Spas ji bo serdana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî moda lihevhatinê di Internet Explorer-ê de vemirînin). Di vê navberê de, ji bo ku piştgiriya berdewam misoger bikin, em ê malperê bêyî şêwaz û JavaScript-ê nîşan bidin.
Morfogeneza rûvî ya mirovan taybetmendiyên krîpt-villus ên mîkromîmariya epitelyal a 3D û rêxistina fezayî saz dike. Ev avahiya bêhempa ji bo parastina homeostaza rûvî bi parastina nîşa hucreya reh di krîptê bingehîn de ji antîjenên mîkrobî yên eksojen û metabolîtên wan pêwîst e. Wekî din, vîlîyên rûvî û mukusa derdanê hucreyên epitelyal ên fonksiyonel ên cihêreng pêşkêş dikin ku li ser rûyê mukoza rûvî astengiyek parastinê heye. Ji ber vê yekê, ji nû ve afirandina avahiyên epitelyal ên 3D ji bo avakirina modelên rûvî yên in vitro girîng e. Bi taybetî, rûvî-li-ser-çîpek mîmetîk a organîk dikare morfogeneza 3D ya xweber a epiteliya rûvî bi fonksiyonên fîzyolojîk û biyomekanîka pêşkeftî teşwîq bike. Li vir, em protokolek dubarekirî peyda dikin da ku morfogeneza rûvî di rûvî de li ser çîpek mîkrofluîdîk û her weha di çîpek hîbrîd a Transwell-ê de bi xurtî teşwîq bike. Em rêbazên berfireh ji bo çêkirina cîhazê, çandina hucreyên epitelyal ên Caco-2 an organoîd ên rûvî di mîhengên kevneşopî û her weha li ser platformek mîkrofluîdîk, teşwîqkirina morfogeneza 3D, û taybetmendiya 3D ya damezrandî vedibêjin. epîtelyûmê bi karanîna gelek awayên wênekirinê. Ev protokol bi kontrolkirina herikîna şilava bazolateral ji bo 5 rojan vejenandina mîkromîmariya rûvî ya fonksiyonel pêk tîne. Rêbaza me ya morfogenezê ya in vitro stresa şikandina fîzyolojîkî ya têkildar û tevgera mekanîkî bikar tîne û endezyarî an manîpulasyona hucreyê ya tevlihev hewce nake, ku dibe ku ji teknîkên din ên heyî çêtir be. Em texmîn dikin ku protokola me ya pêşniyarkirî dikare bandorên berfireh li ser civaka lêkolîna biyomedîkî hebe, rêbazek peyda bike da ku tebeqeyên epîtelyûmê yên rûvî yên 3D in vitro ji bo serîlêdanên biyomedîkî, klînîkî û dermansaziyê vejenîne.
Ceribandin nîşan didin ku şaneyên Caco-2 yên epitelîyal ên rûvî yên ku di cîhazên mîkrofluîdîk ên duqatî de têne çandin6,7, dikarin bêyî têgihîştineke zelal a mekanîzmaya bingehîn morfogeneza 3D ya xweber di vitro de derbas bikin. Di lêkolîna me ya dawî de, me dît ku rakirina dijberên morfogenê yên ku bi awayekî bazolateral têne veşartin ji cîhazên çandiniyê ji bo teşwîqkirina morfogeneza epitelîyal a 3D di vitro de pêwîst û bes e, ku ev yek ji hêla Caco-2 û organoîdên rûvî yên ji nexweşan hatine wergirtin ve hatiye nîşandan. Hucreyên epitelyal hatin pejirandin. Di vê lêkolînê de, me bi taybetî li ser hilberîna hucreyan û belavbûna kombûna dijberê Wnt yê bihêz, Dickkopf-1 (DKK-1), di cîhazên mîkrofluidîk ên guherandî yên ku tê de insertên Transwell hene, ku wekî "Çîpa Hîbrîd" têne binavkirin, sekinî. Em nîşan didin ku zêdekirina dijberên Wnt yên eksojen (wek DKK-1, tepeserkerê Wnt 1, proteîna 1 a têkildarî frizzled a veşartî, an Soggy-1) li ser rûviya li ser çîpê morfogenezê asteng dike an jî qata epitelyal a 3D ya pêş-avakirî têk dibe, ku pêşniyar dike ku stresa dijber di dema çandiniyê de berpirsiyarê morfogeneza rûvî di vitro de ye. Ji ber vê yekê, nêzîkatiyek pratîkî ji bo bidestxistina morfogenezek xurt li navrûya epitelyal ew e ku asta dijberên Wnt di beşa bazolateral de bi şuştina çalak (mînak, di platformên gut-on-a-chip an hybrid-on-a-chip) an belavbûnê were rakirin an jî bi kêmanî were parastin. Medyaya bazolateral (mînak, ji tê desên Transwell nav rezervuarên mezin ên bazolateral di...) bîr).
Di vê protokolê de, em rêbazek berfireh ji bo çêkirina mîkroamûrên gut-on-a-chip û çîpên hîbrîd ên Transwell-insertable (gav 1-5) peyda dikin da ku şaneyên epitelyal ên rûvî li ser membranên poroz ên li ser bingeha polîdîmetîlsîloksan (PDMS) (gav 6A, 7A, 8, 9) an membranên polîester ên insertên Transwell (gav 6B, 7B, 8, 9) çandin û morfogeneza 3D di vitro de teşwîq bikin (gav 10). Me her weha taybetmendiyên şaneyî û molekulî yên ku nîşana hîstogeneza taybetî ya tevnê û cûdahiya şaneyî ya girêdayî rêzê nîşan didin bi sepandina gelek modalîteyên wênekirinê (gav 11-24) destnîşan kirin. Em morfogenezê bi karanîna şaneyên epitelyal ên rûvî yên mirovî, wekî Caco-2 an organoîdên rûvî, di du formatên çandiniyê de bi hûrguliyên teknîkî yên wekî guherandina rûyê membranên poroz, afirandina monoqatên 2D, û biyokîmya û hilberandina mîkrojîngeha biyomekanîkî ya rûvî teşwîq dikin. di vitro de. Ji bo teşwîqkirina morfogeneza 3D ji monoqatên epitelyal ên 2D, me rakirin. dijberên morfogenê di her du formên çandî de bi herikîna nav beşa bazolateral a çandî. Di dawiyê de, em nûnertiyek kêrhatî ya çînek epitelyal a 3D ya nûjenkirî peyda dikin ku dikare ji bo modelkirina mezinbûna epitelyal a girêdayî morfogenê, hev-kulturên dirêj-mêvandar-mîkrobiomê, enfeksiyona patojenê, birîndarbûna iltîhabî, bêserûberiya astengiya epitelyal, û terapiyên li ser bingeha probiyotîk were bikar anîn. Mînak. bandor.
