Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-ийн дэмжлэг хязгаарлагдмал байна. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг унтраах). Энэ хооронд бид үргэлжлүүлэн дэмжлэг үзүүлэхийн тулд сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр харуулах болно.
Хүний гэдэсний морфогенез нь 3D хучуур эдийн бичил архитектур болон орон зайн зохион байгуулалтын крипто-виллсийн онцлогийг бий болгодог. Энэхүү өвөрмөц бүтэц нь суурийн крипт дэх үүдэл эсийн орон зайг гадны бичил биетний эсрэгтөрөгч болон тэдгээрийн метаболитуудаас хамгаалах замаар гэдэсний гомеостазыг хадгалахад шаардлагатай. Үүнээс гадна, гэдэсний вилл болон ялгаруулдаг салиа нь гэдэсний салст бүрхүүлийн гадаргуу дээр хамгаалалтын хаалттай функциональ ялгаатай хучуур эдийн эсүүдийг агуулдаг. Тиймээс 3D хучуур эдийн бүтцийг дахин бүтээх нь in vitro гэдэсний загварыг бүтээхэд чухал үүрэгтэй. Органик дуураймал гэдэс нь физиологийн функц болон биомеханикийг сайжруулснаар гэдэсний хучуур эдийн аяндаа 3D морфогенезийг өдөөж чаддаг гэдгийг онцлон тэмдэглэх нь зүйтэй. Энд бид микрофлюидик чип болон Трансвеллийн суулгагдсан эрлийз чип дээр гэдсэнд гэдэсний морфогенезийг хүчтэй өдөөх хуулбарлах протоколыг өгч байна. Бид төхөөрөмж үйлдвэрлэх, уламжлалт орчинд болон микрофлюидик платформ дээр Caco-2 эсвэл гэдэсний органоид хучуур эдийн эсийг өсгөвөрлөх, 3D морфогенезийг өдөөх, олон дүрслэлийн аргыг ашиглан тогтсон 3D хучуур эдийн шинж чанарыг тодорхойлох нарийвчилсан аргуудыг тайлбарласан болно. Энэхүү протокол нь базолат шингэний урсгалыг 5 хоногийн турш хянаснаар гэдэсний үйл ажиллагааны бичил архитектурыг нөхөн төлжүүлдэг. Бидний in vitro морфогенезийн арга нь физиологийн хувьд хамааралтай зүсэлтийн стресс болон механик хөдөлгөөнийг ашигладаг бөгөөд бусад одоо байгаа техникээс илүү гүйцэтгэлтэй байж болох нарийн төвөгтэй эсийн инженерчлэл эсвэл зохицуулалт шаарддаггүй. Бидний санал болгож буй протокол нь биоанагаахын судалгааны нийгэмлэгт өргөн хүрээтэй үр дагавар авчирч, биоанагаахын, клиник болон эмийн хэрэглээнд зориулж in vitro 3 хэмжээст гэдэсний хучуур эдийн давхаргыг нөхөн сэргээх аргыг санал болгож чадна гэж бид үзэж байна.
Туршилтууд нь гэдэсний хучуур эдийн Caco-2 эсүүд нь in vitro нөхцөлд gut-on-a-chip1,2,3,4,5 эсвэл хоёр давхаргат микрофлюидик төхөөрөмжид6 өсгөвөрлөсөн нь үндсэн механизмыг тодорхой ойлголгүйгээр аяндаа 3 хэмжээст морфогенезийг in vitro нөхцөлд хийж болохыг харуулж байна. Бидний саяхны судалгаагаар өсгөвөрийн төхөөрөмжөөс базолатерал ялгардаг морфоген антагонистуудыг зайлуулах нь in vitro нөхцөлд 3 хэмжээст хучуур эдийн морфогенезийг өдөөхөд зайлшгүй бөгөөд хангалттай болохыг тогтоосон бөгөөд үүнийг Caco-2 болон өвчтөнөөс гаргаж авсан гэдэсний органоидууд харуулсан. Хучуур эдийн эсүүдийг баталгаажуулсан. Энэхүү судалгаанд бид "Хибрик чип" гэж нэрлэгддэг Трансвелл оруулга агуулсан гэдэс доторх чип болон өөрчлөгдсөн микрофлюидик төхөөрөмжүүдэд хүчтэй Wnt антагонист болох Диккопф-1 (DKK-1)-ийн эсийн үйлдвэрлэл болон концентрацийн тархалтад онцгой анхаарал хандуулсан. Бид гадны Wnt антагонистуудыг (жишээлбэл, DKK-1, Wnt дарангуйлагч 1, ялгарсан буржгартай холбоотой уураг 1, эсвэл Согги-1) чип дээрх гэдсэнд нэмэх нь морфогенезийг дарангуйлдаг эсвэл урьдчилан бүтэцлэгдсэн 3D хучуур эдийн давхаргыг алдагдуулдаг болохыг харуулсан бөгөөд энэ нь өсгөвөрлөх үеийн антагонист стресс нь гэдэсний морфогенезийг in vitro хариуцдаг болохыг харуулж байна. Тиймээс хучуур эдийн интерфэйс дээр бат бөх морфогенезийг бий болгох практик арга бол базолатрын тасалгаанд Wnt антагонистуудын түвшинг идэвхтэй угаах (жишээлбэл, гэдэс дээрх чип эсвэл эрлийз дээрх чип платформуудад) эсвэл диффузи хийх замаар арилгах эсвэл хамгийн бага хэмжээнд байлгах явдал юм. Базолатрын орчин (жишээлбэл, Трансвелл оруулгаас худаг дахь том базолатрын усан сан руу)
Энэхүү протоколд бид гэдэсний хучуур эдийн эсийг полидиметилсилоксан (PDMS) дээр суурилсан сүвэрхэг мембран (6A, 7A, 8, 9-р алхамууд) эсвэл Трансвеллийн оруулгын полиэстр мембран (6B, 7B, 8, 9-р алхамууд) дээр өсгөвөрлөхийн тулд гэдэс-чип дээрх микро төхөөрөмж болон Трансвеллийн оруулгатай эрлийз чип (1-5-р алхамууд) үйлдвэрлэх нарийвчилсан аргыг өгч, in vitro 3D морфогенезийг өдөөсөн. Мөн бид олон дүрслэлийн аргыг хэрэглэснээр эд эсийн өвөрмөц гистогенез ба удам угсаанаас хамааралтай эсийн ялгаварлан гадуурхалтыг илтгэх эсийн болон молекулын шинж чанаруудыг тодорхойлсон (11-24-р алхамууд). Бид Caco-2 эсвэл гэдэсний органоид зэрэг хүний ​​гэдэсний хучуур эдийн эсийг ашиглан морфогенезийг өдөөж, сүвэрхэг мембраны гадаргуугийн өөрчлөлт, 2D моно давхарга үүсгэх, гэдэсний биохимийн болон биомеханик бичил орчныг нөхөн үржих зэрэг техникийн дэлгэрэнгүй мэдээллийг агуулсан хоёр өсгөвөрлөлтийн хэлбэрээр өдөөсөн. in vitro. 2D хучуур эдийн моно давхаргаас 3D морфогенезийг өдөөхийн тулд бид морфогенийн антагонистуудыг ...-г зайлуулсан. өсгөврийн базолар талын хэсэг рүү орчинг урсгах замаар өсгөвөрлөсөн хэлбэрүүдийг хоёуланг нь. Эцэст нь бид морфогенээс хамааралтай хучуур эдийн өсөлт, урт хугацааны эзэн-микробиомын хам өсгөвөр, эмгэг төрүүлэгчийн халдвар, үрэвслийн гэмтэл, хучуур эдийн саад тотгорын үйл ажиллагааны алдагдал, пробиотик дээр суурилсан эмчилгээг загварчлахад ашиглаж болох нөхөн төлжих боломжтой 3 хэмжээст хучуур эдийн давхаргын ашиг тусын талаарх дүрслэлийг өгч байна. Жишээ нь: нөлөөлөл.
