Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Адамдын ичегинин морфогенези 3D эпителий микроархитектурасынын жана мейкиндик уюмунун крипто-виллаларынын өзгөчөлүктөрүн белгилейт. Бул уникалдуу түзүлүш базалдык криптадагы өзөк клеткасынын нишасын экзогендик микробдук антигендерден жана алардын метаболиттеринен коргоо менен ичегинин гомеостазын сактоо үчүн талап кылынат. Мындан тышкары, ичегинин виллалары жана бөлүп чыгаруучу былжыр ичегинин былжыр челинин бетинде коргоочу тосмо менен функционалдык жактан дифференциацияланган эпителий клеткаларын көрсөтөт. Ошондуктан, 3D эпителий структураларын кайра түзүү in vitro ичеги моделдерин куруу үчүн абдан маанилүү. Белгилей кетчү нерсе, чиптеги органикалык миметикалык ичеги физиологиялык функциялары жана биомеханикасы менен ичегинин эпителийинин өзүнөн-өзү 3D морфогенезин пайда кылышы мүмкүн. Бул жерде биз микрофлюиддик чипте жана Трансвеллдин орнотулган гибриддик чипинде ичегидеги морфогенезди бекем индукциялоо үчүн кайталануучу протоколду сунуштайбыз. Биз түзмөктөрдү жасоонун, Caco-2 же ичеги органоиддик эпителий клеткаларын салттуу шарттарда, ошондой эле микрофлюиддик платформада өстүрүүнүн, 3D морфогенезди индукциялоонун жана бир нече сүрөткө тартуу ыкмаларын колдонуу менен түзүлгөн 3D эпителийлерди мүнөздөөнүн деталдуу ыкмаларын сүрөттөйбүз. Бул протокол 5 күн бою базолатералдык суюктуктун агымын көзөмөлдөө менен ичегилердин функционалдык микроархитектурасын калыбына келтирүүгө жетишет. Биздин in vitro морфогенез ыкмабыз физиологиялык жактан тиешелүү жылышуу стрессин жана механикалык кыймылды колдонот жана татаал клеткалык инженерияны же манипуляцияны талап кылбайт, бул башка учурдагы ыкмалардан ашып түшүшү мүмкүн. Биз сунуштаган протокол биомедициналык изилдөө коомчулугу үчүн кеңири мааниге ээ болушу мүмкүн деп эсептейбиз, биомедициналык, клиникалык жана фармацевтикалык колдонмолор үчүн in vitro 3D ичегинин эпителий катмарларын калыбына келтирүү ыкмасын камсыз кылат.
Эксперименттер ичеги эпителийинин Caco-2 клеткалары чиптеги ичегиде1,2,3,4,5 же эки катмарлуу микрофлюиддик түзүлүштөрдө6,7 өстүрүлгөн, негизги механизмди так түшүнбөстөн, in vitro шартында өзүнөн-өзү 3D морфогенезге дуушар болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Жакында жүргүзүлгөн изилдөөбүздө биз өстүрүү түзүлүштөрүнөн базолатералдык түрдө бөлүнүп чыккан морфоген антагонисттерин алып салуу in vitro шартында 3D эпителий морфогенезин индукциялоо үчүн зарыл жана жетиштүү экенин аныктадык, бул Caco-2 жана пациенттен алынган ичеги органоиддери менен көрсөтүлдү. Эпителий клеткалары текшерилди. Бул изилдөөдө биз "Гибриддик чип" деп аталган Transwell кошумчаларын камтыган ичегидеги чиптеги жана модификацияланган микрофлюиддик түзүлүштөгү күчтүү Wnt антагонисти Диккопф-1 (DKK-1) клетканын өндүрүлүшүнө жана концентрациясынын бөлүштүрүлүшүнө өзгөчө көңүл бурдук. Биз чиптеги ичекке экзогендик Wnt антагонисттерин (мисалы, DKK-1, Wnt репрессору 1, бөлүнүп чыккан бүктөлүүчү белок 1 же Согги-1) кошуу морфогенезди басаңдатарын же алдын ала түзүлгөн 3D эпителий катмарын бузарын көрсөттүк, бул культура учурундагы антагонисттик стресс in vitro шартында ичегинин морфогенезине жооптуу экенин көрсөтүп турат. Ошондуктан, эпителий интерфейсинде бекем морфогенезге жетүү үчүн практикалык ыкма - базолатералдык бөлүктөгү Wnt антагонисттеринин деңгээлин активдүү жууп салуу (мисалы, ичегидеги чипте же гибриддик чип платформаларында) же диффузия аркылуу алып салуу же минималдуу түрдө кармап туруу. Базолатералдык чөйрө (мисалы, Трансвелл кошумчаларынан кудуктардагы чоң базолатералдык резервуарларга).
Бул протоколдо биз ичеги эпителий клеткаларын полидиметилсилоксан (PDMS) негизиндеги тешиктүү мембраналарда (6A, 7A, 8, 9-кадамдар) же Transwell кошумчаларынын полиэстер мембраналарында (6B, 7B, 8, 9-кадамдар) өстүрүү жана in vitro 3D морфогенезди индукциялоо үчүн ичеги-чиптеги микротүзүлүштөрдү жана Transwellге салынуучу гибриддик чиптерди (1-5-кадамдар) жасоонун деталдуу ыкмасын сунуштайбыз (10-кадам). Ошондой эле, биз бир нече сүрөткө тартуу ыкмаларын колдонуу менен тканга мүнөздүү гистогенезди жана тукумга көз каранды клеткалык дифференциацияны көрсөткөн клеткалык жана молекулярдык өзгөчөлүктөрдү аныктадык (11-24-кадамдар). Биз Caco-2 же ичеги органоиддери сыяктуу адамдын ичеги эпителий клеткаларын колдонуп, эки культура форматында тешиктүү мембраналардын бетин модификациялоо, 2D монокабаттарды түзүү жана ичеги биохимиялык жана биомеханикалык микрочөйрөнү көбөйтүү сыяктуу техникалык деталдары менен морфогенезди индукциялайбыз. in vitro. 2D эпителий монокабаттарынан 3D морфогенезди индукциялоо үчүн, биз морфоген антагонисттерин алып салдык. эки өстүрүлгөн форманы тең чөйрөнү өстүрүүнүн базолатералдык бөлүгүнө куюу менен. Акырында, биз морфогенге көз каранды эпителий өсүшүн, узунунан кеткен кожоюн-микробиом биргелешип өстүрүлүшүн, патогендик инфекцияны, сезгенүү жаракатын, эпителий тосмосунун дисфункциясын жана пробиотикалык терапияны моделдөө үчүн колдонула турган калыбына келүүчү 3D эпителий катмарынын пайдалуулугун көрсөтөбүз. Мисалы, таасирлер.
