გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
ადამიანის ნაწლავის მორფოგენეზი ადგენს კრიპტ-ხაოების 3D ეპითელური მიკროარქიტექტურისა და სივრცითი ორგანიზაციის მახასიათებლებს. ეს უნიკალური სტრუქტურა აუცილებელია ნაწლავის ჰომეოსტაზის შესანარჩუნებლად, ბაზალურ კრიპტში ღეროვანი უჯრედების ნიშის ეგზოგენური მიკრობული ანტიგენებისა და მათი მეტაბოლიტების დაცვით. გარდა ამისა, ნაწლავის ხაოები და გამომყოფი ლორწო წარმოადგენს ფუნქციურად დიფერენცირებულ ეპითელურ უჯრედებს ნაწლავის ლორწოვანი გარსის ზედაპირზე დამცავი ბარიერით. ამიტომ, 3D ეპითელური სტრუქტურების ხელახლა შექმნა გადამწყვეტია in vitro ნაწლავის მოდელების აგებისთვის. აღსანიშნავია, რომ ორგანული მიმიკური ნაწლავის ჩიპზე გამოყენებას შეუძლია ნაწლავის ეპითელიუმის სპონტანური 3D მორფოგენეზის ინდუცირება გაძლიერებული ფიზიოლოგიური ფუნქციებითა და ბიომექანიკით. აქ ჩვენ გთავაზობთ რეპროდუცირებად პროტოკოლს ნაწლავში ნაწლავის მორფოგენეზის ინდუცირებისთვის მიკროფლუიდურ ჩიპზე, ასევე Transwell-ში ჩაშენებულ ჰიბრიდულ ჩიპზე. ჩვენ აღვწერთ მოწყობილობის დამზადების, Caco-2 ან ნაწლავის ორგანოიდური ეპითელური უჯრედების კულტივირების, როგორც ჩვეულებრივ, ასევე მიკროფლუიდურ პლატფორმაზე, 3D მორფოგენეზის ინდუქციის და დადგენილი 3D-ის დახასიათების დეტალურ მეთოდებს. ეპითელიუმის გამოკვლევა მრავალი ვიზუალიზაციის მეთოდის გამოყენებით. ეს პროტოკოლი აღწევს ფუნქციური ნაწლავის მიკროარქიტექტურის რეგენერაციას 5 დღის განმავლობაში ბაზოლატერალური სითხის ნაკადის კონტროლით. ჩვენი in vitro მორფოგენეზის მეთოდი იყენებს ფიზიოლოგიურად შესაბამის ძვრის სტრესს და მექანიკურ მოძრაობას და არ საჭიროებს კომპლექსურ უჯრედულ ინჟინერიას ან მანიპულირებას, რამაც შეიძლება გადააჭარბოს სხვა არსებულ ტექნიკას. ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ჩვენს შემოთავაზებულ პროტოკოლს შეიძლება ჰქონდეს ფართო გავლენა ბიოსამედიცინო კვლევის საზოგადოებისთვის, რაც უზრუნველყოფს მეთოდს ნაწლავის ეპითელური ფენების 3D რეგენერაციისთვის in vitro ბიოსამედიცინო, კლინიკური და ფარმაცევტული გამოყენებისთვის.
ექსპერიმენტები აჩვენებს, რომ ნაწლავის ეპითელური Caco-2 უჯრედები, რომლებიც კულტივირებულია gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ან ორშრიან მიკროფლუიდურ მოწყობილობებში6,7, შეიძლება განიცადოს სპონტანური 3D მორფოგენეზი in vitro, ძირითადი მექანიზმის მკაფიო გაგების გარეშე. ჩვენს ბოლოდროინდელ კვლევაში აღმოვაჩინეთ, რომ ბაზოლატერალურად სეკრეტირებული მორფოგენის ანტაგონისტების მოცილება კულტივირების მოწყობილობებიდან აუცილებელია და საკმარისია 3D ეპითელური მორფოგენეზის ინდუცირებისთვის in vitro, რაც დადასტურდა Caco-2-ით და პაციენტებისგან მიღებული ნაწლავის ორგანოიდებით. ეპითელური უჯრედები დადასტურდა. ამ კვლევაში, ჩვენ კონკრეტულად გავამახვილეთ ყურადღება უჯრედების წარმოებასა და კონცენტრაციის განაწილებაზე ძლიერი Wnt ანტაგონისტის, Dickkopf-1-ის (DKK-1), ჩიპზე განთავსებულ ნაწლავში და მოდიფიცირებულ მიკროფლუიდურ მოწყობილობებში, რომლებიც შეიცავენ Transwell-ის ჩანართებს, რომლებსაც „ჰიბრიდულ ჩიპს“ უწოდებენ. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ეგზოგენური Wnt ანტაგონისტების (როგორიცაა DKK-1, Wnt რეპრესორი 1, გამოყოფილი ფრიზლირებულ ცილა 1, ან Soggy-1) დამატება ჩიპზე განთავსებულ ნაწლავში აფერხებს მორფოგენეზს ან არღვევს წინასწარ სტრუქტურირებულ 3D ეპითელურ შრეს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ კულტურის დროს ანტაგონისტური სტრესი პასუხისმგებელია ნაწლავის მორფოგენეზზე in vitro. ამიტომ, ეპითელურ ინტერფეისზე ძლიერი მორფოგენეზის მისაღწევად პრაქტიკული მიდგომაა Wnt ანტაგონისტების დონის მოცილება ან მინიმალურად შენარჩუნება ბაზოლატერალურ განყოფილებაში აქტიური გამორეცხვით (მაგ., ჩიპზე განთავსებულ ან ჰიბრიდულ პლატფორმებზე) ან დიფუზიით. ბაზოლატერალური მედია (მაგ., Transwell-ის ჩანართებიდან დიდ ბაზოლატერალურ რეზერვუარებში) ჭები).
ამ პროტოკოლში ჩვენ გთავაზობთ დეტალურ მეთოდს ჩიპზე დაფუძნებული მიკრომოწყობილობების და ტრანსველში ჩასადგმელი ჰიბრიდული ჩიპების (ნაბიჯები 1-5) დასამზადებლად, რათა ნაწლავის ეპითელური უჯრედები პოლიდიმეთილსილოქსანზე (PDMS) დაფუძნებულ ფოროვან მემბრანებზე (ნაბიჯები 6A, 7A, 8, 9) ან ტრანსველში ჩასადგმელი ჩანართების პოლიესტერის მემბრანებზე (ნაბიჯები 6B, 7B, 8, 9) კულტივირება მოხდეს და ინ ვიტრო (ნაბიჯი 10) 3D მორფოგენეზი გამოვიწვიოთ. ჩვენ ასევე გამოვავლინეთ ქსოვილ-სპეციფიკური ჰისტოგენეზისა და შთამომავლობაზე დამოკიდებული უჯრედული დიფერენციაციის მანიშნებელი უჯრედული და მოლეკულური მახასიათებლები მრავალი ვიზუალიზაციის მეთოდის გამოყენებით (ნაბიჯები 11-24). ჩვენ ვახდენთ მორფოგენეზის ინდუცირებას ადამიანის ნაწლავის ეპითელური უჯრედების, როგორიცაა Caco-2 ან ნაწლავის ორგანოიდების გამოყენებით, ორ კულტურულ ფორმატში, ტექნიკური დეტალებით, მათ შორის ფოროვანი მემბრანების ზედაპირის მოდიფიკაცია, 2D მონოშრეების შექმნა და ნაწლავის ბიოქიმიური და ბიომექანიკური მიკროგარემოს რეპროდუქცია ინ ვიტრო. 2D ეპითელური მონოშრეებიდან 3D მორფოგენეზის ინდუცირებისთვის, ჩვენ ამოვიღეთ... მორფოგენის ანტაგონისტები ორივე კულტივირებულ ფორმაში, ნიადაგის კულტურის ბაზოლატერალურ განყოფილებაში შეყვანით. და ბოლოს, ჩვენ წარმოგიდგენთ რეგენერირებადი 3D ეპითელური ფენის სარგებლიანობის წარმოდგენას, რომლის გამოყენება შესაძლებელია მორფოგენ-დამოკიდებული ეპითელური ზრდის, მასპინძელ-მიკრობიომის გრძივი კოკულტურების, პათოგენური ინფექციის, ანთებითი დაზიანების, ეპითელური ბარიერის დისფუნქციის და პრობიოტიკებზე დაფუძნებული თერაპიების მოდელირებისთვის. მაგალითები. გავლენა.
