Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Морфогенез кишечника людини встановлює особливості крипто-ворсинчастої тривимірної епітеліальної мікроархітектури та просторової організації. Ця унікальна структура необхідна для підтримки гомеостазу кишечника, захищаючи нішу стовбурових клітин у базальній крипті від екзогенних мікробних антигенів та їх метаболітів. Крім того, кишкові ворсинки та секретуючий слиз представляють функціонально диференційовані епітеліальні клітини із захисним бар'єром на поверхні слизової оболонки кишечника. Тому відтворення тривимірних епітеліальних структур має вирішальне значення для побудови моделей кишечника in vitro. Примітно, що органічний міметичний кишечник на чіпі може індукувати спонтанний тривимірний морфогенез кишкового епітелію з покращеними фізіологічними функціями та біомеханікою. Тут ми пропонуємо відтворюваний протокол для надійної індукції кишкового морфогенезу в кишечнику на мікрофлюїдному чіпі, а також на вбудованому гібридному чіпі Transwell. Ми описуємо детальні методи виготовлення пристроїв, культивування клітин Caco-2 або кишкового органоїдного епітелію в звичайних умовах, а також на мікрофлюїдній платформі, індукції тривимірного морфогенезу та характеристики встановленого тривимірного епітелію за допомогою різних методів візуалізації. Цей протокол досягає регенерації функціональної мікроархітектури кишечника шляхом контролю базолатерального потоку рідини протягом 5 днів. Наш метод морфогенезу in vitro використовує фізіологічно значущу напругу зсуву та механічний рух і не вимагає складної клітинної інженерії чи маніпуляцій, що може перевершити інші існуючі методи. Ми передбачаємо, що запропонований нами протокол може мати широке значення для біомедичної дослідницької спільноти, забезпечуючи метод регенерації 3D-шарів кишкового епітелію in vitro для біомедичних, клінічних та фармацевтичних застосувань.
Експерименти демонструють, що клітини кишкового епітелію Caco-2, культивовані в пристроях «кишка на чіпі»1,2,3,4,5 або двошарових мікрофлюїдних пристроях6,7, можуть зазнавати спонтанного 3D-морфогенезу in vitro без чіткого розуміння основного механізму. У нашому нещодавньому дослідженні ми виявили, що видалення базолатерально секретованих антагоністів морфогенів з пристроїв для культивування є необхідним і достатнім для індукції 3D-епітеліального морфогенезу in vitro, що було продемонстровано за допомогою Caco-2 та кишкових органоїдів, отриманих від пацієнтів. Епітеліальні клітини були валідовані. У цьому дослідженні ми спеціально зосередилися на виробництві клітин та розподілі концентрації потужного антагоніста Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), у пристроях типу «кишка на чіпі» та модифікованих мікрофлюїдних пристроях, що містять вставки Transwell, що називаються «гібридним чіпом». Ми демонструємо, що додавання екзогенних антагоністів Wnt (таких як DKK-1, репресор Wnt 1, секретований білок frizzled-related 1 або Soggy-1) до кишківника на чіпі пригнічує морфогенез або порушує попередньо структурований 3D епітеліальний шар, що свідчить про те, що антагоністичний стрес під час культивування відповідає за морфогенез кишечника in vitro. Тому практичним підходом до досягнення надійного морфогенезу на епітеліальному інтерфейсі є видалення або мінімальне підтримання рівнів антагоністів Wnt у базолатеральному компартменті шляхом активного промивання (наприклад, на платформах «кишка на чіпі» або «гібрид на чіпі») або дифузії в базолатеральних середовищах (наприклад, з вставок Transwell у великі базолатеральні резервуари в лунках).
У цьому протоколі ми пропонуємо детальний метод виготовлення мікропристроїв «кишка на чіпі» та гібридних чіпів, що вставляються Transwell (кроки 1-5) для культивування кишкових епітеліальних клітин на пористих мембранах на основі полідиметилсилоксану (PDMS) (кроки 6A, 7A, 8, 9) або поліефірних мембранах вставок Transwell (кроки 6B, 7B, 8, 9) та індукованого 3D-морфогенезу in vitro (крок 10). Ми також визначили клітинні та молекулярні особливості, що вказують на тканинно-специфічний гістогенез та клітинну диференціацію, залежну від лінії, застосовуючи кілька методів візуалізації (кроки 11-24). Ми індукуємо морфогенез, використовуючи людські кишкові епітеліальні клітини, такі як Caco-2 або кишкові органоїди, у двох форматах культури з технічними деталями, включаючи модифікацію поверхні пористих мембран, створення 2D-моношарів та біохімічні процеси кишечника та відтворення біомеханічного мікросередовища in vitro. Щоб індукувати 3D-морфогенез з 2D-епітеліальних моношарів, ми видалили антагоністи морфогенів в обох культивованих формах шляхом протікання. середовище в базолатеральний компартмент культури. Нарешті, ми пропонуємо уявлення про корисність регенерованого 3D епітеліального шару, який можна використовувати для моделювання морфоген-залежного росту епітелію, поздовжніх спільних культур господаря та мікробіома, патогенної інфекції, запального пошкодження, дисфункції епітеліального бар'єру та терапії на основі пробіотиків. Приклад впливу.