Protokola me dikare ji bo rêzek berfireh a zanyarên di lêkolînên bingehîn (mînak, biyolojiya mukoza rûvî, biyolojiya hucreya reh, û biyolojiya pêşketinê) û lêkolînên sepandî (mînak, ceribandina dermanan a pêşklînîkî, modela nexweşiyan, endezyariya tevnan, û gastroenterolojî) de bi bandor be. Ji ber dubarekirin û xurtbûna protokola me ji bo teşwîqkirina morfogeneza 3D ya epîtelyûma rûvî di vitro de, em texmîn dikin ku stratejiya me ya teknîkî dikare ji temaşevanên ku dînamîkên sînyala hucreyê di dema pêşketina rûvî, nûvekirinê an homeostazê de lêkolîn dikin re were belavkirin. Wekî din, protokola me ji bo lêpirsîna enfeksiyonê di bin ajanên enfeksiyonê yên cûrbecûr de wekî Norovirus 8, Sendroma Giran a Akût a Bêhnvedanê Koronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 an Vibrio cholerae bikêr e. Guhdarên patolojî û patogeneza nexweşiyê jî bikêr in. Bikaranîna pergalek mîkrofîzyolojiya rûvî ya li ser çîpê dibe ku rê bide hev-çandiniya dirêj 10 û nirxandina paşê ya parastina mêvandar, bersivên parastinê û tamîrkirina birînên têkildarî patojenê di rêça gastrointestinal (GI) de 11. Nexweşiyên din ên GI yên bi sendroma rûviya leaky, nexweşiya sîlyakê, nexweşiya Crohn, kolîta ûlseratîf, pouchitis, an sendroma rûviya acizker ve girêdayî dikarin werin simulasyon kirin dema ku qatên epitelyal ên rûvî yên 3D bi karanîna qatên epitelyal ên rûvî yên 3D yên nexweş têne amadekirin, ev nexweşî atrofiya vîlûz, kurtbûna krîptê, zirara mukozê, an astengiya epitelyal a xirabkirî vedihewîne. Biyopsî an organoîdên rûvî yên ji hucreyên reh hatine wergirtin 12,13. Ji bo modela çêtir a tevliheviya bilind a jîngeha nexweşiyê, xwendevan dikarin li ser zêdekirina celebên hucreyên têkildarî nexweşiyê, wekî hucreyên mononukleer ên xwîna periferîk ên nexweş (PBMCs), li modelên ku mîkromîmarîyên vîlûs-krîptên rûvî yên 3D hene, bifikirin. hucreyên parastinê yên taybetî yên tevnê, 5.
Ji ber ku mîkroavahîya epitelîyal a 3D bêyî pêvajoya beşê dikare were sabît kirin û dîtbarî kirin, temaşevanên ku li ser transkrîptomîkên fezayî û wênekirina bi çareseriya bilind an jî bi çareseriya super dixebitin, dibe ku bi nexşerêya me ya dînamîkên fezayî-demkî yên gen û proteînan li ser nîşên epitelîyal eleqedar bibin. Bi teknolojiyê re eleqedar dibin. Bersiva li hember teşwîqên mîkrobî an jî îmûnî. Wekî din, têkiliya dirêj-dirêj a mîkrobioma mêvandar 10, 14 ku homeostaza rûvî hevrêz dike, dikare di qata mukoza rûvî ya 3D de bi hev-çandinkirina cûrbecûr cureyên mîkrobî, civakên mîkrobî an mîkrobiota fekal, nemaze di rûvî-li-ser-çîpekê de were saz kirin. di platformê de. Ev rêbaz bi taybetî ji bo temaşevanên ku îmmunolojiya mukozal, gastroenterolojî, mîkrobioma mirovan, kulturomîk û mîkrobiolojiya klînîkî dixwînin balkêş e ku dixwazin mîkrobiotaya rûvî ya berê neçandî di laboratîfê de çandin bikin. Ger protokola me ya morfogeneza in vitro dikare li gorî formatên çandê yên pîvanbar were adaptekirin, wekî têketinên pir-çalik di plakayên 24, 96 an 384 çalikan de ku bi berdewamî beşên bazolateral tijî dikin, protokol dikare ji bo kesên ku platformên ceribandin an pejirandinê yên dermansazî, biyomedîkî an jî platformên nirxandinê an pejirandinê yên bi derûdora bilind ji bo pîşesaziya xwarinê pêş dixin jî were belavkirin. Wekî delîlek prensîbê, me vê dawiyê gengaziya pergalek morfogeneza piralî ya bi derûdora bilind nîşan da ku dikare li gorî formata plakaya 24-çalikan were pîvandin. Wekî din, gelek hilberên organ-li-ser-çîp hatine bazirganî kirin16,17,18. Ji ber vê yekê, pejirandina rêbaza me ya morfogeneza in vitro dikare ji hêla gelek laboratîfên lêkolînê, pîşesazî an hikûmet û ajansên rêziknameyê ve were bilez kirin û potansiyel were pejirandin da ku ji nû ve bernamekirina hucreyî ya morfogeneza rûvî ya in vitro di asta transkrîptomîk de fam bike da ku dermanan biceribînin an biyoterapî Veguhestina û veguandina dermanan bi karanîna cîgirên rûvî yên 3D an jî bi karanîna modelên organ-li-ser-çîpê yên xwerû an bazirganî ji bo nirxandina dubarekirina pêvajoya morfogeneza rûvî hate nirxandin.
Hejmareke sînorkirî ji modelên ceribandinî yên têkildarî mirovan ji bo lêkolîna morfogeneza epitelîyal a rûvî hatine bikar anîn, bi giranî ji ber nebûna protokolên bicîhkirî ji bo teşwîqkirina morfogeneza 3D di vitro de. Bi rastî, piraniya zanîna heyî ya li ser morfogeneza rûvî li ser lêkolînên heywanan e (mînak, masiyê zebra20, mişk21 an mirîşk22). Lêbelê, ew ked û lêçûnek dijwar in, dikarin ji hêla exlaqî ve gumanbar bin, û ya herî girîng, pêvajoyên pêşkeftina mirovan bi rastî diyar nakin. Ev model di heman demê de di şiyana xwe de ku bi rengek piralî werin ceribandin pir sînordar in. Ji ber vê yekê, protokola me ji bo nûjenkirina avahiyên tevnê yên 3D di vitro de ji modelên heywanan ên di vivo de û her weha modelên din ên çanda hucreyê yên statîk ên 2D yên kevneşopî çêtir e. Wekî ku berê hate vegotin, karanîna avahiyên epitelîyal ên 3D rê da me ku em cîhê fezayî yê hucreyên cihêreng di eksena krîpt-villus de di bersiva cûrbecûr teşwîqên mukozal an parastinê de lêkolîn bikin. Qatên epitelîyal ên 3D dikarin cîhek peyda bikin da ku lêkolîn bikin ka hucreyên mîkrobî çawa pêşbaziyê dikin da ku nîşên fezayî û pêşveçûna ekolojîk di bersiva faktorên mêvandar de (mînak, hundur li hember derve) çêbikin. qatên mukusê, derdana IgA û peptîdên antîmîkrobî). Wekî din, morfolojiya epitelyal a 3D dikare bihêle ku em fêm bikin ka mîkrobiotaya rûvî çawa civakên xwe ava dike û bi awayekî sinerjîk metabolîtên mîkrobî (mînak, asîdên rûn ên zincîra kurt) çêdike ku rêxistina hucreyî û nîşên hucreyên reh di krîptên bingehîn de şekil didin. Ev taybetmendî tenê dikarin werin nîşandan dema ku qatên epitelyal ên 3D di vitro de têne damezrandin.
Ji bilî rêbaza me ya afirandina avahiyên epitelyal ên rûvî yên 3D, çend rêbazên in vitro hene. Çanda organoîda rûvî teknîkek endezyariya tevnê ya herî pêşketî ye ku li ser çandina hucreyên stûna rûvî di bin şert û mercên morfojenê yên taybetî de ye23,24,25. Lêbelê, karanîna modelên organoîda 3D ji bo analîza veguhastinê an jî hev-kulturên mîkrobiomê-mazûvan pir caran dijwar e ji ber ku lûmena rûvî di nav organoîdê de girtî ye û ji ber vê yekê, danasîna pêkhateyên lûmînal ên wekî hucreyên mîkrobî an antîjenên eksojen sînordar e. Gihîştina lûmenên organoîdê dikare bi karanîna mîkroînjektorek were baştir kirin,26,27 lê ev rêbaz dagirker û kedkar e û ji bo pêkanîna wê zanîna taybetî hewce dike. Wekî din, çandên organoîda kevneşopî yên ku di bin şert û mercên statîk de di şemalên hîdrojel de têne parastin bi rastî biyomekanîka çalak a in vivo nîşan nadin.
