Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Морфогенез кишечника человека формирует крипто-ворсинчатые структуры с трехмерной эпителиальной микроархитектурой и пространственной организацией. Эта уникальная структура необходима для поддержания гомеостаза кишечника, защищая нишу стволовых клеток в базальной крипте от экзогенных микробных антигенов и их метаболитов. Кроме того, кишечные ворсинки и секретирующая слизь представляют собой функционально дифференцированные эпителиальные клетки с защитным барьером на поверхности слизистой оболочки кишечника. Поэтому воссоздание трехмерных эпителиальных структур имеет решающее значение для создания моделей кишечника in vitro. Примечательно, что органическая миметическая модель кишечника на чипе может индуцировать спонтанный трехмерный морфогенез кишечного эпителия с улучшенными физиологическими функциями и биомеханикой. Здесь мы предлагаем воспроизводимый протокол для надежной индукции кишечного морфогенеза в кишечнике на микрофлюидном чипе, а также на гибридном чипе с встроенным Transwell. Мы описываем подробные методы изготовления устройства, культивирования эпителиальных клеток Caco-2 или кишечных органоидов. Этот протокол позволяет моделировать регенерацию функциональной микроархитектуры кишечника как в обычных условиях, так и на микрофлюидной платформе, индуцировать 3D-морфогенез и характеризовать сформированные 3D-эпителиальные структуры с использованием различных методов визуализации. Он обеспечивает регенерацию функциональной микроархитектуры кишечника путем контроля базального потока жидкости в течение 5 дней. Наш метод морфогенеза in vitro использует физиологически значимое сдвиговое напряжение и механическое движение и не требует сложной клеточной инженерии или манипуляций, что может превзойти другие существующие методы. Мы предполагаем, что предложенный нами протокол может иметь широкие последствия для биомедицинского исследовательского сообщества, предоставляя метод регенерации 3D-слоев кишечного эпителия in vitro для биомедицинских, клинических и фармацевтических применений.
Эксперименты показывают, что клетки эпителия кишечника Caco-2, культивируемые в микрофлюидных устройствах типа «кишечник на чипе»1,2,3,4,5 или двухслойных микрофлюидных устройствах6,7, могут подвергаться спонтанному 3D-морфогенезу in vitro без четкого понимания лежащего в основе механизма. В нашем недавнем исследовании мы обнаружили, что удаление антагонистов морфогенов, секретируемых базолатерально, из устройств для культивирования является необходимым и достаточным условием для индукции 3D-морфогенеза эпителия in vitro, что было продемонстрировано на клетках Caco-2 и кишечных органоидах, полученных от пациентов. Были подтверждены свойства эпителиальных клеток. В этом исследовании мы целенаправленно изучали продукцию клеток и распределение концентрации мощного антагониста Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), в устройствах типа «кишечник на чипе» и модифицированных микрофлюидных устройствах, содержащих трансвелл-вставки, называемых «гибридным чипом». Мы показали, что добавление экзогенных антагонистов Wnt (таких как DKK-1, репрессор Wnt 1, секретируемый белок, связанный с frizzled, или Soggy-1) в кишечник на чипе ингибирует морфогенез или нарушает предварительно структурированный трехмерный эпителиальный слой, предполагая, что антагонистический стресс во время культивирования отвечает за кишечный морфогенез in vitro. Поэтому практический подход к достижению устойчивого морфогенеза на эпителиальном интерфейсе заключается в удалении или минимальном поддержании уровня антагонистов Wnt в базолатеральном компартменте путем активного промывания (например, в устройствах типа «кишечник на чипе» или гибридные платформы на чипе) или диффузия. Базолатеральные среды (например, из вставок Transwell в большие базолатеральные резервуары в скважинах).
В данном протоколе мы предлагаем подробный метод изготовления микроустройств типа «кишечник на чипе» и гибридных чипов с вставками Transwell (шаги 1-5) для культивирования эпителиальных клеток кишечника на пористых мембранах на основе полидиметилсилоксана (PDMS) (шаги 6A, 7A, 8, 9) или полиэфирных мембранах вставок Transwell (шаги 6B, 7B, 8, 9) и индуцирования 3D-морфогенеза in vitro (шаг 10). Мы также идентифицировали клеточные и молекулярные особенности, указывающие на тканеспецифический гистогенез и клеточную дифференцировку, зависящую от линии клеток, с помощью нескольких методов визуализации (шаги 11-24). Мы индуцируем морфогенез с использованием человеческих эпителиальных клеток кишечника, таких как Caco-2 или кишечные органоиды, в двух форматах культивирования с техническими подробностями, включая модификацию поверхности пористых мембран, создание 2D-монослоев, а также биохимические и биомеханические характеристики кишечника. микроокружение.in vitro. Для индукции 3D-морфогенеза из 2D-эпителиальных монослоев мы удалили антагонисты морфогенов в обеих формах культивирования, пропуская среду через базальный компартмент культуры. Наконец, мы представляем пример использования регенерируемого 3D-эпителиального слоя, который может быть использован для моделирования морфоген-зависимого роста эпителия, продольных совместных культур хозяина и микробиома, инфекции патогенами, воспалительного повреждения, дисфункции эпителиального барьера и пробиотической терапии. Пример.