Манай протокол нь үндсэн (жишээ нь, гэдэсний салст бүрхүүлийн биологи, үүдэл эсийн биологи, хөгжлийн биологи) болон хэрэглээний судалгаа (жишээ нь, клиникээс өмнөх эмийн шинжилгээ, өвчний загварчлал, эдийн инженерчлэл, хоол боловсруулах эрхтний өвчин судлал)-ын өргөн хүрээний нөлөө бүхий эрдэмтдэд ашигтай байж болох юм. Гэдэсний хучуур эдийн 3 хэмжээст морфогенезийг in vitro нөхцөлд өдөөх протоколын маань давтагдах чадвар, бат бөх байдлын ачаар бид техникийн стратегиа гэдэсний хөгжил, нөхөн төлжилт эсвэл гомеостазын үед эсийн дохиоллын динамикийг судалж буй үзэгчдэд түгээх боломжтой гэж үзэж байна. Үүнээс гадна, манай протокол нь Норовирус 8, Хүнд хэлбэрийн цочмог амьсгалын замын хам шинжийн коронавирус 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 эсвэл Vibrio cholerae зэрэг янз бүрийн халдварт бодисын халдварыг судлахад ашигтай юм. Өвчний эмгэг жам, эмгэг жамын талаарх судалгааны хүрээнүүд бас ашигтай. Чип дээрх гэдэсний микрофизиологийн системийг ашиглах нь урт хугацааны хамт өсгөвөрлөлт 10 болон дараа нь ходоод гэдэсний (ХО) замын 11 эзний хамгаалалт, дархлааны хариу урвал, эмгэг төрүүлэгчтэй холбоотой гэмтлийн нөхөн сэргээлтийг үнэлэх боломжийг олгодог. Өвчтөний 3D гэдэсний хучуур эдийн давхаргыг ашиглан 3D гэдэсний хучуур эдийн давхаргыг бэлтгэх үед гоожиж буй гэдэсний хам шинж, целиакийн өвчин, Кроны өвчин, шархлаат колит, уушигны үрэвсэл, эсвэл цочромтгой гэдэсний хам шинжтэй холбоотой бусад ходоод гэдэсний эмгэгийг дуурайлган хийж болно. Эдгээр өвчинд виллёз хатингаршил, крипт богиносох, салст бүрхүүлийн гэмтэл, эсвэл хучуур эдийн саад тотгорын сулрал орно. Биопси эсвэл үүдэл эсээс гаралтай гэдэсний органоидууд12,13. Өвчний орчны өндөр нарийн төвөгтэй байдлыг илүү сайн загварчлахын тулд уншигчид 3D гэдэсний виллёз-крипт микроархитектур агуулсан загваруудад өвчтөний захын цусны мононуклеар эсүүд (PBMCs) зэрэг өвчинтэй холбоотой эсийн төрлийг нэмэх талаар бодож үзэж болно. эдэд өвөрмөц дархлааны эсүүд, 5.
3 хэмжээст хучуур эдийн бичил бүтцийг огтлолын процессгүйгээр засаж, дүрслэн харуулах боломжтой тул орон зайн транскриптомик болон өндөр нягтралтай эсвэл хэт нягтралтай дүрслэл дээр ажиллаж буй үзэгчид хучуур эдийн зангилаанууд дээрх ген ба уургийн орон зайн цаг хугацааны динамикийн бидний зураглалыг сонирхож магадгүй юм. Технологид сонирхолтой. Микроб эсвэл дархлааны өдөөлтөд үзүүлэх хариу үйлдэл. Цаашилбал, гэдэсний гомеостазыг зохицуулдаг урт хугацааны эзэн-микробиомын харилцан үйлчлэлийг 10, 14-ийг 3 хэмжээст гэдэсний салст бүрхүүлд янз бүрийн бичил биетний төрөл зүйл, бичил биетний бүлгэмдэл эсвэл ялгадасын микробиотыг, ялангуяа чип дээрх гэдсэнд хамт өсгөвөрлөх замаар тогтоож болно. платформ дээр. Энэхүү арга нь салст бүрхүүлийн дархлаа судлал, хоол боловсруулах эрхтний эмгэг судлал, хүний ​​микробиом, соёл судлал, клиник микробиологи судалж буй, өмнө нь өсгөвөрлөөгүй гэдэсний микробиотыг лабораторид өсгөвөрлөхийг эрмэлздэг хүмүүст онцгой сонирхолтой юм. Хэрэв бидний in vitro морфогенезийн протоколыг базолат талын тасалгаануудыг тасралтгүй нөхдөг 24, 96 эсвэл 384 худгийн хавтан дахь олон худгийн оруулга гэх мэт өргөтгөх боломжтой өсгөврийн форматад тохируулан өөрчилж чадвал уг протоколыг хүнсний үйлдвэрлэлийн эмийн, биоанагаахын эсвэл өндөр хүчин чадалтай скрининг эсвэл баталгаажуулалтын платформ боловсруулж буй хүмүүст түгээж болно. Зарчмын нотолгоо болгон бид саяхан 24 худгийн хавтан формат руу өргөтгөх боломжтой олон талт өндөр хүчин чадалтай морфогенезийн системийн хэрэгжих боломжийг харуулсан. Үүнээс гадна, олон эрхтэн-чип дээрх бүтээгдэхүүнийг арилжааны зорилгоор ашигласан16,17,18. Тиймээс бидний in vitro морфогенезийн аргын баталгаажуулалтыг хурдасгаж, олон судалгааны лаборатори, салбар эсвэл засгийн газар, зохицуулах байгууллагууд эмийг туршихын тулд in vitro гэдэсний морфогенезийн эсийн дахин програмчлалыг ойлгохын тулд нэвтрүүлж болно. эсвэл био эмчилгээний эмүүд Эмийн нэр дэвшигчдийн шингээлт болон тээвэрлэлтийг гэдэсний морфогенезийн процессын давтагдах чадварыг үнэлэхийн тулд 3 хэмжээст гэдэсний орлуулагч ашиглан эсвэл захиалгат эсвэл арилжааны эрхтэн дээрх чип загваруудыг ашиглан үнэлсэн.
Гэдэсний хучуур эдийн морфогенезийг судлахад цөөн тооны хүнтэй холбоотой туршилтын загваруудыг ашигласан бөгөөд энэ нь голчлон in vitro нөхцөлд 3 хэмжээст морфогенезийг өдөөх хэрэгжүүлэх боломжтой протокол дутмаг байгаагаас үүдэлтэй юм. Үнэндээ гэдэсний морфогенезийн талаарх одоогийн мэдлэгийн ихэнх нь амьтдын судалгаанд үндэслэсэн байдаг (жишээ нь, зебра загас20, хулгана21 эсвэл тахиа22). Гэсэн хэдий ч тэдгээр нь хөдөлмөр их шаарддаг, ёс зүйн хувьд эргэлзээтэй байж болох бөгөөд хамгийн чухал нь хүний ​​хөгжлийн үйл явцыг нарийн тодорхойлдоггүй. Эдгээр загварууд нь олон талт өргөтгөх боломжтой байдлаар турших чадвараараа маш хязгаарлагдмал байдаг. Тиймээс in vitro нөхцөлд 3 хэмжээст эдийн бүтцийг нөхөн сэргээх бидний протокол нь in vivo амьтны загварууд болон бусад уламжлалт статик 2 хэмжээст эсийн өсгөврийн загваруудаас илүү сайн ажилладаг. Өмнө нь дурдсанчлан, 3 хэмжээст хучуур эдийн бүтцийг ашиглах нь янз бүрийн салст бүрхэвч эсвэл дархлааны өдөөлтөд хариу үйлдэл үзүүлэхийн тулд крипто-виллусын тэнхлэгт ялгаварлан гадуурх эсүүдийн орон зайн байршлыг судлах боломжийг бидэнд олгосон. 3 хэмжээст хучуур эдийн давхаргууд нь бичил биетний эсүүд орон зайн зангилаа үүсгэхийн тулд хэрхэн өрсөлддөг, мөн эзэн хүчин зүйлсийн (жишээ нь, дотор болон гадна салст давхарга, шүүрэл) хариуд экологийн хувьслыг судлах орон зайг бий болгож чадна. IgA ба нянгийн эсрэг пептидүүд). Цаашилбал, 3D хучуур эдийн морфологи нь гэдэсний микробиота нь өөрийн бүлгүүдийг хэрхэн бүрдүүлж, суурь криптэд эсийн зохион байгуулалт болон үүдэл эсийн орон зайг бүрдүүлдэг бичил биетний метаболитуудыг (жишээлбэл, богино гинжин тосны хүчил) хэрхэн синергетик байдлаар үүсгэдэгийг ойлгох боломжийг бидэнд олгодог. Эдгээр шинж чанаруудыг зөвхөн 3D хучуур эдийн давхаргууд in vitro үүссэн үед л харуулж болно.