Nêzîkatiyên din ên ku ji hêla çend komên lêkolînê ve têne bikar anîn, platformên hîdrojel ên 3D yên pêş-avakirî bikar tînin da ku avahiya epitelyal a rûvî bi çandina şaneyên rûvî yên mirovan ên îzolekirî li ser rûyê jel teqlîd bikin. Plaformên hîdrojel bi karanîna qalibên çapkirî yên 3D, mîkro-hêzkirî, an jî bi lîtografî hatine çêkirin çêbikin. Ev rêbaz rêzkirina xwe-rêxistinkirî ya şaneyên epitelyal ên îzolekirî di vitro de bi gradientên morfojen ên fîzyolojîkî yên têkildar nîşan dide, avahiyek epitelyal a rêjeya bilind û xaçerêya stroma-epitelyal bi tevlêkirina şaneyên stromal di platformê de ava dike. Lêbelê, xwezaya platformên pêş-avakirî dibe ku pêşî li nîşandana pêvajoya morfogenetîk a xweber bigire. Ev model her weha herikîna luminal an navberî ya dînamîk peyda nakin, ji ber ku stresa şilavê ya ku şaneyên rûvî hewce ne ku morfogenezê derbas bikin û fonksiyona fîzyolojîkî bi dest bixin kêm in. Lêkolînek din a vê dawiyê platformên hîdrojel di platformek mîkrofluidîk de bikar anîn û avahiyên epitelyal ên rûvî bi karanîna teknîkên lazer-gravkirinê şêwaz kirin. Organoîdên rûvî yên mişk şablonên gravkirî dişopînin da ku avahiyên lûleyî yên rûvî çêbikin, û herikîna şilava nav-luminal dikare bi karanîna modula mîkrofluidîkê. Lêbelê, ev model ne pêvajoyên morfogenetîk ên xweber nîşan dide û ne jî tevgerên mekanobiyolojîk ên rûvî dihewîne. Teknîkên çapkirina 3D ji heman komê karibûn lûleyên rûvî yên mînyatur bi pêvajoyên morfogenetîk ên xweber biafirînin. Tevî çêkirina tevlihev a beşên rûvî yên cûda di nav lûleyê de, ev model di heman demê de kêmasiya herikîna şilava luminal û deformasyona mekanîkî jî heye. Wekî din, xebitandina modelê dibe ku sînordar be, nemaze piştî ku pêvajoya çapkirina biyolojîk qediya, şert û mercên ceribandinê an têkiliyên hucre-bi-hucreyê xera bike. Di şûna wê de, protokola me ya pêşniyarkirî morfogeneza rûvî ya xweber, stresa şikandina fîzyolojîkî ya têkildar, biyomekanîka ku tevgera rûvî dişibihe, gihîştina beşên apîkal û bazolateral ên serbixwe, û ji nû ve afirandina mîkrojîngehên biyolojîk ên tevlihev ên modularîteyê peyda dike. Ji ber vê yekê, protokola me ya morfogeneza 3D ya in vitro ya me dikare nêzîkatiyek temamker peyda bike da ku li ser dijwarîyên rêbazên heyî derbas bibe.
Protokola me bi tevahî li ser morfogeneza epîtelî ya 3D disekine, tenê hucreyên epîtelî di kulturê de hene û ti celebên din ên hucreyên derdorê yên wekî hucreyên mezenkîmal, hucreyên endotel û hucreyên parastinê tune ne. Wekî ku berê hatiye vegotin, bingeha protokola me teşwîqkirina morfogeneza epîtelî ye bi rakirina astengkerên morfogenê yên ku li aliyê bazolateral ê navgîna hatî destnîşan kirin têne veşartin. Her çend modularîteya xurt a gut-li-ser-çîp û hîbrîd-li-ser-çîp-a me dihêle ku em qata epîtelî ya 3D ya pêlan ji nû ve biafirînin jî, tevliheviyên biyolojîkî yên din ên wekî têkiliyên epîtelî-mezenkîmal33,34, danîna Matrîksa derveyî hucreyê (ECM) 35 û, di modela me de, taybetmendiyên krîpt-villus ku nişên hucreyên reh di krîptên bingehîn de vediguhezînin hîn jî têne hesibandin. Hucreyên stromal (mînak, fîbroblast) di mezenkîmê de rolek sereke di hilberîna proteînên ECM û rêkxistina morfogeneza rûvî di vivo de dilîzin35,37,38. Zêdekirina mezenkîmal şaneyên ji bo modela me pêvajoya morfogenetîk û karîgeriya girêdana şaneyan zêde kir. Çîna endotel (ango, kapîler an lîmfatîk) roleke girîng di rêkxistina veguhastina molekulî39 û komkirina şaneyên parastinê40 di mîkrojîngeha rûvî de dilîze. Wekî din, pêkhateyên damarên xwînê yên ku dikarin di navbera modelên tevnê de werin girêdan, gava ku modelên tevnê ji bo nîşandana têkiliyên pir-organ têne sêwirandin, şertek pêşîn in. Ji ber vê yekê, dibe ku hewce be ku şaneyên endotel ji bo modelkirina taybetmendiyên fîzyolojîk ên rasttir bi çareseriya asta organê ve werin zêdekirin. Şaneyên parastinê yên ji nexweşan hatine wergirtin jî ji bo nîşandana bersivên parastinê yên xwemalî, pêşkêşkirina antîjenê, danûstandina parastinê ya adapteyî ya xwemalî, û parastina taybetî ya tevnê di çarçoveya teqlîdkirina nexweşiya rûvî de girîng in.
Bikaranîna çîpên hîbrîd ji gut-on-a-chip rasterasttir e ji ber ku sazkirina cîhazê hêsantir e û karanîna pêvekên Transwell dihêle ku çanda epîtelyûma rûvî bi pîvan were çêkirin. Lêbelê, pêvekên Transwell ên bazirganî yên bi membranên polîester ne elastîk in û nikarin tevgerên peristaltîk-mîna simul bikin. Wekî din, beşa apîkal a pêveka Transwell a ku di çîpa hîbrîd de hatî danîn bêyî zexta birînê li aliyê apîkal sabît ma. Bê guman, taybetmendiyên statîk ên di beşa apîkal de kêm kêm di çîpên hîbrîd de hev-çandiniya bakteriyan a demdirêj dihêle. Her çend em dikarin bi xurtî morfogeneza 3D di pêvekên Transwell de dema ku çîpên hîbrîd bikar tînin teşwîq bikin jî, kêmbûna biyomekanîka têkildar a fîzyolojîkî û herikîna şilava apîkal dibe ku gengaziya platformên çîpa hîbrîd ji bo serîlêdanên potansiyel sînordar bike.
Nûavakirinên tevahî yên eksena krîpt-villus a mirovan di çandên gut-on-a-chip û hybrid-on-a-chip de bi tevahî nehatine saz kirin. Ji ber ku morfogenez ji qatek yekalî ya epitelyal dest pê dike, mîkromîmarîyên 3D ne hewce ne ku dişibin krîptan di vivo de peyda bikin. Her çend me nifûsa hucreyên pirjimar ên nêzîkî domaina krîptê ya bingehîn di epiteliya 3D ya mîkroendezyarî de diyar kir jî, herêmên krîpt û villous bi zelalî nehatin destnîşankirin. Her çend kanalên jorîn ên bilindtir li ser çîpê dibin sedema bilindahiya zêde ya epiteliya mîkroendezyarî, bilindahiya herî zêde hîn jî bi ~300-400 µm ve sînorkirî ye. Kûrahiya rastîn a krîptên rûvî yên mirovan di rûviyên piçûk û mezin de bi rêzê ve ~135 µm û ~400 µm e, û bilindahiya vîlîyên rûvî yên piçûk ~600 µm e41.