Биздин протокол негизги (мисалы, ичегинин былжыр челинин биологиясы, өзөк клеткаларынын биологиясы жана өнүгүү биологиясы) жана колдонмо изилдөөлөр (мисалы, клиникага чейинки дары-дармектерди текшерүү, ооруларды моделдөө, ткандарды инженериялоо жана гастроэнтерология) боюнча кеңири таасирдүү окумуштуулардын кеңири чөйрөсү үчүн пайдалуу болушу мүмкүн. In vitro ичеги эпителийинин 3D морфогенезин индукциялоо боюнча протоколубуздун кайталануучулугу жана бекемдигинен улам, биз техникалык стратегиябызды ичегинин өнүгүшү, регенерациясы же гомеостаз учурунда клеткалык сигнализациянын динамикасын изилдеген аудиторияга жайылтууга болот деп ойлойбуз. Мындан тышкары, биздин протокол Норовирус 8, Катуу курч респиратордук синдром коронавирусу 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 же Vibrio cholerae сыяктуу ар кандай жугуштуу агенттердин таасири астындагы инфекцияны изилдөө үчүн пайдалуу. Оорунун патологиясы жана патогенези боюнча аудиториялар да пайдалуу. Чиптеги ичеги микрофизиология системасын колдонуу узунунан биргелешип өстүрүүгө 10 жана андан кийин ашказан-ичеги (АШ) трактындагы кожоюндун коргонуусун, иммундук реакцияларды жана патогенге байланыштуу жаракаттарды калыбына келтирүүнү баалоого мүмкүндүк берет 11. Агып жаткан ичеги синдрому, целиакия оорусу, Крон оорусу, жаралуу колит, пухит же кыжырданган ичеги синдрому менен байланышкан башка АШ бузулууларын бейтаптын 3D ичеги эпителий катмарларын колдонуп 3D ичеги эпителий катмарлары даярдалганда симуляциялоого болот, бул ооруларга виллалардын атрофиясы, криптанын кыскарышы, былжыр челдин жабыркашы же эпителий тосмосунун бузулушу кирет. Биопсия же өзөк клеткаларынан алынган ичеги органоиддери 12,13. Оору чөйрөсүнүн жогорку татаалдыгын жакшыраак моделдөө үчүн, окурмандар 3D ичеги вилла-крипта микроархитектураларын камтыган моделдерге бейтаптын перифериялык канынын мононуклеардык клеткалары (ППМК) сыяктуу ооруга тиешелүү клетка түрлөрүн кошууну карап көрүшү мүмкүн. тканга мүнөздүү иммундук клеткалар, 5.
3D эпителий микроструктурасын кесүү процессисиз элестетип жана бекитүүгө мүмкүн болгондуктан, мейкиндик транскриптомика жана жогорку чечилиштеги же супер чечилиштеги сүрөткө тартуу боюнча иштеген көрүүчүлөр эпителий нишаларындагы гендер менен белоктордун мейкиндик-убакыт динамикасын картага түшүрүүгө кызыкдар болушу мүмкүн. Технологияга кызыгуу. Микробдук же иммундук стимулдарга жооп. Андан тышкары, ичеги гомеостазын координациялаган узунунан кеткен хост-микробиомдук кайчылаш байланыш 10, 14 3D ичегинин былжырлуу катмарында ар кандай микробдук түрлөрдү, микробдук жамааттарды же фекалдык микробиотаны, айрыкча ичегидеги чипте бирге өстүрүү аркылуу орнотулушу мүмкүн. платформада. Бул ыкма былжырлуу иммунологияны, гастроэнтерологияны, адамдын микробиомасын, културомиканы жана клиникалык микробиологияны изилдеген жана мурда лабораторияда өстүрүлбөгөн ичеги микробиотасын өстүрүүнү көздөгөн аудитория үчүн өзгөчө жагымдуу. Эгерде биздин in vitro морфогенез протоколубуз масштабдуу культура форматтарына, мисалы, базолатералдык бөлүктөрдү тынымсыз толтуруп турган 24, 96 же 384 кудук пластиналарындагы көп кудуктуу киргизүүлөргө ылайыкташтырылса, протоколду тамак-аш өнөр жайы үчүн фармацевтикалык, биомедициналык же жогорку өндүрүмдүүлүктөгү скрининг же валидация платформаларын иштеп чыгуучуларга да жайылтса болот. Принциптин далили катары биз жакында эле 24 кудуктуу пластина форматына масштабдалуучу мультиплекстүү жогорку өндүрүмдүүлүктөгү морфогенез системасынын мүмкүнчүлүгүн көрсөттүк. Мындан тышкары, чиптеги бир нече органдуу продуктылар коммерциялаштырылды16,17,18. Ошондуктан, биздин in vitro морфогенез ыкмабызды валидациялоону тездетип, көптөгөн изилдөө лабораториялары, өнөр жай же өкмөттүк жана жөнгө салуучу органдар тарабынан дары-дармектерди сыноо үчүн in vitro ичеги морфогенезинин клеткалык кайра программалоосун түшүнүү үчүн колдонулушу мүмкүн. же биотерапиялык дары-дармектердин сиңирилиши жана ташылышы ичеги морфогенез процессинин кайталануучулугун баалоо үчүн 3D ичеги суррогаттарын колдонуу менен же чиптеги органдын атайын же коммерциялык моделдерин колдонуу менен бааланган.
Ичеги эпителийинин морфогенезин изилдөө үчүн адамга тиешелүү чектелген сандагы эксперименталдык моделдер колдонулган, негизинен in vitro шартында 3D морфогенезди индукциялоо үчүн ишке ашырууга боло турган протоколдордун жоктугунан улам. Чындыгында, ичеги морфогенези жөнүндөгү учурдагы билимдин көпчүлүгү жаныбарларды изилдөөгө негизделген (мисалы, зебра балыгы20, чычкандар21 же тооктор22). Бирок, алар көп эмгекти жана чыгымдарды талап кылат, этикалык жактан күмөн жаратышы мүмкүн жана эң негизгиси, адамдын өнүгүү процесстерин так аныктай албайт. Бул моделдер көп тараптуу масштабдуу түрдө сыноо мүмкүнчүлүгү жагынан да өтө чектелүү. Ошондуктан, in vitro 3D ткань структураларын калыбына келтирүү боюнча биздин протокол in vivo жаныбарлардын моделдеринен, ошондой эле башка салттуу статикалык 2D клетка культурасынын моделдеринен ашып түшөт. Буга чейин айтылгандай, 3D эпителий структураларын колдонуу бизге ар кандай былжырлуу же иммундук стимулдарга жооп катары крипто-виллалардын огундагы дифференциацияланган клеткалардын мейкиндик локализациясын изилдөөгө мүмкүндүк берди. 3D эпителий катмарлары микробдук клеткалардын мейкиндик нишаларын түзүү үчүн кантип атаандашаарын жана кожоюн факторлоруна (мисалы, ички жана тышкы былжыр катмарлары, бөлүп чыгаруу) жооп катары экологиялык эволюцияны изилдөө үчүн мейкиндикти камсыздай алат. IgA жана микробго каршы пептиддер). Андан тышкары, 3D эпителий морфологиясы бизге ичеги микробиотасы өзүнүн жамааттарын кантип түзөрүн жана базальдык крипталардагы клеткалык уюмду жана өзөк клеткаларынын нишаларын калыптандыруучу микробдук метаболиттерди (мисалы, кыска чынжырлуу май кислоталарын) кантип синергетикалык түрдө өндүрөрүн түшүнүүгө мүмкүндүк берет. Бул өзгөчөлүктөрдү 3D эпителий катмарлары in vitro шартында түзүлгөндө гана көрсөтүүгө болот.
Ичеги эпителийинин 3D түзүлүштөрүн түзүү ыкмабыздан тышкары, бир нече in vitro ыкмалары бар. Ичеги органоиддик культурасы - бул белгилүү бир морфогендик шарттарда ичегинин өзөк клеткаларын өстүрүүгө негизделген заманбап ткань инженерия ыкмасы23,24,25. Бирок, транспорттук анализ же кожоюн-микробиом биргелешип маданияттоо үчүн 3D органоиддик моделдерди колдонуу көп учурда кыйынчылык жаратат, анткени ичегинин люмени органоиддин ичинде жайгашкан жана ошондуктан микробдук клеткалар же экзогендик антигендер сыяктуу люмендик компоненттерди киргизүү чектелүү. Органоиддик люмендерге жетүү микроинжекторду колдонуу менен жакшыртылышы мүмкүн,26,27 бирок бул ыкма инвазивдүү жана эмгекти көп талап кылат жана аны аткаруу үчүн атайын билимди талап кылат. Андан тышкары, статикалык шарттарда гидрогель каркастарында кармалган салттуу органоиддик культуралар in vivo активдүү биомеханиканы так чагылдырбайт.