ჩვენი პროტოკოლი შეიძლება სასარგებლო იყოს მეცნიერთა ფართო სპექტრისთვის საბაზისო (მაგ., ნაწლავის ლორწოვანი გარსის ბიოლოგია, ღეროვანი უჯრედების ბიოლოგია და განვითარების ბიოლოგია) და გამოყენებითი კვლევების (მაგ., პრეკლინიკური წამლის ტესტირება, დაავადებათა მოდელირება, ქსოვილების ინჟინერია და გასტროენტეროლოგია) ფართო გავლენის მქონე სფეროებში. ჩვენი პროტოკოლის რეპროდუცირებადობისა და სიმტკიცის გამო, რომელიც მიზნად ისახავს ნაწლავის ეპითელიუმის 3D მორფოგენეზის ინ ვიტრო ინდუცირებას, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ჩვენი ტექნიკური სტრატეგია შეიძლება გავრცელდეს აუდიტორიაში, რომელიც სწავლობს უჯრედული სიგნალიზაციის დინამიკას ნაწლავის განვითარების, რეგენერაციის ან ჰომეოსტაზის დროს. გარდა ამისა, ჩვენი პროტოკოლი სასარგებლოა სხვადასხვა ინფექციური აგენტებით, როგორიცაა ნოროვირუსი 8, მძიმე მწვავე რესპირატორული სინდრომის კორონავირუსი 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ან Vibrio cholerae, ინფექციის გამოკვლევისთვის. დაავადების პათოლოგიისა და პათოგენეზის აუდიტორია ასევე სასარგებლოა. ჩიპზე დამონტაჟებული ნაწლავის მიკროფიზიოლოგიის სისტემის გამოყენებამ შეიძლება შესაძლებელი გახადოს გრძივი თანაკულტივირება 10 და შემდგომში მასპინძლის თავდაცვის, იმუნური რეაქციების და კუჭ-ნაწლავის (GI) ტრაქტში პათოგენთან დაკავშირებული დაზიანების აღდგენის შეფასება 11. სხვა კუჭ-ნაწლავის დარღვევები, რომლებიც დაკავშირებულია გაჟონვის სინდრომთან, ცელიაკიასთან, კრონის დაავადებასთან, წყლულოვან კოლიტთან, პოუჩიტთან ან გაღიზიანებული ნაწლავის სინდრომთან, შეიძლება სიმულირდეს, როდესაც ნაწლავის ეპითელური ფენები მზადდება პაციენტის ნაწლავის 3D ეპითელური ფენების გამოყენებით, ეს დაავადებები მოიცავს ხაოების ატროფიას, კრიპტების დამოკლებას, ლორწოვანი გარსის დაზიანებას ან ეპითელური ბარიერის დარღვევას. ბიოფსია ან ღეროვანი უჯრედებიდან მიღებული ნაწლავის ორგანოიდები 12,13. დაავადების გარემოს მაღალი სირთულის უკეთ მოდელირებისთვის, მკითხველს შეუძლია განიხილოს დაავადებასთან დაკავშირებული უჯრედების ტიპების დამატება, როგორიცაა პაციენტის პერიფერიული სისხლის მონონუკლეარული უჯრედები (PBMCs), ნაწლავის ხაო-კრიპტის 3D მიკროარქიტექტურის შემცველ მოდელებში. ქსოვილ-სპეციფიკური იმუნური უჯრედები, 5.
ვინაიდან 3D ეპითელური მიკროსტრუქტურის ფიქსირება და ვიზუალიზაცია შესაძლებელია კვეთის პროცესის გარეშე, სივრცულ ტრანსკრიპტომიკასა და მაღალი გარჩევადობის ან სუპერგარჩევადობის ვიზუალიზაციაზე მომუშავე მაყურებლები შეიძლება დაინტერესდნენ ეპითელურ ნიშებზე გენებისა და ცილების სივრცულ-დროითი დინამიკის ჩვენი რუკებით. დაინტერესებული არიან ტექნოლოგიებით. მიკრობულ ან იმუნურ სტიმულებზე რეაგირება. გარდა ამისა, მასპინძელ-მიკრობიომის გრძივი ურთიერთქმედება 10, 14, რომელიც კოორდინაციას უწევს ნაწლავის ჰომეოსტაზს, შეიძლება დამყარდეს 3D ნაწლავის ლორწოვან გარსში სხვადასხვა მიკრობული სახეობების, მიკრობული თემების ან ფეკალური მიკრობიოტის თანაკულტივირებით, განსაკუთრებით ჩიპზე არსებულ ნაწლავში. პლატფორმაზე. ეს მიდგომა განსაკუთრებით მიმზიდველია იმ აუდიტორიისთვის, რომელიც სწავლობს ლორწოვანი გარსის იმუნოლოგიას, გასტროენტეროლოგიას, ადამიანის მიკრობიომს, კულტურომიკას და კლინიკურ მიკრობიოლოგიას, რომლებიც ცდილობენ ლაბორატორიაში ადრე არაკულტივირებული ნაწლავის მიკრობიოტის კულტივირებას. თუ ჩვენი in vitro მორფოგენეზის პროტოკოლი შეიძლება ადაპტირებული იყოს მასშტაბირებად კულტურულ ფორმატებთან, როგორიცაა მრავალჭაბურღილიან ჩანართები 24, 96 ან 384 ჭიანჭლიან ფირფიტებში, რომლებიც მუდმივად ავსებენ ბაზოლატერალურ კომპარტმენტებს, პროტოკოლი ასევე შეიძლება გავრცელდეს მათ შორის, ვინც ავითარებს ფარმაცევტულ, ბიოსამედიცინო ან მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის ან ვალიდაციის პლატფორმებს კვების მრეწველობისთვის. პრინციპის დასამტკიცებლად, ჩვენ ცოტა ხნის წინ ვაჩვენეთ მულტიპლექსური მაღალი გამტარუნარიანობის მორფოგენეზის სისტემის შესაძლებლობა, რომელიც მასშტაბირებადია 24 ჭიანჭლიან ფირფიტის ფორმატზე. გარდა ამისა, კომერციალიზებულია მრავალი ორგანო ჩიპზე დამზადებული პროდუქტები16,17,18. ამრიგად, ჩვენი in vitro მორფოგენეზის მეთოდის ვალიდაცია შეიძლება დაჩქარდეს და პოტენციურად იქნას გამოყენებული მრავალი კვლევითი ლაბორატორიის, ინდუსტრიის ან მთავრობისა და მარეგულირებელი სააგენტოს მიერ, რათა გაიგონ in vitro ნაწლავის მორფოგენეზის უჯრედული რეპროგრამირება ტრანსკრიპტომიურ დონეზე, რათა გამოსცადონ პრეპარატები ან ბიოთერაპიული საშუალებები. ნაწლავის მორფოგენეზის პროცესის რეპროდუცირებადობის შესაფასებლად, კანდიდატი პრეპარატების შეწოვა და ტრანსპორტირება შეფასდა ნაწლავის 3D სუროგატების ან ჩიპზე დამონტაჟებული ორგანოების მორგებული ან კომერციული მოდელების გამოყენებით.
ნაწლავის ეპითელური მორფოგენეზის შესასწავლად გამოყენებული იქნა ადამიანისთვის შესაფერისი ექსპერიმენტული მოდელების შეზღუდული რაოდენობა, ძირითადად ინ ვიტრო 3D მორფოგენეზის გამოსაწვევად განსახორციელებელი პროტოკოლების არარსებობის გამო. სინამდვილეში, ნაწლავის მორფოგენეზის შესახებ ამჟამინდელი ცოდნის დიდი ნაწილი ცხოველებზე ჩატარებულ კვლევებს ეფუძნება (მაგ., ზებრა თევზი20, თაგვები21 ან ქათმები22). თუმცა, ისინი შრომატევადი და ძვირია, შეიძლება ეთიკურად საეჭვო იყოს და რაც მთავარია, ზუსტად არ განსაზღვრავს ადამიანის განვითარების პროცესებს. ამ მოდელებს ასევე ძალიან შეზღუდული აქვთ მრავალმხრივი მასშტაბირების უნარი. ამიტომ, ჩვენი პროტოკოლი 3D ქსოვილოვანი სტრუქტურების რეგენერაციისთვის ინ ვიტრო აღემატება ინ ვივო ცხოველურ მოდელებს, ასევე სხვა ტრადიციულ სტატიკურ 2D უჯრედული კულტურის მოდელებს. როგორც ადრე იყო აღწერილი, 3D ეპითელური სტრუქტურების გამოყენებამ საშუალება მოგვცა შეგვესწავლა დიფერენცირებული უჯრედების სივრცითი ლოკალიზაცია კრიპტ-ხაოების ღერძში სხვადასხვა ლორწოვანი ან იმუნური სტიმულის საპასუხოდ. 3D ეპითელური შრეები შეიძლება უზრუნველყოფდეს სივრცეს იმის შესასწავლად, თუ როგორ კონკურენციას უწევენ მიკრობული უჯრედები სივრცითი ნიშების ფორმირებას და ეკოლოგიურ ევოლუციას მასპინძელი ფაქტორების საპასუხოდ (მაგ., შიდა და გარე). ლორწოს ფენები, IgA-ს სეკრეცია და ანტიმიკრობული პეპტიდები). გარდა ამისა, 3D ეპითელური მორფოლოგია საშუალებას გვაძლევს გავიგოთ, თუ როგორ აყალიბებს ნაწლავის მიკრობიოტა თავის საზოგადოებებს და სინერგიულად წარმოქმნის მიკრობულ მეტაბოლიტებს (მაგ., მოკლეჯაჭვიან ცხიმოვან მჟავებს), რომლებიც ქმნიან უჯრედულ ორგანიზაციას და ღეროვანი უჯრედების ნიშებს ბაზალურ კრიპტებში. ეს მახასიათებლების დემონსტრირება შესაძლებელია მხოლოდ მაშინ, როდესაც 3D ეპითელური ფენები ჩამოყალიბდება in vitro.
ნაწლავის ეპითელური სტრუქტურების სამგანზომილებიანი შექმნის ჩვენი მეთოდის გარდა, არსებობს რამდენიმე in vitro მეთოდი. ნაწლავის ორგანოიდური კულტურა ქსოვილების ინჟინერიის უახლესი ტექნიკაა, რომელიც დაფუძნებულია ნაწლავის ღეროვანი უჯრედების კულტივაციაზე სპეციფიკური მორფოგენის პირობებში23,24,25. თუმცა, ტრანსპორტის ანალიზისთვის ან მასპინძელ-მიკრობიომის კოკულტურებისთვის 3D ორგანოიდური მოდელების გამოყენება ხშირად რთულია, რადგან ნაწლავის სანათური ორგანოიდის შიგნითაა შემოსაზღვრული და, შესაბამისად, სანათურის კომპონენტების, როგორიცაა მიკრობული უჯრედები ან ეგზოგენური ანტიგენები, შეყვანა შეზღუდულია. ორგანოიდის სანათურებზე წვდომა შეიძლება გაუმჯობესდეს მიკროინექტორის გამოყენებით26,27, მაგრამ ეს მეთოდი ინვაზიური და შრომატევადია და შესასრულებლად სპეციალიზებულ ცოდნას მოითხოვს. გარდა ამისა, ტრადიციული ორგანოიდური კულტურები, რომლებიც ჰიდროგელის ხარაჩოებში ინახება სტატიკურ პირობებში, ზუსტად არ ასახავს აქტიურ in vivo ბიომექანიკას.