Ji aliyê wênekirinê ve, wênekirina in situ ya çareseriya super a mîkromîmarîyên 3D dibe ku bi rûviya li ser çîpê ve sînordar be, ji ber ku mesafeya xebatê ya pêwîst ji lenza objektîfê heta qata epitelyal bi qasî çend mîlîmetreyan e. Ji bo çareserkirina vê pirsgirêkê, dibe ku objektîfek dûr hewce be. Wekî din, çêkirina beşên zirav ji bo amadekirina nimûneya wênekirinê ji ber elastîkbûna bilind a PDMS-ê dijwar e. Wekî din, ji ber ku mîkrofabrîkasyona qat bi qat a rûviya li ser çîpê girêdana daîmî di navbera her qatê de vedihewîne, vekirina an rakirina qata jorîn ji bo lêkolîna avahiya rûyê qata epitelyal pir dijwar e. Mînakî, bi karanîna mîkroskopa elektronîkî ya şopandinê (SEM).
Hîdrofobîtiya PDMS di lêkolînên mîkrofluîdîk ên ku bi molekulên piçûk ên hîdrofobîk re mijûl dibin de faktorek sînordar bûye, ji ber ku PDMS dikare bi awayekî ne-taybetî van molekulên hîdrofobîk adsorb bike. Alternatîfên PDMS-ê dikarin bi materyalên din ên polîmerîk werin hesibandin. Wekî din, guherîna rûyê PDMS-ê (mînak, pêçandina bi materyalên lîpofîlîk 42 an polî(etîlen glîkol) 43) dikare were hesibandin da ku adsorbsiyona molekulên hîdrofobîk kêm bike.
Di dawiyê de, rêbaza me di warê peyda kirina platformek ceribandinê ya bikarhêner-dostane ya "yek-size-fits-all" an jî "yek-size-fits-all" de baş nehatiye destnîşankirin. Protokola heyî ji bo her mîkroamûrê pompeyek şîrîng hewce dike, ku di înkubatorek CO2 de cîh digire û pêşî li ceribandinên di asta mezin de digire. Ev sînorkirin dikare bi pîvanbariya formatên çandê yên nûjen (mînak, têketinên poroz ên 24-qulî, 96-qulî, an 384-qulî ku destûrê didin dagirtin û rakirina domdar a medyaya bazolateral) bi girîngî were baştir kirin.
Ji bo teşwîqkirina morfogeneza 3D ya epitelyûma rûvî ya mirovî di vitro de, me amûrek rûvî ya çîpa mîkrofluîdîk bikar anî ku du mîkrokanalên paralel û membranek poroz a elastîk di navberê de dihewîne da ku navberek lûmen-kapîlar çêbike. Em her weha karanîna amûrek mîkrofluîdîk a yek-kanal (çîpek hîbrîd) nîşan didin ku herikîna bazolateral a domdar di bin tebeqeyên epitelyal ên polarîzekirî yên li ser insertên Transwell mezin dibin peyda dike. Di her du platforman de, morfogeneza cûrbecûr şaneyên epitelyal ên rûvî yên mirovî dikare bi sepandina manîpulasyona arasteyî ya herikînê ji bo rakirina dijberên morfojenê ji beşa bazolateral were nîşandan. Tevahiya prosedûra ceribandinê (Wêne 1) ji pênc beşan pêk tê: (i) mîkroçêkirina çîpa rûvî an çîpa hîbrîd a têxe Transwell (gavên 1-5; Qutiya 1), (ii) amadekirina şaneyên epitelyal ên rûvî (şaneyên Caco-2) an organoîdên rûvî yên mirovî; qutiyên 2-5), (iii) çandina şaneyên epitelyal ên rûvî li ser çîpên rûvî an çîpên hîbrîd (gavên 6-9), (iv) destpêkirina morfogeneza 3D di vitro de (gava 10) û (v)) ji bo taybetmendiya mîkroavakirina epitelyal a 3D (gavên 11-24). Di dawiyê de, komek kontrolê ya guncaw (ku li jêr bêtir tê nîqaş kirin) hate sêwirandin da ku bandora morfogeneza di vitro de bi berawirdkirina morfogeneza epitelyal bi kontrolên cîhî, demkî, şertî, an prosedurî ​​ve piştrast bike.
Me du platformên çandiniyê yên cûda bi kar anîn: gut-on-a-chip bi kanalên rasterast an kanalên tevlihev ên ne-xêzik, an çîpên hîbrîd ên ku tê de têxistinên Transwell (TW) di cîhazek mîkrofluidîk de hene, ku wekî ku di Qutiya 1-ê de hatî vegotin hatine çêkirin, û gava 1-5. "Çêkirina Amûrê" gavên sereke di çêkirina çîpek yekane an çîpek hîbrîd de nîşan dide. "Çandina Hucreyên Epitelyal ên Rûviya Mirovan" çavkaniya hucreyê (Caco-2 an organoîdên rûviya mirovan) û prosedurên çandiniyê yên ku di vê protokolê de têne bikar anîn rave dike. "Morfogeneza in vitro" gavên giştî nîşan dide ku tê de hucreyên epitelyal ên ji Caco-2 an organoîd-ê hatine wergirtin li ser çîpek rûviyan an li ser têxistinên Transwell ên çîpek hîbrîd têne çandin, dûv re jî destpêkirina morfogeneza 3D û avakirina avahiyek epitelyal a taybetmendîkirî. Hejmara gava bernameyê an hejmara qutiyê li binê her tîrê tê xuyang kirin. Serlêdan mînakan dide ka çawa qatên epitelyal ên rûviyan ên damezrandî dikarin werin bikar anîn, mînakî, di taybetmendiya cûdakirina hucreyan, lêkolînên fîzyolojiya rûviyan, avakirina ekosîstemên mîkrobioma mêvandar, û modelkirina nexweşiyê de. Îmmunofluoresans wêneyên di "Cudakirina Hucreyê" de navik, F-aktîn û MUC2 nîşan didin ku di qata epitelyal a Caco-2 ya 3D de ku li ser çîpa rûvî çêdibe têne îfade kirin. Sînyala MUC2 di hucreyên goblet û mukusê ku ji rûyên mukozayê tê derxistin de heye. Wêneyên floresan di Fîzyolojiya Rûvî de mukusê nîşan didin ku bi boyaxkirina asîda sîalîk û bermayiyên N-asetilglukozamîn bi karanîna agglutinîna genimê floresan tê hilberandin. Du wêneyên hevûdu yên di "Hev-Kulturên Mîkrob-Mêvandar" de hev-kulturên mîkrobiom-mêvandar ên temsîlî di rûvî de li ser çîpekê nîşan didin. Panela çepê hev-kultura E. coli ya ku proteîna floresan a kesk (GFP) bi hucreyên epitelyal ên Caco-2 yên 3D yên mîkroendezyarî îfade dike nîşan dide. Panela rastê cihê GFP E. coli ya ku bi hucreyên epitelyal ên Caco-2 yên 3D re hatî hev-kultur kirin nîşan dide, dûv re boyaxkirina îmmunofluoresansê bi F-aktîn (sor) û navik (şîn) re tê. Modelkirina nexweşiyê rûviya saxlem li hember rûviya rijandî di çîpên iltîhaba rûvî de di bin dijwarîya fîzyolojîkî de bi antîjenên bakterî nîşan dide (mînak, lîpopolîsakarîd, LPS) û şaneyên parastinê (mînak, PBMC; kesk). Şaneyên Caco-2 hatin çandin da ku tebeqeyek epitelyal a 3D ava bikin. Şêweya pîvanê, 50 µm. Wêne di rêza jêrîn de: "Cûdakirina şaneyan" bi destûra referansê hatîye adaptekirin.2. Weşanxaneya Zanîngeha Oxfordê; Bi destûra Ref.5 hatîye hilberandin. NAS; "Hev-Çandina Mîkrobê-Mêvandar" bi destûra ref.3 hatîye adaptekirin. NAS; "Modelkirina Nexweşiyê" bi destûra referansê hatîye adaptekirin.5. NAS.
