделсозии беморӣ, муҳандисии бофтаҳо ва гастроэнтерология) таъсири васеъ муфид бошад. Аз сабаби такроршавандагӣ ва устувории протоколи мо барои ба вуҷуд овардани морфогенези сеченакаи эпителияи рӯда дар in vitro, мо тасаввур мекунем, ки стратегияи техникии мо метавонад ба аудиторияҳое, ки динамикаи сигнализатсияи ҳуҷайраро ҳангоми инкишофи рӯда, барқароршавӣ ё гомеостаз меомӯзанд, паҳн карда шавад. Илова бар ин, протоколи мо барои пурсиши сироятҳо таҳти агентҳои гуногуни сироятӣ, ба монанди Норовирус 8, Синдроми шадиди роҳи нафас Коронавирус 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ё Vibrio cholerae муфид аст. Шунавандагони патология ва патогенези беморӣ низ муфиданд. Истифодаи системаи микрофизиологияи рӯдаи дар чип буда метавонад имкон диҳад, ки ҳамфарҳангии дарозмуддат 10 ва арзёбии минбаъдаи дифоъи мизбон, вокунишҳои иммунӣ ва таъмири осеби марбут ба патогенҳо дар рӯдаи меъдаву рӯда (GI) 11 анҷом дода шавад. Дигар бемориҳои GI, ки бо синдроми рӯдаи шорида, бемории целиакия, бемории Крон, колити захмӣ, пучит ё синдроми рӯдаи асабӣ алоқаманданд, метавонанд ҳангоми омода кардани қабатҳои эпителиалии рӯдаи 3D бо истифода аз қабатҳои эпителиалии рӯдаи 3D-и бемор симулятсия карда шаванд, ин бемориҳо атрофияи виллаҳо, кӯтоҳшавии крипта, осеби луобпарда ё монеаи вайроншудаи эпителиалиро дар бар мегиранд. Биопсия ё органоидҳои рӯдаи аз ҳуҷайраҳои бунёдӣ гирифташуда 12,13. Барои моделсозии беҳтари мураккабии баланди муҳити беморӣ, хонандагон метавонанд илова кардани намудҳои ҳуҷайраҳои марбут ба беморӣ, ба монанди ҳуҷайраҳои мононуклеарии хуни периферии бемор (PBMCs)-ро ба моделҳое, ки микроархитектураҳои вилла-криптаи рӯдаи 3D доранд, баррасӣ кунанд. ҳуҷайраҳои иммунии мушаххаси бофта, 5.
Азбаски сохтори эпителиалии сеченака бидуни раванди қисмбандӣ метавонад собит ва визуалӣ карда шавад, тамошобиноне, ки дар транскриптомикаи фазоӣ ва тасвирҳои баландсифат ё супер-қарорӣ кор мекунанд, метавонанд ба харитасозии динамикаи фазоӣ-замонии генҳо ва сафедаҳо дар нишҳои эпителиалӣ таваҷҷӯҳ дошта бошанд. Ба технология таваҷҷӯҳ доранд. Вокуниш ба ангезаҳои микробӣ ё иммунӣ. Ғайр аз ин, байниҳамдигарии дарозмуддати мизбон-микробиома 10, 14, ки гомеостази рӯдаро ҳамоҳанг мекунанд, метавонанд дар қабати луобпардаи рӯдаи сеченака бо роҳи якҷоя парвариш кардани намудҳои гуногуни микробӣ, ҷамоаҳои микробӣ ё микробиотаи наҷосат, махсусан дар gut-on-a-chip, муқаррар карда шаванд. дар платформа. Ин равиш барои шунавандагоне, ки иммунологияи луобпарда, гастроэнтерология, микробиомаи инсон, културомика ва микробиологияи клиникиро меомӯзанд, махсусан ҷолиб аст. Агар протоколи морфогенези in vitro-и мо ба форматҳои парвариши миқёспазир, ба монанди воридкунии бисёрчоҳӣ дар табақчаҳои чоҳи 24, 96 ё 384, ки пайваста қисмҳои базоларалиро пур мекунанд, мутобиқ карда шавад, протокол инчунин метавонад ба онҳое, ки платформаҳои скрининг ё тасдиқи дорусозӣ, биотиббӣ ё баландсифатро барои саноати хӯрокворӣ таҳия мекунанд, паҳн карда шавад. Ҳамчун исботи принсип, мо ба наздикӣ имконияти системаи морфогенези мултиплексии баландсифатро, ки ба формати табақчаи 24-чоҳӣ миқёспазир аст, нишон додем. Илова бар ин, маҳсулоти сершумори узвҳо дар чип тиҷоратӣ карда шудаанд16,17,18. Аз ин рӯ, тасдиқи усули морфогенези in vitro-и мо метавонад суръат гирад ва эҳтимолан аз ҷониби бисёр лабораторияҳои тадқиқотӣ, саноат ё ҳукумат ва мақомоти танзимкунанда барои фаҳмидани барномарезии ҳуҷайравии морфогенези in vitro дар сатҳи транскриптомӣ барои санҷиши доруҳо қабул карда шавад. ё биотерапияҳо Ҷаббида ва интиқоли номзадҳои дору бо истифода аз суррогатҳои рӯдаи 3D ё бо истифода аз моделҳои фармоишӣ ё тиҷоратии узвҳо дар чип барои арзёбии такроршавандагии раванди морфогенези рӯда арзёбӣ карда шуд.
Барои омӯзиши морфогенези эпителиалии рӯда шумораи маҳдуди моделҳои таҷрибавии марбут ба инсон истифода шудаанд, ки асосан аз сабаби набудани протоколҳои амалӣ барои ба вуҷуд овардани морфогенези сеченака дар in vitro мебошанд. Дар асл, қисми зиёди донишҳои мавҷуда дар бораи морфогенези рӯда ба таҳқиқоти ҳайвонот (масалан, зебрафишӣ20, мушҳо21 ё мурғҳо22) асос ёфтаанд. Аммо, онҳо меҳнатталаб ва хароҷотталабанд, метавонанд аз ҷиҳати ахлоқӣ шубҳанок бошанд ва аз ҳама муҳимтар, равандҳои рушди инсонро дақиқ муайян намекунанд. Ин моделҳо инчунин аз ҷиҳати қобилияти санҷидани онҳо бо роҳи миқёспазири бисёрҷониба хеле маҳдуданд. Аз ин рӯ, протоколи мо барои барқарор кардани сохторҳои бофтаи сеченака дар in vitro аз моделҳои ҳайвоноти in vivo ва инчунин дигар моделҳои анъанавии фарҳанги ҳуҷайраҳои статикии дученака бартарӣ дорад. Тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, истифодаи сохторҳои эпителиалии сеченака ба мо имкон дод, ки маҳаллисозии фазоии ҳуҷайраҳои тафриқашударо дар меҳвари криптовиллус дар посух ба ангезаҳои гуногуни луобпарда ё иммунӣ таҳқиқ кунем. Қабатҳои эпителиалии сеченака метавонанд фазоеро барои омӯхтани он, ки чӣ гуна ҳуҷайраҳои микробӣ барои ташкили нишҳои фазоӣ ва эволютсияи экологӣ дар посух ба омилҳои мизбон (масалан, қабатҳои луоби дохилӣ ва беруна, ихроҷи...) рақобат мекунанд, фароҳам оваранд. IgA ва пептидҳои зиддимикробӣ). Ғайр аз ин, морфологияи эпителиалии сеченака метавонад ба мо имкон диҳад, ки бифаҳмем, ки чӣ гуна микробиотаи рӯда ҷамоатҳои худро сохтор медиҳад ва метаболитҳои микробӣ (масалан, кислотаҳои равғании занҷири кӯтоҳ)-ро, ки сохтори ҳуҷайра ва нишҳои ҳуҷайраҳои бунёдиро дар криптҳои базалӣ ташаккул медиҳанд, синергетикӣ истеҳсол мекунад. Ин хусусиятҳоро танҳо вақте нишон додан мумкин аст, ки қабатҳои эпителиалии сеченака дар in vitro муқаррар карда шаванд.