Бир нече изилдөө топтору тарабынан колдонулган башка ыкмалар гель бетинде обочолонгон адамдын ичеги клеткаларын өстүрүү аркылуу ичеги эпителий түзүлүшүн туураган алдын ала структураланган 3D гидрогель каркастарын колдонушат. 3D басылган, микро-фрезерленген же литографиялык жактан жасалган калыптарды колдонуп, гидрогель каркастарын жасаңыз. Бул ыкма физиологиялык жактан тиешелүү морфогендик градиенттери бар in vitro обочолонгон эпителий клеткаларынын өзүн-өзү уюштурган жайгашуусун көрсөтөт, каркаска стромалдык клеткаларды кошуу менен жогорку аспект катышындагы эпителий түзүлүшүн жана строма-эпителий кайчылаштыгын түзөт. Бирок, алдын ала структураланган каркастардын мүнөзү өзүнөн-өзү пайда болгон морфогенетикалык процесстин өзүн көрсөтүүсүнө тоскоол болушу мүмкүн. Бул моделдер ошондой эле динамикалык люминалдык же интерстициалдык агымын камсыз кылбайт, ичеги клеткалары морфогенезден өтүп, физиологиялык функцияны алуу үчүн керектүү суюктуктун жылышуу стресси жок. Жакында жүргүзүлгөн дагы бир изилдөөдө микрофлюиддик платформадагы гидрогель каркастары колдонулган жана лазердик оюу ыкмаларын колдонуп, ичеги эпителий структураларын үлгү катары көрсөткөн. Чычкандардын ичеги органоиддери оюлган үлгүлөрдү ээрчип, ичеги түтүкчөлүү структураларын түзөт жана люминалдык суюктуктун агымы болушу мүмкүн. микрофлюидика модулунун жардамы менен кайталанган. Бирок, бул модель өзүнөн-өзү пайда болгон морфогенетикалык процесстерди көрсөтпөйт жана ичегилердин механобиологиялык кыймылдарын камтыбайт. Ошол эле топтун 3D басып чыгаруу ыкмалары өзүнөн-өзү пайда болгон морфогенетикалык процесстери бар миниатюралык ичеги түтүкчөлөрүн түзө алды. Түтүктүн ичиндеги ар кандай ичеги сегменттерин татаал жасоого карабастан, бул моделде люмендик суюктук агымы жана механикалык деформация да жок. Мындан тышкары, моделдин иштеши чектелүү болушу мүмкүн, айрыкча биобасып чыгаруу процесси аяктагандан кийин, эксперименталдык шарттарды же клеткалар аралык өз ара аракеттенүүнү бузгандан кийин. Анын ордуна, биздин сунушталган протокол ичегилердин өзүнөн-өзү пайда болгон морфогенезин, физиологиялык жактан тиешелүү жылышуу стрессин, ичегилердин кыймылдуулугун туураган биомеханиканы, көз карандысыз апикалдык жана базолатералдык бөлүмдөрдүн жеткиликтүүлүгүн жана модулдуктун татаал биологиялык микрочөйрөлөрүн кайра түзүүнү камсыз кылат. Ошондуктан, биздин in vitro 3D морфогенез протоколу учурдагы ыкмалардын кыйынчылыктарын жеңүү үчүн кошумча ыкманы камсыз кылышы мүмкүн.
Биздин протокол толугу менен 3D эпителий морфогенезине багытталган, культурада эпителий клеткалары гана бар жана мезенхималдык клеткалар, эндотелий клеткалары жана иммундук клеткалар сыяктуу башка айланадагы клеткалар жок. Буга чейин айтылгандай, биздин протоколдун өзөгү киргизилген чөйрөнүн базолатералдык тарабында бөлүнүп чыккан морфоген ингибиторлорун алып салуу менен эпителий морфогенезин индукциялоо болуп саналат. Ичегибиздин чиптеги жана гибриддик чиптеги бекем модулдук касиеттери толкундуу 3D эпителий катмарын кайра түзүүгө мүмкүндүк берсе да, эпителий-мезенхималдык өз ара аракеттенүүлөр 33,34, клеткадан тышкаркы матрица (ECM) чөкмөлөрү 35 жана биздин моделде базальдык крипталардагы өзөк клеткаларынын нишаларын жеткирген криптовиллус өзгөчөлүктөрү сыяктуу кошумча биологиялык татаалдыктар андан ары каралышы керек. Мезенхимадагы стромалдык клеткалар (мисалы, фибробласттар) ECM белокторун өндүрүүдө жана in vivo ичеги морфогенезин жөнгө салууда маанилүү ролду ойнойт 35,37,38. Биздин моделге мезенхималдык клеткаларды кошуу морфогенетикалык процессти жана клетканы күчөттү бекитүүнүн натыйжалуулугу. Эндотелий катмары (б.а., капиллярлар же лимфа тамырлары) ичеги микрочөйрөсүндө молекулярдык транспортту жөнгө салууда39 жана иммундук клеткаларды тартууда40 маанилүү ролду ойнойт. Андан тышкары, ткань моделдери көп органдардын өз ара аракеттенүүсүн көрсөтүү үчүн иштелип чыкканда, ткань моделдеринин ортосунда байланыштырылышы мүмкүн болгон кан тамыр компоненттери милдеттүү шарт болуп саналат. Ошондуктан, органдар деңгээлиндеги чечилиш менен физиологиялык өзгөчөлүктөрдү так моделдөө үчүн эндотелий клеткаларын кошуу керек болушу мүмкүн. Бейтаптан алынган иммундук клеткалар ошондой эле ичеги ооруларын туураган контекстте тубаса иммундук жоопторду, антиген презентациясын, тубаса адаптивдүү иммундук кайчылаш байланышты жана тканга мүнөздүү иммунитетти көрсөтүү үчүн абдан маанилүү.
Гибриддик чиптерди колдонуу "ичегидеги чипке" караганда жөнөкөй, анткени түзмөктүн орнотуусу жөнөкөй жана Transwell кошумчаларын колдонуу ичеги эпителийинин масштабдуу өстүрүлүшүнө мүмкүндүк берет. Бирок, полиэстер мембраналары бар коммерциялык жактан жеткиликтүү Transwell кошумчалары серпилгич эмес жана перисталтикалык кыймылдарды симуляциялай албайт. Андан тышкары, гибриддик чипке жайгаштырылган Transwell кошумчасынын апикалдык бөлүгү апикалдык жагында жылышуу күчүнө ээ болбой, кыймылсыз бойдон калган. Албетте, апикалдык бөлүмдөгү статикалык касиеттер гибриддик чиптерде бактериялардын узак мөөнөттүү бирге өстүрүлүшүнө сейрек мүмкүндүк берет. Гибриддик чиптерди колдонууда Transwell кошумчаларында 3D морфогенезди күчтүү түрдө индукциялай алсак да, физиологиялык жактан тиешелүү биомеханиканын жана апикалдык суюктук агымынын жетишсиздиги гибриддик чип платформаларынын потенциалдуу колдонмолор үчүн мүмкүнчүлүгүн чектеши мүмкүн.