Наш протокол может быть полезен широкому кругу ученых в фундаментальных (например, биология слизистой оболочки кишечника, биология стволовых клеток и биология развития) и прикладных исследованиях (например, доклинические испытания лекарств, моделирование заболеваний, тканевая инженерия и гастроэнтерология) с широким спектром применения. Благодаря воспроизводимости и надежности нашего протокола для индукции 3D-морфогенеза эпителия кишечника in vitro, мы предполагаем, что наша техническая стратегия может быть распространена среди аудиторий, изучающих динамику клеточной сигнализации во время развития, регенерации или гомеостаза кишечника. Кроме того, наш протокол полезен для исследования инфекций, вызываемых различными инфекционными агентами, такими как норовирус 8, коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 или Vibrio cholerae. Также полезно учитывать особенности патологии и патогенеза заболеваний. Использование системы микрофизиологии кишечника на чипе может позволить проводить продольное совместное культивирование 10 и последующую оценку защитных механизмов организма, иммунных ответов и восстановления повреждений, связанных с патогенами, в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) 11. Другие заболевания ЖКТ, связанные с синдромом повышенной проницаемости кишечника, целиакией, болезнью Крона, язвенным колитом, пучититом или синдромом раздраженного кишечника, могут быть смоделированы при подготовке трехмерных слоев кишечного эпителия с использованием трехмерных слоев кишечного эпителия пациента; эти заболевания включают атрофию ворсинок, укорочение крипт, повреждение слизистой оболочки или нарушение эпителиального барьера. Биопсия или кишечные органоиды, полученные из стволовых клеток12,13. Для лучшего моделирования более сложной среды заболевания читатели могут рассмотреть возможность добавления релевантных для заболевания типов клеток, таких как мононуклеарные клетки периферической крови пациента (МПК), к моделям, содержащим трехмерные кишечные ворсинки-крипты. микроархитектуры. тканеспецифические иммунные клетки, 5.
Поскольку трехмерную эпителиальную микроструктуру можно зафиксировать и визуализировать без процесса нарезки, специалисты, работающие в области пространственной транскриптомики и высокоразрешающей или сверхвысокоразрешающей визуализации, могут заинтересоваться нашим картированием пространственно-временной динамики генов и белков в эпителиальных нишах. Интерес к технологиям. Реакция на микробные или иммунные стимулы. Кроме того, продольное взаимодействие хозяина и микробиома 10, 14, координирующее гомеостаз кишечника, может быть установлено в трехмерном слое слизистой оболочки кишечника путем совместного культивирования различных видов микроорганизмов, микробных сообществ или фекальной микробиоты, особенно в модели «кишечник на чипе». на платформе. Этот подход особенно привлекателен для исследователей, изучающих иммунологию слизистых оболочек, гастроэнтерологию, микробиом человека, культуромику и клиническую микробиологию, стремящихся культивировать ранее некультивированную кишечную микробиоту в лабораторных условиях. Если наш протокол морфогенеза in vitro может быть адаптирован к масштабируемым форматам культивирования, таким как многолуночные вставки в 24, 96 или 384-луночных планшетах, которые непрерывно пополняют базальные компартменты, протокол также может быть распространен среди разработчиков фармацевтических, биомедицинских или высокопроизводительных скрининговых или валидационных платформ для пищевой промышленности. В качестве подтверждения принципа мы недавно продемонстрировали осуществимость мультиплексной высокопроизводительной системы морфогенеза, масштабируемой до формата 24-луночного планшета. Кроме того, было коммерциализировано множество продуктов «орган-на-чипе»16,17,18. Таким образом, валидация нашего метода морфогенеза in vitro может быть ускорена и потенциально принята многими исследовательскими лабораториями, промышленностью или государственными и регулирующими органами для понимания Клеточная перестройка морфогенеза кишечника in vitro на транскриптомном уровне для тестирования лекарств или биотерапевтических препаратов. Всасывание и транспорт лекарственных кандидатов оценивались с использованием 3D-моделей кишечника или с помощью изготовленных на заказ или коммерческих моделей «орган на чипе» для оценки воспроизводимости процесса морфогенеза кишечника.
Для изучения морфогенеза кишечного эпителия использовалось ограниченное количество экспериментальных моделей, имеющих отношение к человеку, главным образом из-за отсутствия реализуемых протоколов для индукции 3D-морфогенеза in vitro. Фактически, большая часть современных знаний о морфогенезе кишечника основана на исследованиях на животных (например, на рыбах данио20, мышах21 или цыплятах22). Однако они трудоемки и дорогостоящи, могут быть этически сомнительными и, что наиболее важно, не позволяют точно определить процессы развития человека. Эти модели также очень ограничены в своей способности к многофакторному масштабируемому тестированию. Поэтому наш протокол регенерации 3D-структур ткани in vitro превосходит модели животных in vivo, а также другие традиционные статические 2D-модели клеточных культур. Как было описано ранее, использование 3D-эпителиальных структур позволило нам изучить пространственную локализацию дифференцированных клеток в оси крипта-ворсинка в ответ на различные слизистые или иммунные стимулы. 3D-эпителиальные слои могут обеспечивать пространство Изучение того, как микробные клетки конкурируют за формирование пространственных ниш и экологическую эволюцию в ответ на факторы хозяина (например, внутренний и внешний слои слизи, секреция IgA и антимикробных пептидов). Кроме того, трехмерная морфология эпителия позволяет понять, как кишечная микробиота структурирует свои сообщества и синергически продуцирует микробные метаболиты (например, короткоцепочечные жирные кислоты), которые формируют клеточную организацию и ниши стволовых клеток в базальных криптах. Эти особенности можно продемонстрировать только при создании трехмерных эпителиальных слоев in vitro.
Помимо нашего метода создания трехмерных структур кишечного эпителия, существует несколько методов in vitro. Культивирование кишечных органоидов — это передовая методика тканевой инженерии, основанная на культивировании кишечных стволовых клеток в специфических морфогенных условиях23,24,25. Однако использование трехмерных органоидных моделей для анализа транспорта или совместного культивирования хозяина и микробиома часто сопряжено с трудностями, поскольку просвет кишечника заключен внутри органоида, и, следовательно, введение компонентов просвета, таких как микробные клетки или экзогенные антигены, ограничено. Доступ к просвету органоида можно улучшить с помощью микроинъектора26,27, но этот метод является инвазивным и трудоемким и требует специальных знаний для выполнения. Кроме того, традиционные органоидные культуры, поддерживаемые в гидрогелевых каркасах в статических условиях, неточно отражают активную биомеханику in vivo.