Илова бар усули мо барои эҷоди сохторҳои эпителиалии сеченака рӯда, якчанд усулҳои in vitro мавҷуданд. Фарҳанги органоидии рӯда як усули муосири муҳандисии бофтаҳо мебошад, ки ба парвариши ҳуҷайраҳои бунёдии рӯда дар шароити мушаххаси морфогенӣ асос ёфтааст23,24,25. Аммо, истифодаи моделҳои органоидии сеченака барои таҳлили интиқол ё ҳамфарҳангии мизбон-микробиом аксар вақт душвор аст, зеро люмени рӯда дар дохили органоид ҷойгир аст ва аз ин рӯ, ворид кардани ҷузъҳои люменӣ, ба монанди ҳуҷайраҳои микробӣ ё антигенҳои экзогенӣ маҳдуд аст. Дастрасӣ ба люменҳои органоидро бо истифода аз микроинжектор беҳтар кардан мумкин аст26,27, аммо ин усул инвазивӣ ва меҳнатталаб аст ва барои иҷрои он дониши махсусро талаб мекунад. Ғайр аз ин, фарҳангҳои анъанавии органоид, ки дар скелетҳои гидрогелӣ дар шароити статикӣ нигоҳ дошта мешаванд, биомеханикаи фаъолро дар in vivo дақиқ инъикос намекунанд.
Усулҳои дигаре, ки аз ҷониби якчанд гурӯҳҳои тадқиқотӣ истифода мешаванд, аз скелетҳои гидрогелии сеченакаи пешакӣ сохташуда барои тақлид кардани сохтори эпителиалии рӯда тавассути парвариши ҳуҷайраҳои рӯдаи ҷудогонаи инсон дар сатҳи гел истифода мебаранд. Скелетҳои гидрогелиро бо истифода аз қолабҳои чопшудаи сеченакаи морфогенӣ, микро-майдакунӣ ё литографӣ сохташуда созед. Ин усул тартиби худташкилшудаи ҳуҷайраҳои эпителиалии ҷудогонаи in vitro-ро бо градиентҳои морфогении физиологӣ нишон медиҳад, ки сохтори эпителиалии таносуби баланди ҷанба ва ҳамбастагии строма-эпителиалиро бо дохил кардани ҳуҷайраҳои стромалӣ дар скелет муқаррар мекунад. Аммо, табиати скелетҳои пешакӣ сохташуда метавонад аз намоиши худи раванди морфогенетикии стихиявӣ пешгирӣ кунад. Ин моделҳо инчунин ҷараёни динамикии люминалӣ ё байнисоҳавиро таъмин намекунанд, ки стресси буриши моеъро надорад, ки ҳуҷайраҳои рӯда бояд морфогенезро аз сар гузаронанд ва вазифаи физиологиро ба даст оранд. Як таҳқиқоти дигари ахир скелетҳои гидрогелиро дар платформаи микрофлюидӣ ва сохторҳои эпителиалии рӯдаро бо истифода аз усулҳои кандакории лазерӣ истифода бурд. Органоидҳои рӯдаи муш намунаҳои кандашударо барои ташкили сохторҳои найчаҳои рӯда пайравӣ мекунанд ва ҷараёни моеъи дохилилюминалӣ метавонад... бо истифода аз модули микрофлюидика такрор карда шуд. Аммо, ин модел на равандҳои морфогенетикии худсаронаро нишон медиҳад ва на ҳаракатҳои механобиологии рӯдаро дар бар мегирад. Усулҳои чопи 3D аз ҳамон гурӯҳ тавонистанд найчаҳои хурди рӯдаро бо равандҳои морфогенетикии худсарона эҷод кунанд. Сарфи назар аз сохтани мураккаби сегментҳои гуногуни рӯда дар дохили найча, ин модел инчунин ҷараёни моеъи люминалӣ ва деформатсияи механикӣ надорад. Илова бар ин, кори модел метавонад маҳдуд бошад, хусусан пас аз анҷоми раванди биопринтинг, ки шароити таҷрибавӣ ё таъсири мутақобилаи ҳуҷайра ба ҳуҷайраро халалдор мекунад. Ба ҷои ин, протоколи пешниҳодшудаи мо морфогенези худсаронаи рӯда, стресси буриши физиологии муҳим, биомеханикае, ки ҳаракати рӯдаро тақлид мекунанд, дастрасии қисмҳои мустақили апикалӣ ва базолатералӣ ва аз нав эҷод кардани микромуҳитҳои мураккаби биологии модулӣ. Аз ин рӯ, протоколи морфогенези 3D-и мо дар in vitro метавонад як равиши мукаммалро барои бартараф кардани мушкилоти усулҳои мавҷуда таъмин кунад.
Протоколи мо пурра ба морфогенези эпителиалии сеченака нигаронида шудааст, ки дар он танҳо ҳуҷайраҳои эпителиалӣ дар парвариш мавҷуданд ва дигар намудҳои ҳуҷайраҳои атроф, ба монанди ҳуҷайраҳои мезенхималӣ, ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ ва ҳуҷайраҳои масуният, вуҷуд надоранд. Тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, асоси протоколи мо индуксияи морфогенези эпителиалӣ бо роҳи хориҷ кардани ингибиторҳои морфоген, ки дар тарафи базолатериалии муҳити воридшуда ҷудо мешаванд, мебошад. Дар ҳоле ки модулятсияи мустаҳками рӯда-дар-чип ва гибрид-дар-чип ба мо имкон медиҳад, ки қабати эпителиалии сеченака мавҷнокро аз нав эҷод кунем, мураккабиҳои иловагии биологӣ, ба монанди таъсири мутақобилаи эпителиалӣ-мезенхималӣ33,34, ҷойгиршавии Матритсаи берунҳуҷайравӣ (ECM)35 ва дар модели мо, хусусиятҳои крипт-виллус, ки нишҳои ҳуҷайраҳои бунёдиро дар криптҳои базалӣ интиқол медиҳанд, бояд минбаъд баррасӣ шаванд. Ҳуҷайраҳои стромалӣ (масалан, фибробластҳо) дар мезенхима дар истеҳсоли сафедаҳои ECM ва танзими морфогенези рӯда дар vivo нақши калидӣ мебозанд35,37,38. Илова кардани ҳуҷайраҳои мезенхималӣ ба модели мо раванди морфогенетикӣ ва ҳуҷайраро тақвият дод. Самаранокии пайвастшавӣ. Қабати эндотелиалӣ (яъне капиллярҳо ё лимфаҳо) дар танзими интиқоли молекулавӣ39 ва ҷалби ҳуҷайраҳои иммунӣ40 дар муҳити микрои рӯда нақши муҳим мебозад. Ғайр аз ин, ҷузъҳои рагҳо, ки метавонанд байни моделҳои бофта пайваст карда шаванд, шарти пешакӣ мебошанд, вақте ки моделҳои бофта барои нишон додани таъсири мутақобилаи бисёр узвҳо тарҳрезӣ мешаванд. Аз ин рӯ, ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ метавонанд барои моделсозии хусусиятҳои дақиқтари физиологӣ бо қарори сатҳи узвҳо дохил карда шаванд. Ҳуҷайраҳои иммунии аз ҷониби бемор гирифташуда инчунин барои нишон додани вокунишҳои иммунии модарзодӣ, муаррифии антиген, муколамаи иммунии мутобиқшавандаи модарзодӣ ва иммунитети мушаххаси бофта дар заминаи тақлид кардани бемории рӯда муҳиманд.
