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O le morphogenesis o le manava o le tagata e faʻatuina ai foliga o le crypt-villus o le 3D epithelial microarchitecture ma le faʻatulagaina o le avanoa. O lenei fausaga tulaga ese e manaʻomia e tausia ai le homeostasis o le manava e ala i le puipuia o le stem cell niche i le basal crypt mai exogenous microbial antigens ma a latou metabolites. E le gata i lea, o le intestinal villi ma le secreting mucus e tuʻuina atu ai sela epithelial ua eseese galuega ma se pa puipui i luga o le mucosal surface o le manava. O le mea lea, o le toe faia o fausaga epithelial 3D e taua tele mo le fausiaina o in vitro gut models. E taua tele, o le organic mimetic gut-on-a-chip e mafai ona faʻaosofia ai le 3D morphogenesis faʻafuaseʻi o le intestinal epithelium faʻatasi ai ma galuega faʻaletino ma biomechanics faʻaleleia. O iinei, matou te tuʻuina atu se protocol e mafai ona toe gaosia e faʻaosofia ai le morphogenesis o le manava i totonu o le manava i luga o se microfluidic chip faʻapea foʻi ma se Transwell embedded hybrid chip. Matou te faʻamatalaina auala auiliili mo le gaosiga o masini, totoina o Caco-2 poʻo intestinal organoid epithelial cells i tulaga masani faʻapea foʻi ma luga o se microfluidic platform, faʻaosofia o le 3D morphogenesis, ma le faʻamatalaina o le 3D epithelia ua faʻatuina e faʻaaoga ai le tele o auala faʻataʻitaʻi. O lenei protocol E ausia ai le toe faʻafouina o le fausaga o le manava e ala i le puleaina o le tafe o le vai basolateral mo le 5 aso. O la matou metotia o le morphogenesis in vitro e faʻaaogaina ai le mamafa o le shear ma le gaioiga faʻamekanika e talafeagai ma le tino ma e le manaʻomia ai le faʻainisinia poʻo le faʻaogaina o sela, lea e ono sili atu nai lo isi metotia o loʻo iai nei. Matou te vaʻaia o la matou faʻatulagaga ua fautuaina e mafai ona i ai ni aafiaga lautele mo le nuʻu suʻesuʻega faʻafomaʻi, ma maua ai se metotia e toe faʻafouina ai vaega epithelial o le intestinal 3D in vitro mo faʻaoga faʻafomaʻi, falemaʻi, ma vailaʻau.
Ua faʻaalia i faʻataʻitaʻiga e mafai e sela Caco-2 epithelial o le intestinal o loʻo totoina i totonu o le gut-on-a-chip1,2,3,4,5 poʻo masini bilayer microfluidic6,7 ona faia ni suiga faʻafuaseʻi i le 3D morphogenesis in vitro e aunoa ma se malamalamaga manino i le faiga o loʻo i lalo. I la matou suʻesuʻega talu ai nei, na matou iloa ai o le aveeseina o mea e tetee i le morphogen e faʻasaʻolotoina mai le basolateral mai masini faʻatoʻaga e manaʻomia ma lava lea e faʻaosofia ai le 3D epithelial morphogenesis in vitro, lea ua faʻaalia e Caco-2 ma organoids intestinal e maua mai i le maʻi. Sa fa'amaoniaina sela epithelial. I lenei su'esu'ega, na matou taula'i fa'apitoa i le gaosiga o sela ma le tufatufaina atu o le malosi o se tagata e tetee i le Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), i totonu o masini gut-on-a-chip ma masini microfluidic ua suia o lo'o i ai ni mea fa'apipi'i Transwell, ua ta'ua o le "Hybrid Chip". Matou te fa'aalia o le fa'aopoopoina o mea e tetee i le Wnt mai fafo (e pei o le DKK-1, Wnt repressor 1, protein e feso'ota'i ma le frizzled 1, po'o le Soggy-1) i le gut i luga o le chip e taofia ai le morphogenesis pe fa'alavelaveina le vaega epithelial 3D ua uma ona fa'atulagaina, ma fa'ailoa mai ai o le atuatuvale e tetee i le taimi o le totoina e mafua ai le morphogenesis o le intestinal i vitro. O le mea lea, o se auala aoga e ausia ai le morphogenesis malosi i le epithelial interface o le ave'esea pe fa'atumauina itiiti lava le maualuga o mea e tetee i le Wnt i totonu o le vaega basolateral e ala i le fa'amama malosi (e.g., i totonu o le gut-on-a-chip po'o le hybrid-on-a-chip platforms) po'o le diffusion. Basolateral media (e.g., mai mea fa'apipi'i Transwell i totonu o vaieli basolateral tetele i totonu o vaieli).
I totonu o lenei protocol, matou te tuʻuina atu se metotia auiliili mo le fausiaina o microdevices gut-on-a-chip ma Transwell-insertable hybrid chips (laasaga 1-5) e faʻatupu ai sela epithelial intestinal i luga o membrane porous e faʻavae i le polydimethylsiloxane (PDMS) (laasaga 6A, 7A, 8, 9) poʻo membrane polyester o Transwell inserts (laasaga 6B, 7B, 8, 9) ma faʻaosofia ai le 3D morphogenesis in vitro (laasaga 10). Na matou faʻailoaina foʻi foliga o le sela ma le molecular e faʻaalia ai le histogenesis faʻapitoa o aano ma le lineage-dependent cellular differentiation e ala i le faʻaaogaina o le tele o auala faʻataʻitaʻi (laasaga 11-24). Matou te faʻaosofia le morphogenesis e faʻaaoga ai sela epithelial intestinal o le tagata, e pei o le Caco-2 poʻo organoids intestinal, i ni faʻatulagaga faʻatupuina se lua ma faʻamatalaga faʻapitoa e aofia ai le suiga o luga o membrane porous, fatuina o 2D monolayers, ma le intestinal biochemical ma le Reproduction o le biomechanical microenvironment.in vitro. Ina ia faʻaosofia le 3D morphogenesis mai 2D epithelial monolayers, na matou aveeseina morphogen antagonists i foliga faʻatupuina uma e lua e ala i le tafe le ala o fesootaiga i totonu o le vaega basolateral o le aganuu. I le iuga, matou te tuʻuina atu se faʻataʻitaʻiga o le aoga o se vaega epithelial 3D e mafai ona toe faʻafouina e mafai ona faʻaaogaina e faʻataʻitaʻi ai le tuputupu aʻe o le epithelial e faʻalagolago i le morphogen, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, ma probiotic-based therapies Example.