3 хэмжээст гэдэсний хучуур эдийн бүтцийг бий болгох аргаас гадна хэд хэдэн in vitro аргууд байдаг. Гэдэсний органоид өсгөвөр нь тодорхой морфогенийн нөхцөлд гэдэсний үүдэл эсийг тариалахад суурилсан хамгийн сүүлийн үеийн эдийн инженерчлэлийн техник юм23,24,25. Гэсэн хэдий ч гэдэсний хөндий нь органоид дотор байрладаг тул бичил биетний эс эсвэл гадны эсрэгтөрөгч зэрэг хөндийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг нэвтрүүлэх нь хязгаарлагдмал тул тээврийн шинжилгээ эсвэл эзэн-микробиомын хам өсгөвөрт 3 хэмжээст органоид загварыг ашиглах нь ихэвчлэн бэрхшээлтэй байдаг. Органоид хөндийд нэвтрэх боломжийг микроинжектор ашиглан сайжруулж болно26,27 гэхдээ энэ арга нь инвазив бөгөөд хөдөлмөр их шаарддаг бөгөөд гүйцэтгэхийн тулд тусгай мэдлэг шаарддаг. Цаашилбал, статик нөхцөлд гидрогелийн шатлалд хадгалагддаг уламжлалт органоид өсгөвөр нь in vivo идэвхтэй биомеханикийг үнэн зөв тусгадаггүй.
Хэд хэдэн судалгааны бүлгүүдийн ашигладаг бусад аргууд нь гель гадаргуу дээр тусгаарлагдсан хүний ​​гэдэсний эсийг өсгөвөрлөх замаар гэдэсний хучуур эдийн бүтцийг дуурайлган урьдчилан бүтэцлэгдсэн 3 хэмжээст гидрогелийн шатыг ашигладаг. 3D хэвлэсэн, микро тээрэмдсэн эсвэл литографийн аргаар хийсэн хэв ашиглан гидрогелийн шатыг үйлдвэрлэнэ. Энэ арга нь тусгаарлагдсан хучуур эдийн эсийн in vitro өөрөө зохион байгуулалттай зохион байгуулалтыг физиологийн хувьд хамааралтай морфоген градиенттэй хамт харуулж, шат руу стромын эсүүдийг оруулснаар өндөр харьцаатай хучуур эдийн бүтэц, стром-хучуур эдийн хөндлөн огтлолыг тогтоодог. Гэсэн хэдий ч урьдчилан бүтэцлэгдсэн шатны мөн чанар нь аяндаа үүсэх морфогенетикийн процессыг өөрөө харуулахаас сэргийлж болзошгүй юм. Эдгээр загварууд нь мөн динамик люмен буюу завсрын урсгалыг өгдөггүй бөгөөд гэдэсний эсүүд морфогенезд орж, физиологийн үйл ажиллагааг олж авахад шаардлагатай шингэний зүсэлтийн стрессгүй байдаг. Саяхны өөр нэг судалгаагаар гидрогелийн шатыг микрофлюидик платформ дээр ашиглаж, лазер сийлбэрийн техник ашиглан гэдэсний хучуур эдийн бүтцийг хээтэй болгосон. Хулганы гэдэсний органоидууд нь сийлбэрлэгдсэн хэв маягийг дагаж гэдэсний гуурсан бүтэц үүсгэдэг бөгөөд люмен доторх шингэний урсгалыг микрофлюидик модулийг ашиглан дахин тоймлосон. Гэсэн хэдий ч энэ загвар нь аяндаа морфогенетикийн процессуудыг харуулдаггүй бөгөөд гэдэсний механик биологийн хөдөлгөөнийг оруулаагүй болно. Нэг бүлгийн 3D хэвлэх техникүүд нь аяндаа морфогенетикийн процесс бүхий бяцхан гэдэсний хоолойг бий болгож чадсан. Хоолой доторх өөр өөр гэдэсний сегментүүдийг нарийн төвөгтэй байдлаар хийсэн ч энэ загвар нь люмений шингэний урсгал болон механик деформаци дутагдалтай байдаг. Нэмж дурдахад, загварын ажиллах чадвар хязгаарлагдмал байж болно, ялангуяа био хэвлэх үйл явц дууссаны дараа, туршилтын нөхцөл байдал эсвэл эс хоорондын харилцан үйлчлэлийг алдагдуулсны дараа. Үүний оронд бидний санал болгож буй протокол нь аяндаа гэдэсний морфогенез, физиологийн хувьд хамааралтай зүсэлтийн стресс, гэдэсний хөдөлгөөнийг дуурайдаг биомеханик, бие даасан оройн болон базоларын тасалгаануудын хүртээмж, модульчлагдсан цогц биологийн бичил орчныг дахин бүтээх боломжийг олгодог. Тиймээс бидний in vitro 3D морфогенезийн протокол нь одоо байгаа аргуудын бэрхшээлийг даван туулах нэмэлт аргыг санал болгож магадгүй юм.
Манай протокол нь бүхэлдээ 3 хэмжээст хучуур эдийн морфогенезд чиглэгддэг бөгөөд өсгөвөрт зөвхөн хучуур эдийн эсүүд байдаг бөгөөд мезенхимийн эсүүд, эндотелийн эсүүд, дархлааны эсүүд гэх мэт бусад төрлийн эргэн тойрон дахь эсүүд байдаггүй. Өмнө дурдсанчлан, манай протоколын гол цөм нь нэвтрүүлсэн орчны базолар талд ялгардаг морфогенийн дарангуйлагчдыг зайлуулснаар хучуур эдийн морфогенезийг өдөөх явдал юм. Бидний гэдэс-чип дээрх болон эрлийз-чип дээрх бат бөх модульчлал нь долгионтой 3 хэмжээст хучуур эдийн давхаргыг дахин бүтээх боломжийг олгодог боловч хучуур эд-мезенхимийн харилцан үйлчлэл 33,34, эсийн гаднах матриц (ECM) тунадас 35 болон бидний загварт суурь криптэд үүдэл эсийн орон зайг дамжуулдаг крипто-виллус шинж чанарууд зэрэг нэмэлт биологийн нарийн төвөгтэй байдлыг цаашид авч үзэх шаардлагатай хэвээр байна. Мезенхим дэх стромын эсүүд (жишээлбэл, фибробластууд) нь ECM уургуудыг үйлдвэрлэх, гэдэсний морфогенезийг in vivo зохицуулахад гол үүрэг гүйцэтгэдэг 35,37,38. Манай загварт мезенхимийн эсүүдийг нэмснээр морфогенетикийн процесс болон эсийн... хавсаргах үр ашиг. Эндотелийн давхарга (өөрөөр хэлбэл хялгасан судас эсвэл лимфийн судаснууд) нь гэдэсний бичил орчинд молекулын тээвэрлэлтийг39 болон дархлааны эсийн элсэлтийг40 зохицуулахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Цаашилбал, эдийн загваруудыг олон эрхтний харилцан үйлчлэлийг харуулахаар зохион бүтээх үед эдийн загваруудын хооронд холбогдож болох судасны бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь урьдчилсан нөхцөл болдог. Тиймээс эрхтний түвшний нягтралтай илүү нарийвчлалтай физиологийн шинж чанарыг загварчлахын тулд эндотелийн эсүүдийг оруулах шаардлагатай байж магадгүй юм. Өвчтөний гаралтай дархлааны эсүүд нь гэдэсний өвчнийг дуурайлган хийх нөхцөлд төрөлхийн дархлааны хариу урвал, эсрэгтөрөгчийн танилцуулга, төрөлхийн дасан зохицох дархлааны харилцан үйлчлэл, эд эсэд өвөрмөц дархлааг харуулахад чухал үүрэгтэй.
Эрлийз чипийг ашиглах нь "гэдэсний дээр чип"-ээс илүү энгийн байдаг, учир нь төхөөрөмжийн тохиргоо нь илүү хялбар бөгөөд Трансвелл оруулгыг ашиглах нь гэдэсний хучуур эдийн өргөтгөх боломжтой өсгөвөрлөх боломжийг олгодог. Гэсэн хэдий ч худалдаанд байгаа полиэстр мембрантай Трансвелл оруулга нь уян харимхай биш бөгөөд перисталтик шиг хөдөлгөөнийг дуурайж чадахгүй. Цаашилбал, эрлийз чипэнд байрлуулсан Трансвелл оруулгын оройн хэсэг нь оройн тал дээр зүсэлтийн стрессгүйгээр хөдөлгөөнгүй хэвээр байв. Мэдээжийн хэрэг, оройн хэсэг дэх статик шинж чанарууд нь эрлийз чипэнд бактерийн урт хугацааны хамт өсгөвөрлөлтийг ховорхон зөвшөөрдөг. Бид эрлийз чип ашиглах үед Трансвелл оруулгад 3 хэмжээст морфогенезийг хүчтэй өдөөж чаддаг ч физиологийн хувьд хамааралтай биомеханик болон оройн шингэний урсгалын хомсдол нь эрлийз чипийн платформуудыг боломжит хэрэглээнд ашиглах боломжийг хязгаарлаж болзошгүй юм.
