Nature.com غا كىرگىنىڭىزگە رەھمەت. سىز ئىشلىتىۋاتقان تور كۆرگۈچ نۇسخىسىدا CSS نى قوللاش چەكلىك. ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن، يېڭىلانغان تور كۆرگۈچ ئىشلىتىشىڭىزنى (ياكى Internet Explorer دا ماسلىشىشچانلىق ھالىتىنى ئېتىۋېتىشىڭىزنى) تەۋسىيە قىلىمىز. بۇ ئارىلىقتا، داۋاملىق قوللاشنى كاپالەتلەندۈرۈش ئۈچۈن، تور بېكەتنى ئۇسلۇب ۋە JavaScriptسىز كۆرسىتىمىز.
ئىنسان ئۈچەي شەكىللىنىشى ئۈچ ئۆلچەملىك ئېپىتېلىي مىكرو ئارخىتېكتۇرىسى ۋە بوشلۇق تەشكىللىنىشىنىڭ كرىپتا-ۋىللۇس ئالاھىدىلىكلىرىنى بەرپا قىلىدۇ. بۇ ئۆزگىچە قۇرۇلما ئاساسىي كرىپتادىكى غول ھۈجەيرە ئورنىنى سىرتقى مىكروب ئانتىگېنلىرى ۋە ئۇلارنىڭ مېتابولىتلىرىدىن قوغداش ئارقىلىق ئۈچەينىڭ گومېئوستازىسىنى ساقلاش ئۈچۈن تەلەپ قىلىنىدۇ. بۇنىڭدىن باشقا، ئۈچەي ۋىللىلىرى ۋە ئاجرىتىپ چىقىرىدىغان شىلىمشىق ماددىلار ئۈچەي شىلىمشىق پەردىسى يۈزىدە قوغداش توسۇقى بىلەن ئىقتىدار جەھەتتىن پەرقلەنگەن ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى تەمىنلەيدۇ. شۇڭا، ئۈچ ئۆلچەملىك ئېپىتېلىي قۇرۇلمىلىرىنى قايتا يارىتىش سىناق نەيچىسىدىكى ئۈچەي مودېللىرىنى قۇرۇش ئۈچۈن ئىنتايىن مۇھىم. ئالاھىدە تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدىغىنى شۇكى، ئورگانىك تەقلىدلىك ئۈچەي-چىپ ئۈچەي ئېپىتېلىيسىنىڭ ئۆزلۈكىدىن 3D شەكىللىنىشىنى قوزغىتىپ، فىزىئولوگىيىلىك ئىقتىدار ۋە بىئومېخانىكىنى كۈچەيتەلەيدۇ. بۇ يەردە، بىز ئۈچەيدە مىكرو سۇيۇقلۇق چىپى ۋە ترانسۋېل قىستۇرۇلغان ئارىلاشما چىپتا ئۈچەي شەكىللىنىشىنى كۈچلۈك قوزغىتىش ئۈچۈن قايتا ئىشلەتكىلى بولىدىغان بىر كېلىشىم بىلەن تەمىنلەيمىز. بىز ئۈسكۈنە ياساش، Caco-2 ياكى ئۈچەي ئورگانوئىد ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى ئەنئەنىۋى مۇھىتتا ۋە مىكرو سۇيۇقلۇق سۇپىسىدا يېتىشتۈرۈش، 3D شەكىللىنىشىنى قوزغىتىش ۋە كۆپ خىل رەسىمگە ئېلىش ئۇسۇللىرىنى ئىشلىتىپ قۇرۇلغان 3D ئېپىتېلىيىنىڭ خاراكتېرىنى ئېنىقلاشنىڭ تەپسىلىي ئۇسۇللىرىنى بايان قىلىمىز. بۇ كېلىشىم 5 كۈن ئىچىدە بازولاتېرال سۇيۇقلۇق ئېقىمىنى كونترول قىلىش ئارقىلىق ئۈچەينىڭ فۇنكسىيەلىك مىكرو قۇرۇلمىسىنىڭ قايتا ھاسىل بولۇشىغا ئېرىشىدۇ. بىزنىڭ سىناق نەيچىسىدىكى مورفوگېنېز ئۇسۇلىمىز فىزىئولوگىيىلىك جەھەتتىن مۇناسىۋەتلىك قىرقىش كۈچى ۋە مېخانىكىلىق ھەرىكەتنى قوللىنىدۇ ھەمدە مۇرەككەپ ھۈجەيرە قۇرۇلۇشى ياكى باشقۇرۇشنى تەلەپ قىلمايدۇ، بۇ باشقا مەۋجۇت تېخنىكىلاردىن ئېشىپ كېتىشى مۇمكىن. بىز تەكلىپ قىلغان كېلىشىمنىڭ بىئومېدىتسىنا تەتقىقات ساھەسىگە كەڭ دائىرىلىك تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىن، بۇنىڭ بىئومېدىتسىنا، كلىنىكىلىق ۋە دورىگەرلىك قوللىنىشلىرى ئۈچۈن سىناق نەيچىسىدىكى ئۈچ ئۆلچەملىك ئۈچەي ئېپىتېلىي قەۋىتىنى قايتا ھاسىل قىلىش ئۇسۇلىنى تەمىنلىشى مۇمكىن دەپ قارايمىز.
تەجرىبىلەر شۇنى ئىسپاتلىدىكى، ئۈچەي ئېپىتېلىيىسى Caco-2 ھۈجەيرىلىرى چىپتىكى 1،2،3،4،5 ياكى ئىككى قەۋەتلىك مىكرو سۇيۇقلۇق ئۈسكۈنىلىرىدە6،7 يېتىشتۈرۈلگەن بولۇپ، ئاساسىي مېخانىزمنى ئېنىق چۈشەنمىگەن ئەھۋالدا، سىناق نەيچىسىدە ئۆزلۈكىدىن 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى باشتىن كەچۈرەلەيدۇ. يېقىنقى تەتقىقاتىمىزدا، بىز يېتىشتۈرۈش ئۈسكۈنىلىرىدىن بازولاتېرال ئاجرىتىپ چىقىرىلغان شەكىل ئۆزگىرىشىگە قارشى تۇرغۇچىلارنى چىقىرىۋېتىشنىڭ سىناق نەيچىسىدە 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى قوزغىتىش ئۈچۈن زۆرۈر ۋە يېتەرلىك ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق، بۇ Caco-2 ۋە بىمارلاردىن ئېلىنغان ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى تەرىپىدىن ئىسپاتلاندى. ئېپىتېلىيە ھۈجەيرىلىرى تەكشۈرۈلدى. بۇ تەتقىقاتتا، بىز بولۇپمۇ كۈچلۈك Wnt ئانتاگونىستى Dickkopf-1 (DKK-1) نىڭ ھۈجەيرە ئىشلەپچىقىرىشى ۋە قويۇقلۇق تەقسىملىنىشىغا دىققەت قىلدۇق، بۇ ھۈجەيرە «ھىبرىد چىپ» دەپ ئاتىلىدىغان Transwell قىستۇرمىلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئۆزگەرتىلگەن مىكرو سۇيۇقلۇق ئۈسكۈنىلىرىدە ئىشلىتىلىدۇ. بىز سىرتقى Wnt ئانتاگونىستلىرىنى (مەسىلەن، DKK-1، Wnt باستۇرغۇچى 1، ئاجرىتىلغان بۇرمىلانغان ئاقسىل 1 ياكى Soggy-1) چىپ ئىچىدىكى ئۈچەيگە قوشۇشنىڭ مورفوگېنېزنى توسىدىغانلىقىنى ياكى ئالدىن قۇرۇلمىلىق 3D ئېپىتېلىيە قەۋىتىنى بۇزۇۋېتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىمىز، بۇ بولسا يېتىشتۈرۈش جەريانىدا ئانتاگونىستلىق بېسىمنىڭ سىناق نەيچىسىدە ئۈچەي مورفوگېنېزغا مەسئۇل ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. شۇڭا، ئېپىتېلىيە چېگرىسىدا كۈچلۈك مورفوگېنېزغا ئېرىشىشنىڭ ئەمەلىي ئۇسۇلى، ئاكتىپ يۇيۇش (مەسىلەن، چىپ ئىچىدىكى ئۈچەي ياكى چىپ ئىچىدىكى ھىبرىد سۇپىلىرىدا) ياكى بازولاتېرال تاراتقۇلاردا (مەسىلەن، Transwell قىستۇرمىلىرىدىن قۇدۇقلاردىكى چوڭ بازولاتېرال سۇ ئامبىرىغا) تارقىتىش ئارقىلىق بازولاتېرال بۆلەكتىكى Wnt ئانتاگونىستلىرىنىڭ سەۋىيەسىنى يوقىتىش ياكى ئەڭ تۆۋەن چەكتە ساقلاشتىن ئىبارەت.
بۇ پروتوكولدا، بىز ئۈچەي ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى پولىدىمېتىلسىلوكسان (PDMS) ئاساسلىق تۆشۈكلۈك پەردىلەر (6A، 7A، 8، 9-قەدەملەر) ياكى Transwell قىستۇرمىلىرىنىڭ پولىئېستېر پەردىلىرى (6B، 7B، 8، 9-قەدەملەر) ئۈستىدە يېتىشتۈرۈش ۋە سىناق نەيچىسىدە 3D مورفوگېنېزنى قوزغىتىش (10-قەدەم) ئۈچۈن ئۈچەي ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى ياساشنىڭ تەپسىلىي ئۇسۇلىنى تەمىنلەيمىز. بىز يەنە كۆپ خىل رەسىمگە تارتىش ئۇسۇللىرىنى قوللىنىش ئارقىلىق (11-24-قەدەملەر) توقۇلمىغا خاس گىستوگېنېز ۋە نەسەبكە باغلىق ھۈجەيرە پەرقلىنىشىنى كۆرسىتىدىغان ھۈجەيرە ۋە مولېكۇلا ئالاھىدىلىكلىرىنى بايقىدۇق. بىز Caco-2 ياكى ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى قاتارلىق ئىنسان ئۈچەي ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى ئىشلىتىپ، ئىككى خىل يېتىشتۈرۈش شەكلىدە مورفوگېنېزنى قوزغىتىمىز، بۇنىڭ ئىچىدە تۆشۈكلۈك پەردىلەرنىڭ يۈزى ئۆزگەرتىلىشى، 2D مونوقاتلاملارنى يارىتىش ۋە ئۈچەينىڭ بىئوخىمىيەلىك ۋە بىئومېخانىكىلىق مىكرو مۇھىتنى كۆپەيتىش قاتارلىق تېخنىكىلىق تەپسىلاتلار بار. سىناق نەيچىسىدە 3D مورفوگېنېزنى قوزغىتىش ئۈچۈن، بىز مورفوگېن ئانتاگونىستلىرىنى چىقىرىۋەتتۇق. ئاخىرىدا، بىز مورفوگېنغا تايىنىدىغان ئېپىتېلىي ئۆسۈشى، ئۇزۇنلۇقتىكى ساھىبخان-مىكروبىئوم بىرلىكتە يېتىشتۈرۈشى، پاتوگېن يۇقۇملىنىشى، ياللۇغلىنىش يارىلىنىشى، ئېپىتېلىي توسۇقىنىڭ نورمالسىزلىقى ۋە پروبىئوتىك ئاساسلىق داۋالاش ئۇسۇللىرىنى مودېللاشتۇرۇشقا ئىشلىتىشكە بولىدىغان قايتا ھاسىل بولىدىغان 3D ئېپىتېلىي قەۋىتىنىڭ پايدىلىقلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىمىز. مىسال: تەسىرلەر.