Atonu e aoga la matou fa'atulagaga mo le tele o saienitisi i su'esu'ega fa'avae (e pei o le intestinal mucosal biology, stem cell biology, ma le developmental biology) ma su'esu'ega fa'aoga (e pei o le preclinical drug testing, fa'ata'ita'iga o fa'ama'i, tissue engineering, ma gastroenterology). Ona o le toe gaosia ma le malosi o la matou fa'atulagaga e fa'aosofia ai le 3D morphogenesis o le intestinal epithelium in vitro, matou te va'aia o la matou fuafuaga fa'apitoa e mafai ona fa'asalalauina i tagata o lo'o su'esu'eina le fa'agasologa o le fa'ailoilo o sela i le taimi o le atina'eina o le intestinal, toe fa'afouina po'o le homeostasis. E le gata i lea, e aoga la matou fa'atulagaga mo le su'esu'eina o fa'ama'i i lalo o le tele o siama pipisi e pei o le Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 po'o le Vibrio cholerae. E aoga fo'i le aofia o fa'ama'i ma le pathogenesis o fa'ama'i. O le fa'aaogaina o se faiga microphysiology o le gut i luga o le chip e mafai ona fa'atagaina ai le fa'aputuga fa'atasi longitudinal 10 ma le iloiloga mulimuli ane o le puipuiga o le talimalo, tali atu o le puipuiga ma le toe fa'aleleia o manu'a e feso'ota'i ma pathogen i le gastrointestinal (GI) tract 11. O isi fa'aletonu o le GI e feso'ota'i ma le leaky gut syndrome, celiac disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, pouchitis, po'o le irritable bowel syndrome e mafai ona fa'ata'ita'iina pe a saunia vaega epithelial intestinal 3D e fa'aaoga ai vaega epithelial intestinal 3D a le ma'i, o nei fa'ama'i e aofia ai le villous atrophy, crypt shortening, mucosal damage, po'o le fa'aleagaina o le epithelial barrier. Biopsy po'o le stem cell-derived intestinal organoids 12,13. Ina ia sili atu ona fa'ata'ita'i le faigata tele o le siosiomaga o le fa'ama'i, e mafai e le au faitau ona mafaufau e fa'aopoopo ituaiga sela e talafeagai mo le fa'ama'i, e pei o sela mononuclear toto peripheral o le ma'i (PBMCs), i fa'ata'ita'iga o lo'o i ai le 3D intestinal villus-crypt microarchitectures. sela puipuiga fa'apitoa o a'ano, 5.
Talu ai e mafai ona fa'amautu ma va'aia le fausaga o le epithelial 3D e aunoa ma le faiga o le vaevaeina, o tagata matamata o lo'o galulue i le spatial transcriptomics ma le maualuga-resolution po'o le super-resolution imaging atonu e fiafia i la matou fa'afanua o le spatiotemporal dynamics o genes ma porotini i luga o epithelial niches. E fiafia i tekinolosi. Tali atu i microbial po'o immune stimuli. E le gata i lea, o le longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 e fa'amaopoopo ai le homeostasis o le manava e mafai ona fa'atuina i le 3D intestinal mucosal layer e ala i le fa'afaileleina fa'atasi o ituaiga microbial eseese, microbial community po'o fecal microbiota, aemaise lava i le gut-on-a-chip. i totonu o le fausaga. O lenei auala e matuā manaia lava i tagata maimoa o loʻo suʻesuʻeina le mucosal immunology, gastroenterology, human microbiome, culturomics ma clinical microbiology o loʻo sailia le faʻaleleia o le gut microbiota e leʻi faʻaleleia muamua i totonu o le fale suʻesuʻe. Afai e mafai ona fetuʻunaʻi la matou in vitro morphogenesis protocol i scalable culture formats, e pei o multiwell inserts i 24, 96 poʻo le 384 well plates e faʻaauau pea ona faʻatumuina basolateral compartments, e mafai foʻi ona faʻasalalauina le protocol ia i latou o loʻo atiaʻe vailaʻau, biomedical Poʻo le maualuga-throughput screening poʻo le faʻamaoniga mo le alamanuia o meaʻai. I le avea ai o se faʻamaoniga-o-le-mataupu faavae, na matou faʻaalia talu ai nei le mafai ona faʻaaogaina se multiplex high-throughput morphogenesis system scalable i se 24-well plate format. I se faʻaopoopoga, o le tele o oloa organ-on-a-chip ua faʻapisinisi16,17,18. O le mea lea, o le faʻamaoniaina o la matou in vitro morphogenesis method e mafai ona faʻavavevaveina ma ono faʻaaogaina e le tele o fale suʻesuʻe suʻesuʻega, alamanuia poʻo le malo ma ofisa faʻatonutonu e malamalama ai i le toe faʻatulagaina o le cellular o le in vitro gut morphogenesis i le tulaga transcriptomic e suʻe ai vailaʻau poʻo biotherapeutics O le mitiia ma felauaiga o sui tauva fualaau faasaina sa iloiloina e faaaoga ai sui o le manava 3D po o le faaaogaina o faataitaiga o totoga-i-luga-o-le-chip masani po o faapisinisi e iloilo ai le toe gaosia o le faagasologa o le morphogenesis o le manava.
E fa'atapula'aina le aofa'i o fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'i e talafeagai ma tagata ua fa'aaogaina e su'esu'e ai le morphogenesis o le epithelial intestinal, ona o le leai o ni fa'atulagaga e mafai ona fa'atinoina e fa'aosofia ai le 3D morphogenesis i vitro. O le mea moni, o le tele o le malamalama o lo'o iai nei e uiga i le morphogenesis o le gut e fa'avae i luga o su'esu'ega a manu (e pei o le zebrafish20, mice21 po'o moa22). Peita'i, e tele galuega ma tau, e ono fesiligia ai amioga, ma le mea e sili ona taua, e le o fa'amautuina tonu ai faiga o atina'e a tagata. O nei fa'ata'ita'iga e matua fa'atapula'aina fo'i lo latou gafatia e fa'ata'ita'iina i se auala e tele auala e mafai ona fa'alauteleina. O le mea lea, o la matou fa'atulagaga mo le toe fa'afouina o fausaga o a'ano 3D i vitro e sili atu nai lo fa'ata'ita'iga o manu i vivo fa'apea fo'i ma isi fa'ata'ita'iga masani o le 2D cell culture. E pei ona fa'amatalaina muamua, o le fa'aaogaina o fausaga epithelial 3D na mafai ai ona matou su'esu'eina le fa'avasegaina o sela eseese i le crypt-villus axis e tali atu ai i le tele o mucosal po'o le immune stimuli. O vaega epithelial 3D e mafai ona maua ai se avanoa e su'esu'e ai pe fa'apefea ona tauva sela microbial e fausia ai niches spatial ma le evolusione ecological e tali atu ai i mea taua (e pei o vaega i totonu e fa'asaga i vaega i fafo o le mucus, fa'asa'olotoina o le IgA ma antimicrobial peptides). E le gata i lea, o le 3D epithelial morphology e mafai ona faʻatagaina ai i tatou e malamalama i le auala e faʻatulaga ai e le gut microbiota ona nuʻu ma gaosia faʻatasi ai metabolites microbial (e pei o short-chain fatty acids) e faʻatulaga ai le faʻatulagaga o sela ma stem cell niches i totonu o le basal crypts. O nei foliga e mafai ona faʻaalia pe a faʻatuina vaega 3D epithelial i totonu o vitro.
I le fa’aopoopoga i la matou metotia o le fatuina o fausaga epithelial intestinal 3D, e tele auala in vitro. O le fa’ato’aga organoid intestinal o se metotia fa’aonaponei o le inisinia o aano e fa’avae i luga o le totoina o sela autu o le intestinal i lalo o tulaga fa’apitoa o le morphogen23,24,25. Peita’i, o le fa’aaogaina o fa’ata’ita’iga organoid 3D mo le au’ili’iliga o felauaiga po’o le fa’ato’aga fa’atasi a le host-microbiome e masani ona faigata ona o le lumen o le intestinal o lo’o i totonu o le organoid ma, o le mea lea, o le fa’alauiloaina o vaega luminal e pei o sela microbial po’o antigens exogenous e fa’atapula’aina. E mafai ona fa’aleleia le avanoa i lumens organoid e fa’aaoga ai se microinjector,26,27 ae o lenei metotia e fa’alavelave ma faigata ma e mana’omia ai le malamalama fa’apitoa e fa’atino ai. E le gata i lea, o aganu’u organoid masani e tausia i totonu o hydrogel scaffolds i lalo o tulaga tumau e le o atagia sa’o ai le malosi o biomechanics in vivo.
