Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining advisearje wy jo in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Minsklik darmmorfogenese stelt krypt-villus-funksjes fan 3D-epitheelmikroarsjitektuer en romtlike organisaasje fêst. Dizze unike struktuer is nedich om darmhomeostase te behâlden troch de stamselnis yn 'e basale krypt te beskermjen tsjin eksogene mikrobiële antigenen en har metaboliten. Derneist presintearje darmvilli en sekretearjend slym funksjoneel differinsjearre epitheelzellen mei in beskermjende barriêre op it darmmucosale oerflak. Dêrom is it opnij oanmeitsjen fan 3D-epitheelstrukturen krúsjaal foar de konstruksje fan in vitro darmmodellen. Benammen de organyske mimetyske darm-op-in-chip kin spontane 3D-morfogenese fan it darmepitheel ynducearje mei ferbettere fysiologyske funksjes en biomechanika. Hjir leverje wy in reprodusearber protokol om darmmorfogenese yn 'e darm robúst te ynducearjen op in mikrofluidyske chip, lykas yn in Transwell-ynbêde hybride chip. Wy beskriuwe detaillearre metoaden foar apparaatfabrikaasje, kultivaasje fan Caco-2 of darmorganoïde epitheelzellen yn konvinsjonele ynstellings, lykas op in mikrofluidysk platfoarm, ynduksje fan 3D-morfogenese en karakterisaasje. fan fêststelde 3D-epithelia mei meardere ôfbyldingsmodaliteiten. Dit protokol berikt regeneraasje fan funksjonele darmmikroarsjitektuer troch basolaterale floeistofstream te kontrolearjen foar 5 dagen. Us in vitro morfogenese-metoade brûkt fysiologysk relevante skuorspanning en meganyske beweging en fereasket gjin komplekse seltechnyk of manipulaasje, dy't oare besteande techniken kinne oertreffe. Wy sjogge foar ús dat ús foarstelde protokol brede ymplikaasjes kin hawwe foar de biomedyske ûndersyksmienskip, en in metoade kin leverje om 3D-darmepitheliale lagen yn vitro te regenerearjen foar biomedyske, klinyske en farmaseutyske tapassingen.
Eksperiminten litte sjen dat Caco-2-sellen fan it intestinale epitheliale systeem, kultivearre yn darm-op-in-chip1,2,3,4,5 of bilayer mikrofluidyske apparaten6,7, spontane 3D-morfogenese yn vitro kinne ûndergean sûnder in dúdlik begryp fan it ûnderlizzende meganisme. Yn ús resinte stúdzje hawwe wy fûn dat it fuortheljen fan basolateraal útskieden morfogeen-antagonisten út kultuerapparaten needsaaklik en foldwaande is om 3D-epitheliale morfogenese yn vitro te indusearjen, wat oantoand is troch Caco-2 en troch pasjinten ôflaat intestinale organoïden. Epitheelzellen waarden validearre. Yn dizze stúdzje hawwe wy ús spesifyk rjochte op 'e selproduksje en konsintraasjeferdieling fan in krêftige Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), yn darm-op-in-chip en modifisearre mikrofluidyske apparaten mei Transwell-ynfoegsels, neamd "Hybrid Chip". Wy demonstrearje dat tafoeging fan eksogene Wnt-antagonisten (lykas DKK-1, Wnt-repressor 1, sekretearre frizzled-related protein 1, of Soggy-1) oan 'e darm op' e chip morfogenese remt of de foarstrukturearre 3D-epitheellaach fersteurt, wat suggerearret dat antagonistyske stress tidens kultuer ferantwurdlik is foar intestinale morfogenese yn vitro. Dêrom is in praktyske oanpak om robuste morfogenese by de epitheelinterface te berikken it ferwiderjen of minimaal behâlden fan 'e nivo's fan Wnt-antagonisten yn it basolaterale kompartimint troch aktyf spoelen (bygelyks yn darm-op-in-chip of hybride-op-in-chip platfoarms) of diffúzje. Basolaterale media (bygelyks fan Transwell-ynfoegsels yn grutte basolaterale reservoirs yn putten).
Yn dit protokol leverje wy in detaillearre metoade foar it meitsjen fan darm-op-in-chip-mikroapparaten en Transwell-ynfoegjebere hybride chips (stappen 1-5) om intestinale epitheelzellen te kultivearjen op polydimethylsiloxaan (PDMS)-basearre poreuze membranen (stappen 6A, 7A, 8, 9) of polyestermembranen fan Transwell-ynfoegsels (stappen 6B, 7B, 8, 9) en ynducearre 3D-morfogenese yn vitro (stap 10). Wy identifisearren ek sellulêre en molekulêre skaaimerken dy't oanjaan fan weefselspesifike histogenese en lineage-ôfhinklike sellulêre differinsjaasje troch meardere ôfbyldingsmodaliteiten ta te passen (stappen 11-24). Wy ynducearje morfogenese mei minsklike intestinale epitheelzellen, lykas Caco-2 of intestinale organoïden, yn twa kultuerformaten mei technyske details, ynklusyf oerflakmodifikaasje fan poreuze membranen, it meitsjen fan 2D-monolagen, en intestinale biogemyske en reproduksje fan 'e biomechanyske mikroomjouwing yn vitro. Om 3D-morfogenese te indusearjen út 2D-epitheelmonolagen, hawwe wy morfogeen fuorthelle. antagonisten yn beide kultivearre foarmen troch it medium yn it basolaterale kompartimint fan 'e kultuer te streamen. Uteinlik leverje wy in foarstelling fan it nut fan in regenerearbere 3D-epitheellaach dy't brûkt wurde kin om morfogeen-ôfhinklike epitheellaachgroei, longitudinale gasthear-mikrobioom-ko-kultueren, patogeenynfeksje, ûntstekkingsblessuere, epitheellale barriêredysfunksje en probiotika-basearre terapyen Foarbyld. ynfloeden.