სხვა მიდგომები, რომლებსაც რამდენიმე კვლევითი ჯგუფი იყენებს, იყენებს წინასწარ სტრუქტურირებულ 3D ჰიდროგელის ხარაჩოებს ნაწლავის ეპითელური სტრუქტურის იმიტაციისთვის, გელის ზედაპირზე იზოლირებული ადამიანის ნაწლავის უჯრედების კულტივირებით. ჰიდროგელის ხარაჩოების დამზადება 3D დაბეჭდილი, მიკროდაფქული ან ლითოგრაფიულად დამზადებული ფორმების გამოყენებით. ეს მეთოდი აჩვენებს იზოლირებული ეპითელური უჯრედების თვითორგანიზებულ განლაგებას in vitro ფიზიოლოგიურად შესაბამისი მორფოგენის გრადიენტებით, რაც ქმნის მაღალი ასპექტის თანაფარდობის ეპითელური სტრუქტურას და სტრომა-ეპითელური ჯვარედინი ურთიერთქმედებას ხარაჩოში სტრომული უჯრედების ჩართვით. თუმცა, წინასწარ სტრუქტურირებული ხარაჩოების ბუნებამ შეიძლება ხელი შეუშალოს თავად სპონტანური მორფოგენეტიკური პროცესის ჩვენებას. ეს მოდელები ასევე არ უზრუნველყოფენ დინამიურ სანათურში ან ინტერსტიციულ ნაკადს, არ გააჩნიათ სითხის ძვრის სტრესი, რომელიც ნაწლავის უჯრედებს სჭირდებათ მორფოგენეზის გასავლელად და ფიზიოლოგიური ფუნქციის მოსაპოვებლად. კიდევ ერთმა ბოლოდროინდელმა კვლევამ გამოიყენა ჰიდროგელის ხარაჩოები მიკროფლუიდურ პლატფორმაზე და შექმნა ნაწლავის ეპითელური სტრუქტურები ლაზერული გრავირების ტექნიკის გამოყენებით. თაგვის ნაწლავის ორგანოიდები მიჰყვებიან გრავირებად ნიმუშებს ნაწლავის მილაკოვანი სტრუქტურების ფორმირებისთვის, ხოლო სანათურშიდა სითხის ნაკადის რეკაპიტულაცია შესაძლებელია... მიკროფლუიდიკის მოდული. თუმცა, ეს მოდელი არც სპონტანურ მორფოგენეტიკურ პროცესებს ავლენს და არც ნაწლავის მექანობიოლოგიურ მოძრაობებს მოიცავს. იმავე ჯგუფის 3D ბეჭდვის ტექნიკებმა შეძლეს მინიატურული ნაწლავის მილების შექმნა სპონტანური მორფოგენეტიკური პროცესებით. მილში სხვადასხვა ნაწლავის სეგმენტების რთული დამზადების მიუხედავად, ამ მოდელს ასევე აკლია სანათურის სითხის ნაკადი და მექანიკური დეფორმაცია. გარდა ამისა, მოდელის ფუნქციონირება შეიძლება შეზღუდული იყოს, განსაკუთრებით ბიობეჭდვის პროცესის დასრულების შემდეგ, რაც არღვევს ექსპერიმენტულ პირობებს ან უჯრედებს შორის ურთიერთქმედებას. ამის ნაცვლად, ჩვენს მიერ შემოთავაზებული პროტოკოლი ითვალისწინებს სპონტანურ ნაწლავის მორფოგენეზს, ფიზიოლოგიურად შესაბამის ძვრის სტრესს, ბიომექანიკას, რომელიც ბაძავს ნაწლავის მოძრაობას, დამოუკიდებელი აპიკალური და ბაზოლატერალური კომპარტმენტების ხელმისაწვდომობას და მოდულარობის რთული ბიოლოგიური მიკროგარემოს ხელახლა შექმნას. ამიტომ, ჩვენი in vitro 3D მორფოგენეზის პროტოკოლი შეიძლება უზრუნველყოფდეს დამატებით მიდგომას არსებული მეთოდების გამოწვევების დასაძლევად.
ჩვენი პროტოკოლი მთლიანად ფოკუსირებულია 3D ეპითელურ მორფოგენეზზე, კულტურაში მხოლოდ ეპითელური უჯრედებით და სხვა ტიპის მიმდებარე უჯრედების, როგორიცაა მეზენქიმული უჯრედები, ენდოთელური უჯრედები და იმუნური უჯრედები, გარეშე. როგორც ადრე იყო აღწერილი, ჩვენი პროტოკოლის ბირთვია ეპითელური მორფოგენეზის ინდუქცია შეყვანილი გარემოს ბაზოლატერალურ მხარეს გამოყოფილი მორფოგენის ინჰიბიტორების მოცილებით. მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენი „ჩიპზე ნაწლავი“ და „ჩიპზე ჰიბრიდი“-ს მყარი მოდულარობა საშუალებას გვაძლევს ხელახლა შევქმნათ ტალღოვანი 3D ეპითელური ფენა, დამატებითი ბიოლოგიური სირთულეები, როგორიცაა ეპითელურ-მეზენქიმული ურთიერთქმედებები33,34, უჯრედგარე მატრიქსის (ECM) დეპონირება35 და, ჩვენს მოდელში, კრიპტ-ხაოს მახასიათებლები, რომლებიც გადასცემენ ღეროვანი უჯრედების ნიშებს ბაზალურ კრიპტებში, კვლავ განსახილველია. მეზენქიმაში სტრომული უჯრედები (მაგ., ფიბრობლასტები) მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ ECM ცილების წარმოებაში და ნაწლავის მორფოგენეზის რეგულირებაში in vivo35,37,38. მეზენქიმული... ჩვენს მოდელში უჯრედების დამატებამ გააძლიერა მორფოგენეტიკური პროცესი და უჯრედების მიმაგრების ეფექტურობა. ენდოთელური შრე (ანუ კაპილარები ან ლიმფური გემები) მნიშვნელოვან როლს ასრულებს მოლეკულური ტრანსპორტის რეგულირებაში39 და იმუნური უჯრედების რეკრუტირებაში40 ნაწლავის მიკროგარემოში. გარდა ამისა, ქსოვილის მოდელების მრავალორგანული ურთიერთქმედების დემონსტრირების წინაპირობაა სისხლძარღვოვანი კომპონენტები, რომლებიც შეიძლება დაკავშირებული იყოს ქსოვილოვან მოდელებს შორის. ამიტომ, ენდოთელური უჯრედების ჩართვა შეიძლება საჭირო გახდეს ორგანოს დონის გარჩევადობით უფრო ზუსტი ფიზიოლოგიური მახასიათებლების მოდელირებისთვის. პაციენტისგან მიღებული იმუნური უჯრედები ასევე აუცილებელია თანდაყოლილი იმუნური პასუხების, ანტიგენის პრეზენტაციის, თანდაყოლილი ადაპტური იმუნური ურთიერთქმედების და ქსოვილ-სპეციფიკური იმუნიტეტის საჩვენებლად ნაწლავის დაავადების იმიტაციის კონტექსტში.
ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენება უფრო მარტივია, ვიდრე „ნაწლავი ჩიპზე“, რადგან მოწყობილობის დაყენება უფრო მარტივია და Transwell-ის ჩანართების გამოყენება ნაწლავის ეპითელიუმის მასშტაბირებადი კულტივირების საშუალებას იძლევა. თუმცა, კომერციულად ხელმისაწვდომი Transwell-ის ჩანართები პოლიესტერის მემბრანებით არ არის ელასტიური და ვერ ახდენს პერისტალტიკური მოძრაობების სიმულირებას. გარდა ამისა, ჰიბრიდულ ჩიპში მოთავსებული Transwell-ის ჩანართის აპიკალური განყოფილება უძრავად დარჩა აპიკალურ მხარეს ძვრის სტრესის გარეშე. ცხადია, აპიკალურ განყოფილებაში სტატიკური თვისებები იშვიათად იძლევა ჰიბრიდულ ჩიპებში ბაქტერიული თანაკულტივაციის ხანგრძლივ საშუალებას. მიუხედავად იმისა, რომ ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენებისას შეგვიძლია მტკიცედ გამოვიწვიოთ 3D მორფოგენეზი Transwell-ის ჩანართებში, ფიზიოლოგიურად შესაბამისი ბიომექანიკისა და აპიკალური სითხის ნაკადის ნაკლებობამ შეიძლება შეზღუდოს ჰიბრიდული ჩიპების პლატფორმების პოტენციური გამოყენების შესაძლებლობა.