O isi auala e faʻaaogaina e le tele o vaega suʻesuʻe e faʻaaogaina ai faʻavaa hydrogel 3D ua uma ona faʻatulagaina e faʻataʻitaʻi ai le fausaga epithelial o le manava e ala i le faʻatoʻagaina o sela intestinal o le tagata tuʻufua i luga o le gel. Fausia faʻavaa hydrogel e faʻaaoga ai mamanu ua lolomiina 3D, micro-milled, poʻo le lithographically fabricated. O lenei metotia e faʻaalia ai le faʻatulagaga faʻatulagaina o sela epithelial tuʻufua i totonu o le vitro ma le physiologically relevant morphogen gradients, faʻatuina ai se fausaga epithelial maualuga ma le stroma-epithelial crosstalk e ala i le aofia ai o sela stromal i totonu o le faʻavaa. Peitaʻi, o le natura o faʻavaa ua uma ona faʻatulagaina e ono taofia ai le faʻaalia o le faʻagasologa morphogenetic spontaneous lava ia. O nei faʻataʻitaʻiga e le tuʻuina atu ai foʻi le tafe o le luminal poʻo le interstitial, e leai se faʻalavelave shear fluid e manaʻomia e sela intestinal e faia ai le morphogenesis ma maua ai le galuega faʻaletino. O le isi suʻesuʻega talu ai nei na faʻaaogaina ai faʻavaa hydrogel i totonu o se faʻavae microfluidic ma faʻataʻitaʻiga o le epithelial intestinal e faʻaaoga ai metotia laser-etching. O organoids intestinal isumu e mulimuli i mamanu e fausia ai fausaga tubular intestinal, ma e mafai ona toe faʻatulagaina le tafe o le vai intraluminal e faʻaaoga ai se microfluidics module. Peitaʻi, o lenei faʻataʻitaʻiga e le o faʻaalia ai le spontaneous. e le aofia ai foʻi gaioiga faʻa-morphogenetic e le aofia ai gaioiga faʻa-mechanobiological o le manava. O metotia lolomi 3D mai le vaega lava e tasi na mafai ona fatuina ni tamaʻi paipa manava ma ni faiga faʻa-morphogenetic faʻafuaseʻi. E ui i le lavelave o le gaosiga o vaega eseese o le manava i totonu o le paipa, o lenei faʻataʻitaʻiga e leai foʻi se tafega o le vai luminal ma le faʻaleagaina o le masini. E le gata i lea, e ono faʻatapulaʻaina le faʻagaioiga o le faʻataʻitaʻiga, aemaise lava pe a maeʻa le faagasologa o le bioprinting, faʻalavelaveina ai tulaga faʻataʻitaʻi poʻo fegalegaleaiga o le sela i le sela. Nai lo lena, o la matou protocol ua fautuaina e maua ai le morphogenesis faʻafuaseʻi o le manava, le mamafa o le shear e talafeagai i le tino, biomechanics e faʻataʻitaʻi ai le gaioiga o le manava, le mafai ona maua o vaega apical ma basolateral tutoʻatasi, ma le toe faʻafouina o siosiomaga lavelave o meaola o le modularity. O le mea lea, o la matou protocol 3D morphogenesis in vitro e mafai ona maua ai se auala faʻaopoopo e faʻatoʻilalo ai luʻitau o metotia o loʻo iai.
O la matou fa'atulagaga e taula'i atoatoa i le 3D epithelial morphogenesis, fa'atasi ai ma na'o sela epithelial i le fa'ato'aga ma e leai ni isi ituaiga o sela o lo'o siomia ai e pei o sela mesenchymal, sela endothelial, ma sela puipuia. E pei ona fa'amatalaina muamua, o le fatu o la matou fa'atulagaga o le fa'aosofia lea o le epithelial morphogenesis e ala i le aveeseina o morphogen inhibitors o lo'o fa'asalalauina i le itu basolateral o le medium ua fa'aofiina. E ui o le malosi o le modularity o la matou gut-on-a-chip ma le hybrid-on-a-chip e mafai ai ona matou toe faia le undulating 3D epithelial layer, o isi fa'alavelave fa'ale-biological e pei o fegalegaleaiga epithelial-mesenchymal33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ma, i la matou fa'ata'ita'iga, o foliga crypt-villus e fa'ailoa mai ai niches stem cell i basal crypts e tatau ona toe mafaufau i ai. O sela stromal (e pei o fibroblasts) i le mesenchyme e iai se matafaioi taua i le gaosiga o porotini ECM ma le fa'atonutonuina o le intestinal morphogenesis in vivo35,37,38. O le fa'aopoopoina o sela mesenchymal i la matou fa'ata'ita'iga na fa'aleleia atili ai le fa'agasologa o le morphogenetic ma le lelei o le fa'apipi'iina o sela. O le vaega endothelial (e pei o capillaries poʻo lymphatics) e taua tele i le faʻatonutonuina o felauaiga molecular39 ma le faʻafaigaluegaina o sela puipuia40 i le siosiomaga micro gut. E le gata i lea, o vaega o le vasculature e mafai ona fesoʻotaʻi i le va o faʻataʻitaʻiga o aano o se mea e manaʻomia muamua pe a mamanuina faʻataʻitaʻiga o aano e faʻaalia ai fegalegaleaiga e tele-totoga. O le mea lea, atonu e manaʻomia ona aofia ai sela endothelial e faʻataʻitaʻi ai foliga faʻaletino saʻo ma le fofo o le tulaga o totoga. O sela puipuia e maua mai i le maʻi e taua tele foi mo le faʻaalia o tali puipuia masani, faʻaaliga antigen, innate adaptive immune crosstalk, ma le puipuiga faʻapitoa o aano i le tulaga o le faʻataʻitaʻiina o faʻamaʻi o le manava.
O le faʻaaogaina o hybrid chips e sili atu ona faigofie nai lo le gut-on-a-chip auā e faigofie le faʻatulagaina o le masini ma o le faʻaaogaina o Transwell inserts e mafai ai ona faʻateleina le faʻaleleia o le gut epithelium. Peitaʻi, o Transwell inserts e maua faʻapisinisi ma polyester membranes e le o ni elastic ma e le mafai ona faʻataʻitaʻi ni gaioiga e pei o le peristaltic. E le gata i lea, o le apical compartment o le Transwell insert na tuʻuina i totonu o le hybrid chip na tumau pea le tumau e aunoa ma se shear stress i le itu apical. E manino lava, o meatotino tumau i totonu o le apical compartment e seasea ona mafai ai ona faʻateleina le faʻaleleia o siama i totonu o hybrid chips mo se taimi umi. E ui e mafai ona tatou faʻaosofia malosi le 3D morphogenesis i Transwell inserts pe a faʻaaogaina hybrid chips, o le le lava o biomechanics talafeagai faʻaletino ma le tafe o le apical fluid e ono faʻatapulaʻaina ai le aoga o hybrid chip platforms mo faʻaoga e ono mafai.
E le'i atoatoa ona fa'amautuina le toe fa'aleleia atoa o le crypt-villus axis o le tagata i totonu o le gut-on-a-chip ma le hybrid-on-a-chip cultures. Talu ai ona amata le morphogenesis mai se epithelial monolayer, e le o taimi uma e maua ai e 3D microarchitectures le tutusa o le morphology ma crypts i vivo. E ui ina matou fa'amatalaina le faitau aofa'i o sela o lo'o fa'atupula'ia e lata ane i le basal crypt domain i le microengineered 3D epithelium, ae e le'i manino le fa'avasegaina o vaega o le crypt ma villous. E ui o alavai maualuga i luga o le chip e mafua ai le maualuga o le microengineered epithelium, ae o le maualuga maualuga e fa'atapula'aina pea i le ~300–400 µm. O le loloto moni o crypts o le tagata i totonu o le tama'i ma le tele o intestinal e ~135 µm ma le ~400 µm, i le fa'asologa, ma o le maualuga o le tama'i intestinal villi e ~600 µm41.
