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인간 장 형태 발생은 3차원 상피 미세 구조 및 공간적 조직을 갖는 융모-음와 특징을 확립합니다. 이러한 독특한 구조는 기저 음와에 있는 줄기세포 틈새를 외부 미생물 항원 및 그 대사산물로부터 보호함으로써 장 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 또한, 장 융모와 분비 점액은 장 점막 표면에 보호 장벽을 형성하는 기능적으로 분화된 상피 세포를 제공합니다. 따라서 3차원 상피 구조를 재현하는 것은 시험관 내 장 모델 구축에 매우 중요합니다. 특히, 유기 모방 장 칩은 향상된 생리적 기능과 생체 역학을 통해 장 상피의 자발적인 3차원 형태 발생을 유도할 수 있습니다. 본 연구에서는 미세유체 칩과 트랜스웰이 내장된 하이브리드 칩에서 장 형태 발생을 안정적으로 유도하는 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 장치 제작, Caco-2 또는 장 오가노이드 상피 세포 배양에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 본 연구에서는 미세유체 플랫폼을 이용하여 3D 형태 형성을 유도하고, 다양한 영상 기법을 통해 형성된 3D 상피를 특성화했습니다. 이 프로토콜은 기저측 유체 흐름을 5일 동안 제어함으로써 기능성 장 미세구조를 재생합니다. 본 연구의 체외 형태 형성 방법은 생리학적으로 적합한 전단 응력과 기계적 운동을 이용하며, 복잡한 세포 공학이나 조작이 필요하지 않아 기존의 다른 기술보다 우수한 성능을 보일 수 있습니다. 본 프로토콜은 생의학 연구 분야에 폭넓게 적용될 수 있으며, 생의학, 임상 및 제약 분야에 활용될 수 있는 체외 3D 장 상피층 재생 방법을 제공할 것으로 기대합니다.
실험 결과에 따르면, 장 상피 세포인 Caco-2 세포는 장 칩(gut-on-a-chip)1,2,3,4,5 또는 이중층 미세유체 장치6,7에서 배양될 때 기저 메커니즘에 대한 명확한 이해 없이도 시험관 내에서 자발적인 3차원 형태 형성을 겪을 수 있습니다. 최근 연구에서 우리는 배양 장치에서 기저측으로 분비되는 형태 형성 촉진제 길항제를 제거하는 것이 시험관 내에서 3차원 상피 형태 형성을 유도하는 데 필요충분조건임을 발견했으며, 이는 Caco-2 세포와 환자 유래 장 오가노이드를 통해 입증되었습니다. 상피세포의 유효성을 검증하였다. 본 연구에서는 특히 장 칩(gut-on-a-chip)과 트랜스웰(Transwell) 인서트가 포함된 변형된 미세유체 장치인 "하이브리드 칩(Hybrid-on-a-chip)"에서 강력한 Wnt 길항제인 Dickkopf-1(DKK-1)의 세포 생성 및 농도 분포에 초점을 맞추었다. 칩 내 장에 외인성 Wnt 길항제(DKK-1, Wnt 억제자 1, 분비성 프리즐드 관련 단백질 1, Soggy-1 등)를 첨가하면 형태 형성이 억제되거나 미리 구조화된 3D 상피층이 파괴됨을 보여주었으며, 이는 배양 중 발생하는 길항 작용으로 인한 스트레스가 시험관 내 장 형태 형성에 관여함을 시사한다. 따라서 상피 계면에서 안정적인 형태 형성을 달성하기 위한 실질적인 접근 방식은 능동적인 세척(예: 장 칩 또는 하이브리드 칩 플랫폼) 또는 확산을 통해 기저측 구획에서 Wnt 길항제의 농도를 제거하거나 최소한으로 유지하는 것이다. 기저측 매질(예: 유정 내 대형 기저측 저장소에 삽입된 트랜스웰 인서트).
본 프로토콜에서는 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 다공성 막(단계 6A, 7A, 8, 9) 또는 트랜스웰 인서트의 폴리에스터 막(단계 6B, 7B, 8, 9)에서 장 상피 세포를 배양하고 시험관 내에서 3D 형태 형성을 유도하기 위한 장 칩 마이크로 장치 및 트랜스웰 삽입형 하이브리드 칩(단계 1-5)을 제작하는 상세한 방법을 제공합니다. 또한, 다양한 이미징 방식을 적용하여 조직 특이적 조직 발생 및 계통 의존적 세포 분화를 나타내는 세포 및 분자적 특징을 확인했습니다(단계 11-24). Caco-2 또는 장 오가노이드와 같은 인간 장 상피 세포를 사용하여 두 가지 배양 형식에서 형태 형성을 유도했으며, 다공성 막의 표면 개질, 2D 단층 형성, 장 생화학적 및 생체역학적 재현을 포함한 기술적 세부 사항을 제시합니다. 미세환경.시험관내.2D 상피 단층에서 3D 형태발생을 유도하기 위해, 배양액을 배양액의 기저측 구획으로 흘려보내 두 배양 형태 모두에서 형태발생 억제제를 제거했습니다. 마지막으로, 형태발생 억제제 의존적 상피 성장, 장기적인 숙주-미생물 공동 배양, 병원균 감염, 염증성 손상, 상피 장벽 기능 장애 및 프로바이오틱스 기반 치료법을 모델링하는 데 사용할 수 있는 재생 가능한 3D 상피층의 유용성을 보여주는 예시를 제시합니다.