بىزنىڭ بۇ كېلىشىم ئاساسىي (مەسىلەن، ئۈچەي شىلىمشىق پەردە بىئولوگىيەسى، غول ھۈجەيرە بىئولوگىيەسى ۋە تەرەققىيات بىئولوگىيەسى) ۋە قوللىنىشچان تەتقىقات (مەسىلەن، كلىنىكىدىن بۇرۇنقى دورا سىنىقى، كېسەللىك مودېلى، توقۇلما قۇرۇلۇشى ۋە ئاشقازان-ئۈچەي كېسەللىكلىرى) ساھەسىدىكى كەڭ دائىرىلىك ئالىملارغا پايدىلىق بولۇشى مۇمكىن. سىناق نەيچىسىدە ئۈچەي ئېپىتېلىيىنىڭ 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى قوزغىتىش كېلىشىمىمىزنىڭ قايتا ئىشلەپچىقىرىش ئىقتىدارى ۋە كۈچلۈكلۈكى سەۋەبىدىن، بىز تېخنىكىلىق ئىستراتېگىيىمىزنىڭ ئۈچەي تەرەققىياتى، قايتا ھاسىل قىلىش ياكى گومېئوستاز جەريانىدا ھۈجەيرە سىگنالىنىڭ دىنامىكىسىنى تەتقىق قىلىۋاتقان ئاڭلىغۇچىلارغا تارقىتىلىشىنى تەسەۋۋۇر قىلىمىز. بۇنىڭدىن باشقا، بىزنىڭ كېلىشىم Norovirus 8، ئېغىر ئۆتكۈر نەپەس يولى سىندرومى كورونا ۋىرۇسى 2 (SARS-CoV-2)، Clostridium difficile، Salmonella Typhimurium 9 ياكى Vibrio cholerae قاتارلىق ھەر خىل يۇقۇملۇق ئامىللار تەسىرىدىكى يۇقۇملىنىشنى تەكشۈرۈشتە پايدىلىق. كېسەللىك پاتولوگىيەسى ۋە كېسەللىك پەيدا قىلىش ئۇسۇلىنى تەتقىق قىلىدىغانلارمۇ پايدىلىق. چىپ ئۈستىدىكى ئۈچەي مىكروفىزىئولوگىيە سىستېمىسىنى ئىشلىتىش ئۇزۇن مۇددەت بىرلىكتە يېتىشتۈرۈش 10 ۋە كېيىن ئاشقازان-ئۈچەي (GI) يولىدا ساھىبخانىنىڭ مۇداپىئەسى، ئىممۇنىتېت ئىنكاسى ۋە پاتوگېنغا مۇناسىۋەتلىك يارىلىنىشنى رېمونت قىلىشنى باھالاشقا يول قويۇشى مۇمكىن 11. ئېقىشچان ئۈچەي كېسىلى، گلۇتېن كېسىلى، كرون كېسىلى، يارىلىق كولىت، پوپىت ياكى ئۈچەينىڭ غىدىقلىنىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك باشقا GI كېسەللىكلىرىنى بىمارنىڭ 3D ئۈچەي ئېپىتېلىي قەۋىتىنى ئىشلىتىپ 3D ئۈچەي ئېپىتېلىي قەۋىتى تەييارلىغاندا تەقلىد قىلغىلى بولىدۇ، بۇ كېسەللىكلەر ۋىللۇس ئاتروفىيەسى، كىرىفتا قىسقارشى، شىللىق پەردىنىڭ زەخمىلىنىشى ياكى ئېپىتېلىي توسۇقىنىڭ بۇزۇلۇشى قاتارلىقلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. بىئوپسىيە ياكى ئاساسىي ھۈجەيرىدىن ئېلىنغان ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى 12، 13. كېسەللىك مۇھىتىنىڭ يۇقىرى مۇرەككەپلىكىنى تېخىمۇ ياخشى مودېللاشتۇرۇش ئۈچۈن، ئوقۇرمەنلەر 3D ئۈچەي ۋىللۇس-كىرىفتا مىكرو ئارخىتېكتۇرىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان مودېللارغا بىمارنىڭ پېرىفېرىك قان مونونۇكلېئار ھۈجەيرىلىرى (PBMCs) قاتارلىق كېسەللىككە مۇناسىۋەتلىك ھۈجەيرە تىپلىرىنى قوشۇشنى ئويلىشىشى مۇمكىن. توقۇلمىغا خاس ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرى 5.
3D ئېپىتېلىي مىكرو قۇرۇلمىسىنى بۆلەكلەش جەريانىسىزلا بېكىتىپ، كۆرگىلى بولىدىغان بولغاچقا، بوشلۇق ترانسكرىپتومىكىسى ۋە يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى ياكى يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى رەسىملەر ئۈستىدە ئىشلەۋاتقان كۆرۈرمەنلەر ئېپىتېلىي بوشلۇقلىرىدىكى گېن ۋە ئاقسىللارنىڭ بوشلۇق-ۋاقىت دىنامىكىسىنى خەرىتىلەشىمىزگە قىزىقىشى مۇمكىن. تېخنىكىغا قىزىقىدۇ. مىكروب ياكى ئىممۇنىتېت غىدىقلىغۇچىلىرىغا بولغان ئىنكاس. بۇنىڭدىن باشقا، ئۈچەينىڭ گومېئوستازىنى ماسلاشتۇرىدىغان ئۇزۇنلۇقتىكى ساھىبخان-مىكروبيوم ئۆزئارا سۆھبىتى 10، 14 نى ئۈچەي شىللىق پەردىسىدە ھەر خىل مىكروب تۈرلىرى، مىكروبلار توپى ياكى تەرەت مىكروبيوتالىرىنى، بولۇپمۇ چىپتىكى ئۈچەيدە بىرلىكتە يېتىشتۈرۈش ئارقىلىق قۇرغىلى بولىدۇ. بۇ سۇپا ئىچىدە. بۇ ئۇسۇل، بولۇپمۇ، ئىلگىرى مەدەنىيەتسىز ئۈچەي مىكرو بىئولوگىيىسى، ئاشقازان-ئۈچەي كېسەللىكلىرى، ئىنسانلارنىڭ مىكرو بىئولوگىيىسى، مەدەنىيەتشۇناسلىق ۋە كلىنىكىلىق مىكرو بىئولوگىيە تەتقىقاتىنى ئۆگىنىۋاتقان ۋە تەجرىبىخانىدا ئىلگىرى مەدەنىيەتسىز ئۈچەي مىكرو بىئولوگىيىسىنى يېتىشتۈرۈشنى ئۈمىد قىلىۋاتقان ئوقۇغۇچىلار ئۈچۈن ئالاھىدە جەلپ قىلارلىق. ئەگەر بىزنىڭ سىناق تەجرىبە مورفوگېنېز كېلىشىمىمىز 24، 96 ياكى 384 قۇدۇق تاختىسىدىكى كۆپ قۇدۇقلۇق قىستۇرمىلار قاتارلىق كېڭەيتكىلى بولىدىغان مەدەنىيەت فورماتلىرىغا ماسلاشتۇرۇلسا، بۇ كېلىشىم يەنە يېمەكلىك سانائىتى ئۈچۈن دورىگەرلىك، بىئومېدىتسىنا ياكى يۇقىرى ئۈنۈملۈك تەكشۈرۈش ياكى دەلىللەش سۇپىلىرىنى تەرەققىي قىلدۇرۇۋاتقانلارغىمۇ تارقىتىلىشى مۇمكىن. پىرىنسىپنىڭ ئىسپاتى سۈپىتىدە، بىز يېقىندا 24 قۇدۇقلۇق تاختا فورماتىغا كېڭەيتكىلى بولىدىغان كۆپ ئىقتىدارلىق يۇقىرى ئۈنۈملۈك مورفوگېنېز سىستېمىسىنىڭ مۇمكىنچىلىكىنى نامايان قىلدۇق. بۇنىڭدىن باشقا، كۆپ ئورگانلىق چىپ مەھسۇلاتلىرى سودىغا ئايلاندۇرۇلدى16،17،18. شۇڭلاشقا، بىزنىڭ سىناق تەجرىبە مورفوگېنېز ئۇسۇلىمىزنىڭ دەلىللىنىشىنى تېزلىتىش ۋە نۇرغۇن تەتقىقات تەجرىبىخانىلىرى، سانائەت ياكى ھۆكۈمەت ۋە نازارەت قىلىپ باشقۇرۇش ئورگانلىرى تەرىپىدىن قوللىنىلىشى مۇمكىن، بۇ ئارقىلىق دورىلارنى سىناق قىلىش ئۈچۈن ترانسكرىپتوم سەۋىيەسىدە سىناق تەجرىبە ئۈچەي مورفوگېنېزىنىڭ ھۈجەيرە قايتا پروگراممىلىنىشىنى چۈشىنىشكە بولىدۇ. ياكى بىئوتېراپېۋتىك دورىلار دورا نامزاتلىرىنىڭ سۈمۈرۈلۈشى ۋە توشۇلىشى ئۈچ ئۆلچەملىك ئۈچەي ئورنىدىن ياسالغان ماددىلار ئارقىلىق ياكى خاسلاشتۇرۇلغان ياكى سودا خاراكتېرلىك ئورگان-چىپ مودېللىرى ئارقىلىق ئۈچەي شەكىللىنىش جەريانىنىڭ قايتا ھاسىل بولۇش ئىقتىدارىنى باھالاش ئۈچۈن باھالاندى.
ئۈچەي ئېپىتېلىيىسىنىڭ مورفوگېنېزىنى تەتقىق قىلىشتا چەكلىك ساندا ئىنسانلارغا مۇناسىۋەتلىك تەجرىبە مودېللىرى ئىشلىتىلدى، بۇنىڭ ئاساسلىق سەۋەبى سىناق نەيچىسىدە 3D مورفوگېنېزىنى قوزغىتىدىغان يولغا قويۇلىدىغان قائىدىلەرنىڭ يوقلۇقىدۇر. ئەمەلىيەتتە، ئۈچەي مورفوگېنېزى توغرىسىدىكى ھازىرقى بىلىملەرنىڭ كۆپىنچىسى ھايۋانلارنى تەتقىق قىلىشقا ئاساسلانغان (مەسىلەن، زېبرا بېلىقى 20، چاشقان 21 ياكى توخۇ 22). قانداقلا بولمىسۇن، ئۇلار ئەمگەك ۋە چىقىمنى كۆپ تەلەپ قىلىدۇ، ئەخلاق جەھەتتىن گۇمانلىق بولۇشى مۇمكىن، ئەڭ مۇھىمى، ئىنسانلارنىڭ تەرەققىيات جەريانلىرىنى ئېنىق بېكىتەلمەيدۇ. بۇ مودېللارنىڭ كۆپ تەرەپلىمە كېڭەيتكىلى بولىدىغان ئۇسۇلدا سىناق قىلىش ئىقتىدارىمۇ ناھايىتى چەكلىك. شۇڭلاشقا، سىناق نەيچىسىدە 3D توقۇلما قۇرۇلمىسىنى قايتا ھاسىل قىلىش قائىدىمىز سىناق نەيچىسىدە ھايۋانات مودېللىرى ۋە باشقا ئەنئەنىۋى ستاتىك 2D ھۈجەيرە يېتىشتۈرۈش مودېللىرىدىن ئۈستۈن تۇرىدۇ. ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك، 3D ئېپىتېلىي قۇرۇلمىسىنى ئىشلىتىش بىزگە ھەر خىل شىلىمشىق پەردە ياكى ئىممۇنىتېت غىدىقلىغۇچىلىرىغا جاۋابەن كرىپتا-ۋىللۇس ئوقىدىكى پەرقلەنگەن ھۈجەيرىلەرنىڭ بوشلۇقتىكى ئورنىنى تەكشۈرۈشكە يول قويدى. 3D ئېپىتېلىي قەۋەتلىرى مىكروب ھۈجەيرىلىرىنىڭ بوشلۇق بوشلۇقىنى شەكىللەندۈرۈش ۋە ساھىبخان ئامىللىرىغا جاۋابەن ئېكولوگىيىلىك تەرەققىياتنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن بوشلۇق بىلەن تەمىنلىيەلەيدۇ (مەسىلەن، ئىچكى ۋە تاشقى شىلىمشىق قەۋەتلەر، ئاجرىلىپ چىقىش...). IgA ۋە مىكروبقا قارشى پېپتىدلار). بۇنىڭدىن باشقا، 3D ئېپىتېلىي مورفولوگىيەسى بىزگە ئۈچەي مىكرو بىئولوگىيىسىنىڭ قانداق قىلىپ ئۆز جەمئىيەتلىرىنى قۇرىدىغانلىقىنى ۋە ئاساسىي كرىپتلاردا ھۈجەيرە تەشكىللىنىشى ۋە ئاساسىي ھۈجەيرە بوشلۇقلىرىنى شەكىللەندۈرىدىغان مىكروب مېتابولىتلىرىنى (مەسىلەن، قىسقا زەنجىرسىمان ياغ كىسلاتاسى) قانداق ئىشلەپچىقىرىدىغانلىقىنى چۈشىنىشكە يول قويىدۇ. بۇ ئالاھىدىلىكلەرنى پەقەت 3D ئېپىتېلىي قەۋىتى سىناق نەيچىسىدە قۇرۇلغاندا نامايان قىلغىلى بولىدۇ.