Истифодаи чипҳои гибридӣ нисбат ба "ғубор дар болои чип" соддатар аст, зеро танзимоти дастгоҳ соддатар аст ва истифодаи воридҳои Transwell имкон медиҳад, ки эпителияи рӯда миқёспазир парвариш карда шавад. Аммо, воридҳои Transwell, ки бо мембранаҳои полиэстер дастрасанд, чандир нестанд ва наметавонанд ҳаракатҳои шабеҳи перисталтикиро тақлид кунанд. Ғайр аз ин, қисмати апикалии воридҳои Transwell, ки дар чипи гибридӣ ҷойгир карда шудаанд, бе ягон фишори буриш дар тарафи апикали статикӣ боқӣ монданд. Албатта, хосиятҳои статикӣ дар қисмати апикали кам ба парвариши дарозмуддати бактериявӣ дар чипҳои гибридӣ имкон медиҳанд. Гарчанде ки мо метавонем морфогенези сеандозаро дар воридҳои Transwell ҳангоми истифодаи чипҳои гибридӣ ба таври қавӣ ба вуҷуд орем, норасоии биомеханикаи физиологӣ ва ҷараёни моеъи апикали метавонад имконияти платформаҳои чипҳои гибридиро барои барномаҳои эҳтимолӣ маҳдуд кунад.
Таҷдиди пурраи меҳвари крипт-виллаҳои инсон дар фарҳангҳои gut-on-a-chip ва гибрид-on-a-chip пурра муқаррар нашудаанд. Азбаски морфогенез аз як қабати эпителиалӣ оғоз мешавад, микроархитектураҳои сеченака ҳатман ба криптҳо дар in vivo шабоҳати морфологӣ намедиҳанд. Гарчанде ки мо популятсияи ҳуҷайраҳои афзоишёбандаро дар наздикии домени криптои базалӣ дар эпителиияи сеченакаи микромуҳандисӣ тавсиф кардем, минтақаҳои крипт ва виллаҳо ба таври возеҳ ҷудо карда нашуда буданд. Гарчанде ки каналҳои болоии баландтар дар чип боиси афзоиши баландии эпителиияи микромуҳандисӣ мешаванд, баландии максималӣ то ҳол то ~300-400 мкм маҳдуд аст. Чуқурии воқеии криптҳои рӯдаи инсон дар рӯдаҳои хурд ва ғафс мутаносибан ~135 мкм ва ~400 мкм ва баландии виллаҳои рӯдаи хурд ~600 мкм аст41.
Аз нуқтаи назари тасвиргирӣ, тасвири баландсифати микроархитектураҳои сеченака дар ҷой метавонад танҳо ба рӯдаи рӯи чип маҳдуд бошад, зеро масофаи кории зарурӣ аз линзаи объектив то қабати эпителиалӣ тақрибан чанд миллиметр аст. Барои ҳалли ин мушкилот, объективи дурдаст метавонад лозим бошад. Ғайр аз ин, сохтани қисмҳои тунук барои тайёр кардани намунаҳои тасвирӣ аз сабаби чандирии баланди PDMS душвор аст. Ғайр аз ин, азбаски микросохтори қабат ба қабати рӯда дар чип часпиши доимиро байни ҳар як қабат дар бар мегирад, кушодан ё хориҷ кардани қабати болоӣ барои таҳқиқи сохтори сатҳии қабати эпителиалӣ хеле душвор аст. Масалан, бо истифода аз микроскопи электронии сканкунӣ (SEM).
Гидрофобияти PDMS омили маҳдудкунанда дар таҳқиқоти микрофлюидӣ, ки бо молекулаҳои хурди гидрофобӣ сарукор доранд, буд, зеро PDMS метавонад чунин молекулаҳои гидрофобиро ғайримушаххас адсорбсия кунад. Алтернативаҳо ба PDMS метавонанд бо дигар маводҳои полимерӣ баррасӣ шаванд. Интихобан, тағир додани сатҳи PDMS (масалан, пӯшиш бо маводҳои липофилӣ 42 ё поли (этиленгликол) 43) -ро барои кам кардани адсорбсияи молекулаҳои гидрофобӣ баррасӣ кардан мумкин аст.
Ниҳоят, усули мо аз ҷиҳати таъмини платформаи озмоишии қулайи скрининги баландсифат ё платформаи озмоишии "як андоза барои ҳама" хуб тавсиф нашудааст. Протоколи ҷорӣ барои ҳар як дастгоҳи хурд насоси сӯзандоруро талаб мекунад, ки дар инкубатори CO2 ҷойро ишғол мекунад ва аз таҷрибаҳои миқёси калон пешгирӣ мекунад. Ин маҳдудиятро метавон бо миқёспазирии форматҳои инноватсионии парвариш (масалан, воридҳои сӯрохии 24-чоҳӣ, 96-чоҳӣ ё 384-чоҳӣ, ки имкон медиҳанд, ки муҳити базоларалӣ доимо пурра ва хориҷ карда шавад) ба таври назаррас беҳтар кард.
Барои ба вуҷуд овардани морфогенези сеченакали эпителияи рӯдаи инсон дар in vitro, мо дастгоҳи рӯдаи микрофлюидии чипро истифода бурдем, ки дорои ду микроканалҳои параллелӣ ва як мембранаи эластикии сӯрохи байни онҳо буд, то интерфейси люмен-капиллярӣ эҷод кунем. Мо инчунин истифодаи дастгоҳи микрофлюидии якканалӣ (чипи гибридӣ)-ро нишон медиҳем, ки ҷараёни пайвастаи базолатералиро дар зери қабатҳои эпителиалии поляризатсияшуда, ки дар воридҳои Трансвелл парвариш карда мешаванд, таъмин мекунад. Дар ҳарду платформа, морфогенези ҳуҷайраҳои гуногуни эпителиалии рӯдаи инсонро бо истифода аз манипуляцияи самтии ҷараён барои хориҷ кардани антагонистҳои морфоген аз қисмати базолатералӣ нишон додан мумкин аст. Тамоми тартиби таҷрибавӣ (Расми 1) аз панҷ қисм иборат аст: (i) микросохтори чипи рӯда ё чипи гибридии воридшавандаи Трансвелл (қадамҳои 1-5; Қуттии 1), (ii) омода кардани ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда (ҳуҷайраҳои Caco-2) ё органоидҳои рӯдаи инсон; қуттиҳои 2-5), (iii) парвариши ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯда дар чипҳои рӯда ё чипҳои гибридӣ (қадамҳои 6-9), (iv) индуксияи морфогенези сеченака дар шароити in vitro (қадами 10) ва (v)) барои тавсифи микросохтори эпителиалии сеченака (қадамҳои 11-24). Дар ниҳоят, як гурӯҳи мувофиқи назоратӣ (ки дар зер баррасӣ мешавад) барои тасдиқи самаранокии морфогенези in vitro тавассути муқоисаи морфогенези эпителиалӣ бо назорати фазоӣ, замонӣ, шартӣ ё тартибӣ тарҳрезӣ шудааст.