Наш протокол може бути корисним для широкого кола науковців у фундаментальних (наприклад, біологія слизової оболонки кишечника, біологія стовбурових клітин та біологія розвитку) та прикладних дослідженнях (наприклад, доклінічні випробування ліків, моделювання захворювань, тканинна інженерія та гастроентерологія) з широким спектром застосування. Завдяки відтворюваності та надійності нашого протоколу для індукції 3D-морфогенезу кишкового епітелію in vitro, ми передбачаємо, що наша технічна стратегія може бути поширена серед аудиторії, яка вивчає динаміку клітинної сигналізації під час розвитку, регенерації або гомеостазу кишечника. Крім того, наш протокол корисний для дослідження інфекції, спричиненої різними інфекційними агентами, такими як норовірус 8, коронавірус 2 тяжкого гострого респіраторного синдрому (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 або холерний вібріон. Також корисними є аудиторії патології та патогенезу захворювань. Використання системи мікрофізіології кишечника на чіпі може дозволити поздовжнє спільне культивування 10 та подальшу оцінку захисту господаря, імунних реакцій та відновлення пошкоджень, пов'язаних з патогенами, у шлунково-кишковому (ШКТ) тракті 11. Інші розлади ШКТ, пов'язані із синдромом проникності кишечника, целіакією, хворобою Крона, виразковим колітом, резервуаром або синдромом подразненого кишечника, можна моделювати, коли 3D-шари кишкового епітелію готуються з використанням 3D-шарів кишкового епітелію пацієнта. Ці захворювання включають атрофію ворсинок, вкорочення крипт, пошкодження слизової оболонки або порушення епітеліального бар'єру. Біопсія або кишкові органоїди, отримані зі стовбурових клітин 12,13. Щоб краще змоделювати вищу складність середовища захворювання, читачі можуть розглянути можливість додавання типів клітин, релевантних до захворювання, таких як мононуклеарні клітини периферичної крові пацієнта (PBMC), до моделей, що містять 3D-мікроархітектуру ворсинок-крипт кишечника. тканинно-специфічні імунні клітини, 5.
Оскільки 3D-мікроструктуру епітелію можна зафіксувати та візуалізувати без процесу зрізання, глядачі, які працюють над просторовою транскриптомікою та зображеннями високої або надвисокої роздільної здатності, можуть бути зацікавлені в нашому картографуванні просторово-часової динаміки генів та білків на епітеліальних нішах. Цікавляться технологіями. Реакція на мікробні або імунні подразники. Крім того, поздовжні перехресні перешкоди між господарем та мікробіомом 10, 14, які координують гомеостаз кишечника, можуть бути встановлені в 3D-шарі слизової оболонки кишечника шляхом спільного культивування різних видів мікробів, мікробних спільнот або фекальної мікробіоти, особливо в кишківнику на чіпі. на платформі. Цей підхід особливо привабливий для аудиторії, яка вивчає імунологію слизової оболонки, гастроентерологію, мікробіом людини, культуроміку та клінічну мікробіологію, і прагне культивувати раніше некультивовану кишкову мікробіоту в лабораторії. Якщо наш протокол морфогенезу in vitro можна адаптувати до масштабованих форматів культивування, таких як багатолункові вставки в 24-, 96- або 384-лункові планшети, які безперервно поповнюють базолатеральні компартменти, протокол також можна поширити серед тих, хто розробляє фармацевтичні, біомедичні або високопродуктивні платформи скринінгу чи валідації для харчової промисловості. Як доказ принципу, ми нещодавно продемонстрували доцільність створення мультиплексної високопродуктивної системи морфогенезу, масштабованої до формату 24-лункового планшета. Крім того, було комерціалізовано кілька продуктів «орган на чіпі»16,17,18. Таким чином, валідацію нашого методу морфогенезу in vitro можна прискорити та потенційно прийняти багатьма дослідницькими лабораторіями, промисловістю або урядовими та регуляторними органами для розуміння клітинного репрограмування кишкового морфогенезу in vitro на транскриптомному рівні для тестування ліків або біотерапевтичних засобів. Поглинання та Транспортування кандидатів у ліки оцінювали за допомогою 3D-сурогатів кишечника або за допомогою спеціальних чи комерційних моделей органу на чіпі для оцінки відтворюваності процесу морфогенезу кишечника.
Обмежена кількість експериментальних моделей, що стосуються людини, була використана для вивчення морфогенезу кишкового епітелію, головним чином через відсутність протоколів, що підходять для індукції 3D-морфогенезу in vitro. Фактично, значна частина сучасних знань про морфогенез кишечника базується на дослідженнях на тваринах (наприклад, даніо реріо20, миші21 або кури22). Однак вони є трудомісткими та економічно значними, можуть бути етично сумнівними та, найголовніше, не точно визначають процеси розвитку людини. Ці моделі також дуже обмежені в можливості тестування багатостороннім масштабованим способом. Тому наш протокол для регенерації 3D-структур тканин in vitro перевершує моделі на тваринах in vivo, а також інші традиційні статичні 2D-моделі культури клітин. Як було описано раніше, використання 3D-епітеліальних структур дозволило нам дослідити просторову локалізацію диференційованих клітин у осі крипта-ворсинка у відповідь на різні слизові або імунні стимули. 3D-епітеліальні шари можуть надати простір для вивчення того, як мікробні клітини конкурують за формування просторових ніш та екологічної еволюції у відповідь на фактори господаря (наприклад, внутрішні та зовнішні шари слизу, секреція IgA та антимікробні пептиди).Крім того, 3D епітеліальна морфологія може дозволити нам зрозуміти, як кишкова мікробіота структурує свої спільноти та синергетично виробляє мікробні метаболіти (наприклад, коротколанцюгові жирні кислоти), які формують клітинну організацію та ніші стовбурових клітин у базальних криптах. Ці особливості можна продемонструвати лише тоді, коли 3D епітеліальні шари встановлені in vitro.
Окрім нашого методу створення 3D-структур кишкового епітелію, існує кілька методів in vitro. Культивування органоїдів кишечника – це найсучасніший метод тканинної інженерії, заснований на культивуванні стовбурових клітин кишечника за певних умов морфогену23,24,25. Однак використання 3D-моделей органоїдів для аналізу транспорту або спільних культур хазяїна та мікробіому часто є складним завданням, оскільки просвіт кишечника укладений всередині органоїда, і тому введення компонентів просвіту, таких як мікробні клітини або екзогенні антигени, обмежене. Доступ до просвітів органоїдів можна покращити за допомогою мікроінжектора26,27, але цей метод є інвазивним та трудомістким, і для його виконання потрібні спеціалізовані знання. Крім того, традиційні культури органоїдів, що утримуються в гідрогелевих каркасах за статичних умов, не точно відображають активну біомеханіку in vivo.