Hem çîpên gut-on-chip û hem jî hîbrîd bi karanîna kopiyên PDMS-ê yên ku ji qalibên silîkonê bi lîtografiya nerm hatine derxistin1,44 û bi SU-8 hatine nexşandin, hatine çêkirin. Sêwirana mîkrokanalên di her çîpê de bi berçavgirtina hîdrodînamîkê wekî stresa şikestinê û zexta hîdrodînamîkê1,4,12 tê destnîşankirin. Sêwirana orîjînal a gut-on-a-chip (Daneyên Berfireh Wêne 1a), ku ji du mîkrokanalên rasterast ên paralel ên li kêleka hev pêk dihat, veguheriye gut-on-a-chip-ek tevlihev (Daneyên Berfireh Wêne 1b) ku cotek mîkrokanalên xêzkirî vedihewîne da ku dema rûniştinê ya şilavê ya zêde, qalibên herikîna ne-xêzik, û deformasyona piralî ya şaneyên çandî çêbike (Wêne 2a-f)12. Dema ku biyomekanîka gut-ê ya tevlihevtir hewce ye ku ji nû ve were afirandin, gut-on-a-chip-ên tevlihev dikarin werin hilbijartin. Me nîşan da ku Gut-Chip-a tevlihev di heman demê de bi astek mezinbûna epitelyal a wekhev li gorî ya orîjînal bi xurtî morfogeneza 3D jî di çarçoveyek demê ya wekhev de bi astek wekhev a mezinbûna epitelyal teşwîq dike. Çîpa Gut, bêyî ku celebê şaneya çandî çi be. Ji ber vê yekê, ji bo teşwîqkirina morfogeneza 3D, sêwiranên rûviyan ên xêzikî û tevlihev ên li ser çîpê bi hev ve guhêrbar in. Kopiyên PDMS-ê yên ku li ser qalibên silîkonê bi şablonên SU-8 hatine saxkirin piştî derxistina qalibê taybetmendiyên neyînî peyda kirin (Wêne 2a). Ji bo çêkirina rûviyan li ser çîpekê, qata jorîn a PDMS-ê ya amadekirî bi rêzê ve bi fîlimek PDMS-ê ya poroz ve hate girêdan û dûv re bi girêdana bêveger bi karanîna dermankerek koronayê bi qata PDMS-ê ya jêrîn ve hate hevrêz kirin (Wêne 2b-f). Ji bo çêkirina çîpên hîbrîd, kopîkirinên PDMS-ê yên saxkirî bi slaytên cam ve hatin girêdan da ku cîhazên mîkrofluidîk ên yek-kanal biafirînin ku dikarin têketinên Transwell bicîh bikin (Wêne 2h û Daneyên Berfirehkirî Wêne 2). Pêvajoya girêdanê bi dermankirina rûyên kopî û cam bi plazmaya oksîjenê an dermankirina koronayê tê kirin. Piştî sterilîzasyona cîhaza mîkroçêkirî ya ku bi lûleya silîkonê ve girêdayî ye, sazkirina cîhazê amade bû ku morfogeneza 3D ya epîtelyûma rûvî pêk bîne (Wêne 2g).
a, Wêneya şematîk a amadekirina perçeyên PDMS ji qalibên silîkonî yên bi şêwaza SU-8. Çareseriya PDMS-ya neqediyayî li ser qalibek silîkonî hat rijandin (çep), di 60 °C de hat qediyayî (navîn) û ji qalibê hat derxistin (rast). PDMS-ya qediyayî ji bo karanîna din hat perçekirin û ji bo karanîna din hat paqijkirin.b, Wêneya qaliba silîkonî ya ku ji bo amadekirina qata jorîn a PDMS-ê hat bikar anîn.c, Wêneya qaliba silîkonî ya ku ji bo çêkirina membrana poroz a PDMS-ê hat bikar anîn.d, Rêze wêneyên pêkhateyên PDMS-ya jorîn û jêrîn û cîhaza rûvî ya li ser çîpê ya komkirî.e, Nexşeya hevrêziya pêkhateyên PDMS-ya jorîn, membran û jêrîn. Her qatek bi dermankirina plazmayê an koronayê bi awayekî bêveger tê girêdan.f, Nexşeya cîhaza gut-on-a-chip-a çêkirî bi mîkrokanalên tevlihev û odeyên valahiyê yên li ser hev.g, Sazkirina gut-on-a-chip ji bo çandina hucreya mîkrofluidîk. Gurîya çêkirî li ser çîpek ku bi lûleyek silîkonî û şîrîngek hatî kom kirin li ser pêçekê hat danîn. Amûra çîpê li ser qapaxê hat danîn. qalikeke Petri ya 150 mm ji bo pêvajoyê. Girêdan ji bo girtina lûleya silîkonê tê bikar anîn.h, Wêneyên dîtbarî yên çêkirina çîpa hîbrîd û morfogeneza 3D bi karanîna çîpên hîbrîd. Pêvekên Transwell ên ku bi serbixwe ji bo çandina qatên yekjimar ên 2D yên hucreyên epitelyal ên rûvî hatine amadekirin, di nav çîpa hîbrîd de hatine danîn da ku morfogeneza 3D ya rûvî were teşwîqkirin. Medya bi rêya mîkrokanalên di bin qata hucreyê de ku li ser pêveka Transwell hatî saz kirin tê perfuz kirin. Barika pîvanê, 1 cm.h Bi destûra referansê ji nû ve hatî çap kirin.4. Elsevier.
Di vê protokolê de, xeta şaneyên Caco-2 û organoîdên rûvî wekî çavkaniyên epitelyal hatin bikar anîn (Wêne 3a). Her du celeb şaneyan bi serbixwe hatin çandin (Qutiya 2 û Qutiya 5) û ji bo çandina mîkrokanalên bi ECM-pêçayî yên rûvî an jî têketinên Transwell hatin bikar anîn. Dema ku şaneyên bi hev re dicivin (>95% vegirtin di şûşeyan de), şaneyên Caco-2 yên bi rêkûpêk têne çandin (di navbera rêyên 10 û 50 de) di şûşeyên T-ê de têne berhev kirin da ku rawestandinên şaneyên ji hev veqetandî bi şilava trîpsînasyonê werin amadekirin (qutiya 2). Organoîdên rûvî yên mirovan ji biyopsiyên rûvî an jî rezeksiyonên cerrahî di qubeyên skela Matrigel de di plakayên 24-qulikan de hatin çandin da ku mîkrojîngeha avahîsaziyê piştgirî bikin. Medyaya ku morfojenên bingehîn (wek Wnt, R-spondin, û Noggin) û faktorên mezinbûnê yên ku wekî ku di Qutiya 3-an de hatine vegotin tê de hatine amadekirin, her du rojan carekê hate zêdekirin heya ku organoîd bigihîjin ~500 µm di qutrê de. Organoîdên bi tevahî mezinbûyî têne berhev kirin û ji bo çandina li ser şaneyên yekane têne veqetandin. zik an jî pêvekên Transwell li ser çîpekê (Qutiya 5). Wekî ku me berê ragihandibû, ew dikare li gorî celebê nexweşiyê12,13 (mînak kolîta ûlseratîf, nexweşiya Crohn, kansera kolorektal, an donorê normal), cîhê birînê (mînak, birîn li hember devera ne-birîndar) û cihê gastrointestinal di rêkê de (mînak, duodenum, jejunum, ileum, sekum, kolon, an rektûm) were cûdakirin. Em di Qutiya 5 de protokolek çêtirînkirî peyda dikin ji bo çandina organoîdên kolonê (koloîd) ku bi gelemperî ji organoîdên rûviya piçûk bêtir hewceyê morfojenan in.