Ичеги-чиптеги жана гибрид-чиптеги культуралардагы адамдын криптовилласынын огун толук масштабдуу реконструкциялоо толук аныктала элек. Морфогенез эпителий монокабатынан башталгандыктан, 3D микроархитектуралары сөзсүз түрдө in vivo крипталарга морфологиялык окшоштукту камсыз кылбайт. Микроинженердик 3D эпителийдеги базальдык крипто доменинин жанындагы көбөйүп жаткан клетка популяциясын мүнөздөгөнүбүзгө карабастан, крипта жана вилла аймактары так аныкталган эмес. Чиптеги жогорку жогорку каналдар микроинженердик эпителийдин бийиктигинин жогорулашына алып келгени менен, максималдуу бийиктик дагы эле ~300–400 мкм менен чектелген. Ичке жана жоон ичегилердеги адамдын ичеги крипталарынын чыныгы тереңдиги тиешелүүлүгүнө жараша ~135 мкм жана ~400 мкм, ал эми ичке ичегинин виллаларынын бийиктиги ~600 мкм41.
Сүрөткө тартуу көз карашынан алганда, 3D микроархитектуралардын in situ супер чечилиштеги сүрөткө тартуусу чиптеги ичеги менен чектелиши мүмкүн, анткени объективдүү линзадан эпителий катмарына чейинки талап кылынган жумушчу аралык бир нече миллиметрдин тегерегинде. Бул көйгөйдү чечүү үчүн алыскы объектив талап кылынышы мүмкүн. Андан тышкары, сүрөткө тартуу үлгүсүн даярдоо үчүн жука кесилиштерди жасоо PDMSтин жогорку ийкемдүүлүгүнөн улам кыйынчылык жаратат. Андан тышкары, чиптеги ичегилердин катмар-катмар микрофабрикациясы ар бир катмардын ортосунда туруктуу адгезияны камтыгандыктан, эпителий катмарынын үстүнкү түзүлүшүн изилдөө үчүн үстүнкү катмарды ачуу же алып салуу өтө кыйын. Мисалы, сканерлөөчү электрондук микроскопту (SEM) колдонуу менен.
PDMSтин гидрофобдук касиети гидрофобдук кичинекей молекулалар менен байланышкан микрофлюиддик изилдөөлөрдө чектөөчү фактор болуп келген, анткени PDMS мындай гидрофобдук молекулаларды спецификалык эмес түрдө адсорбциялай алат. PDMSке альтернативаларды башка полимердик материалдар менен карап көрүүгө болот. Же болбосо, гидрофобдук молекулалардын адсорбциясын минималдаштыруу үчүн PDMSтин беттик модификациясын (мисалы, липофильдүү материалдар 42 же поли(этиленгликоль) 43 менен каптоо) карап көрүүгө болот.
Акырында, биздин ыкма жогорку өндүрүмдүүлүктөгү скрининг же "баарына бир өлчөм туура келген" колдонуучуга ыңгайлуу эксперименталдык платформаны камсыз кылуу жагынан жакшы мүнөздөлгөн эмес. Учурдагы протокол ар бир микротүзүлүш үчүн шприц насосун талап кылат, ал CO2 инкубаторунда орун ээлейт жана ири масштабдуу эксперименттерге жол бербейт. Бул чектөөнү инновациялык культура форматтарынын масштабдуулугу менен бир топ жакшыртса болот (мисалы, базолатералдык чөйрөнү үзгүлтүксүз толуктоого жана алып салууга мүмкүндүк берген 24-чуңкурлуу, 96-чуңкурлуу же 384-чуңкурлуу тешиктүү кошумчалар).
In vitro шартында адамдын ичеги эпителийинин 3D морфогенезин индукциялоо үчүн, биз эки параллель микроканалды жана ортосунда ийкемдүү тешиктүү мембрананы камтыган микрофлюиддик чиптүү ичегинин аппаратын колдондук, бул люмен-капиллярдык интерфейсти түзүү үчүн. Ошондой эле, биз Transwell кошумчаларында өстүрүлгөн поляризацияланган эпителий катмарларынын астында үзгүлтүксүз базолатералдык агымды камсыз кылган бир каналдуу микрофлюиддик аппаратты (гибриддик чип) колдонууну көрсөтөбүз. Эки платформада тең ар кандай адамдын ичеги эпителий клеткаларынын морфогенезин базолатералдык бөлүктөн морфоген антагонисттерин алып салуу үчүн агымдын багытын манипуляциялоо менен көрсөтсө болот. Бүткүл эксперименталдык процедура (1-сүрөт) беш бөлүктөн турат: (i) ичеги чибин же Трансвеллдин кошумча гибриддик чибин микрофабрикациялоо (1-5-кадамдар; 1-кутуча), (ii) ичеги эпителий клеткаларын (Caco-2 клеткаларын) же адамдын ичеги органоиддерин даярдоо; 2-5-кутучалар), (iii) ичеги эпителий клеткаларын ичеги чиптерине же гибрид чиптерине өстүрүү (6-9-кадамдар), (iv) 3D эпителий микроструктурасын мүнөздөө үчүн in vitro шартында 3D морфогенезди индукциялоо (10-кадам) жана (v)). Акырында, эпителий морфогенезин мейкиндик, убакыт, шарттуу же процедуралык көзөмөл менен салыштыруу аркылуу in vitro морфогенезинин натыйжалуулугун текшерүү үчүн тиешелүү контролдук топ (төмөндө кененирээк талкууланат) иштелип чыккан.
Биз эки башка культура платформасын колдондук: түз каналдары же сызыктуу эмес айланма каналдары бар ичеги-чип, же 1-кутучада сүрөттөлгөндөй жасалган микрофлюиддик түзүлүштөгү Transwell (TW) кошумчаларын камтыган гибриддик чиптер жана 1-5-кадам. "Түзмөктү жасоо" бир чипти же гибриддик чипти жасоонун негизги кадамдарын көрсөтөт. "Адамдын ичеги эпителий клеткаларын өстүрүү" бул протоколдо колдонулган клетка булагын (Caco-2 же адамдын ичеги органоиддери) жана өстүрүү процедурасын түшүндүрөт. "In vitro морфогенез" Caco-2 же органоидден алынган эпителий клеткалары ичеги чипинде же гибриддик чиптин Трансвелл кошумчаларында өстүрүлгөн жалпы кадамдарды көрсөтөт, андан кийин 3D морфогенез индукцияланат жана мүнөздөлгөн эпителий түзүлүшү түзүлөт. Программанын кадамынын номери же кутучанын номери ар бир жебенин астында көрсөтүлөт. Тиркемеде ичеги эпителий катмарлары кантип колдонулушу мүмкүн экендиги жөнүндө мисалдар келтирилген, мисалы, клеткалардын дифференциациясын мүнөздөөдө, ичеги физиологиясын изилдөөдө, кожоюн-микробиом экосистемаларын түзүүдө жана ооруларды моделдөөдө. "Клетка" бөлүмүндөгү иммунофлуоресценция сүрөттөрү. "Дифференциация" ичеги чипинде пайда болгон 3D Caco-2 эпителий катмарында экспрессияланган ядролорду, F-актинди жана MUC2ди көрсөтөт. MUC2 сигнализациясы бокал клеткаларында жана былжырлуу беттерден бөлүнүп чыккан былжырда болот. Ичеги физиологиясындагы флуоресценттик сүрөттөрдө флуоресценттик буудайдын уругунун агглютининин колдонуп, сиал кислотасын жана N-ацетилглюкозамин калдыктарын боёо менен өндүрүлгөн былжыр көрсөтүлгөн. "Кожоюн-микроб биргелешип өстүрүү" бөлүмүндөгү эки бири-бирине дал келген сүрөттөрдө чипте ичегидеги өкүлчүлүктүү кожоюн-микробиом биргелешип өстүрүүлөрү көрсөтүлгөн. Сол панелде микроинженердик 3D Caco-2 эпителий клеткалары менен жашыл флуоресценттик белокту (GFP) экспрессиялаган E. coli биргелешип өстүрүлүшү көрсөтүлгөн. Оң панелде 3D Caco-2 эпителий клеткалары менен бирге өстүрүлгөн GFP E. coli локализациясы, андан кийин F-актин (кызыл) жана ядролор (көк) менен иммунофлуоресценциялык боёо көрсөтүлгөн. Ооруларды моделдөө бактериялык антигендер (мисалы, липополисахарид, физиологиялык кыйынчылыктар) менен ичеги сезгенүү чиптериндеги дени сак жана агып жаткан ичегини көрсөтөт. LPS) жана иммундук клеткалар (мисалы, PBMC; жашыл). Caco-2 клеткалары 3D эпителий катмарын түзүү үчүн өстүрүлгөн. Масштаб тилкеси, 50 мкм. Төмөнкү катардагы сүрөттөр: "Клеткалардын дифференциациясы" шилтемеден уруксат менен ылайыкташтырылган.2. Oxford University Press; 5-шилтемеден уруксат менен көчүрүлдү. NAS; "Хост-микроб биргелешип өстүрүү" 3-шилтемеден уруксат менен ылайыкташтырылган. NAS; "Ооруларды моделдөө" шилтемеден уруксат менен ылайыкташтырылган.5. NAS.