Інші підходи, що застосовуються кількома дослідницькими групами, використовують попередньо структуровані 3D гідрогелеві каркаси для імітації структури кишкового епітелію шляхом культивування ізольованих клітин кишечника людини на поверхні гелю. Виготовляють гідрогелеві каркаси за допомогою 3D-друкованих, мікрофрезерованих або літографічно виготовлених форм. Цей метод демонструє самоорганізоване розташування ізольованих епітеліальних клітин in vitro з фізіологічно відповідними градієнтами морфогенів, встановлюючи епітеліальну структуру з високим співвідношенням сторін та перехресні перешкоди строма-епітеліаль шляхом включення стромальних клітин до каркасу. Однак природа попередньо структурованих каркасів може перешкоджати відображенню самого спонтанного морфогенетичного процесу. Ці моделі також не забезпечують динамічного просвітного або інтерстиціального потоку, не маючи напруги зсуву рідини, необхідної кишковим клітинам для проходження морфогенезу та отримання фізіологічної функції. В іншому нещодавньому дослідженні використовували гідрогелеві каркаси в мікрофлюїдній платформі та створювали візерункові структури кишкового епітелію за допомогою методів лазерного травлення. Мишачі кишкові органоїди слідують витравленим візерункам для формування кишкових трубчастих структур, а внутрішньопросвітний потік рідини можна відтворити за допомогою мікрофлюїдного модуля. Однак ця модель не демонструє ні спонтанного морфогенетичні процеси, а також не включають механобіологічні рухи кишечника. Методи 3D-друку з тієї ж групи дозволили створити мініатюрні кишкові трубки зі спонтанними морфогенетичними процесами. Незважаючи на складне виготовлення різних сегментів кишечника всередині трубки, цій моделі також бракує потоку рідини в просвіті та механічної деформації. Крім того, працездатність моделі може бути обмеженою, особливо після завершення процесу біодруку, що порушує експериментальні умови або міжклітинну взаємодію. Натомість, запропонований нами протокол забезпечує спонтанний морфогенез кишечника, фізіологічно значущу напругу зсуву, біомеханіку, що імітує моторику кишечника, доступність незалежних апікальних та базолатеральних компартментів та відтворення складних біологічних мікросередовищ модульності. Тому наш протокол 3D-морфогенезу in vitro може забезпечити додатковий підхід до подолання проблем існуючих методів.
Наш протокол повністю зосереджений на 3D епітеліальному морфогенезі, при цьому в культурі використовуються лише епітеліальні клітини, а інші типи навколишніх клітин, такі як мезенхімальні клітини, ендотеліальні клітини та імунні клітини, відсутні. Як було описано раніше, основою нашого протоколу є індукція епітеліального морфогенезу шляхом видалення інгібіторів морфогенів, що секретуються на базолатеральній стороні введеного середовища. Хоча надійна модульність наших методів «кишка на чіпі» та «гібрид на чіпі» дозволяє нам відтворити хвилеподібний 3D епітеліальний шар, додаткові біологічні складнощі, такі як епітеліально-мезенхімальні взаємодії33,34, відкладення позаклітинного матриксу (ECM)35 та, в нашій моделі, особливості крипто-ворсинки, що передають ніші стовбурових клітин у базальних криптах, залишаються предметом подальшого розгляду. Стромальні клітини (наприклад, фібробласти) в мезенхімі відіграють ключову роль у виробництві білків ECM та регуляції кишкового морфогенезу in vivo35,37,38. Додавання мезенхімальних клітин до нашої моделі покращило процес морфогенезу та прикріплення клітин. ефективність. Ендотеліальний шар (тобто капіляри або лімфатичні судини) відіграє важливу роль у регулюванні молекулярного транспорту39 та залученні імунних клітин40 у мікросередовищі кишечника. Крім того, компоненти судинної системи, які можуть бути з'єднані між тканинними моделями, є необхідною умовою, коли тканинні моделі розробляються для демонстрації взаємодії між різними органами. Тому ендотеліальні клітини можуть знадобитися для моделювання точніших фізіологічних характеристик з роздільною здатністю на рівні органів. Імунні клітини, отримані від пацієнта, також важливі для демонстрації вроджених імунних відповідей, презентації антигенів, вроджених адаптивних імунних перехресних зв'язків та тканинно-специфічного імунітету в контексті імітації кишкових захворювань.
Використання гібридних чіпів є простішим, ніж «кишка на чіпі», оскільки налаштування пристрою простіше, а використання вставок Transwell дозволяє масштабовану культуру кишкового епітелію. Однак комерційно доступні вставки Transwell з поліефірними мембранами не є еластичними та не можуть імітувати перистальтичні рухи. Крім того, апікальний відсік вставки Transwell, розміщеної в гібридному чіпі, залишався нерухомим без зсувного напруження на апікальній стороні. Очевидно, що статичні властивості в апікальному відсіку рідко дозволяють довготривале спільне культивування бактерій у гібридних чіпах. Хоча ми можемо надійно індукувати 3D-морфогенез у вставках Transwell при використанні гібридних чіпів, брак фізіологічно значущої біомеханіки та апікального потоку рідини може обмежити можливість використання гібридних чіпових платформ для потенційних застосувань.
Повномасштабні реконструкції осі крипта-ворсинка людини в культурах «кишка на чіпі» та «гібрид на чіпі» ще не були повністю встановлені. Оскільки морфогенез починається з епітеліального моношару, 3D-мікроархітектури не обов'язково забезпечують морфологічну подібність до крипт in vivo. Хоча ми охарактеризували популяцію проліферуючих клітин поблизу базального домену крипти в мікроінженерному 3D-епітелії, області крипти та ворсинки не були чітко розмежовані. Хоча вищі верхні канали на чіпі призводять до збільшення висоти мікроінженерного епітелію, максимальна висота все ще обмежена ~300–400 мкм. Фактична глибина кишкових крипт людини в тонкому та товстому кишечнику становить ~135 мкм та ~400 мкм відповідно, а висота ворсинок тонкого кишечника становить ~600 мкм41.