Другие подходы, используемые несколькими исследовательскими группами, применяют предварительно структурированные 3D-гидрогелевые каркасы для имитации структуры эпителия кишечника путем культивирования изолированных клеток кишечника человека на поверхности геля. Гидрогелевые каркасы изготавливаются с использованием 3D-печатных, микрофрезерованных или литографически изготовленных форм. Этот метод демонстрирует самоорганизующееся расположение изолированных эпителиальных клеток in vitro с физиологически значимыми градиентами морфогенов, создавая эпителиальную структуру с высоким соотношением сторон и взаимодействие стромы и эпителия за счет включения стромальных клеток в каркас. Однако природа предварительно структурированных каркасов может препятствовать отображению самого спонтанного морфогенетического процесса. Эти модели также не обеспечивают динамического потока в просвете или интерстиции, поскольку им не хватает сдвигового напряжения жидкости, необходимого клеткам кишечника для морфогенеза и приобретения физиологической функции. В другом недавнем исследовании использовались гидрогелевые каркасы на микрофлюидной платформе и структурированные структуры кишечного эпителия с использованием методов лазерного травления. Затем были получены органоиды кишечника мышей. Вытравленные узоры для формирования кишечных трубчатых структур и внутрипросветный поток жидкости могут быть воспроизведены с помощью микрофлюидного модуля. Однако эта модель не демонстрирует ни спонтанных морфогенетических процессов, ни механобиологических движений кишечника. Методы 3D-печати той же группы позволили создать миниатюрные кишечные трубки со спонтанными морфогенетическими процессами. Несмотря на сложное изготовление различных сегментов кишечника внутри трубки, эта модель также не имеет внутрипросветного потока жидкости и механической деформации. Кроме того, работоспособность модели может быть ограничена, особенно после завершения процесса биопечати, что нарушает экспериментальные условия или межклеточные взаимодействия. Вместо этого предлагаемый нами протокол обеспечивает спонтанный морфогенез кишечника, физиологически значимое сдвиговое напряжение, биомеханику, имитирующую моторику кишечника, доступность независимых апикальных и базальных компартментов и воссоздание сложных биологических микросред модульности. Таким образом, наш протокол 3D-морфогенеза in vitro может представлять собой дополнительный подход для преодоления проблем существующих методов.
Наш протокол полностью сосредоточен на трехмерном эпителиальном морфогенезе, при этом в культуре присутствуют только эпителиальные клетки, без других типов окружающих клеток, таких как мезенхимальные клетки, эндотелиальные клетки и иммунные клетки. Как было описано ранее, ядром нашего протокола является индукция эпителиального морфогенеза путем удаления ингибиторов морфогенов, секретируемых на базальной стороне вводимой среды. Хотя надежная модульность нашей модели «кишечник на чипе» и гибридной модели «кишечник на чипе» позволяет нам воссоздать волнообразный трехмерный эпителиальный слой, дополнительные биологические сложности, такие как эпителиально-мезенхимальные взаимодействия33,34, отложение внеклеточного матрикса (ВКМ)35 и, в нашей модели, особенности крипто-ворсинчатой ​​структуры, которые создают ниши стволовых клеток в базальных криптах, требуют дальнейшего изучения. Стромальные клетки (например, фибробласты) в мезенхиме играют ключевую роль в производстве белков ВКМ и регуляции кишечного морфогенеза. vivo35,37,38. Добавление мезенхимальных клеток к нашей модели улучшило морфогенетический процесс и эффективность прикрепления клеток. Эндотелиальный слой (т. е. капилляры или лимфатические сосуды) играет важную роль в регуляции молекулярного транспорта39 и привлечении иммунных клеток40 в микроокружении кишечника. Кроме того, компоненты сосудистой системы, которые могут быть соединены между тканевыми моделями, являются необходимым условием при разработке тканевых моделей для демонстрации взаимодействия нескольких органов. Поэтому для моделирования более точных физиологических особенностей с разрешением на уровне органов может потребоваться включение эндотелиальных клеток. Иммунные клетки, полученные от пациента, также необходимы для демонстрации врожденных иммунных ответов, презентации антигенов, взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета и тканеспецифического иммунитета в контексте имитации кишечных заболеваний.
Использование гибридных чипов проще, чем «кишечник на чипе», поскольку конструкция устройства проще, а использование вставок Transwell позволяет масштабируемо культивировать эпителий кишечника. Однако имеющиеся в продаже вставки Transwell с полиэфирными мембранами неэластичны и не могут имитировать перистальтические движения. Кроме того, апикальный отсек вставки Transwell, помещенной в гибридный чип, оставался неподвижным, без сдвигового напряжения на апикальной стороне. Очевидно, что статические свойства апикального отсека редко позволяют осуществлять долгосрочное совместное культивирование бактерий в гибридных чипах. Хотя мы можем надежно индуцировать 3D-морфогенез во вставках Transwell при использовании гибридных чипов, недостаток физиологически значимой биомеханики и апикального потока жидкости может ограничивать применимость гибридных чип-платформ для потенциальных задач.
Полномасштабные реконструкции оси крипта-ворсинка человека в культурах «кишечник на чипе» и «гибрид на чипе» еще не полностью разработаны. Поскольку морфогенез начинается с эпителиального монослоя, 3D-микроархитектура не обязательно обеспечивает морфологическое сходство с криптами in vivo. Хотя мы охарактеризовали пролиферирующую популяцию клеток вблизи базальной области крипты в микроинженерном 3D-эпителии, области крипты и ворсинки не были четко разграничены. Хотя более высокие верхние каналы на чипе приводят к увеличению высоты микроинженерного эпителия, максимальная высота все еще ограничена ~300–400 мкм. Фактическая глубина крипт кишечника человека в тонком и толстом кишечнике составляет ~135 мкм и ~400 мкм соответственно, а высота ворсинок тонкого кишечника составляет ~600 мкм41.