Mai se vaaiga o ata, o le ata sili ona manino i totonu o le 3D microarchitectures e ono fa'atapula'aina i le manava i luga o se chip, talu ai o le mamao faigaluega e mana'omia mai le tioata fa'amoemoe i le vaega epithelial e tusa ma ni nai milimita. Ina ia foia lenei fa'afitauli, atonu e mana'omia se mea mamao. E le gata i lea, o le faia o vaega manifinifi mo le sauniuniga o fa'ata'ita'iga ata e faigata ona o le maualuga o le elasticity o le PDMS. E le gata i lea, talu ai o le microfabrication o le manava i luga o se chip e aofia ai le pipii tumau i le va o vaega ta'itasi, e matua faigata lava ona tatala pe aveese le vaega pito i luga e su'esu'e ai le fausaga o le vaega epithelial. Mo se fa'ata'ita'iga, e ala i le fa'aogaina o se scanning electron microscope (SEM).
O le hydrophobicity o le PDMS ua avea ma mea e fa'atapula'aina ai su'esu'ega fa'avae i luga o le microfluidic e feagai ma molela'au laiti hydrophobic, talu ai e mafai e le PDMS ona fa'apipi'i fa'apitoa ia molela'au hydrophobic. E mafai ona mafaufauina isi mea e sui ai le PDMS fa'atasi ai ma isi mea polymeric. I se isi itu, o le suiga o le luga o le PDMS (e pei o le ufiufi i mea lipophilic 42 po'o le poly(ethylene glycol) 43) e mafai ona mafaufauina e fa'aitiitia ai le adsorption o molela'au hydrophobic.
Ma le mea mulimuli, o la matou metotia e leʻi faʻamatalaina lelei i tulaga o le tuʻuina atu o se suʻesuʻega maualuga-throughput poʻo se faʻavae faʻataʻitaʻi faigofie ona faʻaaogaina "tasi-tele-e fetaui-mo tagata uma". O le faʻatulagaga o loʻo iai nei e manaʻomia ai se pamu syringe mo masini taʻitasi, lea e faʻaaogaina ai le avanoa i totonu o se incubator CO2 ma puipuia ai faʻataʻitaʻiga tetele. O lenei tapulaʻa e mafai ona faʻaleleia atili e ala i le faʻalauteleina o faʻatulagaga faʻatoʻaga fou (e pei o, 24-well, 96-well, poʻo le 384-well porous inserts e mafai ai ona faʻaauau pea ona toe faʻatumu ma aveese faʻasalalauga basolateral).
Ina ia faʻaosofia le 3D morphogenesis o le epithelium intestinal o le tagata i totonu o le vitro, na matou faʻaaogaina ai se masini intestinal microfluidic chip o loʻo i ai ni microchannels se lua e tutusa ma se membrane porous elastic i le va e fausia ai se lumen-capillary interface. Matou te faʻaalia foʻi le faʻaaogaina o se masini microfluidic e tasi le auala (o se hybrid chip) e maua ai le tafe faifai pea o le basolateral i lalo o vaega epithelial polarized ua totoina i luga o Transwell inserts. I fausaga uma e lua, o le morphogenesis o le tele o sela epithelial intestinal o le tagata e mafai ona faʻaalia e ala i le faʻaaogaina o le faʻatonuga o le tafe e aveese ai morphogen antagonists mai le basolateral compartment. O le faiga atoa o faʻataʻitaʻiga (Ata 1) e aofia ai vaega e lima: (i) microfabrication o le gut chip poʻo le Transwell insertable hybrid chip (laʻasaga 1-5; Pusa 1), (ii) sauniuniga o sela epithelial intestinal (Caco-2 cells) poʻo organoids intestinal o le tagata; pusa 2-5), (iii) fa'ato'aga o sela epithelial intestinal i luga o fasi intestinal po'o fasi hybrid (la'asaga 6-9), (iv) fa'aosofia o le 3D morphogenesis i totonu o le vitro (la'asaga 10) ma le (v)) e fa'ailoa ai le 3D epithelial microstructure (la'asaga 11-24). Mulimuli ane, o se vaega fa'atonutonu talafeagai (o le a talanoaina atili i lalo) na mamanuina e fa'amaonia ai le aoga o le in vitro morphogenesis e ala i le fa'atusatusaina o le epithelial morphogenesis i fa'atonuga fa'apitoa, fa'avaitaimi, fa'atulagaina, po'o fa'atonuga fa'atino.
Matou te faʻaaogaina ni faʻavae eseese se lua o le faʻatoʻaga: gut-on-a-chip ma auala saʻo poʻo auala fenumiai e le o laina, poʻo ni chips hybrid o loʻo i ai ni faʻaofi Transwell (TW) i totonu o se masini microfluidic, na gaosia e pei ona faʻamatalaina i le Pusa 1, ma le laʻasaga 1 -5. "Fausiaina o le Masini" o loʻo faʻaalia ai laʻasaga autu i le faia o se chip e tasi poʻo se chip hybrid. "Faʻatoʻaga o Sela Epithelial o le Intestinal o le Tagata" o loʻo faʻamatalaina ai le puna o le sela (Caco-2 poʻo organoids o le intestinal o le tagata) ma le faiga o le faʻatoʻaga na faʻaaogaina i lenei protocol. "In vitro morphogenesis" o loʻo faʻaalia ai laʻasaga lautele e faʻatoʻaga ai Caco-2 poʻo sela epithelial e maua mai i organoid i luga o se chip intestinal poʻo luga o faʻaofi Transwell o se chip hybrid, sosoo ai ma le faʻaosofia o le 3D morphogenesis ma le fausiaina o se fausaga epithelial ua faʻaalia. O le numera o laʻasaga o le polokalame poʻo le numera o le pusa o loʻo faʻaalia i lalo o aū taʻitasi. O le talosaga e tuʻuina atu ai faʻataʻitaʻiga o le auala e mafai ona faʻaaogaina ai vaega epithelial o le intestinal ua faʻatuina, mo se faʻataʻitaʻiga, i le faʻamatalaina o le eseesega o sela, suʻesuʻega o le physiology o le manava, faʻavaeina o siosiomaga o le host-microbiome, ma le faʻataʻitaʻiga o faʻamaʻi. Ata Immunofluorescence i le "Cell "Differentiation" o loʻo faʻaalia ai nuclei, F-actin ma le MUC2 o loʻo faʻaalia i le vaega epithelial 3D Caco-2 na gaosia i luga o le gut chip. O loʻo iai le faʻailoga MUC2 i totonu o sela goblet ma le mucus na faʻasaʻolotoina mai luga o le mucosal. O ata Fluorescent i le Gut Physiology o loʻo faʻaalia ai le mucus na gaosia e ala i le valiina mo le sialic acid ma N-acetylglucosamine residues e faʻaaoga ai le fluorescent wheat germ agglutinin. O ata e lua e fefiloi i le "Host-Microbe Co-Cultures" o loʻo faʻaalia ai le faʻatulagaina o host-microbiome co-cultures i totonu o le gut i luga o se chip. O le panel agavale o loʻo faʻaalia ai le faʻatulagaina o le E. coli o loʻo faʻaalia ai le fluorescent protein lanumeamata (GFP) faʻatasi ai ma microengineered 3D Caco-2 epithelial cells. O le panel taumatau o loʻo faʻaalia ai le localization o le GFP E. coli faʻatasi ai ma 3D Caco-2 epithelial cells, sosoo ai ma le immunofluorescence staining ma le F-actin (mumu) ma nuclei (lanumoana). O le faʻataʻitaʻiga o faʻamaʻi o loʻo faʻaalia ai le soifua maloloina e faʻatusatusa i le leaky gut i totonu o le gut inflammation chips i lalo o le luʻitau faʻaletino ma bacterial antigens (e.g., lipopolysaccharide, LPS) ma immune cells (e.g., PBMC; lanumeamata). Sa totoina sela Caco-2 e fa'atuina ai se vaega epithelial 3D. Pa fua, 50 µm. Ata i le laina pito i lalo: "Differentiation of cells" ua fetu'una'i ma le fa'atagaga mai le fa'asinomaga.2. Oxford University Press; Toe gaosia ma le fa'atagaga mai le Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" ua fetu'una'i ma le fa'atagaga mai le ref.3. NAS; "Disease Modeling" ua fetu'una'i ma le fa'atagaga mai le fa'asinomaga.5. NAS.