a, Herikîna Kar ji bo destpêkirina morfogeneza rûvî di çîpa rûvî de. Epîteliya rûvî ya mirovî ya Caco-2 û organoîdên rûvî di vê protokolê de têne bikar anîn da ku morfogeneza 3D nîşan bidin. Hucreyên epitelyal ên îzolekirî di cîhaza gut-on-a-chip a amadekirî de hatin çandin (amadekirina çîpê). Dema ku hucre di roja 0-an de (D0) têne çandin (toxkirin) û bi membrana poroz a PDMS ve têne girêdan (girêdan), herikîna apîkal (AP) dest pê dike û ji bo 2 rojên pêşîn tê domandin (herikîn, AP, D0-D2). Herikîna bazolateral (BL) jî digel tevgerên dirêjkirina çerxî (dirêjkirin, herikîn, AP û BL) dest pê dike dema ku qatek yekalî ya 2D ya bêkêmasî çêdibe. Morfogeneza 3D ya rûvî piştî 5 rojan ji çanda mîkrofluidîk (morfogenez, D5) bi awayekî xweber çêbû. Wêneyên berevajîkirina qonaxê morfolojiya nûner a hucreyên Caco-2 di her gav an xala demê ya ceribandinê de nîşan didin (grafa bar, 100 µm). Çar diyagramên şematîk kaskadên têkildar ên morfogeneza rûvî nîşan didin (jor rast).Tîrên xalxalî di şematîk de rêça herikîna şilavê temsîl dikin.b, Wêneya SEM topolojiya rûyê epîtelyûma Caco-2 ya 3D ya damezrandî nîşan dide (çep).Nîşana hundirîn a ku devera mezinkirî ronî dike (qutiya xalxalî ya spî) mîkrovillên ji nû ve hatine çêkirin li ser qata Caco-2 ya 3D nîşan dide (rast).c, Dîtina pêşiyê ya horizontî ya Caco-2 3D ya damezrandî, klaudin (ZO-1, sor) û membranên sînorê firçeyê yên domdar ên bi F-actin (kesk) û navik (şîn) hatine nîşankirin. Dîtbariya konfokal a îmmunofluoresansê ya şaneyên epîtelyal li ser çîpên rûvî.Tîrên ku ber bi şematîka navîn ve nîşan didin cihê balafira fokusê ji bo her dîtina konfokal nîşan didin.d, Demjimêra guhertinên morfolojîk di organoîdan de ku li ser çîpek hatine çandin ku bi mîkroskopiya kontrastê ya qonaxê di rojên 3, 7, 9, 11 û 13-an de hatine bidestxistin.Nîşana hundirîn (jorê rastê) mezinbûna bilind a wêneya peydakirî nîşan dide.e, Fotomîkrografa DIC ya epîtelyûma 3D ya organoîdî ku di rûvî de li ser perçeya ku di roja 7-an de hatiye girtin hatiye damezrandin.f, Wêneyên îmmunofluoresansa li ser hev nîşankerên ji bo hucreyên reh (LGR5; magenta), hucreyên goblet (MUC2; kesk), F-aktîn (gewr) û navik (şîn) nîşan didin ku li ser çîpên rûvî bi rêzê ve 3 rojan (Çep) û organoîdên 13-rojî (navîn) li ser qata epitelyal mezin bûne. Her weha Wêneya Daneyên Berfireh 3 bibînin, ku sînyala LGR5 bêyî sînyala MUC2 ronî dike. Wêneyên fluoresansê mîkroavahîya epitelyal (rast) ya epiteliya organoîda 3D nîşan didin ku di rûvî de li ser çîpekê bi boyaxkirina parzûna plazmayê bi boyaxa CellMask (rast) di roja 13-an a çandiniyê de hatî damezrandin. Xeta pîvanê 50 μm e heya ku nehatibe diyarkirin.b Bi destûra referansê ji nû ve hatî çapkirin.2. Weşanxaneya Zanîngeha Oxfordê; c Bi destûra referansê hatî adaptekirin.2. Weşanxaneya Zanîngeha Oxfordê; e û f bi destûra referansê hatî adaptekirin.12 Di bin Lîsansa Creative Commons CC BY 4.0 de.
Di rûvî de li ser çîpê, ji bo pêçandina serkeftî ya ECM, pêdivî ye ku rûyê hîdrofobîk ê parzûna poroz a PDMS were guhertin. Di vê protokolê de, em du rêbazên cûda bikar tînin da ku hîdrofobîtiya parzûnên PDMS biguherînin. Ji bo çandina şaneyên Caco-2, aktîvkirina rûyê bi dermankirina UV/ozonê tenê bes bû ku hîdrofobîtiya rûyê PDMS kêm bike, ECM pêç bike û şaneyên Caco-2 bi parzûna PDMS ve girêbide. Lêbelê, çanda mîkrofluîdîk a epîtelyûma organoîd hewceyê fonksiyonalîzasyona rûyê ya kîmyewî ye da ku bi sepandina rêze-polyethyleneimine (PEI) û glutaraldehyde li ser mîkrokanalên PDMS-ê depoyek bi bandor a proteînên ECM-ê bi dest bixe. Piştî guheztina rûyê, proteînên ECM-ê ji bo veşandina rûyê PDMS-ê ya fonksiyonel hatin danîn û dûv re di nav epîtelyûma organoîd a îzolekirî de hatin danîn. Piştî ku şane têne girêdan, çanda şaneya mîkrofluîdîk bi perfuzyonkirina tenê navînê di mîkrokanala jorîn de dest pê dike heya ku şaneyên yekqatek bêkêmasî çêbikin, dema ku mîkrokanala jêrîn şert û mercên statîk diparêze. Ev rêbaza çêtirînkirî ji bo aktîvkirina rûyê û pêçandina ECM-ê dihêle ku epîtelyûma organoîd were girêdan da ku 3D-ê teşwîq bike. morfogenezê li ser rûyê PDMSê
Çandên Transwell berî çandina şaneyan pêçandina ECM jî hewce dikin; lêbelê, çandên Transwell gavên pêşdermankirinê yên tevlihev hewce nakin da ku rûyê têkelên poroz çalak bikin. Ji bo mezinbûna şaneyên Caco-2 li ser têkelên Transwell, pêçandina ECM li ser têkelên poroz girêdana şaneyên Caco-2 yên ji hev veqetandî (<1 saet) û avakirina astengiya girêdana teng (<1-2 roj) lez dike. Ji bo çandina organoîdan li ser têkelên Transwell, organoîdên îzolekirî li ser têkelên bi ECM pêçayî têne çandin, bi rûyê parzûnê ve têne girêdan (<3 saet) û têne parastin heya ku organoîd tebeqeyek yekpare ya bêkêmasî bi yekparebûna astengiyê çêbikin. Çandên Transwell di plakayên 24-bîr de bêyî karanîna çîpên hîbrîd têne kirin.