С точки зрения визуализации, сверхразрешающая визуализация 3D-микроархитектур in situ может быть ограничена исследованием кишечника на чипе, поскольку необходимое рабочее расстояние от объектива до эпителиального слоя составляет порядка нескольких миллиметров. Для решения этой проблемы может потребоваться удаленный объектив. Кроме того, изготовление тонких срезов для подготовки образцов для визуализации представляет собой сложную задачу из-за высокой эластичности полидиметилсилоксана (PDMS). Более того, поскольку послойное микроизготовление кишечника на чипе включает в себя постоянную адгезию между каждым слоем, чрезвычайно сложно открыть или удалить верхний слой для изучения структуры поверхности эпителиального слоя. Например, с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).
Гидрофобность ПДМС является ограничивающим фактором в исследованиях на основе микрофлюидики, посвященных гидрофобным малым молекулам, поскольку ПДМС может неспецифически адсорбировать такие гидрофобные молекулы. В качестве альтернативы ПДМС можно рассмотреть другие полимерные материалы. В качестве альтернативы можно рассмотреть модификацию поверхности ПДМС (например, покрытие липофильными материалами 42 или полиэтиленгликолем) 43) для минимизации адсорбции гидрофобных молекул.
Наконец, наш метод недостаточно хорошо изучен с точки зрения обеспечения высокопроизводительного скрининга или универсальной, удобной для пользователя экспериментальной платформы. Текущий протокол требует использования шприцевого насоса для каждого микроустройства, что занимает место в CO2-инкубаторе и препятствует проведению крупномасштабных экспериментов. Это ограничение может быть значительно улучшено за счет масштабируемости инновационных форматов культивирования (например, пористых вставок на 24, 96 или 384 лунки, позволяющих непрерывно пополнять и удалять базальную среду).
Для индукции 3D-морфогенеза эпителия кишечника человека in vitro мы использовали микрофлюидный чип, имитирующий кишечник, содержащий два параллельных микроканала и эластичную пористую мембрану между ними для создания интерфейса просвет-капилляр. Мы также демонстрируем использование одноканального микрофлюидного устройства (гибридного чипа), обеспечивающего непрерывный базальный поток под поляризованными эпителиальными слоями, выращенными на вставках Transwell. На обеих платформах морфогенез различных клеток эпителия кишечника человека можно продемонстрировать, применяя направленное управление потоком для удаления антагонистов морфогенов из базального компартмента. Вся экспериментальная процедура (рис. 1) состоит из пяти частей: (i) микроизготовление кишечного чипа или вставляемого гибридного чипа Transwell (шаги 1-5; блок 1), (ii) подготовка клеток эпителия кишечника (клетки Caco-2) или органоидов кишечника человека; (1) этапы 2-5), (iii) культивирование эпителиальных клеток кишечника на кишечных чипах или гибридных чипах (этапы 6-9), (iv) индукция 3D-морфогенеза in vitro (этап 10) и (v) для характеристики 3D-эпителиальной микроструктуры (этапы 11-24). Наконец, была разработана соответствующая контрольная группа (подробнее обсуждается ниже) для подтверждения эффективности морфогенеза in vitro путем сравнения эпителиального морфогенеза с пространственными, временными, условными или процедурными контролями.
Мы использовали две разные платформы для культивирования: чип «кишечник на чипе» с прямыми каналами или нелинейными извилистыми каналами, или гибридные чипы, содержащие вставки Transwell (TW) в микрофлюидном устройстве, изготовленные, как описано в блоке 1, и на этапах 1-5. «Изготовление устройства» показывает основные этапы создания отдельного чипа или гибридного чипа. «Культивирование эпителиальных клеток кишечника человека» объясняет источник клеток (Caco-2 или органоиды кишечника человека) и процедуру культивирования, используемую в этом протоколе. «Морфогенез in vitro» показывает общие этапы, на которых эпителиальные клетки, полученные из клеток Caco-2 или органоидов, культивируются на кишечном чипе или на вставках Transwell гибридного чипа, после чего происходит индукция 3D-морфогенеза и формирование охарактеризованной эпителиальной структуры. Номер этапа программы или номер блока отображается под каждой стрелкой. Приложение предоставляет примеры того, как можно использовать сформированные слои эпителия кишечника, например, для характеристики дифференцировки клеток, исследований физиологии кишечника, создания Экосистемы «хозяин-микробиом» и моделирование заболеваний. Изображения иммунофлуоресценции в разделе «Дифференцировка клеток» показывают ядра, F-актин и MUC2, экспрессируемые в 3D-эпителиальном слое Caco-2, созданном на кишечном чипе. Сигнал MUC2 присутствует в бокаловидных клетках и слизи, выделяемой с слизистых оболочек. Флуоресцентные изображения в разделе «Физиология кишечника» показывают слизь, образующуюся при окрашивании на остатки сиаловой кислоты и N-ацетилглюкозамина с использованием флуоресцентного агглютинина зародышей пшеницы. Два перекрывающихся изображения в разделе «Совместное культивирование хозяина и микробов» показывают репрезентативные совместные культуры хозяина и микробиома в кишечнике на чипе. Левая панель показывает совместное культивирование E. coli, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), с микроинженерными 3D-эпителиальными клетками Caco-2. Правая панель показывает локализацию GFP E. coli, совместно культивируемой с 3D-эпителиальными клетками Caco-2. клетки, затем иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием F-актина (красный) и ядер (синий). Моделирование заболевания иллюстрирует здоровую и поврежденную кишечную ткань на чипах с изображением воспаления кишечника при физиологическом воздействии бактериальных антигенов (например, липополисахарида, ЛПС) и иммунных клеток (например, PBMC; зеленый). Клетки Caco-2 культивировали для создания трехмерного эпителиального слоя. Масштабная линейка, 50 мкм. Изображения в нижнем ряду: «Дифференцировка клеток», адаптировано с разрешения из ссылки 2. Oxford University Press; Воспроизведено с разрешения из ссылки 5. NAS; «Совместное культивирование хозяина и микроба», адаптировано с разрешения из ссылки 3. NAS; «Моделирование заболевания», адаптировано с разрешения из ссылки 5. NAS.