O gut-on-chip ma hybrid chips na gaosia e faʻaaoga ai kopi PDMS na aveese mai le silicon molds e ala i le soft lithography1,44 ma faʻataʻitaʻiina i le SU-8. O le mamanu o microchannels i totonu o chip taʻitasi e fuafuaina e ala i le mafaufau i le hydrodynamics e pei o le shear stress ma le hydrodynamic pressure1,4,12. O le mamanu muamua o le gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1a), lea e aofia ai ni microchannels saʻo se lua e tuʻufaʻatasia, ua faʻagasolo i se gut-on-a-chip faigata (Extended Data Fig. 1b) lea e aofia ai se paga o microchannels piʻo e faʻaosofia ai le faʻateleina o le taimi e nofo ai le vai, mamanu tafe e le o laina, ma le faʻaleagaina tele o sela faʻatoʻaga (Fig. 2a–f) 12. A manaʻomia ona toe faia ni biomechanics faigata o le gut, e mafai ona filifilia ni gut-on-a-chips faigata. Ua matou faʻaalia o le Gut-Chip faʻafefiloi e faʻaosofia ai foʻi le 3D morphogenesis i se taimi tutusa ma se tikeri tutusa o le tuputupu aʻe o le epithelial pe a faʻatusatusa i le uluai. Gut-Chip, e tusa lava po o le a le ituaiga o sela ua totoina. O le mea lea, ina ia faʻaosofia ai le 3D morphogenesis, e mafai ona fesuiaʻi mamanu o le gut linear ma le lavelave i luga o le chip. O kopi PDMS na faʻamalolo i luga o le silicon molds ma mamanu SU-8 na maua ai ni foliga le lelei pe a uma ona aveese (Ata 2a). Ina ia faia le gut i luga o se chip, o le vaega pito i luga o le PDMS ua saunia na faʻapipiʻi faʻasolosolo i se ata PDMS porous ona faʻatulagaina lea ma le vaega pito i lalo o le PDMS e ala i le faʻapipiʻiina e le mafai ona toe faʻafoʻisia e faʻaaoga ai se corona treater (Ata 2b–f). Ina ia faia ni chips hybrid, o kopi PDMS ua faʻamalolo na faʻapipiʻi i ni slides tioata e fatu ai ni masini microfluidic e tasi le auala e mafai ona faʻaogaina ai Transwell inserts (Ata 2h ma le Extended Data Fig. 2). O le faiga o le faʻapipiʻiina e faia e ala i le togafitia o luga o le PDMS replica ma le tioata i le oxygen plasma poʻo le corona treatment. A maeʻa ona faʻamamaina le masini microfabricated ua faʻapipiʻi i le silicone tube, ua sauni le seti o le masini e faʻatino le 3D morphogenesis o le intestinal epithelium (Ata 2g).
a, Fa'ata'ita'iga o le sauniuniga o vaega PDMS mai mamanu silicon SU-8. O le fofo PDMS e le'i fa'amaloloina na sasaa i luga o se mamanu silicon (agavale), fa'amalolo i le 60 °C (ogatotonu) ma aveese (taumatau). O le PDMS ua aveese na tipiina i ni fasi ma fa'amama mo nisi fa'aoga. b, Ata o le mamanu silicon na fa'aaogaina e saunia ai le vaega pito i luga o le PDMS. c, Ata o le mamanu silicon na fa'aaogaina e fausia ai le membrane porous PDMS. d, O se faasologa o ata o vaega pito i luga ma lalo o le PDMS ma le masini intestinal ua fa'apotopotoina i luga o le chip. e, Ata o le fa'atulagaina o vaega pito i luga, membrane, ma lalo o le PDMS. O vaega ta'itasi e pipii mautu e ala i le plasma po'o le corona treatment. f, Ata o le masini gut-on-a-chip ua faia fa'atasi ai ma microchannels fa'apipi'i ma potu vacuum. g, Fa'atulagaina o le gut-on-a-chip mo le microfluidic cell culture. O le gut ua faia i luga o se chip ua fa'apotopotoina ma se paipa silicone ma le syringe ua tu'u i luga o se coverslip. O le masini chip ua tu'u i luga o le tapuni o se Petri 150 mm ipu mo le fa'agasologa. O le mea e fa'apipi'i ai e fa'aaoga e tapuni ai le paipa silicone. h, Ata vaaia o le gaosiga o le hybrid chip ma le 3D morphogenesis e fa'aaoga ai hybrid chips. O mea fa'apipi'i Transwell na saunia tuto'atasi e fa'atupu ai 2D monolayers o sela epithelial intestinal na fa'aofiina i totonu o le hybrid chip e fa'aosofia ai le intestinal 3D morphogenesis. O le medium e fa'asusuina e ala i microchannels i lalo o le cell layer ua fa'atuina i luga o le Transwell insert. Scale bar, 1 cm.h Toe lolomiina ma le fa'atagaga mai le fa'asinomaga. 4. Elsevier.
I lenei faiga fa'avae, o le laina o le sela Caco-2 ma organoids o le intestinal na fa'aaogaina o ni punaoa epithelial (Ata 3a). O ituaiga uma e lua o sela na totoina tuto'atasi (Pusa 2 ma le Pusa 5) ma fa'aaogaina e fatu ai microchannels ua ufiufiina e le ECM o le gut i luga o le chip po'o Transwell inserts. A fa'apotopoto sela (>95% le ufiufi i totonu o fagu), o sela Caco-2 ua totoina masani (i le va o auala 10 ma le 50) i totonu o fagu T e seleseleina e saunia ai fa'aputuga sela ua vavae'ese e ala i le vai trypsinization (pusa 2). O organoids o le intestinal o le tagata mai biopsies o le intestinal po'o taotoga na totoina i totonu o Matrigel scaffold domes i totonu o ipu e 24-well e lagolago ai le siosiomaga fa'atulagaina. O le medium o lo'o i ai morphogens taua (e pei o le Wnt, R-spondin, ma Noggin) ma mea e tuputupu a'e ai na saunia e pei ona fa'amatalaina i le Pusa 3 na fa'aopoopoina i aso uma se'ia o'o ina tuputupu a'e organoids i le ~500 µm le lautele. O organoids ua matua atoatoa e seleseleina ma vaevaeina i totonu o sela ta'itasi mo le totoina i luga o le gut. po'o fa'apipi'i Transwell i luga o se chip (Pusa 5). E pei ona matou lipotia muamua, e mafai ona fa'avasegaina e tusa ai ma le ituaiga o fa'ama'i12,13 (e pei o le ulcerative colitis, Crohn's disease, colorectal cancer, po'o le tagata foa'i masani), nofoaga o le manu'a (e pei o le manu'a pe a fa'atusatusa i le vaega e le'i manu'a) ma le nofoaga o le gastrointestinal i le tract (e pei o le duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, po'o le rectum). Matou te tu'uina atu se fa'atulagaga fa'alelei i le Pusa 5 mo le fa'ato'againa o organoids colonic (coloids) e masani ona mana'omia ai le maualuga o le fa'aputuga o morphogens nai lo organoids intestinal laiti.