Us protokol kin nuttich wêze foar in breed skala oan wittenskippers yn basis (bygelyks, intestinale mucosale biology, stamselbiology, en ûntwikkelingsbiology) en tapast ûndersyk (bygelyks, preklinyske medisyntests, syktemodellering, weefseltechnyk, en gastroenterology) brede ynfloed. Fanwegen de reprodusearberens en robuustheid fan ús protokol om 3D-morfogenese fan it intestinale epithelium yn vitro te indusearjen, sjogge wy dat ús technyske strategy ferspraat wurde kin oan publyk dat de dynamyk fan selsignalisaasje bestudearret tidens intestinale ûntwikkeling, regeneraasje of homeostase. Derneist is ús protokol nuttich foar it ûndersiikjen fan ynfeksje ûnder ferskate ynfeksjeuze aginten lykas Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 of Vibrio cholerae. Publyk fan syktepatology en patogenese is ek nuttich. It gebrûk fan in on-chip darmmikrofysiologysysteem kin longitudinale ko-kultuer 10 en neifolgjende beoardieling fan gasthearferdigening, ymmúnreaksjes en patogeen-relatearre ferwûningsreparaasje yn it gastrointestinale (GI) trakt 11 mooglik meitsje. Oare GI-steurnissen dy't ferbûn binne mei lekkende darmsyndroom, celiac sykte, sykte fan Crohn, ulcerative colitis, pouchitis, of irritable bowel syndrome kinne simulearre wurde as 3D intestinale epitheellagen wurde taret mei de 3D intestinale epitheellagen fan 'e pasjint, dizze sykten omfetsje villous atrofy, kryptferkoarting, mucosale skea, of beheinde epitheellagen. Biopsie of stamsel-ôflaat intestinale organoïden 12,13. Om de hegere kompleksiteit fan 'e sykteomjouwing better te modellearjen, kinne lêzers beskôgje om sykte-relevante seltypen, lykas perifeare bloedmononukleêre sellen (PBMC's) fan pasjinten, ta te foegjen oan modellen dy't 3D intestinale villus-krypt mikroarsjitektueren befetsje. weefselspesifike ymmúnsellen, 5.
Omdat 3D-epitheelmikrostruktuer fêstlein en fisualisearre wurde kin sûnder it seksjeproses, kinne sjoggers dy't wurkje oan romtlike transkriptomika en ôfbylding mei hege resolúsje of superresolúsje ynteressearre wêze yn ús kartering fan 'e romtlike en tydlike dynamyk fan genen en proteïnen op epitheelnissen. Ynteressearre yn technology. Reaksje op mikrobiële of ymmúnstimuli. Fierder kin longitudinale gasthear-mikrobioom-krústalk 10, 14 dy't darmhomeostase koördinearje, fêststeld wurde yn 'e 3D-darmmucosale laach troch it mei-kultivearjen fan ferskate mikrobiële soarten, mikrobiële mienskippen of fekale mikrobiota, foaral yn 'e darm-op-in-chip. yn it platfoarm. Dizze oanpak is benammen oantreklik foar publyk dat mucosale immunology, gastroenterology, minsklik mikrobioom, kulturomika en klinyske mikrobiology bestudearret en dy't earder net-kultivearre darmmikrobiota yn it laboratoarium wolle kultivearje. As ús in vitro morfogeneseprotokol oanpast wurde kin oan skalberbere kultuerformaten, lykas multiwell-ynserts yn platen mei 24, 96 of 384 putten dy't basolaterale kompartiminten kontinu oanfolje, kin it protokol ek ferspraat wurde oan dyjingen dy't farmaseutyske, biomedyske of hege-trochput screening- of falidaasjeplatfoarms ûntwikkelje foar de fiedingssektor. As in proof-of-principe hawwe wy koartlyn de mooglikheid demonstrearre fan in multiplex hege-trochput morfogenesesysteem dat skalberber is nei in plaatformaat mei 24 putten. Derneist binne meardere organ-on-a-chip-produkten kommersjalisearre16,17,18. Dêrom kin de falidaasje fan ús in vitro morfogenesemetoade fersneld wurde en potinsjeel oannaam wurde troch in protte ûndersykslaboratoaria, yndustry as oerheid en regeljouwingsynstânsjes om sellulêre herprogrammearring fan in vitro darmmorfogenese op it transkriptomyske nivo te begripen om medisinen of bioterapeutika te testen. De opname en It transport fan medisynkandidaten waard beoardiele mei 3D-darmsurrogaten of mei oanpaste of kommersjele organ-op-a-chip-modellen om de reprodusearberens fan it darmmorfogeneseproses te beoardieljen.
In beheind oantal minsklik relevante eksperimintele modellen binne brûkt om intestinale epitheliale morfogenese te bestudearjen, benammen fanwegen it gebrek oan ymplementearbere protokollen om 3D-morfogenese yn vitro te indusearjen. Eins is in protte fan 'e hjoeddeistige kennis oer darmmorfogenese basearre op bistestúdzjes (bygelyks sebrafisken20, mûzen21 of hinnen22). Se binne lykwols arbeids- en kostenyntinsyf, kinne etysk twifelich wêze, en it wichtichste, bepale minsklike ûntwikkelingsprosessen net presys. Dizze modellen binne ek tige beheind yn har fermogen om op in mearfâldige skalberbere manier te testen. Dêrom presteart ús protokol foar it regenerearjen fan 3D-weefselstrukturen yn vitro better as in vivo-diermodellen, lykas oare tradisjonele statyske 2D-selkultuermodellen. Lykas earder beskreaun, liet it brûken fan 3D-epitheliale strukturen ús de romtlike lokalisaasje fan differinsjearre sellen yn 'e krypt-villus-as ûndersykje yn reaksje op ferskate mucosale of ymmúnstimuli. 3D-epitheliale lagen kinne in romte biede om te bestudearjen hoe't mikrobiële sellen konkurrearje om romtlike nissen te foarmjen en ekologyske evolúsje yn reaksje op gasthearfaktoaren (bygelyks binnenste versus bûtenste mukuslagen, útskieding fan IgA en antimikrobiële peptiden). Fierder kin 3D-epitheelmorfology ús tastean te begripen hoe't de darmflora syn mienskippen strukturearret en synergistysk mikrobiële metaboliten produseart (bygelyks koartekettige fettsoeren) dy't sellulêre organisaasje en stamselnissen yn 'e basale krypten foarmje. Dizze funksjes kinne allinich oantoand wurde as 3D-epitheellagen yn vitro fêststeld wurde.
Neist ús metoade foar it meitsjen fan 3D-intestinale epitheliale struktueren, binne d'r ferskate in vitro-metoaden. Intestinale organoïde kultuer is in state-of-the-art tissue engineering technyk basearre op it kultivearjen fan intestinale stamsellen ûnder spesifike morfogeenomstannichheden23,24,25. It gebrûk fan 3D-organoïde modellen foar transportanalyse of gasthear-mikrobioom ko-kultueren is lykwols faak in útdaging, om't it intestinale lumen ynsletten is yn it organoïde en dêrom de ynfiering fan luminale komponinten lykas mikrobiële sellen of eksogene antigenen beheind is. Tagong ta organoïde lumens kin ferbettere wurde mei in mikro-ynjektor,26,27 mar dizze metoade is invasyf en arbeidsyntinsyf en fereasket spesjalisearre kennis om út te fieren. Fierder reflektearje tradisjonele organoïde kultueren dy't ûnder statyske omstannichheden yn hydrogel-steigers ûnderhâlden wurde, de aktive in vivo biomeganika net akkuraat.