ადამიანის კრიპტ-ხაოების ღერძის სრულმასშტაბიანი რეკონსტრუქციები ჩიპზე და ჩიპზე განლაგებულ ჰიბრიდულ კულტურებში სრულად დადგენილი არ არის. ვინაიდან მორფოგენეზი ეპითელური მონოშრიდან იწყება, 3D მიკროარქიტექტურა სულაც არ იძლევა მორფოლოგიურ მსგავსებას კრიპტებთან in vivo. მიუხედავად იმისა, რომ მიკროინჟინერიით დამუშავებულ 3D ეპითელიუმში ბაზალური კრიპტის დომენის მახლობლად პროლიფერაციული უჯრედების პოპულაცია დავახასიათეთ, კრიპტისა და ხაოების რეგიონები მკაფიოდ არ იყო გამიჯნული. მიუხედავად იმისა, რომ ჩიპზე ზედა არხების არსებობა მიკროინჟინერიით დამუშავებული ეპითელიუმის სიმაღლის ზრდას იწვევს, მაქსიმალური სიმაღლე მაინც ~300–400 µm-ით შემოიფარგლება. ადამიანის ნაწლავის კრიპტების ფაქტობრივი სიღრმე წვრილ და მსხვილ ნაწლავებში შესაბამისად ~135 µm და ~400 µm-ია, ხოლო წვრილი ნაწლავის ხაოების სიმაღლე ~600 µm-ია41.
ვიზუალიზაციის თვალსაზრისით, 3D მიკროარქიტექტურის in situ სუპერგარჩევადობის გამოსახულება შეიძლება შემოიფარგლოს ჩიპზე არსებული ნაწლავით, რადგან ობიექტივის ლინზიდან ეპითელურ შრემდე საჭირო სამუშაო მანძილი რამდენიმე მილიმეტრის რიგისაა. ამ პრობლემის გადასაჭრელად შეიძლება საჭირო გახდეს შორეული ობიექტივი. გარდა ამისა, PDMS-ის მაღალი ელასტიურობის გამო, ნიმუშის მოსამზადებლად თხელი მონაკვეთების დამზადება რთულია. გარდა ამისა, რადგან ჩიპზე ნაწლავის ფენა-ფენა მიკროფაბრიკაცია გულისხმობს თითოეულ ფენას შორის მუდმივ ადჰეზიას, ეპითელური შრის ზედაპირული სტრუქტურის შესასწავლად ზედა ფენის გახსნა ან მოხსნა უკიდურესად რთულია. მაგალითად, სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპის (SEM) გამოყენებით.
PDMS-ის ჰიდროფობიურობა შემზღუდველი ფაქტორი იყო მიკროფლუიდურ კვლევებში, რომლებიც ჰიდროფობულ მცირე მოლეკულებს ეხება, რადგან PDMS-ს შეუძლია არასპეციფიკურად ადსორბირება მოახდინოს ასეთ ჰიდროფობულ მოლეკულებზე. PDMS-ის ალტერნატივები შეიძლება განიხილებოდეს სხვა პოლიმერული მასალებით. ალტერნატიულად, PDMS-ის ზედაპირის მოდიფიკაცია (მაგ., ლიპოფილური მასალებით 42 ან პოლი(ეთილენგლიკოლით) 43 დაფარვა) შეიძლება განიხილებოდეს ჰიდროფობიური მოლეკულების ადსორბციის მინიმიზაციისთვის.
და ბოლოს, ჩვენი მეთოდი კარგად არ არის დახასიათებული მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის ან „ერთი ზომის ყველასთვის“ მოსახერხებელი ექსპერიმენტული პლატფორმის უზრუნველყოფის თვალსაზრისით. მიმდინარე პროტოკოლი მოითხოვს შპრიცის ტუმბოს თითოეულ მიკრომოწყობილობაზე, რაც იკავებს ადგილს CO2 ინკუბატორში და ხელს უშლის მასშტაბური ექსპერიმენტების ჩატარებას. ეს შეზღუდვა შეიძლება მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდეს ინოვაციური კულტურული ფორმატების მასშტაბირებით (მაგ., 24-ჭეჭიანი, 96-ჭეჭიანი ან 384-ჭეჭიანი ფოროვანი ჩანართები, რომლებიც საშუალებას იძლევა ბაზოლატერალური მედიის უწყვეტი შევსებისა და მოცილების).
ადამიანის ნაწლავის ეპითელიუმის სამგანზომილებიანი მორფოგენეზის ინ ვიტრო ინდუცირებისთვის, ჩვენ გამოვიყენეთ მიკროფლუიდური ჩიპის ნაწლავის მოწყობილობა, რომელიც შეიცავდა ორ პარალელურ მიკროარხს და მათ შორის ელასტიური ფოროვან მემბრანას, რათა შექმნილიყო სანათურ-კაპილარული ინტერფეისი. ჩვენ ასევე ვაჩვენებთ ერთარხიანი მიკროფლუიდური მოწყობილობის (ჰიბრიდული ჩიპის) გამოყენებას, რომელიც უზრუნველყოფს უწყვეტ ბაზოლატერალურ დინებას ტრანსველის ჩანართებზე გაზრდილი პოლარიზებული ეპითელური ფენების ქვეშ. ორივე პლატფორმაზე, ადამიანის ნაწლავის სხვადასხვა ეპითელური უჯრედების მორფოგენეზის დემონსტრირება შესაძლებელია ნაკადის მიმართულებითი მანიპულირების გამოყენებით, რათა მორფოგენის ანტაგონისტები ბაზოლატერალური განყოფილებიდან მოიხსნას. მთელი ექსპერიმენტული პროცედურა (სურათი 1) შედგება ხუთი ნაწილისგან: (i) ნაწლავის ჩიპის ან ტრანსველის ჩასადგმელი ჰიბრიდული ჩიპის მიკროფაბრიკაცია (ნაბიჯები 1-5; ჩარჩო 1), (ii) ნაწლავის ეპითელური უჯრედების (Caco-2 უჯრედები) ან ადამიანის ნაწლავის ორგანოიდების მომზადება; ჩარჩოები 2-5), (iii) ნაწლავის ეპითელური უჯრედების კულტივირება ნაწლავის ჩიპებზე ან ჰიბრიდულ ჩიპებზე (ნაბიჯები 6-9), (iv) 3D მორფოგენეზის ინდუქცია in vitro (ნაბიჯი 10) და (v)) 3D ეპითელური მიკროსტრუქტურის დასახასიათებლად (ნაბიჯები 11-24). და ბოლოს, შეიქმნა შესაბამისი საკონტროლო ჯგუფი (რომელიც უფრო დეტალურად განიხილება ქვემოთ) in vitro მორფოგენეზის ეფექტურობის დასადასტურებლად ეპითელური მორფოგენეზის სივრცულ, დროით, პირობით ან პროცედურულ კონტროლებთან შედარებით.
ჩვენ გამოვიყენეთ ორი განსხვავებული კულტურული პლატფორმა: ნაწლავი ჩიპზე სწორი არხებით ან არაწრფივი დახვეული არხებით, ან ჰიბრიდული ჩიპები, რომლებიც შეიცავს Transwell (TW) ჩანართებს მიკროფლუიდურ მოწყობილობაში, დამზადებული როგორც აღწერილია ჩარჩო 1-ში, და ნაბიჯი 1-5. „მოწყობილობის დამზადება“ აჩვენებს ერთი ჩიპის ან ჰიბრიდული ჩიპის დამზადების ძირითად ეტაპებს. „ადამიანის ნაწლავის ეპითელური უჯრედების კულტურა“ განმარტავს უჯრედის წყაროს (Caco-2 ან ადამიანის ნაწლავის ორგანოიდები) და ამ პროტოკოლში გამოყენებულ კულტურულ პროცედურას. „ინ ვიტრო მორფოგენეზი“ აჩვენებს ზოგად ეტაპებს, რომელთა დროსაც Caco-2 ან ორგანოიდიდან მიღებული ეპითელური უჯრედები კულტივირდება ნაწლავის ჩიპზე ან ჰიბრიდული ჩიპის Transwell ჩანართებზე, რასაც მოჰყვება 3D მორფოგენეზის ინდუქცია და დახასიათებული ეპითელური სტრუქტურის ფორმირება. პროგრამის ნაბიჯის ნომერი ან ჩარჩოს ნომერი ნაჩვენებია თითოეული ისრის ქვეშ. აპლიკაცია იძლევა მაგალითებს, თუ როგორ შეიძლება გამოყენებულ იქნას ჩამოყალიბებული ნაწლავის ეპითელური შრეები, მაგალითად, უჯრედების დიფერენციაციის დახასიათებაში, ნაწლავის ფიზიოლოგიის კვლევებში, მასპინძელი მიკრობიომის ეკოსისტემების ჩამოყალიბებასა და დაავადების მოდელირებაში. იმუნოფლუორესცენცია „უჯრედების დიფერენციაციის“ სურათები აჩვენებს ბირთვებს, F-აქტინს და MUC2-ს, რომლებიც ექსპრესირებულია ნაწლავის ჩიპზე გენერირებულ 3D Caco-2 ეპითელურ შრეში. MUC2 სიგნალიზაცია წარმოდგენილია გობლეტურ უჯრედებში და ლორწოვანი გარსის ზედაპირებიდან გამოყოფილ ლორწოში. „ნაწლავის ფიზიოლოგიის“ ფლუორესცენტული სურათები აჩვენებს ლორწოს, რომელიც წარმოიქმნება სიალის მჟავას და N-აცეტილგლუკოზამინის ნარჩენების შეღებვით ფლუორესცენტული ხორბლის ჩანასახის აგლუტინინის გამოყენებით. „მასპინძელ-მიკრობის თანაკულტურების“ ორი გადამკვეთი სურათი აჩვენებს მასპინძელ-მიკრობიომის წარმომადგენლობით თანაკულტურებს ნაწლავში ჩიპზე. მარცხენა პანელი აჩვენებს მწვანე ფლუორესცენტული ცილის (GFP) გამომხატველი E. coli-ს თანაკულტივაციას მიკროინჟინერიით დამუშავებულ 3D Caco-2 ეპითელურ უჯრედებთან. მარჯვენა პანელი აჩვენებს GFP E. coli-ს ლოკალიზაციას, რომელიც თანაკულტივირებულია 3D Caco-2 ეპითელურ უჯრედებთან, რასაც მოჰყვება იმუნოფლუორესცენტული შეღებვა F-აქტინით (წითელი) და ბირთვებით (ლურჯი). დაავადების მოდელირება ასახავს ჯანმრთელ და გაჟონილ ნაწლავებს ნაწლავის ანთების ჩიპებში ბაქტერიული ანტიგენებით ფიზიოლოგიური გამოწვევის ქვეშ (მაგ., ლიპოპოლისაქარიდი, LPS) და იმუნური უჯრედები (მაგ., PBMC; მწვანე). Caco-2 უჯრედები კულტივირებული იქნა 3D ეპითელური შრის შესაქმნელად. მასშტაბის ზოლი, 50 µm. სურათები ქვედა რიგში: „უჯრედების დიფერენციაცია“ ადაპტირებულია მითითების ნებართვით. 2. Oxford University Press; რეპროდუცირებულია მითითების ნებართვით 5. NAS; „მასპინძელი-მიკრობის თანაკულტივაცია“ ადაპტირებულია მითითების ნებართვით 3. NAS; „დაავადების მოდელირება“ ადაპტირებულია მითითების ნებართვით 5. NAS.