ئۈچ ئۆلچەملىك ئۈچەي ئېپىتېلىي قۇرۇلمىسىنى يارىتىش ئۇسۇلىمىزدىن باشقا، بىر قانچە سىناق نەيچىسىدە ئۇسۇللار بار. ئۈچەي ئورگانوئىد مەدەنىيىتى ئالاھىدە مورفوگېن شارائىتى ئاستىدا ئۈچەي غول ھۈجەيرىلىرىنى يېتىشتۈرۈشكە ئاساسلانغان ئەڭ ئىلغار توقۇلما قۇرۇلۇش تېخنىكىسى23،24،25. قانداقلا بولمىسۇن، ئۈچ ئۆلچەملىك ئورگانوئىد مودېللىرىنى توشۇش ئانالىزى ياكى ساھىبخان-مىكروبىئوم بىرلىكتە مەدەنىيەت قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىش كۆپىنچە قىيىن، چۈنكى ئۈچەي بوشلۇقى ئورگانوئىدنىڭ ئىچىگە ئورالغان، شۇڭا مىكروب ھۈجەيرىلىرى ياكى سىرتقى ئانتىگېن قاتارلىق لۇمىنال تەركىبلىرىنى كىرگۈزۈش چەكلىك. ئورگانوئىد لۇمىنلىرىغا كىرىشنى مىكرو ئىنژېكتور ئارقىلىق ياخشىلىغىلى بولىدۇ26،27، ئەمما بۇ ئۇسۇل تاجاۋۇزچىلىق خاراكتېرلىك ۋە ئەمگەك تەلەپ قىلىدىغان بولۇپ، ئۇنى ئىجرا قىلىش ئۈچۈن مەخسۇس بىلىم تەلەپ قىلىنىدۇ. بۇنىڭدىن باشقا، گىدروگېل ئىسكىلاتلىرىدا ساقلانغان ئەنئەنىۋى ئورگانوئىد مەدەنىيىتى جانلىق جانلىقلارنىڭ بىئومېخانىكىسىنى توغرا ئەكس ئەتتۈرەلمەيدۇ.
بىر قانچە تەتقىقات گۇرۇپپىلىرى قوللانغان باشقا ئۇسۇللار، گېل يۈزىدە ئايرىم ئىنسان ئۈچەي ھۈجەيرىلىرىنى يېتىشتۈرۈش ئارقىلىق ئۈچەي ئېپىتېلىي قۇرۇلمىسىنى تەقلىد قىلىش ئۈچۈن ئالدىن قۇرۇلمىلىق 3D گىدروگېل ئىسكىلاتلىرىنى ئىشلىتىدۇ. 3D بېسىلغان، مىكرو ئۇۋىلانغان ياكى لىتوگرافىيەلىك ياسالغان قېلىپلارنى ئىشلىتىپ گىدروگېل ئىسكىلاتلىرىنى ياساڭ. بۇ ئۇسۇل فىزىئولوگىيەلىك جەھەتتىن مۇناسىۋەتلىك مورفوگېن گرادىيېنتى بىلەن ئايرىم ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆزلۈكىدىن تەشكىللەنگەن تەرتىپىنى سىناق نەيچىسىدە كۆرسىتىپ بېرىدۇ، ئىسكىلاتقا سترومال ھۈجەيرىلىرىنى قوشۇش ئارقىلىق يۇقىرى تەرەپ نىسبىتىدىكى ئېپىتېلىي قۇرۇلمىسى ۋە ستروما-ئېپىتېلىي ئۆزئارا تەسىر كۆرسىتىشىنى شەكىللەندۈرىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن، ئالدىن قۇرۇلمىلىق ئىسكىلاتلارنىڭ تەبىئىتى ئۆزلۈكىدىن مورفوگېنېتىك جەرياننىڭ كۆرۈنۈشىنىڭ ئالدىنى ئېلىشى مۇمكىن. بۇ مودېللار يەنە دىنامىك لۇمىنال ياكى ئارىلىق ئېقىم بىلەن تەمىنلىمەيدۇ، ئۈچەي ھۈجەيرىلىرىنىڭ مورفوگېنېزدىن ئۆتۈشى ۋە فىزىئولوگىيەلىك ئىقتىدارغا ئېرىشىشى ئۈچۈن لازىم بولغان سۇيۇقلۇق قىرقىش بېسىمى يوق. يېقىندا ئېلىپ بېرىلغان يەنە بىر تەتقىقاتتا مىكرو سۇيۇقلۇق سۇپىسىدىكى گىدروگېل ئىسكىلاتلىرى ئىشلىتىلگەن ۋە لازېر ئويۇش تېخنىكىسى ئارقىلىق ئۈچەي ئېپىتېلىي قۇرۇلمىسىنى نەقىشلىگەن. چاشقان ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى ئويۇلغان نەقىشلەرگە ئەگىشىپ ئۈچەي تۇرۇبىسى قۇرۇلمىسىنى شەكىللەندۈرىدۇ، ۋە ئىچكى لۇمىنال سۇيۇقلۇق ئېقىمى ... مىكرو سۇيۇقلۇق مودۇلى ئارقىلىق قايتا تەسۋىرلەنگەن. قانداقلا بولمىسۇن، بۇ مودېل ئۆزلۈكىدىن شەكىللىنىدىغان مورفوگېنېتىك جەريانلارنى نامايان قىلمايدۇ، شۇنداقلا ئۈچەي مېخانىكىلىق بىئولوگىيىلىك ھەرىكەتلىرىنىمۇ ئۆز ئىچىگە ئالمايدۇ. ئوخشاش گۇرۇپپىدىكى 3D بېسىش تېخنىكىسى ئۆزلۈكىدىن شەكىللىنىدىغان مورفوگېنېتىك جەريانلارغا ئىگە كىچىك ئۈچەي نەيچىلىرىنى يارىتالىدى. تۇرۇبا ئىچىدىكى ھەر خىل ئۈچەي بۆلەكلىرىنى ياساش مۇرەككەپ بولسىمۇ، بۇ مودېلدا يەنە لۈمىنا سۇيۇقلۇقى ئېقىمى ۋە مېخانىكىلىق دېفورماتسىيە يوق. بۇنىڭدىن باشقا، مودېلنىڭ ئىشلىتىلىشچانلىقى چەكلىك بولۇشى مۇمكىن، بولۇپمۇ بىئو بېسىش جەريانى تاماملانغاندىن كېيىن، تەجرىبە شارائىتىنى بۇزۇش ياكى ھۈجەيرىلەر ئارا ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش. ئەكسىچە، بىزنىڭ تەكلىپ قىلغان كېلىشىم ئۆزلۈكىدىن شەكىللىنىدىغان ئۈچەي مورفوگېنېزى، فىزىئولوگىيىلىك جەھەتتىن مۇناسىۋەتلىك قىرقىش بېسىمى، ئۈچەي ھەرىكىتىنى تەقلىد قىلىدىغان بىئومېخانىكا، مۇستەقىل ئۇچ ۋە بازولاتېرال بۆلەكلەرنىڭ قولايلىقلىقى ۋە مودۇللۇق مۇرەككەپ بىئولوگىيىلىك مىكرو مۇھىتنى قايتا يارىتىشنى تەمىنلەيدۇ. شۇڭا، بىزنىڭ سىناق نەيچىسىدىكى 3D شەكىللىنىدىغان مورفوگېنېز كېلىشىمىمىز مەۋجۇت ئۇسۇللارنىڭ خىرىسلىرىنى يېڭىش ئۈچۈن تولۇقلايدىغان ئۇسۇل بىلەن تەمىنلىشى مۇمكىن.
بىزنىڭ پروتوكولىمىز پۈتۈنلەي 3D ئېپىتېلىي مورفوگېنېزىغا مەركەزلەشكەن بولۇپ، پەقەت ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىلا مەدەنىيەتتە بولۇپ، مېزېنخىما ھۈجەيرىلىرى، ئېندوتېلىي ھۈجەيرىلىرى ۋە ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرى قاتارلىق باشقا تىپتىكى ئەتراپتىكى ھۈجەيرىلەر يوق. ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك، بىزنىڭ پروتوكولىمىزنىڭ يادروسى كىرگۈزۈلگەن مۇھىتنىڭ بازولاتېرال تەرىپىدە ئاجرىلىپ چىققان مورفوگېن چەكلىگۈچىلىرىنى چىقىرىۋېتىش ئارقىلىق ئېپىتېلىي مورفوگېنېزىنى قوزغىتىشتىن ئىبارەت. بىزنىڭ چىپ ئۈستىدىكى ئۈچەي ۋە چىپ ئۈستىدىكى ئارىلاشما ھۈجەيرىلەرنىڭ كۈچلۈك مودۇللىقى بىزگە دولقۇنسىمان 3D ئېپىتېلىي قەۋىتىنى قايتا يارىتىشقا يول قويغان بولسىمۇ، ئېپىتېلىي-مېزېنخىما ئۆزئارا تەسىرى 33،34، ھۈجەيرە سىرتىدىكى ماترىتسا (ECM) چۆكمىسى 35 ۋە بىزنىڭ مودېلىمىزدا، ئاساسىي كرىپتلاردا ئاساسىي ھۈجەيرە بوشلۇقلىرىنى يەتكۈزىدىغان كرىپت-ۋىللۇس ئالاھىدىلىكلىرى قاتارلىق قوشۇمچە بىئولوگىيىلىك مۇرەككەپلىكلەر تېخىمۇ كۆپ ئويلىنىشقا تېگىشلىك. مېزېنخىمادىكى سترومال ھۈجەيرىلىرى (مەسىلەن، فىبروبلاستلار) ECM ئاقسىللىرىنى ئىشلەپچىقىرىش ۋە تىرىك جانلىقلاردا ئۈچەي مورفوگېنېزىنى تەڭشەشتە مۇھىم رول ئوينايدۇ 35،37،38. بىزنىڭ مودېلىمىزغا مېزېنخىما ھۈجەيرىلىرىنى قوشۇش مورفوگېنېتىك جەرياننى ۋە ھۈجەيرىنى كۈچەيتتى. ئۇلىنىش ئۈنۈمى. ئېندوتېلىي قەۋىتى (يەنى كاپىللا ياكى لىمفا قان تومۇرلىرى) ئۈچەي مىكرو مۇھىتىدا مولېكۇلا توشۇشى39 ۋە ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىسىنىڭ قوبۇل قىلىنىشى40 نى تەڭشەشتە مۇھىم رول ئوينايدۇ. بۇنىڭدىن باشقا، توقۇلما مودېللىرى كۆپ ئەزا ئۆزئارا تەسىر كۆرسىتىش ئۈچۈن لايىھەلەنگەندە، توقۇلما مودېللىرى ئارىسىدا باغلىنىشقا بولىدىغان قان تومۇر تەركىبلىرى ئالدىنقى شەرت. شۇڭلاشقا، ئورگان سەۋىيىسىدىكى ئېنىقلىق بىلەن تېخىمۇ توغرا فىزىئولوگىيىلىك ئالاھىدىلىكلەرنى مودېللاشتۇرۇش ئۈچۈن ئېندوتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى قوشۇشقا توغرا كېلىشى مۇمكىن. بىماردىن ئېلىنغان ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرى يەنە ئۈچەي كېسىلىنى تەقلىد قىلىش جەريانىدا تۇغما ئىممۇنىتېت ئىنكاسى، ئانتىگېننىڭ كۆرسىتىلىشى، تۇغما ماسلىشىشچان ئىممۇنىتېت ئۆزئارا تەسىرى ۋە توقۇلمىغا خاس ئىممۇنىتېتنى كۆرسىتىش ئۈچۈنمۇ مۇھىم.
گىبرىد چىپلارنى ئىشلىتىش، گىبرىد چىپقا قارىغاندا ئاسانراق، چۈنكى ئۈسكۈنە قۇرۇلمىسى ئاددىي، ھەمدە Transwell قىستۇرمىلىرىنى ئىشلىتىش گىبرىد ئېپىتېلىيىنى كېڭەيتىشكە يول قويىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن، بازاردا سېتىلىۋاتقان پولىئېستېر پەردىلىك Transwell قىستۇرمىلىرى ئېلاستىك ئەمەس ۋە پېرىستالتىكقا ئوخشاش ھەرىكەتلەرنى تەقلىد قىلالمايدۇ. بۇنىڭدىن باشقا، گىبرىد چىپقا قويۇلغان Transwell قىستۇرمىسىنىڭ ئۇچى قىسمى ھەرىكەتسىز ھالەتتە تۇرىدۇ، ئۇچى تەرەپتە قىرقىش كۈچى يوق. ئېنىقكى، ئۇچى قىسمىدىكى ستاتىك خۇسۇسىيەتلەر گىبرىد چىپلاردا ئۇزۇن مۇددەتلىك باكتېرىيە بىرلىكتە يېتىشتۈرۈشنى ئاز ئۇچرايدۇ. گىبرىد چىپلارنى ئىشلەتكەندە Transwell قىستۇرمىلىرىدا 3D مورفوگېنېزىنى كۈچلۈك قوزغىتالايمىز، ئەمما فىزىئولوگىيەلىك جەھەتتىن مۇناسىۋەتلىك بىئومېخانىكا ۋە ئۇچى سۇيۇقلۇق ئېقىمىنىڭ كەمچىل بولۇشى گىبرىد چىپ سۇپىلىرىنىڭ مۇمكىن بولغان قوللىنىشچانلىقىنى چەكلەپ قويۇشى مۇمكىن.