Oare oanpakken dy't brûkt wurde troch ferskate ûndersyksgroepen brûke foarstrukturearre 3D-hydrogel-steigers om de darmepitelstruktuer te imitearjen troch isolearre minsklike darmsellen op it geloerflak te kultivearjen. Meitsje hydrogel-steigers mei 3D-printe, mikro-frezen of litografysk makke mallen. Dizze metoade lit de selsorganisearre rangskikking fan isolearre epitheelzellen yn vitro sjen mei fysiologysk relevante morfogeengradiënten, wêrtroch in epitheelstruktuer mei hege aspektferhâlding en stroma-epitheel-oerspraak ûntstiet troch stromale sellen yn 'e steiger op te nimmen. De aard fan foarstrukturearre steigers kin lykwols de werjefte fan it spontane morfogenetyske proses sels foarkomme. Dizze modellen leverje ek gjin dynamyske luminale of ynterstitiële stream, en misse de floeistofskuorspanning dy't darmsellen nedich binne om morfogenese te ûndergean en fysiologyske funksje te krijen. In oare resinte stúdzje brûkte hydrogel-steigers yn in mikrofluidysk platfoarm en patroanearre darmepitheelstrukturen mei laser-etstechniken. Mûsdarmorganoïden folgje etste patroanen om darmbuisstrukturen te foarmjen, en intraluminale floeistofstream kin opnij wurde werjûn mei in mikrofluidika-module. Dit model toant lykwols gjin spontane morfogenetyske prosessen en omfettet ek gjin meganobiologyske bewegingen yn 'e darm. 3D-printtechniken fan deselde groep wiene yn steat om miniatuer darmbuizen te meitsjen mei spontane morfogenetyske prosessen. Nettsjinsteande de komplekse fabrikaazje fan ferskate darmsegmenten binnen de buis, mist dit model ek luminale floeistofstream en meganyske deformaasje. Derneist kin de operabiliteit fan it model beheind wêze, foaral nei't it bioprintproses foltôge is, wêrtroch eksperimintele omstannichheden of sel-nei-sel-ynteraksjes fersteurd wurde. Ynstee dêrfan leveret ús foarstelde protokol spontane darmmorfogenese, fysiologysk relevante skuorspanning, biomechanika dy't darmmotiliteit imitearje, tagonklikens fan ûnôfhinklike apikale en basolaterale kompartiminten, en it opnij meitsjen fan komplekse biologyske mikroomjouwings fan modulariteit. Dêrom kin ús in vitro 3D-morfogeneseprotokol in komplementêre oanpak leverje om de útdagings fan besteande metoaden te oerwinnen.
Us protokol is folslein rjochte op 3D epitheliale morfogenese, mei allinich epitheliale sellen yn kultuer en gjin oare soarten omlizzende sellen lykas mesenchymale sellen, endotheelzellen en ymmúnsellen. Lykas earder beskreaun, is de kearn fan ús protokol de ynduksje fan epitheliale morfogenese troch it fuortheljen fan morfogeeninhibitoren dy't ôfskieden wurde oan 'e basolaterale kant fan it ynfierde medium. Wylst de robuuste modulariteit fan ús darm-op-in-chip en hybride-op-in-chip ús tastean om de golvende 3D epitheliale laach opnij te meitsjen, moatte ekstra biologyske kompleksiteiten lykas epitheliaal-mesenchymale ynteraksjes33,34, ekstrasellulêre Matrix (ECM) ôfsetting 35 en, yn ús model, krypt-villusfunksjes dy't stamselnissen yn basale krypten oerbringe, fierder beskôge wurde. Stromale sellen (bygelyks fibroblasten) yn it mesenchym spylje in wichtige rol yn 'e produksje fan ECM-proteïnen en regeling fan intestinale morfogenese yn vivo35,37,38. De tafoeging fan mesenchymale sellen oan ús model ferbettere it morfogenetyske proses en de effisjinsje fan selhechting. De endotheellaach (d.w.s. kapillaren of lymfeklieren) spilet in wichtige rol by it regeljen fan molekulêr transport39 en ymmúnselrekrutearring40 yn 'e darmmikroomjouwing. Fierder binne vaskulêre komponinten dy't ferbûn wurde kinne tusken weefselmodellen in betingst as weefselmodellen ûntworpen binne om ynteraksjes tusken meardere organen te demonstrearjen. Dêrom moatte endotheelzellen miskien wurde opnommen om krekter fysiologyske skaaimerken te modellearjen mei resolúsje op oargelnivo. Ymmúnsellen ôflaat fan pasjinten binne ek essensjeel foar it werjaan fan oanberne ymmúnreaksjes, antigeenpresintaasje, oanberne adaptive ymmún-oerspraak en weefselspesifike ymmúniteit yn 'e kontekst fan it neimakken fan darmsykte.
It gebrûk fan hybride chips is ienfâldiger as darm-op-in-chip, om't de apparaatynstelling ienfâldiger is en it gebrûk fan Transwell-ynfoegsels in skalbere kultuer fan darm-epitheel mooglik makket. Kommersjeel beskikbere Transwell-ynfoegsels mei polyestermembranen binne lykwols net elastysk en kinne se gjin peristaltyske bewegingen simulearje. Fierder bleau it apikale kompartimint fan 'e Transwell-ynfoegsel pleatst yn' e hybride chip stasjonêr sûnder skuorspanning oan 'e apikale kant. Dúdlik meitsje de statyske eigenskippen yn it apikale kompartimint selden langduorjende baktearjele ko-kultuer mooglik yn hybride chips. Wylst wy robúst 3D-morfogenese kinne indusearje yn Transwell-ynfoegsels by it brûken fan hybride chips, kin it tekoart oan fysiologysk relevante biomeganika en apikale floeistofstream de mooglikheid fan hybride chipplatfoarms foar potinsjele tapassingen beheine.
Folslein skaalrekonstruksjes fan 'e minsklike krypt-villus-as yn darm-op-in-chip en hybride-op-in-chip-kulturen binne net folslein fêststeld. Om't morfogenese begjint fanút in epitheliale monolaach, jouwe 3D-mikroarsjitektueren net needsaaklik morfologyske oerienkomst mei krypten yn vivo. Hoewol wy de proliferearjende selpopulaasje tichtby it basale kryptdomein yn it mikro-engineered 3D-epitheel karakterisearre hawwe, wiene de krypt- en villusregio's net dúdlik ôfbakene. Hoewol hegere boppeste kanalen op 'e chip liede ta ferhege hichte fan it mikro-engineered epithelium, is de maksimale hichte noch beheind ta ~300-400 µm. De werklike djipte fan minsklike darmkrypten yn 'e tinne en dikke darm is respektivelik ~135 µm en ~400 µm, en de hichte fan 'e tinne darmvilli is ~600 µm41.