본 프로토콜은 기초 연구(예: 장 점막 생물학, 줄기세포 생물학, 발생 생물학) 및 응용 연구(예: 전임상 약물 시험, 질병 모델링, 조직 공학, 위장병학) 분야의 다양한 과학자들에게 유용하게 활용될 수 있으며, 그 영향력 또한 광범위합니다. 본 프로토콜은 시험관 내에서 장 상피의 3차원 형태 형성을 유도하는 데 있어 재현성과 견고성을 보여주므로, 장 발달, 재생 또는 항상성 유지 과정에서 세포 신호 전달의 역학을 연구하는 연구자들에게도 널리 보급될 수 있을 것으로 기대합니다. 또한, 본 프로토콜은 노로바이러스 8형, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2형(SARS-CoV-2), 클로스트리디움 디피실, 살모넬라 티피무륨 9형 또는 비브리오 콜레라와 같은 다양한 감염성 병원체에 의한 감염 연구에도 활용될 수 있습니다. 질병 병리학 및 병인론에 대한 연구 또한 유용합니다. 온칩 장 미세생리 시스템을 사용하면 장기간 공동 배양¹⁰ 및 이후 위장관(GI) 내 숙주 방어, 면역 반응 및 병원체 관련 손상 복구¹¹ 평가가 가능합니다. 장 누수 증후군, 셀리악병, 크론병, 궤양성 대장염, 장루염 또는 과민성 대장 증후군과 관련된 기타 위장관 질환은 환자의 3D 장 상피층을 사용하여 3D 장 상피층을 준비할 때 시뮬레이션할 수 있으며, 이러한 질환에는 융모 위축, 음와 단축, 점막 손상 또는 상피 장벽 기능 장애가 포함됩니다. 생검 또는 줄기세포 유래 장 오가노이드¹²,¹³. 질병 환경의 복잡성을 더 잘 모델링하기 위해, 독자들은 3D 장 상피층을 포함하는 모델에 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 질병 관련 세포 유형을 추가하는 것을 고려할 수 있습니다. 융모-음와 미세구조. 조직 특이적 면역 세포, 5.
3D 상피 미세구조는 절편 과정 없이 고정 및 시각화할 수 있으므로 공간 전사체학 및 고해상도 또는 초고해상도 이미징을 연구하는 사람들은 상피 틈새에서 유전자와 단백질의 시공간적 역학 매핑에 관심을 가질 수 있습니다. 기술에 관심이 있는 사람들은 미생물 또는 면역 자극에 대한 반응을 연구할 수 있습니다. 또한, 다양한 미생물 종, 미생물 군집 또는 분변 미생물을 공동 배양함으로써, 특히 장 칩(gut-on-a-chip)에서 장 항상성을 조절하는 숙주-미생물 상호작용(10, 14)을 3D 장 점막층에서 확립할 수 있습니다. 이 플랫폼은 특히 점막 면역학, 위장병학, 인간 마이크로바이옴, 컬처로믹스 및 임상 미생물학을 연구하는 연구자들에게 매력적이며, 실험실에서 이전에 배양되지 않았던 장내 미생물을 배양하고자 하는 연구자들에게 유용합니다. 본 연구의 시험관 내 형태 형성 프로토콜을 24, 96 또는 384웰 플레이트의 멀티웰 인서트와 같이 기저측 구획을 지속적으로 보충하는 확장 가능한 배양 형식에 적용할 수 있다면, 제약, 생의학 또는 식품 산업을 위한 고처리량 스크리닝 또는 검증 플랫폼을 개발하는 연구자들에게도 보급할 수 있습니다. 원리 입증 차원에서, 우리는 최근 24웰 플레이트 형식으로 확장 가능한 다중 고처리량 형태 형성 시스템의 실현 가능성을 입증했습니다. 또한, 여러 오르간 온 어 칩 제품이 상용화되었습니다.16,17,18 따라서, 본 연구의 시험관 내 형태 형성 방법의 검증을 가속화하고, 세포 재프로그래밍을 이해하기 위해 많은 연구실, 산업계, 정부 및 규제 기관에서 이를 채택할 수 있을 것입니다. 약물 또는 생물 치료제의 효능을 시험하기 위해 전사체 수준에서 시험관 내 장 형태 형성을 연구했습니다. 약물 후보 물질의 흡수 및 수송은 3D 장 대체 모델 또는 맞춤형이나 상용 오르간 온 어 칩 모델을 사용하여 평가했으며, 이를 통해 장 형태 형성 과정의 재현성을 검증했습니다.
인간에게 적용 가능한 실험 모델은 장 상피세포 형태발생 연구에 제한적으로 사용되어 왔는데, 이는 주로 시험관 내에서 3D 형태발생을 유도하는 실행 가능한 프로토콜이 부족하기 때문입니다. 실제로 장 형태발생에 대한 현재 지식의 대부분은 동물 연구(예: 제브라피시20, 마우스21 또는 닭22)에 기반하고 있습니다. 그러나 이러한 모델은 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 윤리적으로 문제가 될 수 있고, 무엇보다도 인간의 발달 과정을 정확하게 규명하지 못합니다. 또한 이러한 모델은 다방면으로 확장 가능한 방식으로 테스트하는 데 한계가 있습니다. 따라서 시험관 내에서 3D 조직 구조를 재생하는 본 연구의 프로토콜은 생체 내 동물 모델뿐만 아니라 기존의 정적 2D 세포 배양 모델보다 우수합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 3D 상피 구조를 활용함으로써 다양한 점막 또는 면역 자극에 대한 반응으로 장선와-융모 축에서 분화된 세포의 공간적 위치를 조사할 수 있었습니다. 3D 상피층은 미생물 세포가 어떻게 경쟁하여 융모를 형성하는지 연구할 수 있는 공간을 제공합니다. 숙주 요인(예: 내측 대 외측 점액층, IgA 및 항균 펩타이드 분비)에 대한 반응으로 공간적 틈새와 생태학적 진화가 나타납니다. 또한, 3D 상피 형태학을 통해 장내 미생물 군집이 어떻게 구성되고, 세포 조직과 기저선와 내 줄기세포 틈새를 형성하는 미생물 대사산물(예: 단쇄 지방산)을 어떻게 시너지 효과적으로 생성하는지 이해할 수 있습니다. 이러한 특징은 시험관 내에서 3D 상피층을 구축했을 때만 확인할 수 있습니다.
본 연구에서 제시하는 3D 장 상피 구조 생성 방법 외에도 여러 가지 시험관 내 방법이 있습니다. 장 오가노이드 배양은 특정 형태형성 조건 하에서 장 줄기세포를 배양하는 최첨단 조직 공학 기술입니다.23,24,25 그러나 3D 오가노이드 모델을 이용한 수송 분석이나 숙주-미생물 공동 배양은 장 내강이 오가노이드 내부에 갇혀 있어 미생물 세포나 외래 항원과 같은 내강 구성 요소를 도입하는 데 어려움이 있습니다. 미세 주입기를 사용하면 오가노이드 내강 접근성을 개선할 수 있지만,26,27 이 방법은 침습적이고 노동 집약적이며 전문적인 지식이 필요합니다. 또한, 정적인 조건에서 하이드로겔 스캐폴드에 유지되는 기존의 오가노이드 배양은 생체 내 활성적인 생체역학을 정확하게 반영하지 못합니다.