Хүний крипт-вилл тэнхлэгийг бүрэн хэмжээний сэргээн засварласан нь гэдэс-чип дээрх болон эрлийз-чип дээрх өсгөвөрт бүрэн тогтоогдоогүй байна. Морфогенез нь хучуур эдийн нэг давхаргаас эхэлдэг тул 3 хэмжээст бичил архитектур нь in vivo криптуудтай морфологийн ижил төстэй байдлыг заавал хангах албагүй. Бид микроинженерчлэгдсэн 3 хэмжээст хучуур эдийн суурь крипт домэйны ойролцоох үржиж буй эсийн популяцийг тодорхойлсон боловч крипт ба хөвөнгийн хэсгүүдийг тодорхой заагаагүй байна. Хэдийгээр чип дээрх дээд сувгууд нь микроинженерчлэгдсэн хучуур эдийн өндрийг нэмэгдүүлэхэд хүргэдэг ч хамгийн их өндөр нь ~300–400 µм хүртэл хязгаарлагдмал хэвээр байна. Нарийн болон бүдүүн гэдсэнд хүний ​​гэдэсний криптийн бодит гүн нь тус тус ~135 µм ба ~400 µм бөгөөд нарийн гэдэсний хөвөнгийн өндөр нь ~600 µм41 байна.
Дүрслэлийн үүднээс авч үзвэл, 3D бичил архитектурын in situ супер нягтралтай дүрслэлийг чип дээрх гэдсэнд хязгаарлаж болно, учир нь объектив линзээс хучуур эдийн давхарга хүртэлх шаардлагатай ажлын зай хэдхэн миллиметр орчим байдаг. Энэ асуудлыг даван туулахын тулд алсын объект шаардлагатай байж болно. Цаашилбал, PDMS-ийн өндөр уян хатан чанараас шалтгаалан дүрслэлийн дээж бэлтгэхэд нимгэн хэсгүүд хийх нь бэрхшээлтэй байдаг. Цаашилбал, чип дээрх гэдэс давхаргын бичил үйлдвэрлэл нь давхарга бүрийн хооронд байнгын наалдац шаарддаг тул хучуур эдийн давхаргын гадаргуугийн бүтцийг шалгахын тулд дээд давхаргыг нээх эсвэл авахад маш хэцүү байдаг. Жишээлбэл, сканнердах электрон микроскоп (SEM) ашиглан.
PDMS нь гидрофобик жижиг молекулуудтай холбоотой микрофлюидик дээр суурилсан судалгаанд PDMS-ийн гидрофобик чанар нь хязгаарлах хүчин зүйл болсон, учир нь PDMS нь ийм гидрофобик молекулуудыг өвөрмөц бус байдлаар шингээж чаддаг. PDMS-ийн өөр хувилбаруудыг бусад полимер материалуудтай хамт авч үзэж болно. Эсвэл гидрофобик молекулуудын шингээлтийг багасгахын тулд PDMS-ийн гадаргуугийн өөрчлөлтийг (жишээлбэл, липофилик материал 42 эсвэл поли (этилен гликол) 43-аар бүрэх) авч үзэж болно.
Эцэст нь хэлэхэд, бидний арга нь өндөр хүчин чадалтай скрининг эсвэл "бүгдэд тохирох нэг хэмжээ" хэрэглэгчдэд ээлтэй туршилтын платформоор хангах тал дээр сайн тодорхойлогдоогүй байна. Одоогийн протокол нь микро төхөөрөмж бүрт тариурын шахуурга шаарддаг бөгөөд энэ нь CO2 инкубаторт зай эзэлдэг бөгөөд томоохон хэмжээний туршилтаас сэргийлдэг. Энэхүү хязгаарлалтыг шинэлэг өсгөврийн форматын өргөтгөх боломжоор (жишээлбэл, базолартераль орчныг тасралтгүй нөхөж, зайлуулах боломжийг олгодог 24 нүхтэй, 96 нүхтэй, эсвэл 384 нүхтэй сүвэрхэг оруулга) мэдэгдэхүйц сайжруулж болно.
Хүний гэдэсний хучуур эдийн 3 хэмжээст морфогенезийг in vitro нөхцөлд өдөөхийн тулд бид хоёр зэрэгцээ микро суваг болон тэдгээрийн хооронд уян хатан сүвэрхэг мембран агуулсан микрофлюидик чип гэдэсний төхөөрөмжийг ашиглан люмен-хялгасан судасны интерфейсийг бий болгосон. Мөн бид Трансвеллийн оруулга дээр ургуулсан туйлширсан хучуур эдийн давхаргын доор тасралтгүй базолатераль урсгалыг хангадаг нэг сувгийн микрофлюидик төхөөрөмж (эрлийз чип)-ийг ашиглахыг харуулж байна. Хоёр платформ дээр хүний ​​гэдэсний янз бүрийн хучуур эдийн эсийн морфогенезийг базолатераль тасалгаанаас морфоген антагонистуудыг зайлуулахын тулд урсгалын чиглэлийг өөрчлөх замаар харуулж болно. Туршилтын бүх процедур (Зураг 1) нь таван хэсгээс бүрдэнэ: (i) гэдэсний чип эсвэл Трансвеллийн оруулж болох эрлийз чипийг микро үйлдвэрлэх (1-5-р алхам; Хайрцаг 1), (ii) гэдэсний хучуур эдийн эсүүд (Caco-2 эсүүд) эсвэл хүний ​​гэдэсний органоидуудыг бэлтгэх; хайрцаг 2-5), (iii) гэдэсний хучуур эдийн эсийг гэдэсний чипс эсвэл эрлийз чипс дээр өсгөвөрлөх (6-9-р алхам), (iv) 3 хэмжээст хучуур эдийн бичил бүтцийг тодорхойлохын тулд in vitro нөхцөлд 3 хэмжээст морфогенезийг өдөөх (10-р алхам) ба (v)) (11-24-р алхам). Эцэст нь, хучуур эдийн морфогенезийг орон зайн, цаг хугацааны, нөхцөлт эсвэл процедурын хяналттай харьцуулж in vitro нөхцөлд морфогенезийн үр нөлөөг баталгаажуулах зохих хяналтын бүлгийг (доор дэлгэрэнгүй авч үзнэ) боловсруулсан.
Бид хоёр өөр өсгөврийн платформ ашигласан: шулуун сувагтай эсвэл шугаман бус мушгирсан сувагтай гэдэс-чип эсвэл 1-р хайрцагт тайлбарласны дагуу үйлдвэрлэсэн Трансвелл (TW) оруулгатай микрофлюидик төхөөрөмж дэх эрлийз чип, 1-р хайрцаг болон 1-5-р алхамд заасны дагуу үйлдвэрлэсэн. “Төхөөрөмжийн үйлдвэрлэл” нь дан чип эсвэл эрлийз чип хийх үндсэн алхмуудыг харуулдаг. “Хүний гэдэсний хучуур эдийн эсийн өсгөвөр” нь энэхүү протоколд ашигласан эсийн эх үүсвэр (Caco-2 эсвэл хүний ​​гэдэсний органоид) болон өсгөврийн процедурыг тайлбарладаг. “In vitro морфогенез” нь Caco-2 эсвэл органоидоос гаралтай хучуур эдийн эсийг гэдэсний чип эсвэл эрлийз чипийн Трансвелл оруулга дээр өсгөвөрлөх, дараа нь 3 хэмжээст морфогенезийг өдөөх, тодорхойлсон хучуур эдийн бүтцийг бий болгох ерөнхий алхмуудыг харуулдаг. Хөтөлбөрийн алхамын дугаар эсвэл хайрцагны дугаарыг сум бүрийн доор харуулав. Аппликейшн нь тогтсон гэдэсний хучуур эдийн давхаргыг хэрхэн ашиглаж болох жишээг өгдөг, жишээлбэл, эсийн ялгаварлан гадуурхалтын шинж чанар, гэдэсний физиологийн судалгаа, эзэн-микробиомын экосистемийг тогтоох, өвчний загварчлалд. “Эс” дэх дархлаа флуоресценцийн зургууд "Ялгаварлан гадуурхалт" нь гэдэсний чип дээр үүссэн 3D Caco-2 хучуур эдийн давхаргад илэрхийлэгдсэн цөм, F-актин болон MUC2-ийг харуулж байна. MUC2 дохиолол нь аяга эсүүд болон салст бүрхүүлийн гадаргуугаас ялгардаг салстад байдаг. Гэдэсний физиологийн флуоресцент зургууд нь флуоресцент улаан буудайн үр хөврөлийн агглютинин ашиглан сиалийн хүчил болон N-ацетилглюкозамины үлдэгдлийг будах замаар үүссэн салстыг харуулж байна. "Хост-Микробын хамтарсан өсгөвөр" дахь хоёр давхцсан зураг нь чип дээрх гэдсэн дэх хост-микробиомын төлөөллийн хам өсгөвөрийг харуулж байна. Зүүн самбар нь микроинженерийн аргаар боловсруулсан 3D Caco-2 хучуур эдийн эсүүдтэй ногоон флуоресцент уураг (GFP) илэрхийлсэн E. coli-ийн хам өсгөврийг харуулж байна. Баруун самбар нь 3D Caco-2 хучуур эдийн эсүүдтэй хам өсгөвөрлөсөн GFP E. coli-ийн байршлыг харуулж, дараа нь F-актин (улаан) болон цөмүүдээр (цэнхэр) иммунофлуоресценцийн будалтыг харуулж байна. Өвчний загварчлал нь бактерийн эсрэгтөрөгч (жишээ нь, липополисахарид)-тай физиологийн сорилтын дор гэдэсний үрэвслийн чипүүдэд эрүүл ба гоожиж буй гэдсийг харуулж байна. LPS) болон дархлааны эсүүд (жишээ нь, PBMC; ногоон). Caco-2 эсүүдийг 3 хэмжээст хучуур эдийн давхарга үүсгэхийн тулд өсгөвөрлөсөн. Масштабын мөр, 50 µм. Доод мөрөнд байгаа зургууд: “Эсүүдийн ялгаа”-г лавлагаанаас зөвшөөрөл авч тохируулсан.2. Оксфордын Их Сургуулийн Хэвлэлийн газар; 5-р лавлагаанаас зөвшөөрөл авч хуулбарласан. NAS; “Хост-Микробын Хамтын өсгөвөр”-ийг 3-р лавлагаанаас зөвшөөрөл авч тохируулсан. NAS; “Өвчний загварчлал”-ыг лавлагаанаас зөвшөөрөл авч тохируулсан.5. NAS.