Morfogeneza 3D ya in vitro dikare bi sepandina herikîna şilavê li aliyê bazolateral ê qata epitelyal a damezrandî were destpêkirin. Di rûvî de li ser çîpekê, morfogeneza epitelyal dest pê kir dema ku navgîn di mîkrokanalên jorîn û jêrîn de hate perfuzkirin (Wêne 3a). Wekî ku berê hate vegotin, ji bo rakirina domdar a astengkerên morfogenê yên veşartî yên arasteyî, girîng e ku herikîna şilavê di beşa jêrîn (basolateral) de were danîn. Ji bo ku xurek û serumê têr ji şaneyên ku li ser membranên poroz ve girêdayî ne re peyda bikin û stresa şikestina luminal çêbikin, em bi gelemperî herikîna dualî di rûvî de li ser çîpekê bicîh tînin. Di çîpên hîbrîd de, pêvekên Transwell ên ku tebeqeyên yekalî yên epitelyal dihewînin hatin danîn nav çîpên hîbrîd. Dûv re, navgîn di bin aliyê bazolateral ê pêveka Transwell a poroz de bi rêya mîkrokanalê hate sepandin. Morfogeneza rûvî 3-5 roj piştî destpêkirina herikîna bazolateral di her du platformên çandiniyê de çêbû.
Taybetmendiyên morfolojîk ên qatên epitelyal ên 3D yên mîkroendezyarî dikarin bi sepandina modalîteyên wênekirinê yên cûrbecûr, di nav de mîkroskopiya kontrastê ya qonaxê, mîkroskopiya kontrastê ya destwerdana cûdahiyê (DIC), SEM, an mîkroskopiya konfokal a îmmunofluoresansê (Wêne 3 û 4) werin analîzkirin. Wênekirina kontrastê ya qonaxê an DIC dikare bi hêsanî di her kêliyê de di dema çandiniyê de were kirin da ku şikl û derketina qatên epitelyal ên 3D were şopandin. Ji ber zelaliya optîkî ya fîlmên PDMS û polîester, hem platformên çîpa gut-on-a-chip û hem jî platformên çîpa hîbrîd dikarin wênekirina di cih de ya rast-dem bêyî hewcedariya beşkirin an veqetandina cîhazê peyda bikin. Dema ku wênekirina îmmunofluoresansê tê kirin (Wêne 1, 3c, f û 4b, c), hucre bi gelemperî bi 4% (wt/vol) paraformaldeîd (PFA) têne sabît kirin, dûv re Triton X-100 û 2% (wt/vol)) albûmîna seruma ga (BSA), li gorî celebê hucreyê, dikarin werin sabît kirin. bikar anîn. Antîkorên seretayî yên ku nîşankerên şaneyên an deverên girêdayî rêzê hedef digirin, ji bo ronîkirina şaneyên ku li ser çîpê di cîh de hatine sabît kirin têne bikar anîn, dûv re antîkorên duyemîn bi boyaxa dijber re ku an navik (mînak, 4′,6-dîamîdîno-2-fenîlen) îndol, DAPI) an F-aktîn (mînak, faloîdîn bi fluoresansê nîşankirî) hedef digire. Wênekirina zindî ya li ser bingeha fluoresansê jî dikare di cîh de were kirin da ku hilberîna mukusê (Wêne 1, "Cûdahiya şaneyê" û "Fîzyolojiya rûvî"), kolonîzasyona rasthatî ya şaneyên mîkrobî (Wêne 1, "Hevçûna mîkrobê mêvandar"), komkirina şaneyên parastinê (Wêne 1, 'Modelkirina Nexweşiyê') an jî konturên morfolojiya epitelyal a 3D (Wêne 3c, f û 4b, c) were tespît kirin. Dema ku rûvî li ser çîpê tê guhertin da ku qata jorîn ji qata mîkrokanala jêrîn veqetîne, wekî ku di referansê de hatî vegotin. Wekî ku di Wêne 2 de tê xuyang kirin, morfolojiya epitelyal a 3D û her weha mîkrovîlên li ser apîkal Sînorê firçeyê dikare bi SEM were xuyang kirin (Wêne 3b). Derbirîna nîşankerên cûdakirinê dikare bi pêkanîna PCR5-a hejmarî an rêzkirina RNA-ya yek-hucreyî were nirxandin. Di vê rewşê de, qatên 3D yên hucreyên epitelyal ên ku di çîpên rûvî an çîpên hîbrîd de mezin dibin bi trîpsînasyonê têne berhev kirin û dûv re ji bo analîza molekulî an genetîkî têne bikar anîn.
a, Herikîna Kar ji bo destpêkirina morfogeneza rûvî di çîpek hîbrîd de. Caco-2 û organoîdên rûvî di vê protokolê de têne bikar anîn da ku morfogeneza 3D di platformek çîpa hîbrîd de nîşan bidin. Hucreyên epitelyal ên ji hev veqetandî di nav insertên Transwell ên amadekirî de hatin çandin (amadekariya TW; li wêneyê li jêr binêre). Piştî ku hucre hatin çandin (tovkirin) û bi membranên polîester di insertên Transwell de hatin girêdan, hemî hucre di bin şert û mercên statîk de hatin çandin (çanda TW). Piştî 7 rojan, yek insertek Transwell ku tê de qatek yekane ya 2D ya hucreyên epitelyal heye, di nav çîpek hîbrîd de hate entegre kirin da ku herikînek bazolateral (Flow, BL) were destnîşan kirin, ku di dawiyê de bû sedema çêbûna qatek epitelyal a 3D (morfogenez). Mîkrografên berevajî yên qonaxê taybetmendiyên morfolojîk ên hucreyên epitelyal ên organên mirovan ên ku ji kolona hilkişîner a donor normal (xeta C103) di her gav an xala demê ya ceribandinê de hatine wergirtin nîşan didin. Şematîkên di qatên jorîn de veavakirina ceribandinê ji bo her gavê nîşan didin.b, Çîpên hîbrîd (şematîka çepê) dikarin bibin sedema morfogeneza 3D ya hucreyên epitelyal ên organoîd bi Dîmenên mîkroskopiya konfokal a jor-jêr ku di pozîsyonên Z yên cuda de hatine girtin (jorîn, navîn û jêrîn; li şematîka rastê û xetên xalxalî yên têkildar binêre). taybetmendiyên morfolojîk ên eşkere nîşan dan. F-aktîn (şîn), navik (boz).c, Mîkrografên konfokal ên flûoresansê (dîmena goşeyî ya 3D) ya şaneyên epitelyal ên ji organoîdê hatine wergirtin ku di Transwell-a statîk (TW; navgîn di nav qutiya spî ya xalxalî de) de li hember çîpa hîbrîd (wêneya tevahî ya herî mezin) têne çandin ku morfolojiya 2D li hember 3D, bi rêzê ve, didin ber hev. Cotek dîmenên xaçerêya vertîkal ên 2D (navgîn di quncikê jorîn ê rastê de; "XZ") jî taybetmendiyên 2D û 3D nîşan didin. Barika pîvanê, 100 µm.c Bi destûra referansê ji nû ve hatî çapkirin.4. Elsevier.
Kontrol dikarin bi çandina heman şaneyan (Caco-2 an şaneyên epitelyal ên organoîd ên rûvî) di bin şert û mercên çandina statîk a kevneşopî de di nav qatên yekalî yên du-alî de werin amadekirin. Bi taybetî, kêmbûna xurekê dibe ku ji ber kapasîteya qebareya sînorkirî ya mîkrokanalan çêbibe (ango ~4 µL di kanala jorîn de li ser sêwirana çîpa rûvî ya orîjînal). Ji ber vê yekê, morfolojiya epitelyal berî û piştî sepandina herikîna bazolateral jî dikare were berhev kirin.