여러 연구 그룹에서 사용하는 다른 접근 방식은 미리 구조화된 3D 하이드로겔 스캐폴드를 활용하여 분리된 인간 장 세포를 겔 표면에서 배양함으로써 장 상피 구조를 모방하는 것입니다. 하이드로겔 스캐폴드는 3D 프린팅, 마이크로 밀링 또는 리소그래피로 제작된 몰드를 사용하여 제작할 수 있습니다. 이 방법은 생리학적으로 관련된 형태형성 물질 기울기를 이용하여 분리된 상피 세포의 자가 조직화 배열을 시험관 내에서 보여주며, 스캐폴드에 기질 세포를 포함시킴으로써 높은 종횡비의 상피 구조와 기질-상피 상호작용을 확립합니다. 그러나 미리 구조화된 스캐폴드의 특성상 자발적인 형태형성 과정 자체를 보여주지 못할 수 있습니다. 또한 이러한 모델은 동적인 내강 또는 간질 흐름을 제공하지 못하며, 장 세포가 형태형성을 겪고 생리학적 기능을 획득하는 데 필요한 유체 전단 응력이 부족합니다. 최근의 또 다른 연구에서는 미세유체 플랫폼에서 하이드로겔 스캐폴드를 사용하고 레이저 에칭 기술을 이용하여 장 상피 구조를 패턴화했습니다. 오가노이드는 에칭된 패턴을 따라 장관 구조를 형성하며, 미세유체 모듈을 사용하여 장 내강의 유체 흐름을 재현할 수 있습니다. 그러나 이 모델은 자발적인 형태발생 과정이나 장의 기계적 생물학적 운동을 나타내지 않습니다. 동일 연구팀의 3D 프린팅 기술을 이용하여 자발적인 형태발생 과정을 보이는 소형 ​​장관을 제작할 수 있었습니다. 관 내부의 다양한 장 분절을 복잡하게 제작했음에도 불구하고, 이 모델 역시 내강의 유체 흐름과 기계적 변형이 부족합니다. 또한, 특히 바이오프린팅 공정이 완료된 후에는 모델의 작동성이 제한될 수 있으며, 실험 조건이나 세포 간 상호작용을 방해할 수 있습니다. 반면, 본 연구에서 제안하는 프로토콜은 자발적인 장 형태발생, 생리학적으로 관련된 전단 응력, 장 운동성을 모방하는 생체역학, 독립적인 첨단 및 기저측 구획의 접근성, 그리고 모듈성을 갖춘 복잡한 생물학적 미세환경의 재현을 제공합니다. 따라서, 본 연구의 체외 3D 형태발생 프로토콜은 기존 방법의 한계를 극복하는 보완적인 접근 방식을 제시할 수 있습니다.
본 프로토콜은 3D 상피 형태 형성에만 초점을 맞추고 있으며, 배양에는 상피 세포만 사용하고 중간엽 세포, 내피 세포, 면역 세포와 같은 다른 유형의 주변 세포는 포함하지 않습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 프로토콜의 핵심은 주입된 배지의 기저측에서 분비되는 형태 형성 억제제를 제거함으로써 상피 형태 형성을 유도하는 것입니다. 본 연구에서 개발한 장 칩(gut-on-a-chip) 및 하이브리드 칩(hybrid-on-a-chip)의 견고한 모듈성은 물결 모양의 3D 상피층을 재현할 수 있게 해주지만, 상피-중간엽 상호작용33,34, 세포외 기질(ECM) 침착35, 그리고 본 모델에서 기저선와에 줄기세포 틈새를 제공하는 선와-융모 특징과 같은 추가적인 생물학적 복잡성은 추가적인 연구가 필요합니다. 중간엽의 기질 세포(예: 섬유아세포)는 ECM 단백질 생성 및 장 형태 형성 조절에 중요한 역할을 합니다. vivo35,37,38. 우리 모델에 중간엽 세포를 추가함으로써 형태 형성 과정과 세포 부착 효율이 향상되었습니다. 내피층(즉, 모세혈관 또는 림프관)은 장내 미세환경에서 분자 수송39 및 면역 세포 모집40을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, 조직 모델을 설계할 때 다기관 상호작용을 보여주기 위해서는 조직 모델 간에 연결될 수 있는 혈관 구조가 필수적입니다. 따라서, 보다 정확한 생리적 특징을 장기 수준의 해상도로 모델링하기 위해서는 내피 세포를 포함해야 할 수도 있습니다. 환자 유래 면역 세포는 장 질환을 모방하는 맥락에서 선천 면역 반응, 항원 제시, 선천-적응 면역 상호작용 및 조직 특이적 면역을 나타내는 데에도 필수적입니다.
하이브리드 칩은 장치 구성이 간단하고 트랜스웰 인서트를 사용하여 장 상피 세포의 확장 가능한 배양이 가능하기 때문에 장 칩(gut-on-a-chip)보다 사용이 더 간편합니다. 그러나 시판되는 폴리에스터 막으로 된 트랜스웰 인서트는 탄성이 없어 연동 운동과 유사한 움직임을 모방할 수 없습니다. 또한 하이브리드 칩에 삽입된 트랜스웰 인서트의 상단부는 정지 상태를 유지하며 상단부에 전단 응력이 발생하지 않습니다. 이러한 정적인 상단부 특성은 하이브리드 칩에서 장기간의 세균 공동 배양을 어렵게 합니다. 하이브리드 칩을 사용하면 트랜스웰 인서트에서 3D 형태 형성을 효과적으로 유도할 수 있지만, 생리학적으로 적합한 생체역학 및 상단부 유체 흐름의 부족은 하이브리드 칩 플랫폼의 잠재적 응용 가능성을 제한할 수 있습니다.
장 칩(gut-on-a-chip) 및 하이브리드 칩(hybrid-on-a-chip) 배양에서 인간 장선-융모 축의 완전한 재구성은 아직 완전히 확립되지 않았습니다. 형태 발생은 상피 단층에서 시작되므로 3D 미세 구조가 생체 내 장선과 형태학적 유사성을 반드시 제공하는 것은 아닙니다. 미세 공학적으로 제작된 3D 상피에서 기저 장선 영역 근처의 증식 세포 집단을 특성화했지만, 장선과 융모 영역은 명확하게 구분되지 않았습니다. 칩의 상부 채널이 높을수록 미세 공학적으로 제작된 상피의 높이가 증가하지만 최대 높이는 여전히 약 300~400µm로 제한됩니다. 소장과 대장에 있는 인간 장선의 실제 깊이는 각각 약 135µm와 400µm이며, 소장 융모의 높이는 약 600µm입니다.