چىپ ئۈستىدىكى ئۆڭكۈر ۋە چىپ ئۈستىدىكى ئارىلاشما مەدەنىيەتلەردە ئىنسانلارنىڭ كرىپتا-ۋىللۇس ئوقىنىڭ تولۇق كۆلەمدە قايتا قۇرۇلۇشى تولۇق ئېنىقلانمىغان. مورفوگېنېز ئېپىتېلىي مونو قەۋەتتىن باشلىنىدىغان بولغاچقا، 3D مىكرو ئارخىتېكتۇرا چوقۇم تىرىك جانلىقلاردا كرىپتالارغا مورفولوگىيەلىك ئوخشاشلىقنى تەمىنلىمەيدۇ. مىكرو ئىنژېنېرلىق 3D ئېپىتېلىيىدىكى ئاساسىي كرىپتا رايونىغا يېقىن كۆپىيىۋاتقان ھۈجەيرە توپىنى خاراكتېرلەندۈرسەكمۇ، كرىپتا ۋە ۋىللۇس رايونلىرى ئېنىق ئايرىلمىغان. چىپتىكى يۇقىرى ئۈستۈنكى قاناللار مىكرو ئىنژېنېرلىق ئېپىتېلىينىڭ ئېگىزلىكىنىڭ ئېشىشىغا ئېلىپ كەلگەن بولسىمۇ، ئەڭ يۇقىرى ئېگىزلىك يەنىلا ~300–400 µm بىلەن چەكلىنىدۇ. ئىنچىكە ۋە چوڭ ئۈچەيدىكى ئىنسانلارنىڭ ئۈچەي كرىپتالىرىنىڭ ئەمەلىي چوڭقۇرلۇقى ئايرىم-ئايرىم ھالدا ~135 µm ۋە ~400 µm، ئىنچىكە ئۈچەي ۋىللۇسىنىڭ ئېگىزلىكى ~600 µm41.
رەسىمگە تارتىش نۇقتىسىدىن قارىغاندا، 3D مىكرو ئارخىتېكتۇرانىڭ يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى رەسىمگە تارتىش ئىقتىدارى چىپتىكى ئۈچەي بىلەنلا چەكلىنىشى مۇمكىن، چۈنكى ئوبيېكتىپ لىنزىسىدىن ئېپىتېلىي قەۋىتىگىچە بولغان خىزمەت ئارىلىقى بىر قانچە مىللىمېتىر ئەتراپىدا. بۇ مەسىلىنى ھەل قىلىش ئۈچۈن، يىراق ئوبيېكتىپ تەلەپ قىلىنىشى مۇمكىن. بۇنىڭدىن باشقا، PDMS نىڭ يۇقىرى ئېلاستىكىلىقى سەۋەبىدىن، رەسىم ئەۋرىشكىسى تەييارلاش ئۈچۈن نېپىز بۆلەكلەرنى ياساش قىيىن. ئۇنىڭدىن باشقا، چىپتىكى ئۈچەينىڭ قەۋەت-قەۋەت مىكرو ياسىلىشى ھەر بىر قەۋەتنىڭ مەڭگۈلۈك چاپلىشىشىنى ئۆز ئىچىگە ئالغاچقا، ئېپىتېلىي قەۋىتىنىڭ يۈزەكى قۇرۇلمىسىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن ئۈستۈنكى قەۋەتنى ئېچىش ياكى ئېلىۋېتىش ئىنتايىن قىيىن. مەسىلەن، سىكانىرلاش ئېلېكترونلۇق مىكروسكوپى (SEM) ئارقىلىق.
PDMS نىڭ سۇغا چىدامچانلىقى مىكرو سۇيۇقلۇققا ئاساسلانغان تەتقىقاتلاردا، سۇغا چىدامچان كىچىك مولېكۇلالارغا مۇناسىۋەتلىك چەكلىمە ئامىلى بولۇپ كەلدى، چۈنكى PDMS بۇ خىل سۇغا چىدامچان مولېكۇلالارنى ئالاھىدە ئەمەس ھالدا ئادسوربىلىيەلەيدۇ. PDMS نىڭ ئورنىغا باشقا پولىمېر ماتېرىياللارنى ئىشلىتىشنى ئويلىشىشقا بولىدۇ. يەنە بىر ئۇسۇل، سۇغا چىدامچان مولېكۇلالارنىڭ ئادسوربىلىيەسىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ئۈچۈن PDMS نىڭ يۈزەكى ئۆزگىرىشىنى (مەسىلەن، لىپوفىل ماتېرىياللار 42 ياكى پولى (ئېتىلېن گلىكول) 43 بىلەن قاپلاش) ئويلىشىشقا بولىدۇ.
ئاخىرىدا، بىزنىڭ ئۇسۇلىمىز يۇقىرى ئۈنۈملۈك تەكشۈرۈش ياكى «ھەممىگە ماس كېلىدىغان» ئىشلەتكۈچىگە قۇلايلىق تەجرىبە سۇپىسى بىلەن تەمىنلەش جەھەتتە ياخشى ئىپادىلەنمىدى. ھازىرقى كېلىشىم ھەر بىر مىكرو ئۈسكۈنىگە بىر ئوكۇل پومپىسىنى تەلەپ قىلىدۇ، بۇ CO2 ئىنكۇباتورىدا بوشلۇق ئىگىلەيدۇ ۋە چوڭ كۆلەملىك تەجرىبە ئېلىپ بېرىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ. بۇ چەكلىمىنى يېڭىچە مەدەنىيەت فورماتلىرىنىڭ كېڭەيتىشچانلىقى (مەسىلەن، بازولاتېرال مۇھىتنى ئۈزلۈكسىز تولۇقلاش ۋە چىقىرىۋېتىشكە يول قويىدىغان 24-ئۆڭكۈرلۈك، 96-ئۆڭكۈرلۈك ياكى 384-ئۆڭكۈرلۈك تۆشۈكلۈك قىستۇرمىلار) ئارقىلىق كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ياخشىلىغىلى بولىدۇ.
سىناق نەيچىسىدە ئىنسانلارنىڭ ئۈچەي ئېپىتېلىيسىنىڭ 3D شەكىللىك مورفوگېنېزىنى قوزغىتىش ئۈچۈن، بىز ئىككى پاراللېل مىكرو قانال ۋە ئارىلىقتا ئېلاستىك تۆشۈك پەردىسى بار مىكرو سۇيۇقلۇق چىپلىق ئۈچەي ئۈسكۈنىسىنى ئىشلىتىپ، بوشلۇق-كاپىللار ئارا سىزىق ھاسىل قىلدۇق. بىز يەنە ترانسۋېل قىستۇرمىلىرىدا ئۆستۈرۈلگەن قۇتۇپلاشقان ئېپىتېلىي قەۋەتلىرى ئاستىدا ئۈزلۈكسىز بازولاتېرال ئېقىم بىلەن تەمىنلەيدىغان بىر قاناللىق مىكرو سۇيۇقلۇق ئۈسكۈنىسىنى (گىرىبلىق چىپ) ئىشلىتىشنى كۆرسىتىمىز. ئىككى سۇپا ئىچىدە، ھەر خىل ئىنسانلارنىڭ ئۈچەي ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ شەكىللىنىشىنى ئېقىمنى يۆنىلىشلىك باشقۇرۇش ئارقىلىق بازولاتېرال بۆلەكتىن مورفوگېن ئانتاگونىستلىرىنى چىقىرىۋېتىش ئارقىلىق كۆرسىتىشكە بولىدۇ. پۈتۈن تەجرىبە جەريانى (1-رەسىم) بەش قىسىمدىن تەركىب تاپقان: (i) ئۈچەي چىپى ياكى ترانسۋېل قىستۇرغىلى بولىدىغان گىرىبلىق چىپنى مىكرو ياساش (1-5-قەدەملەر؛ 1-قۇتىسى)، (ii) ئۈچەي ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى (Caco-2 ھۈجەيرىلىرى) ياكى ئىنسان ئۈچەي ئورگانوئىدلىرىنى تەييارلاش؛ 2-5-نومۇرلۇق قۇتا)، (iii) ئۈچەي ئېپىتېلىيە ھۈجەيرىلىرىنى ئۈچەي پارچىلىرى ياكى ئارىلاشما پارچىلارغا يېتىشتۈرۈش (6-9-قەدەملەر)، (iv) سىناق نەيچىسىدە 3D مورفوگېنېزنى قوزغىتىش (10-قەدەم) ۋە (v)) 3D ئېپىتېلىيە مىكرو قۇرۇلمىسىنى خاراكتېرلەندۈرۈش (11-24-قەدەملەر). ئاخىرىدا، ئېپىتېلىيە مورفوگېنېزىنى بوشلۇق، ۋاقىت، شەرتلىك ياكى تەرتىپ كونتروللىرى بىلەن سېلىشتۇرۇش ئارقىلىق سىناق نەيچىسىدە مورفوگېنېزنىڭ ئۈنۈمىنى جەزملەشتۈرۈش ئۈچۈن ماس كېلىدىغان كونترول گۇرۇپپىسى (تۆۋەندە تېخىمۇ كۆپ مۇھاكىمە قىلىنىدۇ) لايىھەلەندى.
بىز ئىككى خىل مەدەنىيەت سۇپىسىنى ئىشلەتتۇق: تۈز قاناللىق ياكى سىزىقسىز ئايلانما قاناللىق ئۈچەي-چىپ، ياكى مىكرو سۇيۇقلۇق ئۈسكۈنىسىدە Transwell (TW) قىستۇرمىسى بار ئارىلاشما چىپلار، 1-قۇتىدا تەسۋىرلەنگەندەك ياسالغان ۋە 1-5-قەدەم. «ئۈسكۈنىنى ياساش» يەككە چىپ ياكى ئارىلاشما چىپ ياساشتىكى ئاساسلىق قەدەملەرنى كۆرسىتىدۇ. «ئىنسان ئۈچەي ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى ئۆستۈرۈش» بۇ كېلىشىمدە ئىشلىتىلگەن ھۈجەيرە مەنبەسى (Caco-2 ياكى ئىنسان ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى) ۋە مەدەنىيەت جەريانىنى چۈشەندۈرىدۇ. «in vitro مورفوگېنېز» Caco-2 ياكى ئورگانوئىدتىن ئېلىنغان ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۈچەي چىپىدا ياكى ئارىلاشما چىپنىڭ Transwell قىستۇرمىسىدا يېتىشتۈرۈلۈشى، ئاندىن 3D مورفوگېنېزنى قوزغىتىش ۋە خاراكتېرلىك ئېپىتېلىي قۇرۇلمىسىنى شەكىللەندۈرۈشنىڭ ئومۇمىي قەدەملىرىنى كۆرسىتىدۇ. پروگرامما قەدەم نومۇرى ياكى قۇتا نومۇرى ھەر بىر ئوقنىڭ ئاستىدا كۆرسىتىلىدۇ. بۇ قوللىنىشچان پروگراممىدا قۇرۇلغان ئۈچەي ئېپىتېلىي قەۋەتلىرىنىڭ قانداق ئىشلىتىلىشىنىڭ مىساللىرى بېرىلگەن، مەسىلەن، ھۈجەيرە پەرقلەندۈرۈش خاراكتېرىنى بېكىتىش، ئۈچەي فىزىئولوگىيىسى تەتقىقاتى، ساھىبخان-مىكروبىئوم ئېكولوگىيە سىستېمىسىنى قۇرۇش ۋە كېسەللىك مودېلى ياساش قاتارلىقلاردا. «ھۈجەيرە» دىكى ئىممۇنوفلۇئورېسسېنسىيە رەسىملىرى. «پەرقلەندۈرۈش» ناملىق رەسىمدە ئۈچەي چىپىدا ھاسىل بولغان 3D Caco-2 ئېپىتېلىي قەۋىتىدە ئىپادىلەنگەن يادرو، F-ئاكتىن ۋە MUC2 كۆرسىتىلگەن. MUC2 سىگنالى قەدەھ ھۈجەيرىلىرىدە ۋە شىلىمشىق پەردە يۈزىدىن ئاجرىلىپ چىققان شىلىمشىق پەردىلەردە مەۋجۇت. «ئۈچەي فىزىئولوگىيەسى»دىكى فلۇئورېسسېنسىيەلىك رەسىملەردە فلۇئورېسسېنسىيەلىك بۇغداي ئۇرۇقى ئاگلۇتىنىن ئارقىلىق سىئالىك كىسلاتاسى ۋە N-ئاتسېتىلگلۇكوزامىن قالدۇقلىرىغا بوياش ئارقىلىق ھاسىل بولغان شىلىمشىق پەردىلەر كۆرسىتىلگەن. «ساھىبجامال-مىكروب بىرلىكتە يېتىشتۈرۈش»تىكى ئىككى قاپلانغان رەسىمدە ئۈچەيدىكى ۋەكىللىك ساھىبجامال-مىكروبيوم بىرلىكتە يېتىشتۈرۈشلىرى كۆرسىتىلگەن. سول تەرەپتىكى تاختىدا يېشىل فلۇئورېسسېنسىيەلىك ئاقسىل (GFP) نى ئىپادىلەيدىغان E. coli نىڭ مىكرو ئىنژېنېرلىق 3D Caco-2 ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرى بىلەن بىرلىكتە يېتىشتۈرۈلگەنلىكى كۆرسىتىلگەن. ئوڭ تەرەپتىكى تاختىدا 3D Caco-2 ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرى بىلەن بىرلىكتە يېتىشتۈرۈلگەن GFP E. coli نىڭ ئورنى، ئاندىن F-ئاكتىن (قىزىل) ۋە يادرو (كۆك) بىلەن ئىممۇنىتېت فلۇئورېسسېنسىيەلىك بوياش كۆرسىتىلگەن. كېسەللىك مودېلى باكتېرىيە ئانتىگېنلىرى (مەسىلەن، لىپوپولىساخارىد، ...) بىلەن فىزىئولوگىيىلىك خىرىس ئاستىدا ئۈچەي ياللۇغى چىپلىرىدىكى ساغلام ۋە ئېقىشچان ئۈچەينى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. LPS) ۋە ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرى (مەسىلەن، PBMC؛ يېشىل). Caco-2 ھۈجەيرىلىرى 3D ئېپىتېلىي قەۋىتىنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن يېتىشتۈرۈلدى. كۆلەم بالداق، 50 µm. ئاستىنقى قۇردىكى رەسىملەر: «ھۈجەيرىلەرنىڭ پەرقلىنىشى» پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت ئېلىپ ئۆزگەرتىلدى. 2. ئوكسفورد ئۇنىۋېرسىتېتى نەشرىياتى؛ 5- پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت ئېلىپ كۆپەيتىلدى. NAS؛ «ساھىبجامال-مىكروب بىرلىكتە يېتىشتۈرۈش» 3- پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت ئېلىپ ئۆزگەرتىلدى. NAS؛ «كېسەللىك مودېلى» پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت ئېلىپ ئۆزگەرتىلدى. 5. NAS.