Divê pêvajoya lîtografiya nerm di odeyek paqij de were kirin. Ji bo her tebeqeya li ser çîpê (tebeqe û membranên jorîn û jêrîn) û çîpên hîbrîd, fotomaskên cûda hatin bikar anîn û li ser waferên silîkonê yên cuda hatin çêkirin ji ber ku bilindahiya mîkrokanalan cûda bû. Bilindahiya hedef a mîkrokanalên jorîn û jêrîn ên rûvî li ser çîpê bi rêzê ve 500 µm û 200 µm e. Bilindahiya hedefa kanala çîpa hîbrîd 200 µm e.
Wafleke silîkonî ya 3 înç bi asetonê têxin nav taseke. Plaqeyê bi nermî 30 saniyeyan bizivirînin, paşê waflê di hewayê de hişk bikin. Waflê veguhezînin ser taseke bi IPA, paşê plakeyê 30 saniyeyan bizivirînin da ku paqij bibe.
Ji bo zêdekirina rakirina bermayiyên organîk ji rûyê wafera silîkonê, bi awayekî vebijarkî dikare çareseriyek piranhayê (tevliheviya hîdrojen peroksît û asîda sulfurîk a konsantre, 1:3 (vol/vol)) were bikar anîn.
Çareseriya Piranhayê pir korozîf e û germê çêdike. Tedbîrên ewlehiyê yên zêdetir pêwîst in. Ji bo avêtina bermayiyan, bila çareserî sar bibe û veguhezînin konteynireke bermayiyan a paqij û hişk. Konteynerên duyemîn bikar bînin û konteynerên bermayiyan bi rêkûpêk nîşan bikin. Ji kerema xwe ji bo prosedurên berfirehtir rêbernameyên ewlehiyê yên tesîsê bişopînin.
Waflan bi danîna wan li ser plakaya germ a 200°C bo 10 deqeyan ji bo zuhakirina avê zuha bikin. Piştî zuhakirinê, wafl pênc caran di hewayê de hat hejandin da ku sar bibe.
Nêzîkî 10 g fotoresîst SU-8 2100 li navenda wafera silîkonê ya paqijkirî birijînin. Bi karanîna pîncekê fotoresîstê bi rengek wekhev li ser waferê belav bikin. Carinan waferê li ser lewheyek germ a 65°C deynin da ku fotoresîst kêmtir zeliqok bibe û belavkirina wê hêsantir bibe. Waferê rasterast li ser lewheya germ nexin.
SU-8 bi rêbaza pêçandina spinê li ser waferê bi awayekî wekhev hate belavkirin. Zivirîna hatinî ya SU-8ê ji bo 5-10 saniyeyan bername bikin da ku bi leza 500 rpm û lezandina 100 rpm/s belav bibe. Zivirîna sereke ji bo qalindahiya 200 µm li 1,500 rpm bicîh bikin, an jî qalindahiya 250 µm bi dest bixin (bi çêkirina bilindahiyek 500 µm ji bo qata jorîn a zikê li ser çîpê; li "Gavên krîtîk" ên li jêr binêre) li lezandina 300 rpm/s û 30 saniyeyan li 1,200 rpm bicîh bikin.
Leza zivirîna sereke dikare li gorî stûriya hedef a qaliba SU-8 ya li ser wafera silîkonê were sererast kirin.
Ji bo çêkirina qalibên SU-8 ên bi bilindahiya 500 µm ji bo qata jorîn a zikê li ser çîpê, gavên pêçandina bi zîvirandinê û pijandina nerm a vê Qutiyê (gavên 7 û 8) li pey hev hatin dubarekirin (gava 9 bibînin) da ku du qatên qatek stûr a 250 µm ya SU-8 çêbikin, ku dikarin di gava 12-an a vê qutiyê de bi rêya tîrêjên UV werin qatkirin û bi hev ve werin girêdan, û qatek bilindahiya 500 µm çêbikin.
Waflên bi pêçandina SU-8 pêçayî bi baldarî 5 deqeyan li ser plakaya germ bi 65°C bipêjin, paşê mîhengê biguherînin 95°C û 40 deqeyên din înkubasyonê bikin.
Ji bo bidestxistina bilindahiya 500 μm a qalibê SU-8 di mîkrokanala jorîn de, gavên 7 û 8 dubare bikin da ku du tebeqeyên SU-8 yên bi stûriya 250 μm çêbikin.
Bi karanîna Aligner-a Mask UV, li gorî rêwerzên çêker ceribandina lampa pêk bînin da ku dema danîna waferê hesab bikin. (dema danînê, ms) = (doza danînê, mJ/cm2)/(hêza lampa, mW/cm2).
Piştî diyarkirina dema kişandinê, fotomaskê deynin ser cihê maskeyê yê rêzkera maskeya UV û fotomaskê deynin ser wafera bi pêçandina SU-8.
Ji bo kêmkirina belavbûna UV, rûyê çapkirî yê fotomaskê rasterast li ser aliyê wafera silîkonê yê bi pêçandina SU-8 deynin.
Wafer û fotomaska ​​bi pêçandina SU-8 ji bo dema pêşwext diyarkirî bi awayekî vertîkal li ber 260 mJ/cm2 ronahiya UV bidin (gava 10 a vê qutiyê bibînin).
Piştî rûbirûbûna bi tîrêjên ultraviyole (UV), waflên silîkonî yên bi SU-8 pêçayî li ser her plakaya germ di 65°C de ji bo 5 deqeyan û di 95°C de ji bo 15 deqeyan hatin pijandin da ku qalibên bi bilindahiya 200 μm werin çêkirin. Dema piştî pijandinê li 95°C dirêj bikin heta 30 deqeyan da ku qalibên bi bilindahiya 500 µm werin çêkirin.
Pêşdebir tê rijandin nav kaseyek cam û wafla pijandî tê de tê danîn. Qebareya pêşdebirê SU-8 dikare li gorî mezinahiya plakaya cam biguhere. Piştrast bikin ku hûn têra pêşdebirê SU-8 bikar bînin da ku SU-8-ya nehatî eşkerekirin bi tevahî were rakirin. Mînakî, dema ku kaseyek cam a bi qûtra 150 mm bi kapasîteya 1 lître tê bikar anîn, ~300 mL pêşdebirê SU-8 bikar bînin. Qalibê 25 hûrdeman bi zivirandina nerm a carinan pêşve bibin.
Qalibê pêşketî bi qasî 10 mL pêşdebirê teze bişo û piştre bi karanîna pîpetekê çareseriyê bi IPA birijîne.
Waferê têxin nav paqijkera plazmayê û 1.5 deqîqeyan bi plazmaya oksîjenê (gaza atmosferê, zexta hedef 1 × 10−5 Torr, hêz 125 W) re bihêlin.
Waferê têxin nav desîkatoreke valahiyê ku slaytek cam tê de hebe. Wafer û slayt dikarin li kêleka hev werin danîn. Ger desîkatora valahiyê bi plakeyekê bibe çend tebeqe, slaytan têxin odeya jêrîn û waferan jî têxin odeya jorîn. 100 μL çareseriya trîkloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktîl)sîlanê bavêjin ser slaytek cam û ji bo sîlankirinê valahiyê bicîh bînin.
Şûşeyek ji şaneyên Caco-2 yên cemidî di serşokek avê ya 37°C de bihelînin, paşê şaneyên helandî veguhezînin firaxek T75 ku 15 mL ji navgîniya Caco-2 ya pêşwext germkirî ya 37°C tê de heye.
Ji bo derbaskirina şaneyên Caco-2 bi rêjeya hevgirtinê ya ~90%, pêşî navgîniya Caco-2, PBS, û 0.25% trîpsîn/1 mM EDTA di serşokek avê ya 37°C de germ bikin.
Bi vakumê gihandinê navgînê bihelînin. Bi dubarekirina vakumê gihandinê û lê zêdekirina PBS-ya teze, şaneyan du caran bi 5 mL PBS-ya germ bişon.