З точки зору візуалізації, візуалізація 3D-мікроархітектур in situ з надвисокою роздільною здатністю може бути обмежена кишечником на чіпі, оскільки необхідна робоча відстань від об'єктива до епітеліального шару становить порядку кількох міліметрів. Щоб подолати цю проблему, може знадобитися віддалений об'єктив. Крім того, створення тонких зрізів для підготовки зразків для візуалізації є складним завданням через високу еластичність PDMS. Крім того, оскільки пошарове мікрофабрикація кишечника на чіпі передбачає постійну адгезію між кожним шаром, надзвичайно складно відкрити або видалити верхній шар для дослідження поверхневої структури епітеліального шару. Наприклад, за допомогою скануючого електронного мікроскопа (SEM).
Гідрофобність PDMS була обмежувальним фактором у дослідженнях на основі мікрофлюїдів, що стосуються гідрофобних малих молекул, оскільки PDMS може неспецифічно адсорбувати такі гідрофобні молекули. Альтернативами PDMS можуть бути інші полімерні матеріали. Як альтернатива, модифікація поверхні PDMS (наприклад, покриття ліпофільними матеріалами 42 або полі(етиленгліколем) 43) може бути розглянута для мінімізації адсорбції гідрофобних молекул.
Зрештою, наш метод не був добре охарактеризований з точки зору забезпечення високопродуктивного скринінгу або універсальної експериментальної платформи. Поточний протокол вимагає шприцевого насоса на кожен мікропристрій, що займає місце в CO2-інкубаторі та перешкоджає проведенню масштабних експериментів. Це обмеження може бути значно покращено завдяки масштабованості інноваційних форматів культивування (наприклад, 24-лункових, 96-лункових або 384-лункових пористих вставок, що дозволяють безперервне поповнення та видалення базолатерального середовища).
Щоб індукувати 3D-морфогенез кишкового епітелію людини in vitro, ми використали мікрофлюїдний чіп для кишкового пристрою, що містить два паралельні мікроканали та еластичну пористу мембрану між ними для створення просвіт-капілярного інтерфейсу. Ми також демонструємо використання одноканального мікрофлюїдного пристрою (гібридного чіпа), який забезпечує безперервний базолатеральний потік під поляризованими епітеліальними шарами, вирощеними на вставках Transwell. На обох платформах морфогенез різних клітин кишкового епітелію людини можна продемонструвати, застосовуючи спрямовану маніпуляцію потоком для видалення антагоністів морфогенів з базолатерального компартменту. Вся експериментальна процедура (Рисунок 1) складається з п'яти частин: (i) мікровиготовлення кишкового чіпа або вставного гібридного чіпа Transwell (кроки 1-5; Блок 1), (ii) підготовка клітин кишкового епітелію (клітини Caco-2) або органоїдів кишкового організму людини; блоки 2-5), (iii) культивування клітин кишкового епітелію на кишкових чіпах або гібридних чіпах (кроки 6-9), (iv) індукція 3D-морфогенезу in vitro (крок 10) та (v)) для характеристики 3D-мікроструктури епітелію (кроки 11-24). Нарешті, була розроблена відповідна контрольна група (обговорюється далі) для перевірки ефективності морфогенезу in vitro шляхом порівняння епітеліального морфогенезу з просторовим, часовим, умовним або процедурним контролем.
Ми використовували дві різні платформи культивування: кишківник на чіпі з прямими каналами або нелінійними звивистими каналами, або гібридні чіпи, що містять вставки Transwell (TW) у мікрофлюїдному пристрої, виготовленому, як описано у Вставці 1, а крок 1-5. «Виготовлення пристрою» показує основні кроки створення окремого чіпа або гібридного чіпа. «Культурування клітин кишкового епітелію людини» пояснює джерело клітин (Caco-2 або органоїди кишечника людини) та процедуру культивування, що використовуються в цьому протоколі. «Морфогенез in vitro» показує загальні кроки, на яких епітеліальні клітини, отримані з Caco-2 або органоїдів, культивуються на кишковому чіпі або на вставках Transwell гібридного чіпа, після чого відбувається індукція 3D-морфогенезу та формування охарактеризованої епітеліальної структури. Номер кроку програми або номер поля відображається під кожною стрілкою. Додаток надає приклади того, як можна використовувати встановлені шари кишкового епітелію, наприклад, для характеристики диференціації клітин, досліджень фізіології кишечника, встановлення екосистем мікробіома господаря та моделювання захворювань. Імунофлуоресцентні зображення в «Диференціації клітин». Показує ядра, F-актин та MUC2, експресовані в 3D-епітеліальному шарі Caco-2, сформованому на чіпі кишечника. Сигналізація MUC2 присутня в келихоподібних клітинах та слизу, що виділяється з поверхонь слизової оболонки. Флуоресцентні зображення у Gut Physiology показують слиз, що утворюється шляхом фарбування на сіалову кислоту та залишки N-ацетилглюкозаміну з використанням флуоресцентного аглютиніну зародків пшениці. Два зображення, що перекриваються, у розділі «Спільні культури господаря-мікробіома» показують репрезентативні спільні культури господаря-мікробіома в кишечнику на чіпі. Ліва панель показує спільну культуру E. coli, що експресує зелений флуоресцентний білок (GFP), з мікроінженерними 3D-епітеліальними клітинами Caco-2. Права панель показує локалізацію GFP E. coli, спільно культивованої з 3D-епітеліальними клітинами Caco-2, з подальшим імунофлуоресцентним фарбуванням F-актином (червоний) та ядрами (синій). Моделювання захворювання ілюструє здоровий проти синдрому протікання кишечника в чіпах запалення кишечника під фізіологічним впливом бактеріальних антигенів (наприклад, ліпополісахариду, LPS) та імунних клітин (наприклад, PBMC; зелений). Клітини Caco-2 культивували для створення 3D епітеліального шару. Масштабна шкала, 50 мкм. Зображення в нижньому рядку: «Диференціація клітин», адаптована з дозволу посилання.2. Oxford University Press; Відтворено з дозволу посилання.5. NAS; «Спільне культивування хазяїна-мікробів», адаптовано з дозволу посилання.3. NAS; «Моделювання захворювань», адаптовано з дозволу посилання.5. NAS.