چىپتىكى چىپ ۋە ئارىلاشما چىپلارنىڭ ھەر ئىككىسى سىلىتسىي قېلىپلىرىدىن يۇمشاق لىتوگرافىيە ئارقىلىق چېقىپ ئېلىنغان ۋە SU-8 بىلەن نەقىشلەنگەن PDMS كۆچۈرمىلىرى ئارقىلىق ياسالغان. ھەر بىر چىپتىكى مىكرو قاناللارنىڭ لايىھىسى قىرقىش بېسىمى ۋە گىدرودىنامىك بېسىم قاتارلىق گىدرودىنامىكىنى ئويلىشىش ئارقىلىق بېكىتىلىدۇ1،4،12. ئىككى يانغا قويۇلغان پاراللېل تۈز مىكرو قانالدىن تەركىب تاپقان دەسلەپكى چىپتىكى چىپ لايىھىسى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات رەسىم 1a) مۇرەككەپ چىپتىكى چىپقا (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات رەسىم 1b) تەرەققىي قىلىپ، سۇيۇقلۇقنىڭ تۇرۇش ۋاقتىنىڭ ئېشىشى، سىزىقسىز ئېقىم شەكلى ۋە يېتىشتۈرۈلگەن ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپ ئوقلۇق دېفورماسىيەسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان بىر جۈپ ئەگرى مىكرو قانالنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (رەسىم 2a-f). تېخىمۇ مۇرەككەپ ئۈچەي بىئومېخانىكىسىنى قايتا ياساشقا توغرا كەلگەندە، مۇرەككەپ ئۈچەيدىكى چىپلارنى تاللىغىلى بولىدۇ. بىز چىپتىكى چىپنىڭ ئوخشاش ۋاقىت ئىچىدە 3D مورفوگېنېزىنى كۈچلۈك قوزغىتىدىغانلىقىنى، ئەسلى بىلەن سېلىشتۇرغاندا ئېپىتېلىي ئۆسۈش دەرىجىسىنىڭ ئوخشاش ئىكەنلىكىنى ئىسپاتلىدۇق. گۈمبەز-چىپ، يېتىشتۈرۈلگەن ھۈجەيرە تىپىغا قارىماي. شۇڭا، 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى قوزغىتىش ئۈچۈن، سىزىقلىق ۋە مۇرەككەپ چىپ ئۈستىدىكى گۈمبەز لايىھەلىرى ئالماشتۇرغىلى بولىدۇ. SU-8 شەكلىدىكى كرېمنىي قېلىپلىرىدا ساقلانغان PDMS كۆچۈرمىلىرى پارچىلانغاندىن كېيىن سەلبىي ئالاھىدىلىكلەرنى كۆرسەتتى (2a-رەسىم). چىپ ئۈستىدە گۈمبەز ياساش ئۈچۈن، تەييارلانغان ئۈستۈنكى PDMS قەۋىتى ئارقا-ئارقىدىن تۆشۈكلۈك PDMS پىلاستىنكىسىغا چاپلىنىپ، ئاندىن تاج بىر تەرەپ قىلغۇچ ئارقىلىق قايتۇرغىلى بولمايدىغان باغلىنىش ئارقىلىق ئاستىنقى PDMS قەۋىتى بىلەن ماسلاشتۇرۇلدى (2b-f-رەسىم). ئارىلاشما چىپ ياساش ئۈچۈن، ساقلانغان PDMS كۆچۈرمىلىرى ئەينەك سىيرىلمىلىرىغا چاپلىنىپ، Transwell قىستۇرمىلىرىنى سىغدۇرالايدىغان يەككە قاناللىق مىكرو سۇيۇقلۇق ئۈسكۈنىلىرى ياسالدى (2h-رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات 2-رەسىم). باغلىنىش جەريانى PDMS كۆچۈرمىسى ۋە ئەينەكنىڭ يۈزىنى ئوكسىگېن پلازمىسى ياكى تاج بىر تەرەپ قىلىش ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلىدۇ. كرېمنىي تۇرۇبىسىغا چاپلانغان مىكرو ياسىمىچىلىق ئۈسكۈنىسى ستېرىللانغاندىن كېيىن، ئۈسكۈنە قۇرۇلمىسى ئۈچەي ئېپىتېلىيىنىڭ 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى ئېلىپ بېرىشقا تەييار بولدى (2g-رەسىم).
a، SU-8 نەقىشلىك كرېمنىي قېلىپلىرىدىن PDMS زاپچاسلىرىنى تەييارلاشنىڭ سىخېما رەسىمى. قېتىلمىغان PDMS ئېرىتمىسى كرېمنىي قېلىپىغا قۇيۇلدى (سولدا)، 60 سېلسىيە گرادۇستا قېتىلدى (ئوتتۇرىدا) ۋە پارچىلاندى (ئوڭدا). پارچىلانغان PDMS پارچىلارغا بۆلۈنۈپ، كېيىنكى ئىشلىتىش ئۈچۈن تازىلاندى. b، PDMS ئۈستۈنكى قەۋىتىنى تەييارلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن كرېمنىي قېلىپىنىڭ سۈرىتى. c، PDMS تۆشۈكلۈك پەردىسىنى ياساش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن كرېمنىي قېلىپىنىڭ سۈرىتى. d، ئۈستۈنكى ۋە ئاستىنقى PDMS زاپچاسلىرى ۋە يىغىلغان چىپ ئۈستىدىكى ئۈچەي ئۈسكۈنىسىنىڭ بىر يۈرۈش سۈرىتى. e، ئۈستۈنكى، پەردە ۋە ئاستىنقى PDMS زاپچاسلىرىنىڭ ماسلىشىش سىخېمىسى. ھەر بىر قەۋەت پلازما ياكى كورونا بىر تەرەپ قىلىش ئارقىلىق قايتۇرۇلماس باغلىنىدۇ. f، ئۈستى-ئۈستىگە ئىگىلگەن مىكرو قاناللار ۋە ۋاكۇئۇم كامېراسى قوشۇلغان ياسالغان ئۈچەي ئۈستىدىكى ئۈچەي ئۈسكۈنىسىنىڭ سىخېما رەسىمى. g، مىكرو سۇيۇقلۇق ھۈجەيرە يېتىشتۈرۈش ئۈچۈن ئۈچەي ئۈستىدىكى ئۈچەينى تەڭشەش. سىلىكون تۇرۇبىسى ۋە ئوكۇل بىلەن يىغىلغان چىپ ئۈستىدىكى ياسالغان ئۈچەي قاپاققا قويۇلدى. چىپ ئۈسكۈنىسى قاپاققا قويۇلدى. بىر تەرەپ قىلىش ئۈچۈن 150 مىللىمېتىرلىق پېترى قاچىسى. باغلىغۇچ سىلىكون تۇرۇبىسىنى يېپىشقا ئىشلىتىلىدۇ. h، ئارىلاشما چىپ ياساش ۋە ئارىلاشما چىپلارنى ئىشلىتىپ 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنىڭ كۆرۈنۈشلۈك سۈرەتلىرى. ئۈچەي ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ 2D مونوقەۋەتلىرىنى يېتىشتۈرۈش ئۈچۈن مۇستەقىل تەييارلانغان ترانسۋېل قىستۇرمىلىرى ئۈچەينىڭ 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى قوزغىتىش ئۈچۈن ئارىلاشما چىپقا كىرگۈزۈلدى. بۇ ئوتتۇرا ماددا ترانسۋېل قىستۇرمىسىغا ئورنىتىلغان ھۈجەيرە قەۋىتىنىڭ ئاستىدىكى مىكرو قاناللار ئارقىلىق پېرفۇزىيە قىلىنىدۇ. كۆلەم بالداق، 1 سانتىمېتىر. h پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت ئېلىپ قايتا بېسىلدى. 4. Elsevier.
بۇ پروتوكولدا، Caco-2 ھۈجەيرە لىنىيىسى ۋە ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى ئېپىتېلىي مەنبەسى سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن (3a-رەسىم). ھەر ئىككى خىل ھۈجەيرە مۇستەقىل ھالدا يېتىشتۈرۈلگەن (2-قۇتا ۋە 5-قۇتا) ۋە چىپ ئۈستىدىكى ئۈچەي ياكى ترانسۋېل قىستۇرمىلىرىنىڭ ECM بىلەن قاپلانغان مىكرو قاناللىرىنى ئۇرۇقلاندۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن. ھۈجەيرىلەر بىر يەرگە جەم بولغاندا (ئىسكىلاتلاردا قاپلاش نىسبىتى >95%)، T-ئىسكىلاتلىرىدىكى دائىم يېتىشتۈرۈلگەن Caco-2 ھۈجەيرىلىرى (10- ۋە 50- يوللار ئارىلىقىدا) تىرىپسىنىزاتسىيە سۇيۇقلۇقى ئارقىلىق پارچىلانغان ھۈجەيرە سۇسپېنزىيەسىنى تەييارلاش ئۈچۈن يىغىۋېلىنىدۇ (2-قۇتا). ئۈچەي بىئوپسىيەسى ياكى جىددىي كېسىش ئوپېراتسىيەسىدىن ئېلىنغان ئىنسان ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى قۇرۇلما مىكرو مۇھىتىنى قوللاش ئۈچۈن 24 ئۆڭكۈرلۈك تاختايلاردىكى Matrigel ئىسكىلات گۈمبەزلىرىدە يېتىشتۈرۈلگەن. 3-قۇتادا تەسۋىرلەنگەندەك تەييارلانغان مۇھىم مورفوگېنلار (مەسىلەن، Wnt، R-spondin ۋە Noggin) ۋە ئۆسۈش ئامىللىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان مۇھىت، ئورگانوئىدلارنىڭ دىئامېتىرى ~500 µm غا چوڭ بولغۇچە ھەر ئىككى كۈندە تولۇقلانغان. تولۇق يېتىلگەن ئورگانوئىدلار يىغىۋېلىنىدۇ ۋە پارچىلىنىدۇ. ئۈچەي ياكى ترانسۋېل قىستۇرمىلىرىغا چىپ ئارقىلىق ئۇرۇق سېلىش ئۈچۈن يەككە ھۈجەيرىلەرگە ئايلاندۇرۇلىدۇ (5-قۇتىسى). ئىلگىرى خەۋەر قىلغىنىمىزدەك، ئۇنى كېسەللىك تىپى 12،13 (مەسىلەن، يارا خاراكتېرلىك كولىت، كرون كېسىلى، تۈز ئۈچەي راكى ياكى نورمال بەرگۈچى)، زەخمە ئورنى (مەسىلەن، زەخمە ياكى زەخمە بولمىغان رايون) ۋە ئاشقازان-ئۈچەي يولىدىكى ئاشقازان-ئۈچەي ئورنى (مەسىلەن، ئون ئىككى بارماق ئۈچەي، ئاچ ئۈچەي، ئىلېئۇم، سوقۇر ئۈچەي، چوڭ ئۈچەي ياكى تۈز ئۈچەي) گە ئاساسەن پەرقلەندۈرگىلى بولىدۇ. بىز 5-قۇتىدا ئادەتتە ئىنچىكە ئۈچەي ئورگانوئىدلىرىغا قارىغاندا يۇقىرى قويۇقلۇقتىكى مورفوگېنلارنى تەلەپ قىلىدىغان چوڭ ئۈچەي ئورگانوئىدلىرىنى (كولوئىدلارنى) يېتىشتۈرۈش ئۈچۈن ئەلالاشتۇرۇلغان بىر كېلىشىم بىلەن تەمىنلەيمىز.