როგორც gut-on-chip, ასევე ჰიბრიდული ჩიპები დამზადდა PDMS რეპლიკების გამოყენებით, რომლებიც სილიკონის ყალიბებიდან რბილი ლითოგრაფიით იქნა ამოღებული1,44 და SU-8-ით იყო დამუშავებული. თითოეულ ჩიპში მიკროარხების დიზაინი განისაზღვრება ჰიდროდინამიკის, როგორიცაა ძვრის სტრესი და ჰიდროდინამიკური წნევა1,4,12, გათვალისწინებით. ორიგინალური gut-on-a-chip დიზაინი (გაფართოებული მონაცემები სურ. 1ა), რომელიც შედგებოდა ორი პარალელური სწორი მიკროარხისგან, განვითარდა კომპლექსურ gut-on-a-chip დიზაინად (გაფართოებული მონაცემები სურ. 1ბ), რომელიც მოიცავს მრუდი მიკროარხების წყვილს, რათა გამოიწვიოს სითხის ყოფნის დროის გაზრდა, არაწრფივი ნაკადის ნიმუშები და კულტივირებული უჯრედების მრავალღერძიანი დეფორმაცია (სურ. 2ა-ვ)12. როდესაც საჭიროა უფრო რთული ნაწლავის ბიომექანიკის ხელახლა შექმნა, შესაძლებელია რთული gut-on-a-chips-ის არჩევა. ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ ჩახლართული Gut-Chip ასევე ძლიერად იწვევს 3D მორფოგენეზს მსგავს დროში ეპითელური ზრდის მსგავსი ხარისხით, ორიგინალთან შედარებით. ნაწლავ-ჩიპი, კულტივირებული უჯრედის ტიპის მიუხედავად. ამიტომ, 3D მორფოგენეზის ინდუცირებისთვის, წრფივი და კომპლექსური ჩიპზე განლაგებული ნაწლავის დიზაინები ურთიერთშემცვლელია. PDMS რეპლიკებმა, რომლებიც SU-8 ნიმუშებით სილიკონის ყალიბებზე იყო გამყარებული, ჩამოსხმის შემდეგ უარყოფითი მახასიათებლები გამოავლინა (სურ. 2ა). ჩიპზე ნაწლავის დასამზადებლად, მომზადებული ზედა PDMS ფენა თანმიმდევრულად მიაერთეს ფოროვან PDMS ფენას და შემდეგ შეუქცევადი შეკავშირებით გაასწორეს PDMS ქვედა ფენასთან კორონას დამმუშავებლის გამოყენებით (სურ. 2ბ-ვ). ჰიბრიდული ჩიპების დასამზადებლად, გამყარებული PDMS რეპლიკები მიაერთეს მინის სლაიდებს ერთარხიანი მიკროფლუიდური მოწყობილობების შესაქმნელად, რომლებიც შეძლებდნენ Transwell-ის ჩანართების განთავსებას (სურ. 2ჰ და გაფართოებული მონაცემები სურ. 2). შეკავშირების პროცესი ხორციელდება PDMS რეპლიკისა და მინის ზედაპირების ჟანგბადის პლაზმით ან კორონას დამუშავებით დამუშავებით. სილიკონის მილზე მიმაგრებული მიკროფაბრიცირებული მოწყობილობის სტერილიზაციის შემდეგ, მოწყობილობის დაყენება მზად იყო ნაწლავის ეპითელიუმის 3D მორფოგენეზის შესასრულებლად (სურათი 2გ).
ა, SU-8 ნიმუშიანი სილიკონის ყალიბებიდან PDMS ნაწილების მომზადების სქემატური ილუსტრაცია. დაუმუშავებელი PDMS ხსნარი ჩაასხეს სილიკონის ყალიბში (მარცხნივ), გაამყარეს 60°C-ზე (შუაში) და მოხსნან ყალიბიდან (მარჯვნივ). მოხსნილი PDMS ნაწილებად დაჭრეს და გაიწმინდეს შემდგომი გამოყენებისთვის. ბ, PDMS ზედა ფენის მოსამზადებლად გამოყენებული სილიკონის ყალიბის ფოტოსურათი. გ, PDMS ფოროვანი მემბრანის დასამზადებლად გამოყენებული სილიკონის ყალიბის ფოტოსურათი. დ, PDMS ზედა და ქვედა კომპონენტების და აწყობილი ჩიპზე დამონტაჟებული ნაწლავის მოწყობილობის ფოტოების სერია. ე, PDMS ზედა, მემბრანული და ქვედა კომპონენტების განლაგების სქემა. თითოეული ფენა შეუქცევადად არის დაკავშირებული პლაზმური ან კორონას დამუშავებით. ვ, დამზადებული ნაწლავი ჩიპზე მოწყობილობის სქემატური გამოსახულება გადაფარებული ჩახლართული მიკროარხებით და ვაკუუმური კამერებით. ზ, ნაწლავი ჩიპზე მიკროფლუიდური უჯრედული კულტურისთვის. სილიკონის მილით და შპრიცით აწყობილი ჩიპზე დამზადებული ნაწლავი მოათავსეს საფარზე. ჩიპური მოწყობილობა მოათავსეს სახურავზე. 150 მმ-იანი პეტრის ჯამი დასამუშავებლად. შემკვრელი გამოიყენება სილიკონის მილის დასახურად. სთ, ჰიბრიდული ჩიპის დამზადების ვიზუალური ანაბეჭდები და ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენებით 3D მორფოგენეზი. ნაწლავის ეპითელური უჯრედების 2D მონოშრეების კულტივირებისთვის დამოუკიდებლად მომზადებული ტრანსველის ჩანართები შეიყვანეს ჰიბრიდულ ჩიპში ნაწლავის 3D მორფოგენეზის ინდუცირების მიზნით. გარემო პერფუზირდება ტრანსველის ჩანართზე დადგენილი უჯრედული ფენის ქვეშ არსებული მიკროარხების მეშვეობით. მასშტაბის ზოლი, 1 სმ. სთ. გადაბეჭდილია მითითების ნებართვით. 4. Elsevier.
ამ პროტოკოლში, Caco-2 უჯრედული ხაზი და ნაწლავის ორგანოიდები გამოყენებული იქნა ეპითელურ წყაროებად (სურ. 3ა). უჯრედების ორივე ტიპი დამოუკიდებლად იქნა კულტივირებული (ჩარჩო 2 და ჩასართავი 5) და გამოყენებული იქნა ჩიპზე განლაგებული ნაწლავის ან ტრანსველის ჩანართების ECM-ით დაფარული მიკროარხების დასათესად. როდესაც უჯრედები კონფლუენტურია (>95% დაფარვა კოლბებში), T-კოლბებში რუტინულად კულტივირებული Caco-2 უჯრედები (პასაჟები 10 და 50 შორის) გროვდება ტრიფსინიზაციის სითხით დისოცირებული უჯრედული სუსპენზიების მოსამზადებლად (ჩასართავი 2). ნაწლავის ბიოფსიებიდან ან ქირურგიული რეზექციებიდან აღებული ადამიანის ნაწლავის ორგანოიდები კულტივირებული იქნა Matrigel-ის ხარაჩოს ​​გუმბათებში 24-ჭაბურღილიან ფირფიტებში სტრუქტურული მიკროგარემოს შესანარჩუნებლად. აუცილებელი მორფოგენების (როგორიცაა Wnt, R-სპონდინი და ნოგინი) შემცველი გარემო, რომელიც მომზადებულია ჩასართავი 3-ში აღწერილი მეთოდით, დაემატა ყოველ მეორე დღეს, სანამ ორგანოიდები არ გაიზრდებოდა ~500 µm დიამეტრამდე. სრულად გაზრდილი ორგანოიდები გროვდება და დისოცირდება ერთ უჯრედებად დასათესად. ჩიპზე განთავსებული ნაწლავის ან ტრანსველის ჩანართები (ჩარჩო 5). როგორც ადრე აღვნიშნეთ, მისი დიფერენცირება შესაძლებელია დაავადების ტიპის12,13 (მაგ. წყლულოვანი კოლიტი, კრონის დაავადება, მსხვილი ნაწლავის კიბო ან ნორმალური დონორი), დაზიანების ადგილის (მაგ., დაზიანება არადაზიანებული უბნის წინააღმდეგ) და კუჭ-ნაწლავის ტრაქტში მდებარეობის (მაგ., თორმეტგოჯა ნაწლავი, ჯეჯუნუმი, ილეუმი, ბრმა ნაწლავი, მსხვილი ნაწლავი ან სწორი ნაწლავი) მიხედვით. ჩასმა 5-ში ჩვენ გთავაზობთ ოპტიმიზებულ პროტოკოლს მსხვილი ნაწლავის ორგანოიდების (კოლოიდების) კულტივირებისთვის, რომლებიც, როგორც წესი, საჭიროებენ მორფოგენების უფრო მაღალ კონცენტრაციას, ვიდრე წვრილი ნაწლავის ორგანოიდები.