Як мікрочіпи типу «кишка на чіпі», так і гібридні мікрочіпи були виготовлені з використанням реплік PDMS, які були вилучені з кремнієвих форм за допомогою м’якої літографії1,44 та нанесені на них малюнки за допомогою SU-8. Конструкція мікроканалів у кожному мікрочіпі визначається з урахуванням гідродинаміки, такої як напруження зсуву та гідродинамічний тиск1,4,12. Оригінальна конструкція «кишка на чіпі» (розширені дані, рис. 1a), яка складалася з двох розташованих поруч паралельних прямих мікроканалів, перетворилася на складну конструкцію «кишка на чіпі» (розширені дані, рис. 1b), яка включає пару вигнутих мікроканалів для індукції збільшеного часу перебування рідини, нелінійних моделей потоку та багатоосьової деформації культивованих клітин (рис. 2a–f)12. Коли потрібно відтворити складнішу біомеханіку кишечника, можна вибрати складну «кишка на чіпі». Ми продемонстрували, що згорнутий «кишковий чіп» також сильно індукує 3D-морфогенез за аналогічні часові рамки з аналогічним ступенем росту епітелію порівняно з оригінальним «кишковим чіпом». незалежно від типу культивованих клітин. Отже, для індукції 3D-морфогенезу лінійні та складні конструкції кишківника на чіпі є взаємозамінними. Репліки PDMS, затверділі на кремнієвих формах зі шаблонами SU-8, забезпечували негативні характеристики після вилучення з форми (рис. 2a). Для виготовлення кишківника на чіпі підготовлений верхній шар PDMS послідовно скріплювали з пористою плівкою PDMS, а потім вирівнювали з нижнім шаром PDMS шляхом незворотного скріплення за допомогою коронного обробника (рис. 2b–f). Для виготовлення гібридних чіпів затверділі репліки PDMS скріплювали зі скляними слайдами для створення одноканальних мікрофлюїдних пристроїв, які могли б вмістити вставки Transwell (рис. 2h та розширені дані, рис. 2). Процес скріплення виконується шляхом обробки поверхонь репліки PDMS та скла кисневою плазмою або коронною обробкою. Після стерилізації мікрофабрикованого пристрою, прикріпленого до силіконової трубки, установка пристрою була готова до виконання 3D-морфогенезу кишкового епітелію (рис. 2g).
a, Схематична ілюстрація приготування деталей PDMS з силіконових форм з малюнком SU-8. Незатверділий розчин PDMS виливали на силіконову форму (ліворуч), затвердівали при 60 °C (посередині) та виймали з форми (праворуч). Вийнятий з форми PDMS розрізали на шматки та очистили для подальшого використання.b, Фотографія силіконової форми, що використовується для приготування верхнього шару PDMS.c, Фотографія силіконової форми, що використовується для виготовлення пористої мембрани PDMS.d, Серія фотографій верхніх та нижніх компонентів PDMS та зібраного кишкового пристрою на чіпі.e, Схема вирівнювання верхнього, мембранного та нижнього компонентів PDMS. Кожен шар незворотно з'єднаний плазмовою або коронною обробкою.f, Схема виготовленого пристрою «кишка на чіпі» з накладеними звивистими мікроканалами та вакуумними камерами.g, Налаштування «кишки на чіпі» для мікрофлюїдної культури клітин. Виготовлену «кишку на чіпі», зібрану за допомогою силіконової трубки та шприца, розміщували на покривному склі. Чіповий пристрій розміщували на кришці 150-мм склянки Петрі. чашка для обробки. Сполучна речовина використовується для закриття силіконової трубки.h, Візуальні знімки виготовлення гібридного чіпа та 3D-морфогенезу з використанням гібридних чіпів. Вставки Transwell, підготовлені незалежно для культивування 2D-моношарів клітин кишкового епітелію, були вставлені в гібридний чіп для індукції кишкового 3D-морфогенезу. Середовище перфузується через мікроканали під шаром клітин, встановленим на вставці Transwell. Масштабна шкала, 1 см.h Передруковано з дозволу посилання.4. Elsevier.
У цьому протоколі клітинну лінію Caco-2 та кишкові органоїди використовували як епітеліальні джерела (рис. 3a). Обидва типи клітин культивували незалежно (Вставка 2 та Вставка 5) та використовували для посіву мікроканалів, покритих ECM, на чіпі кишківника або вставок Transwell. Коли клітини конфлюентні (>95% покриття у колбах), рутинно культивовані клітини Caco-2 (між пасажами 10 та 50) у Т-подібних колбах збирали для приготування дисоційованих клітинних суспензій за допомогою рідини для трипсинізації (Вставка 2). Людські кишкові органоїди з кишкових біопсій або хірургічних резекцій культивували в куполах Matrigel у 24-лункових планшетах для підтримки структурного мікрооточення. Середовище, що містить необхідні морфогени (такі як Wnt, R-спондин та Noggin) та фактори росту, підготовлені, як описано у Вставці 3, доповнювали через день, доки органоїди не виросли до ~500 мкм у діаметрі. Повністю вирощені органоїди збирали та дисоціювали на окремі клітини для посіву на кишківник або Вставки Transwell на чіпі (Вставка 5). Як ми вже повідомляли раніше, його можна диференціювати за типом захворювання12,13 (наприклад, виразковий коліт, хвороба Крона, колоректальний рак або нормальний донор), місцем ураження (наприклад, ураження проти неураженої ділянки) та розташуванням у шлунково-кишковому тракті (наприклад, дванадцятипала кишка, порожня кишка, клубова кишка, сліпа кишка, товста кишка або пряма кишка). У Вставці 5 ми пропонуємо оптимізований протокол для культивування органоїдів товстої кишки (колоїдів), які зазвичай потребують вищих концентрацій морфогенів, ніж органоїди тонкої кишки.