a, Faiga o galuega mo le fa'aosofiaina o le gut morphogenesis i totonu o le gut chip. O le Caco-2 human intestinal epithelium ma intestinal organoids e fa'aaogaina i lenei protocol e fa'aalia ai le 3D morphogenesis. O sela epithelial ua vavae'ese na totoina i totonu o le masini gut-on-a-chip ua saunia (sauniuniga chip). O le taimi lava e totoina ai sela (fa'ato'aina) ma fa'apipi'i (fa'apipi'i) i le PDMS porous membrane i le aso 0 (D0), e amatalia ma fa'atumauina le apical (AP) flow mo aso muamua e 2 (tafe, AP, D0-D2). E amatalia fo'i le Basolateral (BL) flow fa'atasi ai ma gaioiga fa'aloaloa fa'asolosolo (fa'aloaloa, tafe, AP ma le BL) pe a fausia se 2D monolayer atoa. Na tupu fa'afuase'i le intestinal 3D morphogenesis ina ua mavae aso e 5 o le microfluidic culture (morphogenesis, D5). O ata fa'atusatusaga o le vaega e fa'aalia ai le morphology fa'atusa o sela Caco-2 i la'asaga ta'itasi o fa'ata'ita'iga po'o le taimi (kalafi pa, 100 µm). Fa ata fa'ata'ita'i o lo'o fa'aalia ai le fa'asologa tutusa o le gut morphogenesis (pito i luga taumatau). O le dashed O aū i le ata fa'atusa o lo'o fa'atusalia ai le itu o le tafe o le vai.b, Ata SEM o lo'o fa'aalia ai le topology o luga o le 3D Caco-2 epithelium ua fa'atuina (agavale). O le inset o lo'o fa'ailoa mai ai le vaega fa'ateleina (pusa pa'epa'e) o lo'o fa'aalia ai le microvilli ua toe fa'afouina i luga o le 3D Caco-2 layer (taumatau).c, Va'aiga fa'alava i luma o le Caco-2 3D ua fa'atuina, claudin (ZO-1, mumu) ma membrane o le pito i tua o le pulumu ua fa'ailogaina F-actin (lanumeamata) ma nuclei (lanumoana) Immunofluorescence confocal visualization o sela epithelial i luga o chips intestinal. O aū o lo'o fa'asino i le ata ogatotonu o lo'o fa'aalia ai le nofoaga o le focal plane mo va'aiga confocal ta'itasi.d, Taimi o suiga morphological i organoids na totoina i luga o se chip na maua e ala i le phase contrast microscopy i aso 3, 7, 9, 11, ma le 13. O le inset (pito i luga taumatau) o lo'o fa'aalia ai le fa'ateleina maualuga o le ata na tu'uina atu.e, DIC photomicrograph o le organoid 3D epithelium ua fa'atuina i totonu o le manava i luga o le fasi na pu'eina i le aso 7.f, Ata immunofluorescence ua ufiufi o lo'o fa'aalia ai fa'ailoga mo stem cells (LGR5; magenta), sela goblet (MUC2; lanumeamata), F-actin (efuefu) ma nuclei (cyan) na ola i luga o fasi gut mo le 3 aso, i le faasologa (Agavale) ma le 13-aso (ogatotonu) organoids i luga o le vaega epithelial. Tagai foi i le Extended Data Figure 3, lea e faamatilatila ai le LGR5 signaling e aunoa ma le MUC2 signaling. Ata fluorescence o loo faaalia ai le epithelial microstructure (taumatau) o le 3D organoid epithelium ua faatuina i totonu o le gut i luga o se chip e ala i le valiina o le plasma membrane i le CellMask dye (taumatau) i le aso 13 o le totoina. O le scale bar e 50 μm vagana ua ta’ua i se isi itu. b Toe lolomiina ma le faatagaga mai le faasinomaga. 2. Oxford University Press; c Fetuunai ma le faatagaga mai le Faasinomaga. 2. Oxford University Press; e ma le f ua fetuuna’i ma le faatagaga e ala i le faasinomaga. 12 I lalo o le Creative Commons License CC BY 4.0.
I totonu o le manava i luga o se chip, e tatau ona suia le fogāeleele hydrophobic o le membrane porous PDMS mo le ufiufiina manuia o le ECM. I lenei protocol, matou te faʻaaogaina ni auala se lua eseese e suia ai le hydrophobicity o membrane PDMS. Mo le totoina o sela Caco-2, o le faʻagaoioia o le fogāeleele e ala i le togafitiga UV/ozone na lava lea e faʻaitiitia ai le hydrophobicity o le fogāeleele PDMS, ufiufi le ECM ma faʻapipiʻi sela Caco-2 i le membrane PDMS. Peitaʻi, o le faʻatoʻaga microfluidic o le organoid epithelium e manaʻomia ai le faʻatinoina o le fogāeleele e faʻavae i vailaʻau ina ia ausia ai le faʻaputuina lelei o porotini ECM e ala i le faʻaaogaina faʻasolosolo o le polyethyleneimine (PEI) ma le glutaraldehyde i microchannels PDMS. A maeʻa ona suia le fogāeleele, na teuina porotini ECM e ufiufi ai le fogāeleele PDMS ona faʻaofiina lea i totonu o le epithelium organoid ua vavaeʻeseina. A maeʻa ona faʻapipiʻi sela, e amata le faʻatoʻaga sela microfluidic e ala i le faʻasusuina naʻo le medium i totonu o le microchannel pito i luga seʻia oʻo ina fausia e sela se monolayer atoa, aʻo tausia e le microchannel pito i lalo tulaga tumau. O lenei metotia faʻaleleia mo le faʻagaoioia o le fogāeleele ma le ufiufiina o le ECM e mafai ai ona faʻapipiʻi le organoid epithelium e faʻaosofia ai le 3D morphogenesis i luga o le PDMS. luga.
E manaʻomia foʻi e faʻatoʻaga Transwell le ufiufiina o le ECM aʻo leʻi totoina sela; peitaʻi, e le manaʻomia e faʻatoʻaga Transwell ni laʻasaga faigata o togafitiga muamua e faʻagaoioia ai le fogāeleele o mea e faʻapipiʻi ai sela. Mo le totoina o sela Caco-2 i luga o mea e faʻapipiʻi ai Transwell, o le ufiufiina o le ECM i luga o mea e faʻapipiʻi ai sela e faʻavavevave ai le faʻapipiʻiina o sela Caco-2 ua vavaeʻese (<1 itula) ma le fausiaina o pa puipui tight junction (<1-2 aso). Mo le totoina o organoids i luga o mea e faʻapipiʻi ai Transwell, o organoids ua vavaeʻese e totoina i luga o mea e faʻapipiʻi ai le ECM, faʻapipiʻi i luga o le membrane (<3 itula) ma tausia seʻia oʻo ina fausia e organoids se monolayer atoatoa ma le atoatoa o pa puipui. O faʻatoʻaga Transwell e faʻatinoina i ipu e 24-well e aunoa ma le faʻaaogaina o chips hybrid.