이미징 관점에서 볼 때, 3D 미세구조의 현장 초고해상도 이미징은 대물렌즈에서 상피층까지의 작동 거리가 수 밀리미터 정도에 불과하기 때문에 칩 상의 장 구조에만 국한될 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 원거리 대물렌즈가 필요할 수 있습니다. 또한, PDMS의 높은 탄성 때문에 이미징용 시료 준비를 위한 얇은 절편 제작이 어렵습니다. 더욱이, 칩 상의 장을 층별로 미세가공하는 과정에서 각 층 사이에 영구적인 접착이 발생하기 때문에, 주사전자현미경(SEM) 등을 이용하여 상피층의 표면 구조를 관찰하기 위해 상부 층을 열거나 제거하는 것이 매우 어렵습니다.
PDMS의 소수성은 소수성 소분자를 다루는 미세유체 기반 연구에서 제한 요소로 작용해 왔는데, 이는 PDMS가 이러한 소수성 분자를 비특이적으로 흡착할 수 있기 때문입니다. PDMS의 대안으로 다른 고분자 재료를 고려할 수 있습니다. 또는 소수성 분자의 흡착을 최소화하기 위해 PDMS의 표면 개질(예: 친유성 물질 42 또는 폴리에틸렌 글리콜 43으로 코팅)을 고려할 수 있습니다.
마지막으로, 본 연구 방법은 고처리량 스크리닝이나 "만능" 사용자 친화적인 실험 플랫폼을 제공하는 측면에서 아직 충분히 규명되지 않았습니다. 현재 프로토콜은 마이크로 디바이스당 주사기 펌프가 필요하므로 CO2 배양기 공간을 차지하고 대규모 실험을 어렵게 합니다. 이러한 한계는 혁신적인 배양 형식(예: 기저측 배지의 지속적인 보충 및 제거가 가능한 24웰, 96웰 또는 384웰 다공성 인서트)의 확장성을 통해 크게 개선될 수 있습니다.
인간 장 상피의 3D 형태 발생을 시험관 내에서 유도하기 위해, 우리는 두 개의 평행한 미세 채널과 그 사이에 탄성 다공성 막을 포함하는 미세유체 칩 장 장치를 사용하여 내강-모세혈관 계면을 만들었습니다. 또한, 트랜스웰 인서트에서 배양된 극성 상피층 아래에 ​​연속적인 기저측 유동을 제공하는 단일 채널 미세유체 장치(하이브리드 칩)의 사용법도 시연했습니다. 두 플랫폼 모두에서, 기저측 구획에서 형태 발생 억제제를 제거하기 위해 유동의 방향성 조작을 적용함으로써 다양한 인간 장 상피 세포의 형태 발생을 시연할 수 있습니다. 전체 실험 절차(그림 1)는 다음 다섯 부분으로 구성됩니다. (i) 장 칩 또는 트랜스웰 삽입형 하이브리드 칩의 미세 가공(단계 1-5, 박스 1), (ii) 장 상피 세포(Caco-2 세포) 또는 인간 장 오가노이드 준비; (i) 장 칩 또는 하이브리드 칩에서 장 상피 세포 배양(6~9단계), (iv) 시험관 내 3D 형태 형성 유도(10단계), (v) 3D 상피 미세 구조 특성 분석(11~24단계)을 수행하였다. 마지막으로, 적절한 대조군(아래에서 자세히 설명)을 설계하여 상피 형태 형성을 공간적, 시간적, 조건적 또는 절차적 대조군과 비교함으로써 시험관 내 형태 형성의 효과를 검증하였다.
본 연구에서는 직선 채널 또는 비선형 굴곡 채널을 갖춘 장 상피 세포 칩(gut-on-a-chip)과, 박스 1에 설명된 대로 제작한 미세유체 장치 내 트랜스웰(Transwell, TW) 인서트가 포함된 하이브리드 칩, 이렇게 두 가지 배양 플랫폼을 사용했습니다. "장치 제작" 섹션에서는 단일 칩 또는 하이브리드 칩 제작의 주요 단계를 보여줍니다. "인간 장 상피 세포 배양" 섹션에서는 본 프로토콜에 사용된 세포 공급원(Caco-2 또는 인간 장 오가노이드)과 배양 절차를 설명합니다. "시험관 내 형태 형성" 섹션에서는 Caco-2 또는 오가노이드 유래 상피 세포를 장 상피 세포 칩 또는 하이브리드 칩의 트랜스웰 인서트에서 배양한 후, 3D 형태 형성을 유도하고 특성화된 상피 구조를 형성하는 전체 단계를 보여줍니다. 각 화살표 아래에는 프로그램 단계 번호 또는 박스 번호가 표시되어 있습니다. 본 응용 프로그램은 확립된 장 상피층을 세포 분화 특성 분석, 장 생리학 연구, 장 조직 확립 등에 활용하는 방법을 예시로 제시합니다. 숙주-미생물 생태계 및 질병 모델링. "세포 분화" 섹션의 면역형광 이미지는 장 칩에서 생성된 3D Caco-2 상피층에서 발현되는 핵, F-액틴 및 MUC2를 보여줍니다. MUC2 신호전달은 술잔세포와 점막 표면에서 분비되는 점액에 존재합니다. "장 생리" 섹션의 형광 이미지는 형광 밀배아 응집소를 사용하여 시알산 및 N-아세틸글루코사민 잔류물을 염색하여 생성된 점액을 보여줍니다. "숙주-미생물 공동 배양" 섹션의 두 개의 겹치는 이미지는 칩 상의 장에서 대표적인 숙주-미생물 공동 배양을 보여줍니다. 왼쪽 패널은 미세공학적으로 제작된 3D Caco-2 상피세포와 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 대장균의 공동 배양을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 3D Caco-2 상피세포와 공동 배양된 GFP 대장균의 위치를 ​​보여주고, 이어서 면역형광 염색을 통해 얻은 결과입니다. F-액틴(빨간색)과 핵(파란색). 질병 모델링은 세균 항원(예: 지질다당류, LPS) 및 면역 세포(예: PBMC, 녹색)를 이용한 생리적 자극 하에서 장 염증 칩을 통해 건강한 장과 누출성 장을 비교합니다. Caco-2 세포를 배양하여 3D 상피층을 형성했습니다. 스케일 바: 50 µm. 맨 아래 줄 이미지: "세포 분화"는 참고문헌 2(옥스퍼드 대학교 출판부)에서 허가를 받아 사용했습니다. "숙주-미생물 공동 배양"은 참고문헌 3(NAS)에서 허가를 받아 사용했습니다. "질병 모델링"은 참고문헌 5(NAS)에서 허가를 받아 사용했습니다.