ა, სამუშაო პროცესი ნაწლავის მორფოგენეზის ინდუქციისთვის ნაწლავის ჩიპში. ამ პროტოკოლში გამოყენებულია Caco-2 ადამიანის ნაწლავის ეპითელიუმი და ნაწლავის ორგანოიდები 3D მორფოგენეზის დემონსტრირებისთვის. იზოლირებული ეპითელური უჯრედები დათესეს მომზადებულ ჩიპ-ზე ნაწლავურ მოწყობილობაში (ჩიპის მომზადება). უჯრედების დათესვის (დათესვის) და PDMS ფოროვან მემბრანაზე მიმაგრების (მიმაგრების) შემდეგ 0 დღეს (D0), იწყება აპიკალური (AP) ნაკადი და ნარჩუნდება პირველი 2 დღის განმავლობაში (ნაკადი, AP, D0-D2). ბაზოლატერალური (BL) ნაკადი ასევე იწყება ციკლური გაჭიმვის მოძრაობებთან ერთად (გაჭიმვა, ნაკადი, AP და BL), როდესაც წარმოიქმნება სრული 2D მონოშრე. ნაწლავის 3D მორფოგენეზი სპონტანურად მოხდა მიკროფლუიდური კულტივირების 5 დღის შემდეგ (მორფოგენეზი, D5). ფაზური კონტრასტული სურათები აჩვენებს Caco-2 უჯრედების წარმომადგენლობით მორფოლოგიას თითოეულ ექსპერიმენტულ ეტაპზე ან დროის წერტილში (სვეტოგრაფი, 100 µm). ოთხი სქემატური დიაგრამა ასახავს ნაწლავის მორფოგენეზის შესაბამის კასკადებს (ზედა მარჯვნივ). სქემაში წყვეტილი ისრები წარმოადგენს სითხის ნაკადის მიმართულებას.b, SEM გამოსახულება, რომელიც აჩვენებს ჩამოყალიბებული 3D Caco-2 ეპითელიუმის ზედაპირის ტოპოლოგიას (მარცხნივ). ჩანართი, რომელიც ხაზს უსვამს გადიდებულ არეს (თეთრი წყვეტილი ჩარჩო), აჩვენებს რეგენერირებულ მიკროხაოებს 3D Caco-2 ფენაზე (მარჯვნივ).c, ჩამოყალიბებული Caco-2 3D, კლაუდინის (ZO-1, წითელი) და უწყვეტი ფუნჯის სასაზღვრო მემბრანების ჰორიზონტალური შუბლის ხედი, რომლებიც მონიშნულია F-აქტინით (მწვანე) და ბირთვებით (ლურჯი). ეპითელური უჯრედების იმუნოფლუორესცენტული კონფოკალური ვიზუალიზაცია ნაწლავის ჩიპებზე. შუა სქემაზე მიმართული ისრები მიუთითებს ფოკალური სიბრტყის მდებარეობას თითოეული კონფოკალური ხედისთვის.d, მორფოლოგიური ცვლილებების დროითი მიმდინარეობა ორგანოიდებში, რომლებიც კულტივირებულია ჩიპზე, მიღებული ფაზური კონტრასტული მიკროსკოპიით მე-3, მე-7, მე-9, მე-11 და მე-13 დღეს. ჩანართი (ზედა მარჯვენა) აჩვენებს მოწოდებული გამოსახულების მაღალ გადიდებას.e, DIC ფოტომიკროგრაფია ორგანოიდური 3D ეპითელიუმის, რომელიც ჩამოყალიბებულია ნაწლავში მე-7 დღეს გადაღებულ ნაჭერზე.f, გადაფარული იმუნოფლუორესცენტული გამოსახულებები, რომლებიც აჩვენებენ ღეროვანი უჯრედების (LGR5; მეწამული), სასმისისებრი უჯრედების (MUC2; მწვანე), F-აქტინის (ნაცრისფერი) და ბირთვების (ცისფერი) მარკერებს, რომლებიც გაიზარდა ნაწლავის ჩიპებზე 3 დღის განმავლობაში, შესაბამისად (მარცხნივ) და 13-დღიანი (შუა) ორგანოიდების ეპითელურ შრეზე. იხილეთ აგრეთვე გაფართოებული მონაცემების სურათი 3, რომელიც ასახავს LGR5 სიგნალიზაციას MUC2 სიგნალიზაციის გარეშე. ფლუორესცენტული გამოსახულებები აჩვენებს ნაწლავში ჩამოყალიბებული 3D ორგანოიდური ეპითელიუმის ეპითელურ მიკროსტრუქტურას (მარჯვნივ), რომელიც ჩამოყალიბდა ჩიპზე პლაზმური მემბრანის CellMask საღებავით (მარჯვნივ) შეღებვით კულტურის მე-13 დღეს. მასშტაბის ზოლი არის 50 μm, თუ სხვა რამ არ არის მითითებული.b გადაბეჭდილია მითითების ნებართვით.2. Oxford University Press; c ადაპტირებულია მითითების ნებართვით.2. Oxford University Press; e და f ადაპტირებულია მითითების ნებართვით.12 Creative Commons License CC BY 4.0-ის შესაბამისად.
ჩიპზე ნაწლავში, ECM-ის წარმატებული დაფარვისთვის აუცილებელია PDMS ფოროვანი მემბრანის ჰიდროფობიური ზედაპირის მოდიფიცირება. ამ პროტოკოლში, ჩვენ ვიყენებთ ორ განსხვავებულ მეთოდს PDMS მემბრანების ჰიდროფობიურობის შესაცვლელად. Caco-2 უჯრედების კულტივირებისთვის, მხოლოდ ულტრაიისფერი/ოზონის დამუშავებით ზედაპირის აქტივაცია საკმარისი იყო PDMS ზედაპირის ჰიდროფობიურობის შესამცირებლად, ECM-ის დასაფარად და Caco-2 უჯრედების PDMS მემბრანაზე დასამაგრებლად. თუმცა, ორგანოიდური ეპითელიუმის მიკროფლუიდური კულტურა მოითხოვს ქიმიურად დაფუძნებულ ზედაპირის ფუნქციონალიზაციას ECM ცილების ეფექტური დეპონირების მისაღწევად, პოლიეთილენიმინის (PEI) და გლუტარალდეჰიდის თანმიმდევრული გამოყენებით PDMS მიკროარხებზე. ზედაპირის მოდიფიკაციის შემდეგ, ECM ცილები დაილექა ფუნქციონალიზებული PDMS ზედაპირის დასაფარად და შემდეგ შეიყვანეს იზოლირებულ ორგანოიდურ ეპითელიუმში. უჯრედების მიმაგრების შემდეგ, მიკროფლუიდური უჯრედული კულტურა იწყება მხოლოდ გარემოს პერფუზიით ზედა მიკროარხში, სანამ უჯრედები არ ჩამოაყალიბებენ სრულ მონოშრეს, ხოლო ქვედა მიკროარხი ინარჩუნებს სტატიკურ პირობებს. ზედაპირული აქტივაციისა და ECM დაფარვის ეს ოპტიმიზებული მეთოდი საშუალებას იძლევა ორგანოიდური ეპითელიუმის მიმაგრება 3D-ის ინდუცირებისთვის. მორფოგენეზი PDMS ზედაპირზე.
ტრანსველის კულტურებს ასევე სჭირდებათ ECM-ით დაფარვა უჯრედების დათესვამდე; თუმცა, ტრანსველის კულტურებს არ სჭირდებათ ფოროვანი ჩანართების ზედაპირის გასააქტიურებლად რთული წინასწარი დამუშავების ეტაპები. ტრანსველის ჩანართებზე Caco-2 უჯრედების გასაზრდელად, ფოროვან ჩანართებზე ECM-ით დაფარვა აჩქარებს დისოცირებული Caco-2 უჯრედების მიმაგრებას (<1 საათი) და მჭიდრო შეერთების ბარიერის ფორმირებას (<1-2 დღე). ტრანსველის ჩანართებზე ორგანოიდების კულტივირებისთვის, იზოლირებული ორგანოიდები ითესება ECM-ით დაფარულ ჩანართებზე, მაგრდება მემბრანის ზედაპირზე (<3 საათი) და შენარჩუნდება მანამ, სანამ ორგანოიდები არ ჩამოაყალიბებენ სრულ მონოშრეს ბარიერული მთლიანობით. ტრანსველის კულტურები ტარდება 24-ჭედიან ფირფიტებში ჰიბრიდული ჩიპების გამოყენების გარეშე.