Чип дээрх гэдэс болон эрлийз чипүүдийг хоёуланг нь зөөлөн литографигаар цахиурын хэвнээс задалж, SU-8-аар хээтэй PDMS хуулбаруудыг ашиглан үйлдвэрлэсэн. Чип бүрийн микро сувгуудын загварыг зүсэлтийн стресс болон гидродинамик даралт зэрэг гидродинамикийг харгалзан тодорхойлдог. Хоёр зэрэгцээ байрлуулсан зэрэгцээ шулуун микро сувгаас бүрдсэн анхны гэдэс дээрх гэдэс загвар (Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 1a) нь шингэний оршин тогтнох хугацааг нэмэгдүүлэх, шугаман бус урсгалын хэв маяг, өсгөвөрлөсөн эсийн олон тэнхлэгийн деформацийг өдөөх хос муруй микро сувгийг багтаасан цогц гэдэс дээрх гэдэс (Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 1b) болж хөгжсөн (Зураг 2a-f). 12. Илүү нарийн төвөгтэй гэдэс биомеханикийг дахин бүтээх шаардлагатай үед нарийн төвөгтэй гэдэс дээрх гэдэс сонгож болно. Бид мушгирсан гэдэс-чип нь анхныхтай харьцуулахад ижил төстэй хучуур эдийн өсөлттэй ижил төстэй хугацаанд 3 хэмжээст морфогенезийг хүчтэй өдөөдөг болохыг харуулсан. Өсгөвөрлөсөн эсийн төрлөөс үл хамааран гэдэсний чип. Тиймээс 3 хэмжээст морфогенезийг өдөөхийн тулд шугаман болон нарийн төвөгтэй чип дээрх гэдэсний загваруудыг сольж болно. SU-8 хээтэй цахиурын хэвэнд хатаасан PDMS хуулбарууд нь задалсны дараа сөрөг шинж чанарыг өгсөн (Зураг 2a). Чип дээр гэдэсний гэдсийг үйлдвэрлэхийн тулд бэлтгэсэн дээд PDMS давхаргыг сүвэрхэг PDMS хальсанд дараалан холбож, дараа нь титэм боловсруулагч ашиглан эргэлт буцалтгүй холболтоор доод PDMS давхаргатай уялдуулсан (Зураг 2b–f). Эрлийз чип үйлдвэрлэхийн тулд хатаасан PDMS хуулбаруудыг шилэн слайдтай холбож, Трансвелл оруулгыг багтаах боломжтой нэг сувгийн микрофлюидик төхөөрөмжийг үүсгэсэн (Зураг 2h ба Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 2). Холболтын процессыг PDMS хуулбар болон шилний гадаргууг хүчилтөрөгчийн плазм эсвэл титэм боловсруулалтаар боловсруулж гүйцэтгэдэг. Силикон хоолойд бэхлэгдсэн микро үйлдвэрлэсэн төхөөрөмжийг ариутгасны дараа төхөөрөмжийн тохиргоо нь гэдэсний хучуур эдийн 3 хэмжээст морфогенезийг гүйцэтгэхэд бэлэн болсон (Зураг 2g).
a, SU-8 хээтэй цахиурын хэвнээс PDMS эд ангиудыг бэлтгэх бүдүүвч зураг. Хатаагүй PDMS уусмалыг цахиурын хэвэнд цутгаж (зүүн талд), 60 °C-д хатааж (дунд талд), буулгасан (баруун талд). Буулгасан PDMS-ийг хэсэг болгон хувааж, цаашид ашиглахаар цэвэрлэсэн.b, PDMS дээд давхаргыг бэлтгэхэд ашигласан цахиурын хэвний гэрэл зураг.c, PDMS сүвэрхэг мембраныг үйлдвэрлэхэд ашигласан цахиурын хэвний гэрэл зураг.d, Дээд ба доод PDMS бүрэлдэхүүн хэсгүүд болон угсарсан чип дээрх гэдэсний төхөөрөмжийн цуврал гэрэл зураг.e, Дээд, мембран болон доод PDMS бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг тохируулах бүдүүвч зураг. Давхарга бүрийг плазм эсвэл корона боловсруулалтаар эргэлт буцалтгүй холбодог.f, Давхарласан мушгирсан микро сувгууд болон вакуум камертай хийсэн гэдэс-чип төхөөрөмжийн бүдүүвч зураг.g, Микрофлюидик эсийн өсгөвөрт зориулсан гэдэс-чипийн тохиргоо. Силикон хоолой болон тариураар угсарсан чип дээрх хийсэн гэдсийг бүрхүүл дээр байрлуулсан. Чип төхөөрөмжийг таган дээр байрлуулсан. Боловсруулах зориулалттай 150 мм-ийн Петрийн аяга. Холбогчийг силикон хоолойг хаахад ашигладаг.h, Эрлийз чип үйлдвэрлэх болон эрлийз чип ашиглан 3 хэмжээст морфогенезийн дүрслэлийн агшин зургууд. Гэдэсний 3 хэмжээст морфогенезийг өдөөхийн тулд гэдэсний хучуур эдийн эсийн 2 хэмжээст давхаргыг өсгөвөрлөхөд бие даан бэлтгэсэн Трансвелл оруулгыг эрлийз чипэнд оруулсан. Трансвелл оруулга дээр тогтоосон эсийн давхаргын доорх бичил сувгаар дамжуулан тэжээлийн орчинг нэвт шингээдэг. Масштабын бар, 1 см.h Лавлах материалаас зөвшөөрөл авч дахин хэвлэв.4. Elsevier.