장 온 칩과 하이브리드 칩 모두 소프트 리소그래피¹⁴⁴를 이용하여 실리콘 몰드에서 탈형한 PDMS 복제본을 사용하여 제작하고 SU-8로 패터닝했습니다. 각 칩의 미세 채널 설계는 전단 응력 및 유체역학적 압력¹⁴⁻¹²과 같은 유체역학적 요소를 고려하여 결정됩니다. 원래의 장 온 칩 설계(확장 데이터 그림 1a)는 두 개의 평행한 직선 미세 채널이 나란히 배치된 형태였지만, 유체 체류 시간 증가, 비선형 유동 패턴, 배양 세포의 다축 변형을 유도하기 위해 한 쌍의 곡선 미세 채널을 포함하는 복잡한 장 온 칩(확장 데이터 그림 1b)으로 발전했습니다(그림 2a–f)¹². 보다 복잡한 장 생체역학을 재현해야 할 경우, 복잡한 장 온 칩을 선택할 수 있습니다. 본 연구에서는 복잡한 장 온 칩이 기존의 장 온 칩과 유사한 시간 내에 유사한 정도의 상피 성장을 유도하여 3D 형태 형성을 강력하게 촉진함을 보여주었습니다. 배양된 세포 유형에 관계없이 원래의 Gut-Chip과 동일한 방식으로 3D 형태 발생을 유도할 수 있습니다. 따라서 3D 형태 발생을 유도하기 위해 선형 및 복잡한 온칩 장 디자인을 상호 교환하여 사용할 수 있습니다. SU-8 패턴이 있는 실리콘 몰드에 경화된 PDMS 복제본은 탈형 후 음각 특징을 제공합니다(그림 2a). 칩에 장을 제작하기 위해 준비된 상부 PDMS 층을 다공성 PDMS 필름에 순차적으로 접합한 다음 코로나 처리기를 사용하여 비가역적 접합을 통해 하부 PDMS 층과 정렬했습니다(그림 2b–f). 하이브리드 칩을 제작하기 위해 경화된 PDMS 복제본을 유리 슬라이드에 접합하여 트랜스웰 인서트를 수용할 수 있는 단일 채널 미세유체 장치를 만들었습니다(그림 2h 및 확장 데이터 그림 2). 접합 과정은 PDMS 복제본과 유리 표면을 산소 플라즈마 또는 코로나 처리로 처리하여 수행합니다. 실리콘 튜브에 부착된 미세 가공 장치를 멸균한 후, 장 상피의 3D 형태 발생을 수행할 수 있도록 장치를 설정했습니다(그림). 2g).
a. SU-8 패턴 실리콘 몰드를 이용한 PDMS 부품 제작 과정의 개략도. 미경화 PDMS 용액을 실리콘 몰드에 붓고(왼쪽), 60°C에서 경화시킨 후(중간), 탈형하였다(오른쪽). 탈형된 PDMS는 조각으로 자르고 세척하여 추가 사용에 적합하게 하였다. b. PDMS 상층부 제작에 사용된 실리콘 몰드의 사진. c. PDMS 다공성 멤브레인 제작에 사용된 실리콘 몰드의 사진. d. 상층부 및 하층부 PDMS 구성 요소와 조립된 온칩 장 장치의 사진. e. 상층부, 멤브레인, 하층부 PDMS 구성 요소의 배열 개략도. 각 층은 플라즈마 또는 코로나 처리로 비가역적으로 접합되었다. f. 중첩된 복잡한 미세 채널과 진공 챔버를 갖는 제작된 온칩 장 장치의 개략도. g. 미세유체 세포 배양을 위한 온칩 장 장치 설치 모습. 실리콘 튜브와 주사기로 조립된 제작된 온칩 장을 커버슬립 위에 놓았다. 장치를 150mm 페트리 접시 뚜껑 위에 놓고 처리했습니다. 실리콘 튜브를 밀봉하기 위해 바인더를 사용했습니다. 하이브리드 칩 제작 및 하이브리드 칩을 이용한 3D 형태 형성의 시각적 스냅샷입니다. 장 상피 세포의 2D 단층을 배양하기 위해 별도로 준비된 트랜스웰 인서트를 하이브리드 칩에 삽입하여 장의 3D 형태 형성을 유도했습니다. 트랜스웰 인서트에 형성된 세포층 아래의 미세 채널을 통해 배지를 주입했습니다. 스케일 바: 1cm. 참고문헌 4에서 허가받아 재인쇄했습니다. Elsevier.
본 프로토콜에서는 Caco-2 세포주와 장 오가노이드를 상피세포 공급원으로 사용했습니다(그림 3a). 두 종류의 세포 모두 독립적으로 배양하여(상자 2 및 상자 5) 온칩 장 또는 트랜스웰 인서트의 ECM 코팅 마이크로채널에 접종했습니다. 세포가 밀집 배양되면(플라스크 내 95% 이상 피복률), T-플라스크에서 배양된 Caco-2 세포(10~50대 계대)를 수확하여 트립신 처리액으로 세포 현탁액을 준비했습니다(상자 2). 장 생검 또는 외과적 절제술로 얻은 인간 장 오가노이드는 구조적 미세환경을 지지하기 위해 24웰 플레이트의 Matrigel 스캐폴드 돔에서 배양했습니다. 상자 3에 설명된 대로 준비된 필수 형태형성인자(Wnt, R-스폰딘, 노긴 등) 및 성장인자를 포함하는 배지를 오가노이드가 약 500개 세포로 자랄 때까지 이틀에 한 번씩 보충했습니다. 직경이 µm인 오가노이드를 완전히 배양한 후, 단일 세포로 분리하여 칩 위의 장 또는 트랜스웰 인서트에 접종합니다(상자 5). 이전에 보고한 바와 같이, 질병 유형¹²,¹³(예: 궤양성 대장염, 크론병, 직장결장암 또는 정상 공여자), 병변 부위(예: 병변 부위 대 비병변 부위) 및 위장관 내 위치(예: 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장 또는 직장)에 따라 구분할 수 있습니다. 상자 5에서는 소장 오가노이드보다 일반적으로 더 높은 농도의 형태형성인자가 필요한 결장 오가노이드(콜로이드) 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다.