Как чипы типа «кишечник на чипе», так и гибридные чипы были изготовлены с использованием реплик из ПДМС, которые были извлечены из кремниевых форм методом мягкой литографии1,44 и обработаны SU-8. Конструкция микроканалов в каждом чипе определяется с учетом гидродинамики, такой как касательное напряжение и гидродинамическое давление1,4,12. Первоначальная конструкция чипа типа «кишечник на чипе» (дополнительные данные, рис. 1a), состоявшая из двух расположенных рядом параллельных прямых микроканалов, эволюционировала в сложный чип типа «кишечник на чипе» (дополнительные данные, рис. 1b), который включает пару изогнутых микроканалов для увеличения времени пребывания жидкости, нелинейных картин потока и многоосевой деформации культивируемых клеток (рис. 2a–f)12. Когда необходимо воссоздать более сложную биомеханику кишечника, можно выбрать сложные чипы типа «кишечник на чипе». Мы продемонстрировали, что сложный чип типа «кишечник на чипе» также сильно стимулирует 3D-морфогенез за аналогичное время. каркас с аналогичной степенью эпителиального роста по сравнению с исходным Gut-Chip, независимо от типа культивируемых клеток. Поэтому для индукции 3D-морфогенеза линейные и сложные конструкции кишечника на чипе взаимозаменяемы. Реплики из ПДМС, отвержденные на кремниевых формах с рисунками из SU-8, обеспечивали негативные элементы после извлечения из формы (рис. 2а). Для изготовления кишечника на чипе подготовленный верхний слой ПДМС последовательно приклеивался к пористой пленке ПДМС, а затем выравнивался с нижним слоем ПДМС путем необратимого склеивания с использованием коронного разрядника (рис. 2b–f). Для изготовления гибридных чипов отвержденные реплики из ПДМС приклеивались к стеклянным подложкам для создания одноканальных микрофлюидных устройств, которые могли вмещать вставки Transwell (рис. 2h и дополнительные данные, рис. 2). Процесс склеивания выполняется путем обработки поверхностей реплики из ПДМС и стекла кислородной плазмой или коронным разрядом. После стерилизации микроизготовленного устройства Присоединив устройство к силиконовой трубке, можно было сразу приступать к трехмерному морфогенезу эпителия кишечника (рис. 2g).
a) Схематическое изображение процесса изготовления деталей из ПДМС из кремниевых форм с нанесенным рисунком из SU-8. Неотвердевший раствор ПДМС заливали в кремниевую форму (слева), отверждали при 60 °C (посередине) и извлекали из формы (справа). Извлеченный из формы ПДМС разрезали на кусочки и очищали для дальнейшего использования. b) Фотография кремниевой формы, используемой для изготовления верхнего слоя ПДМС. c) Фотография кремниевой формы, используемой для изготовления пористой мембраны из ПДМС. d) Серия фотографий верхнего и нижнего компонентов ПДМС и собранного на чипе кишечного устройства. e) Схема выравнивания верхнего, мембранного и нижнего компонентов ПДМС. Каждый слой необратимо соединен плазмой или коронным разрядом. f) Схема изготовленного устройства «кишечник на чипе» с наложенными друг на друга сложными микроканалами и вакуумными камерами. g) Установка «кишечника на чипе» для микрофлюидной клеточной культуры. Собранное устройство «кишечник на чипе» Силиконовую трубку и шприц помещали на покровное стекло. Чип помещали на крышку чашки Петри диаметром 150 мм для обработки. Связующее вещество использовали для закрытия силиконовой трубки. Визуальные снимки процесса изготовления гибридного чипа и 3D-морфогенеза с использованием гибридных чипов. Вставки Transwell, подготовленные независимо для культивирования 2D-монослоев эпителиальных клеток кишечника, вставляли в гибридный чип для индукции 3D-морфогенеза кишечника. Среда перфузировалась через микроканалы под слоем клеток, сформированным на вставке Transwell. Масштабная линейка, 1 см. Перепечатано с разрешения из ссылки 4. Elsevier.
В этом протоколе в качестве источников эпителия использовались клеточная линия Caco-2 и кишечные органоиды (рис. 3а). Оба типа клеток культивировались независимо (бокс 2 и бокс 5) и использовались для засева микроканалов, покрытых внеклеточным матриксом, в имплантатах типа «кишечник на чипе» или Transwell. Когда клетки достигают конфлюентности (>95% покрытия в колбах), клетки Caco-2, культивируемые в обычных условиях (между пассажами 10 и 50) в Т-образных колбах, собирают для приготовления диссоциированных клеточных суспензий с помощью трипсинизации (бокс 2). Человеческие кишечные органоиды, полученные из биопсий кишечника или хирургических резекций, культивировали в куполах из матригеля в 24-луночных планшетах для поддержания структурной микросреды. Среда, содержащая необходимые морфогены (такие как Wnt, R-спондин и ноггин) и факторы роста, приготовленные, как описано в боксе 3, добавлялась каждые два дня до тех пор, пока органоиды не выросли примерно до 500 клеток. микрометров в диаметре. Полностью созревшие органоиды собирают и диссоциируют на отдельные клетки для посева на кишечные или трансвелл-вставки на чипе (Box 5). Как мы сообщали ранее, их можно дифференцировать в зависимости от типа заболевания12,13 (например, язвенный колит, болезнь Крона, колоректальный рак или нормальный донор), места поражения (например, пораженный участок против непораженного участка) и локализации в желудочно-кишечном тракте (например, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, слепая кишка, толстая кишка или прямая кишка). В Box 5 мы приводим оптимизированный протокол для культивирования органоидов толстой кишки (колоидов), которые обычно требуют более высоких концентраций морфогенов, чем органоиды тонкой кишки.