ინ ვიტრო 3D მორფოგენეზის ინიცირება შესაძლებელია ჩამოყალიბებული ეპითელური შრის ბაზოლატერალურ ასპექტზე სითხის ნაკადის გამოყენებით. ჩიპზე ნაწლავში ეპითელური მორფოგენეზი დაიწყო მაშინ, როდესაც გარემო პერფუზირებული იყო ზედა და ქვედა მიკროარხებში (სურ. 3ა). როგორც ადრე იყო აღწერილი, კრიტიკულად მნიშვნელოვანია ქვედა (ბაზოლატერალურ) განყოფილებაში სითხის ნაკადის შეყვანა მიმართულებითი სეკრეტირებული მორფოგენის ინჰიბიტორების უწყვეტი მოსაშორებლად. ფოროვან მემბრანებზე შეკრული უჯრედებისთვის საკმარისი საკვები ნივთიერებებისა და შრატის უზრუნველსაყოფად და სანათურის ძვრის სტრესის გენერირებისთვის, ჩვენ, როგორც წესი, ვიყენებთ ორმაგ ნაკადს ნაწლავში ჩიპზე. ჰიბრიდულ ჩიპებში, ეპითელური მონოშრეების შემცველი Transwell ჩანართები შეიყვანეს ჰიბრიდულ ჩიპებში. შემდეგ, გარემო შეიყვანეს ფოროვანი Transwell ჩანართის ბაზოლატერალური მხარის ქვეშ მიკროარხის მეშვეობით. ნაწლავის მორფოგენეზი მოხდა ორივე კულტურულ პლატფორმაზე ბაზოლატერალური ნაკადის დაწყებიდან 3-5 დღის შემდეგ.
მიკროინჟინერიით დამუშავებული 3D ეპითელური ფენების მორფოლოგიური მახასიათებლების ანალიზი შესაძლებელია სხვადასხვა ვიზუალიზაციის მეთოდების გამოყენებით, მათ შორის ფაზური კონტრასტული მიკროსკოპიით, დიფერენციალური ინტერფერენციული კონტრასტული (DIC) მიკროსკოპიით, SEM-ით ან იმუნოფლუორესცენტული კონფოკალური მიკროსკოპიით (სურათები 3 და 4). ფაზური კონტრასტული ან DIC ვიზუალიზაცია ადვილად შეიძლება განხორციელდეს კულტურის დროს ნებისმიერ დროს, 3D ეპითელური ფენების ფორმისა და გამოწეულობის მონიტორინგისთვის. PDMS-ისა და პოლიესტერის ფირების ოპტიკური გამჭვირვალობის გამო, როგორც gut-on-a-chip, ასევე ჰიბრიდული ჩიპური პლატფორმები უზრუნველყოფენ რეალურ დროში in situ ვიზუალიზაციას მოწყობილობის გაკვეთის ან დაშლის საჭიროების გარეშე. იმუნოფლუორესცენტული ვიზუალიზაციის ჩატარებისას (სურათები 1, 3c, f და 4b, c), უჯრედები, როგორც წესი, ფიქსირდება 4% (wt/vol) პარაფორმალდეჰიდით (PFA), შემდეგ Triton X-100-ით და 2% (wt/vol)) ძროხის შრატის ალბუმინით (BSA), თანმიმდევრობით. უჯრედის ტიპის მიხედვით, შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა ფიქსატორები, გამტარი და ბლოკირების აგენტები. გამოყენებული. ჩიპზე ადგილზე იმობილიზებული უჯრედების გამოსაყოფად გამოიყენება შტამზე დამოკიდებული უჯრედის ან რეგიონის მარკერების სამიზნე პირველადი ანტისხეულები, რასაც მოჰყვება მეორადი ანტისხეულები კონტრშეღებვის საღებავთან ერთად, რომელიც მიზნად ისახავს ბირთვს (მაგ., 4′,6-დიამიდინო-2-ფენილენი) ინდოლი, DAPI) ან F-აქტინს (მაგ., ფლუორესცენციულად მონიშნული ფალოიდინი). ფლუორესცენციაზე დაფუძნებული ცოცხალი ვიზუალიზაცია ასევე შეიძლება ჩატარდეს ადგილზე ლორწოს წარმოების დასადგენად (სურ. 1, „უჯრედის დიფერენციაცია“ და „ნაწლავის ფიზიოლოგია“), მიკრობული უჯრედების შემთხვევითი კოლონიზაციისთვის (სურ. 1, „მასპინძელი-მიკრობის თანაკულტურა“), იმუნური უჯრედების რეკრუტირებისთვის (სურ. 1, „დაავადების მოდელირება“) ან 3D ეპითელური მორფოლოგიის კონტურების დასადგენად (სურ. 3c,f და 4b,c). ჩიპზე ნაწლავის მოდიფიკაციისას ზედა ფენა მიკროარხის ქვედა ფენისგან გამოყოფის მიზნით, როგორც აღწერილია ნახ. 2-ში. როგორც ნაჩვენებია ნახ. 2-ში, 3D ეპითელური მორფოლოგია, ასევე მიკროხაოები აპიკალურზე. ფუნჯისებრი საზღვრის ვიზუალიზაცია შესაძლებელია SEM-ის მეშვეობით (სურ. 3ბ). დიფერენციაციის მარკერების ექსპრესია შეიძლება შეფასდეს რაოდენობრივი PCR5-ის ან ერთუჯრედიანი RNA სეკვენირების ჩატარებით. ამ შემთხვევაში, ნაწლავის ჩიპებში ან ჰიბრიდულ ჩიპებში გაზრდილი ეპითელური უჯრედების 3D ფენები გროვდება ტრიფსინიზაციით და შემდეგ გამოიყენება მოლეკულური ან გენეტიკური ანალიზისთვის.
ა, ჰიბრიდულ ჩიპში ნაწლავის მორფოგენეზის ინდუქციის სამუშაო პროცესი. Caco-2 და ნაწლავის ორგანოიდები გამოიყენება ამ პროტოკოლში ჰიბრიდული ჩიპის პლატფორმაზე 3D მორფოგენეზის დემონსტრირებისთვის. დისოცირებული ეპითელური უჯრედები დაითესა მომზადებულ Transwell ჩანართებში (TW მომზადება; იხილეთ სურათი ქვემოთ). უჯრედების დათესვის (დათესვის) და Transwell ჩანართებში პოლიესტერის მემბრანებზე მიმაგრების შემდეგ, ყველა უჯრედი კულტივირებული იქნა სტატიკურ პირობებში (TW კულტურა). 7 დღის შემდეგ, ეპითელური უჯრედების 2D მონოშრის შემცველი ერთი Transwell ჩანართი ინტეგრირებული იქნა ჰიბრიდულ ჩიპში ბაზოლატერალური ნაკადის (Flow, BL) შესატანად, რამაც საბოლოოდ გამოიწვია 3D ეპითელური ფენის წარმოქმნა (მორფოგენეზი). ფაზური კონტრასტული მიკროგრაფიები აჩვენებს ნორმალური დონორის (C103 ხაზი) ​​აღმავალი მსხვილი ნაწლავიდან მიღებული ადამიანის ორგანოს ეპითელური უჯრედების მორფოლოგიურ მახასიათებლებს თითოეულ ექსპერიმენტულ ეტაპზე ან დროის წერტილში. ზედა ფენებში არსებული სქემები ასახავს თითოეული ეტაპის ექსპერიმენტულ კონფიგურაციას. ბ, ჰიბრიდული ჩიპები (მარცხენა სქემა) შეიძლება გამოიწვიოს ორგანოიდური ეპითელური უჯრედების 3D მორფოგენეზი სხვადასხვა Z პოზიციიდან (ზედა, შუა და ქვედა; იხილეთ მარჯვენა სქემა და შესაბამისი წერტილოვანი ხაზები) გადაღებული ზემოდან ქვემოთ კონფოკალური მიკროსკოპიის ხედები აშკარა მორფოლოგიურ მახასიათებლებს ავლენდა. F-აქტინი (ცისფერი), ბირთვი (ნაცრისფერი).c, სტატიკურ Transwell-ში (TW; ჩანართი თეთრ წყვეტილ ჩარჩოში) კულტივირებული ორგანოიდისგან მიღებული ეპითელური უჯრედების ფლუორესცენციული კონფოკალური მიკროგრაფიები (3D კუთხოვანი ხედი) ჰიბრიდულ ჩიპთან (ყველაზე დიდი სრული კადრი), სადაც შედარებულია შესაბამისად 2D და 3D მორფოლოგია. 2D ვერტიკალური ჯვარედინი ჭრილის ხედების წყვილი (ჩანართი ზედა მარჯვენა კუთხეში; „XZ“) ასევე აჩვენებს 2D და 3D მახასიათებლებს. მასშტაბის ზოლი, 100 µm.c გადაბეჭდილია მითითების ნებართვით.4. Elsevier.
საკონტროლო უჯრედების მომზადება შესაძლებელია იმავე უჯრედების (Caco-2 ან ნაწლავის ორგანოიდური ეპითელური უჯრედები) ორგანზომილებიან მონოშრეებად კულტივირებით ჩვეულებრივი სტატიკური კულტივირების პირობებში. აღსანიშნავია, რომ საკვები ნივთიერებების შემცირება შეიძლება გამოწვეული იყოს მიკროარხების შეზღუდული მოცულობითი ტევადობით (ანუ ~4 µL ზედა არხში ორიგინალური ნაწლავის ჩიპის დიზაინზე). ამრიგად, ასევე შესაძლებელია ეპითელური მორფოლოგიის შედარება ბაზოლატერალური ნაკადის გამოყენებამდე და მის შემდეგ.
რბილი ლითოგრაფიის პროცესი სუფთა ოთახში უნდა ჩატარდეს. ჩიპზე თითოეული ფენისთვის (ზედა და ქვედა ფენები და მემბრანები) და ჰიბრიდული ჩიპებისთვის გამოყენებული და ცალკეულ სილიკონის ვაფლებზე დამზადებულ იქნა სხვადასხვა ფოტონიღბები, რადგან მიკროარხების სიმაღლეები განსხვავებული იყო. ჩიპზე ნაწლავის ზედა და ქვედა მიკროარხების სამიზნე სიმაღლეები შესაბამისად 500 µm და 200 µm-ია. ჰიბრიდული ჩიპის არხის სამიზნე სიმაღლე 200 µm-ია.