a. 장 칩에서 장 형태 발생 유도 워크플로. 본 프로토콜에서는 3D 형태 발생을 보여주기 위해 Caco-2 인간 장 상피 세포와 장 오가노이드를 사용합니다. 분리된 상피 세포를 준비된 장 칩 장치에 접종합니다(칩 준비). 세포를 접종하고 0일(D0)에 PDMS 다공성 막에 부착시킨 후, 처음 2일 동안 첨단(AP) 유동을 시작하고 유지합니다(유동, AP, D0-D2). 완전한 2D 단층이 형성되면 주기적인 신장 운동과 함께 기저측(BL) 유동도 시작합니다(신장, 유동, AP 및 BL). 미세유체 배양 5일 후 장의 3D 형태 발생이 자발적으로 일어납니다(형태 발생, D5). 위상차 현미경 이미지는 각 실험 단계 또는 시점에서 Caco-2 세포의 대표적인 형태를 보여줍니다(막대 그래프, 100 µm). 해당 단계를 설명하는 네 개의 개략도가 있습니다. a. 장 형태 형성의 연쇄 반응(오른쪽 상단). 도식의 점선 화살표는 유체 흐름 방향을 나타냅니다. b. 확립된 3D Caco-2 상피의 표면 형태를 보여주는 SEM 이미지(왼쪽). 확대된 영역(흰색 점선 상자)을 강조한 삽입 그림은 3D Caco-2 층에서 재생된 미세융모를 보여줍니다(오른쪽). c. 확립된 Caco-2 3D의 수평 정면도. 클라우딘(ZO-1, 빨간색)과 연속적인 솔 모양 경계막은 F-액틴(녹색) 및 핵(파란색)으로 표시되었습니다. 장 칩 위의 상피 세포에 대한 면역형광 공초점 현미경 이미지. 가운데 도식을 가리키는 화살표는 각 공초점 이미지의 초점면 위치를 나타냅니다. d. 칩에서 배양된 오가노이드의 형태학적 변화의 시간 경과. 3일, 7일, 9일, 11일 및 13일에 위상차 현미경으로 관찰했습니다. 삽입 그림(오른쪽 상단)은 제공된 이미지의 고배율 확대본입니다. 이미지 e, 7일째에 채취한 절편에서 장에 형성된 3D 오가노이드 상피의 DIC 현미경 사진. f, 장 칩에서 각각 3일(왼쪽)과 13일(가운데) 동안 배양한 오가노이드의 상피층에 대한 줄기세포(LGR5; 마젠타), 술잔세포(MUC2; 녹색), F-액틴(회색) 및 핵(청록색) 마커를 보여주는 중첩된 면역형광 이미지. MUC2 신호전달 없이 LGR5 신호전달을 강조하는 확장 데이터 그림 3도 참조하십시오. 배양 13일째에 CellMask 염색약으로 세포막을 염색하여 칩에서 장에 형성된 3D 오가노이드 상피의 상피 미세구조(오른쪽)를 보여주는 형광 이미지. 별도로 명시되지 않는 한 스케일 바는 50μm입니다. b 참고문헌 2에서 허가받아 재인쇄함. Oxford University Press; c 참고문헌 2에서 허가받아 수정함. Oxford University Press; e와 f는 참조를 통해 허가를 받아 수정되었습니다.12 크리에이티브 커먼즈 라이선스 CC BY 4.0에 따라.
칩 기반 장 배양에서 성공적인 세포외기질(ECM) 코팅을 위해서는 PDMS 다공성 막의 소수성 표면을 개질하는 것이 필수적입니다. 본 프로토콜에서는 PDMS 막의 소수성을 개질하기 위해 두 가지 다른 방법을 적용했습니다. Caco-2 세포 배양의 경우, UV/오존 처리만으로 PDMS 표면의 소수성을 감소시키고 ECM을 코팅하며 Caco-2 세포를 PDMS 막에 부착하는 데 충분했습니다. 그러나 미세유체 환경에서 오가노이드 상피를 배양하려면 ECM 단백질의 효율적인 증착을 위해 폴리에틸렌이민(PEI)과 글루타르알데히드를 PDMS 미세채널에 순차적으로 적용하는 화학적 표면 기능화가 필요합니다. 표면 개질 후, ECM 단백질이 기능화된 PDMS 표면을 덮도록 증착된 후 분리된 오가노이드 상피에 도입되었습니다. 세포가 부착된 후, 상부 미세채널에는 세포가 완전한 단층을 형성할 때까지 배양액만 주입하고 하부 미세채널은 정지 상태를 유지하여 미세유체 세포 배양을 시작했습니다. 이 최적화된 표면 활성화 및 ECM 코팅 방법은 오가노이드의 부착을 가능하게 합니다. PDMS 표면에서 3D 형태 형성을 유도하기 위한 상피세포.
트랜스웰 배양법 역시 세포 접종 전에 ECM 코팅이 필요하지만, 다공성 인서트 표면 활성화를 위한 복잡한 전처리 단계는 필요하지 않습니다. 트랜스웰 인서트에서 Caco-2 세포를 배양할 때, 다공성 인서트에 ECM 코팅을 하면 분리된 Caco-2 세포의 부착(1시간 미만)과 치밀연접 장벽 형성(1~2일 미만)이 촉진됩니다. 트랜스웰 인서트에서 오가노이드를 배양하려면, 분리된 오가노이드를 ECM 코팅된 인서트에 접종하고 막 표면에 부착시킨 후(3시간 미만), 오가노이드가 장벽 기능을 갖춘 완전한 단층을 형성할 때까지 유지합니다. 트랜스웰 배양은 하이브리드 칩을 사용하지 않고 24웰 플레이트에서 수행됩니다.