E mafai ona amata le in vitro 3D morphogenesis e ala i le faʻaaogaina o le tafe o le vai i le itu basolateral o se vaega epithelial ua faʻatuina. I totonu o le manava i luga o se chip, na amata le epithelial morphogenesis ina ua faʻasalalauina le medium i totonu o microchannels pito i luga ma lalo (Ata 3a). E pei ona faʻamatalaina muamua, e taua tele le faʻalauiloaina o le tafe o le vai i le vaega pito i lalo (basolateral) mo le aveʻesea pea o le directional secreted morphogen inhibitors. Ina ia maua ai meaʻai ma serum e lava i sela o loʻo fusifusia i luga o porous membranes ma faʻatupuina le luminal shear stress, matou te masani ona faʻaaogaina le lua tafe i totonu o le manava i luga o se chip. I hybrid chips, o Transwell inserts o loʻo i ai epithelial monolayers na faʻaofiina i totonu o hybrid chips. Ona faʻaaogaina lea o le medium i lalo o le itu basolateral o le porous Transwell insert e ala i le microchannel. Na tupu le intestinal morphogenesis i le 3-5 aso talu ona amata le tafe o le basolateral i fausaga uma e lua o le totoina.
E mafai ona iloiloina foliga vaaia o vaega epithelial 3D ua fa'a'ele'eleina i le microengineered e ala i le fa'aaogaina o auala eseese o ata, e aofia ai le phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, po'o le immunofluorescence confocal microscopy (Ata 3 ma le 4). E faigofie ona faia le phase contrast po'o le DIC imaging i so'o se taimi i le taimi o le totoina e mata'ituina ai le foliga ma le fa'asalalauina o vaega epithelial 3D. Ona o le manino o le optical o le PDMS ma polyester films, o le gut-on-a-chip ma le hybrid chip platforms e mafai ona tu'uina atu le real-time in situ imaging e aunoa ma le mana'omia o le vaevaeina po'o le fa'aesea o le masini. A faia le immunofluorescence imaging (Ata 1, 3c, f ma le 4b, c), e masani ona fa'amautu sela i le 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), sosoo ai ma le Triton X-100 ma le 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), i le faasologa. Fa'alagolago i le ituaiga sela, e mafai ona fa'aogaina ni fixatives eseese, permeabilizers, ma blocking agents. Antibodies autu e fa'atatau i le lineage-dependent cell po'o O fa'ailoga o le itulagi e fa'aaogaina e fa'ailoa ai sela ua fa'amautu i totonu o le chip, sosoo ai ma antibodies lona lua fa'atasi ai ma se vali counterstain e fa'atatau i le nucleus (e.g., 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) po'o le F-actin (e.g., fluorescently labeled phalloidin). E mafai fo'i ona faia le fluorescence-based live imaging i totonu e iloa ai le gaosiga o le mucus (Ata 1, "Cell differentiation" ma le "Gut physiology"), fa'alavelave fa'atupuina o sela microbial (Ata 1, "Host-microbe co-culture") , le fa'afaigaluegaina o sela puipuia (Ata 1, 'Disease Modeling') po'o le contours o le 3D epithelial morphology (Ata 3c,f ma le 4b,c). A suia le gut i luga o le chip e vavae'ese ai le vaega pito i luga mai le vaega pito i lalo o le microchannel, e pei ona fa'amatalaina i le ref. E pei ona fa'aalia i le Ata 2, o le 3D epithelial morphology fa'apea fo'i ma le microvilli i luga o le apical brush border e mafai ona va'aia e le SEM (Ata 3b). O le fa'aalia o le differentiation E mafai ona iloiloina fa'ailoga e ala i le faia o le PCR5 fa'atatau po'o le fa'asologa o le RNA e tasi le sela. I lenei tulaga, o vaega 3D o sela epithelial e ola a'e i totonu o fasi otaota po'o fasi otaota hybrid e seleseleina e ala i le trypsinization ona fa'aaoga lea mo le au'ili'iliga molecular po'o le genetic.
a, Faiga o galuega mo le fa'aosofiaina o le morphogenesis o le manava i totonu o se hybrid chip. O Caco-2 ma organoids o le manava e fa'aaogaina i lenei protocol e fa'aalia ai le 3D morphogenesis i totonu o se hybrid chip platform. O sela epithelial ua vavae'eseina na totoina i totonu o Transwell inserts ua saunia (TW prep; taga'i i le ata i lalo). Ina ua uma ona totoina (fa'ato'aina) sela ma fa'apipi'i i polyester membranes i Transwell inserts, o sela uma na totoina i lalo o tulaga tumau (TW culture). Ina ua mavae aso e 7, o se Transwell insert e tasi o lo'o i ai se 2D monolayer o sela epithelial na tu'ufa'atasia i totonu o se hybrid chip e fa'alauiloa ai se basolateral flow (Flow, BL), lea na iu ai ina i'u ai i le gaosia o se 3D epithelial layer (morphogenesis). Phase contrast micrographs o lo'o fa'aalia ai foliga morphological o sela epithelial o le tagata e mafua mai i le donor masani (C103 line) ascending colon i la'asaga ta'itasi o fa'ata'ita'iga po'o le taimi. O ata fa'ata'ita'i i vaega pito i luga o lo'o fa'aalia ai le fa'atulagaga fa'ata'ita'i mo la'asaga ta'itasi. b, Hybrid chips (agavale schematic) e mafai ona ta'ita'ia ai le 3D morphogenesis o sela epithelial organoid ma vaaiga microscopy confocal pito i luga i lalo na pu'eina i tulaga Z eseese (luga, ogatotonu, ma le pito i lalo; taga'i i le fa'asologa taumatau ma laina togitogi tutusa). na fa'aalia ai uiga manino o le morphology.F-actin (cyan), nucleus (efuefu).c, Fluorescence confocal micrographs (va'aiga tulimanu 3D) o sela epithelial e maua mai i organoid na totoina i le Transwell static (TW; fa'apipi'i i totonu o le pusa pa'epa'e) e fa'atusatusa i le hybrid chip (ata atoa tele) e fa'atusatusa ai le 2D e fa'atusatusa i le 3D morphology, i le fa'asologa.O se paga o va'aiga tipi fa'alava 2D (fa'apipi'i i le tulimanu taumatau pito i luga; "XZ") o lo'o fa'aalia ai fo'i foliga 2D ma le 3D.Scale bar, 100 µm.c Toe lolomiina ma le fa'atagaga mai le fa'asinomaga.4. Elsevier.
E mafai ona saunia ni vaega e pulea e ala i le totoina o sela lava e tasi (Caco-2 po'o sela epithelial organoid intestinal) i totonu o ni vaega e lua-dimensional i lalo o tulaga masani o le totoina o sela tumau. E taua le maitauina, o le fa'aitiitia o mea'ai e ono mafua ona o le fa'atapula'aina o le gafatia o microchannels (e pei o le ~4 µL i le auala pito i luga i le mamanu muamua o le gut-chip). O le mea lea, e mafai fo'i ona fa'atusatusa le morphology o le epithelial a'o le'i fa'aogaina ma a mae'a ona fa'aogaina le tafe basolateral.
E tatau ona faia le faiga o le lithography vaivai i totonu o se potu mama. Mo vaega taʻitasi i luga o le chip (vaega pito i luga ma lalo ma membrane) ma hybrid chips, na faʻaaogaina ai ni photomasks eseese ma gaosia i luga o ni silicon wafers eseese ona e eseese le maualuga o microchannels. O le maualuga faʻamoemoeina o microchannels pito i luga ma lalo o le gut i luga o le chip e 500 µm ma le 200 µm, i le faasologa lava. O le maualuga faʻamoemoeina o le channel o le hybrid chip e 200 µm.