Fanút in ôfbyldingseachpunt kin in situ superresolúsje-ôfbylding fan 3D-mikroarsjitektueren beheind wêze ta de darm op in chip, om't de fereaske wurkôfstân fan 'e objektivlens oant de epitheallaach yn 'e oarder fan in pear millimeter is. Om dit probleem te oerwinnen kin in fier objektyf nedich wêze. Fierder is it meitsjen fan tinne seksjes foar de tarieding fan ôfbyldingseksimplaren in útdaging fanwegen de hege elastisiteit fan PDMS. Fierder, om't de laach-foar-laach mikrofabrikaasje fan 'e darm op in chip permaninte adhesion tusken elke laach omfettet, is it ekstreem útdaagjend om de boppeste laach te iepenjen of te ferwiderjen om de oerflakstruktuer fan 'e epitheallaach te ûndersykjen. Bygelyks troch in scanning elektronenmikroskoop (SEM) te brûken.
De hydrofobisiteit fan PDMS is in beheinde faktor west yn stúdzjes basearre op mikrofluidyk dy't te krijen hawwe mei hydrofobe lytse molekulen, om't PDMS sokke hydrofobe molekulen net-spesifyk kin adsorbearje. Alternativen foar PDMS kinne wurde beskôge mei oare polymere materialen. As alternatyf kin oerflakmodifikaasje fan PDMS (bygelyks, coating mei lipofile materialen 42 of poly(ethyleenglycol) 43) wurde beskôge om adsorpsje fan hydrofobe molekulen te minimalisearjen.
Uteinlik is ús metoade net goed karakterisearre yn termen fan it leverjen fan in hege-trochput screening of in "one-size-fits-all" brûkerfreonlik eksperiminteel platfoarm. It hjoeddeistige protokol fereasket in spuitpomp per mikroapparaat, wat romte ynnimt yn in CO2-ynkubator en grutskalige eksperiminten foarkomt. Dizze beheining kin signifikant ferbettere wurde troch de skalberens fan ynnovative kultuerformaten (bygelyks poreuze ynfoegsels mei 24 putten, 96 putten of 384 putten dy't trochgeande oanfolling en ferwidering fan basolaterale media mooglik meitsje).
Om 3D-morfogenese fan minsklik darmepitheel yn vitro te indusearjen, hawwe wy in mikrofluidysk chip-darmapparaat brûkt mei twa parallelle mikrokanalen en in elastysk poreus membraan dertusken om in lumen-kapillêre ynterface te meitsjen. Wy demonstrearje ek it gebrûk fan in ienkanaals mikrofluidysk apparaat (in hybride chip) dat trochgeande basolaterale stream leveret ûnder polarisearre epitheellagen dy't groeid binne op Transwell-ynfoegsels. Yn beide platfoarms kin morfogenese fan ferskate minsklike darmepitheelsellen demonstrearre wurde troch rjochtingsmanipulaasje fan stream ta te passen om morfogeenantagonisten út it basolaterale kompartimint te ferwiderjen. De heule eksperimintele proseduere (figuer 1) bestiet út fiif dielen: (i) mikrofabrikaasje fan 'e darmchip of Transwell-ynfoegbere hybride chip (stappen 1-5; Fak 1), (ii) tarieding fan darmepitheelsellen (Caco-2-sellen) of minsklike darmorganoïden; fakjes 2-5), (iii) kultuer fan intestinale epitheelzellen op intestinale chips of hybride chips (stappen 6-9), (iv) ynduksje fan 3D-morfogenese yn vitro (stap 10) en (v)) om de 3D-epitheelmikrostruktuer te karakterisearjen (stappen 11-24). Uteinlik waard in passende kontrôlegroep (hjirûnder fierder besprutsen) ûntworpen om de effektiviteit fan in vitro-morfogenese te falidearjen troch epitheelmorfogenese te fergelykjen mei romtlike, tydlike, betingste of proseduerele kontrôles.
Wy brûkten twa ferskillende kultuerplatfoarms: darm-op-in-chip mei rjochte kanalen of net-lineaire yngewikkelde kanalen, of hybride chips mei Transwell (TW) ynfoegsels yn in mikrofluidysk apparaat, makke lykas beskreaun yn Fak 1, en stap 1-5. "Apparaatfabrikaasje" lit de wichtichste stappen sjen by it meitsjen fan in inkele chip of in hybride chip. "Kultuer fan minsklike darm-epiteelzellen" ferklearret de selboarne (Caco-2 of minsklike darmorganoïden) en kultuerproseduere dy't yn dit protokol brûkt wurdt. "In vitro morfogenese" lit de algemiene stappen sjen wêryn Caco-2 of organoïde-ôflaatte epitheelzellen wurde kultivearre op in darmchip of op Transwell-ynfoegsels fan in hybride chip, folge troch ynduksje fan 3D-morfogenese en de foarming fan in karakterisearre epitheelstruktuer. It programmastapnûmer of faknûmer wurdt ûnder elke pylk werjûn. De applikaasje jout foarbylden fan hoe't fêststelde darm-epiteellagen kinne wurde brûkt, bygelyks yn seldifferinsjaasjekarakterisaasje, darmfysiologystúdzjes, fêstiging fan gasthear-mikrobioom-ekosystemen en syktemodellering. Immunofluoreszinsje Ofbyldings yn "Seldifferinsjaasje" dy't kearnen, F-actine en MUC2 sjen litte dy't útdrukt binne yn 'e 3D Caco-2 epitheellaach generearre op 'e darmchip. MUC2-sinjalearring is oanwêzich yn bekerzellen en slym ôfskieden fan slymvliesoerflakken. Fluoreszinte ôfbyldings yn Gut Physiology litte slym sjen produsearre troch kleuring foar siaalsoer en N-acetylglucosamine-residuen mei fluoreszinte weetkiem-agglutinine. De twa oerlappende ôfbyldings yn "Host-Microbe Co-Cultures" litte fertsjintwurdigjende gasthear-mikrobioom-ko-kultueren sjen yn 'e darm op in chip. It linker paniel lit de ko-kultuer sjen fan E. coli dy't grien fluoreszearjend proteïne (GFP) útdrukt mei mikro-engineered 3D Caco-2 epitheelsellen. It rjochter paniel lit de lokalisaasje sjen fan GFP E. coli dy't mei-kultuer makke is mei 3D Caco-2 epitheelsellen, folge troch immunofluoreszinsjekleuring mei F-actine (read) en kearnen (blau). Syktemodellering yllustrearret sûne versus lekkende darm yn darmûntstekkingschips ûnder fysiologyske útdaging mei baktearjele antigenen (bygelyks, lipopolysaccharide, LPS) en ymmúnsellen (bygelyks PBMC; grien). Caco-2-sellen waarden kultivearre om in 3D-epitheellaach te meitsjen. Skaalbalke, 50 µm. Ofbyldings yn ûnderste rige: "Differinsjaasje fan sellen" oanpast mei tastimming fan referinsje.2. Oxford University Press; Werjûn mei tastimming fan Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" oanpast mei tastimming fan referinsje.3. NAS; "Disease Modeling" oanpast mei tastimming fan referinsje.5. NAS.