Энэхүү протоколд Caco-2 эсийн шугам болон гэдэсний органоидуудыг хучуур эдийн эх үүсвэр болгон ашигласан (Зураг 3a). Хоёр төрлийн эсийг бие даан өсгөвөрлөсөн (Хайрцаг 2 ба Хайрцаг 5) бөгөөд чип дээрх гэдэсний эсвэл Трансвелл оруулгын ECM бүрсэн микро сувгуудыг үржүүлэхэд ашигласан. Эсүүд нийлсэн үед (колбонд >95% бүрхэлт), Т-колбонд тогтмол өсгөвөрлөсөн Caco-2 эсүүдийг (10 ба 50-р гарцуудын хооронд) трипсинжүүлэлтийн шингэнээр диссоциацилагдсан эсийн суспензийг бэлтгэхийн тулд хурааж авдаг (Хайрцаг 2). Гэдэсний биопси эсвэл мэс заслын резекцээс гаргаж авсан хүний ​​гэдэсний органоидуудыг бүтцийн бичил орчныг дэмжихийн тулд 24 нүхтэй хавтан дахь Matrigel шатны бөмбөгөрт өсгөвөрлөсөн. Хайрцаг 3-т тайлбарласны дагуу бэлтгэсэн чухал морфоген (Wnt, R-спондин, Ноггин гэх мэт) болон өсөлтийн хүчин зүйлсийг агуулсан орчинг органоидууд диаметр нь ~500 µm хүртэл өсөх хүртэл өдөр бүр нэмэлтээр нэмэгдүүлсэн. Бүрэн ургасан органоидуудыг хурааж, задалдаг. чип дээрх гэдэс эсвэл Трансвелл оруулга дээр суулгах зориулалттай дан эсүүдэд (Хайрцаг 5). Өмнө нь мэдээлсэнчлэн үүнийг өвчний төрөл12,13 (жишээ нь шархлаат колит, Кроны өвчин, бүдүүн гэдэсний хорт хавдар, эсвэл хэвийн донор), гэмтлийн байршил (жишээ нь, гэмтэл ба гэмтээгүй хэсэг) болон зам дахь ходоод гэдэсний байршил (жишээ нь, арван хоёр нугас гэдэс, өтгөн гэдэс, цулцан, сохор гэдэс, бүдүүн гэдэс эсвэл шулуун гэдэс) зэргээс хамааран ялгаж болно. Бид 5-р хайрцагт нарийн гэдэсний органоидуудаас илүү өндөр концентрацитай морфоген шаарддаг бүдүүн гэдэсний органоид (колоид)-ыг өсгөвөрлөх оновчтой протоколыг өгсөн болно.
a, Гэдэсний чип дэх гэдэсний морфогенезийг өдөөх ажлын урсгал. Энэхүү протоколд Caco-2 хүний ​​гэдэсний хучуур эд болон гэдэсний органоидуудыг 3 хэмжээст морфогенезийг харуулахын тулд ашигладаг. Тусгаарлагдсан хучуур эдийн эсүүдийг бэлтгэсэн гэдэс-чип дээрх төхөөрөмжид (чип бэлтгэх) үржүүлсэн. Эсүүд 0-р өдөр (D0) PDMS сүвэрхэг мембранд үржиж (үржүүлж), наалдсаны дараа апикаль (AP) урсгалыг эхлүүлж, эхний 2 өдрийн турш хадгалдаг (урсгал, AP, D0-D2). Бүрэн 2 хэмжээст моно давхарга үүсэх үед базолатрал (BL) урсгалыг циклийн суналтын хөдөлгөөнтэй хамт эхлүүлдэг (суналт, урсгал, AP ба BL). Гэдэсний 3 хэмжээст морфогенез нь микрофлюидийн өсгөврийн 5 хоногийн дараа аяндаа үүссэн (морфогенез, D5). Фазын контраст зургууд нь туршилтын алхам эсвэл цаг хугацааны цэг бүрт Caco-2 эсийн төлөөллийн морфологийг харуулж байна (багана график, 100 µm). Гэдэсний морфогенезийн харгалзах каскадыг харуулсан дөрвөн схемийн диаграмм (дээд) баруун талд). Схем дэх тасархай сумнууд нь шингэний урсгалын чиглэлийг илэрхийлнэ.b, Тогтсон 3D Caco-2 хучуур эдийн гадаргуугийн топологийг харуулсан SEM зураг (зүүн талд). Томруулсан хэсгийг тодруулсан оруулга нь (цагаан тасархай хайрцаг) 3D Caco-2 давхарга дээрх нөхөн төлжсөн микровиллиг харуулж байна (баруун талд).c, Тогтсон Caco-2 3D, клаудин (ZO-1, улаан) болон F-актин (ногоон) ба цөм (цэнхэр) гэж тэмдэглэгдсэн тасралтгүй сойзтой хилийн мембраны хэвтээ урд талын харагдац. Гэдэсний чип дээрх хучуур эдийн эсийн иммунофлуоресценцийн конфокал дүрслэл. Дунд схем рүү чиглэсэн сумнууд нь конфокал харагдац бүрийн фокусын хавтгайн байршлыг заана.d, 3, 7, 9, 11, 13 дахь өдрүүдэд фазын контраст микроскопоор олж авсан чип дээр өсгөвөрлөсөн органоидуудын морфологийн өөрчлөлтийн хугацааны явц.Оруулга (баруун дээд талд) нь өгөгдсөн зургийн өндөр томруулалттай байдлыг харуулж байна.e, 7 дахь өдөр авсан зүсмэл дээр гэдсэнд үүссэн органоид 3D хучуур эдийн DIC фотомикрограф.f, Давхарласан иммунофлуоресценцийн зургууд нь гэдэсний чипс дээр 3 өдөр (Зүүн) болон хучуур эдийн давхарга дээр 13 хоногийн (дунд) органоидууд тус тус ургуулсан үүдэл эс (LGR5; ягаан), аяга эс (MUC2; ногоон), F-актин (саарал) болон цөм (хөх)-ийн маркеруудыг харуулсан. Мөн MUC2 дохиололгүйгээр LGR5 дохиоллыг онцолсон Өргөтгөсөн өгөгдлийн 3-р зургийг үзнэ үү. Өсгөвөрлөлтийн 13 дахь өдөр CellMask будгаар (баруун) плазмын мембраныг будах замаар чип дээр гэдсэнд үүссэн 3D органоид хучуур эдийн хучуур эдийн бичил бүтцийг (баруун) харуулсан флуоресценцийн зургууд. Өөрөөр заагаагүй бол масштабын зурвас нь 50 μм байна.b Лавлах материалаас зөвшөөрөл авч дахин хэвлэв.2. Оксфордын Их Сургуулийн Хэвлэлийн газар; c Лавлах материалаас зөвшөөрөл авч тохируулсан.2. Оксфордын Их Сургуулийн Хэвлэлийн газар; e ба f лавлах материалаас зөвшөөрөл авч тохируулсан.12 Creative Commons License CC BY 4.0-ийн дагуу.
Чип дээрх гэдсэнд ECM бүрхүүлийг амжилттай хийхийн тулд PDMS сүвэрхэг мембраны гидрофобик гадаргууг өөрчлөх шаардлагатай. Энэхүү протоколд бид PDMS мембраны гидрофобик чанарыг өөрчлөх хоёр өөр аргыг хэрэглэдэг. Caco-2 эсийг өсгөвөрлөхийн тулд зөвхөн хэт ягаан туяа/озоны боловсруулалтаар гадаргууг идэвхжүүлэх нь PDMS гадаргуугийн гидрофобик чанарыг бууруулж, ECM-ийг бүрж, Caco-2 эсийг PDMS мембранд бэхлэхэд хангалттай байсан. Гэсэн хэдий ч органоид хучуур эдийн микрофлюидик өсгөвөр нь PDMS микро сувгуудад полиэтиленимин (PEI) болон глутаральдегидийг дараалан түрхэж ECM уургийг үр дүнтэй тунадасжуулахын тулд химийн суурьтай гадаргуугийн функциональчлалыг шаарддаг. Гадаргууг өөрчилсний дараа ECM уургуудыг функциональ PDMS гадаргууг бүрхэхээр тунадасжуулж, дараа нь тусгаарлагдсан органоид хучуур эдэд оруулсан. Эсүүдийг хавсаргасны дараа микрофлюидик эсийн өсгөвөр нь эсүүд бүрэн моно давхарга үүсгэх хүртэл зөвхөн орчныг дээд микро суваг руу нэвт шингээж эхэлдэг бол доод микро суваг нь статик нөхцлийг хадгалдаг. Гадаргууг идэвхжүүлэх болон ECM бүрхүүлийн энэхүү оновчтой арга нь органоид хучуур эдийн хавсаргалтыг өдөөх боломжийг олгодог. PDMS гадаргуу дээрх 3 хэмжээст морфогенез.
Трансвелл өсгөвөр нь эсийн үр суулгахаас өмнө ECM бүрхүүл шаарддаг; гэсэн хэдий ч Трансвелл өсгөвөр нь сүвэрхэг оруулгын гадаргууг идэвхжүүлэхийн тулд нарийн төвөгтэй урьдчилсан боловсруулалтын алхмуудыг шаарддаггүй. Трансвелл оруулга дээр Caco-2 эсийг ургуулахын тулд сүвэрхэг оруулга дээрх ECM бүрхүүл нь диссоциацилагдсан Caco-2 эсийн наалдацыг (<1 цаг) болон нягт холболтын саад үүсэхийг (<1-2 өдөр) хурдасгадаг. Трансвелл оруулга дээрх органоидуудыг өсгөвөрлөхийн тулд тусгаарлагдсан органоидуудыг ECM бүрсэн оруулга дээр үржүүлж, мембраны гадаргуу дээр нааж (<3 цаг), органоидууд нь саадын бүрэн бүтэн байдал бүхий бүрэн моно давхарга үүсгэх хүртэл хадгалдаг. Трансвелл өсгөврийг эрлийз чипс ашиглахгүйгээр 24 нүхтэй хавтангаар гүйцэтгэдэг.