Ичеги-чиптеги жана гибриддик чиптер кремний калыптарынан жумшак литография1,44 аркылуу демонтаждалган жана SU-8 менен оймо-чиймеленген PDMS көчүрмөлөрүн колдонуу менен жасалган. Ар бир чиптеги микроканалдардын дизайны жылышуу стресси жана гидродинамикалык басым1,4,12 сыяктуу гидродинамиканы эске алуу менен аныкталат. Эки жанаша коюлган параллелдүү түз микроканалдардан турган баштапкы чиптеги ичеги-чип дизайны (Кеңейтилген маалыматтар 1a-сүрөт) суюктуктун көпкө сакталуу убактысын, сызыктуу эмес агым схемаларын жана өстүрүлгөн клеткалардын көп октуу деформациясын пайда кылуу үчүн жуп ийри микроканалдарды камтыган татаал чиптеги ичеги-чипке (Кеңейтилген маалыматтар 1b-сүрөт) айланган (2a–f-сүрөт). 12. Татаалыраак ичеги биомеханикасын кайра түзүү керек болгондо, татаал чиптеги ичеги-чиптерди тандоого болот. Биз ийилген ичеги-чип ошондой эле окшош убакыт аралыгында эпителийдин өсүшүнүн окшош деңгээли менен 3D морфогенезди күчтүү индукциялай турганын көрсөттүк. Ичеги-Чип, өстүрүлгөн клетканын түрүнө карабастан. Ошондуктан, 3D морфогенезди индукциялоо үчүн, сызыктуу жана татаал чиптеги ичеги конструкциялары бири-бирин алмаштырууга болот. SU-8 үлгүлөрү бар кремний калыптарында айыктырылган PDMS репликалары демонтаждалгандан кийин терс өзгөчөлүктөрдү берген (2a-сүрөт). Ичегини чипте жасоо үчүн, даярдалган жогорку PDMS катмары тешиктүү PDMS пленкасына ырааттуу түрдө байланыштырылган жана андан кийин корона тазалоочуну колдонуп кайтарылгыс байланыш аркылуу төмөнкү PDMS катмары менен тегизделген (2b–f-сүрөт). Гибриддик чиптерди жасоо үчүн, айыктырылган PDMS репликалары айнек слайддарга байланыштырылып, Трансвеллдин кошумчаларын батыра турган бир каналдуу микрофлюиддик түзүлүштөр түзүлгөн (2h-сүрөт жана кеңейтилген маалыматтар 2-сүрөт). Байланыштыруу процесси PDMS репликасынын жана айнектин беттерин кычкылтек плазмасы же корона дарылоо менен иштетүү аркылуу жүргүзүлөт. Силикон түтүккө бекитилген микрофабрикаланган түзүлүштү стерилдөөдөн кийин, түзүлүш ичеги эпителийинин 3D морфогенезин аткарууга даяр болгон (2g-сүрөт).
а, SU-8 үлгүсүндөгү кремний калыптарынан PDMS бөлүктөрүн даярдоонун схемалык иллюстрациясы. Катууланбаган PDMS эритмеси кремний калыпка куюлган (солдо), 60 °C температурада кургатылган (ортодо) жана кургатылган (оңдо). Кургатылган PDMS бөлүктөргө кесилип, андан ары колдонуу үчүн тазаланган.б, PDMS үстүнкү катмарын даярдоо үчүн колдонулган кремний калыптын сүрөтү.в, PDMS тешиктүү мембранасын жасоо үчүн колдонулган кремний калыптын сүрөтү.г, Жогорку жана төмөнкү PDMS компоненттеринин жана чогултулган чиптеги ичеги түзүлүшүнүн сүрөттөр сериясы.е, Жогорку, мембраналык жана астыңкы PDMS компоненттеринин тегиздөө схемасы. Ар бир катмар плазма же корона менен иштетүү аркылуу кайтарылгыс байланышат.ф, Кабатталган ийилген микроканалдар жана вакуум камералары бар жасалган ичеги-чиптеги түзүлүштүн схемасы.г, Микрофлюиддик клетка культурасы үчүн чиптеги ичеги-орнотуу. Силикон түтүк жана шприц менен чогултулган чиптеги жасалган ичеги капкактын үстүнө коюлган. Чиптик түзүлүш капкактын үстүнө коюлган. иштетүү үчүн 150 мм Петри табагы. Байланышуучу зат силикон түтүктү жабуу үчүн колдонулат.h, Гибриддик чиптерди жасоонун жана гибриддик чиптерди колдонуу менен 3D морфогенездин визуалдык сүрөттөрү. Ичеги эпителий клеткаларынын 2D монокабаттарын өстүрүү үчүн өз алдынча даярдалган Трансвелл кошумчалары ичегинин 3D морфогенезин индукциялоо үчүн гибриддик чипке киргизилген. Орточо Трансвелл кошумчасында орнотулган клетка катмарынын астындагы микроканалдар аркылуу перфузияланат. Масштаб тилкеси, 1 см.h Шилтемеден уруксат менен кайра басылган.4. Elsevier.
Бул протоколдо Caco-2 клетка линиясы жана ичеги органоиддери эпителий булактары катары колдонулган (3a-сүрөт). Эки типтеги клеткалар өз алдынча өстүрүлгөн (2-кутуча жана 5-кутуча) жана чиптеги ичегилердин же Трансвеллдин кошумчаларынын ECM менен капталган микроканалдарын себүү үчүн колдонулган. Клеткалар биригип турганда (колбаларда >95% камтуу), Т-колбалардагы үзгүлтүксүз өстүрүлгөн Caco-2 клеткалары (10 жана 50 өтмөктөрдүн ортосунда) трипсиндөө суюктугу менен диссоциацияланган клетка суспензияларын даярдоо үчүн чогултулат (2-кутуча). Ичеги биопсияларынан же хирургиялык резекциялардан алынган адамдын ичеги органоиддери структуралык микрочөйрөнү колдоо үчүн Matrigel каркас күмбөздөрүндө 24 кудуктуу плиталарда өстүрүлгөн. 3-кутучада сүрөттөлгөндөй даярдалган маанилүү морфогендерди (мисалы, Wnt, R-спондин жана Noggin) жана өсүү факторлорун камтыган чөйрө органоиддер диаметри ~500 мкмге чейин өскөнгө чейин ар бир эки күн сайын кошулуп турган. Толук өскөн органоиддер чогултулуп, диссоциацияланат. чиптеги ичегиге же Трансвеллдин кошумчаларына себүү үчүн бир клеткага бөлүнөт (5-кутуча). Буга чейин кабарлагандай, аны оорунун түрүнө жараша айырмалоого болот12,13 (мисалы, жаралуу колит, Крон оорусу, жоон ичеги рагы же кадимки донор), жабыркоо жерине (мисалы, жабыркоо же жабыркабаган аймак) жана тракттагы ашказан-ичеги жайгашуусуна (мисалы, он эки эли ичегинин, ачы ичегинин, илеумдун, сокур ичегинин, жоон ичеги же көтөн чучук). 5-кутучада биз ичке ичеги органоиддерине караганда морфогендердин жогорку концентрациясын талап кылган жоон ичеги органоиддерин (колоиддерди) өстүрүү үчүн оптималдаштырылган протоколду беребиз.