시험관 내 3D 형태 형성은 확립된 상피층의 기저측에 유체 흐름을 적용함으로써 시작될 수 있습니다. 칩 위의 장(gut on a chip)에서 상피 형태 형성은 상부 및 하부 미세 채널에 배지를 주입했을 때 시작되었습니다(그림 3a). 앞서 설명한 바와 같이, 방향성 분비 형태 형성 억제제를 지속적으로 제거하기 위해서는 하부(기저측) 구획에 유체 흐름을 도입하는 것이 중요합니다. 다공성 막에 결합된 세포에 충분한 영양분과 혈청을 공급하고 내강 전단 응력을 생성하기 위해, 우리는 일반적으로 칩 위의 장(gut on a chip)에 이중 흐름을 적용합니다. 하이브리드 칩에서는 상피 단층을 포함하는 트랜스웰(Transwell) 인서트를 하이브리드 칩에 삽입했습니다. 그런 다음, 미세 채널을 통해 다공성 트랜스웰 인서트의 기저측 아래에 배지를 적용했습니다. 두 배양 플랫폼 모두에서 기저측 흐름 시작 후 3~5일 후에 장 형태 형성이 발생했습니다.
미세공학적으로 제작된 3D 상피층의 형태학적 특징은 위상차 현미경, 미분 간섭 대비(DIC) 현미경, SEM 또는 면역형광 공초점 현미경을 포함한 다양한 이미징 방식을 적용하여 분석할 수 있습니다(그림 3 및 4). 위상차 또는 DIC 이미징은 배양 중 언제든지 쉽게 수행하여 3D 상피층의 모양과 돌출부를 모니터링할 수 있습니다. PDMS 및 폴리에스터 필름의 광학적 투명성 덕분에 장 칩(gut-on-a-chip) 및 하이브리드 칩 플랫폼 모두 장치를 절단하거나 분해할 필요 없이 실시간 현장 이미징을 제공할 수 있습니다. 면역형광 이미징을 수행할 때(그림 1, 3c, f 및 4b, c), 세포는 일반적으로 4%(wt/vol) 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 다음, Triton X-100 및 2%(wt/vol) 소 혈청 알부민(BSA)으로 순차적으로 고정합니다. 세포 유형, 다른 고정액, 투과 촉진제와 차단제를 사용할 수 있습니다. 세포 계통 또는 영역 마커를 표적으로 하는 1차 항체를 사용하여 칩에 고정된 세포를 강조 표시하고, 이어서 핵(예: 4′,6-디아미디노-2-페닐렌 인돌, DAPI) 또는 F-액틴(예: 형광 표지된 팔로이딘)을 표적으로 하는 대조 염색 시약과 함께 2차 항체를 사용합니다. 형광 기반 실시간 이미징을 통해 점액 생성(그림 1, "세포 분화" 및 "장 생리"), 미생물 세포의 무작위 군집화(그림 1, "숙주-미생물 공동 배양"), 면역 세포의 모집(그림 1, "질병 모델링") 또는 3D 상피 형태의 윤곽(그림 3c,f 및 4b,c)을 현장에서 관찰할 수 있습니다. 참고 문헌에 설명된 대로 칩의 장을 변형하여 상부층과 하부 미세 채널층을 분리할 때, 그림에 나타낸 바와 같이, 2. 3D 상피 형태와 첨단 솔 모양 경계면의 미세융모는 SEM으로 시각화할 수 있습니다(그림 3b). 분화 마커의 발현은 정량적 PCR5 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통해 평가할 수 있습니다. 이 경우, 장 칩 또는 하이브리드 칩에서 배양된 3D 상피 세포층은 트립신 처리하여 수확한 후 분자 또는 유전 분석에 사용합니다.
a. 하이브리드 칩에서 장 형태 형성 유도 워크플로우. 이 프로토콜에서는 Caco-2 세포와 장 오가노이드를 사용하여 하이브리드 칩 플랫폼에서 3D 형태 형성을 시연합니다. 분리된 상피 세포를 준비된 트랜스웰 인서트(TW prep; 아래 그림 참조)에 접종했습니다. 세포가 접종되어 트랜스웰 인서트의 폴리에스터 막에 부착되면 모든 세포를 정지 조건(TW culture)에서 배양했습니다. 7일 후, 2D 상피 세포 단층을 포함하는 단일 트랜스웰 인서트를 하이브리드 칩에 통합하여 기저측 유동(Flow, BL)을 유도함으로써 최종적으로 3D 상피층을 형성했습니다(형태 형성). 각 실험 단계 또는 시점에서 정상 공여자(C103 세포주)의 상행 결장에서 유래한 인간 장기 상피 세포의 형태학적 특징을 보여주는 위상차 현미경 사진입니다. 위쪽 레이어의 개략도는 각 단계의 실험 구성을 보여줍니다. b. 하이브리드 칩(왼쪽 개략도)은 다음을 유도할 수 있습니다. 다양한 Z 위치(상단, 중간, 하단; 오른쪽 개략도 및 해당 점선 참조)에서 촬영한 탑다운 공초점 현미경 이미지를 통해 오가노이드 상피 세포의 3D 형태 발생을 관찰한 결과, 명확한 형태학적 특징이 나타났다. F-액틴(청록색), 핵(회색). c, 정적 트랜스웰(TW; 흰색 점선 상자 안의 삽입 이미지)과 하이브리드 칩(가장 큰 전체 이미지)에서 배양한 오가노이드 유래 상피 세포의 형광 공초점 현미경 이미지(3D 각도 이미지)를 비교하여 2D 형태와 3D 형태를 각각 보여준다. 한 쌍의 2D 수직 단면 이미지(오른쪽 상단 모서리의 삽입 이미지; "XZ") 또한 2D 및 3D 특징을 보여준다. 스케일 바, 100 µm. c 참고문헌 4에서 허가받아 재인쇄함. Elsevier.
대조군은 동일한 세포(Caco-2 또는 장 상피세포)를 기존의 정적 배양 조건에서 2차원 단층으로 배양하여 준비할 수 있습니다. 특히, 미세 채널의 제한된 부피 용량(예: 기존 장 칩 설계의 상단 채널의 약 4µL)으로 인해 영양분 고갈이 발생할 수 있습니다. 따라서 기저측 유동 적용 전후의 상피 형태를 비교할 수도 있습니다.
소프트 리소그래피 공정은 클린룸에서 수행되어야 합니다. 칩의 각 층(상부, 하부 층 및 멤브레인)과 하이브리드 칩의 경우, 미세 채널의 높이가 서로 다르기 때문에 각각 다른 포토마스크를 사용하고 별도의 실리콘 웨이퍼에 제작했습니다. 칩의 상부 및 하부 미세 채널의 목표 높이는 각각 500µm와 200µm입니다. 하이브리드 칩의 채널 목표 높이는 200µm입니다.