Sawol darm-op-chip as hybride chips waarden makke mei PDMS-replika's dy't út silikonfoarmen helle waarden troch sêfte litografy1,44 en patroanearre waarden mei SU-8. It ûntwerp fan 'e mikrokanalen yn elke chip wurdt bepaald troch rekken te hâlden mei hydrodynamika lykas skuorspanning en hydrodynamyske druk1,4,12. It orizjinele darm-op-in-chip-ûntwerp (Extended Data Fig. 1a), dat bestie út twa neist elkoar pleatste parallelle rjochte mikrokanalen, is evoluearre ta in komplekse darm-op-in-chip (Extended Data Fig. 1b) dy't in pear bûgde mikrokanalen omfettet om ferhege ferbliuwstiid fan floeistof, net-lineaire streampatroanen en multiaksiale deformaasje fan kultivearre sellen te indusearjen (Fig. 2a-f)12. As kompleksere darmbiomeganika opnij makke wurde moat, kin komplekse darm-op-in-chip keazen wurde. Wy hawwe oantoand dat de yngewikkelde darm-chip ek sterk 3D-morfogenese ynducearret yn in ferlykber tiidsbestek mei in ferlykbere mjitte fan epitheliale groei yn ferliking mei it orizjineel. Gut-Chip, nettsjinsteande it kultivearre seltype. Dêrom, om 3D-morfogenese te indusearjen, binne lineêre en komplekse on-chip-darmûntwerpen útwikselber. PDMS-replika's dy't útharde binne op silikonfoarmen mei SU-8-patroanen levere negative funksjes nei it ûntfoarmjen (Fig. 2a). Om de darm op in chip te meitsjen, waard de taret boppeste PDMS-laach sekwinsjeel ferbûn oan in poreuze PDMS-film en dan ôfstimd mei de legere PDMS-laach troch ûnomkearbere binding mei in koronabehanneler (Fig. 2b-f). Om hybride chips te meitsjen, waarden útharde PDMS-replika's ferbûn oan glêzen dia's om ienkanaals mikrofluidyske apparaten te meitsjen dy't Transwell-ynfoegsels koene ûnderbringe (Fig. 2h en útwreide gegevens Fig. 2). It bondingproses wurdt útfierd troch de oerflakken fan 'e PDMS-replika en glês te behanneljen mei soerstofplasma of koronabehanneling. Nei sterilisaasje fan it mikrofabrisearre apparaat dat oan 'e silikonbuis befestige wie, wie de apparaatopstelling klear om 3D-morfogenese fan it intestinale epithelium út te fieren (Figuer 2g).
a, Skematyske yllustraasje fan 'e tarieding fan PDMS-ûnderdielen út SU-8-patroande silisiumfoarmen. De net-útharde PDMS-oplossing waard op in silisiumfoarm getten (lofts), útharde by 60 °C (midden) en út 'e foarm helle (rjochts). De útharde PDMS waard yn stikken snien en skjinmakke foar fierder gebrûk. b, Foto fan 'e silisiumfoarm dy't brûkt waard om de boppeste laach fan PDMS ta te rieden. c, Foto fan 'e silisiumfoarm dy't brûkt waard om it poreuze membraan fan PDMS te meitsjen. d, In searje foto's fan 'e boppeste en ûnderste PDMS-komponinten en it gearstalde on-chip-darmapparaat. e, Skematyske foarstelling fan 'e ôfstimming fan 'e boppeste, membraan- en ûnderste PDMS-komponinten. Elke laach is ûnomkearber ferbûn troch plasma- of koronabehanneling. f, Skematyske foarstelling fan it fabrisearre darm-op-in-chip-apparaat mei oerlappende yngewikkelde mikrokanalen en fakuümkeamers. g, Opset fan darm-op-in-chip foar mikrofluidyske selkultuer. De fabrisearre darm op in chip gearstald mei in silikonbuis en spuit waard op in dekglaasje pleatst. It chipapparaat waard pleatst op 'e deksel fan in 150 mm Petrischaal foar ferwurking. De binder wurdt brûkt om de silikonbuis te sluten. h, Fisuele snapshots fan hybride chipfabrikaasje en 3D-morfogenese mei hybride chips. Transwell-ynfoegsels dy't ûnôfhinklik taret binne om 2D-monolagen fan intestinale epitheelzellen te kweken, waarden ynfoege yn 'e hybride chip om intestinale 3D-morfogenese te indusearjen. It medium wurdt perfusearre fia mikrokanalen ûnder de sellaach dy't op 'e Transwell-ynfoegsel fêstige is. Skaalbalke, 1 sm. h Opnij printe mei tastimming fan referinsje. 4. Elsevier.
Yn dit protokol waarden de Caco-2-selline en intestinale organoïden brûkt as epitheliale boarnen (Fig. 3a). Beide soarten sellen waarden ûnôfhinklik kultivearre (Fak 2 en Fak 5) en brûkt om de ECM-coated mikrokanalen fan on-chip darm of Transwell-ynserts te siedzjen. As sellen konfluent binne (> 95% dekking yn kolven), wurde routinematich kultivearre Caco-2-sellen (tusken passaazjes 10 en 50) yn T-kolven rispe om dissosiearre selsuspensjes te meitsjen troch trypsinisaasjefloeistof (fak 2). Minskelike intestinale organoïden fan intestinale biopsies of sjirurgyske reseksjes waarden kultivearre yn Matrigel-scaffoldkoepels yn 24-wellplaten om de strukturele mikroomjouwing te stypjen. Medium mei essensjele morfogenen (lykas Wnt, R-spondin en Noggin) en groeifaktoaren taret lykas beskreaun yn Fak 3 waard om de oare dei oanfolle oant de organoïden groeiden ta ~ 500 µm yn diameter. Folslein groeide organoïden wurde rispe en dissosiearre yn ienige sellen foar siedzjen op darm- of Transwell-ynserts op in chip (Fak 5). Lykas wy earder rapportearre hawwe, kin it ûnderskieden wurde neffens syktetype12,13 (bygelyks ulcerative kolitis, sykte fan Crohn, kolorektale kanker, of normale donor), laesjeplak (bygelyks laesje versus net-lesionearre gebiet) en gastrointestinale lokaasje yn it trakt (bygelyks duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, of rectum). Wy leverje in optimalisearre protokol yn Fak 5 foar it kultivearjen fan kolonorganoïden (koloiden) dy't typysk hegere konsintraasjes morfogenen fereaskje as tinne darmorganoïden.