a، ئۈچەي چىپىدا ئۈچەي شەكىللىنىشىنى قوزغىتىش ئۈچۈن خىزمەت ئېقىمى. بۇ كېلىشىمدە Caco-2 ئىنسان ئۈچەي ئېپىتېلىيى ۋە ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى 3D شەكىللىنىشىنى كۆرسىتىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. ئايرىم ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرى تەييارلانغان ئۈچەي-چىپ ئۈسكۈنىسىگە (چىپ تەييارلاش) ئۇرۇقلاندۇرۇلىدۇ. 0-كۈنى (D0) ھۈجەيرىلەر ئۇرۇقلاندۇرۇلۇپ (ئۇرۇقلاندۇرۇلۇپ) PDMS تۆشۈك پەردىسىگە ئۇلانغاندىن كېيىن، ئۇچلۇق (AP) ئېقىمى باشلىنىدۇ ۋە دەسلەپكى 2 كۈن ساقلىنىدۇ (ئېقىم، AP، D0-D2). تولۇق 2D مونو قەۋەت شەكىللەنگەندە، بازولاتېرال (BL) ئېقىمى دەۋرىي سوزۇلۇش ھەرىكەتلىرى (سوزۇلۇش، ئېقىم، AP ۋە BL) بىلەن بىرلىكتە باشلىنىدۇ. ئۈچەينىڭ 3D شەكىللىنىشى مىكرو سۇيۇقلۇق يېتىشتۈرۈشتىن 5 كۈن كېيىن ئۆزلۈكىدىن يۈز بېرىدۇ (مورفوگېنېز، D5). باسقۇچلۇق سېلىشتۇرما رەسىملەر Caco-2 ھۈجەيرىلىرىنىڭ ھەر بىر تەجرىبە باسقۇچى ياكى ۋاقىت نۇقتىسىدىكى ۋەكىللىك شەكىللىنىشىنى كۆرسىتىدۇ (ستول گىرافىكى، 100 µm). ئۈچەي شەكىللىنىشىنىڭ ماس كېلىدىغان كاسساتلىرىنى كۆرسىتىدىغان تۆت خىل سىخېما دىئاگراممىسى (ئۈستىدىكى ئوڭ). سىخېمادىكى سىزىقلىق كۆرسەتكۈچلەر سۇيۇقلۇق ئېقىمىنىڭ يۆنىلىشىنى كۆرسىتىدۇ.b، SEM رەسىمى قۇرۇلغان 3D Caco-2 ئېپىتېلىيىنىڭ يۈزەكى توپولوگىيەسىنى كۆرسىتىدۇ (سول تەرەپ). چوڭايتىلغان رايوننى گەۋدىلەندۈرىدىغان قىستۇرما رەسىم (ئاق سىزىقلىق رامكا) 3D Caco-2 قەۋىتىدىكى قايتا ھاسىل بولغان مىكرو ھۈجەيرىلەرنى كۆرسىتىدۇ (ئوڭ تەرەپ).c، قۇرۇلغان Caco-2 3D، كلاۋدىن (ZO-1، قىزىل) ۋە F-ئاكتىن (يېشىل) ۋە يادروسى (كۆك) دەپ بەلگە قويۇلغان ئۈزلۈكسىز چوتكا چېگرا پەردىلىرىنىڭ گورىزونتال ئالدى كۆرۈنۈشى. ئۈچەي پارچىلىرىدىكى ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئىممۇنوفلۇئورېسسېنسىيە كونفوكال كۆرۈنۈشى. ئوتتۇرىدىكى سىخېماغا قارىتىلغان كۆرسەتكۈچلەر ھەر بىر كونفوكال كۆرۈنۈشنىڭ مەركىزى تۈزلەڭلىكىنىڭ ئورنىنى كۆرسىتىدۇ.d، 3، 7، 9، 11 ۋە 13-كۈنلەردە باسقۇچلۇق كونتراستلىق مىكروسكوپ ئارقىلىق قولغا كەلتۈرۈلگەن چىپتا يېتىشتۈرۈلگەن ئورگانوئىدلارنىڭ مورفولوگىيىلىك ئۆزگىرىشلىرىنىڭ ۋاقىت جەريانى. قىستۇرما رەسىم (ئۈستۈنكى ئوڭ تەرەپ) بېرىلگەن رەسىمنىڭ يۇقىرى چوڭايتىلىشىنى كۆرسىتىدۇ.e، 7-كۈنى تارتىلغان پارچىدا ئۈچەيدە قۇرۇلغان ئورگانوئىد 3D ئېپىتېلىيىنىڭ DIC مىكروسكوپىيەسى.f، ئۈچەي پارچىلىرىدا 3 كۈن (سول تەرەپ) ۋە 13 كۈنلۈك (ئوتتۇرا تەرەپ) ئېپىتېلىي قەۋىتىدە ئۆستۈرۈلگەن ئۆزەك ھۈجەيرىلىرى (LGR5؛ قىزىل رەڭ)، قەدەھ ھۈجەيرىلىرى (MUC2؛ يېشىل)، F-ئاكتىن (كۈلرەڭ) ۋە يادروسى (كۆك رەڭ) نىڭ بەلگىلىرىنى كۆرسىتىدىغان ئۈستى قاپلانغان ئىممۇنوفلۇئورېسسېنسىيە رەسىملىرى. شۇنداقلا كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات رەسىمى 3 گە قاراڭ، بۇ رەسىمدە MUC2 سىگنالىسىز LGR5 سىگنالى گەۋدىلەندۈرۈلگەن. فلۇئورېسسېنسىيە رەسىملىرى، 13-كۈنى CellMask بوياق بىلەن (ئوڭ تەرەپ) پلازما پەردىسىنى بوياش ئارقىلىق ئۈچەيدە شەكىللەنگەن 3D ئورگانوئىد ئېپىتېلىيىنىڭ ئېپىتېلىي مىكرو قۇرۇلمىسىنى (ئوڭ تەرەپ) كۆرسىتىدۇ. باشقىچە بەلگىلىمە بولمىسا، كۆلەم بالداقچىسى 50 μm.b پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت بىلەن قايتا بېسىلدى.2. ئوكسفورد ئۇنىۋېرسىتېتى نەشرىياتى؛ c پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت بىلەن ئۆزگەرتىلدى.2. ئوكسفورد ئۇنىۋېرسىتېتى نەشرىياتى؛ e ۋە f پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت بىلەن ئۆزگەرتىلدى.12 Creative Commons ئىجازەتنامىسى CC BY 4.0 ئاستىدا.
چىپتىكى ئۈچەيدە، ECM قاپلاشنى مۇۋەپپەقىيەتلىك قىلىش ئۈچۈن PDMS تۆشۈكلۈك پەردىسىنىڭ سۇدىن قورقۇپ قالغان يۈزىنى ئۆزگەرتىش كېرەك. بۇ كېلىشىمدە، بىز PDMS پەردىلىرىنىڭ سۇدىن قورقۇپ قالغانلىقىنى ئۆزگەرتىش ئۈچۈن ئىككى خىل ئۇسۇل قوللىنىمىز. Caco-2 ھۈجەيرىلىرىنى يېتىشتۈرۈش ئۈچۈن، پەقەت UV/ئوزون بىر تەرەپ قىلىش ئارقىلىق يۈزە ئاكتىپلاشتۇرۇش PDMS يۈزىنىڭ سۇدىن قورقۇپ قالغانلىقىنى ئازايتىش، ECM نى قاپلاش ۋە Caco-2 ھۈجەيرىلىرىنى PDMS پەردىسىگە چاپلاش ئۈچۈن يېتەرلىك بولدى. قانداقلا بولمىسۇن، ئورگانوئىد ئېپىتېلىيىنىڭ مىكرو سۇيۇقلۇق يېتىشتۈرۈشى خىمىيىلىك ئاساستىكى يۈزە فۇنكسىيەسىنى تەلەپ قىلىدۇ، بۇ ئارقىلىق ECM ئاقسىللىرىنى PDMS مىكرو قاناللىرىغا ئارقا-ئارقىدىن پولىئېتىلېنىمىن (PEI) ۋە گلۇتارالدېھىد ئىشلىتىش ئارقىلىق ئۈنۈملۈك چۆكتۈرۈشكە ئېرىشكىلى بولىدۇ. يۈزە ئۆزگەرتىلگەندىن كېيىن، ECM ئاقسىللىرى فۇنكسىيەلەشتۈرۈلگەن PDMS يۈزىنى قاپلاش ئۈچۈن چۆكتۈرۈلىدۇ ۋە ئاندىن ئايرىم ئورگانوئىد ئېپىتېلىيىغا كىرگۈزۈلىدۇ. ھۈجەيرىلەر چاپلانغاندىن كېيىن، مىكرو سۇيۇقلۇق ھۈجەيرە يېتىشتۈرۈشى پەقەت ئوتتۇراھالنى ئۈستۈنكى مىكرو قانالغا كىرگۈزۈشتىن باشلىنىدۇ، ھۈجەيرىلەر تولۇق بىر قەۋەت ھاسىل قىلغۇچە، تۆۋەنكى مىكرو قانال بولسا ستاتىك شارائىتنى ساقلايدۇ. يۈزە ئاكتىپلاشتۇرۇش ۋە ECM قاپلاش ئۈچۈن بۇ ئەلالاشتۇرۇلغان ئۇسۇل ئورگانوئىد ئېپىتېلىيىنىڭ چاپلىنىشىنى قوزغىتىشقا شارائىت ھازىرلايدۇ. PDMS يۈزىدىكى 3D مورفوگېنېزى.
Transwell مەدەنىيىتى ھۈجەيرە ئۇرۇقىنى تىكىشتىن بۇرۇن ECM قاپلاشنى تەلەپ قىلىدۇ؛ قانداقلا بولمىسۇن، Transwell مەدەنىيىتى تۆشۈكلۈك قىستۇرمىلارنىڭ يۈزىنى ئاكتىپلاشتۇرۇش ئۈچۈن مۇرەككەپ ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش باسقۇچلىرىنى تەلەپ قىلمايدۇ. Transwell قىستۇرمىلىرىدا Caco-2 ھۈجەيرىلىرىنى ئۆستۈرۈش ئۈچۈن، تۆشۈكلۈك قىستۇرمىلارغا ECM قاپلاش پارچىلىنىپ كەتكەن Caco-2 ھۈجەيرىلىرىنىڭ چاپلىشىشىنى (<1 سائەت) ۋە زىچ تۇتاشتۇرۇش توسۇقىنىڭ شەكىللىنىشىنى (<1-2 كۈن) تېزلىتىدۇ. Transwell قىستۇرمىلىرىدا ئورگانوئىدلارنى يېتىشتۈرۈش ئۈچۈن، ئايرىم ئورگانوئىدلار ECM قاپلانغان قىستۇرمىلارغا ئۇرۇقلىنىپ، پەردە يۈزىگە چاپلىنىدۇ (<3 سائەت) ۋە ئورگانوئىدلار توسۇق پۈتۈنلۈكىگە ئىگە تولۇق بىر قەۋەت ھاسىل بولغۇچە ساقلىنىدۇ. Transwell مەدەنىيىتى گىبرىد چىپسى ئىشلەتمەي 24 ئۆڭكۈرلۈك تاختايلاردا ئېلىپ بېرىلىدۇ.