Мо ду платформаи гуногуни парваришро истифода бурдем: рӯда-дар-чип бо каналҳои рост ё каналҳои ғайрихаттии печида, ё чипҳои гибридӣ, ки дорои воридҳои Трансвелл (TW) дар дастгоҳи микрофлюидӣ мебошанд, ки мувофиқи тавсифи қуттии 1 ва қадами 1-5 сохта шудаанд. "Сохтани дастгоҳ" қадамҳои асосии сохтани як чип ё чипи гибридиро нишон медиҳад. "Фарҳанги ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯдаи инсон" манбаи ҳуҷайра (Caco-2 ё органоидҳои рӯдаи инсон) ва тартиби парваришро, ки дар ин протокол истифода мешавад, шарҳ медиҳад."Морфогенези in vitro" қадамҳои умумиеро нишон медиҳад, ки дар онҳо ҳуҷайраҳои эпителиалии Caco-2 ё органоидҳои ҳосилшуда дар чипи рӯда ё дар воридҳои Трансвелл чипи гибридӣ парвариш карда мешаванд, ки пас аз он индуксияи морфогенези сеченака ва ташаккули сохтори эпителиалии хос ба амал меояд. Рақами қадами барнома ё рақами қуттӣ дар зери ҳар як тир нишон дода шудааст. Дар барнома мисолҳое оварда шудаанд, ки чӣ гуна қабатҳои эпителиалии рӯдаи муқарраршуда метавонанд истифода шаванд, масалан, дар тавсифи дифференсиатсияи ҳуҷайраҳо, омӯзиши физиологияи рӯда, таъсиси экосистемаҳои микробиомаи мизбон ва моделсозии беморӣ. Тасвирҳои иммунофлуоресценция дар "Ҳуҷайра" "Дифференсиатсия" ядроҳо, F-актин ва MUC2-ро нишон медиҳад, ки дар қабати эпителиалии 3D Caco-2, ки дар чипи рӯда тавлид шудааст, ифода ёфтааст. Сигнализатсияи MUC2 дар ҳуҷайраҳои пиёлаҳо ва луобе, ки аз сатҳҳои луобпарда ҷудо мешавад, мавҷуд аст. Тасвирҳои флуоресентӣ дар физиологияи рӯда луоберо нишон медиҳанд, ки тавассути ранг кардани кислотаи сиалӣ ва боқимондаҳои N-ацетилглюкозамин бо истифода аз агглютинини флуоресцентии гандуми навниҳол ҳосил мешавад. Ду тасвири ҳампӯш дар "Ҳамкории мизбон-микроб" фарҳангҳои ҳамкории мизбон-микробиомро дар рӯда дар чип нишон медиҳанд. Панели чап фарҳанги ҳамкории E. coli-ро, ки сафедаи флуоресцентии сабзро (GFP) бо ҳуҷайраҳои эпителиалии 3D Caco-2 микромуҳандисӣ ифода мекунад, нишон медиҳад. Панели рост маҳаллисозии ҳамкории GFP E. coli-ро, ки бо ҳуҷайраҳои эпителиалии 3D Caco-2 якҷоя парвариш карда шудааст, нишон медиҳад ва баъдан рангкунии иммунофлуоресцентӣ бо F-актин (сурх) ва ядроҳо (кабуд) анҷом дода мешавад. Моделсозии беморӣ рӯдаи солим ва ихроҷро дар чипҳои илтиҳоби рӯда дар зери мушкилоти физиологӣ бо антигенҳои бактериявӣ (масалан, липополисахарид, LPS) ва ҳуҷайраҳои масуният (масалан, PBMC; сабз). Ҳуҷайраҳои Caco-2 барои ташкили қабати эпителиалии 3D парвариш карда шуданд. Миқёси сатр, 50 мкм. Тасвирҳо дар сатри поён: "Тафовути ҳуҷайраҳо" бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудааст. 2. Oxford University Press; Бо иҷозати истинод 5. NAS такрор карда шудааст; "Ҳамкории мизбон-микроб" бо иҷозати истинод 3. NAS мутобиқ карда шудааст; "Моделсозии беморӣ" бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудааст. 5. NAS.
Ҳам чипҳои "ғурӯда дар чип" ва ҳам гибридӣ бо истифода аз нусхаҳои PDMS сохта шудаанд, ки аз қолабҳои кремний бо литографияи нарм1,44 ҷудо карда шуда, бо SU-8 нақшбандӣ шудаанд. Тарҳи микроканалҳо дар ҳар як чип бо назардошти гидродинамика, ба монанди фишори буриш ва фишори гидродинамикӣ1,4,12 муайян карда мешавад. Тарҳи аслии "ғурӯда дар чип" (Маълумоти васеъшуда Расми 1a), ки аз ду микроканалҳои рости параллелии ҳамҷояшуда иборат буд, ба як "ғурӯда дар чип"-и мураккаб (Маълумоти васеъшуда Расми 1b) табдил ёфтааст, ки як ҷуфт микроканалҳои каҷро дар бар мегирад, ки вақти зиёдшудаи моеъ, нақшҳои ҷараёни ғайрихаттӣ ва деформатсияи бисёрмеҳварии ҳуҷайраҳои парваришшударо ба вуҷуд меоранд (Расми 2a-f). 12. Вақте ки биомеханикаи мураккабтари "ғурӯда" бояд аз нав сохта шавад, "ғурӯда дар чип"-ҳои мураккабро интихоб кардан мумкин аст. Мо нишон додем, ки "ғурӯда"-и печида инчунин морфогенези сеченакаро дар чаҳорчӯбаи вақти монанд бо дараҷаи монанд ба афзоиши эпителиалӣ дар муқоиса бо аслӣ ба таври қавӣ ба вуҷуд меорад. Гут-Чип, новобаста аз намуди ҳуҷайраҳои парваришёфта. Аз ин рӯ, барои ба вуҷуд овардани морфогенези сеченака, тарҳҳои хаттӣ ва мураккаби дарунии чип ивазшавандаанд. Нусхаҳои PDMS, ки дар қолабҳои силикон бо нақшҳои SU-8 табобат карда шудаанд, пас аз демонтаж хусусиятҳои манфӣ доданд (Расми 2a). Барои сохтани рӯда дар чип, қабати болоии омодашудаи PDMS пайдарпай ба плёнкаи сӯрохи PDMS пайваст карда шуд ва сипас бо қабати поёнии PDMS бо пайванди бебозгашт бо истифода аз коркардкунандаи корона ҳамоҳанг карда шуд (Расми 2b-f). Барои сохтани чипҳои гибридӣ, нусхаҳои PDMS-и табобатшуда ба слайдҳои шишагӣ пайваст карда шуданд, то дастгоҳҳои микрофлюиди якканалӣ эҷод карда шаванд, ки метавонанд воридҳои Трансвеллро ҷойгир кунанд (Расми 2h ва Маълумоти васеъшуда Расми 2). Раванди пайвасткунӣ бо коркарди сатҳҳои нусхаи PDMS ва шиша бо плазмаи оксиген ё коркарди корона анҷом дода мешавад. Пас аз стерилизатсияи дастгоҳи микросохташуда, ки ба найчаи силикон пайваст карда шудааст, насби дастгоҳ барои иҷрои морфогенези сеченакаи эпителияи рӯда омода буд (Расми 2g).