a, Робочий процес індукції морфогенезу кишечника в кишковому чіпі. У цьому протоколі для демонстрації 3D-морфогенезу використовуються людський кишковий епітелій Caco-2 та кишкові органоїди. Ізольовані епітеліальні клітини були висіяні в підготовлений пристрій «кишка на чіпі» (підготовка чіпа). Після того, як клітини висіяні (висічені) та прикріплені (прикріплені) до пористої мембрани PDMS на 0-й день (D0), ініціюється апікальний (AP) потік та підтримується протягом перших 2 днів (потік, AP, D0-D2). Базолатеральний (BL) потік також ініціюється разом із циклічними рухами розтягування (розтягування, потік, AP та BL), коли формується повний 2D-моношар. Кишковий 3D-морфогенез відбувався спонтанно після 5 днів мікрофлюїдної культури (морфогенез, D5). Фазово-контрастні зображення показують репрезентативну морфологію клітин Caco-2 на кожному експериментальному етапі або моменті часу (гістограма, 100 мкм). Чотири схематичні діаграми, що ілюструють відповідні каскади морфогенезу кишечника (угорі праворуч). Пунктирні стрілки. На схемі показано напрямок потоку рідини.b, SEM-зображення, що показує топологію поверхні усталеного 3D-епітелію Caco-2 (ліворуч). Вставка, що виділяє збільшену область (біла пунктирна рамка), показує регенеровані мікроворсинки на 3D-шарі Caco-2 (праворуч).c, Горизонтальний фронтальний вигляд усталеного 3D-епітелію Caco-2, клаудину (ZO-1, червоний) та мембран безперервної щіткової облямівки, позначених F-актином (зелений) та ядрами (синій). Імунофлуоресцентна конфокальна візуалізація епітеліальних клітин на кишкових чіпах. Стрілки, що вказують на середню схему, вказують розташування фокальної площини для кожного конфокального зображення.d, Часовий хід морфологічних змін в органоїдах, культивованих на чіпі, отриманий за допомогою фазово-контрастної мікроскопії на 3, 7, 9, 11 та 13 дні. Вставка (угорі праворуч) показує велике збільшення наданого зображення.e, DIC-фотомікрографія органоїдного 3D-епітелію, усталеного в кишечнику, на зрізі, зробленому на 7 день.f, Накладені імунофлуоресцентні зображення, що показують маркери для стовбурових клітин. (LGR5; пурпуровий), келихоподібні клітини (MUC2; зелений), F-актин (сірий) та ядра (блакитний), вирощені на кишкових чіпах протягом 3 днів відповідно (ліворуч) та 13-денні (посередині) органоїди на епітеліальному шарі. Див. також Розширені дані Рисунок 3, на якому виділено сигналізацію LGR5 без сигналізації MUC2. Флуоресцентні зображення, що показують епітеліальну мікроструктуру (праворуч) 3D органоїдного епітелію, встановленого в кишечнику на чіпі шляхом фарбування плазматичної мембрани барвником CellMask (праворуч) на 13-й день культивування. Масштабна шкала становить 50 мкм, якщо не зазначено інше.b Передруковано з дозволу посилання.2. Oxford University Press; c Адаптовано з дозволу посилання.2. Oxford University Press; e та f адаптовані з дозволу посилання.12 За ліцензією Creative Commons CC BY 4.0.
У кишечнику на чіпі необхідно модифікувати гідрофобну поверхню пористої мембрани PDMS для успішного покриття ECM. У цьому протоколі ми застосовуємо два різні методи модифікації гідрофобності мембран PDMS. Для культивування клітин Caco-2 активація поверхні лише УФ/озоновою обробкою була достатньою для зменшення гідрофобності поверхні PDMS, покриття ECM та прикріплення клітин Caco-2 до мембрани PDMS. Однак мікрофлюїдна культура органоїдного епітелію вимагає хімічної функціоналізації поверхні для досягнення ефективного осадження білків ECM шляхом послідовного нанесення поліетиленіміну (PEI) та глутаральдегіду на мікроканали PDMS. Після модифікації поверхні білки ECM були осаджені для покриття функціоналізованої поверхні PDMS, а потім введені в ізольований органоїдний епітелій. Після прикріплення клітин мікрофлюїдна культура клітин починається з перфузії лише середовища у верхній мікроканал, доки клітини не утворюють повний моношар, тоді як нижній мікроканал підтримує статичні умови. Цей оптимізований метод активації поверхні та покриття ECM дозволяє прикріпленню органоїдного епітелію індукувати 3D-морфогенез на поверхні PDMS.
Культури Transwell також потребують покриття ECM перед посівом клітин; однак, культури Transwell не потребують складних етапів попередньої обробки для активації поверхні пористих вставок. Для вирощування клітин Caco-2 на вставках Transwell, покриття ECM на пористих вставках прискорює прикріплення дисоційованих клітин Caco-2 (<1 година) та формування бар'єру щільного з'єднання (<1-2 дні). Для культивування органоїдів на вставках Transwell ізольовані органоїди висівають на вставки, покриті ECM, прикріплюють до поверхні мембрани (<3 години) та витримують, доки органоїди не утворюють повний моношар з цілісністю бар'єру. Культури Transwell проводяться в 24-лункових планшетах без використання гібридних чіпів.
In vitro 3D-морфогенез можна ініціювати шляхом подачі потоку рідини до базолатеральної сторони сформованого епітеліального шару. У кишечнику на чіпі епітеліальний морфогенез починався, коли середовище перфузувалося у верхній та нижній мікроканали (рис. 3a). Як було описано раніше, критично важливо ввести потік рідини в нижній (базолатеральний) компартмент для безперервного видалення спрямованих секретованих інгібіторів морфогенів. Щоб забезпечити достатню кількість поживних речовин та сироватки для клітин, зв'язаних на пористих мембранах, та створити напругу зсуву в просвіті, ми зазвичай застосовуємо подвійний потік у кишечнику на чіпі. У гібридних чіпах вставки Transwell, що містять епітеліальні моношари, вставлялися в гібридні чіпи. Потім середовище наносилося під базолатеральну сторону пористої вставки Transwell через мікроканал. Кишковий морфогенез відбувався через 3-5 днів після початку базолатерального потоку в обох культуральних платформах.