а) Схема процесса индукции морфогенеза кишечника на микрочипе. В данном протоколе для демонстрации 3D-морфогенеза используются клетки эпителия кишечника человека Caco-2 и кишечные органоиды. Изолированные эпителиальные клетки высевали в подготовленное устройство «кишечник на чипе» (подготовка чипа). После посева (засеивания) и прикрепления (прикрепления) клеток к пористой мембране из ПДМС на нулевой день (D0) инициируется апикальный (AP) поток, который поддерживается в течение первых 2 дней (поток, AP, D0-D2). Базолатеральный (BL) поток также инициируется вместе с циклическими растягивающими движениями (растяжение, поток, AP и BL) при формировании полного 2D-монослоя. 3D-морфогенез кишечника происходил спонтанно после 5 дней микрофлюидной культуры (морфогенез, D5). Фазово-контрастные изображения показывают репрезентативную морфологию клеток Caco-2 на каждом этапе эксперимента или в каждой временной точке (гистограмма, 100). мкм). Четыре схематических диаграммы, иллюстрирующие соответствующие каскады морфогенеза кишечника (вверху справа). Пунктирные стрелки на схеме показывают направление потока жидкости. b, Изображение SEM, показывающее топологию поверхности сформированного 3D-эпителия Caco-2 (слева). Вставка, выделяющая увеличенную область (белый пунктирный прямоугольник), показывает регенерированные микроворсинки на 3D-слое Caco-2 (справа). c, Горизонтальный фронтальный вид сформированного 3D-эпителия Caco-2, клаудина (ZO-1, красный) и сплошной щеточной каймы мембран, помеченных F-актином (зеленый) и ядрами (синий). Конфокальная иммунофлуоресцентная визуализация эпителиальных клеток на кишечных чипах. Стрелки, указывающие на среднюю схему, показывают расположение фокальной плоскости для каждого конфокального изображения. d, Динамика морфологических изменений в органоидах, культивируемых на чипе, полученная с помощью фазово-контрастной микроскопии на 3, 7, 9, 11 и 13. Вставка (вверху справа) показывает увеличенное изображение предоставленного материала. e, DIC-микрофотография 3D-эпителия органоида, сформированного в кишечнике на срезе, полученном на 7-й день. f, Наложенные друг на друга изображения иммунофлуоресценции, показывающие маркеры стволовых клеток (LGR5; пурпурный), бокаловидных клеток (MUC2; зеленый), F-актина (серый) и ядер (голубой), выращенных на чипах кишечника в течение 3 дней соответственно (слева) и 13-дневных (посередине) органоидов на эпителиальном слое. См. также дополнительные данные, рисунок 3, который иллюстрирует сигнализацию LGR5 без сигнализации MUC2. Флуоресцентные изображения, показывающие эпителиальную микроструктуру (справа) 3D-эпителия органоида, сформированного в кишечнике на чипе путем окрашивания плазматической мембраны красителем CellMask (справа) на 13-й день культивирования. Масштабная линейка составляет 50 мкм, если не указано иное. b Перепечатано с разрешения ссылка 2. Издательство Оксфордского университета; c Адаптировано с разрешения из ссылки 2. Издательство Оксфордского университета; e и f адаптированы с разрешения из ссылки 12. Под лицензией Creative Commons CC BY 4.0.
В микрофлюидной модели кишечника на чипе необходимо модифицировать гидрофобную поверхность пористой мембраны из полидиметилсилоксана (ПДМС) для успешного нанесения покрытия из внеклеточного матрикса (ВКМ). В этом протоколе мы применяем два различных метода модификации гидрофобности мембран из ПДМС. Для культивирования клеток Caco-2 достаточно было одной лишь активации поверхности УФ-излучением/озоном для снижения гидрофобности поверхности ПДМС, нанесения покрытия из ВКМ и прикрепления клеток Caco-2 к мембране из ПДМС. Однако микрофлюидная культура органоидного эпителия требует химической функционализации поверхности для эффективного осаждения белков ВКМ путем последовательного нанесения полиэтиленимина (ПЭИ) и глутарового альдегида на микроканалы из ПДМС. После модификации поверхности белки ВКМ осаждались для покрытия функционализированной поверхности ПДМС, а затем вводились в изолированный органоидный эпителий. После прикрепления клеток начинается микрофлюидная культура клеток путем перфузии только среды в верхний микроканал до образования полного монослоя, в то время как нижний микроканал остается неподвижным. Условия. Этот оптимизированный метод активации поверхности и нанесения покрытия из внеклеточного матрикса позволяет прикреплять эпителий органоидов для индукции 3D-морфогенеза на поверхности ПДМС.
Для культивирования клеток в трансвеллах также требуется покрытие внеклеточным матриксом (ВКМ) перед посевом клеток; однако для культивирования в трансвеллах не требуются сложные этапы предварительной обработки для активации поверхности пористых вставок. При выращивании клеток Caco-2 на вставках трансвеллов покрытие ВКМ на пористых вставках ускоряет прикрепление диссоциированных клеток Caco-2 (<1 часа) и формирование барьера плотных межклеточных соединений (<1-2 дня). Для культивирования органоидов на вставках трансвеллов изолированные органоиды высевают на вставки с покрытием ВКМ, прикрепляют к поверхности мембраны (<3 ч) и поддерживают до образования органоидами полного монослоя с целостностью барьера. Культивирование в трансвеллах проводится в 24-луночных планшетах без использования гибридных чипов.
В условиях in vitro 3D-морфогенез может быть инициирован путем приложения потока жидкости к базальной стороне сформировавшегося эпителиального слоя. В модели кишечника на чипе эпителиальный морфогенез начинался, когда среда перфузировалась в верхний и нижний микроканалы (рис. 3а). Как было описано ранее, крайне важно ввести поток жидкости в нижний (базолатеральный) отдел для непрерывного удаления направленно секретируемых ингибиторов морфогенов. Для обеспечения достаточного количества питательных веществ и сыворотки для клеток, связанных с пористыми мембранами, и создания люминального сдвигового напряжения мы обычно применяем двойной поток в модели кишечника на чипе. В гибридных чипах в гибридные чипы вставлялись трансвелл-вставки, содержащие эпителиальные монослои. Затем среда подавалась под базальную сторону пористой трансвелл-вставки через микроканал. Кишечный морфогенез происходил через 3-5 дней после начала базального потока на обеих культуральных платформах.