a, Workflow foar de ynduksje fan darmmorfogenese yn 'e darmchip. Caco-2 minsklik darmepitheel en darmorganoïden wurde brûkt yn dit protokol om 3D-morfogenese te demonstrearjen. De isolearre epitheelzellen waarden siedde yn it taret darm-op-in-chip-apparaat (chiptarieding). Sadree't sellen siedde (siedde) en hechte (oanhechte) binne oan it PDMS-poreuze membraan op dei 0 (D0), wurdt apikale (AP) stream inisjeare en ûnderhâlden foar de earste 2 dagen (stream, AP, D0-D2). Basolaterale (BL) stream wurdt ek inisjeare tegearre mei sykliske stretchbewegingen (stretch, flow, AP en BL) as in folsleine 2D-monolaach foarme wurdt. Intestinale 3D-morfogenese fûn spontaan plak nei 5 dagen fan mikrofluidyske kultuer (morfogenese, D5). Fazekontrastôfbyldings litte represintative morfology fan Caco-2-zellen sjen by elke eksperimintele stap of tiidpunt (staafdiagram, 100 µm). Fjouwer skematyske diagrammen dy't de oerienkommende kaskades fan darmmorfogenese yllustrearje (rjochtsboppe). De stippele pylken yn it skematyske byld fertsjintwurdigje de rjochting fan floeistofstream.b, SEM-ôfbylding dy't de oerflaktopology fan it fêststelde 3D Caco-2-epitheel sjen lit (lofts). De ynfoegsel dat it fergrutte gebiet markearret (wyt stippele fak) lit de regenerearre mikrovilli op 'e 3D Caco-2-laach sjen (rjochts).c, Horizontale frontale werjefte fan fêststelde Caco-2 3D, claudine (ZO-1, read) en trochgeande boarstelrânemembranen markearre F-actine (grien) en kearnen (blau) Immunofluoreszinsje konfokale fisualisaasje fan epitheelzellen op darmchips.Pylken dy't nei it middelste skematyske byld wize, jouwe de lokaasje fan it fokale flak oan foar elke konfokale werjefte.d, Tiidsferrin fan morfologyske feroarings yn organoïden kultivearre op in chip krigen troch fazekontrastmikroskopie op dagen 3, 7, 9, 11 en 13. De ynfoegsel (rjochtsboppe) lit de hege fergrutting fan 'e levere ôfbylding sjen.e, DIC-fotomikrografy fan organoïde 3D-epitheel fêststeld yn 'e darm op in plak nommen op dei 7.f, Oerlaapjende immunofluoreszinsjeôfbyldings mei markers foar stamsellen (LGR5; magenta), bekersellen (MUC2; grien), F-actine (griis) en kearnen (syaan) dy't 3 dagen lang groeid binne op darmchips, respektivelik (links) en 13-dagen (midden) organoïden op 'e epitheallaach. Sjoch ek Extended Data Figuer 3, dy't LGR5-sinjalearring sûnder MUC2-sinjalearring markearret. Fluoreszinsjeôfbyldings dy't de epitheallaachmikrostruktuer (rjochts) sjen litte fan 3D organoïde epitheel dat yn 'e darm op in chip fêstige is troch it kleurjen fan it plasmamembraan mei CellMask-kleurstof (rjochts) op dei 13 fan kultuer. Skaalbalke is 50 μm, útsein as oars oanjûn. b Opnij printe mei tastimming fan referinsje. 2. Oxford University Press; c Oanpast mei tastimming fan referinsje. 2. Oxford University Press; e en f oanpast mei tastimming troch referinsje. 12 Under Creative Commons License CC BY 4.0.
Yn 'e darm op in chip is it needsaaklik om it hydrofobe oerflak fan it poreuze PDMS-membraan te modifisearjen foar suksesfolle ECM-coating. Yn dit protokol tapasse wy twa ferskillende metoaden om de hydrofobisiteit fan PDMS-membranen te modifisearjen. Foar it kultivearjen fan Caco-2-sellen wie oerflakaktivaasje troch allinich UV/ozonbehanneling genôch om de hydrofobisiteit fan it PDMS-oerflak te ferminderjen, de ECM te coaten en Caco-2-sellen oan it PDMS-membraan te befestigjen. Mikrofluidyske kultuer fan organoïde epithelium fereasket lykwols gemyske-basearre oerflakfunksjonalisaasje om effisjinte ôfsetting fan ECM-proteïnen te berikken troch polyethyleenimine (PEI) en glutaraldehyde op PDMS-mikrokanalen oan te bringen. Nei oerflakmodifikaasje waarden ECM-proteïnen ôfset om it funksjonalisearre PDMS-oerflak te dekken en dan ynfierd yn it isolearre organoïde epithelium. Nei't de sellen binne befestige, begjint de mikrofluidyske selkultuer troch allinich it medium yn it boppeste mikrokanaal te perfusearjen oant de sellen in folsleine monolaach foarmje, wylst it legere mikrokanaal statyske omstannichheden behâldt. Dizze optimalisearre metoade foar oerflakaktivaasje en ECM-coating makket de oanhechting fan organoïde mooglik. epithelium om 3D-morfogenese op it PDMS-oerflak te indusearjen.
Transwell-kultueren fereaskje ek ECM-coating foar it siedzjen fan sellen; Transwell-kultueren fereaskje lykwols gjin komplekse foarbehannelingstappen om it oerflak fan poreuze ynfoegsels te aktivearjen. Foar it kweken fan Caco-2-sellen op Transwell-ynfoegsels fersnelt ECM-coating op poreuze ynfoegsels de oanhechting fan dissosiearre Caco-2-sellen (<1 oere) en de foarming fan in tight junction-barriêre (<1-2 dagen). Om organoïden te kweken op Transwell-ynfoegsels wurde isolearre organoïden siedde op ECM-coated ynfoegsels, oan it membraanoerflak befestige (<3 oeren) en ûnderhâlden oant de organoïden in folsleine monolaach foarmje mei barriêre-yntergriteit. Transwell-kultueren wurde útfierd yn 24-putplaten sûnder it gebrûk fan hybride chips.
In vitro 3D-morfogenese kin inisjearre wurde troch it tapassen fan floeistofstream op it basolaterale aspekt fan in fêststelde epitheallaach. Yn 'e darm op in chip begon epitheallaachmorfogenese doe't it medium yn 'e boppeste en legere mikrokanalen perfusearre waard (Fig. 3a). Lykas earder beskreaun, is it kritysk om floeistofstream yn it ûnderste (basolaterale) kompartimint yn te fieren foar trochgeande ferwidering fan rjochting útskieden morfogeenremmers. Om genôch fiedingsstoffen en serum te leverjen oan sellen bûn oan poreuze membranen en luminale skuorspanning te generearjen, tapasse wy typysk dûbele stream yn 'e darm op in chip. Yn hybride chips waarden Transwell-ynfoegsels mei epitheallaachmonolagen ynfoege yn 'e hybride chips. Dêrnei waard it medium ûnder de basolaterale kant fan 'e poreuze Transwell-ynfoegsel troch it mikrokanaal tapast. Intestinale morfogenese fûn 3-5 dagen nei it begjin fan basolaterale stream yn beide kultuerplatfoarms plak.