а, Тасвири схемавии тайёр кардани қисмҳои PDMS аз қолабҳои силиконии нақшдори SU-8. Маҳлули PDMS-и хушкнашуда ба қолаби силикон (чап) рехта, дар ҳарорати 60 °C (миёна) хушк карда шуд ва (рост) демонда шуд. PDMS-и демондашуда ба қисмҳо бурида ва барои истифодаи минбаъда тоза карда шуд. б, Акси қолаби силикон, ки барои тайёр кардани қабати болоии PDMS истифода шудааст. в, Акси қолаби силикон, ки барои сохтани мембранаи сӯрохидори PDMS истифода шудааст. г, Як силсила аксҳои ҷузъҳои PDMS-и болоӣ ва поёнӣ ва дастгоҳи рӯдаи васлшуда дар чип. е, Схемаи ҳамоҳангсозии ҷузъҳои болоӣ, мембрана ва поёнии PDMS. Ҳар як қабат бо коркарди плазма ё корона ба таври бебозгашт пайваст карда шудааст. ф, Схемаи дастгоҳи сохташудаи рӯда дар чип бо микроканалҳои печдор ва камераҳои вакуумӣ. г, Танзими рӯда дар чип барои парвариши ҳуҷайраҳои микрофлюидӣ. Рӯдаи сохташуда дар чип, ки бо найчаи силикон ва сӯзандору васл карда шудааст, дар болои рӯйпӯш ҷойгир карда шуд. Дастгоҳи чип дар болои сарпӯши косачаи Петри 150 мм барои коркард. Ҷудокунанда барои пӯшидани найчаи силикон истифода мешавад.h, Аксҳои визуалии истеҳсоли чипҳои гибридӣ ва морфогенези сеченака бо истифода аз чипҳои гибридӣ. Воридҳои Трансвелл, ки мустақилона барои парвариш омода карда шудаанд, барои ба вуҷуд овардани морфогенези сеченакаи рӯда ба чипи гибридӣ ворид карда шуданд. Муҳит тавассути микроканалҳои зери қабати ҳуҷайра, ки дар варақаи Трансвелл муқаррар шудааст, перфузия карда мешавад. Миқёси рах, 1 см.h Бо иҷозати истинод дубора чоп шудааст.4. Elsevier.
Дар ин протокол, хати ҳуҷайраҳои Caco-2 ва органоидҳои рӯда ҳамчун манбаъҳои эпителиалӣ истифода шуданд (Расми 3a). Ҳарду намуди ҳуҷайраҳо мустақилона парвариш карда шуданд (Қуттии 2 ва Қуттии 5) ва барои кишти микроканалҳои бо ECM пӯшонидашудаи gut on-chip ё воридҳои Transwell истифода шуданд. Вақте ки ҳуҷайраҳо якҷоя мешаванд (>95% фарогирӣ дар колбаҳо), ҳуҷайраҳои Caco-2 (байни гузаргоҳҳои 10 ва 50) дар колбаҳои Т-парваришшуда барои тайёр кардани суспензияҳои ҳуҷайраҳои ҷудошуда бо моеъи трипсинизатсия ҷамъоварӣ карда мешаванд (қуттии 2). Органоидҳои рӯдаи инсон аз биопсияҳои рӯда ё резексияи ҷарроҳӣ дар гунбазҳои скаффоли Matrigel дар табақҳои 24-чоҳӣ парвариш карда шуданд, то микромуҳити сохториро дастгирӣ кунанд. Муҳити дорои морфогенҳои муҳим (ба монанди Wnt, R-spondin ва Noggin) ва омилҳои афзоиш, ки тавре ки дар Қуттии 3 тавсиф шудааст, омода карда шуда буданд, ҳар рӯзи дигар то он даме ки органоидҳо то ~500 мкм диаметри калон шаванд, илова карда мешуд. Органоидҳои пурра парваришёфта ҷамъоварӣ ва ҷудо карда мешаванд. ба ҳуҷайраҳои алоҳида барои кишт кардан ба рӯда ё трансвелл дар чип (қуттии 5). Тавре ки мо қаблан хабар дода будем, онро мувофиқи намуди беморӣ12,13 (масалан, колити захмӣ, бемории Крон, саратони рӯдаи рост ё донори муқаррарӣ), макони осеб (масалан, осеб ё минтақаи осебнадида) ва ҷойгиршавии меъдаву рӯда дар роҳ (масалан, рӯдаи дувоздаҳ, ҷежунум, илеум, рӯдаи корон, рӯдаи ғафс ё росткунҷа) фарқ кардан мумкин аст. Мо дар қуттии 5 протоколи оптимизатсияшударо барои парвариши органоидҳои рӯдаи рост (колоидҳо) пешниҳод менамоем, ки одатан консентратсияи баланди морфогенҳоро нисбат ба органоидҳои рӯдаи борик талаб мекунанд.
a, Ҷараёни корӣ барои индуксияи морфогенези рӯда дар чипи рӯда. Дар ин протокол эпителияи рӯдаи инсон Caco-2 ва органоидҳои рӯда барои нишон додани морфогенези сеченака истифода мешаванд. Ҳуҷайраҳои эпителиалии ҷудошуда дар дастгоҳи омодашудаи gut-on-a-chip (омодасозии чип) шинонда шуданд. Пас аз он ки ҳуҷайраҳо дар рӯзи 0 (D0) ба мембранаи сӯрохии PDMS шинонда (шинонда) ва пайваст (пайваст) карда шуданд, ҷараёни апикалӣ (AP) оғоз ва дар тӯли 2 рӯзи аввал нигоҳ дошта мешавад (ҷараён, AP, D0-D2). Ҷараёни базолатералӣ (BL) инчунин дар баробари ҳаракатҳои дарозкунии даврӣ (кашиш, ҷараён, AP ва BL) ҳангоми ташаккули як қабати пурраи 2D оғоз мешавад. Морфогенези сеченака дар рӯда пас аз 5 рӯзи парвариши микрофлюидӣ худ аз худ ба амал омад (морфогенез, D5). Тасвирҳои контрасти фаза морфологияи намояндагии ҳуҷайраҳои Caco-2-ро дар ҳар як марҳилаи таҷрибавӣ ё нуқтаи вақт нишон медиҳанд (графики сутунӣ, 100 µm). Чор диаграммаи схематикӣ, ки каскадҳои мувофиқи морфогенези рӯдаро нишон медиҳанд (боло рост). Тирҳои хаткашида дар схема самти ҷараёни моеъро нишон медиҳанд.b, Тасвири SEM, ки топологияи сатҳи эпителияи 3D Caco-2-и муқарраршударо нишон медиҳад (чап). Дарҷшуда минтақаи калоншударо нишон медиҳад (қуттии хаткашидаи сафед) микровиллиҳои барқароршударо дар қабати 3D Caco-2 нишон медиҳад (рост).c, Намуди уфуқии пеши Caco-2-и муқарраршуда 3D, клаудин (ZO-1, сурх) ва мембранаҳои сарҳадии хасуи пайваста бо нишонаи F-актин (сабз) ва ядроҳо (кабуд) нишон дода шудааст. Тасвири конфокалии иммунофлуоресцентии ҳуҷайраҳои эпителиалӣ дар чипҳои рӯда. Тирҳое, ки ба схемаи миёна ишора мекунанд, макони ҳамвории фокусиро барои ҳар як намуди конфокалӣ нишон медиҳанд.d, Ҷараёни вақти тағйироти морфологӣ дар органоидҳое, ки дар чип парвариш карда шудаанд, ки бо микроскопияи контрасти фазавӣ дар рӯзҳои 3, 7, 9, 11 ва 13 ба даст оварда шудаанд. Дарҷшуда (рости боло) бузургии баланди тасвири пешниҳодшударо нишон медиҳад.e, Фотомикрографияи DIC-и эпителияи 3D-и органоидӣ, ки дар рӯда дар бурида дар рӯзи 7 гирифта шудааст.f, Тасвирҳои иммунофлуоресценсияи рӯйпӯшшуда, ки нишонгузорҳои ҳуҷайраҳои бунёдӣ (LGR5; арғувонӣ), ҳуҷайраҳои пиёлаи (MUC2; сабз), F-актин (хокистарӣ) ва ядроҳо (кабуд)-ро, ки мутаносибан 3 рӯз дар чипҳои рӯда (чап) ва 13-рӯза (миёна) органоидҳоро дар қабати эпителиалӣ парвариш кардаанд, нишон медиҳанд. Инчунин ба Расми Маълумоти Васеъ нигаред 3, ки сигнализатсияи LGR5-ро бе сигнализатсияи MUC2 нишон медиҳад. Тасвирҳои флуоресценсия, ки сохтори эпителиалии (рост) эпителияи органоидии 3D-ро, ки дар рӯда дар чип бо ранг кардани мембранаи плазма бо ранги CellMask (рост) дар рӯзи 13-уми парвариш ҷойгир шудаанд, нишон медиҳанд. Агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад, андозаи миқёс 50 мкм аст.b Бо иҷозати истинод дубора чоп шудааст.2. Oxford University Press; c Бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудааст.2. Oxford University Press; e ва f бо иҷозати истинод мутобиқ карда шудаанд.12 Тибқи иҷозатномаи Creative Commons CC BY 4.0.