Морфологічні особливості мікроінженерних 3D епітеліальних шарів можна аналізувати, застосовуючи різні методи візуалізації, включаючи фазово-контрастну мікроскопію, диференціально-інтерференційну контрастну (DIC) мікроскопію, SEM або імунофлуоресцентну конфокальну мікроскопію (рисунки 3 та 4). Фазово-контрастну або DIC-візуалізацію можна легко виконати в будь-який час культивування для контролю форми та випинання 3D епітеліальних шарів. Завдяки оптичній прозорості PDMS та поліефірних плівок, як платформи «кишка на чіпі», так і гібридні чіпи можуть забезпечити візуалізацію in situ в режимі реального часу без необхідності розрізання або розбирання пристрою. Під час проведення імунофлуоресцентної візуалізації (рисунки 1, 3c, f та 4b, c) клітини зазвичай фіксують 4% (мас./об.) параформальдегідом (PFA), потім Triton X-100 та 2% (мас./об.) бичачим сироватковим альбуміном (BSA) по порядку. Залежно від типу клітин можна використовувати різні фіксатори, пермеабілізатори та блокуючі агенти. Первинні антитіла, спрямовані на клітину або ділянку, що залежить від лінії клітини. Маркери використовуються для виділення клітин, іммобілізованих in situ на чіпі, а потім вторинні антитіла разом з контрастним барвником, спрямованим або на ядро ​​(наприклад, 4',6-діамідино-2-фенілен)індол, DAPI) або F-актин (наприклад, флуоресцентно мічений фалоїдин). Флуоресцентна візуалізація в реальному часі також може бути виконана in situ для виявлення продукції слизу (рис. 1, «Диференціація клітин» та «Фізіологія кишечника»), випадкової колонізації мікробних клітин (рис. 1, «Спільна культура хазяїна-мікроба»), рекрутингу імунних клітин (рис. 1, «Моделювання захворювань») або контурів 3D-епітеліальної морфології (рис. 3c,f та 4b,c). При модифікації кишечника на чіпі для відокремлення верхнього шару від нижнього шару мікроканального каналу, як описано в посиланням. Як показано на рис. 2, 3D-епітеліальну морфологію, а також мікроворсинки на апікальній щітковій облямівці можна візуалізувати за допомогою SEM (рис. 3b). Експресія Маркери диференціації можна оцінити за допомогою кількісної ПЛР5 або секвенування РНК окремих клітин. У цьому випадку 3D-шари епітеліальних клітин, вирощених у кишкових чіпах або гібридних чіпах, збирають за допомогою трипсинізації, а потім використовуються для молекулярного або генетичного аналізу.
a, Робочий процес індукції кишкового морфогенезу в гібридному чіпі. Caco-2 та кишкові органоїди використовуються в цьому протоколі для демонстрації 3D морфогенезу на платформі гібридного чіпа. Дисоційовані епітеліальні клітини були висіяні в підготовлені вставки Transwell (TW prep; див. малюнок нижче). Після того, як клітини були висіяні (висічені) та прикріплені до поліефірних мембран у вставках Transwell, всі клітини культивували в статичних умовах (TW culture). Через 7 днів один вставний елемент Transwell, що містить 2D моношар епітеліальних клітин, був інтегрований у гібридний чіп для введення базолатерального потоку (Flow, BL), що зрештою призвело до створення 3D епітеліального шару (морфогенез). Фазово-контрастні мікрофотографії, що показують морфологічні особливості епітеліальних клітин органів людини, отриманих від висхідної ободової кишки нормального донора (лінія C103) на кожному експериментальному етапі або моменті часу. Схеми у верхніх шарах ілюструють експериментальну конфігурацію для кожного етапу. b, Гібридні чіпи (ліва схема) можуть призвести до 3D морфогенезу органоїдних епітеліальних клітин за допомогою конфокальної мікроскопії зверху вниз, отриманої в різних умовах. Z-позиції (верхнє, середнє та нижнє; див. схему праворуч та відповідні пунктирні лінії). показали очевидні морфологічні характеристики. F-актин (блакитний), ядро ​​(сіре).c, Флуоресцентні конфокальні мікрофотографії (3D кутовий вигляд) епітеліальних клітин, отриманих з органоїдів, культивованих у статичному Transwell (TW; вставка всередині білої пунктирної рамки) проти гібридного чіпа (найбільший повний знімок), що порівнюють 2D та 3D морфологію відповідно. Пара 2D вертикальних поперечних зрізів (вставка у верхньому правому куті; «XZ») також показує 2D та 3D ознаки. Масштабна шкала, 100 мкм.c Передруковано з дозволу посилання.4. Elsevier.
Контролі можна приготувати шляхом культивування тих самих клітин (Caco-2 або клітин кишкового органоїдного епітелію) у двовимірні моношари за звичайних статичних умов культивування. Зокрема, обмежена об'ємна ємність мікроканалів (тобто ~4 мкл у верхньому каналі на оригінальній конструкції кишкового чіпа) може призвести до виснаження поживних речовин. Тому також можна порівняти морфологію епітелію до та після застосування базолатерального потоку.
Процес м'якої літографії слід виконувати в чистому приміщенні. Для кожного шару на чіпі (верхній та нижній шари та мембрани) та гібридних чіпів використовувалися різні фотошаблони, які виготовлялися на окремих кремнієвих пластинах, оскільки висота мікроканалів була різною. Висота мішені верхнього та нижнього мікроканалів оболонки чіпа становить 500 мкм та 200 мкм відповідно. Висота мішені каналу гібридного чіпа становить 200 мкм.