In vitro 3D морфогенезийг тогтсон хучуур эдийн давхаргын базолар тал руу шингэний урсгалыг түрхэх замаар эхлүүлж болно. Чип дээрх гэдсэнд дээд ба доод микро сувгууд руу тэжээлийн орчинг нэвтрүүлэх үед хучуур эдийн морфогенез эхэлдэг (Зураг 3a). Өмнө дурдсанчлан, чиглэлтэй ялгардаг морфогенийн дарангуйлагчдыг тасралтгүй зайлуулахын тулд доод (базолар талын) хэсэгт шингэний урсгалыг нэвтрүүлэх нь чухал юм. Сүвэрхэг мембран дээр холбогдсон эсүүдэд хангалттай шим тэжээл, ийлдэс өгөх, люмений зүсэлтийн стресс үүсгэхийн тулд бид ихэвчлэн чип дээрх гэдсэнд давхар урсгалыг түрхдэг. Эрлийз чипүүдэд хучуур эдийн моно давхарга агуулсан Трансвелл оруулгыг эрлийз чипэнд оруулсан. Дараа нь тэжээлийн орчинг микро сувгаар дамжуулан сүвэрхэг Трансвелл оруулгын базолар талын доор түрхсэн. Гэдэсний морфогенез нь хоёр өсгөвөрлөлтийн тавцан дээр базолар урсгал эхэлснээс хойш 3-5 хоногийн дараа үүссэн.
Микроинженерийн 3D хучуур эдийн давхаргын морфологийн шинж чанарыг фазын контраст микроскоп, дифференциал интерференцийн контраст (DIC) микроскоп, SEM, эсвэл иммунофлуоресценцийн конфокал микроскоп зэрэг янз бүрийн дүрслэх аргуудыг ашиглан шинжилж болно (Зураг 3 ба 4). 3D хучуур эдийн давхаргын хэлбэр, цухуйсан байдлыг хянахын тулд фазын контраст эсвэл DIC дүрслэлийг өсгөвөрлөх явцад хүссэн үедээ хялбархан хийж болно. PDMS болон полиэстр хальсны оптик тунгалаг байдлаас шалтгаалан чип дээрх гэдэс болон эрлийз чип платформууд нь төхөөрөмжийг хэсэгчлэн хуваах эсвэл задлах шаардлагагүйгээр бодит цагийн in situ дүрслэлийг өгөх боломжтой. Иммунофлуоресценцийн дүрслэл хийх үед (Зураг 1, 3c, f ба 4b, c) эсүүдийг ихэвчлэн 4% (жин/воль) параформальдегид (PFA)-аар бэхлээд, дараа нь Triton X-100 болон 2% (жин/воль)) үхрийн сийвэнгийн альбумин (BSA)-аар дарааллаар нь бэхэлдэг. Эсийн төрлөөс хамааран янз бүрийн бэхлэгч, нэвчилт үүсгэгч, хаагч бодисуудыг ашиглаж болно. ашигласан. Удам угсаанаас хамааралтай эс эсвэл бүсийн тэмдэглэгээг чиглүүлсэн анхдагч эсрэгбиеийг чип дээр хөдөлгөөнгүй болсон эсүүдийг тодруулахад ашигладаг бөгөөд дараа нь хоёрдогч эсрэгбиеийг цөм (жишээ нь, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) эсвэл F-актин (жишээ нь, флуоресцент шошготой фаллоидин)-ийг чиглүүлсэн эсрэг будгийн хамт ашигладаг. Флуоресценцийн суурьтай амьд дүрслэлийг мөн салс үүсэхийг (Зураг 1, “Эсийн ялгаварлан гадуурхалт” ба “Гэдэсний физиологи”), бичил биетний эсийн санамсаргүй колоничлол (Зураг 1, “Хост-микробын хамт өсгөвөр”), дархлааны эсийн элсэлтийг (Зураг 1, 'Өвчний загварчлал') эсвэл 3D хучуур эдийн морфологийн хэлбэрийг (Зураг 3c, f ба 4b,c) илрүүлэхийн тулд in situ хийж болно. Лавлагаанд дурдсанчлан дээд давхаргыг доод микро сувгийн давхаргаас салгахын тулд чип дээрх гэдсийг өөрчлөх үед. Зураг 2-т үзүүлсэнчлэн, 3D хучуур эдийн морфологи, мөн оройн сойзны хил дээрх микровилли SEM-ээр дүрслэн харуулж болно (Зураг 3b). Ялгаварлан гадуурхах маркеруудын илэрхийлэлийг тоон PCR5 эсвэл нэг эсийн РНХ-ийн дарааллыг ашиглан үнэлж болно. Энэ тохиолдолд гэдэсний чипс эсвэл эрлийз чипсэд ургуулсан хучуур эдийн эсийн 3 хэмжээст давхаргыг трипсинжүүлэлтээр хурааж аваад дараа нь молекул эсвэл генетикийн шинжилгээнд ашигладаг.
a, Эрлийз чип дэх гэдэсний морфогенезийг өдөөх ажлын урсгал. Энэхүү протоколд Caco-2 болон гэдэсний органоидуудыг эрлийз чип платформ дээр 3 хэмжээст морфогенезийг харуулахад ашигладаг. Салсан хучуур эдийн эсүүдийг бэлтгэсэн Трансвелл оруулгад (TW бэлтгэл; доорх зургийг үзнэ үү) суулгасан. Трансвелл оруулгад эсүүдийг суулгаж (үржүүлж), полиэстр мембранд наалдуулсны дараа бүх эсийг статик нөхцөлд өсгөвөрлөв (TW өсгөвөр). 7 хоногийн дараа хучуур эдийн эсийн 2 хэмжээст нэг давхарга агуулсан Трансвелл оруулгыг эрлийз чипд нэгтгэж, базолат урсгалыг (Урсгал, BL) нэвтрүүлсэн бөгөөд энэ нь эцэстээ 3 хэмжээст хучуур эдийн давхарга (морфогенез) үүсэхэд хүргэсэн. Туршилтын алхам эсвэл цаг хугацааны цэг бүрт хэвийн донор (C103 шугам) өгсөх бүдүүн гэдсээс гаргаж авсан хүний ​​эрхтний хучуур эдийн эсийн морфологийн шинж чанарыг харуулсан фазын контраст микрографууд. Дээд давхарга дахь схемүүд нь алхам бүрийн туршилтын тохиргоог харуулж байна. b, Эрлийз чипүүд (зүүн схем) нь өөр өөр Z цэг дээр авсан дээрээс доош конфокал микроскопийн харагдацаар органоид хучуур эдийн эсийн 3 хэмжээст морфогенезийг үүсгэж болно. байрлалууд (дээд, дунд, доод; баруун талын схем болон харгалзах цэгтэй шугамыг үзнэ үү). морфологийн шинж чанарууд илэрхий харагдаж байна. F-актин (хөх), цөм (саарал).c, Статик Трансвелл (TW; цагаан тасархай хайрцаг дотор оруулга)-д өсгөвөрлөсөн органоид гаралтай хучуур эдийн эсүүдийн флуоресценцийн конфокал микрографууд (3 хэмжээст өнцөгт харагдац) болон эрлийз чип (хамгийн том бүтэн зураг)-д тус тус 2D болон 3D морфологийг харьцуулсан. 2D босоо хөндлөн огтлолын хос харагдац (баруун дээд буланд оруулга; “XZ”) нь мөн 2D болон 3D онцлогуудыг харуулж байна. Масштабын мөр, 100 µm.c Лавлагаанаас зөвшөөрөл авч дахин хэвлэв.4. Elsevier.
Хяналтын эсүүдийг ижил эсүүдийг (Caco-2 эсвэл гэдэсний органоид хучуур эдийн эсүүд) уламжлалт статик өсгөврийн нөхцөлд хоёр хэмжээст моно давхарга болгон өсгөвөрлөж бэлтгэж болно. Микро сувгуудын хязгаарлагдмал эзэлхүүний багтаамжаас (жишээ нь анхны гэдэсний чипийн загвар дээрх дээд сувагт ~4 µL) шалтгаалан шим тэжээлийн хомсдол үүсч болзошгүйг тэмдэглэх нь зүйтэй. Тиймээс базолартераль урсгалыг хэрэглэхээс өмнө болон дараа хучуур эдийн морфологийг харьцуулж болно.