Дар рӯдаи рӯи чип, барои пӯшонидани бомуваффақияти ECM сатҳи гидрофобии мембранаи сӯрохи PDMS-ро тағир додан лозим аст. Дар ин протокол, мо ду усули гуногунро барои тағир додани гидрофобии мембранаҳои PDMS истифода мебарем. Барои парвариши ҳуҷайраҳои Caco-2, фаъолсозии сатҳ танҳо бо табобати ултрабунафш/озон барои коҳиш додани гидрофобии сатҳи PDMS, пӯшонидани ECM ва пайваст кардани ҳуҷайраҳои Caco-2 ба мембранаи PDMS кофӣ буд. Бо вуҷуди ин, парвариши микрофлюиди эпителияи органоидӣ барои ноил шудан ба ҷойгиркунии самараноки сафедаҳои ECM бо истифода аз пайдарпайи полиэтиленимин (PEI) ва глутаральдегид ба микроканалҳои PDMS, функсионализатсияи сатҳӣ дар асоси кимиёвӣ талаб мекунад. Пас аз тағир додани сатҳ, сафедаҳои ECM барои пӯшонидани сатҳи функсионалии PDMS ҷойгир карда шуданд ва сипас ба эпителияи ҷудогонаи органоидӣ ворид карда шуданд. Пас аз пайваст кардани ҳуҷайраҳо, парвариши ҳуҷайраҳои микрофлюидӣ бо ворид кардани танҳо муҳити атроф ба микроканалҳои болоӣ то он даме, ки ҳуҷайраҳо як қабати пурраро ташкил медиҳанд, оғоз мешавад, дар ҳоле ки микроканалҳои поёнӣ шароити статикиро нигоҳ медоранд. Ин усули оптимизатсияшуда барои фаъолсозии сатҳ ва пӯшонидани ECM имкон медиҳад, ки пайвастшавии эпителияи органоидӣ ба индуксия оварда расонад. Морфогенези сеченака дар сатҳи PDMS.
Культураҳои Трансвелл инчунин пеш аз кишти ҳуҷайраҳо пӯшиши ECM-ро талаб мекунанд; аммо, фарҳангҳои Трансвелл барои фаъол кардани сатҳи вурудҳои сӯрохдор қадамҳои мураккаби пеш аз коркардро талаб намекунанд. Барои парвариши ҳуҷайраҳои Caco-2 дар вурудҳои Трансвелл, пӯшиши ECM дар вурудҳои сӯрохдор пайвастшавии ҳуҷайраҳои ҷудошудаи Caco-2-ро (<1 соат) ва ташаккули монеаи пайвастагии зичро (<1-2 рӯз) метезонад. Барои парвариши органоидҳо дар вурудҳои Трансвелл, органоидҳои ҷудогона дар вурудҳои бо пӯшонидашудаи ECM кошта мешаванд, ба сатҳи мембрана пайваст карда мешаванд (<3 соат) ва то он даме, ки органоидҳо як қабати пурра бо якпорчагии монеаро ташкил диҳанд, нигоҳ дошта мешаванд. Культураҳои Трансвелл дар табақҳои 24-чоҳӣ бидуни истифодаи чипҳои гибридӣ анҷом дода мешаванд.
Морфогенези сеченакаи in vitro метавонад бо роҳи татбиқи ҷараёни моеъ ба ҷанбаи базоларии қабати эпителиалии муқарраршуда оғоз шавад. Дар рӯдаи рӯи чип, морфогенези эпителиалӣ вақте оғоз ёфт, ки муҳит ба микроканалҳои болоӣ ва поёнӣ ворид карда шуд (Расми 3a). Тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, ворид кардани ҷараёни моеъ дар қисмати поёнӣ (базоларӣ) барои хориҷ кардани пайвастаи ингибиторҳои морфогени самтӣ муҳим аст. Барои таъмин намудани маводи ғизоӣ ва зардоби кофӣ ба ҳуҷайраҳое, ки дар мембранаҳои сӯрохдор пайваст шудаанд ва стресси буриши люминалиро ба вуҷуд меоранд, мо одатан ҷараёни дугонаро дар рӯда дар чип истифода мебарем. Дар чипҳои гибридӣ, воридҳои Трансвелл, ки дорои моноқабатҳои эпителиалӣ мебошанд, ба чипҳои гибридӣ ворид карда шуданд. Сипас, муҳит дар зери тарафи базоларии вориди сӯрохи Трансвелл тавассути микроканал истифода шуд. Морфогенези рӯда 3-5 рӯз пас аз оғози ҷараёни базоларӣ дар ҳарду платформаи парвариш ба амал омад.