აცეტონთან ერთად დასველებულ ჭურჭელში მოათავსეთ 7.5 სმ-იანი სილიკონის ვაფლი. ფირფიტა ფრთხილად შეანჯღრიეთ 30 წამის განმავლობაში, შემდეგ კი ვაფლი ჰაერზე გააშრეთ. ვაფლი გადაიტანეთ IPA-თი დაფარულ თეფშზე და შემდეგ ფირფიტა 30 წამის განმავლობაში გაწმინდეთ.
სილიკონის ვაფლის ზედაპირიდან ორგანული ნარჩენების მაქსიმიზაციისთვის, სურვილისამებრ, შეიძლება გამოყენებულ იქნას პირანიას ხსნარი (წყალბადის ზეჟანგისა და კონცენტრირებული გოგირდმჟავას ნარევი, 1:3 (მოც./მოც.)).
პირანიას ხსნარი უკიდურესად კოროზიულია და გამოყოფს სითბოს. აუცილებელია დამატებითი უსაფრთხოების ზომების მიღება. ნარჩენების გადასაყრელად, გააგრილეთ ხსნარი და გადაიტანეთ სუფთა, მშრალ ნარჩენების კონტეინერში. გამოიყენეთ მეორადი კონტეინერები და სათანადოდ მონიშნეთ ნარჩენების კონტეინერები. უფრო დეტალური პროცედურებისთვის, გთხოვთ, დაიცვათ დაწესებულების უსაფრთხოების ინსტრუქციები.
ვაფლების გასაშრობად მოათავსეთ ისინი 200°C-ზე გახურებულ ცხელ ფირფიტაზე 10 წუთის განმავლობაში. გაშრობის შემდეგ, ვაფლი ხუთჯერ შეანჯღრიეთ ჰაერზე გასაცივებლად.
გაწმენდილი სილიკონის ვაფლის ცენტრში დაასხით დაახლოებით 10 გ ფოტორეზისტი SU-8 2100. პინცეტით თანაბრად გადაანაწილეთ ფოტორეზისტი ვაფლზე. პერიოდულად მოათავსეთ ვაფლი 65°C-ზე გახურებულ ცხელ ფირფიტაზე, რათა ფოტორეზისტი ნაკლებად წებოვანი იყოს და მისი გაშლა გაადვილდეს. არ მოათავსოთ ვაფლი პირდაპირ ცხელ ფირფიტაზე.
SU-8 თანაბრად გადანაწილდა ვაფლზე სპინინგ-დაფარვის გამოყენებით. დაპროგრამეთ SU-8-ის შემომავალი ბრუნვა 5-10 წამის განმავლობაში, რათა გავრცელდეს 500 ბრ/წთ სიჩქარით 100 ბრ/წთ აჩქარებით. დააყენეთ ძირითადი ბრუნვა 200 µმ ​​სისქის ნიმუშის შესაქმნელად 1500 ბრ/წთ-ზე, ან მიაღწიეთ 250 µმ სისქის მიღწევას (ჩიპზე ნაწლავის ზედა ფენისთვის 500 µმ ​​სიმაღლის შექმნით; იხილეთ „კრიტიკული ნაბიჯები“ ქვემოთ) და დააყენეთ 300 ბრ/წთ აჩქარებაზე 30 წამის განმავლობაში 1200 ბრ/წთ-ზე.
ძირითადი ბრუნვის სიჩქარის რეგულირება შესაძლებელია სილიკონის ვაფლზე SU-8 ნიმუშის სამიზნე სისქის მიხედვით.
ჩიპზე ნაწლავის ზედა ფენისთვის 500 µm სიმაღლის SU-8 ნიმუშების დასამზადებლად, ამ ყუთის (ნაბიჯები 7 და 8) დატრიალების და რბილი გამოწვის ეტაპები თანმიმდევრულად განმეორდა (იხილეთ ნაბიჯი 9) SU-8-ის 250 µm სისქის ორი ფენის მისაღებად, რომელთა ფენებად დადება და შეერთება შესაძლებელია ულტრაიისფერი გამოსხივების ზემოქმედებით ამ ყუთის მე-12 ეტაპზე, რითაც მიიღება 500 µm სიმაღლის ფენა.
SU-8 საფარით დაფარული ვაფლები ფრთხილად მოათავსეთ ცხელ თეფშზე 65°C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში, შემდეგ შეცვალეთ ტემპერატურა 95°C-ზე და ინკუბაცია მოახდინეთ დამატებით 40 წუთის განმავლობაში.
ზედა მიკროარხში SU-8 ნიმუშის 500 მკმ სიმაღლის მისაღწევად, გაიმეორეთ მე-7 და მე-8 ნაბიჯები 250 მკმ სისქის SU-8 ორი ფენის გენერირებისთვის.
ულტრაიისფერი ნიღბის გასწორების მოწყობილობის გამოყენებით, მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად, ჩაატარეთ ნათურის ტესტირება ვაფლის ექსპოზიციის დროის გამოსათვლელად. (ექსპოზიციის დრო, ms) = (ექსპოზიციის დოზა, mJ/cm2)/(ნათურის სიმძლავრე, mW/cm2).
ექსპოზიციის დროის განსაზღვრის შემდეგ, ფოტონიღაბი მოათავსეთ ულტრაიისფერი ნიღბის გასწორების ნიღბის დამჭერზე და ფოტონიღაბი მოათავსეთ SU-8 დაფარულ ვაფლზე.
ულტრაიისფერი გამოსხივების დისპერსიის მინიმუმამდე დასაყვანად, ფოტონიღბის დაბეჭდილი ზედაპირი პირდაპირ სილიკონის ვაფლის SU-8 დაფარულ მხარეს მოათავსეთ.
SU-8-ით დაფარული ვაფლი და ფოტონიღაბი ვერტიკალურად დაამუშავეთ 260 მჯ/სმ2 ულტრაიისფერი სხივის ზემოქმედების ქვეშ წინასწარ განსაზღვრული ექსპოზიციის დროის განმავლობაში (იხილეთ ამ ჩარჩოს მე-10 ნაბიჯი).
ულტრაიისფერი გამოსხივების შემდეგ, SU-8-ით დაფარული სილიკონის ვაფლები გამოაცხვეს 65°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში და 95°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში თითოეულ ცხელ ფირფიტაზე 200 μm სიმაღლის ნიმუშების შესაქმნელად. 500 μm სიმაღლის ნიმუშების შესაქმნელად, გამოცხობის შემდგომი დრო 95°C-ზე გაზარდეთ 30 წუთამდე.
დეველოპერს ასხამენ შუშის ჭურჭელში და გამომცხვარ ვაფლს ათავსებენ. SU-8 დეველოპერის მოცულობა შეიძლება განსხვავდებოდეს შუშის ფირფიტის ზომის მიხედვით. დარწმუნდით, რომ გამოიყენეთ საკმარისი რაოდენობის SU-8 დეველოპერი, რათა მთლიანად მოაშოროთ გამოუყენებელი SU-8. მაგალითად, 150 მმ დიამეტრის და 1 ლიტრი ტევადობის შუშის ჭურჭელს იყენებთ, გამოიყენეთ დაახლოებით 300 მლ SU-8 დეველოპერის საშუალება. ფორმა გაანათეთ 25 წუთის განმავლობაში, პერიოდულად ფრთხილად ბრუნვით.
განვითარებული ობი გარეცხეთ დაახლოებით 10 მლ ახალი დეველოპერით, შემდეგ კი ხსნარის პიპეტით შესხურებით დაამატეთ IPA.
მოათავსეთ ვაფლი პლაზმურ გამწმენდში და გააჩერეთ ჟანგბადის პლაზმაში (ატმოსფერული აირი, სამიზნე წნევა 1 × 10−5 ტორი, სიმძლავრე 125 ვატი) 1.5 წუთის განმავლობაში.
ვაფლი მოათავსეთ ვაკუუმ-ექსიკატორში, შიგნით კი მინის სლაიდი მოათავსეთ. ვაფლები და სლაიდები შეიძლება გვერდიგვერდ განთავსდეს. თუ ვაკუუმ-ექსიკატორი ფირფიტით რამდენიმე ფენად არის დაყოფილი, სლაიდები ქვედა კამერაში მოათავსეთ, ხოლო ვაფლები ზედა კამერაში. მინის სლაიდზე ჩაასხით 100 μL ტრიქლორო(1H, 1H, 2H, 2H-პერფტოროოქტილ)სილანის ხსნარი და სილანიზაციისთვის გამოიყენეთ ვაკუუმი.
გაყინული Caco-2 უჯრედების ფლაკონი გაალღვეთ 37°C წყლის აბაზანაში, შემდეგ გალღობილი უჯრედები გადაიტანეთ T75 კოლბაში, რომელიც შეიცავს 15 მლ 37°C ტემპერატურაზე წინასწარ გახურებულ Caco-2 გარემოს.
Caco-2 უჯრედების ~90%-იანი შეერთებისას გასატარებლად, ჯერ Caco-2 გარემო, PBS და 0.25% ტრიფსინი/1 mM EDTA გაათბეთ 37°C წყლის აბაზანაში.
გარემოს ასპირაცია ვაკუუმური ასპირაციით მოახდინეთ. უჯრედები ორჯერ გარეცხეთ 5 მლ თბილი PBS-ით ვაკუუმური ასპირაციის გამეორებით და ახალი PBS-ის დამატებით.