Зөөлөн литографийн процессыг цэвэр өрөөнд хийх ёстой. Чип (дээд ба доод давхарга ба мембран) болон эрлийз чип дээрх давхарга бүрийн хувьд бичил сувгуудын өндөр өөр өөр байсан тул тусдаа цахиурын вафли дээр өөр өөр фотомаск ашиглаж, үйлдвэрлэсэн. Чип дээрх гэдэсний дээд ба доод микро сувгуудын зорилтот өндөр нь тус тус 500 µм ба 200 µм байна. Эрлийз чипийн сувгийн зорилтот өндөр нь 200 µм байна.
Ацетонтой саванд 3 инчийн силикон вафли хийнэ. Тавгийг 30 секундын турш зөөлөн эргүүлээд, дараа нь агаарт хатаана. Вафлиг IPA-тай таваг руу шилжүүлээд, дараа нь тавгийг 30 секундын турш эргүүлж цэвэрлэнэ.
Цахиурын вафлийн гадаргуугаас органик үлдэгдлийг хамгийн их хэмжээгээр зайлуулахын тулд пиранья уусмал (устөрөгчийн хэт исэл ба баяжуулсан хүхрийн хүчлийн холимог, 1:3 (vol/vol))-г сонголтоор ашиглаж болно.
Пираньягийн уусмал нь маш их идэмхий бөгөөд дулаан ялгаруулдаг. Нэмэлт аюулгүй байдлын арга хэмжээ авах шаардлагатай. Хог хаягдлыг зайлуулахын тулд уусмалыг хөргөөд цэвэр, хуурай хог хаягдлын саванд хийнэ. Хоёрдогч сав ашиглаж, хог хаягдлын савыг зохих ёсоор шошголоно уу. Илүү дэлгэрэнгүй журмыг авахын тулд байгууламжийн аюулгүй байдлын удирдамжийг дагаж мөрдөнө үү.
Вафлиг 200°C халуун тавган дээр 10 минут тавьж хатаана. Усгүйжүүлсний дараа вафлиг агаарт таван удаа сэгсэрч хөргөнө.
Цэвэрлэсэн цахиурын вафлийн голд ~10 гр фоторезист SU-8 2100 хийнэ. Фоторезистийг вафли дээр жигд тараахын тулд хясаа ашиглана. Фоторезистийг наалдамхай биш, түрхэхэд хялбар болгохын тулд вафлиг хааяа 65°C халуун хавтан дээр байрлуулна. Вафлиг шууд халуун хавтан дээр байрлуулж болохгүй.
SU-8-ийг ээрэх бүрхүүл ажиллуулснаар вафер дээр жигд тархсан. SU-8-ийн ирж буй эргэлтийг 5-10 секундын турш 500 эрг/мин хурдтайгаар 100 эрг/с хурдатгалтайгаар тараахын тулд програмчилна. Үндсэн эргэлтийг 1500 эрг/мин хурдтайгаар 200 мкм зузаантай хэв маягаар тохируулах эсвэл 1200 эрг/мин хурдтайгаар 30 секундын хурдатгалтайгаар 250 мкм зузаантай болгох (чип дээрх гэдэсний дээд давхаргын хувьд 500 мкм өндөр болгох; доорх "Чухал алхамууд"-ыг үзнэ үү)
Үндсэн эргэлтийн хурдыг цахиурын хавтангийн SU-8 хэв маягийн зорилтот зузаанаас хамааран тохируулж болно.
Чип дээрх гэдэсний дээд давхаргад зориулж 500 µм өндөртэй SU-8 хэв маягийг үйлдвэрлэхийн тулд энэхүү Хайрцагны ээрэх бүрхүүл болон зөөлөн жигнэх алхмуудыг (7 ба 8-р алхамууд) дараалан давтаж (9-р алхамыг үзнэ үү) 250 µм зузаантай хоёр давхаргыг гаргаж авсан бөгөөд энэ хайрцагны 12-р алхамд хэт ягаан туяаны нөлөөллөөр давхарлаж, холбож болох SU-8 зузаан давхаргыг гаргаж авсан бөгөөд 500 µм өндөр давхарга үүсгэсэн.
SU-8 бүрсэн вафлиг зөөлөн жигнэхийн тулд вафлиг 65°C-д 5 минутын турш халуун тавган дээр болгоомжтой байрлуулж, дараа нь тохиргоог 95°C болгож, дахин 40 минут инкубацлана.
Дээд бичил сувагт SU-8 хэв маягийн 500 μм өндөрт хүрэхийн тулд 250 μм зузаантай хоёр SU-8 давхаргыг үүсгэхийн тулд 7 ба 8-р алхмуудыг давтана уу.
Хэт ягаан туяаны маск тэгшлэгч ашиглан үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу чийдэнгийн туршилтыг хийж, вафлийн өртөх хугацааг тооцоолно уу. (өртөлтийн хугацаа, мс) = (өртөлтийн тун, мЖ/см2)/(чийдэнгийн чадал, мВт/см2).
Гэрэл өгөх хугацааг тодорхойлсны дараа фотомаскийг хэт ягаан туяаны маск тэгшлэгчийн маскны суурь дээр байрлуулж, фотомаскийг SU-8 бүрсэн вафли дээр байрлуулна.
Хэт ягаан туяаны тархалтыг багасгахын тулд фотомаскийн хэвлэсэн гадаргууг цахиурын вафлийн SU-8 бүрсэн тал дээр шууд байрлуулна.
SU-8 бүрсэн вафли болон фотомаскийг урьдчилан тодорхойлсон хугацаанд 260 мЖ/см2 хэт ягаан туяанд босоо чиглэлд байрлуулна (энэ хайрцгийн 10-р алхамыг үзнэ үү).
Хэт ягаан туяанд өртсөний дараа SU-8 бүрсэн цахиурын вафлигуудыг 200 мкм өндөртэй хэв маяг хийхийн тулд халуун хавтан бүр дээр 65°C-д 5 минут, 95°C-д 15 минут жигнэж, 500 мкм өндөртэй хэв маягийг гаргаж авсан. 95°C-д жигнэсний дараах хугацааг 30 минут болгож сунгаж, 500 мкм өндөртэй хэв маягийг гаргаж авсан.
Хөгжүүлэгчийг шилэн саванд хийж, жигнэсэн вафлиг саванд хийнэ. SU-8 хөгжүүлэгчийн хэмжээ нь шилэн хавтангийн хэмжээнээс хамаарч өөр өөр байж болно. Ил гараагүй SU-8-г бүрэн арилгахад хангалттай хэмжээний SU-8 хөгжүүлэгч ашиглахаа мартуузай. Жишээлбэл, 1 литрийн багтаамжтай 150 мм диаметртэй шилэн сав ашиглахдаа ~300 мл SU-8 хөгжүүлэгч хэрэглэнэ. Хэвийг 25 минутын турш хааяа зөөлөн эргүүлж боловсруулна.
Боловсруулсан хэвийг ~10 мл шинэхэн хөгжүүлэгчээр зайлж, дараа нь уусмалыг пипеткээр шүршиж IPA хийнэ.
Ваферийг плазмын цэвэрлэгчэнд хийж, хүчилтөрөгчийн плазмд (агаар мандлын хий, зорилтот даралт 1 × 10−5 Торр, чадал 125 Вт) 1.5 минут байлгана.
Ваферийг дотор нь шилэн слайдтай вакуум хатаагчинд хийнэ. Вафер болон слайдуудыг зэрэгцүүлэн байрлуулж болно. Хэрэв вакуум хатаагчийг хавтангаар хэд хэдэн давхаргад хуваасан бол слайдуудыг доод камерт, ваферуудыг дээд камерт байрлуулна. Шилэн слайд дээр 100 мкл трихлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силан уусмал дусааж, вакуум ашиглан силанжуулна.
Хөлдөөсөн Caco-2 эсийн шилийг 37°C усан ваннд гэсгээгээд, дараа нь гэсгээсэн эсүүдийг 15 мл 37°C урьдчилан халаасан Caco-2 тэжээлт орчинтой T75 колбонд хийнэ.
Caco-2 эсүүдийг ~90% нийлсэн үед нэвтрүүлэхийн тулд эхлээд Caco-2 орчин, PBS болон 0.25% трипсин/1 мМ EDTA-г 37°C усан ваннд халаана.
Вакуум соролтоор орчныг сороно. Вакуум соролтыг давтан хийж, шинэ PBS нэмж, эсүүдийг 5 мл бүлээн PBS-ээр хоёр удаа угаана.