3인치 실리콘 웨이퍼를 아세톤이 담긴 접시에 넣습니다. 접시를 30초 동안 부드럽게 흔든 다음 웨이퍼를 공기 중에서 건조시킵니다. 웨이퍼를 IPA가 담긴 접시로 옮긴 후 접시를 30초 동안 회전시켜 세척합니다.
피라냐 용액(과산화수소와 진한 황산의 1:3(부피비) 혼합물)은 실리콘 웨이퍼 표면에서 유기 잔류물을 최대한 제거하기 위해 선택적으로 사용할 수 있습니다.
피라냐 용액은 부식성이 매우 강하고 열을 발생시키므로 추가적인 안전 조치가 필요합니다. 폐기물 처리 시에는 용액을 식힌 후 깨끗하고 건조한 폐기물 용기에 옮겨 담으십시오. 2차 용기를 사용하고 폐기물 용기에 적절한 라벨을 부착하십시오. 더 자세한 절차는 시설의 안전 지침을 따르십시오.
웨이퍼를 200°C 가열판에 10분 동안 올려놓아 탈수시킵니다. 탈수 후, 웨이퍼를 공기 중에서 5회 흔들어 식힙니다.
세척된 실리콘 웨이퍼 중앙에 포토레지스트 SU-8 2100 약 10g을 붓습니다. 핀셋을 사용하여 포토레지스트를 웨이퍼 전체에 고르게 펴 바릅니다. 포토레지스트의 점착성을 줄이고 펴 바르기 쉽게 하기 위해 웨이퍼를 65°C로 가열된 핫플레이트에 가끔씩 올려놓습니다. 웨이퍼를 핫플레이트에 직접 올려놓지 마십시오.
SU-8은 스핀 코팅을 통해 웨이퍼 상에 고르게 도포되었습니다. SU-8의 회전 방향을 5~10초 동안 500rpm, 가속도 100rpm/s로 설정하여 회전시킵니다. 200µm 두께의 패터닝을 위해서는 주 스핀을 1,500rpm으로 설정하거나, 250µm 두께(칩 상의 장 상층부 높이는 500µm, 아래 "중요 단계" 참조)를 위해서는 300rpm/s의 가속도로 1,200rpm에서 30초 동안 설정합니다.
메인 스핀 속도는 실리콘 웨이퍼 상의 SU-8 패턴의 목표 두께에 따라 조절할 수 있습니다.
칩 상의 상부층에 500µm 높이의 SU-8 패턴을 제작하기 위해, 본 박스의 스핀 코팅 및 소프트 베이킹 단계(7단계 및 8단계)를 순차적으로 반복하여(9단계 참조) 250µm 두께의 SU-8 층 두 개를 형성하고, 이를 본 박스의 12단계에서 UV 노출을 통해 접합하여 500µm 높이의 층을 완성한다.
SU-8 코팅 웨이퍼를 부드럽게 굽기 위해 웨이퍼를 핫플레이트에 조심스럽게 올려놓고 65°C에서 5분간 가열한 다음, 온도를 95°C로 높여 40분 더 가열합니다.
상부 마이크로채널에서 SU-8 패턴의 높이를 500μm로 만들기 위해서는 7단계와 8단계를 반복하여 250μm 두께의 SU-8 층 두 개를 생성하십시오.
UV 마스크 얼라이너를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 램프 테스트를 수행하여 웨이퍼의 노출 시간을 계산합니다. (노출 시간, ms) = (노출량, mJ/cm2)/(램프 출력, mW/cm2).
노출 시간을 결정한 후, 포토마스크를 UV 마스크 얼라이너의 마스크 홀더에 놓고 SU-8 코팅된 웨이퍼 위에 올려놓습니다.
자외선 확산을 최소화하기 위해 포토마스크의 인쇄면을 실리콘 웨이퍼의 SU-8 코팅면에 직접 놓으십시오.
SU-8 코팅된 웨이퍼와 포토마스크를 260 mJ/cm2의 UV 광선에 미리 정해진 노출 시간 동안 수직으로 노출시킵니다(이 상자의 10단계 참조).
UV 조사 후, SU-8 코팅된 실리콘 웨이퍼를 핫 플레이트에서 각각 65°C에서 5분, 95°C에서 15분 동안 가열하여 높이 200μm의 패턴을 제작했습니다. 95°C에서의 후처리 시간을 30분으로 연장하면 높이 500μm의 패턴을 제작할 수 있습니다.
현상액을 유리 접시에 붓고, 구운 웨이퍼를 접시에 넣습니다. SU-8 현상액의 양은 유리 접시의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 노출되지 않은 SU-8이 완전히 제거될 수 있도록 충분한 양의 SU-8 현상액을 사용하십시오. 예를 들어, 직경 150mm, 용량 1L의 유리 접시를 사용하는 경우 약 300mL의 SU-8 현상액을 사용합니다. 25분 동안 현상하면서 가끔씩 부드럽게 돌려줍니다.
현상된 곰팡이를 약 10mL의 새 현상액으로 헹군 다음, 피펫을 사용하여 IPA 용액을 분사하여 헹굽니다.
웨이퍼를 플라즈마 클리너에 넣고 산소 플라즈마(대기 가스, 목표 압력 1 × 10⁻⁵ Torr, 전력 125 W)에 1.5분 동안 노출시킵니다.
유리 슬라이드가 들어 있는 진공 데시케이터에 웨이퍼를 넣습니다. 웨이퍼와 슬라이드는 나란히 놓을 수 있습니다. 진공 데시케이터가 판으로 여러 층으로 나뉘어 있는 경우, 슬라이드는 아래쪽 칸에, 웨이퍼는 위쪽 칸에 놓습니다. 유리 슬라이드 위에 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸)실란 용액 100 μL를 떨어뜨리고 진공을 가하여 실란화합니다.
냉동된 Caco-2 세포가 담긴 바이알을 37°C 수조에서 해동한 다음, 해동된 세포를 37°C로 미리 데워진 Caco-2 배지 15mL가 들어 있는 T75 플라스크로 옮깁니다.
Caco-2 세포를 약 90% 밀도로 배양하려면 먼저 Caco-2 배지, PBS 및 0.25% 트립신/1 mM EDTA를 37°C 수조에서 데우십시오.
진공 흡입기를 이용하여 배양액을 제거합니다. 진공 흡입을 반복하고 새로운 PBS를 첨가하여 따뜻한 PBS 5mL로 세포를 두 번 세척합니다.