а, Ичеги чипинде ичеги морфогенезин индукциялоо үчүн жумуш агымы. Бул протоколдо 3D морфогенезди көрсөтүү үчүн Caco-2 адамдын ичеги эпителийи жана ичеги органоиддери колдонулат. Изоляцияланган эпителий клеткалары даярдалган ичеги-чиптеги түзүлүшкө себилген (чип даярдоо). Клеткалар 0-күнү (D0) PDMS тешиктүү мембранасына себилгенден (себилгенден) кийин, апикалдык (AP) агым башталат жана алгачкы 2 күн бою сакталат (агым, AP, D0-D2). Толук 2D монокабат пайда болгондо, циклдик созуу кыймылдары (созуу, агым, AP жана BL) менен бирге базолатералдык (BL) агым да башталат. Ичеги 3D морфогенези микрофлюиддик культуранын 5 күнүнөн кийин өзүнөн-өзү пайда болгон (морфогенез, D5). Фазалык контраст сүрөттөрү ар бир эксперименталдык кадамда же убакыт чекитинде Caco-2 клеткаларынын типтүү морфологиясын көрсөтөт (тилке диаграммасы, 100 мкм). Ичеги морфогенезинин тиешелүү каскаддарын көрсөткөн төрт схемалык диаграмма (жогорку оң жакта). Схемадагы үзүк жебелер суюктуктун агымынын багытын көрсөтөт.b, түзүлгөн 3D Caco-2 эпителийинин беттик топологиясын көрсөткөн SEM сүрөтү (сол жакта). Чоңойтулган аймакты белгилеген кошумча сүрөттө (ак үзүк кутуча) 3D Caco-2 катмарындагы регенерацияланган микровиллалар көрсөтүлгөн (оң жакта).c, түзүлгөн Caco-2 3D, клаудин (ZO-1, кызыл) жана F-актин (жашыл) жана ядролор (көк) деп белгиленген үзгүлтүксүз щетка чек ара мембраналарынын горизонталдуу фронталдык көрүнүшү. Ичеги чиптериндеги эпителий клеткаларынын иммунофлуоресценциялык конфокалдык визуализациясы. Ортоңку схемага багытталган жебелер ар бир конфокалдык көрүнүш үчүн фокалдык тегиздиктин жайгашкан жерин көрсөтөт.d, 3, 7, 9, 11 жана 13-күндөрү фазалык контраст микроскопиясы менен алынган чипте өстүрүлгөн органоиддердеги морфологиялык өзгөрүүлөрдүн убакыттык жүрүшү.Кошумча сүрөттө (жогорку оң жакта) берилген сүрөттүн жогорку чоңойтулгандыгы көрсөтүлгөн.e, 7-күнү тартылган кесимде ичегиде түзүлгөн органоиддик 3D эпителийдин DIC фотомикрографиясы.f, Ичеги чиптеринде 3 күн (солдо) жана эпителий катмарында 13 күн (ортодо) өстүрүлгөн өзөк клеткаларынын (LGR5; кызгылт көк), бокал клеткаларынын (MUC2; жашыл), F-актин (боз) жана ядролордун (көгүлтүр) маркерлерин көрсөткөн кабатталган иммунофлуоресценция сүрөттөрү. Ошондой эле MUC2 сигнализациясы жок LGR5 сигнализациясын баса белгилеген кеңейтилген маалыматтардын 3-сүрөтүн караңыз. Өстүрүүнүн 13-күнү плазмалык мембрананы CellMask боёгу (оңдо) менен боёо аркылуу чипте ичегиде орнотулган 3D органоиддик эпителийдин эпителий микроструктурасын (оңдо) көрсөткөн флуоресценция сүрөттөрү. Башкача көрсөтүлбөсө, масштаб тилкеси 50 мкм.b Шилтемеден уруксат менен кайра басылган.2. Oxford University Press; c Шилтемеден уруксат менен ылайыкташтырылган.2. Oxford University Press; e жана f шилтемеден уруксат менен ылайыкташтырылган.12 Creative Commons лицензиясы CC BY 4.0 астында.
Чиптеги ичегиде, ийгиликтүү ECM каптоо үчүн PDMS тешиктүү мембранасынын гидрофобдук бетин өзгөртүү керек. Бул протоколдо биз PDMS мембраналарынын гидрофобдугун өзгөртүү үчүн эки башка ыкманы колдонобуз. Caco-2 клеткаларын өстүрүү үчүн, PDMS бетинин гидрофобдугун азайтуу, ECMди каптоо жана Caco-2 клеткаларын PDMS мембранасына бекитүү үчүн UV/озон менен иштетүү менен бетти активдештирүү жетиштүү болгон. Бирок, органоиддик эпителийдин микрофлюиддик өстүрүүсү PDMS микроканалдарына полиэтиленимин (PEI) жана глутаральдегидди ырааттуу колдонуу менен ECM белокторун натыйжалуу чөктүрүү үчүн химиялык негиздеги беттик функционалдаштырууну талап кылат. Беттик модификациядан кийин, ECM белоктору функционалдаштырылган PDMS бетин жабуу үчүн чөктүрүлүп, андан кийин изоляцияланган органоиддик эпителийге киргизилген. Клеткалар бекитилгенден кийин, микрофлюиддик клетка өстүрүүсү клеткалар толук монокабат пайда болгонго чейин жогорку микроканалга чөйрөнү гана перфузиялоодон башталат, ал эми төмөнкү микроканал статикалык шарттарды сактайт. Беттик активдештирүү жана ECM каптоо үчүн бул оптималдаштырылган ыкма органоиддик эпителийдин жабышуусун индукциялоого мүмкүндүк берет. PDMS бетиндеги 3D морфогенез.
Трансвелл культуралары клеткаларды себүүдөн мурун ECM каптоону талап кылат; бирок, Трансвелл культуралары тешиктүү кошумчалардын бетин активдештирүү үчүн татаал алдын ала иштетүү кадамдарын талап кылбайт. Трансвелл кошумчаларында Caco-2 клеткаларын өстүрүү үчүн, тешиктүү кошумчаларда ECM каптоо диссоциацияланган Caco-2 клеткаларынын жабышуусун (<1 саат) жана тыгыз байланыш тосмосунун пайда болушун (<1-2 күн) тездетет. Трансвелл кошумчаларында органоиддерди өстүрүү үчүн, изоляцияланган органоиддер ECM менен капталган кошумчаларга себилип, мембрананын бетине бекитилет (<3 саат) жана органоиддер тосмонун бүтүндүгү менен толук монокабат пайда болгонго чейин сакталат. Трансвелл культуралары гибриддик чиптерди колдонбостон 24 кудуктуу пластиналарда жүргүзүлөт.