De morfologyske skaaimerken fan mikro-yngeniearre 3D-epitheellagen kinne analysearre wurde troch ferskate ôfbyldingsmodaliteiten ta te passen, ynklusyf fazekontrastmikroskopie, differinsjaal ynterferinsjekontrast (DIC) mikroskopie, SEM, of immunofluoreszinsjekonfokale mikroskopie (figueren 3 en 4). Fazekontrast- of DIC-ôfbylding kin maklik op elk momint tidens kultuer útfierd wurde om de foarm en útsteksel fan 3D-epitheellagen te kontrolearjen. Fanwegen de optyske transparânsje fan PDMS- en polyesterfilms kinne sawol de gut-on-a-chip- as hybride chipplatfoarms real-time in situ-ôfbylding leverje sûnder de needsaak foar it seksjearjen of demontearjen fan it apparaat. By it útfieren fan immunofluoreszinsjeôfbylding (figueren 1, 3c, f en 4b, c) wurde sellen typysk fêstmakke mei 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), folge troch Triton X-100 en 2% (wt/vol)) bovine serumalbumine (BSA), yn folchoarder. Ofhinklik fan it seltype kinne ferskate fiksativen, permeabilisatoren en blokkearjende aginten brûkt wurde. Primêre antistoffen dy't rjochte binne op Lineage-ôfhinklike sel- of regiomarkers wurde brûkt om sellen te markearjen dy't yn situ op 'e chip immobilisearre binne, folge troch sekundêre antistoffen tegearre mei in tsjinkleurstof dy't rjochte is op 'e kearn (bygelyks 4′,6-diamidino-2-fenyleen) indool, DAPI) of F-actine (bygelyks fluoreszinsjeel markearre falloidine). Fluoreszinsje-basearre live ôfbylding kin ek yn situ útfierd wurde om slymproduksje te detektearjen (Fig. 1, "Seldifferinsjaasje" en "Darmfysiology"), willekeurige kolonisaasje fan mikrobiële sellen (Fig. 1, "Host-mikrobe ko-kultuer"), de rekrutearring fan ymmúnsellen (Fig. 1, 'Syktemodellering') of de kontoeren fan 3D-epitheelmorfology (Fig. 3c, f en 4b, c). By it oanpassen fan 'e darm op' e chip om de boppeste laach te skieden fan 'e legere mikrokanaallaach, lykas beskreaun yn ref. Lykas werjûn yn Fig. 2, kinne de 3D-epitheelmorfology lykas de mikrovilli op 'e apikale boarstelgrins fisualisearre wurde troch SEM. (Fig. 3b). De ekspresje fan differinsjaasjemarkers kin wurde beoardiele troch kwantitative PCR5- of iensellige RNA-sekwinsje út te fieren. Yn dit gefal wurde 3D-lagen fan epitheelzellen dy't groeid binne yn darmchips of hybride chips rispe troch trypsinisaasje en dan brûkt foar molekulêre of genetyske analyze.
a, Workflow foar de ynduksje fan intestinale morfogenese yn in hybride chip. Caco-2 en intestinale organoïden wurde brûkt yn dit protokol om 3D-morfogenese te demonstrearjen yn in hybride chipplatfoarm. Dissosiearre epitheelzellen waarden siedde yn taret Transwell-ynfoegsels (TW-tarieding; sjoch ôfbylding hjirûnder). Sadree't sellen siedde (siedde) wiene en oan polyestermembranen yn Transwell-ynfoegsels befestige wiene, waarden alle sellen ûnder statyske omstannichheden kultivearre (TW-kultuer). Nei 7 dagen waard in inkele Transwell-ynfoegsel mei in 2D-monolaach fan epitheelzellen yntegrearre yn in hybride chip om in basolaterale stream yn te fieren (Flow, BL), wat úteinlik late ta de generaasje fan in 3D-epitheellaach (morfogenese). Fazekontrastmikrografen dy't morfologyske skaaimerken sjen litte fan minsklike oargel-epitheelzellen ôflaat fan normale donor (C103-line) opstigende kolon by elke eksperimintele stap of tiidpunt. De skematyske diagrammen yn 'e boppeste lagen yllustrearje de eksperimintele konfiguraasje foar elke stap. b, Hybride chips (lofts skematysk) kinne liede ta 3D-morfogenese fan organoïde epitheelzellen mei Top-down konfokale mikroskopy-werjeften nommen op ferskate Z-posysjes (boppe, midden en ûnder; sjoch rjochts skematyske en oerienkommende stippele linen). lieten dúdlike morfologyske skaaimerken sjen. F-actine (syaan), kearn (griis). c, Fluoreszinsje-konfokale mikrografyen (3D-hoekige werjefte) fan organoïde-ôflaatte epitheelzellen kultivearre yn statyske Transwell (TW; ynfoegsel yn wyt stippele fak) versus hybride chip (grutste folsleine opname) dy't 2D versus 3D-morfology fergeliket, respektivelik. In pear 2D fertikale krússnij-werjeften (ynfoegsel yn 'e rjochter boppeste hoeke; "XZ") litte ek 2D- en 3D-funksjes sjen. Skaalbalke, 100 µm. c Opnij printe mei tastimming fan referinsje. 4. Elsevier.
Kontrôles kinne wurde taret troch deselde sellen (Caco-2 of intestinale organoïde epitheelzellen) te kultivearjen yn twadiminsjonale monolagen ûnder konvinsjonele statyske kultueromstannichheden. It is opmerklik dat fiedingsstoffenútputting kin ûntstean fanwegen de beheinde folumekapasiteit fan 'e mikrokanalen (d.w.s. ~4 µL yn it boppeste kanaal op it orizjinele gut-chip-ûntwerp). Dêrom kin de epitheelmorfology foar en nei tapassing fan basolaterale stream ek wurde fergelike.
It sêfte litografyproses moat útfierd wurde yn in skjinne keamer. Foar elke laach op 'e chip (boppeste en ûnderste lagen en membranen) en hybride chips waarden ferskillende fotomaskers brûkt en makke op aparte silisiumwafers, om't de hichten fan 'e mikrokanalen oars wiene. De doelhichten fan 'e boppeste en ûnderste mikrokanalen fan 'e darm op 'e chip binne respektivelik 500 µm en 200 µm. De doelhichte fan it kanaal fan 'e hybride chip is 200 µm.