Tuu se wafer silicon e 3-inisi i totonu o se ipu ua iai le acetone. Fa'a'avili mālie le ipu mo le 30 sekone, ona fa'amamago lea i le ea. Fa'aliliu le wafer i se ipu ua iai le IPA, ona fa'a'avili lea o le ipu mo le 30 sekone e fa'amamā ai.
E mafai fo'i ona fa'aaogā se vaila'au piranha (o le paluga o le hydrogen peroxide ma le sulfuric acid fa'aputuina, 1:3 (vol/vol)) e fa'ateleina ai le ave'esea o toega o meaola mai le fogā'ele'ele o le silicon wafer.
E matuā 'a'ai tele le vai o le Piranha ma e fa'atupuina ai le vevela. E mana'omia nisi puipuiga fa'aopoopo mo le saogalemu. Mo le lafoa'iina o otaota, tu'u le vai e malūlū ma fa'aliliu i se pusa otaota mama ma mago. Fa'aaoga pusa lona lua ma fa'ailoga lelei pusa otaota. Fa'amolemole mulimuli i ta'iala saogalemu a le nofoaga mo nisi fa'atonuga auiliili.
Fa'amago le apa falaoa i le tu'uina i luga o le vevela e 200 °C mo le 10 minute. A uma ona fa'amago le apa falaoa, ona lūlūina lea fa'alima i le ea e fa'amālūlū ai.
Liligi le tusa ma le 10 kalama o le photoresist SU-8 2100 i le ogatotonu o le silicon wafer ua uma ona fa'amamāina. Fa'aaoga ni tweezers e fa'asalalau tutusa ai le photoresist i luga o le wafer. I nisi taimi, tu'u le wafer i luga o se hot plate e 65°C le vevela ina ia fa'aitiitia ai le pipi'i o le photoresist ma faigofie ai ona fa'asalalau. Aua le tu'u sa'o le wafer i luga o le hot plate.
Sa tufatufa tutusa le SU-8 i luga o le wafer e ala i le fa'agaoioia o le spin coating. Polokalama se fa'ata'amilosaga o le SU-8 mo le 5–10 sekone e fa'asalalau i le 500 rpm i le fa'avavevaveina o le 100 rpm/s. Seti le spin autu mo le 200 µm le mafiafia o le mamanu i le 1,500 rpm, pe ausia se mafiafia e 250 µm (faia se maualuga e 500 µm mo le vaega pito i luga o le manava i luga o le chip; taga'i i le "La'asaga Taua" i lalo) seti i se fa'avavevaveina o le 300 rpm/s 30 sekone i le 1,200 rpm.
E mafai ona fetu'una'i le saoasaoa autū o le vili e tusa ai ma le mafiafia fa'amoemoeina o le mamanu SU-8 i luga o le silicon wafer.
Mo le faia o mamanu SU-8 e 500 µm le maualuga mo le vaega pito i luga o le gut i luga o le chip, o laasaga o le spin coating ma le soft bake o lenei Pusa (laasaga 7 ma le 8) sa toe faia faasolosolo (tagai i le laasaga 9) e maua ai ni vaega se lua e 250 µm le mafiafia o le SU-8, lea e mafai ona fa'aputu ma fa'apipi'i e ala i le fa'aalia i le UV i le laasaga 12 o lenei pusa, ma avea ai se vaega e 500 µm le maualuga.
Tao mālū falaoa ua ufi i le SU-8 e ala i le tu'uina ma le fa'aeteete o falaoa i luga o se ipu vevela i le 65 °C mo le 5 minute, ona sui lea o le seti i le 95 °C ma fa'asusu mo le isi 40 minute.
Ina ia ausia le maualuga o le mamanu SU-8 e 500 μm i le microchannel pito i luga, toe fai laasaga 7 ma le 8 e fatu ai ni vaega se lua o le SU-8 e 250 μm le mafiafia.
Fa'aaoga le UV Mask Aligner, fa'atino se suega lamepa e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa e fuafua ai le taimi e fa'aalia ai le wafer. (taimi e fa'aalia ai, ms) = (fualaau e fa'aalia ai, mJ/cm2)/(malosiaga o le lamepa, mW/cm2).
A uma ona fuafua le taimi e fa'aalia ai, tu'u le photomask i luga o le mea e uu ai le ufimata o le UV mask aligner ma tu'u le photomask i luga o le wafer ua ufiufia i le SU-8.
Tuu sa'o le pito i luga lolomi o le photomask i luga o le itu ua ufiufiina e le SU-8 o le silicon wafer e fa'aitiitia ai le fa'asalalauina o le UV.
Fa'aali sa'o le uamea ua ufiufi i le SU-8 ma le photomask i le 260 mJ/cm2 o le malamalama UV mo le taimi atofaina e fa'aalia ai (tagai i le la'asaga 10 o lenei pusa).
A maeʻa ona faʻaalia i le UV, ona tao lea o keke silicon ua ufiufi i le SU-8 i le 65°C mo le 5 minute ma le 95°C mo le 15 minute i luga o ipu vevela taʻitasi e fai ai ni mamanu e 200 μm le maualuga. Faʻalautele le taimi pe a uma ona tao i le 95 °C i le 30 minute e fai ai ni mamanu e 500 µm le maualuga.
E sasaa le developer i totonu o se ipu tioata, ona tuu lea o le falaoa tao i totonu o le ipu. E ono fesuisuia’i le tele o le SU-8 developer e fuafua i le tele o le ipu tioata. Ia mautinoa e lava le SU-8 developer e aveese atoa ai le SU-8 e le’i fa’aalia. Mo se fa’ata’ita’iga, pe a fa’aaogaina se ipu tioata e 150 mm le lautele ma e 1 L le tele, fa’aaoga le ~300 mL o le SU-8 developer. Fa’aola le fa’ata’ita’iga mo le 25 minute ma fa’ata’amilomilo malie i nisi taimi.
Fufulu le fa'a'ofu'ofu ua atia'e i le tusa ma le 10 mL o le developer fou ona fa'asusu lea o le IPA i le vaila'au e fa'aaoga ai se pipette.
Tuu le wafer i totonu o se masini faamama plasma ma tuu i le plasma okesene (kaso o le ea, mamafa fa'atatau 1 × 10−5 Torr, malosiaga 125 W) mo le 1.5 minute.
Tuu le wafer i totonu o se vacuum desiccator ma se tioata faasee i totonu. E mafai ona tuu faatasi wafers ma slides. Afai e vaevaeina le vacuum desiccator i ni vaega se tele e se ipu, tuu slides i le potu pito i lalo ma wafers i le potu pito i luga. Faapa'u le 100 μL o le trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane solution i luga o se tioata faasee ma fa'aoga le vacuum mo le silanization.
Fa'amalūlū se fagu o sela Caco-2 ua 'aisa i totonu o se tapu vai e 37°C, ona fa'aliliu lea o sela ua fa'amalūlū i totonu o se fagu T75 o lo'o i ai le 15 mL o le vaila'au Caco-2 ua uma ona fa'amafanafana i le 37°C.
Ina ia fa'asolo atu sela Caco-2 i le ~90% o le fa'atasiga, muamua fa'avevela le Caco-2 medium, PBS, ma le 0.25% trypsin/1 mM EDTA i totonu o se ta'ele vai e 37°C.
Fa'amamā le vaila'au e ala i le fa'amamāina i le masini e aunoa ma le vacuum. Fufulu fa'alua sela i le 5 mL o le PBS mafanafana e ala i le toe faia o le fa'amamāina i le masini ma fa'aopoopo i ai se PBS fou.