Морфологические особенности микроинженерных 3D эпителиальных слоев можно анализировать с помощью различных методов визуализации, включая фазово-контрастную микроскопию, дифференциально-интерференционную контрастную микроскопию (ДИК), сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) или конфокальную иммунофлуоресцентную микроскопию (рисунки 3 и 4). Фазово-контрастную или ДИК-визуализацию можно легко проводить в любое время культивирования для мониторинга формы и выступов 3D эпителиальных слоев. Благодаря оптической прозрачности пленок ПДМС и полиэстера, как чип-платформа «кишечник на чипе», так и гибридный чип-платформа могут обеспечивать визуализацию in situ в реальном времени без необходимости разрезания или разборки устройства. При проведении иммунофлуоресцентной визуализации (рисунки 1, 3c, f и 4b, c) клетки обычно фиксируют 4% (вес/объем) параформальдегидом (ПФА), затем Тритоном X-100 и 2% (вес/объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в указанном порядке. В зависимости от типа клеток, Для фиксации, пермеабилизации и блокирования могут использоваться различные фиксаторы, пермеабилизаторы и блокирующие агенты. Первичные антитела, нацеленные на клеточные или региональные маркеры, зависящие от линии развития, используются для выделения клеток, иммобилизованных in situ на чипе, за которыми следуют вторичные антитела вместе с контрастным красителем, нацеленным либо на ядро ​​(например, 4′,6-диамидино-2-фенилен)индол, DAPI), либо на F-актин (например, флуоресцентно меченый фаллоидин). Прижизненная флуоресцентная визуализация также может быть выполнена in situ для обнаружения продукции слизи (рис. 1, «Дифференцировка клеток» и «Физиология кишечника»), случайной колонизации микробных клеток (рис. 1, «Совместное культивирование хозяина и микроба»), привлечения иммунных клеток (рис. 1, «Моделирование заболевания») или контуров 3D-морфологии эпителия (рис. 3c,f и 4b,c). При модификации кишечника на чипе для отделения верхнего слоя от нижнего слой микроканалов, как описано в ссылке. Как показано на рис. 2, трехмерную морфологию эпителия, а также микроворсинки на апикальной щеточной кайме можно визуализировать с помощью СЭМ (рис. 3b). Экспрессию маркеров дифференцировки можно оценить с помощью количественной ПЦР5 или секвенирования РНК отдельных клеток. В этом случае трехмерные слои эпителиальных клеток, выращенных на чипах из кишечника или гибридных чипах, собирают путем трипсинизации, а затем используют для молекулярного или генетического анализа.
а) Схема процесса индукции кишечного морфогенеза на гибридном чипе. В этом протоколе для демонстрации 3D-морфогенеза на гибридной чип-платформе используются клетки Caco-2 и кишечные органоиды. Диссоциированные эпителиальные клетки высевали в подготовленные трансвелл-вставки (подготовка TW; см. рисунок ниже). После посева (засеивания) и прикрепления клеток к полиэфирным мембранам в трансвелл-вставках все клетки культивировали в статических условиях (культура TW). Через 7 дней в гибридный чип интегрировали одну трансвелл-вставку, содержащую 2D-монослой эпителиальных клеток, для создания базального потока (поток, BL), что в конечном итоге привело к образованию 3D-эпителиального слоя (морфогенез). Микрофотографии в фазовом контрасте, показывающие морфологические особенности эпителиальных клеток органов человека, полученных от нормального донора (линия C103) из восходящей ободочной кишки на каждом этапе эксперимента или в каждый момент времени. Схемы в верхних слоях иллюстрируют экспериментальную конфигурацию для каждого этапа. б) Гибридные чипы (схема слева) могут привести 3D-морфогенез эпителиальных клеток органоидов с помощью конфокальной микроскопии сверху вниз, полученной при разных положениях по оси Z (верхнее, среднее и нижнее; см. схему справа и соответствующие пунктирные линии). Наблюдались очевидные морфологические характеристики. F-актин (голубой), ядро ​​(серый). c, Флуоресцентные конфокальные микрофотографии (3D-вид под углом) эпителиальных клеток, полученных из органоидов и культивируемых в статической среде Transwell (TW; вставка внутри белой пунктирной рамки), по сравнению с гибридным чипом (самый большой полный снимок), сравнивающие 2D и 3D морфологию соответственно. Пара 2D вертикальных поперечных срезов (вставка в верхнем правом углу; «XZ») также демонстрируют 2D и 3D особенности. Масштабная линейка, 100 мкм. c Перепечатано с разрешения из ссылки.4. Elsevier.
Контрольные образцы можно подготовить, культивируя те же клетки (Caco-2 или эпителиальные клетки кишечных органоидов) в двумерные монослои в обычных статических условиях культивирования. Следует отметить, что истощение питательных веществ может произойти из-за ограниченной емкости микроканалов (например, ~4 мкл в верхнем канале в исходной конструкции кишечного чипа). Поэтому можно также сравнить морфологию эпителия до и после применения базального потока.
Процесс мягкой литографии следует проводить в чистой комнате. Для каждого слоя на чипе (верхний и нижний слои, а также мембраны) и гибридных чипах использовались разные фотошаблоны, изготовленные на отдельных кремниевых пластинах, поскольку высота микроканалов была различной. Целевая высота верхнего и нижнего микроканалов кишечника на чипе составляет 500 мкм и 200 мкм соответственно. Целевая высота канала гибридного чипа составляет 200 мкм.