Хусусиятҳои морфологии қабатҳои эпителиалии сеченакали микромуҳандисӣ метавонанд бо истифода аз усулҳои гуногуни тасвирӣ, аз ҷумла микроскопияи контрасти фазавӣ, микроскопияи контрасти интерференсиалӣ (DIC), SEM ё микроскопияи конфокалии иммунофлуоресцентӣ таҳлил карда шаванд (Расми 3 ва 4). Тасвири контрасти фазавӣ ё DIC-ро метавон дар вақти дилхоҳ ҳангоми парвариш барои назорат кардани шакл ва баромадани қабатҳои эпителиалии сеченака ба осонӣ анҷом дод. Аз сабаби шаффофияти оптикии PDMS ва плёнкаҳои полиэстерӣ, ҳам платформаҳои чипи рӯда ва ҳам гибридӣ метавонанд тасвири вақти воқеиро дар ҷой бидуни ниёз ба қисмбандӣ ё ҷудо кардани дастгоҳ таъмин кунанд. Ҳангоми анҷом додани тасвири иммунофлуоресцентӣ (Расми 1, 3c, f ва 4b, c), ҳуҷайраҳо одатан бо 4% (wt/vol) параформальдегид (PFA), баъдан Triton X-100 ва 2% (wt/vol)) албумини зардоби гов (BSA), бо тартиб фиксатсия карда мешаванд. Вобаста ба намуди ҳуҷайра, фиксаторҳои гуногун, гузарандаҳо ва агентҳои блоккунанда метавонанд истифода шаванд. истифода мешаванд. Антителоҳои ибтидоӣ, ки ба маркерҳои ҳуҷайра ё минтақа вобастаанд, барои муайян кардани ҳуҷайраҳои дар ҷои худ дар чип иммобилизатсияшуда истифода мешаванд, сипас антителоҳои дуюмдараҷа дар якҷоягӣ бо ранги муқобил, ки ба ядро ​​(масалан, индоли 4',6-диамидино-2-фенилен), DAPI) ё F-актин (масалан, фаллоидини бо флуоресцентӣ нишонгузорӣшуда) нигаронида шудаанд. Тасвири зиндаи флуоресценсия инчунин метавонад дар ҷои худ барои муайян кардани истеҳсоли луоб (Расми 1, "Табақабандии ҳуҷайра" ва "Физиологияи рӯда"), мустамликадории тасодуфии ҳуҷайраҳои микробӣ (Расми 1, "Ҳампарвариши мизбон-микроб"), ҷалби ҳуҷайраҳои иммунӣ (Расми 1, "Моделсозии беморӣ") ё контурҳои морфологияи эпителиалии сеченака (Расми 3c, f ва 4b,c) анҷом дода шавад. Ҳангоми тағир додани рӯда дар чип барои ҷудо кардани қабати болоӣ аз қабати микроканалии поёнӣ, тавре ки дар истинод тавсиф шудааст. Тавре ки дар расми 2 нишон дода шудааст, морфологияи эпителиалии сеченака ва инчунин микровиллиҳо дар сарҳади хасуи апикалӣ. метавонад бо истифода аз SEM тасаввур карда шавад (Расми 3b). Ифодаи нишондиҳандаҳои дифференсиатсияро метавон бо роҳи анҷом додани секвенсияи миқдории PCR5 ё РНК-и якҳуҷайра арзёбӣ кард. Дар ин ҳолат, қабатҳои сеченака ҳуҷайраҳои эпителиалӣ, ки дар чипҳои рӯда ё чипҳои гибридӣ парвариш карда мешаванд, бо роҳи трипсинизатсия ҷамъоварӣ карда мешаванд ва сипас барои таҳлили молекулавӣ ё генетикӣ истифода мешаванд.
a, Ҷараёни корӣ барои индуксияи морфогенези рӯда дар чипи гибридӣ. Дар ин протокол Caco-2 ва органоидҳои рӯда барои нишон додани морфогенези сеченака дар платформаи чипи гибридӣ истифода мешаванд. Ҳуҷайраҳои эпителиалии ҷудошуда дар варақаҳои омодашудаи Трансвелл шинонда шуданд (омодакунии TW; ба расми зер нигаред). Пас аз он ки ҳуҷайраҳо дар варақаҳои Трансвелл шинонда шуданд (тухм карда шуданд) ва ба мембранаҳои полиэстер пайваст карда шуданд, ҳамаи ҳуҷайраҳо дар шароити статикӣ парвариш карда шуданд (фарҳанги TW). Пас аз 7 рӯз, як варақаи ягонаи Трансвелл, ки дорои як қабати 2D ҳуҷайраҳои эпителиалӣ буд, ба чипи гибридӣ барои ворид кардани ҷараёни базолатералӣ (Flow, BL) муттаҳид карда шуд, ки дар ниҳоят ба тавлиди қабати эпителиалии сеченака (морфогенез) оварда расонд. Микрографҳои контрасти фаза, ки хусусиятҳои морфологии ҳуҷайраҳои эпителиалии узвҳои инсонро, ки аз донори муқаррарии болораванда (хати C103) дар ҳар як марҳилаи таҷрибавӣ ё нуқтаи вақт ба даст омадаанд, нишон медиҳанд. Схемаҳо дар қабатҳои болоӣ конфигуратсияи таҷрибавиро барои ҳар як марҳила нишон медиҳанд.b, Чипҳои гибридӣ (схемаи чап) метавонанд ба морфогенези сеченакаи ҳуҷайраҳои эпителиалии органоид бо манзараҳои микроскопияи конфокалии аз боло ба поён, ки дар Z-и гуногун гирифта шудаанд, оварда расонанд. мавқеъҳо (боло, миёна ва поён; ба схемаи рост ва хатҳои нуқтадор нигаред). хусусиятҳои морфологии возеҳро нишон доданд. F-актин (кабудранг), ядро ​​(хокистарӣ).c, Микрографҳои конфокалии флуоресцентӣ (намоиши кунҷи 3D)-и ҳуҷайраҳои эпителиалии аз органоид ҳосилшуда, ки дар Transwell статикӣ (TW; дар дохили қуттии сафеди рахдор ҷойгир карда шудааст) дар муқоиса бо чипи гибридӣ (калонтарин акси пурра) парвариш карда шудаанд, мутаносибан морфологияи 2D ва 3D-ро муқоиса мекунанд. Як ҷуфт намудҳои буриши амудии 2D (дар кунҷи болоии рост ҷойгир карда шудааст; "XZ") инчунин хусусиятҳои 2D ва 3D-ро нишон медиҳанд. Сатри миқёс, 100 µm.c Бо иҷозати истинод дубора чоп шудааст.4. Elsevier.
Назоратҳоро метавон бо парвариши ҳамон ҳуҷайраҳо (Caco-2 ё ҳуҷайраҳои эпителиалии органоидии рӯда) ба қабатҳои дученака дар шароити анъанавии парвариши статикӣ омода кард. Қобили зикр аст, ки кам шудани миқдори маводи ғизоӣ метавонад аз сабаби ҳаҷми маҳдуди микроканалҳо (масалан, ~4 µL дар канали болоӣ дар тарҳи аслии gut-chip) ба вуҷуд ояд. Аз ин рӯ, морфологияи эпителиалиро пеш аз ва баъд аз истифодаи ҷараёни базолатералӣ низ муқоиса кардан мумкин аст.
Раванди литографияи нарм бояд дар як ҳуҷраи тоза анҷом дода шавад. Барои ҳар як қабати чип (қабатҳои болоӣ ва поёнӣ ва мембранаҳо) ва чипҳои гибридӣ, фотониқобҳои гуногун истифода ва дар пластинаҳои алоҳидаи силикон сохта шуданд, зеро баландии микроканалҳо гуногун буданд. Баландии мақсадноки микроканалҳои болоӣ ва поёнии рӯда дар чип мутаносибан 500 мкм ва 200 мкм мебошад. Баландии мақсадноки канали чипи гибридӣ 200 мкм аст.
Вафли силиконии 3-дюймаро дар зарфи бо ацетон пуршуда ҷойгир кунед. Табақро барои 30 сония оҳиста гардонед, сипас вафлиро дар ҳаво хушк кунед. Вафлиро ба табақчаи дорои IPA интиқол диҳед ва сипас табақро барои 30 сония барои тоза кардан чарх занед.
Барои ба ҳадди аксар расонидани тозакунии боқимондаҳои органикӣ аз сатҳи пластинаи кремний, маҳлули пиранья (омехтаи пероксиди гидроген ва кислотаи консентратсияшудаи сулфат, 1:3 (ҳаҷм/ҳаҷм))-ро ихтиёрӣ истифода бурдан мумкин аст.