In vitro 3D морфогенезди суюктук агымын белгиленген эпителий катмарынын базолатералдык жагына колдонуу менен баштоого болот. Чиптеги ичегиде эпителий морфогенези чөйрө жогорку жана төмөнкү микроканалдарга перфузияланганда башталган (3a-сүрөт). Буга чейин айтылгандай, багытта бөлүнүп чыккан морфоген ингибиторлорун үзгүлтүксүз алып салуу үчүн төмөнкү (базолатералдык) бөлүмгө суюктук агымын киргизүү абдан маанилүү. Кесилген кабыкчаларга байланган клеткаларга жетиштүү азык заттарын жана сыворотканы берүү жана люменалдык жылышуу стрессин пайда кылуу үчүн, биз адатта чиптеги ичегиге кош агым колдонобуз. Гибриддик чиптерде эпителий монокабаттарын камтыган Трансвелл кошумчалары гибриддик чиптерге киргизилген. Андан кийин, чөйрө микроканал аркылуу кесилген Трансвелл кошумчасынын базолатералдык жагынын астына колдонулган. Ичеги морфогенези эки культуралык платформада тең базолатералдык агым башталгандан 3-5 күн өткөндөн кийин болгон.
Микроинженерияланган 3D эпителий катмарларынын морфологиялык өзгөчөлүктөрүн ар кандай сүрөткө тартуу ыкмаларын, анын ичинде фазалык контраст микроскопиясын, дифференциалдык интерференциялык контраст (DIC) микроскопиясын, SEMди же иммунофлуоресценциялык конфокалдык микроскопияны колдонуу менен талдоого болот (3 жана 4-сүрөттөр). 3D эпителий катмарларынын формасын жана чыгып турган жерин көзөмөлдөө үчүн фазалык контраст же DIC сүрөткө тартууну өстүрүү учурунда каалаган убакта оңой эле жасоого болот. PDMS жана полиэстер пленкаларынын оптикалык тунуктугунун аркасында, чиптеги ичегинин жана гибриддик чип платформаларынын экөө тең түзмөктү бөлүп же ажыратпастан реалдуу убакыт режиминде in situ сүрөткө тартууну камсыздай алат. Иммунофлуоресценциялык сүрөткө тартууну жүргүзүүдө (1, 3c, f жана 4b, c-сүрөттөр), клеткалар адатта 4% (салмак/көлөм) параформальдегид (PFA) менен фиксацияланат, андан кийин Triton X-100 жана 2% (салмак/көлөм)) уйдун кан сарысу альбумини (BSA) менен бекитилет. Клетканын түрүнө жараша ар кандай фиксаторлор, өткөргүчтөр жана бөгөттөөчү агенттер колдонулушу мүмкүн. колдонулган. Линияга көз каранды клетка же аймак маркерлерине багытталган баштапкы антителолор чипте in situ иммобилизацияланган клеткаларды белгилөө үчүн колдонулат, андан кийин экинчилик антителолор ядрону (мисалы, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) же F-актинди (мисалы, флуоресценттик белгиленген фаллоидин) бутага алган контр-боёк менен бирге колдонулат. Флуоресценцияга негизделген тирүү сүрөткө тартуу былжырдын пайда болушун (1-сүрөт, "Клетканын дифференциациясы" жана "Ичеги физиологиясы"), микробдук клеткалардын кокустук колонизациясын (1-сүрөт, "Кожоюн-микроб биргелешип өстүрүлүшү"), иммундук клеткалардын тартылышын (1-сүрөт, "Оорунун моделин түзүү") же 3D эпителий морфологиясынын контурларын (3c, f жана 4b,c сүрөттөрү) аныктоо үчүн in situ режиминде да жүргүзүлүшү мүмкүн. Шилтемеде сүрөттөлгөндөй, чиптеги ичегини жогорку катмарды төмөнкү микроканал катмарынан бөлүү үчүн өзгөртүүдө. 2-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, 3D эпителий морфологиясы, ошондой эле апикалдык щетканын чек арасындагы микровиллалар SEM аркылуу көрүүгө болот (3b-сүрөт). Дифференциация маркерлеринин экспрессиясын сандык PCR5 же бир клеткалуу РНК секвенирлөөсүн жүргүзүү менен баалоого болот. Бул учурда, ичеги чиптеринде же гибриддик чиптерде өстүрүлгөн эпителий клеткаларынын 3D катмарлары трипсиндөө жолу менен жыйналып, андан кийин молекулярдык же генетикалык анализ үчүн колдонулат.
а, Гибриддик чипте ичеги морфогенезин индукциялоо үчүн жумуш агымы. Бул протоколдо Caco-2 жана ичеги органоиддери гибриддик чип платформасында 3D морфогенезди көрсөтүү үчүн колдонулат. Диссоциацияланган эпителий клеткалары даярдалган Transwell кошумчаларына себилген (TW даярдоо; төмөндөгү сүрөттү караңыз). Transwell кошумчаларында клеткалар себилгенден (себилгенден) кийин жана полиэстер мембраналарына бекитилгенден кийин, бардык клеткалар статикалык шарттарда өстүрүлгөн (TW өстүрүлгөн). 7 күндөн кийин, эпителий клеткаларынын 2D монокабатын камтыган бир Transwell кошумчасы гибриддик чипке базолатералдык агым (Flow, BL) киргизүү үчүн интеграцияланган, бул акырында 3D эпителий катмарынын пайда болушуна алып келген (морфогенез). Ар бир эксперименталдык кадамда же убакыт чекитинде кадимки донордон (C103 сызыгы) көтөрүлүп бараткан жоон ичегиден алынган адам органынын эпителий клеткаларынын морфологиялык өзгөчөлүктөрүн көрсөткөн фазалык контраст микрографиялары. Жогорку катмарлардагы схемалар ар бир кадам үчүн эксперименталдык конфигурацияны көрсөтөт. б, Гибриддик чиптер (сол жактагы схема) ар кандай Zде жогорудан ылдый конфокалдык микроскопиялык көрүнүштөр менен органоиддик эпителий клеткаларынын 3D морфогенезине алып келиши мүмкүн. позициялар (жогорку, ортоңку жана төмөнкү; оң жактагы схеманы жана тиешелүү чекиттүү сызыктарды караңыз). морфологиялык мүнөздөмөлөрү айдан ачык көрсөтүлдү. F-актин (көгүлтүр), ядро ​​(боз).c, статикалык Трансвеллде (TW; ак үзүк кутучанын ичиндеги кыстарма) өстүрүлгөн органоиддерден алынган эпителий клеткаларынын флуоресценциялык конфокалдык микрографиялары (3D бурчтуу көрүнүш) жана гибриддик чипте (эң чоң толук кадр) 2D жана 3D морфологиясын салыштыруу. Эки өлчөмдүү вертикалдуу кесилген көрүнүштөрдүн жубу (жогорку оң бурчтагы кыстарма; "XZ") ошондой эле 2D жана 3D өзгөчөлүктөрүн көрсөтөт. Масштаб тилкеси, 100 мкм.c Шилтемеден уруксат менен кайра басылган.4. Elsevier.
Контролдук клеткаларды ошол эле клеткаларды (Caco-2 же ичеги органоиддик эпителий клеткалары) кадимки статикалык өстүрүү шарттарында эки өлчөмдүү монокабаттарга өстүрүү менен даярдоого болот. Белгилей кетчү нерсе, микроканалдардын көлөмдүк сыйымдуулугунун чектелүүлүгүнөн улам азык заттардын жетишсиздиги келип чыгышы мүмкүн (б.а. баштапкы ичеги-чип дизайнындагы үстүнкү каналда ~4 мкл). Ошондуктан, базолатералдык агымды колдонуудан мурун жана кийин эпителий морфологиясын да салыштырууга болот.
Жумшак литография процесси таза бөлмөдө жүргүзүлүшү керек. Чиптеги ар бир катмар (үстүнкү жана астыңкы катмарлар жана мембраналар) жана гибриддик чиптер үчүн микроканалдардын бийиктиги ар башка болгондуктан, ар кандай фотомаскалар колдонулуп, өзүнчө кремний пластиналарында жасалган. Чиптеги ичегинин үстүнкү жана астыңкы микроканалдарынын максаттуу бийиктиги тиешелүүлүгүнө жараша 500 мкм жана 200 мкм. Гибриддик чиптин каналдын максаттуу бийиктиги 200 мкм.