Помістіть 3-дюймову кремнієву пластину в чашку з ацетоном. Обережно покрутіть пластину протягом 30 секунд, потім висушіть пластину на повітрі. Перенесіть пластину на пластину з IPA, потім обертайте пластину протягом 30 секунд для очищення.
Для максимального видалення органічних залишків з поверхні кремнієвої пластини можна додатково використовувати розчин піраньї (суміш перекису водню та концентрованої сірчаної кислоти, 1:3 (об./об.)).
Розчин піраньї надзвичайно корозійний та виділяє тепло. Необхідні додаткові запобіжні заходи. Для утилізації відходів дайте розчину охолонути та перелийте його в чистий, сухий контейнер для відходів. Використовуйте вторинні контейнери та належним чином маркуйте контейнери для відходів. Будь ласка, дотримуйтесь інструкцій з безпеки на об'єкті для отримання більш детальних процедур.
Зневодніть пластини, помістивши їх на гарячу плиту з температурою 200 °C на 10 хвилин. Після зневоднення пластину п'ять разів струшували на повітрі для охолодження.
Насипте ~10 г фоторезисту SU-8 2100 на центр очищеної кремнієвої пластини. Використовуйте пінцет, щоб рівномірно розподілити фоторезист по пластині. Періодично кладіть пластину на гарячу пластину з температурою 65°C, щоб зробити фоторезист менш липким і його було легше розподілити. Не кладіть пластину безпосередньо на гарячу пластину.
SU-8 рівномірно розподілили на пластині шляхом нанесення покриття методом спінінгу. Запрограмуйте вхідне обертання SU-8 протягом 5–10 секунд для поширення зі швидкістю 500 об/хв та прискоренням 100 об/хв/с. Встановіть основне обертання для формування структури товщиною 200 мкм на швидкості 1500 об/хв або досяжіть товщини 250 мкм (створюючи висоту 500 мкм для верхнього шару оболонки на чіпі; див. «Критичні кроки» нижче), встановивши прискорення 300 об/хв/с протягом 30 секунд при 1200 об/хв.
Основну швидкість обертання можна регулювати відповідно до цільової товщини малюнка SU-8 на кремнієвій пластині.
Для виготовлення шаблонів SU-8 висотою 500 мкм для верхнього шару оболонки на чіпі, етапи нанесення покриття обертанням та м'якого випікання цієї коробки (кроки 7 та 8) послідовно повторювалися (див. крок 9) для отримання двох шарів SU-8 товщиною 250 мкм, які можна нашаровувати та з'єднувати за допомогою УФ-опромінення на кроці 12 цієї коробки, створюючи шар висотою 500 мкм.
Випікайте вафлі з покриттям SU-8 у м’якому режимі, обережно помістивши їх на гарячу плиту за температури 65 °C на 5 хвилин, потім перемкніть температуру на 95 °C та інкубуйте ще 40 хвилин.
Щоб досягти висоти візерунка SU-8 500 мкм у верхньому мікроканалі, повторіть кроки 7 та 8, щоб створити два шари SU-8 товщиною 250 мкм.
Використовуючи вирівнювач ультрафіолетової маски, проведіть тестування лампи згідно з інструкціями виробника, щоб розрахувати час експозиції пластини. (час експозиції, мс) = (доза опромінення, мДж/см2) / (потужність лампи, мВт/см2).
Після визначення часу експозиції помістіть фотошаблон на тримач маски вирівнювача УФ-масок і помістіть фотошаблон на пластину з покриттям SU-8.
Розмістіть друковану поверхню фотошаблону безпосередньо на покритій SU-8 стороні кремнієвої пластини, щоб мінімізувати розсіювання ультрафіолетового випромінювання.
Експонуйте вертикально пластину та фотошаблон з покриттям SU-8 ультрафіолетовим світлом потужністю 260 мДж/см2 протягом заданого часу експозиції (див. крок 10 цієї таблиці).
Після опромінення УФ-випромінюванням кремнієві пластини з покриттям SU-8 випікали при температурі 65°C протягом 5 хвилин та 95°C протягом 15 хвилин на кожній гарячій пластині для виготовлення візерунків висотою 200 мкм. Час після випікання при 95°C збільшили до 30 хвилин для виготовлення візерунків висотою 500 мкм.
Проявник наливають у скляну чашку, а випечену пластину поміщають у чашку. Об'єм проявника SU-8 може змінюватися залежно від розміру скляної пластини. Переконайтеся, що ви використовуєте достатню кількість проявника SU-8, щоб повністю видалити неекспонований SU-8. Наприклад, якщо ви використовуєте скляну чашку діаметром 150 мм та місткістю 1 л, використовуйте ~300 мл проявника SU-8. Проявляйте форму протягом 25 хвилин, періодично обережно обертаючи її.
Промийте проявлену форму приблизно 10 мл свіжого проявника, а потім IPA, розпилюючи розчин за допомогою піпетки.
Помістіть пластину в плазмовий очищувач та піддайте впливу кисневої плазми (атмосферний газ, тиск мішені 1 × 10−5 Торр, потужність 125 Вт) протягом 1,5 хвилини.
Помістіть пластину у вакуумний ексикатор зі скляним предметним склом всередині. Пластини та предметні скловиділення можна розміщувати поруч. Якщо вакуумний ексикатор розділений на кілька шарів пластиною, помістіть предметні скловиділення в нижню камеру, а пластини – у верхню. Крапніть 100 мкл розчину трихлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силану на скляне предметне скло та застосуйте вакуум для силанізації.
Розморозьте флакон із замороженими клітинами Caco-2 на водяній бані з температурою 37°C, потім перенесіть розморожені клітини в колбу T75, що містить 15 мл попередньо нагрітого до 37°C середовища Caco-2.
Для пропускання клітин Caco-2 при ~90% конфлюентності спочатку нагрійте середовище Caco-2, PBS та 0,25% трипсину/1 мМ ЕДТА у водяній бані при температурі 37°C.
Аспіруйте середовище за допомогою вакуумної аспірації. Промийте клітини двічі 5 мл теплого PBS, повторюючи вакуумну аспірацію та додаючи свіжий PBS.