سىناق نەيچىسىدە 3D مورفوگېنېزنى سۇيۇقلۇق ئېقىمىنى ئورنىتىلغان ئېپىتېلىي قەۋىتىنىڭ بازولاتېرال تەرىپىگە قوللىنىش ئارقىلىق باشلىغىلى بولىدۇ. چىپتىكى ئۈچەيدە، ئېپىتېلىي مورفوگېنېزى ئوتتۇراھال ئۈستۈنكى ۋە ئاستىنقى مىكرو قاناللارغا كىرگۈزۈلگەندە باشلىنىدۇ (3a-رەسىم). ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك، يۆنىلىشلىك ئاجرىتىلغان مورفوگېن چەكلىگۈچىلىرىنى ئۈزلۈكسىز چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن ئاستىنقى (بازولاتېرال) بۆلەككە سۇيۇقلۇق ئېقىمىنى كىرگۈزۈش ناھايىتى مۇھىم. تۆشۈكلۈك پەردىلەرگە باغلانغان ھۈجەيرىلەرگە يېتەرلىك ئوزۇقلۇق ۋە قان زەردابى بىلەن تەمىنلەش ۋە لۇمىنال قىرقىش بېسىمىنى پەيدا قىلىش ئۈچۈن، بىز ئادەتتە چىپتىكى ئۈچەيدە قوش ئېقىمنى قوللىنىمىز. ئارىلاش چىپلاردا، ئېپىتېلىي مونو قەۋەتلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ترانسۋېل قىستۇرمىلىرى ئارىلاش چىپلارغا كىرگۈزۈلدى. ئاندىن، ئوتتۇراھال مىكرو قانال ئارقىلىق تۆشۈكلۈك ترانسۋېل قىستۇرمىسىنىڭ بازولاتېرال تەرىپىنىڭ ئاستىغا قوللىنىلدى. ئۈچەي مورفوگېنېزى ئىككى مەدەنىيەت سۇپىسىدا بازولاتېرال ئېقىم باشلانغاندىن 3-5 كۈن كېيىن يۈز بەردى.
مىكرو ئىنژېنېرلىق 3D ئېپىتېلىي قەۋەتلىرىنىڭ مورفولوگىيىلىك ئالاھىدىلىكلىرىنى ھەر خىل سۈرەتكە تارتىش ئۇسۇللىرىنى، مەسىلەن، باسقۇچلۇق كونتراست مىكروسكوپ، دىففېرېنسىئال ئارىلىشىش كونتراست (DIC) مىكروسكوپ، SEM ياكى ئىممۇنوفلۇئورېسسېنسىيە كونفوكال مىكروسكوپىيەسى (3- ۋە 4- رەسىملەر) ئارقىلىق تەھلىل قىلغىلى بولىدۇ. باسقۇچلۇق كونتراست ياكى DIC سۈرەتكە تارتىش ئارقىلىق 3D ئېپىتېلىي قەۋەتلىرىنىڭ شەكلى ۋە چىقىپ تۇرۇشىنى نازارەت قىلغىلى بولىدۇ. PDMS ۋە پولىئېستېر پىلاستىنكىلىرىنىڭ ئوپتىكىلىق سۈزۈكلۈكى سەۋەبىدىن، چىپ ئۈستىدىكى ئىچكى ۋە ئارىلاش چىپ سۇپىلىرىنىڭ ھەر ئىككىسى ئۈسكۈنىنى بۆلەككە ئايرىش ياكى پارچىلاشقا ئېھتىياجلىق بولماستىن، ھەقىقىي ۋاقىتلىق سۈرەتكە تارتىش ئىقتىدارىغا ئىگە. ئىممۇنوفلۇئورېسسېنسىيە سۈرەتكە تارتىش جەريانىدا (1-، 3c، f ۋە 4b، c- رەسىملەر)، ھۈجەيرىلەر ئادەتتە %4 (wt/vol) پارافورمالدېھىد (PFA) بىلەن، ئاندىن Triton X-100 ۋە %2 (wt/vol)) كالا قان زەردابى ئالبۇمىنى (BSA) بىلەن تەرتىپ بويىچە بېكىتىلىدۇ. ھۈجەيرە تىپىغا ئاساسەن، ھەر خىل مۇقىملاشتۇرغۇچلار، ئۆتكۈزۈشچان ماددىلار ۋە توسۇش دورىلىرى قوللىنىلىشى مۇمكىن. ئىشلىتىلگەن. نەسەبكە تايىنىدىغان ھۈجەيرە ياكى رايون بەلگىلىرىنى نىشان قىلغان دەسلەپكى ئانتىتېلا چىپتىكى ئورنىدا ھەرىكەتسىزلەنگەن ھۈجەيرىلەرنى گەۋدىلەندۈرۈش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ، ئۇنىڭدىن كېيىن يادرو (مەسىلەن، 4′,6-دىئامىدىنو-2-فېنىلېن) ئىندول، DAPI) ياكى F-ئاكتىن (مەسىلەن، فلورېسسېنسىيەلىك بەلگە قويۇلغان فاللوئىدىن) نى نىشان قىلغان قارشى رەڭ بىلەن بىللە ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا ئىشلىتىلىدۇ. فلورېسسېنسىيە ئاساسلىق جانلىق رەسىملەرنى كۆرۈش ئارقىلىق شىلىمشىق ھاسىل قىلىشنى (1-رەسىم، «ھۈجەيرە پەرقلەندۈرۈش» ۋە «ئۈچەي فىزىئولوگىيىسى»)، مىكروب ھۈجەيرىلىرىنىڭ تاسادىپىي كولونىيەلىشىشىنى (1-رەسىم، «ساھىبجامال-مىكروب بىرلىكتە يېتىشتۈرۈش»)، ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرىنىڭ قوبۇل قىلىنىشىنى (1-رەسىم، «كېسەللىك مودېلى») ياكى 3D ئېپىتېلىي مورفولوگىيەسىنىڭ شەكلىنى (3c,f ۋە 4b,c) بايقاشقا بولىدۇ. چىپتىكى ئۈچەينى ئۆزگەرتىش ئارقىلىق ئۈستۈنكى قەۋەتنى ئاستىنقى مىكرو قانال قەۋىتىدىن ئايرىغاندا، پايدىلىنىش ماتېرىيالىدا تەسۋىرلەنگەندەك. 2-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك، 3D ئېپىتېلىي مورفولوگىيەسى ۋە ئۇچلۇق چوتكا چېگرىسىدىكى مىكرو ھۈجەيرىلەر. SEM ئارقىلىق كۆرۈنۈشكە بولىدۇ (3b-رەسىم). پەرقلەندۈرۈش بەلگىلىرىنىڭ ئىپادىلىنىشىنى مىقدارلىق PCR5 ياكى يەككە ھۈجەيرىلىك RNA تەرتىپلەش ئارقىلىق باھالىغىلى بولىدۇ. بۇ خىل ئەھۋالدا، ئۈچەي پارچىلىرى ياكى ئارىلاشما پارچىلاردا ئۆستۈرۈلگەن ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ 3D قەۋىتى تىرىپسىنىزلاش ئارقىلىق يىغىۋېلىنىدۇ ۋە ئاندىن مولېكۇلا ياكى گېن ئانالىزى ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.
a، گىبرىد چىپتا ئۈچەي شەكىل ئۆزگىرىشىنى قوزغىتىش ئۈچۈن خىزمەت ئېقىمى. بۇ كېلىشىمدە Caco-2 ۋە ئۈچەي ئورگانوئىدلىرى گىبرىد چىپ سۇپىسىدا 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى كۆرسىتىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. ئايرىلغان ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرى تەييارلانغان Transwell قىستۇرمىلىرىغا ئۇرۇقلاندۇرۇلدى (TW تەييارلىقى؛ تۆۋەندىكى رەسىمگە قاراڭ). Transwell قىستۇرمىلىرىدا ھۈجەيرىلەر ئۇرۇقلاندۇرۇلۇپ (ئۇرۇقلاندۇرۇلۇپ) پولىئېستېر پەردىسىگە چاپلانغاندىن كېيىن، بارلىق ھۈجەيرىلەر ستاتىك شارائىتتا يېتىشتۈرۈلدى (TW يېتىشتۈرۈلدى). 7 كۈندىن كېيىن، 2D مونو قەۋەتلىك ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان يەككە Transwell قىستۇرمىسى گىبرىد چىپقا بىرلەشتۈرۈلۈپ، بازولاتېرال ئېقىم (Flow, BL) كىرگۈزۈلدى، بۇ ئاخىرىدا 3D ئېپىتېلىي قەۋىتىنىڭ ھاسىل بولۇشىغا ئېلىپ كەلدى (مورفوگېنېز). ھەر بىر تەجرىبە باسقۇچى ياكى ۋاقىت نۇقتىسىدا نورمال بەرگۈچىدىن (C103 سىزىقى) ئۆرلەۋاتقان چوڭ ئۈچەيدىن ئېلىنغان ئىنسان ئەزا ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ مورفولوگىيەلىك ئالاھىدىلىكلىرىنى كۆرسىتىدىغان باسقۇچلۇق كونتراست مىكروگرافىيەلەر. ئۈستۈنكى قەۋەتلەردىكى سىخېما ھەر بىر باسقۇچنىڭ تەجرىبە قۇرۇلمىسىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. b، گىبرىد چىپلىرى (سول تەرەپتىكى سىخېما) ئورگانوئىد ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ 3D شەكىل ئۆزگىرىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىپ، ھەر خىل Z دا يۇقىرىدىن تۆۋەنگە قاراپ كونفوكال مىكروسكوپ كۆرۈنۈشلىرىنى ئېلىپ كېلىدۇ. ئورنى (ئۈستۈنكى، ئوتتۇرا ۋە ئاستىنقى؛ ئوڭ تەرەپتىكى سىخېما ۋە ئۇنىڭغا ماس كېلىدىغان نۇقتىلىق سىزىقلارغا قاراڭ). روشەن مورفولوگىيەلىك ئالاھىدىلىكلەرنى كۆرسەتتى. F-ئاكتىن (كۆك رەڭ)، يادرو (كۈلرەڭ).c، ئورگانوئىدتىن ئېلىنغان ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە كونفوكال مىكروگرافىيەلىرى (3D بۇلۇڭلۇق كۆرۈنۈش) ستاتىك ترانسۋېلدا (TW؛ ئاق رەڭلىك سىزىقلىق قۇتىغا قىستۇرما رەسىم) يېتىشتۈرۈلگەن ۋە ئارىلاشما چىپ (ئەڭ چوڭ تولۇق سۈرەت) بىلەن 2D ۋە 3D مورفولوگىيەسىنى سېلىشتۇرغان. بىر جۈپ 2D تىك كېسىشمە كۆرۈنۈشلەر (ئۈستۈنكى ئوڭ بۇلۇڭغا قىستۇرما رەسىم؛ «XZ») مۇ 2D ۋە 3D ئالاھىدىلىكلىرىنى كۆرسىتىدۇ. كۆلەم بالداق، 100 µm.c پايدىلىنىش ماتېرىيالىدىن رۇخسەت ئېلىپ قايتا بېسىلدى.4. Elsevier.
كونترول ھۈجەيرىلىرىنى (Caco-2 ياكى ئۈچەي ئورگانوئىد ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرى) ئادەتتىكى ستاتىك يېتىشتۈرۈش شارائىتى ئاستىدا ئىككى ئۆلچەملىك مونو قەۋەتكە يېتىشتۈرۈش ئارقىلىق تەييارلىغىلى بولىدۇ. ئالاھىدە تەكىتلەپ ئۆتۈشكە تېگىشلىكى، مىكرو قاناللارنىڭ چەكلىك ھەجىم سىغىمى سەۋەبىدىن ئوزۇقلۇق مىقدارىنىڭ ئازىيىشى مۇمكىن (يەنى دەسلەپكى ئۈچەي چىپى لايىھىسىدىكى ئۈستۈنكى قانالدا ~4 µL). شۇڭا، بازولاتېرال ئېقىمنى قوللىنىشتىن بۇرۇنقى ۋە كېيىنكى ئېپىتېلىي مورفولوگىيەسىنى سېلىشتۇرغىلى بولىدۇ.
يۇمشاق لىتوگرافىيە جەريانى پاكىز ئۆيدە ئېلىپ بېرىلىشى كېرەك. چىپتىكى ھەر بىر قەۋەت (ئۈستۈنكى ۋە ئاستىنكى قەۋەتلەر ۋە پەردىلەر) ۋە ئارىلاشما چىپلار ئۈچۈن، مىكرو قاناللارنىڭ ئېگىزلىكى ئوخشىمايدىغان بولغاچقا، ئايرىم كرېمنىي ۋاپپىلىرىدا ئوخشىمايدىغان فوتوماسكا ئىشلىتىلدى ۋە ياسىلدى. چىپتىكى ئۈچەينىڭ ئۈستۈنكى ۋە ئاستىنكى مىكرو قاناللىرىنىڭ نىشان ئېگىزلىكى ئايرىم-ئايرىم ھالدا 500 µm ۋە 200 µm. ئارىلاشما چىپنىڭ قانال نىشان ئېگىزلىكى 200 µm.