3 дюймдук кремний пластинасын ацетон кошулган идишке салыңыз. Тарелканы 30 секунд акырын айландырыңыз, андан кийин пластинаны абада кургатыңыз. Вафлини IPA кошулган тарелкага салып, андан кийин тазалоо үчүн тарелканы 30 секунд айландырыңыз.
Кремний пластинасынын бетинен органикалык калдыктарды максималдуу түрдө алып салуу үчүн пиранья эритмесин (суутек перекисинин жана концентрацияланган күкүрт кислотасынын аралашмасы, 1:3 (көлөм/көлөм)) кошумча катары колдонсо болот.
Пиранья эритмеси өтө коррозиялык жана жылуулукту пайда кылат. Кошумча коопсуздук чаралары зарыл. Калдыктарды жок кылуу үчүн эритмени муздатып, таза, кургак таштанды контейнерине салыңыз. Экинчи контейнерлерди колдонуңуз жана таштанды контейнерлерин туура белгилеңиз. Кененирээк процедуралар үчүн мекеменин коопсуздук көрсөтмөлөрүн аткарыңыз.
Вафлилерди 200°C ысык плитага 10 мүнөт коюп, суусуздандырыңыз. Кургатылгандан кийин, вафли муздатуу үчүн абада беш жолу чайкалды.
Тазаланган кремний пластинасынын ортосуна ~10 г фоторезист SU-8 2100 куюңуз. Фоторезистти пластинага бирдей жайуу үчүн пинцет колдонуңуз. Фоторезистти азыраак жабышчаак жана оңой жайуу үчүн пластинаны 65°C ысык плитага маал-маалы менен коюп туруңуз. Пластинаны түз эле ысык плитага койбоңуз.
SU-8 айлануучу каптоону иштетүү менен пластинага бирдей бөлүштүрүлдү. SU-8дин кирүүчү айлануусун 5–10 секундага 500 айн/мин ылдамдатуу менен жайылтуу үчүн программалаңыз. Негизги айланууну 1500 айн/мин ылдамдатуу менен 200 мкм калыңдыктагы үлгүгө коюңуз же 1200 айн/мин ылдамдатуу менен 300 айн/сек ылдамдатуу менен 250 мкм калыңдыкка жетиңиз (чиптеги ичегинин үстүнкү катмары үчүн 500 мкм бийиктикти жасаңыз; төмөндөгү "Критикалык кадамдарды" караңыз).
Негизги айлануу ылдамдыгын кремний пластинасындагы SU-8 үлгүсүнүн максаттуу калыңдыгына жараша тууралоого болот.
Чиптеги ичегинин үстүнкү катмары үчүн 500 мкм бийиктиктеги SU-8 үлгүлөрүн жасоо үчүн, бул кутучанын айлантуу каптоосу жана жумшак бышыруу кадамдары (7 жана 8-кадамдар) ырааттуу түрдө кайталанып, 250 мкм эки катмар алынган (9-кадамды караңыз). SU-8 калың катмарын ушул кутучанын 12-кадамында катмарлап, ультрафиолет нурлары менен бириктирүүгө болот, бул 500 мкм бийиктиктеги катмарды түзөт.
SU-8 менен капталган вафлилерди жумшак бышыруу үчүн, вафлилерди 65 °C температурадагы ысык тарелкага этияттык менен коюп, 5 мүнөт бышырыңыз, андан кийин жөндөөнү 95 °Cге коюп, дагы 40 мүнөт инкубациялаңыз.
Жогорку микроканалда SU-8 үлгүсүнүн 500 мкм бийиктигине жетүү үчүн, 250 мкм калыңдыктагы эки SU-8 катмарын түзүү үчүн 7 жана 8-кадамдарды кайталаңыз.
UV маскасын тегиздөөчү каражатты колдонуп, пластинанын экспозиция убактысын эсептөө үчүн өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык лампаны сынап көрүңүз. (экспозиция убактысы, мс) = (экспозиция дозасы, мДж/см2)/(лампанын кубаттуулугу, мВт/см2).
Экспозиция убактысын аныктагандан кийин, фотомасканы ультрафиолет маскасын тегиздөөчүнүн маска кармагычына коюп, фотомасканы SU-8 менен капталган пластинага коюңуз.
Фотомасканын басылган бетин ультрафиолет нурларынын дисперсиясын минималдаштыруу үчүн кремний пластинасынын SU-8 менен капталган тарабына түз коюңуз.
SU-8 менен капталган пластинаны жана фотомасканы алдын ала белгиленген экспозиция убактысына 260 мДж/см2 ультрафиолет нуруна тигинен жайгаштырыңыз (ушул кутучанын 10-кадамын караңыз).
Ультрафиолет нурларынан кийин, SU-8 менен капталган кремний пластиналары ар бир ысык плитада 65°C температурада 5 мүнөт жана 95°C температурада 15 мүнөт бышырылып, бийиктиги 200 мкм болгон үлгүлөр жасалган. Бийиктиги 500 мкм болгон үлгүлөрдү жасоо үчүн бышырылгандан кийинки убакытты 95°C температурада 30 мүнөткө чейин узартыңыз.
Иштеп чыгаруучу айнек идишке куюлат, ал эми бышырылган вафли идишке салынат. SU-8 иштеп чыгаруучусунун көлөмү айнек тарелканын көлөмүнө жараша өзгөрүшү мүмкүн. Ачыкка чыкпаган SU-8ди толугу менен алып салуу үчүн жетиштүү SU-8 иштеп чыгаруучусун колдонуңуз. Мисалы, 1 литр сыйымдуулуктагы 150 мм диаметрдеги айнек идиш колдонулганда, ~300 мл SU-8 иштеп чыгаруучусун колдонуңуз. Калыпты 25 мүнөт, маал-маалы менен акырын айландырып, иштеп чыгыңыз.
Иштелип чыккан калыпты ~10 мл жаңы иштеп чыгуучу эритме менен чайкаңыз, андан кийин эритмени пипетка менен чачып, IPA колдонуңуз.
Пластинаны плазма тазалагычка салып, кычкылтек плазмасына (атмосфералык газ, максаттуу басым 1 × 10−5 Торр, кубаттуулугу 125 Вт) 1,5 мүнөткө коюңуз.
Вафлиди ичинде айнек слайды бар вакуумдук эксикаторго салыңыз. Вафлилерди жана слайддарды жанаша коюуга болот. Эгерде вакуумдук эксикатор пластина менен бир нече катмарга бөлүнгөн болсо, слайддарды төмөнкү камерага, ал эми пластиналарды жогорку камерага салыңыз. Айнек слайдга 100 мкл трихлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силан эритмесин тамызып, силандаштыруу үчүн вакуумду колдонуңуз.
Тоңдурулган Caco-2 клеткалары салынган флаконду 37°C суу мончосунда эритип, андан кийин эриген клеткаларды 15 мл 37°C алдын ала жылытылган Caco-2 чөйрөсү бар T75 колбасына салыңыз.
Caco-2 клеткаларын ~90% кошулган жерде өткөрүү үчүн, алгач Caco-2 чөйрөсүн, PBSти жана 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТАны 37°C суу мончосунда жылытыңыз.
Вакуумдук аспирация аркылуу чөйрөнү сордуруңуз. Вакуумдук аспирацияны кайталап жана жаңы PBS кошуп, клеткаларды 5 мл жылуу PBS менен эки жолу жууңуз.