Маҳлули Пиранья хеле зангзананда аст ва гармӣ ба вуҷуд меорад. Чораҳои иловагии бехатарӣ заруранд. Барои партофтани партовҳо, бигзор маҳлул хунук шавад ва ба зарфи тоза ва хушки партов интиқол дода шавад. Зарфҳои дуюмдараҷаро истифода баред ва зарфҳои партовро дуруст нишонагузорӣ кунед. Лутфан, барои расмиёти муфассалтар дастурҳои бехатарии иншоотро риоя кунед.
Вафлиҳоро бо гузоштани онҳо дар табақи гармидиҳии 200°C барои 10 дақиқа хушк кунед. Пас аз хушк кардан, вафлиро панҷ маротиба дар ҳаво барои хунук шудан ҷунбонданд.
Ба маркази лавҳаи тозашудаи силиконии тақрибан 10 г фоторезисти SU-8 2100 резед. Бо истифода аз пинцет, фоторезистро ба таври баробар дар лавҳа паҳн кунед. Баъзан лавҳаро дар табақи гармидиҳандаи 65°C ҷойгир кунед, то фоторезист камтар часпак ва паҳн карданаш осонтар бошад. Вафлиро мустақиман дар табақи гармидиҳанда нагузоред.
SU-8 бо истифода аз рӯйпӯши чархзананда дар пластина баробар тақсим карда шуд. Гардиши воридшавандаи SU-8-ро барои 5-10 сония барномарезӣ кунед, то дар 500 rpm бо суръатбахшии 100 rpm/s паҳн шавад. Гардиши асосиро барои намунагирии ғафсии 200 мкм дар 1500 rpm муқаррар кунед ё ғафсии 250 мкм-ро ба даст оред (ба қабати болоии рӯда дар чип баландии 500 мкм медиҳад; ба "Қадамҳои муҳим" дар зер нигаред), ки бо суръатбахшии 300 rpm/s дар 30 сония дар 1200 rpm муқаррар карда мешавад.
Суръати чархзании асосиро мувофиқи ғафсии мақсадноки намунаи SU-8 дар пластинаи силикон танзим кардан мумкин аст.
Барои сохтани нақшҳои SU-8 бо баландии 500 мкм барои қабати болоии рӯда дар чип, рӯйпӯши чархзанӣ ва қадамҳои пухтани нарми ин қуттӣ (қадамҳои 7 ва 8) пайдарпай такрор карда шуданд (нигаред ба қадами 9), то ду қабати 250 мкм - қабати ғафси SU-8, ки онро метавон дар қадами 12-и ин қуттӣ қабат-қабат гузошт ва бо таъсири ултрабунафш пайваст кард, ки қабати 500 мкм баландӣ ба вуҷуд овард.
Вафлиҳои бо рӯйпӯши SU-8-ро бо эҳтиёт дар табақи гарм дар ҳарорати 65°C барои 5 дақиқа ҷойгир карда, сипас танзимотро ба 95°C иваз кунед ва барои 40 дақиқаи дигар инкубатсия кунед.
Барои ноил шудан ба баландии 500 мкм намунаи SU-8 дар микроканали болоӣ, қадамҳои 7 ва 8-ро такрор кунед, то ду қабати SU-8-и ғафсии 250 мкм-ро ба вуҷуд оред.
Бо истифода аз танзимкунандаи ниқоби ултрабунафш, санҷиши чароғро мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда барои ҳисоб кардани вақти таъсири пластина анҷом диҳед. (вақти таъсири, мс) = (миқдори таъсири, мҶ/см2)/(қувваи чароғ, мВт/см2).
Пас аз муайян кардани вақти экспозиция, ниқоби фотониқобро ба ҷойгоҳи ниқоби ҳамоҳангкунандаи ниқоби ултрабунафш гузоред ва ниқоби фотониқобро ба лавҳаи пӯшонидашудаи SU-8 гузоред.
Сатҳи чопшудаи фотониқобро мустақиман дар тарафи пӯшонидашудаи SU-8-и вафли силикон ҷойгир кунед, то парокандагии ултрабунафшро ба ҳадди ақалл расонед.
Вафли ва фотониқоби бо пӯшонидашудаи SU-8-ро ба таври амудӣ ба 260 мҶ/см2 нури ултрабунафш барои вақти муайяншудаи таъсир гузоред (нигаред ба қадами 10-и ин қуттӣ).
Пас аз таъсири ултрабунафш, вафлиҳои кремнийи бо пӯшонидашудаи SU-8 дар ҳар як табақи гарм дар ҳарорати 65°C барои 5 дақиқа ва 95°C барои 15 дақиқа пухта шуданд, то нақшҳо бо баландии 200 мкм сохта шаванд. Вақти пас аз пухтанро дар ҳарорати 95°C то 30 дақиқа дароз кунед, то нақшҳо бо баландии 500 мкм сохта шаванд.
Таҳиягарро ба зарфи шишагӣ мерезанд ва вафли пухташударо дар зарф мегузоранд. Ҳаҷми таҳиягари SU-8 вобаста ба андозаи табақи шишагӣ метавонад фарқ кунад. Боварӣ ҳосил кунед, ки барои пурра тоза кардани SU-8-и фошнашуда аз миқдори кофии таҳиягари SU-8 истифода баред. Масалан, ҳангоми истифодаи зарфи шишагии диаметри 150 мм бо иқтидори 1 литр, тақрибан 300 мл таҳиягари SU-8 истифода баред. Қолабро барои 25 дақиқа бо гардиши нарм таҳия кунед.
Қолаби таҳияшударо бо тақрибан 10 мл маҳлули тару тоза бишӯед ва баъдан IPA-ро бо пошидани маҳлул бо истифода аз пипетка истифода баред.
Пластинаро дар тозакунандаи плазма ҷойгир кунед ва онро дар плазмаи оксиген (газҳои атмосфера, фишори мақсаднок 1 × 10−5 Торр, қувват 125 Вт) барои 1,5 дақиқа нигоҳ доред.
Вафлиро дар эксикатори вакуумӣ бо слайди шишагин дар дохилаш ҷойгир кунед. Вафлиҳо ва слайдҳоро метавон паҳлӯ ба паҳлӯ ҷойгир кард. Агар эксикатори вакуумӣ бо табақ ба якчанд қабат тақсим карда шавад, слайдҳоро дар камераи поёнӣ ва вафлиҳоро дар камераи болоӣ ҷойгир кунед. 100 мкл маҳлули трихлор (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силанро ба слайди шишагин резед ва барои силанизатсия вакуумро истифода баред.
Як шишачаи ҳуҷайраҳои яхкардашудаи Caco-2-ро дар ваннаи оби 37°C об кунед, сипас ҳуҷайраҳои обшударо ба колбаи T75, ки дорои 15 мл муҳити пешакӣ гармшудаи Caco-2 дар ҳарорати 37°C мебошад, интиқол диҳед.
Барои гузаштани ҳуҷайраҳои Caco-2 дар тақрибан 90% омехташавӣ, аввал муҳити гарми Caco-2, PBS ва 0.25% трипсин/1 мМ EDTA-ро дар ваннаи оби 37°C гарм кунед.
Муҳити зистро бо роҳи аспиратсияи вакуумӣ сӯрох кунед. Ҳуҷайраҳо ду маротиба бо 5 мл PBS гарм бо такрори аспиратсияи вакуумӣ ва илова кардани PBS-и нав бишӯед.