Поместите силиконовую пластину диаметром 7,5 см в посуду с ацетоном. Аккуратно покрутите пластину в течение 30 секунд, затем высушите пластину на воздухе. Переложите пластину на тарелку с изопропиловым спиртом, затем поверните тарелку в течение 30 секунд для очистки.
Для максимального удаления органических остатков с поверхности кремниевой пластины можно дополнительно использовать раствор «пиранья» (смесь перекиси водорода и концентрированной серной кислоты, 1:3 (об/об)).
Раствор «пиранья» чрезвычайно едкий и выделяет тепло. Необходимы дополнительные меры предосторожности. Для утилизации отходов дайте раствору остыть и перелейте его в чистый, сухой контейнер для отходов. Используйте дополнительные контейнеры и надлежащим образом маркируйте их. Для получения более подробной информации о процедурах, пожалуйста, следуйте правилам техники безопасности предприятия.
Для обезвоживания пластин поместили их на нагревательную плиту с температурой 200 °C на 10 минут. После обезвоживания пластину пять раз встряхнули на воздухе для охлаждения.
Нанесите примерно 10 г фоторезиста SU-8 2100 в центр очищенной кремниевой пластины. С помощью пинцета равномерно распределите фоторезист по пластине. Периодически помещайте пластину на нагревательную плиту с температурой 65°C, чтобы фоторезист стал менее липким и его было легче распределить. Не кладите пластину непосредственно на нагревательную плиту.
SU-8 равномерно распределяли по подложке методом центрифугирования. Запрограммировали входящее вращение SU-8 на 5–10 с для распространения со скоростью 500 об/мин при ускорении 100 об/мин/с. Установили основную скорость вращения для формирования рисунка толщиной 200 мкм на 1500 об/мин или для достижения толщины 250 мкм (с высотой 500 мкм для верхнего слоя «кишечника» на чипе; см. «Критические этапы» ниже) при ускорении 300 об/мин/с в течение 30 секунд при 1200 об/мин.
Скорость вращения основного ротора можно регулировать в зависимости от целевой толщины рисунка из SU-8 на кремниевой подложке.
Для изготовления рисунков из SU-8 высотой 500 мкм для верхнего слоя кишечника на чипе этапы центрифугирования и мягкого запекания, описанные в этом руководстве (этапы 7 и 8), были последовательно повторены (см. этап 9) для получения двух слоев SU-8 толщиной 250 мкм, которые можно наслаивать и соединять с помощью УФ-облучения на этапе 12 этого руководства, образуя слой высотой 500 мкм.
Для приготовления мягкого запекания пластин, покрытых SU-8, аккуратно поместите их на нагревательную плиту при температуре 65 °C на 5 минут, затем переключите температуру на 95 °C и выдерживайте еще 40 минут.
Для достижения высоты рисунка из SU-8 в верхнем микроканале в 500 мкм повторите шаги 7 и 8, чтобы создать два слоя SU-8 толщиной 250 мкм.
Используя устройство для выравнивания УФ-масок, проведите проверку лампы в соответствии с инструкциями производителя, чтобы рассчитать время экспозиции пластины. (Время экспозиции, мс) = (доза экспозиции, мДж/см²) / (мощность лампы, мВт/см²).
После определения времени экспозиции поместите фотошаблон на держатель маски УФ-выравнивателя масок, а затем поместите фотошаблон на пластину, покрытую SU-8.
Чтобы минимизировать рассеивание УФ-излучения, расположите печатную поверхность фотошаблона непосредственно на стороне кремниевой пластины, покрытой SU-8.
Подвергните покрытую SU-8 пластину и фотошаблон вертикальному облучению ультрафиолетовым светом интенсивностью 260 мДж/см2 в течение заданного времени экспозиции (см. шаг 10 в этом блоке).
После облучения УФ-излучением кремниевые пластины, покрытые SU-8, запекали при 65 °C в течение 5 мин и при 95 °C в течение 15 мин на каждой нагревательной пластине для создания рисунков высотой 200 мкм. Время последующего запекания при 95 °C увеличили до 30 мин для создания рисунков высотой 500 мкм.
Проявитель заливают в стеклянную посуду, и запеченную вафлю помещают в нее. Объем проявителя SU-8 может варьироваться в зависимости от размера стеклянной пластины. Убедитесь, что вы используете достаточное количество проявителя SU-8 для полного удаления незасвеченного SU-8. Например, при использовании стеклянной чашки диаметром 150 мм и объемом 1 л используйте ~300 мл проявителя SU-8. Проявите форму в течение 25 минут, периодически аккуратно вращая ее.
Промойте проявленную форму примерно 10 мл свежего проявителя, а затем изопропиловым спиртом, распыляя раствор с помощью пипетки.
Поместите пластину в плазменный очиститель и подвергните воздействию кислородной плазмы (атмосферный газ, целевое давление 1 × 10−5 Торр, мощность 125 Вт) в течение 1,5 мин.
Поместите пластину в вакуумный эксикатор со стеклянной пластинкой внутри. Пластины и пластинки можно разместить рядом. Если вакуумный эксикатор разделен на несколько слоев пластинкой, поместите пластинки в нижнюю камеру, а пластинки — в верхнюю. Нанесите 100 мкл раствора трихлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силана на стеклянную пластинку и создайте вакуум для силанизации.
Разморозьте флакон с замороженными клетками Caco-2 в водяной бане при температуре 37°C, затем перенесите размороженные клетки в колбу T75, содержащую 15 мл предварительно подогретой до 37°C среды для клеток Caco-2.
Для культивирования клеток Caco-2 при достижении ~90% конфлюентности сначала необходимо прогреть среду для культивирования клеток Caco-2, фосфатно-солевой буфер (PBS) и 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в водяной бане при температуре 37°C.
Удалите культуральную среду методом вакуумной аспирации. Дважды промойте клетки 5 мл теплого фосфатно-солевого буфера (PBS), повторив вакуумную аспирацию и добавив свежий PBS.