Plak in silikonwafer fan 3 inch yn in skûtel mei aceton. Draai de plaat foarsichtich 30 sekonden, en lit de wafer dan oan 'e loft droegje. Oerdrage de wafer nei in plaat mei IPA, en draai de plaat dan 30 sekonden om skjin te meitsjen.
In piranha-oplossing (in mingsel fan wetterstofperokside en konsintrearre swevelsoer, 1:3 (vol/vol)) kin opsjoneel brûkt wurde om de ferwidering fan organyske resten fan it oerflak fan it silisiumwafer te maksimalisearjen.
Piranha-oplossing is ekstreem korrosyf en genereart waarmte. Ekstra feilichheidsmaatregels binne nedich. Foar it ôffieren fan ôffal, lit de oplossing ôfkuolje en oerdrage nei in skjinne, droege ôffalkontener. Brûk sekundêre konteners en labelje ôffalkonteners goed. Folgje de feilichheidsrjochtlinen fan 'e foarsjenning foar mear detaillearre prosedueres.
Droege de wafers út troch se 10 minuten op in waarme plaat fan 200 °C te pleatsen. Nei it droegjen waard de wafer fiif kear yn 'e loft skodde om ôf te koelen.
Giet ~10 g fotoresist SU-8 2100 yn it midden fan 'e skjinmakke silisiumwafer. Brûk in pinset om de fotoresist evenredich oer de wafer te fersprieden. Plak de wafer sa no en dan op in hjitte plaat fan 65 °C om de fotoresist minder plakkerich en makliker te fersprieden te meitsjen. Plak de wafer net direkt op 'e hjitte plaat.
SU-8 waard evenredich ferdield oer de wafer troch spincoating út te fieren. Programmearje in ynkommende rotaasje fan 'e SU-8 foar 5-10 s om te fersprieden by 500 rpm mei in fersnelling fan 100 rpm/s. Stel de haadspin yn foar patroanen mei in dikte fan 200 µm op 1.500 rpm, of berik in dikte fan 250 µm (wêrtroch't in hichte fan 500 µm ûntstiet foar de boppeste laach fan 'e darm op 'e chip; sjoch "Krityske stappen" hjirûnder) ynsteld op in fersnelling fan 300 rpm/s 30 sekonden by 1.200 rpm.
De haadspinsnelheid kin oanpast wurde neffens de doeldikte fan it SU-8-patroan op 'e silisiumwafer.
Om SU-8-patroanen fan 500 µm hichte te meitsjen foar de boppeste laach fan 'e darm op 'e chip, waarden de spincoating- en sêfte bakstappen fan dizze doaze (stappen 7 en 8) efterinoar werhelle (sjoch stap 9) om twa lagen fan 250 µm dikke laach SU-8 te produsearjen, dy't yn stap 12 fan dizze doaze oaninoar lein en ferbûn wurde kinne troch UV-eksposysje, wêrtroch in laach fan 500 µm heech ûntstiet.
Bak de SU-8-coated wafers sêft troch de wafers foarsichtich 5 minuten op in hjitte plaat te pleatsen by 65 °C, wikselje dan de ynstelling nei 95 °C en ynkubearje foar noch 40 minuten.
Om in hichte fan 500 μm fan it SU-8-patroan yn it boppeste mikrokanaal te berikken, werhelje stappen 7 en 8 om twa 250 μm dikke SU-8-lagen te generearjen.
Brûk de UV-maskerútrichter om in lampetest út te fieren neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant om de bleatstellingstiid fan 'e wafer te berekkenjen. (bleatstellingstiid, ms) = (bleatstellingsdosis, mJ/cm2)/(lampefermogen, mW/cm2).
Nei it bepalen fan 'e bleatstellingstiid, pleats it fotomasker op 'e maskerhâlder fan' e UV-masker-aligner en pleats it fotomasker op 'e SU-8-coated wafer.
Plak it printe oerflak fan it fotomasker direkt op 'e SU-8-coated kant fan' e silisiumwafer om UV-fersprieding te minimalisearjen.
Stel de SU-8-coated wafer en fotomasker fertikaal bleat oan 260 mJ/cm2 UV-ljocht foar de foarôf bepaalde bleatstellingstiid (sjoch stap 10 fan dit fak).
Nei UV-eksposysje waarden SU-8-coated silisiumwafers bakt by 65 °C foar 5 minuten en 95 °C foar 15 minuten op elke hjitte plaat om patroanen te meitsjen mei in hichte fan 200 μm. Ferlingje de neibaktiid by 95 °C nei 30 minuten om patroanen te meitsjen mei in hichte fan 500 μm.
De ûntwikkelder wurdt yn in glêzen skûtel getten, en de bakte wafer wurdt yn 'e skûtel pleatst. It folume fan SU-8 ûntwikkelder kin ferskille ôfhinklik fan 'e grutte fan' e glêzen plaat. Soargje derfoar dat jo genôch SU-8 ûntwikkelder brûke om net-bleatstelde SU-8 folslein te ferwiderjen. Bygelyks, as jo in glêzen skûtel mei in diameter fan 150 mm en in kapasiteit fan 1 L brûke, brûk dan ~ 300 mL SU-8 ûntwikkelder. Untwikkelje de mal 25 minuten mei sa no en dan sêfte rotaasje.
Spoel de ûntwikkele mal mei ~ 10 mL farske ûntwikkelder folge troch IPA troch de oplossing te spuiten mei in pipette.
Plak de wafer yn in plasmareiniger en stel it 1,5 min. bleat oan soerstofplasma (atmosfearysk gas, doeldruk 1 × 10−5 Torr, fermogen 125 W).
Plak de wafer yn in fakuüm-eksikator mei in glêzen dia deryn. Wafers en dia's kinne neist elkoar pleatst wurde. As de fakuüm-eksikator troch in plaat yn ferskate lagen ferdield is, pleats dan de dia's yn 'e ûnderste keamer en de wafers yn 'e boppeste keamer. Lit 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silaanoplossing op in glêzen dia falle en tapasse fakuüm foar silanisaasje.
Untdooi in fleske mei beferzen Caco-2-sellen yn in wetterbad fan 37 °C, en bring de ûntdooide sellen dan oer nei in T75-fleske mei 15 mL foarferwaarme Caco-2-medium fan 37 °C.
Om Caco-2-sellen troch te litten by ~90% konfluens, waarmje earst Caco-2-medium, PBS, en 0,25% trypsine/1 mM EDTA yn in wetterbad fan 37 °C.
Aspirearje it medium troch fakuümaspiraasje. Waskje de sellen twa kear mei 5 mL waarm PBS troch fakuümaspiraasje te werheljen en farske PBS ta te foegjen.