ئاتسېتون قوشۇلغان قاچىغا 3 دىيۇملۇق كرېمنىيلىق ۋاپپېرنى سېلىڭ. تەخسىنى 30 سېكۇنت ئاستا ئايلاندۇرۇڭ، ئاندىن ۋاپپېرنى ھاۋادا قۇرۇتۇڭ. ۋاپپېرنى IPA قوشۇلغان تەخسىگە يۆتكەپ، ئاندىن تەخسىنى 30 سېكۇنت ئايلاندۇرۇپ تازىلاڭ.
كرېمنىي تاختىسىنىڭ يۈزىدىكى ئورگانىك قالدۇقلارنى ئەڭ چوڭ دەرىجىدە چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن، پىرانھا ئېرىتمىسى (ۋودورود پېروكسىد ۋە قويۇقلاشتۇرۇلغان سۇلفات كىسلاتاسىنىڭ ئارىلاشمىسى، 1:3 (ھەج/ھەج)) نى تاللىغىلى بولىدۇ.
پىرانھا ئېرىتمىسى ئىنتايىن چىرىتىش كۈچىگە ئىگە بولۇپ، ئىسسىقلىق پەيدا قىلىدۇ. قوشۇمچە بىخەتەرلىك تەدبىرلىرى زۆرۈر. قالدۇقلارنى تاشلاش ئۈچۈن، ئېرىتمىنىڭ سوۋۇشىغا يول قويۇپ، پاكىز، قۇرۇق قالدۇق قاچىسىغا سېلىڭ. ئىككىنچى دەرىجىلىك قاچىلارنى ئىشلىتىڭ ۋە قالدۇق قاچىلىرىغا توغرا بەلگە قويۇڭ. تېخىمۇ تەپسىلىي تەرتىپلەر ئۈچۈن، ئورۇننىڭ بىخەتەرلىك كۆرسەتمىلىرىگە ئەمەل قىلىڭ.
ۋافلىلارنى 200 سېلسىيە گرادۇسلۇق قىزىق تەخسىگە قويۇپ 10 مىنۇت سۇسىزلاندۇرۇڭ. سۇسىزلاندۇرۇلغاندىن كېيىن، ۋافلىلار ھاۋادا بەش قېتىم چايقىلىپ سوۋۇتۇلدى.
تازىلانغان كرېمنىيلىق ۋاپپېرنىڭ ئوتتۇرىسىغا تەخمىنەن 10 گرام فوتورېزىست SU-8 2100 قۇيۇڭ. پىنسېر ئىشلىتىپ فوتورېزىستنى ۋاپپېرغا تەكشى تارقىتىڭ. ۋاپپېرنى ۋاقتى-ۋاقتىدا 65 سېلسىيە گرادۇسلۇق قىزىتىش تاختىسىغا قويۇپ تۇرۇڭ، بۇ فوتورېزىستنىڭ يېپىشقاقلىقىنى ئازايتىدۇ ۋە ئاسانراق تارقىتىدۇ. ۋاپپېرنى بىۋاسىتە قىزىتىش تاختىسىغا قويماڭ.
SU-8 ئايلىنىش قاپلىمىسىنى ئىشلىتىش ئارقىلىق ۋافېرغا تەكشى تەقسىملەندى. SU-8 نىڭ كىرىش ئايلىنىشىنى 5-10 سېكۇنتقا پروگراممىلاپ، 500 ئايلىنىش سۈرئىتىدە 100 ئايلىنىش/سېكۇنت تېزلىنىش سۈرئىتىدە تارقىلىڭ. ئاساسلىق ئايلىنىشنى 1500 ئايلىنىش/سېكۇنتتا 200 µm قېلىنلىقتىكى نەقىشكە تەڭشەڭ ياكى 1200 ئايلىنىش/سېكۇنتتا 30 سېكۇنتتا 300 ئايلىنىش/سېكۇنت تېزلىنىش سۈرئىتىدە 250 µm قېلىنلىققا ئېرىشىڭ (چىپتىكى ئۈچەينىڭ ئۈستۈنكى قەۋىتى ئۈچۈن 500 µm ئېگىزلىك ھاسىل قىلىڭ؛ تۆۋەندىكى «مۇھىم قەدەملەر» گە قاراڭ).
ئاساسلىق ئايلىنىش سۈرئىتىنى كرېمنىي تاختىسىدىكى SU-8 شەكلىنىڭ نىشان قېلىنلىقىغا ئاساسەن تەڭشىگىلى بولىدۇ.
چىپنىڭ ئۈستى قەۋىتى ئۈچۈن 500 µm ئېگىزلىكتىكى SU-8 قېلىپلىرىنى ياساش ئۈچۈن، بۇ قۇتىنىڭ ئايلىنىش قەۋىتى ۋە يۇمشاق پىشۇرۇش باسقۇچلىرى (7- ۋە 8- باسقۇچلار) ئارقا-ئارقىدىن تەكرارلىنىپ (9- باسقۇچقا قاراڭ)، 250 µm قېلىنلىقتىكى ئىككى قەۋەت ھاسىل قىلىندى. بۇ قەۋەتنىڭ 12- باسقۇچىدا ئۇلترابىنەفشە نۇرغا ئۇچراش ئارقىلىق قاتلام-قاتلام قىلىپ بىرلەشتۈرگىلى بولىدىغان قېلىن SU-8 قەۋىتى ھاسىل قىلىندى، بۇنىڭ بىلەن 500 µm ئېگىزلىكتىكى قەۋەت ھاسىل قىلىندى.
SU-8 قاپلانغان ۋافلىلارنى يۇمشاق پىشۇرۇش ئۈچۈن، ۋافلىلارنى ئېھتىيات بىلەن 65 سېلسىيە گرادۇسلۇق قىزىق تەخسىگە قويۇپ 5 مىنۇت پىشۇرۇڭ، ئاندىن تەڭشىكىنى 95 سېلسىيە گرادۇسقا ئۆزگەرتىپ، يەنە 40 مىنۇت پىشۇرۇڭ.
ئۈستۈنكى مىكرو قانالدا SU-8 ئەندىزىسىنىڭ ئېگىزلىكىنى 500 μm قىلىش ئۈچۈن، 7- ۋە 8- قەدەملەرنى تەكرارلاپ، 250 μm قېلىنلىقتىكى ئىككى SU-8 قەۋىتى ھاسىل قىلىڭ.
UV ماسكا تۈزلەش ئۈسكۈنىسىنى ئىشلىتىپ، ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن چىراغ سىنىقى ئېلىپ بېرىپ، ۋافېرنىڭ نۇرغا چىداملىق ۋاقتىنى ھېسابلاڭ. (نۇرغا چىداملىق ۋاقتى، ms) = (نۇرغا چىداملىق مىقدارى، mJ/cm2)/(چىراغ قۇۋۋىتى، mW/cm2).
ئاشكارلىنىش ۋاقتىنى بېكىتكەندىن كېيىن، فوتو ماسكىنى UV ماسكا تۈزەتكۈچنىڭ ماسكا تۇتقۇچىغا قويۇپ، فوتو ماسكىنى SU-8 قاپلانغان ۋافېرغا قويۇڭ.
UV نۇرىنىڭ تارقىلىشىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ئۈچۈن، فوتو ماسكىنىڭ بېسىلغان يۈزىنى بىۋاسىتە كرېمنىي تاختىسىنىڭ SU-8 قاپلانغان تەرىپىگە قويۇڭ.
SU-8 قاپلانغان ۋافېر ۋە فوتو ماسكىنى بەلگىلەنگەن ۋاقىت ئىچىدە 260 mJ/cm2 ئۇلترا بىنەپشە نۇرغا تىك ھالەتتە قويۇڭ (بۇ قۇتىنىڭ 10-قەدەمىگە قاراڭ).
UV نۇرىغا ئۇچرىغاندىن كېيىن، SU-8 قاپلانغان كرېمنىي ۋاپپېرلىرى ھەر بىر قىزىق تاختىدا 65 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت ۋە 95 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت پىشۇرۇلۇپ، 200 مىكرومېتىر ئېگىزلىكتىكى نەقىشلەر ياسالدى. 500 مىكرومېتىر ئېگىزلىكتىكى نەقىشلەرنى ياساش ئۈچۈن، 95 سېلسىيە گرادۇستا پىشۇرۇلغاندىن كېيىنكى ۋاقىتنى 30 مىنۇتقىچە ئۇزارتىڭ.
ئاچقۇچى ئەينەك قاچىغا قۇيۇلىدۇ، پىشۇرۇلغان ۋافلى قاچىغا سېلىنىدۇ. SU-8 ئاچقۇچىنىڭ مىقدارى ئەينەك تاختىنىڭ چوڭ-كىچىكلىكىگە ئاساسەن ئوخشىماسلىقى مۇمكىن. ئاشكارىلانمىغان SU-8 نى پۈتۈنلەي چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن يېتەرلىك SU-8 ئاچقۇچى ئىشلىتىشىڭىزگە كاپالەتلىك قىلىڭ. مەسىلەن، 1 لىتىرلىق دىئامېتىرى 150 مىللىمېتىر كېلىدىغان ئەينەك قاچىنى ئىشلەتكەندە، تەخمىنەن 300 مىللىلىتىر SU-8 ئاچقۇچى ئىشلىتىڭ. قېلىپنى 25 مىنۇت ئېچىپ، ۋاقتى-ۋاقتىدا يېنىك ئايلاندۇرۇڭ.
پىپېتكا ئارقىلىق ئېرىتمىنى پۈركۈپ، تەخمىنەن 10 مىللىلىتىر يېڭى پىپېتكا بىلەن پىپېتكا قىلىپ، پىپېتكا بىلەن پىپېتكا قىلىپ، پىپېتكا بىلەن پىپېتكا قىلىپ، پىپېتكا قېلىپنى چايقىۋېتىڭ.
لېنتىنى پلازما تازىلىغۇچقا سېلىپ، ئوكسىگېن پلازمىسىغا (ئاتموسفېرا گازى، نىشان بېسىمى 1 × 10−5 Torr، قۇۋۋىتى 125 W) 1.5 مىنۇت قويۇپ قويۇڭ.
ۋاپېرنى ئىچىدە ئەينەك سىيرىلمىسى بار ۋاكۇئۇم قۇرۇتقۇچقا سېلىڭ. ۋاپېر ۋە سىيرىلمىلارنى يانمۇ-يان قويغىلى بولىدۇ. ئەگەر ۋاكۇئۇم قۇرۇتقۇچ تاختا ئارقىلىق بىر قانچە قەۋەتكە بۆلۈنگەن بولسا، سىيرىلمىلارنى ئاستىنقى كامېراغا، ۋاپېرلارنى ئۈستۈنكى كامېراغا قويۇڭ. ئەينەك سىيرىلمىسىغا 100 μL ترىخلورو (1H، 1H، 2H، 2H-پېرفلۇئوروكتىل)سىلان ئېرىتمىسىنى تامچىلاپ، ۋاكۇئۇم ئارقىلىق سىلانلاشتۇرۇڭ.
توڭلىتىلغان Caco-2 ھۈجەيرىلىرى قاچىلانغان بوتۇلكىنى 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق سۇ مۇنچىسىدا ئېرىتىڭ، ئاندىن ئېرىتىلگەن ھۈجەيرىلەرنى 15 مىللىلىتىر 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئالدىن قىزىتىلغان Caco-2 مۇھىتى قاچىلانغان T75 بوتۇلكىسىغا يۆتكەڭ.
Caco-2 ھۈجەيرىلىرىنى تەخمىنەن %90 قوشۇلۇش نۇقتىسىدا ئۆتكۈزۈش ئۈچۈن، ئالدى بىلەن 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق سۇ مۇنچىسىدا Caco-2 مۇھىتى، PBS ۋە %0.25 ترىپسىن/1 mM EDTA نى قىزىتىڭ.
ۋاكۇئۇم سۈمۈرۈش ئارقىلىق مۇھىتنى سۈمۈرۈڭ. ۋاكۇئۇم سۈمۈرۈشنى تەكرارلاپ ۋە يېڭى PBS قوشۇپ، ھۈجەيرىلەرنى ئىككى قېتىم 5 مىللىلىتىر ئىسسىق PBS بىلەن يۇيۇڭ.